Синтез пептидов, включающих серусодержащие аминокислоты тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ
|
Кудрявцева, Елена Витальевна
АВТОР
|
||||
|
кандидата химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
|
Москва
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
|
1997
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
02.00.10
КОД ВАК РФ
|
||
|
|
||||
На правах рукописи
- 3 ЦЯ7
КУДРЯВЦЕВА ЕЛЕНА ВИТАЛЬЕВНА
СШ1ТЕЗ ПЕПТИДОВ, ВКЛЮЧАЮЩИХ СЕРУСОДЕРЖЛЩИЕ АМИНОКИСЛОТЫ.
02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
Москва - 1997
Работа выполнена в ТОО "Пептидный синтез" при Российском КарЬиологическом научно-производственном комплексе Минздрава медпрома РФ н на кафедре химии и технологии тонких органических соединений Московской Государственной Академии Тонкой Химической Технологии им. М. В. Ломоносова.
Научный руководитель: член-корреспондент РАН,
доктор химических наук, профессор Евстигнеева Р. П.
Официальные оппоненты:
доктор химических наук, профессор Ззонкова Е. Н,
кандидат химических наук Андреев С. М.
Ведущая организация: Институт молекулярной генетики РАН
Защита состоится & /
на заседании Диссертационного Совета Д 063.41.01
в Московской Государственной Академии Тонкой Химической
Технологии им. М.В. Ломоносова по адресу: 117371 г. Москва, пр. Вернадского, 86
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М. В. Ломоносова (119831, г. Москва, ул. М. Пироговская, 1)
Автореферат разослан / у _1997 г.
1> ченый секретарь Диссертационного Совета, кандидат химических наук,
старший научный сотрудник А А Лютик А. И.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.
Актуальность темы. Среди пептидов и белков, обнаруженных в природе,
соединения, содержащие цистеин, составляют особую группу. Днсулъфндные мостики, образованные остатками цнетеина, играют важную роль в стабилизации вторичной и третичной структур белковых и пептидных молекул, обеспечивают их фиксированную пространственную ориентацию, придавая тем самым уникальную форму, необходимую для осуществления биологических функций.
В настоящее время известны многие ннзкомолекулярные пептиды, содержащие в своей структуре I, 2 и более дисульфидных мостиков, принимающие участие в регуляции физиологических процессов организма. Синтетические пептиды, в том числе и содержащие ЗБ-свЯзи, получили широкое применение во многих областях ПСДКШППЛ « фармакологии. Многие из них используются для профилактики, диагностики и лечения различных заболеваний. В связи с этим чрезвычайно важна разработка методов, позволяющих получать такие соединения в препаративных количествах. В современной пептидной химии существует целый ряд способов синтеза соединений, содержащих 1, 2 и более ЭЗ-связей, но ни один из них не является универсальным. Циклизация зачастую проходит неоднозначно. Кроме внутримолекулярных, образуются межмолекулярные дисульфидные связи, в реакцию окисления вступают не только ЭН-группы, но и функциональные группы боковых цепей. Часто констатируют факт получения побочных продуктов, однако, информации об их структуре недостаточно. Поэтому исследования в этой области являются актуальными и могут представлять практический интерес.
Работа выполнена в рамках Федеральной научно-технической программы на 1996 - 2000 годы "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники гражданского назначения". Код приоритетных направлений 0.1 и 0.5, код направлений в составе подпрограмм: 0.6 (СПИД), 0.8 (технология синтетических пептидных препаратов). Исследования поддержаны грантом РФФИ № 96-04-49421.
Цель работы. Диссертационная работа посвящена исследованию в области синтеза ряда природных пептидов, содержащих в своей структуре 1 или 2 дисульфидные связи, таких, как гормона окситоцина, фрагментов нммуиояоминаятного эпитопа трансмембранного гликопротеина ер41 ВИЧ, атриальных и оазоконстрикториых пептидов.
Положения, выносимые на защиту.
1) Синтез и очистка линейных форм выбранных цистеинсодержащих пептидов.
2) Сравнительная оценка эффективности замыкания вв-мостиков следующими реагентами:
а) йодом в кислых и нейтральных условиях, изучение структуры побочных продуктов;
б) кислородом воздуха;
в) феррицианидом калия;
г) перекисью водорода.
3) Изучение возможности применения перекиси водорода для:
а) создания БЗ-связей в природных физиологически активных пептидах различной длины и структуры;
б) синтеза препаративных количеств окситоцина;
в) получения пептидов с двумя дисульфидиымн мостиками • эндотелина-1 и эндотелина-З; на примере эндотелина-1 изучить возможность применения Н2О1 для циклизации пептидов, содержащих ыегмонин.
Научная новизна. Впервые на примере синтеза пептида последовательности 593-603 белка яр41 ВИЧ-2 проведена сравнительная оценка применения некоторых известных реагентов (йода, кислорода воздуха, феррИциашща калия, перекиси водорода) для замыкания внутримолекулярных дисульфидных связей. Показало преимущество применения перекиси водорода. На осносашш зги* данных разработан способ, позволяющий просто, быстро и с высокий вькодои проводить циклизацию в физиологически активных пептидах, содарааацих чувепштельиые к
окислению аминокислоты: триптофан, мегпюшш, а также а пептидах, содержащих
Г4. '
по два дисульфидных мостика. На примере триптофансодержащего пептида 593603 ер41 ВИЧ-2 исследован процесс прямого превращения 8-ацетамидометшпащшценного (Аст) производного в соответствующий дисульфид при помощи йода. Выделены и идгитафг.акро&аиы ноше побочные продукты. П сказано, что при синтезе этого пептида конденсация фрагмента с С-копцевыы незамещенным аргинином в растворе Карбодтшпдаыы методом с добавками'Ы-гидроксибешотрйазола (ГЮС/НОВТ) о присутствия бромгплрата пнридтш (НВг'Ру) протекает без рацемизации.
Практичестсая ценность работы. Оптимизирована схема синтеза в^астворе пептидного антигена ВИЧ-2, Соответствующего последовательности 593-603 белка
gp41. Примените перекиси водорода на стадии создания ББ-свяэей позволило получать с выходом 50 - 90% препаративные количества (0.5 - 1.2 г) пептидов из последовательности иммуноломииантного эпитопа глнкопротсшш gp41 различных штаммов ВИЧ, которые входят в- состав отечественных диагностических наборов "Псптоскрин" н "Эпнтоп", применяемых в настоящее время в практическом здравоохранении. Разработанная методика применена для получения медицинского н ветеринарного окситоцина в укрупненном масштабе (до 20 г). Полученные в работе вазоконстрикторные пептиды - эндотелины-1 и -3, нашли применение в совместных работах с кафедрой фитологии МГУ им. М. В. Ломоносова (руководитель академик И. П. Ашмарин) по изучению их влияния на гемодинамику.
АпрЫУавап работы. Результаты работы докладывались на И Турецко -Узбекском Симпозиуме по химии природных соединений (Эскешехир, 1996 г.), на межлабораторном семинаре НИИ эксиерименальной кардиологии РКНПК (1997 г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на ^страницах машинописного текста и состоит из введения, литературного обзора, посвященного особенностям синтеза циклических гетеродины* цистеиисодержащих пептидов, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, списка цитируемой литературы, включающего / ^ наименований). Работа содержит/-<лаблим, схем, ' /рисунков.
РЕЗУЛЬТАТЫ РАВОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
Замыкание дисульфндных связей в сложных природных соединениях, содержащих в своей последовательности метионин, триптофан часто сопровождается побочными реакциями, а выходы циклических продуктов составляют не более 5-30 %. Объектами данной работы были выбраны физиологически активные соединения, имеющие практическое применение в медицине к ветеринарии, содержащие по I - 2 днеульфидиых мостш.а, в том числе включающие чувствительные к окислению аминокислотные остатки. Фрагменты белков вр41 ВИЧ:
Н - А*п - Чег - Тгр - СЛу - Су* - Д1а - РИе - Лгв - Фп - Уа1 - Суя - Н№ (ХШ) (593-603, ПИЧ-2, КОП):
H - Leu - Gly - Leu - Trp - Gly - CyJ - Ser • Gly - Lys - Leu - Ile - CyJ -NHEt (XVII) (598-609, BH4-I.Z3);
H - Leu - Gly - lie - Trp - Gly • Cys - Ser - Gly - Lys - His - lie - Cyi - NHEt (XVHI) (598-609, ВИЧ-I, ELI);
H-Trp - Gly - Cys - Ser.- Gly - Lys - Leu - lie - Cys -Thr - Thr - Ala - Val - Pro -Trp - Aw - Ala - OH (601-617, ВИЧ-I, BRU). (XXI)
Нейрогипофизарный гормон:
H-Cys-Tyr- Ile- Gin - Asn - Cys - Pro - Leu - Gly - NH2 (окситоцин) (XXII) Атриальные пептиды:
H - Ser-Ser-Cvs-Phe-Gly-Gly-Arg-11c-Asp-Arg-lie-Gly-Ala-Gin-Ser-Gly
►er - Cys t-Cyl-
- Leu - Gly - Cyi - Asn - Ser - Phe - Arg - ОН (атриопептин H (крысы)); (XXIV)
Ii- Ser - Ser - Сур - Phe - Gly - Gly - Arg - Ile - Asp - Arg - île - Gîy - Ala - Gin - Ser - Gly - Leu - Gly -Cys - Asn - Ser - Phe - Arg - Туг - ОН (атриопептин III (крысы)); (XXVI)
H - Ser - Leu - Arg - Arg - Ser - Ser - Cys - Phe - Gly - Gly - Arg - Fie - Asp - Arg - fie -Gly - Ala - Glti - Ser - Gly - Leu - Gly - Cy^- Asn - Ser - Piie - Arg - Tyr - OH (XXVHI) атрнальный натрийурстический фактор (t-28) (крысы) (r ANF (1-28)). ВазоконстрикторнЫе пептиды:
H-Cys- Ser - Cys - Ser - Ser - Leu - Met - Asp - Lys - Glu - Cys -Va! -Tyr - Plie - Cys -His - Leu - Asp - lie - lie-Trp-ОН (XXX)
(эндотелии-1 (ET-1 (человека, свиньи, собаки, крысы ));
H - Cys - Tltr - Cys - Phe - Ttií- - Туг - Lys - Asp -Lys -Glu - Cys - Vcl -Tyr -Tyr - Cyl -Ilis - Leu - Asp - Ile -Ile -Trp - ОН (эвдотелш-Э (ЕТ-3(человека, крысы» (XXX11) Линейные бис-Асш-производные пептидов, выделенные й тексте жирным шрифтом, были синтезированы в рамках настоящей работы, в остальных случаях мы исходили из готовых бис-Аст-производных.
1. Сннтез и очистка бис-Аст-проиэводных выбранных пептидов, а) Отимизация схемы синтеза бис-Аст-производного этнламида ундекапсптида последовательности 593-603 трансмембранного глнкопротепна ер41 ВИЧ-2.
Пептид (XIII) на сегодняшний день является единственным антигеном, входящим в состав отечественных диагностических наборов, который отвечает за выявление антител к ВИЧ-2 и совершенно не чувствителен к сыворотке кропи пациентов, инфицированных ВИЧ-1. Поэтому разработка оптимальной схемы его синтеза имеет прянгтпиальное значение.
Для синтеза вышеназванного пептида был выбран метод фрагментном конденсации в растворе, что в случае относительно коротких пептидов обеспечивает быстрое Получение достаточно больших количеств нелевого вещества. Синтезируемая последовательность была разбита на три фрагмента (!(), (V) и (VIII) (схема 1).
С-Концевая карбоксильная группа пептида была модифицирована этиламином. Введение этиламидной группировки, выполняющей в ходе синтеза роль защиты С-концевой карбоксильной функции, позволяет существенно упростить выделение промежуточных продуктов. Кроме того, такая Модификация увеличивает липофнльность пептида что, по-видимому, должно улучшить его сорбцию на пластиковых планшетах п процессе твердофазного иммуноферментного анализа. При выборе фрагмента (V) мы руководствовались данными (ОусЫпт'коу М.У. е1. а!., 1991) о возможности успешной, с высоким выходом конденсации фрагментов с С- концевым №-незашищсиным аргинином. Выбор фрагмента (VIII) с С-концевым остатком глицина традицнонен.
Для временного блокирования а-аминогрупп использовали
бензилоксикарбонильнуто (2) и трет-бутилокенкарбонильную (Вое) зашить!, которые в дальнейшем удаляли каталитическим гидрогенолизоы и ацидолмзом соопетегоетю. Сульфгидрнльну» функцию цистеина блокировали ацетамидометнльной группой, а гидроксильную функция серина - трет-бутильной (Ви1) защитой. При синтезе пептидных фрагментов (V) и (VIII) карбоксильные группы остатков аргинина и глицина защищали солеобразованием.
Синтез фрагментов осуществляли последовательным наращиванием пептидной цепи с С-конца методом активированных эфиров. Для этого использовали М-оксисукцинимидные (-ОЫБи), п-ннтрофениловые (-ОЫр) эфиры и хорошо
кристаллизующийся К-гидрокси-5-норбориен-2,3-днкарбоксиимидшГ| (-ОМВ) эфир для присоединения остатка серкна.
Авп Бег Тгр &у
Вое-
2г-
Вос"|{Жр н Воо-
Н--ОЫа г-Нзыви
г
:- '-вив н
г'
п
г*
Ви'
(VI)
(VII)
(VIII)
Су» А1а РИе А
ОН Вое" ОЫа Вое
ОН Вос-
ОТ* Н"
«н н-
1(2) А
г-оырн
Аст Г Т)Ыр Н' ^ст
Аст ЛТРГ
^Аст
гНОИр НуОН (Ш)
(IV)
(1Уа)
ОН Воо"
(V)
(IX)
(1Ха)
(Ха)
(X)
ша.
он -он
ОН Вое- -ОНр Н
-он н-1(1)
п Уа1 Ср
Аст Вос-рОЫр Аст Вое-¿ПНЕ! Аст
Вос-{0№и Н-^-МНЕ! 0)
Вое-
(Па)
Аст
-МНЕ!
Аст
/Аст
"ЫНЕ! Лап ЧЧНЕ«
Аст
^ст иНЕ1 1ст ПНЕ»
1-ы
Аст ЧШЕ» Аст Т1НЕ1
•МНЕ»
Схема 1. Схема синтеза ундекапептада (ХШ). (I) • НВгРу, 1ХХУНОВТ; (2) -01РС01/Н0ВТ; - +Ы(СНз)зСН2СбН5.
При синтезе фрагмента (V) исходили иэ незамещенного аргинина. Присоединение -ОЫр эфироо г-аминокислот проводили в безводном днметилформамнде (РМ!7). Для очистки промежуточных Ы-защищатых пептидов была использована хроматография на силикагелс, позволяющая выделять продукты реакции с высокими выходами (Овчинников М. В. и др., 1983).
Б
В качестве элюента использовали смесь спирта и хлороформа. При этом выходы целевых соединений были высокими и составляли 82-9! %.
Входе синтеза фрагмента (VIII) при получении дн-(VI) и трипептида (VII) Исходили из натриевых солей соответствующих аминокомпонентов, а реакцию конденсации проводили в водно-ограннческой среде. При получении Тетряпептида (VIH) Исходили из растворимой в DMF бенэилтриметиламмониевой соли аминокомпонента, конденсацию проводили в безводной среде с целью предотвращения возможности омыления л-нитрофеннлового эфира и гидролиза амндной функции аспарагина в водно-щелочных условиях.
Для -Конденсации синтезированных блоков применялся традиционный карбодиимидный метод с добавками HOBT. Конденсацию фрагмента (На) с фрасмяп-ом (V), содержащим С-концевой аргинин, проводили DCC/HOBT-методом в DMF в Присутствии 1 зкв. НВг Ру, необходимого для размыкания внутримолекулярной солн в карбоксильном компоненте и протонирования гуаниднновой группы аргинина. При этом выходы продукта конденсации (IX) сосТ&йКЛй 82 < 90%. Для оцейкй рацемизаций остатка аргинина при проведении фрнгментной конденсации нами был получен аналог соединения (1Ха), содержащий D-аргинин. С tiotíoutbto высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на обращенной фазе было показано, что Целевой гептапептид (.-конфигурации Практически не содержит примеси соответствующего диастереомера (рис. I).
Таким образом, НаМН было показано, что при конденсации фрагмента с С-концевым незамещенным аргинином указанным выше способом рацемизации не Происходит.
Конденсацию соединений (VIII) и (1Ха) проводили также карбоднимидным методом, но вместо DCC использовали диизопропилкарбодэтимнд (DIPCDI), дающий растворимую в DMF динзопронилмочевнну. Защитные группы конечного ундекапептнда (Ха) отщепляли действием трифторуксусмой кислоты (TFA). По данным ВЭЖХ сырой пептид (X) содержал 30% основного вещсстпа. Для очистки полученного соединения были Параллельно Использованы ВЭЖХ на обращенной фазе и ионообменная хроматография на сульфопропия-сефадскте (SP-сефадекс) в градиенте концентрации пиридин-ацетатного буфера от 0.05 до I М. Оба Метода очистки давали сравнимые результаты (выход 77 - 79 %) к обеспечивали получение вещества 90 - 95 % чистоты.
Рис. 1. ВЭЖХ на колонке Ultrasphere ODS (4.6 х 230 мм) в градиенте концентрации ацетонитрила (7-» 42% за 50 мин) в 0.05 М KHjPO« (pH 3) диасгереомерных гептапептидов: гептапептид (ХП), содержащий D-аргинии (а); гаггапептИД (IXa), содержащий L-аргинин (б); смесь днастереомерой (в). Скорость злюци» I мл/мин.
б) трвдофиный CTiTOfta-(Ambngpii36aaimtism>mgs;
H-T^<}ly-Cys(Acm)-Ser^ly-L)^lxu41c-Cyj(Acffl}-TlU'-Thr-Ala-Visl-Pro-Trp-Asn-Ala-OH (XIX);
H-Ser-Ser-Cys{Ara>Phe-OSy<51y-Arg-lk-Asp-Aig'lle-Oiy-A!a-G!ii-Scf-a!y-Lcu-Gly-Cys{Acm)-Asn-Ser-Phe-Arg-ÖH (XX11II);
H-Ser-Ser-Cys(Acm>Phe-Gly.Giy-Arg-lle-A5p*ArS-Ile-aiy-Ala-Gln-S£f-01y-Leu^31y-Cys{Acro>Asa-Ser-Phe-Are-Tyr*OH (XXV);
H-Ser-Leu-Ar2-Arg-Ser-SerCysfAcro>Phe-0iy-01y-Arj-l!s-Asp-Aig-l!c-Gly-Ala-Gb-Scr-Giy-Lcu-Q!y-Cys(Acm>AEa-Sef-Phe-Arg-Tyr-OH (XXVII); H-Cys(Acm>Ser-Cys-Ser-Sc!--Leu-Met-Asp-Ly3-Oiu-Cys-Vül-TyT-Phc-Cys(Acffl)-Hi8' L .'u-Asp-lle-1 le-Tfp(For)-OH (XXIX);
H-Cys(Acni)-Tlir-Cys-Phe-Thr-Tyr-Ly3-Asp-Ly8-Olu-Cys-VeJ-tyt-Tyr-Cy»(Aan)-Hb-Leu- Asp-lle-Ile-Trp(For)-OH (XXXI)
Бис-Асга-проюводные пептидной антигенной датершшаиш 601-617 (XIX) и атриальных пеггтидоп (XXIII, XXV, XXVII) были синтезированы автоматический
твердофазным методом на сополимере стирола с 1% дивннилбснзола с 4-гидроксиметилфеноксиметильной якорной группой (смола Ванга) с использованием карбодинмндного метода. Для блокирования а-амииофункций применялась флуоренил-9-метоксикарбоннльная (Fmoc) группа, в ходе синтеза отщеплявшаяся действием 20% пиперидина (Pip) в N-метилпирролидоне (NMP), Функциональные группы боковых цепей аминокислот защищали кислотолабильными защитами трет- бутильного типа. Сульфгицрнльные функции цистеина блокировали Аст защитными группами.
В ходе синтеза соединения (XIX) было обнаружено, что при присоединении Fmoc-Asn-OH с помощью DCC/HOBT-метода, сырой пептид, судя по данным ВЭЗКХ, содержал 61% целевого вещества и 22'/» побочного продукта, причем по данным аминокислотного анализа оба соединения имели корректный аминокислотный состав. Однако, молекулярная масса побочного продукта была На 18 единиц меньше (данные масс-спектрометрии с электроспрей-ионизацией (ESt-MS)), чем у Целевого соединения. Это позволило нам предположить, что вещество является продуктом дегидратации незащищенной функции аспарагина в присутствии DCC и содержит в Пептидной цепи остаток ß-цнаноаланнна вместо остатка аспарапта. Замена карбодиимйлного способа конденсации Fmoc-Asn-OH на метод активированных эфиров (Fmoc-Asn-ONp) в присутствии HOBT привели к существенному повышешпо содержания целевого вещества (до 81%) в сыром продукте.
В ходе синтеза петидой (XXIII, XXV, XXVII) аспарагин и глутамин присоединяли в виде их Fmoc-Asn(Trt)-OH и Fmoc-Gln(Trt)-OH - производных*.
Твердофазный синтез пептидов (XIX, XXIII, XXV, XXVII) проводили в соответствии со стандартной программой автоматического синтезатора Applied Blosystems 43 i А дли Ртос-техйикй. Ргоос-яминокислоты (4-кратные избытки) предварительно шегивпровали DCC Илй DfPCDt/HOBT в NM Р. По окончании синтеза пептиды отщепляли от носителя с помощью TFA в присутствии соответствующих озвеядаеров и ьчмщшт различными хроматогряфичесхими методами До 99*93% Чистоты по ЙЭЖХ. Петид (XIX) очищали хроматографией на KödtTejte Toyopearf HW-40 в 2% муравьиной кислоте, а соединения (XXIII, XXV, XXVII) - препаративной ВЭЖХ на обращашой фазе.
' Тг» - зрительная защитная группа
Твердофазный синтез бнс-(Аст)-пронзводных зндотелинов-t в -3 (XXIX * • XXXI) был осуществлен с применением Вос-техникн на сополимере стирола с }% дивинилбензола с 4-оксиметилфснилацетамидометильной якорной группой (РАМ-полимер). В сочетании с кислотолабильной К*-Вос-защитой для функциональных групп боковых цепей аминокислот применяли кислотоустойчивые защиты: бензильная (Bzl) для карбоксильных групп асларагиновой и глутаминовой кислот, гидроксильных функций сёрина и треонина, 2,4-динитрофенильная (Dnp) для имидазольного кольца гистидина, формильная (For) для индольного кольца триптофана, 2,6-дихлорбензильная (2,6-дн-С1-Вг1) для гидроксильной группы тирозина, 2-С1-бензилоксикарбонильная (2-CI-Z) для с-амицогруппы лизина. Для региоселектнвного замыкания днсульфидных связей использовали Boc-Cys(Meb) • ОН и Boc-Cys(Mob)-OH * для присоединения остатков цистеина в 3 и II положения в эндотелшт-l п -3 соответственно и Boc-€ys(Acm)-OH для присоединения остатков цистеина в I и 15 Положения (см. схему 3). Для создания амидной связи, в соответствии со стандартной программой, в расчета на 0.1 ммоль стартовой аминокислоты синтезатора Applied Biosystem 431А, Вос-аминокислоты (10-кратные избытки) предварительно активировали в присутствии DIPCDWHOBT в NMP. КГ-Вос-защятную группу удаляли 30% TFA в дихлорметане, нейтрализацию осуществляли 5% раствором • Ы,М-даизопропилзтиламина (DIPEA). По окончании синтеза Dnp-защиту удаляли тиолизом. Отщепление пептидов (XXIX) и (XXXI) от полимера осуществляли при помощи HF & присутствии п-крезола, при этом удалялись также все защиты боковых цепей аминокислот, кроме Асш и For. Линейные соединения без очистки обрабатывали окислителем (см. ниже) и очищали препаративной ВЭЖХ на обращенной фазе до 96 - 97 % чистоты. Полученные моиоцюшические производные, содержащие [Cys(Acm)!"5 и fTrp(For)p были охарактеризованы количественным аминокислотным анализом, ESl-масс-спектрометрией. Выходы моиоциклических производных зндотелинов-1 н -3 в расчете на стартовую аминокислоту составили 1. /о и 9% соответственно (таблица 6);
* Meb - 4-жтибвиалыпи, МеЬ ». шпптиц« группы
12
2. Сравнительная оценка некоторых методов создания БЗ-мостиков.
Следующим этапом работы был подбор подходящих реагентов для деблокирования сульфгидрнлъных групп цистеина и замыкания дисульфидной связи. Окнсленне пептидов, содержащих триптофан, метионин, часто сопровождается побочными реакциями, протекающими по боковым цепям этих аминокислот. Для синтеза выбранных пептидов, включающих эти чувствительные к окислению аминокислотные остатки, необходимо было подобрать метод, позволяющий проводить замыкание днеульфидных связен без образования побочных продуктов, исключающий многократные очистки, а также позволяющий масштабировать процесс окисления. В ' качестве модели для исследований был выбран относительно короткий пептид (XIII), имеющий в своей последовательности триптофан. Для контроля происходящих превращений использовали ВЭЖХ в специально подобранных условиях (рис. 2)'и качественную реакцию на ЗН-группу с реактивом Эллмана. Превращения бис-Асш-производного ундекапептида (X) в соответствующий дисульфид (XIII) осуществляли в соответствии со схемой 2. Для подбора оптимального окислителя была проведена сравнительная оценка некоторых известных реагентов. Результаты этих экспериментов приведены в таблице 3.
Рис. 2. Аналитическая ВЭЖХ смеси образцов различных форм пептида (XIII) на колонке Шгайр11еге (4.6 х 250 мм). Элюция градиентом от 20 до 60% буфера Б (70% ацетонитрила + 30% буфера А) в буфере А (0.05 М КЛ2РО4, рН 3.0) за 40 мин.
О 20 мин -
Аст Аст (X)
Н - Лзп - Бег - Тгр - Оу - Су1 - А1а - РЬе - Агё - в1п - Уа1 - Суя - ЫНЕ[
(а)
(ХШа)
Н - Авп - Бег - Тгр - Оу - Сув - А1а - РЬе - Аг$ - вк - Уа1 - Сув - ЫНЕ1
(б) - Ог или К5[Ре(СЫ)б] или Н2О1
Н - Абп - 8ег - Тгр - ®у
-Су! - А1а -
РЬе-А^-СТп
-Уа1-СуЗ-
(XIII) КНЕг ♦
(в)
Ь/АсОН или
Ь/МеОН
Схема 2. Получение соединения (ХШ): а) удаление Асш-защитной группы; б) образование дисульфидной связи; в) удаление Аст-группы и циклизация одновременно.
а) Окисление йодом.
Йод достаточно широко используется для замыкания ¡й-связей. Преимущество этого метода перед другими состоит в возможности прямого превращения бис-Аст-пронзводных пептидов в дисульфиды. Однако, известно, что этот процесс протекает неоднозначно. Побочным реакциям часто подвержен триптофан. Низкие выходы свидетельствуют о получении побочных продуктов, структура которых часто остается невыясненной. Нам представлялось интересным оценить возможность применения этого метода к триптофансодержащему пептиду (X), а также изучить влияние условий проведения циклизации на количество и соотношение побочных продуктов , и изучить их структуру. При подборе оптимальных условий окисления варьировали избыток йода и растворитель. Оказалось, что при окислении йодом в уксусной кислоте, независимо от используемого избытка окислителя, наряду с целевым продуктом (XIII) образуются побочные. Составы реакционных смесей окисления представлены в таблице I. Побочные соединения были выделены с помощью препаративной ВЭЖХ и проанализированы различными методами (аминокислотным анализом, ЕБЬМЗ, 'Н-ЯМР-спектроскопией, УФ-спектроскопией, элементным анализом на содержание серы). Структура выделенных побочных продуктов изображена на рис. 3, их важнейшие характеристики • в таблице 2.,
О
Таблица 1. Состав реакционных масс (%, поданным ВЭЖХ) при окислении пептида (X) в зависимости от используемого избытка йода.
Количество йода, моль/моль (XIII) Состав реакционной массы (X) (XIV) (XV) (XVI) Выход*, % псптида(Х111)
13 27.6 ¿5.6 12.7 - 28
7 54.2 16.5 - 39
5 33.8 - 16.5 30
2 41.8 37.0 ¡2.0 -
* Выходы приведены в расчете на соединение (X).
Асш
И-А5п-5ег-Тф-ау-Су1л1а-РЬ
Асш
е-Агя-тап-УЫ-Сув-МНЕ! (X)
I-1
гН-ау-С)*.А1а-Р11е-Агг-С1п -Уа1 -Сув-ЫНЕс
Р'
^ р2
(XIV) СНг
(XV)
Н-Ляп-Вет-Ш-СН - СО -С1у -Сук -А!а -РЬе -Arg <31п -Уа1 -ЫН - СН-СОКНЕ!
БгОзН
Н-А5п-5ег-Тф-01у-Су8-А1а-РЬе-Агв-С1п-Уа1-Су5-ЫНЕ1 (ХШ)'
БгОзЩАст) АстфгСЬН)
Н-Ая1-8ег-Тгр-01у-Су5-.'Уа-РЬе-Агя-01п-Уа1-Су1-ЫНЕ1 (XVI) J
У
Рнс.З. Схема превращений (X) под действием йода в уксусной кислоте при избытке йода 13 (А) и 5 моль/моль (X) (Б). (XIV), (XV), (XVI) - побочные продукты.
Было показано, что при окислении йодом (7-13 экв.) в уксусной кислоте, наряду с процессом отщепления Асш-групп и образования дисульфидной связи, протекает реакция более глубокого окисления, приводящая к расщеплению пептидной связи по остатку триптофана. Полученный побочный продукт,''по
данным аминокислотного анализа, не содержал трех Ы-концевых аминокислот, а его молекулярная масса соответствовала молекулярной массе циклического октапсптида (XIV) (рис.3, таблица 2).
Таблица 2. Характеристики продуктов окисления пептида (X) йодом в АеОН.
te Соединение *Ri, мин **MS [M+H)+ ***Я.щах,Н M E X 104, M-'CM-1
(ХШ) NSWGclAFRQvé-NHEt 15.48 1295.9 280 0.50
(XIV) I .........I CCAFRQVC-NHEt 11.10 907.6 • -
(XV) NSvtaçAFRQvi-NHEt S:OjH 16.70 1407.7 299 0.90
(XVI) NSWGCAFRQV^-NHEt (AcmJSjOjH Acm(S2OjH) 16.78 1481.0 280 0.46
•Элюция градиентом от 20% до 80% буфера Б (70% ацетонитрил + 30% буфера А) В буфере А (0.05М KHjPCXi) за 30 мин, скорость потока 1 мл/мин на колонке (4.6x250 мм) Ultrasphere ODS (5мкм; Beckman, США) на хроматографе Gilson (Франция). •♦Масс-спектры снимались на квадрулольном масс-спектрометре Finnigen МАТ TSQ 700 (Германия) с электроспрейным (API)' ионным источником (Finntgan МАТ).
***УФ-спектры получали на спектрофотометре Beckman DU-8B (США) в воде с концентрацией (3.9х10-«М) для соединения (ХШ) к (2.04 х I(ИМ) для (XV) и (XVI).
Другой побочный продукт (XV) (рис. 3) был получен при окислении 13-ю экв. йода в уксусной кислоте и только в случае удаления избытка йода тиосульфатом натрия. При замене последнего на аскорбиновую кислоту, а также в опытах с меньшими избытками йода, образования примеси (XV) не наблюдалось. По данным аминокислотного анализа оказалось, что соединение (XV) содержит все необходимые аминокислоты (за исключением почти вдвое заниженного содержания триптофана (специальные условия гидролиза )). По результатам ESI-MS масса побочного продукта превышала массу целевого вещества на 112 единиц (что соответствует массе аниона SjOî1- ). Элементный анализ вещества (XV) показал, что содержание серы вдвое завышено по сравнению с теоретически
рассчнтзннтнг в целевом продукте. Всезтадамыеишюшствии» ipi.wni ними*,
что соединение (XV) является продуктом взаимодействия пептида с тиосульфат-анионом. Исследование УФ-спектра побочного продукта (XV) показало, что максимум поглощения, характерный для напольного кольца триптофана смещен в длинноволновую область (i.m« 299 им по сравнению с Хам 280 им для продукта XIII), а молярный коэффициент поглощения увеличен почти вдвое (таблица 2). Сравнительный анализ спектров 'Н-ЯМР соединений (XIII) и (XV) показал, что в спектре побочного продукта (XV) отсутствует сигнал протона при атоме углерода во 2 положении индольного кольца триптофана, а также имеются значительные различия в химических сдвигах сигналов протонов триптофана и ближайших к нему по последовательности аминокислотных остатков. Таким образом, данные УФ- и ЯМР-спектроскопии свидетельствуют о том, что в побочном продукте (XV) произошла Модификация индольного кольца триптофана в положении 2. Полученные результаты исследований, а также анализ литературных данных (P. Steber et. al., 1980) позволили нам предположить образование трга1тофан-2-тиоЭфира структуры, изображенной на рис.3.
Уменьшение избытка йода до 7-кратного дало возможность несколько повысить выход целевого продукта (ХШ) (таблица 1) и понизить, а при использовании 5-2-кратных - избежать образования продукта расщепления пептидной цепи по остатку триптофана (XIV). Но при этом в реакционной смеси появляется другой побочный продукт - (XVI), аминокислотный состав которого соответствовал аминокислотному составу целевого продукта (XIII), идентичны бьщи также и их УФ-спектры, однако, молекулярная масса (XVI) бьиа на 186 Да больше, чем у (XIII) (см. Таблицу 2). В спектре 'Н-ЯМР вещества (XVI) содержались сигналы протонов всех аминокислотных остатков, входящих в состав 0011), а также спии-связаиные сигналы при 8.51 и 4.23 мл и синглетный сигнал при 1.84 м.д., которые могут быть отнесены соотгетстоетю к протонам NH, СНгИ СНз-групп Аст-защиты. Интегральная интенсивность этих сигналов соответствовала одному остатку Аст на молекулу, а «у¡ВДГ молекулярных масс остатков Аст-защиты и тйосульфат-аниона точно соответствовала разнице молекулярных масс целевого (XfH) rt побочного (XVI) продуктов. Поэтому мы предположили, что соединение (XVI) содержит Acm-защитную группу на одном из остатков цнетеина (5 или 11), а другой остаток цистеина, вероятно, модифицирован тиосульфат-анионом. Дополнительным подтверждением наличш
1Т
тиосульфат-нона явился элементный анализ соединения (XVI) на содержание серы, которое было вдвое выше содержания серы в целевом продукте (XIII).
Таким образом, в результате проведенного исследования было установлено, что замыкание SS мостика в тркптофансодержащем пептиде (X) под действием йода в уксусной кислоте протекает неоднозначно и, в зависимости от избытка окислителя, сопровождается такими побочными реакциями, как неполное отщепление Acm-зашнты с присоединением к свободному остатку цистеина тиосульфат-иона (XVI), разрыв связи Trp-Gly (XIV), образование производного пептида, содержащего триптофан-2-тиоэфир и модифицированного по остатку Су*5 тиосульфат-ионом (XV). Следовательно, использование ЫАсОН для Циклизации в этом случае неприемлемо.
Мы также опробовали методику окисления йодом в водном метаноле при рН 6 и концентрации пептида 0.2 мг/мл. В этом случае 2-кратного избытка йода было достаточно для полного деблокирования SH-rpynn цистеина и реакция протекала без образования заметных количеств побочных продуктов. Но, при варьировании условий проведения реакции (соотношение воды и метанола, концентрацию Пептида в растворе), нам не удалось добиться выхода больше 66%.
В дальнейших экспериментах были испытаны реагенты, позволяющие замыкать дисульфидные связи, Исходя т свободных тиолов. В предварительных опытах для удаления Acm-защитиой группы л соединении (X) выли использованы соли серебра (AgTfa) и соли ртути (Hg(AcOh). Применение AgTfa не давало занетни* преимуществ перед Н|(АсО)г (Выходы и чистота <ХШа) были сопоставимы), но вносило некоторые ограничения: необходимость применения больших (20-Кратных) избытков дорогостоящих солей Ag(I), удаление. которых из реакционной массы требует очистки гельфильтрацией. Поэтому мы остановились на более простом способе деблокирования цистеина с Использованием 2 зкв. Ug(AcO)i на каждую SH-rpynny с последующей обработкой реакционной массы сероводородом. HgS имеет очень низкую растворимость в кислых водных растворах, легко осаждается и удаляется фильтрацией.
<й Ряпжшк тятю* ршулв
- одни из наиболее широко распространенных приемов для замыкания SS-мосгаков. В первых опытах (при рН 6-7 и концентрации пептида I иг/мл) нам не удавалось быстро достигнуть полного окисления SH-rpynn и реакционная масса состояла из смеси окисленного и восстаиовлеиого пептидов. Реакция окисления в
гом случае протекала медленно н завершалась только через 7 дней с выходом 0%. Для подбора оптимальных условий проведения циклизации мы варьировали H и концентрацию пептида. Результаты этих опытов показали, что наиболее ысокие выходы (67%) были получены при рН 8.0 и концентрации пептида 0.1 ir/мл. Интересно отметить, что окисление проходило быстрее (2 ч вместо сскольких дней) при использовании DIPEA вместо аммиака для поддержания рН еакцнонной массы. Но применение высоких разведений в случае- окисления ольших количеств пептида (500 мг и больше) неудобно, поэтому мы испробовали ругне окислители.
в) Окисление ферриинанидом калия. В результате этих экспериментов был получен целевой циклический продукт КШ) с Шходоы 62%, tío сопоставимо с выходами, полученными при окислении ислороДом воздуха. Но после завершения реакции окисления требуется емедленное удаление ферри- и ферроцияннд - ионов, что делает необходимым ополнйтельиую очистку реакционной массы на ионообменных смолах. Поэтому 1Ы продолжили поиск более удобного реагента для окисления.
Г) ОкпяКПт PfpçMKMQ водорода, Несмотря fia to, что перекись водорода принимает участие в физиологических ■рацсеса« «йкяккм, еяа е» нашла широкого применения в пептидной химии. В итераторе пмизтея отдельные упоминания о се применении для создания SS-¡остнкоэ, по информации о се возмошгостях недостаточно (L. Kisfaludy and 1. chon, 1974; О. С. Пгпсуспяч н др., 1986; Niwa, Mineo et al. 1990). Нам редстшшлссь интересным oueiftm. зффатяшость этого реагента применительно нашему модельному пептиду. Перед замыканием дисульфидного мостика самшотш масса после удаления HgS продувалась азотом для удаления збыпшв сероводорода. Окислите проводилось в водном расгпоре пептида Ша> с ШттршШЯ t uríwl ttpa рН 0.5-7J (рН йодаеряивали при помощи одного раствора аммиака) в присутствия KWO-fcparniís tnStíTtfoa перекиси одерода в Tsnettne 10-15 Mita. По окончании циклизации реакционную смесь одаислдлй уксусной кислотой, кдаиеитрировшт и продукт обессоливали с ътЩа йреперапшой ВЭЖХ. Выход целевого продукта в растете на (X) остг.г!лгл СЗ-55%.
Циклизация rtp» помощи Н2О2 дала наилучшие результаты по получению (XIII) а*. таблйцу 3). Этот метод Дайал быструю и полную конверсию SH фориь! в SS4
высоким выходом и при отсутствии побочных продуктов. Отсутствие неорганических примесей ( перекись водорода после завершения реакции разлагается на кислород и воду) исключало Необходимость дополнительной очистки. Поэтому мы выбрали этот метод как наиболее подходящий для решения наших задач и решили изучить возможность его применения для замыкания 55-Мостиков в физиологически активных пептидах различной структуры. Таблица 3. Сравнительнная оценка лучших результатов, полученных при окислении (X) или (ХШа) различными реагентами.
О1 (слитель Концентрация рн Содержание (ХШ) в реак- Выход* (XIII),
пептида, мг/мл ционной смеси ЮЖХ, % %
НгО! 1.0 7 98 85
КзРе(СЫ)б 1.0 ' 7 78 62
Оа 0.1 8 96 0Т
ЫАсОН 1.0 3 54 39
1а/МеОН 0.2 5 82 6«
'Выходы приведены в расчете на (X).
3. Розитнкти ,применения пакктмдтм,
а) Использование Н7О7 ш!я создания 55-свйзсй в физиологически вктИ&нУх
псгтшквшн'Мйсгоущры,
Мы проверили возможность использования перекиси водорода ДМ получения „триптофан со держащих пептидных фрагментов £р4! ВИЧ (XVII, XVIII, XXI). Сначала были отработаны условия отщепления Аст-1ащитных групп цистеиновых остатков (получение соответствующих 8Н-пептидов). Деблокирование сульфгидрильных групп ацетатом ртути в бис-Аст-производном пептида (XVIII) и в соединении (XIX) осуществляли в 30-50% Водной уксусной кислоте. В случае бис-Аст-производного Пептида (XVII) уксусная кислота была заменена на муравьиную, так как в уксусной кислоте БН-производное (XVII) осаждалось одновременно с сульфидом ртути при разрушении соответствующего меркаптида ртути действием сероводорода. Замыкание дисульфидного мостика Проводилось перекисью водорода в условиях, описанных выше для пептида (XIII). Существенного образования каких-лнбо побочных продуктов не было отмечено. По окончании циклизаций реакционные смеси концентрировали. Целевые продукты обессоливали с помощью ВЭЖХ или геЛЬ-фИлЬтрации на сефадесе С-25
(в случае пептида (XVII), который достаточно сильно сорбировался на обращенной фазе). Пептидные фрагменты зр41 ВИЧ были получены с высокими
выходами 75-90% (таблица 4).— - - . ______
Таблица 4. Сопоставление выходов циклических пептидов при замыкании
Я5-мостнка йодом (в АсОН или МеОН) и перекисью водорода.
Обозначение Структура Выходы (%) !: Н гО:
XVII I I Н-ЬСЬ\УОС5СК.иС-ХНЕ1 51 75- 85*
XVIII {.....1 Н-1Х11\\'СС80КН1С-М1Ш 56 85 - 90-
XIII Н-№\УОСАРЯ(2УС-КН Е1 66 80 - 87*
XXI 1..............1 Н^ССБОКисТТАУР^А-ОН 25 85 - 90*
XXII 1-------'.1 н-сукзмср1.а-кн2 50 70 - 75**
XXIV М-85СГОС1МОШСЛ05ОЬОС\'81?а-ОН 23 83
XXVI Н^РООШОШОАОЗСЬОС^ЗРИУ-ОН 26 50
XVIII 1 ...................1 Н -5иШ55СРООЯ1 ОЯЮ АОБОЬОСЫЗРа У-ОН 20 62
* - приведен разброс выходов при окислении 0.1 - 1.5 г соответствующих бис-Аст-провзводнмх пептидов; ** - разброс выходов при окнслешш 2.0 - 20,0 г бис-Асш,-
Протзоип,« СХСИТОЦ'ПШ.
Циклизация соответствующих БН-производных атриальных пептидов, вюпочаюшнх 23-28 аминокислотных остатков (XXIV, XXVI, ХХУЩ) таюке проводилась в условиях, описанных для (XIII). Полученные выходы этих соединений, указанные в таблице 4, показывают преимущество использовашга
Н;СЬ по сравненшо с Ь, использованным ранее (Овчинников М. В. и др., 1988).
Следует отметить, что метод циклизации при помощи Н2О2 оказался хорошо воспроизводимым и при масштабировании этого процесса. Получение пептидных
фрагментов £р41 ВИЧ из 0.5 - (.5 г соответствующих бис-Аст-пронзводных также проходило с высокими выходами (таблица 4).
Таким образом, на примере ряда физиологически активных пептидов различной структуры было показано, что использование перекиси водорода для э замыкания днсульфидной связи обеспечивает простое, быстрое и эффективное Получение целевых продуктов, при этом не было замечено побочных реакций по чувствительному к окислению триптофану.
б) Использование НО? для синтеза препаративных количеств окентогоша (XXII).
Перекись водорода успешно использовалась при масштабировании процесса окисления в синтезе окситоцина.
При окислении пептидов следует подчеркнуть необходимость тщательного удаления избытка сероводорода из растворов БН-производных пептидов после отделения осажденного сульфида ртути. В случае окисления больших количеств эта проблема представляет отдельную задачу. В присутствии окислителя остаточный сероводород или образующийся из «его гидросульфид аммония (при подщелачивании), а также коллоидная сера Приводили к образованию побочных Продуктов при синтезе окситоцина (их структура не определялась), что приводило к снижению выхода целевого продукта. В наших опытах остаточный сероводород из кислых растворов $Н-производных пептидов удаляли барботированнем
реакционной массы азотом с последующей лнофилизацией или упариванием
1
раствора. При получении окситоцина исходили из 2, 5, 10 и 20 г его бнс-Аст-производного. После деблокирования остатков цистеина линейное производное окситоцина лиофилизовали, растворяли в водио-метаНольной смеси (соотношение 1:1) при концентрации пептида I мг/мл, окисляли перекисью водорода при рН 6.57.5 (рН поддерживали водным раствором аммиака). Применение спирта позволяло быстро концентрировать реакционную массу по окончании процесса окисления. Благодаря отсутствию заметных количеств Неограиических примесей (в частности ацетата аммония) из водного раствора получали янофилизат сырого окситоцина, который хранился в течение нескольких дней без изменения содержания целевого вещества по результатам ВЭЖХ. После очистки полупродукта с помощью препаративной ВЭЖХ был получен окситоции с биологической активностью 450 -480 международных единиц, что соответствовало Медицинскому препарату.
Вьтоды окситоцина в расчете на бнс-Аст-производное при загрузках от 2 до 20 г составляли 70 - 75 %.
Замыкание дисульфндиого мостика в бнс-Асш-производном окситоцина Подои в 80% уксусной кислоте давало выходы порядка 50 - 52 %. Однако, при
циклизации больших количеств пептида реакционные массы, содержащие значительные количества неорганических примесей, неизбежных при окислении йодом, требовали немедленной очистки, так как через 2-3 часа содержание окситоцина резко падало. Одновременная очистка граммовых количеств лимитирована емкостью препаративной колонки ВЭЖХ.
Таким образом, метод окисления перекисью водорода в синтезе окситоцина в укрупненном масштабе наиболее приемлем, дает стабильно высокие результаты и технологически удобен.
в> Синтез зндотелино^-1 и -3 (XXX И XXXW- Изучение возможности применения H 7О3 ддя окисления мстионинсодержаших пептидов на примере зндотелнна-1 ОООО.
Успешное использование перекиси водорода для получения ряда выше ^писанных пептидов позволило нам предположить, что этот реагент можно применить й для синтеза более сложных структур, содержащих по два шеульфидных мостика: эндотемнов-! и »3 (схема 3). Твердофазный синтез »ответсТвующих ядасЯпых прсязздгаи бмп осуществлен с применением Вос-гехннки. Поскольку эндогалт-1 содержит особенно чувствительный к окислению .¡еттшшп, 1!зи представлялось интересным оценить возможность этого метода в ipifKCHemni к нстооттсодержащему пептиду.
Известно, что метпонки в ю!слых условиях в присутствии 1-2 экв. Н2О2 гревращается в сульфоксид в течаше нескольких мняут (А.А. Гершкович, В.К. <ибиреа, 1992 г.). Поэтому возможность использопштя перекиси водорода для амьжштя дясульфидных связей в метноштсодержащих пептидах казалась «аловероиной. Модельные опыты по изучению чувствительности метонина к lefictBino Н2О2 при различных значениях pif мы провели на Met-эшсефалнне. 'езультаты этнх экспериментов представлены в таблице 5.
Маш» наблюдения позволили предположить, что замыкание SS • мостиков в lertiomniooдержащих пептида* возможно в случае проведения реакции шклизащш при рН 7.5 - 8.0 И вЫМе с последующим удалением из реакционней
массы избыточных количеств Н2О2 (перед подкнслснием раствора до рИ 3.0 - 4.0). Оказалось, что барботнрования реакционной массы каким-либо инертным газом (азотоу или гелием) перед подкислением было достаточно для предотвращения образования МеЦО)-производного. Полноту удаления избытков Н2О2 о контролировали при помощи йодометрической пробы, которая обладает необходимой чувствительностью. Полученные в модельных опытах результаты были использованы при синтезе эндотелина-1.
Н Суз -Аст
Суз -М(
СуБ
Н -Су,---Суз
Аст
Суз
'еЬ (МоЬ) \^еЬ (МоЬ) Аст Суз —
Тф • Р НР/п-крезол Ро1- *
Суз ----Тгр- ОН 1)НгО;>
Аст А>г 2)ВЭЖХ
Н. Суз— Аст
Суз 1_
Суз
Суз Тгр - ОН 1)|г/Меру Аст Йог 2)ВЭЖХ
Н-Суз — Суз---------Суз------Суз —■
| I .". I |
-Тгр-ОН 1)0.1 ЫЫаОН> Рог 2)ВЭЖХ
- " " '°У|---------- Су? "" Су|
Схема 3. Получение соединений (XXX) и (XXXII). Таблица 5. Окисление Меюнкефалина перекисью водорода*.
С« — Тгр-ОН XXX (XXXII)
рН Количество Н2О2 (экв.) Время проведения реакции (мин) Содержание МеЦО)-производного в % ВЭЖХ
3.0 - 4.0 1.5 5 44.2
4.0-5.0 1.5 5 14.0
7.5 - 8.0 1.5 5 7.5
8.5-9.0 1.5 5 2.8
♦Концентрация пеПтида в растворе составляла 1 мг/мл.
После отщепления от полимера [Су^Асш)]115, [Суя^Н)]3", (Тгр(Гог)]21 -производное эндотелина-1 обрабатывали 1-2 экв. Н2О2 в 8 М растворе мочевины.
о
Следует отметить сложность работы с линейными производными эндотелинов из-за их высокой склонности к агрегации в водных растворах в широком диапазоне рН. Это свойство эндотелинов обусловливает их высокую сорбцию на хроматографических сорбентах различной природы (сефадексы, обращеннофззные носители) и является причиной низких выходов целевых веществ. Поэтому для проведения реакции окисленияв растворе использовали денатурирующий реагент - мочевину. После завершения окисления (контроль реактивом Эллмана) реякцио!й!ую массу барботировалн инертным газом в течение 20 - 30 ыии. Отсутствие Н;Ог контролировали йодометрической пробой, после чего рН реакционной сМесй доводили до 4-5. Реакционную массу хроматографировали методом препаративной ВЭЖХ на Ууёас С-18. Выделенный моноциклический полупродукт [Су^Аст)]1'11, (Тгр(Рог)Р1-эидотелина-1 практически не содержал еуяьфсяпш. кетастйта, что вьйо «оягвержяен» результатами ВЗЖХ и Е31-ы&сспсктрвнетрией.
Получение моноциклического производного [((^(Аст)]1-15, [Ггр(Рог)]51-зндотеяшз-З также пройодили в 8М мочевине. Отсутствие метНонина в аминокислотной последовательности этого соединения позволило проводить циклизацию 0 условиях описанных Для(ХШ).
Таблица б. Выходы целевых веществ и полупродуктов в синтезе
эндотелинов-( и -3 (XXX п ХХХ11).
Соединение XXX хххн
Выход мопоаиклипеских [Суз^ст}]115, (Тгр(Рог) }21 -производных «а стартозуга амгпюкяслоту, {%) 17 9
Чистота ыопошпспических производных, ВЗЖХ*, (%) 96 97
Выход цглевых бишсятескпя соадтеннЯ п расчете на «оиеШашичеекйе [Су^Лста),"-15, [Тгр(Рог) р> -про!Пводаых, (%) 39 43
Чистота целевых соединений, ВЭЖХ*, (%) 97 99
С^УМ^К!ьтЯг1код13зЯ5етойек;е!гтвзйа стартовую аминокислоту (%) 7 4
•Аналитическая ВЭЖХ па колонке Vydac CIS (4.6x250 мм). Элтоция градиентом от 20 до 80% буфера S б буфере А за 30 мии. Буфер Б * 80% ацетонитрила в буфере А (0.f% TFA).
Препаратнвная ВЭЖХ на Уус1ас С-18 обеспечивала высокую степень чистоты моноциклических производных эндотелинов-1 и -3 (96 • 97%) (таблица 6).
Замыкание второго днсульфидного мостика проводили йодом в водном метаноле. Реакции в обоих случаях проходили однозначно без заметного образования побочных продуктов. После обессолнвания целевых продуктов методом препаративной ВЭЖХ были получены бнциклические Тгр(Рог) - XXX и Тгр(Рог) - ХХХ11 производные 96 - 99% чистоты. Удаление Ы^-формильной группы триптофана осуществляли 0.1Ы ЫаОН с последующим обессоливаннем на ВГЖХ и лиофилизацией. В таблице 6 приведены выходы Полупродуктов и целевых веществ и чистота полученных соединений по результатам аналитической ВЭЖХ.
Структура всех описанных в настоящей работе циклических соединений была подтверждена методами аминокислотного анализа, ЕИ-МБ и 'Н-ЯМР-спектроскопией, а также данными биологического . тестирования. Индивидуальность соединений показана методом ВЭЖХ. Содержание пептидов в соответствующих лиофилизатах составляло 80 - 90% в расчете на свободное основание по данным количественного аминокислотного анализа.
ВЫВОДЫ
К Впервые на примере триптофансодержашего пептида, соответствующего последовательности 593-603 белка £р4! ВИЧ-2 проведена сравнительная оценка применения известных реагентов для замыкания внутримолекулярных дисульфидных связей (кислорода' воздуха, феррицианида калия, перекиси водорода). Показано, что применение перекиси водорода является предпочтительным, так как позволяет быстро, с высоким выходом замыкать связи и обеспечивает простое и одностадийное выделение циклического продукта.
2. Показана возможность применения перекиси Водорода для замыкания внутримолекулярных дисульфидных связей в природных пептидах различной длины и структуры, а также в пептидах, содержащих особенно чувствительные к окислению триптофан и метионин. Осуществлен синтез эндотелинов-1 и -3.
3. Осуществлено прямое превращение Б-аиета мидометилзащнщенного пептида 593-603 £р41ВИЧ-2 в циклический дисульфид под действием различных избытков йода. Выделены и идентифицированы новые побочные продукты.
4. Разработана оптимальная схема синтеза этиламида циклического ундека&птнда последовательности 593-603 трансмембранного гликопротеина gp41 вируса иммунодефицита человека второго типа, нашедшего широкое применение при___________
диагностике ВИЧ-2.
5. Показано, что в ходе синтеза пептида последовательности 593-603 gp4l ВИЧ-2 конденсация фрагмента с С-концевым незамещенным аргинином DCC/HOBT-х; ст о дом в присутствии НВгРу не сопровождается рацемизацией по остатку аргинина.
6. Разработан эффективный, технологически удобный способ получения медицинского окситоцина в укрупненной масштабе в количествах до 20г и пептидных антигенов ВИЧ в количествах до 1.2 г с использованием перекиси водорода.
Основное содерягаипе диссертации изложено в следующих публикациях;
1. Сидорова М. В., Кудрявцева Е. В., Молокоедов А. С., Овчинников М. В., Беспалова Ж. Д. Синтез этиламида циклического ундекапептида последовательности 593 - 603 траисмембранного гликопротеина gp-41 вируса
иммунодефицита человека второго типа // Еиоорганнческая химия - 1995 - Т. 2!, №9 - С. 675 - 683.
2. Сидорова М. В., Кудрявцева Е. В., М. Л. Антопольский, М. Е. Палькеева, М. В. Овчинников, Беспалова Ж. Д. Перекись водорода для замыкания днсульфидиых связей в синтезе пептидов последовательности иммунодомннантиого зпитопа гликопротеина gp41 ВИЧ Н Биоорганическая химия - 1996 - Т. 22, №4 - С. 273 - 279.
3. Кудрявцева Е. В., Сидорова М. В., Овчинников М. В., Беспалова Ж. Д., Бушуев В. Н., Евстигнеева Р. П. Прямое превращение S-ацетамидометилзащищенного пептида ¿93 * 603 gp-41 ВИЧ-2 в циклический дисульфид при помощи йода.' Изучите побочных реакций И Биооргаиическая химия - 1996 - Т.22, №5 - С. 370 -375.
4. . Kudryavtseva E.V., Sidorova M.V., Ovchinnikov M.V., Bespaloia a.D. Comparative evaluation of different methods for disulfide bond formation in synthesis of
the Hl V-2 antigenic determinant // The Journal of Peptide Research - 1997 - Vol.49 №1 -pp. 52-58.
