Синтез и изучение свойств пептидных антигенов β 2 - гликопротеина-I тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

л- 1

- .и-'»* ' На правах рукописи

ПАЛЬКЕЕВА МАРИНА ЕВГЕНЬЕВНА

СИНТЕЗ И ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ПЕПТИДНЫХ АНТИГЕНОВ |3г ГЛИКО ПРОТЕ И НА-1.

02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и фшиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1998

Работа выполнена в лаборатории синтеза пептидов Российского Кардиологического научно-производственного комплекса Минздрава РФ и на кафедре химии и технологии тонких органических соединений Московской Государственной Академии Тонкой Химической Технологии им. М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: член-корреспондент РАН,

доктор химических наук, профессор Евстигнеева Р.П. Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор ' Швачкин Ю.П.

кандидат химических наук Фонина Л. А.

Ведущая организация: Институт иммунологии Минздрава РФ

Защита состоится с^^ в ^^ часов

на заседании Диссертационного Совета Д 063.41.01 в Московской Государственной Академии Тонкой Химической Технологии им. М.В. Ломоносова по адресу: 117571, г.Москва, просп. Вернадского, 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова (119831, г.Москва, ул. МПироговская, 1).

Автореферат разослан ¿£>2 ¡993 г

Ученый секретарь Диссертационного Совета кандидат химических наук,

старший научный сотрудник

Лютик А.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Большое внимание исследователей и клиницистов различных областей медицины привлекает антифосфолипидный синдром, основные проявления которого (повторные тромбозы, системная красная волчанка, акушерская патология) связаны с выработкой в организме антител аутоиммунного происхождения, реагирующих с отрицательно заряженными фосфолипидами, в частности, с кардиолипином. Установлено, что связывание таких антител с фосфолипидами происходит только при участии (52-гликопротеина-1, белка плазмы, вовлеченного в процессы свертывания крови (McNeil Н. et al, 1990; Galli М. et al, 1990). Мишенью антифосфолипидных антител аутоиммунного происхождения в настоящее время считают либо белок prgpt, либо его комплекс с анионными фосфолипидами (Roubey R., 1996). Актуальным является обнаружение антигенных эпитопов Prgpl, распознаваемых аутоиммунными антителами, и использование соответствующих синтетических пептидов для понимания механизмов возникновения аутоиммунной патологии на молекулярном уровне .

Работа выполнена в рамках Федеральной научно-технической программы на 1996-2000 годы "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники гражданского назначения". Код приоритетных направлений 0.1 и 0.5, код направления в составе подпрограмм 0.8 (технология синтетических пептидных препаратов). Исследования поддержаны Российским Фондом Фундаментальных Исследований (грант № 96-04-49388). Цель работы. Диссертационная работа посвящена анализу антигенной структуры белка Pi-gpl с помощью компьютерных программ, выбору потенциальных антигенных детерминант, синтезу соответствующих пептидов, их модификации и исследованию антигенных свойств полученных соединений.

Научная новизна. Впервые синтезированы и охарактеризованы 9 пептидных фрагментов Prgpl (перекрыто около 50% последовательности белка). Применен удобный метод модификации пептида с N-конца на твердой фазе остатками жирных кислот разной длины; показана возможность анализа липофильных пептидных аналогов методом ВЭЖХ на обращенно-фазном носителе Lichrosorb RP-2. Разработан способ получения мультиплетного антигенного пептида (MAP) с высоким выходом целевого продукта, не требующий сложной очистки вещества.

Показана специфичность последовательности РЬе-СуБ-Ьуз-Азп-ЬуБ-Ои-Ьуз-Ьув-

соответсгвии данной последовательности одному из антигенных эпитопов белка Р2-5р1. Показана принципиальная возможность применения в твердофазном синтезе аРтос-аргинина, незащищенного по Ы-гуанидиновой функции.

Практическая ценность работы. Изучение антигенных свойств синтезированных соединений позволяет глубже понять механизмы, определяющие влияние белка ¡З2-др1 на связывание антифосфолипидных антител с антигеном, а также молекулярные механизмы возникновения антифосфолипидного синдрома. На основе

полученных синтетических . антигенов возможно развитие диагностики аутоиммунных заболеваний. Положения, выносимые на защиту.

1) Выявление антигенных эпитопов белка Рг-£р1 с помощью теоретических и экспериментальных методов.

2) Твердофазный синтез 9 неописанных ранее в литературе потенциальных антигенных детерминант белка р2-ср1.

3) Модификация синтезированных пептидов остатками жирных кислот на твердой фазе и анализ липофильных пептидных аналогов методом ВЭЖХ.

4) Выяснение структурно-функциональных зависимостей при изучении антигенной активности аналогов пептида УШа.

5) Получение искусственных пептидных антигенов на основе наиболее иммунологически активного пептида.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на межинститутском семинаре в Институте экспериментальной кардиологии РК НПК МЗ РФ. Публикации. Материал диссертации представлен в 6 статьях.

машинописного текста и состоит из введения, литературного обзора, посвященного методам поиска антигенных детерминант белков с известной первичной структурой, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, списка цитируемой

СуБ-Бег в реакции с антифосфолипидными антителами, сделан вывод о

Объем и структура работы. Диссертация изложена

страницах

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Гликопротеин плазмы (Зг-gpl состоит из 326 аминокислот, его оследователыюсть установлена рядом исследователей (Lozier J. et al, 1984; teinkasserer A et al, 1991). Механизмы, определяющие влияние этого белка на аязывание антифосфолипидных антител с фосфолипидами, изучены недостаточно, уществуют различные взгляды на природу антигенного эпитопа, с которым вязываются антифосфолипидные антитела. Некоторые авторы полагают, что эти нтитела направлены к комплексу белка Рз-gpl с фосфолипидом (McNeil H. et al, 990). Другие считают, что мишенью антител является неоантиген, открывающийся а белке после его взаимодействия с фосфолипидом (Jones J., 1992). Многие сследователи склоняются к тому, что белок Prgpl является истинным антигеном ля антифосфолипидных антител (Galli M. et al, 1990; Arvieux J. et al, 1991; Tincani A. t al, 1996). Локализация антигенных эпитопов в белке P2-gpI остается [искуссионной. Ряд авторов считает, что антигенные эпитопы в нативном белке :крьггы и экспонируются в 3-4 доменах Prgpl при его связывании с фосфолипидом [ерез 5-й домен (Igarashi M. et al, 1996). Было показано, что подвергнутый ферментативному расщеплению по связи Lys317- Thr318 белок prgpl теряет :пособность к связыванию с кардиолипином и антикардиолипиновыми антителами Hunt J. et al, 1994). Нам представлялось интересным проанализировать всю тоследовательность белка с целью выявления возможных иммунодоминантных участков.

[.Компьютерный анализ антигеиной структуры белка B^gpl и выбор потенциальны» антигенных детерминант.

Для анализа аминокислотной последовательности белка и выбора потенциальных антигенных эпитопов был использован коммерческий пакет программ "Microgenic sequence analysis program", в котором применены известные методы предсказания иммунодоминантных структур:

• метод предсказания гидрофильности участков аминокислотной последовательности (Hopp&Woods, 1981)

• метод предсказанпя подвижности а-углеродного атома аминокислот, входящих в полипептидную цепь (KarpIus&Shulz, 1985)

5

• метод, учитывающий частоту встречаемости различных аминокислот в известных антигенных детерминантах (Welling G. et al, 1985).

В результате компьютерного анализа были получены диаграммы (рис.1) и с учетом максимальных параметров каждой из них выбраны потенциальные антигенные детерминанты и синтезированы пептиды:

1-10 Gly-Arg-Thr-Cys-Pro-Lys-Pro-Asp-Asp-Leu IV

1-13 Gly-Arg-Thr-Cys-Pro-Lys-Pro-Asp-Asp-Lcu-Pro-Phc-Scr V

96-112 Tyr-Leu-Asn-Gly-Ala-Asp-Cys-Ala-Lys-Cys-Thr-Glu-Glu-Gly-Lys-Trp-Ser VI

120-138 Pro-Ile-ilc-Cys-Pro-Pro-Pro-Scr-Ilc-Pro-Thr-Phe-Ala-Thr-Lcu-Arg-Val-Tyr-Lys VH

280-289 Phe-Cys-Lys-Asn-Lys-Glu-Lys-Lys-Cys-Ser Vill

313-326 Leu-Ala-Phe-Trp-Lys-Thr-Asp-Ala-Ser-Asp-Val-Lys-Pro-Cys IX

268-279 Lys-Asn-Gly-Met-Lcu-His-Gly-Asp-Lys-Vai-Ser-Phe X

249-267 Val-Lys-Lys-Ala-Thr-Val-Vd-Tyr<}ln-Gly-GIu-Arg-Val-Lys-Ile-Gln-Glu-Lys-Phc XI

200-220 Pro-Ala-Lys-PrcbThr-Leu-TvT-Tyr-Lys-Asp-Lys-Ala-Ibr-Phe-GIy-Cys-His-Asp-Gly-Tyr-Ser XII

2.Chiitci пептидов.

Пептиды IVa - Xlla (с Acm-блокированной сульфгидрильной функцией цистеина) были синтезированы твердофазным методом на автоматическом синтезаторе Applied Biosystems, модель 431А с использованием коммерческих Fmoc-аминоацилполимеров (смола Ванга, степень замещения 0.5 - 0.7 ммоль/г). Для блокирования а-аминофункции применяли Fmoc-rpynny, отщепляемую после каждого шага синтеза действием 20% пиперидина б NMP. Для блокирования функциональных групп боковых цепей использовались кислотолабильные защиты /яре/я-бутильного типа - Вое для остатка лизина и В и1 для серина, треонина, ОВи -для аспарашновой и глутаминовой аминокислот. Для защиты гуанидиновой функции аргинина вводилась Mtr-группа, для блокирования сульфгидрильной функции остатков цистеина - Асш-зашита, для защиты имидазольного кольца гистидина - тритильная фуппа. Триптофан использовали с незащищенной боковой функцией. Конденсацию Fmoc-аминокислот (10-кратный мольный избыток) с полимером проводили карбодиимидным методом в присутствии эквивалентного количества

1 , . 1 л, ,1. 1

ГЦ [, 0 Г| ¡1 (г 1 ( Г(| 1 1 1 - 1

5(1 10» 150 2(Ю 250 3(Х> 350 Аминокислотный остаток.

Рис 1 Профили гидрофильности (а), подвижности а-углсродного атома (б) н частоты встречаемости различных аминокислот в известных антигенных детерминантах (в) для Р;-гликопротсина-! Заштрихованные участки соответствуют синтезированным пептидам

HOBt, в NMP. Аспарагин и глутамин присоединяли в виде н-нитрофениловых активированных эфиров. При синтезе всех пептидов, кроме IXa, пептидную цепь наращивали ступенчато по одной аминокислоте. В случае синтеза пептида IXa, содержащего на С-конце фрагмент -Pro-Cys, склонный к образованию дикетопиперазина, было решено во избежание этой побочной реакции на втором шаге синтеза присоединить к Суз(Аст)-полимеру пептидный фрагмент Fmoc-Val-Lys(Boc)-Pro-OH (Ш). Трипептид синтезировали в растворе методом активированных N-гидроксисукцинимидных эфиров с использованием Na-солей соответствующих аминокомпоненгов в водно-органической среде. По окончании синтеза Z-защита с трипептида снималась каталитическим гидрогенолизом, полученный продукт очищали с помощью ВЭЖХ и превращали в N'VFmoc-производное действием FmocONSu с удовлетворительным выходом (71%). Трипептид присоединяли DCC/HOBt - методом, полноту протекания конденсации определяли реакцией с нингидрином. По окончании синтеза пептиды от носителя отщепляли действием TFA в присутствии этандитиола, тиоанизола, фенола и деионизованной воды, одновременно удалялись боковые защитные группы, кроме S-ацетамидометильной. Содержание целевых соединений в продуктах синтеза после деблокирования, по данным аналитической ВЭЖХ, составляло 60 - 90% (табл.1). Количество наиболее заметных примесей в неочищенных продуктах составляло при этом 5-8% (см. рис.2а), за исключением пептида Vila, который помимо основного вещества (80%) содержал единственную примесь в количестве 19% (рис.2б). Выделенные вещества были проанализированы с помощью аминокислотного анализа. Основное вещество имело корректный аминокислотный состав, а примесь содержала 2 вместо 3 остатков изолейцина. Хроматограмма очищенного пептида Vila представлена на рис.2в.

Все синтезированные соединения подвергались очистке методом ВЭЖХ на обращенной фазе, пептид Va очищали на колонке с Toyopearl HW-40 в 2% уксусной кислоте. Все вещества получены с относительно высокими выходами - 34-65% в расчете на стартовую аминокислоту, присоединенную к полимеру. Гомогенность всех полученных соединений была подтверждена методом ВЭЖХ, пептиды были охарактеризованы данными количественного аминокислотного

анализа и масс-спектрометрии; молекулярные массы н аминокислотный состав веществ соответствовали ожидаемым значениям (табл.1).

Нами были также получены БН-формы пептидов: 1У-У1 и У111-1Х. Для отщепления Асш-защитных групп применялся ацетат ртути (2 экв. на каждую БН-функцию) в 30% уксусной кислоте. За 1.5-2 ч достигалось количественное

Лпо

(а)

(6)

0.5-

I) 10 20 30 0 10 20 30 0 10 20 J0

Рис.2. ВЭЖХ сырых продуктов твердофазного синтеза Villa (а) и Vila (б) после деблокирования пептидилполимера и очищенного Vila (в). Условия: колонка 4.6 х 250 мм (Ultraspherc ODS) (Beckman, США); элюция градиентом буфера Б в буфере А в течение 30 мин (буфер А - 0.05 М KH:PCh, pH 3.0 ; буфер Б - 70% ацетонитрила + 30% буфера А), скорость потока 1 мл/мин; детекция при 220 нм. Градиент составлял 0 -> 70% (а): 30 -> 80% (б.в).

деблокирование БН-групп. Для последующего удаления ионов ртути использовался 20-кратный избыток 2-меркаптоэтанола. После деблокирования БН-функций пептиды обессоливали на колонке с сефадексом С-10 в 2% уксусной кислоте. Полноту отщепления Асш-групп контролировали с помощью ВЭЖХ на

Таблица 1. Характеристики

Пептид Данные аминокислотного анализа * ВЭЖХ" Время удерживания, мин Содержание целевого пептида, % Данные ESI-MS, Мг (в скобках расчетная мол. масса) Выход, %"* ta], град (с i, н:о;

IVa IV D 1.8 (2); T 0.5(1); G 1.2 (1); L 1.0 (1); К 0.96 (1);R 0.7(1) 14.51 15.15 76 91 1172.1 (1172.3) 60 91 -30.05

Va V D 2.0 (2); T 0.5 (1); G 1.1 (1); L 1.0 (1);F i.ox (1); К 1.01(1), R 0.97(1) 19.81 20.13 90 88 1503.5 (1503.7) 54 80 -99.00

Via VI N+D 2.04 (2): T 0.9 (1);E 2.4(2); G 1.99 (2); А 2.08 (2); L 1.0(1); Y 0.9(1); К 2.02 (2) 18.10 19.32 60 91 2017.5 (2017.2) 35 75 -43.33

Vila T 1.6 (2); S 0.8(1); А 0.7(1); V 1.2(1); I 2.86(3); L 1.0(1); Y 1.2(1); F0.95(1);K 1.4(1); R 0.5(1) 17.01 79 2184.3 (2184.7) 39 -132.50

Villa К 1.1 (1);S 0.6 (I); E 1.2 (1);F 1.0(1);K 3.7(4) 12.61 82 1356.2 (1356.6) 62 -32.33

VIII 13.30 89 52

IXa D 1.9 (Z); T 0.92 (I); S 0.96 (I); A 1.6 (2); V1.03(1);L1.0(1);K.1.8(2) 16.08 78 1651.8(1651.9) 65 -28.50

IX 17.35 92 80

X D 1.94 (2); S 0.4 (1); G 2.14(2); V 1.0 (1); M 1.2 (1);L 1.1 (1);F 1.08 (1);H 0.94(1); К 1.99(2) 14.60 79 1332.5 (1332.7) 45 -40.80

XI T 0.7 (1); E 3.5(4);G 1.0 (1); A 0.9(1); V 3.7 (4); 1.4(1); Y 1.09 (1);F 1.4(1); K4.5(4);R1.2(1) 13.82 58 2250.4(2250.7) 47 -76.51 (с 0.7)

Xlla A1.8 (2); K2.7(3); T1.6(2);L1.01(1);Y2.5 (3);D 1,8(2);F 1,0( 1 );G 1. 8(2):H1.2(1); S 0.61(1) 13.18 53 2433.2(2433.7) 34 -62.0 (с 0.25)

•Анализ образцов, гидролизованных бн.НСЬ с 2% тиогликолевой кислоты, при 110°С в течение 24 и 48 ч фоводили на автоматическом анализаторе Biotronik LC 5001 (Германия). Cys, Pro и Тгр не определяли. ** Аналитическая обращенно-фазовая ВЭЖХ на колонке 4.6 х 250 мм (Ultrasphere ODS) (Beckman, США); яюция градиентом буфера Б в буфере А в течение 30 мин (буфер А - 0.05 М КН2РО4, pH 3.0 ; буфер Б -г0% анетонитрила + 30% буфера А), скорость потока 1 мл/мин; детекция при 220 нм. Градиент составлял 10 -> 70% для пептидов IVa-Vla, Х-ХИа; 30 -> 80% для пептида Vila; 0 ->60% для пегггидов VIII - Villa; 20 ->80% для пептидов IX-LXa.

*** Выход S-Acm-пептидов определен в расчете на стартовую аминокислоту после очистки методом; выход >Н-пе1Ш1дов - в расчете на Асш-производное.

обращенной фазе в условиях, обеспечивающих полное разрешение пиков, соответствующих защищенной и деблокированной формам пептида. Реакция деблокирования протекала однозначно, появления побочных веществ не наблюдалось, содержание основного вещества по данным ВЭЖХ в S-Acm- и SH-пептидах было практически одинаково и составляло 95-98%. Выходы целевых SH-пептидов после обессоливания были достаточно высоки и составляли 52-91% в расчете на Асш-производное.

З.Пуучеине антигенньи свойств синтезированных пептидов методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).

Для выявления антигенных эпитопов белка ßj-gpl с помощью синтетических пептидов был предложен модифицированный метод твердофазного нммуноферментного анализа (CL-ELISA), основанный на использовании в качестве антигена комплекса "кардиолипин - белок ßi-gpF' (Hunt J., Krilis S., 1994). В этом методе влияние синтетических пептидных фрагментов С-концевого домена ß:-gpl на связывание антикардиолипиновых антител с кардиолипином оценивалось по конкурентному ингибированию этого связывания в присутствии белка.

Следует отметить, что тестирование пептидов, описанных в настоящей работе, осуществлялось методом CL-ELISA двумя группами исследователей в лаборатории клинической иммунологии Кардиологического Научного Центра МЗ РФ и в Университете Нового Южного Уэльса (Австралия). Реакции проводили в 96-луночных планшетах, для тестирования использовали S-Acm-пептиды и полностью деблокированные пептиды. В качестве источника

т

антикардиолипиновых антител (IgG) использовали плазму больного с тяжелыми проявлениями антифосфолипидного синдрома. Контрольным экспериментом являлось связывание антикардиолипиновых антител с комплексом кардиолипина и белка, принятое за 100% (оптическая плотность 0.9-1 опт. ед. при А=492 нм).

Тестирование синтезированных пептидов в данной системе в интервале концентраций 5-25 мкг на лунку показало, что максимальным ингибирующим эффектом обладает пептид Villa, поэтому было изучено влияние более широкого диапазона концентраций данного пептида (0.5 - 100 мкг на лунку) на связывание

антикардиолипиновых антител с кардиолипином и белком (рис.3). Видно, что с увеличением содержания пептида в смеси связывание уменьшается, достигая минимальных значений при концентрациях более 85 у на лунку. Исходя из полученных результатов, для изучения ингибирующего эффекта синтетических пептидных фрагментов (Ъ-Вр! на связывание антикардиолипиновых антител с кардиолипином была выбрана концентрация пептида 145 у (1.7 мг/мл)на лунку.

Рис. 3. Дозовал зависимость влияния пептида Villa на реакцию актнкарднолипнновых антител с кардиолипином и белком Prgp' в CL-ELISA. Контрольный эксперимент -связывание антикардиолипиновых антител с кардиолипином в присутствии белка |3^-цр1, принятое за 100% (Опт. пл. 0.9-1 опт. ед. при А=492 нм). Эксперимент был проведен в лаборатории клинической иммунологии Российского кардиологического центра МЗ РФ группой с.н.с Тищенко В.А.

Результаты исследования реакции 1уО-фракции плазмы больного с антифосфолипидным синдромом с кардиолипином и ¡Зг-ёР' в присутствии синтетических пептидных фрагментов этого белка приведены на рис.4. Из представленных данных следует, что пептид УШа способен на 98% подавить связывание антикардиолипиновых антител с кардиолипином в присутствии глнкопротеина. Заметный ингибирующий эффект проявили N1- и С-концевые фрагменты Рг-^др!■ Так, пептид V подавил связывание антикардиолипиновых антител с кардиолипином на 46%, а пептид IX - на 72% от контроля.

пептид

Рис.4. Связывание антикардиолипиновых антител с кардиолипином и белком в

присутствии синтетических пептидов: а) IV - IX. Контрольный эксперимент -связывание белка Рг£р! с антикардиолипиновыми антителами и кардиолипином, принятое за ¡00% (Опт.пл. 0.9-1 опт. ед. при А=405 нм). Исследования выполнены в Умипсрсшсге Некого Южного Уэльса (Апстралия) пол руководством профессора С.Крилиса; б) Х-ХИа. Контрольный эксперимент - связывание антикардиаитиковых антител с кардиолипином в присутствии белка Ргйр!, принятое за 100% (Опт. пл. 0.9-1 опт. сд при Л-492 нм). Эксперимент был проведен в лаборатории клинической иммунологии Российского кардиологического центра МЗ РФ группой с.н.с Тищенко В А.

Результаты тестирования пегггидов Х-ХИа представлены на рис.4б. Видно, что пептиды X, XI и Xlla подавляют связывание IgG-фракции с кардиолипином и белком на 29, 42 и 25% соответственно. Из рис.4а также видно, что Аст-блокированные и SH-формы пептидов V, VI и IX проявили разную антигенную активность. Подавление связывания аКЛ с кардиолипином пептидами V, IX, X, XI и ХНа согласуется с данными других исследователей, предположивших наличие антигенных детерминант в соответствующих участках fr-gpl (Wang M. et al, 1995; Lauer S. et al, 1993; TakeyaH. et al, 1997).

Ранее было показано, что пептиды из последовательности 5-го домена белка prgpl, содержащие последовательность Cys281 - Cys288 с высоким положительным зарядом, подавляли связывание антикардиолипиновых антител с кардиолипином и белком (Hunt J., Krilis S., 1994). Результаты нашего тестирования показали, что наибольшую активность проявил пептид Villa, в который входит указанная последовательность. Представлялось интересным выяснить, обусловлено ли связывание пептида Villa с антикардиолипиновыми антителами только высоким положительным зарядом лизиновых остатков, либо оно специфично для данной аминокислотной последовательности. Для этого мы синтезировали ряд структурных аналогов пептида Villa.

4. Синтез структурные аналогов пептида FCKNKEKKCS.

Изучение специфичности данной последовательности в реакции с антителами.

Для более подробного изучения влияния последовательности FCKNKEKKCS на связывание антикардиолипиновых антител с кардиолипином и белком Prgpl нами был синтезирован циклический дисульфид VIII6. Изучение антигенных свойств данного соединения представляет интерес, поскольку в литературе дискутируется вопрос о локализации одной из дисульфидных связй белка Pz-gpl либо между Cys281 и Cys288 (Lozier J. et al, 1984), либо между Cys288 и Cys326 (Steinkasserer A. et al, 1992). Замыкание дисульфидного мостика в пептиде VIII проводили удобным и технологичным способом, предложенным нами ранее, с помощью перекиси водорода в водном растворе ацетата аммония при рН 6.5-7.5. Выход целевого продукта был высоким - 90%, не было отмечено существенного

образования каких-либо побочных продуктов. По окончании циклизации реакционную смесь подкисляли уксусной кислотой, концентрировали и обессоливали с помощью гель-фильтрации на сефадексе G-10.

Тестирование циклического дисульфида VI1I6 описанным выше методом показало, что он проявляет значительно меньшую ингибирующую активность по сравнению с S-Acm-защищенным пептидом Villa - 52% от контроля (рис.4). Более низкая активность пептида VIII6 согласуется с данными группы авторов, показавших, что Cys28! связан дисульфидным мостиком с Cys™, а не с Cys2"1 (Steinkasserer A. et al., 1992).

Для оценки влияния положительного заряда лизиновых остатков на связывание пептида Villa с антителами нами был синтезирован его аналог с аргинином в 3-м положении: FC(Acm)RNKEKKC(Acm)S (ХШа), имеющий более высокий положительный заряд по сравнению с пептидом Villa.

W

—Г

Л 210

0.5

(б)

т

ю

20

30

■(О

20

30 мин

Рис.5. ВЭЖХ пептида ХШа : а) продукт твердофазного синтеза; 6) очищенный пептид ХШа. Условия: колонка 4.6 х 250 мм (Ultrasphere ODS) (Bcckman, США); элю низ градиентом 0-+60% буфера Б в буфере А в течение 30 мин (буфер А - 0.05 М КН;РОд, pH 3.0 ; буфер Б - 70% ацето нитрида + 30% буфера А), скорость потока 1 мл/мин; детекция при 220 нм.

Пептид синтезировали твердофазным методом на приборе Applied Biosystems 431 А по стандартной программе. Аргинин присоединяли в виде Fmoc-производного с протонированной гуанидиновой функцией (в качестве протонирующего агента использовали бромгидрат пиридина) DCC/HOBt - методом. По окончании синтеза пептид отщепляли от полимера действием смеси трифторуксусной кислоты и водь (9.5: 0.5). По данным аналитической обращенно-фазной ВЭЖХ, неочищенный продукт синтеза содержал два основных вещества - 69% и 25% (рис.5). Вещества были разделены методом ВЭЖХ на обращенной фазе и проанализированы методами количественного аминокислотного анализа и масс-спектрометрии. Основное вещество имело корректный аминокислотный состав и молекулярный вес, примесь не содержала аргинина Вероятно, для исчерпывающего присоединения а-Ртос-№-незащищенного аргининового остатка необходим тщательный подбор условий конденсации. Эта проблема выходит за рамки данного исследования, однако, нами показана принципиальная возможность применения в твердофазном синтезе a-Fmoc-аргинина, незащищенного по гуанидиновой функции. Характеристики полученных веществ приведены в табл.2. Пептид ХШа был протестирован методом твердофазного иммуноферментного анализа CL-ELISA и ингибировал связывание антител с кардиолипином и белком лишь на 20%. Эти результаты и результаты тестирования циклического дисульфида VIII6 (рис.4а) свидетельствуют о специфичности природной последовательности FCKNKEKKCS в распознавании ее антикарднолипиновыми антителами и позволяют сделать вывод о том, что данная последовательность входит в состав антигенного эпитопа белка Pr-gpl-

б.Синтез и биологические свойства искусственных янтнгенов на основе пептида, соответствующего последовательности 280-289 белка В?-ег>1. Попытка использования пептида Villa (FC(Acm)KNKEKKC(Acm)S) в качестве антигена в CL-ELISA вместо белка Prgpl не дала положительного результата. Поэтому с целью повышения антигенных свойств данного пептида мы решили синтезировать несколько искусственных антигенов на его основе.

Таблица 2. Характеристики структурных аналогов пептида Villa.

Пептид Данные аминокислотного анализа* ВЭЖХ, время удерживания, мин. ** Содержание целевого пептида в реакционной смеси по ВЭЖХ, % Данные ESI-MS [М+НГ, (в скобках расчетная мол. масса) Выход, % ***

VIII6 FCKNKEKKCS 1 1 N1.1(1), S 0.6 (1),E1.2(1),F 1.0(1),КЗ.7(4) 13.0 98 1213.5(1212.5) 90

XHIa FCRNKEKKCS Аст Асш D1.03(1),S0.8 (1),E1.2(1),F (1);K3.I(3), R 0.8(1) 13.17 69 1387.2 (1384.2) 32

XIV FCNKEKKCS Аст Аст N 0.99(1), S0.7 (1), E 1.2(1), F1.0 (1),K3.1(3) 13.45 25 1229.1 (1228.7) 13

* Cys, Pro не определяли

** Аналитическая сбргщенно-фазовая ВЭЖХ на колонке 4.6 х 250 мм (Ultrasphere ODS) (Beckman, США); элюция градиентом 0->60% буфера Б в буфере А в течение 30 мин (буфер А - 0.05 М КН2РО4, pH 3.0 ; буфер Б - 70% ацетонитрила + 30% буфера А), скорость потока 1 мл/мин; детекция при 220 нм.

*** Выход V1IIS приведен в расчете на SH-производное; выход ХГОа в расчете на стартовую аминокислоту полимера.

Известен ряд способов получения антигенных конструкций: конъюгация с белками, полиаминокислотами, синтетическими полиэлектролитами; включение пептидов, ацилированных высшими жирными кислотами, в состав мицелл, синтез мультиплетных антигенных пептидов (MAP) в виде "дендримеров" . Из перечисленных структур MAP имеют ряд преимуществ: наиболее высокую гагггенную плотность, заданную молекулярную структуру; они высокоспецифичны и подобны небольшому белку с молекулярной массой более 10 кДа. Было показано также, что мультиплетные антигенные пептиды значительно повышают чувствительность иммунсферментного анализа при использовании низкоаффинных и поливалентных антител (Tarn J., Zavala F., 1989). Именно к такому типу относятся антикардиолипиновые антитела.

Нами была предпринята модификация пеггпща Villa с N-конца остатками капрнновой, лауриновой, миристиновой, пальмитиновой и стеариновой кислот, конъюгация его с BSA и синтез октавалентного MAP с гептализиновым ядром, содержащего восемь копий пептида Villa (схема).

Модификацию пептида было решено провести непосредственно на твердой фазе. Такой способ очень удобен, т.к. позволяет исчерпывающе провести реакцию ацилирования за счет применения больших избытков ацилирующего агента, одновременно снимая проблему растворимости ацилпептида. Дня модификации пептида Villa использовали пептидилполимер, полученный ранее.

Остатки жирных кислот присоединяли к пептидилполимеру в виде соответствующих ONSu-эфиров в присутствии HOBt, на автоматическом твердофазном синтезаторе Applied Biosystems 431 А. ONSu-эфир стеариновой кислоты был получен реакцией хлорангидрида стеариновой кислоты с N-гидроксисукцинимидом, а ONSu-эфиры остальных жирных кислот синтезировали с помощью N-трифторацетоксисукцинимида (реагента Сакакибары). Гомогенность полученных липофильных аналогов Acyl-(VHIa) была подтверждена методами ТСХ и ВЭЖХ на обращенной фазе; анализ синтезированных веществ методом масс-спекгрометрии показал, что молекулярные массы соответствуют ожидаемым значениям (табл. 3).

Lvs

Lys - NH-(CH2)3-COOH

Схема. MAP на основе пептида Villa (соединение XXI).

Следует отметить, что анализ липофильных пептидных аналогов методом ВЭЖХ является особой проблемой вследствие их высокой гидрофобности, затрудняющей десорбцию с обращенно-фазных носителей, стандартно используемых при анализе пептидов. Нам удалось проанализировать соединения XV-ХТХ на носителе ЬюЬгозогЬ ИР-2 в условиях, указанных при рис.6. Полученные масс-спектрометрические и хроматографнческие характеристики липофильных аналогов п егггида УШа подтверждают, что примененный нами метод синтеза позволяет получать высокоочищенные соединения.

Таблица 3. Характеристики липофильных аналогов Acvl-(VIIIa).

Соединение (Acyl) Данные ESI-MS [М+ЦГ, (в скобках расчетная мол. масса) ВЭЖХ, R, мин* ТСХ , Rf ** Выход, % ***

А Б

XV (Сар) 1511.5(1510.5) 9.38 0.31 0.27 46.9

XVI (Lau) 1540.2(1538.5) 11.64 0.34 0.30 50.8

XVII (Муг) 1567.2(1566.6) 13.51 0.35 0.32 54.5

XWI (Palm) 1595.4 (1594.6) 15.71 0.37 0.33 49.1

XIX (Ste) 1623.4 (1622.7) 17.18 0.39 0.35 44.8

* Аналитическая ВЭЖХ в условиях: колонка 4.6 х 250 мм Alltech (Lichrosorb RP-2); градиентная элюция буфером Б в буфере А (буфер А - 0.1 % TFA, буфер Б - 70% ацетогаприла в буффе А) 30 —> 90 % Б в течение 30 мин; скорость элюцни 1 мл/мин, детекция при 220 им.

** ТСХ осуществляли на хроматографнческих пластинках Kieselgel 60 ( Mcrck, Германия) в системах растворителей : бутанол - пиридин - уксусная кислота - вода, 21:12:2:15 (А); бутанол - пиридин - уксусная кислота - вода, 30:20:6:2 (Б). Вещества обнаруживали на пластинках с помощью хлорбензидкнового реагента или иода. *** Выход приведен в расчете на стартовую аминокислоту пептида.

Рис.6. ВЭЖХ липофильных аналогов XV-XIX : а) XV (Сар), 6) XVI (Lau), в) XVII (Муг), г) XVIII (Palm), д) XIX (Stc). Условия : колонка 4.6 х 250 мм Alltcch (Lichrosorb RP-2); градиентная элюция буфером Б в буфере А (буфер А - 0.1 % TFA, буфер Б - 70% ацетонитрила в буфере А) 30 —» 90 % Б в течение 30 мин; скорость элюции I мл/мин, детекция при 220 нм.

Соединение XX (конъюгат BS А с пептидом Villa) получали реакцией N-оксисукцинимидного эфира сукцинилированного белка с Аст-защищенным пептидом; активированный эфир BSA синтезировали с помощью реагента Сакакибары. Эпитопная платность конъюгата рассчитывалась по данным аминокислотного анализа и составила 0.065 мкмоль пептида на I мг конъюгата.

Синтез соединения XXI - мультиплетного антигенного пептида - был осуществлен твердофазным методом, с использованием Fmoc-техники. В качестве носителя был применен н-алкоксибензильный полимер ("смола Ванга") с содержанием гидроксиметильных групп 0.45 ммоль/г. В качестве "ножки" использовали е-аминокапроновую кислоту, остаток которой вводили в полимер в виде Fmoc-производного. Количества реагентов брали с таким расчетом, чтобы

20

получить полимер со степенью замещения 0.04 ммоль/r. Конденсацию Fmoc-Aca-ОН с полимером осуществляли с помощью эквивалентных количеств DIPCDI и DMAP. Свободные гидроксильные функции полимера ацетилировали действием уксусного в присутствии DIPEA. Синтез разветвленного гептализинового ядра проводили в сосуде для ручного твердофазного синтеза, в димегилформамиде. Каждый новый уровень ядра получался путем введения №,Н*-ди-Ртос-лизина. Содержание NH2-rpynn носителя возрастало по схеме: 0.04—>0.08—>0.16—>0.32 ммоль/r за счет удвоения количества реакционноспособных а- и s-аминогрупп лизина после деблокирования. Активацию FmocLys(Fmoc)OH (10-кратный избыток) проводили в присутствии эквивалентного количества DIPCDI/HOBt в DMF. Fmoc-группу после каждого шага синтеза отщепляли действием 30% пиперидина в DMF. Конечное содержание аминогрупп (FmoCeLys7)Aca-nonnMepa, определенное с помощью спектрофотометрии по поглощению дибензофульвенового аддукта, составило 0.31 ммоль/г, что близко к ожидаемому. Полученное "ядро" далее использовали в качестве подложки для твердофазного синтеза соединения XXI. Синтез проводили в автоматическом твердофазном синтезаторе Milligen Biosearch 9600, по стандартной программе, с использованием a-Fmoc-амииокислот для создания пептидной цепи. Попытка отщепления целевого продукта от полимера действием TFA оказалась неудачной, т.к. данный метод позволил деблокировать только 10% вещества. Повторная обработка пептвдилполимера смесью TFA с 10%TFMSA, в присутствии тиоанизола, дала возможность полностью отщепить целевой продукт от полимера. Для очистки соединения XXI были применены последовательный диализ против 0.9% NaCl, затем против воды, а также гель-фильтрация на сефадексе G-50. Очищенный MAP был охарактеризован данными количественного аминокислотного анализа.

Доя оценки антигенных свойств синтезированных соединений был применен метод CL-EL1SA, описанный выше. Свойства синтетических антигенов изучались как в прямом, так и в конкурентном тестах.

Мультиплетный антигенный пептид XXI проявил связывание с антикардиолипиновыми антителами, подобно белку (Ь-gpI (рис.7а, б), в то время

Il

a

б

г

A

Рис.7. Связывание антикардиолипиновых антител с кардиолипином в присутствии: а) белка Prgpl (контрольный эксперимент," опт. пл. 0.7 ± 0.04 опт. сд. при А =492); б) соединения XXI: в) конъюгата XX; г) белка p:-gpl и соединения XXI; д) белка Prgpl и коиъюгата XX. Представлены усредненные данные 4-х экспериментов (лаборатория клинической иммунологии КНЦ МЗ РФ).

как соединение XX не проявило антигенной активности (рис.7в). В присутствии белка Prgpl соединения XX и XXI подавили связывание гликопротеина с антикардиолипиновыми антителами на 36% (рис.7г,д).

Полученные нами данные подтверждают, что участок белка Prgpl (280-289) соответствует одному из его антигенных эпитопов. Основной причиной проявления разной активности соединениями XX и XXI в реакции с антикардиолипиновыми антителами в присутствии белка Pi-gpl может быть различие в химической структуре данных веществ. Так, в конъюгате XX пептид Villa присоединен к BSA преимущественно а- и частично е-аминогруппами, в то время как к лизиновому ядру мультиплетного антигена молекулы пептида присоединены своими С-концевыми карбоксильными группами, что, вероятно, позволяет полностью реализовать специфичность аминокислотной последовательности пептида Villa.

К сожалению, оценить антигенность липофильных аналогов XV-X1X нам не удалось, т.к. жирные кислоты и ацилпептиды плохо растворялись в водных буферных системах, используемых в данном методе анализа, и полученные результаты было трудно интерпретировать. Пальмитоильное производное XVIII было использовано для иммунизации экспериментальных животных; получены противопептидные антитела.

выводы.

1. С помощью компьютерного расчета по программе "Microgenic sequence analysis program" проведен анализ антигенной структуры белка ßz-gpl, на основании которого выбраны 9 пептидов длиной от 10 до 21 аминокислотного остатка.

2. Синтезированы и охарактеризованы с помощью методов ВЭЖХ на обращенной фазе, масс-спектрометрии и количественного аминокислотного анализа 9 новых пептидов, соответствующих потенциальным антигенным детерминантам.

3. Методом твердофазного иммуноферментного анализа (CL-ELISA) определена антигенная активность полученных соединений. Показано, что пептиды V, Villa, IX, X, XI, ХПа в разной степени конкурируют с белком ßrgpl за связывание с антителами, направленными к комплексу "белок-кардиолипин". Пептид Vina

( Phe-Cys(Acm)-Lys-Asn-Lys-Glu-Lys-Lys-Cys(Acm)-Ser ) проявил наибольший ингибирующий эффект.

4. Осуществлен синтез двух аналогов пептида Phe-Cys-Lys-Asn-Lys-Glu-Lys-Lys-Cys-Ser : циклического дисульфида и аргининсодержащего аналога.

5. Синтезированы 5 липофильных аналогов пептида Villa и мультиплетный антигенный пептид с разветвленным лизиновым ядром, содержащий 8 копий соединения Villa.

6. На основании биологического тестирования синтезированных пептидных аналогов методом CL-ELISA установлено, что участок Phe-Cys-Lys-Asn-Lys-G!u-Lys-Lys-Cys-Ser соответствует одному из антигенных эпитопов белка ß2-gpl.

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

1. Палькесва М.Е., Сидорова М.В., Кузнецова Т.В., Кобылянский А.Г., Тищенко В.А., Насонов Е.Л., Беспалова Ж.Д., Евстигнеева Р.П. Синтез и исследование антигенных свойств пептидных фрагментов 3;-гликопротеина-1.// Биоорганическая химия - 1996 - Т.22, №9 - С.678-685.

2. Сидорова М.В., Кудрявцева Е.В., Антопольский М.Л, Палькеева М.Е., Овчинников М.В., Беспалова Ж.Д. Перекись водорола для замыкания дисульфидных связей в синтезе пептидов последовательности иммунодоминантного эпитопа гликопротеина gp41 ВИЧ.// Биоорганическая химия -1996 - Т.22, №4 . С.273-279.

3. Евстигнеева Р.П., Беспалова Ж. Д., Палькеева М.Е. Изучение антигенных свойств синтетических фрагментов гликопротеина Рг-gpl-// Доклады Академии Наук - 1998 -Т.360, № 6 - С.1-6.

4. Палькеева М.Е., Сидорова М.В., Молокоедов A.C., Кузнецова Т.В., Тищенко В.А., Кобылянский АГ., Беспалова Ж.Д, Насонов Е.Л., Евстигнеева Р.И Синтез и биологические свойства искусственных антигенов на основе пептида, соответствующего последовательности 280-289 белка ßrgpl-// Биоорганическая химия - 1998 - Т.24, №7 - С.502-508.

5. Кузнецова Т.В., Тищенко В.А, Кобылянский АГ., Сидорова М.В., Палькеева М.Е., Беспалова Ж.Д., Насонов EJL Влияние синтетических пептидных фрагментов ß2-gpl на связывание антифосфолипидных антител с кардиолигошом.// Бюллетень экспериментальной медицины и биологии.В печати.

6. Кузнецова Т.В., Тищенко В.А., Кобылянский АГ., Палькеева М.Е., Насонов Е.Л. Участие Эг-гликопротеина-1 во взаимодействии антикардиолипиновых антител с кардиолипином.// Терапевтический архив. В печати.