Иммунохимическое исследование пептидных эндотоксинов и разработка методов их элиминации тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ У 3Б ИКИСТА Н

ИНСТИТУТ БИООРГАН ИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМЕНИ АКАДЕЛ1ИКА А. С. САДЫ КО ВЛ

На правах рукописи

КАДЫРОВА Асип Фаридонна

УДК 577.352

ИММУНОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПЕПТИДНЫХ

ЭНДОТОКСИНОВ И РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ИХ ЭЛИМИНАЦИИ

Специальность 02.1)0.10 — «Биоор!аническая химия, химия природных и физиологически активных веществ

А ВТОРЕ <!> Г: 1> Л Т диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ташкент — 1991

Работа выполнена в Институте биоорганической химии имени академика А. С. Садыкова АН Республики Узбекистан.

.Научные руководители: — доктор биологических наук,

профессор Ш. И. Салихов,

— кандидат химических наук, старший научный сотрудник Ш. К. Касымов.

Официальные оппоненты; — доктор медицинских наук,

профессор В- Б. Долго-Сабуров,

— доктор химических наук В. Б. Леонтьев.

Ведущая организация: — Московский Государственный

университет им. М. В. Ломоносова.

Защита состоится « ъ 1991 г в /О цЯс,

на заседании специализированного совета Д 015.21.01 при Институте биоорганической химии имени академика А. С. Садыкова АН Республики Узбекистан по адресу: 700143, Ташкент, проспект М- Горького, 83.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии имени академика А. С. Садыкова АН Республики Узбекистан.

Автореферат разослан « » С^^иЯДД/ 1991 Г-

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук чАУ/О С. И. МУХАМЕДХАНОВА

4

---------Актуальность исследования. Цногие патологические состояния

сопровождаются разситием эндогенной интоксикации","что""'приводит ------------

к накопление в организме больных эндотоксинов пептидной природы с молекулярной массой (!£1) от 300 до 5000 Да, которые являются продуктом усиленного катаболизма я протеолиэа белков. Несмотря чп то, что пептидные эндотоксины впервые были описаны в 1950 г. у. многие исследователи изучали их биологическую активность, физиологическое действие и строение, тем не пенсе многие попроси происхождения патогенных пептидов, механизма их действия и эффективны:: способов элиминации остаются нсясшп.:и. Известно, что хроническая почечная недостаточность (Х1Ш) сопровождается тяжелой интоксикацией, при которой происходит накопление в крови больных ряда низкомолекулярньгх веществ, в том числе и пептидных эндотоксинов, которые названы пептидами среднемолекулярной массы' (пептиды СМ).

Наиболее общим для пептидов СЛМ является мембранотропное действие. Изменяя структурно-функциональные характеристики кле-точтпя мембран, пептиды оказывают ингибирутацее действие на цели? ргд метаболических процессов, нарушает фильтрационную способность эритроцитов, процессы транспорта ионов и аминокислот в почках и эпителии, процессы переписного окисления липидов, функционирование системы гемостаза, ферментной и иммунной систем, функции нервны' клеток и др. В связи с этим актуальной является проблема удаления пептидных эндотоксинов из крови болыих. В настоя-га,ее время в клинической практике наиболее часто для очистки крови применяются методы гемосорбция и гемодиализа, недостатком которых является неспецифичноеть действия. Поэтому использование имчуноеорГ)пдон!шх методов, известных своей высокой чувствительности) и избирательностью, является перспвктиптм. Это направление еще не нашло широкого применения в клинической практике, известны •шшь примеры использования иммуносорбентов при аллергических заболеваниях. Кроме того, неспецифичными являются и используемые в настоящее ьремп способы детекнш пептидных эндотоксинов.

Поэт с ту рог.рпботка чувотрятельня* методой определения п?п"«и-пов СММ и высокосиецифичных. способов алиуиншши 1»'. из кроги боль-ньх с использованием г'иоепецифичееки/ сорбентов наряду с исследованием их действия на мембраны, фунш.ши нерпшх я иммуиннх систем является актуальным и будет иметь определенное значение длк практического здравоохранения..

Цель и задачи исследования. Основной целью работы являлось ¡'селедование свойств пептидов СММ из сыворотки крови больных ХПН к разработка метода их количественного определения, а также синтез иммуносорбентов с иммобилизованными антителами к пептидам СММ для очистки крови больных ХИН. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

- выделение пептидов СНЫ из сыворотки крови больных ХПН в терминальной стадии (тХПН);

- исследование нейротоксических, мембранотропных и иммуномоду-лиругсщих свойств пептидов СШ;

- синтез иммуногенных форм пептидов СММ и получение специфических антисывороток;

- разработка иммуноферментного способа определения пептидов СММ в сыворотках крови больных на микроуровне;

- синтез иммуносорбента на основе целлюлозной матрицы с иммобилизованными антителами к пептидам СММ.

Научная новизнр и практическая значимость исследования. Показано, что пептиды СММ, выделенные из сыворотки крови больных тХПН, нейротоксичны и проявлшт неспецифическуго мембранотропнуго активность, изменяет термодинамические параметры и проницаемость мембран. Разработаны подходы для количественной опенки мембрано-тропного действия пептидов СММ. Установлено, что пептиды СМ'.! не оказывают прямого действия на мембранотоксическую активность эф-фекторных лимфоцитов - естественных киллеров и угнетают синтез лимфокина интерлейкина-2.

Получены иммуногенные формы пептидов СММ - конденсат с Ш около 60000 Да и конъгагат пептидов СММ с имму ностимулирущи м полимером - суспензией окисленной целлюлозы. Разработаны оптимальные условия для получения специфичных антисывороток путем исследования динамики антителообразования.

Впервые синтезирован иммуносорбент на основе целлюлозной матрицы и иммобилизованными антителами к пептидам СММ для элиминации пептидных эндотоксинов из крови больных тХПН, использование которого в медицинской практике позволит сделать процесс де-токсикации более специфичным и эффективным.

Впервые разработана и внедрена в Республиканском центре гемодиализа иммуноферментная тест-система для определения пептидов СММ в крови больных ка микроуровне.

Публикации и апробация исслелопанк?.. Основные пою^енлр дйссертаглоноЗ работы бути доложены и обсувдены на Зсетрчон конгрессе по биохимии с ЧССР, г. Прага (ТО-ЗГО, на X О.'Челименноч

симпозиуме биохимических обществ" СССР-ГДР' "Механизмы'регуляции-------

клеточной активности" в г.Ташкенте (1989), на Международном симпозиуме по биотехнологии в ЧССР, Г.Прага (1988), 1У Всесоюзном симпозиуме химии белков и пептидов в г.Таллине (1937), на I Конференции биохимиков Узбекистана в г.Ташкенте (1986), на Юбилейной научной конференции молодых ученых и специалистов, посвященной 60-лети;о комсомола Узбекистана в г.Ташкенте (1985), на конференции молодых ученых "Актуальные проблемы укрепления связи науки и производства" в г.Зерганэ (1988), I съезде иммунологов Узбекистана ь г.Самарканде (1991). По полученным результатам имеется 8 публикаций.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на I9á"страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и обсуждения, заключения, выводов, списка литературы, включающего I0J наименований, из них flQ зарубежных авторов. Работа содержит 17 рисунков.

'йтериалн и методы исследования

Пептиды C:iM выделяли из сыворотки крови больных тХПН, находившихся на лечении в Республиканском центре гемодиализа I клиники ТаяГос!.Н. Д:л контроля исследовали сыворотку крови здоровых доноров со станши переливания крови ТашГосМИ. Для фракциончрова-ниг сыворотки крови использовали методы гелевой хроматографии на сефадексе Q-25 (Pharmacia, Швеция) и TSK-геле Toyo Pearl HW-50 Cíoyo Soda, Японии) л соответствии с рекомендациями фирм-изгото-яителе'К Лейротсксичоские свойства пептидов СММ исследовали на нервно-мышечном препарате лягушки Rana -femporari а с использованием стандартно.« микро-электродоой техники ОСаликулов, 1985). Исследование проницаемости и деформируемости липосом проводили по Бэнг-/емуÍBan£!iauI967). Микрокалориметрические измерения термотропных параметров мультиламеллярных суспензий димиристоилфосфатидилхоли-на (ДЖО и ДМЬХ в смеси с фосфатидилинозитом (ФИ) проводили на цит<5[ еронциая 11 сум скянипугкасм микрона яоримеуре ДАС*!- 1 (СССР) при

Г 1' от

скорости записи í'C/мт:. " *Р-ЯМР-спектроског:и о мембран эритроцитов человека проводили ня спектрометре XJL-20Q (beckmna, США). Дина ¡лиг/ ан?ителooíразорения изучали по wtOf.y Пене Cjerrse, X^Ior-ut п^, 1уСЗ). «унктонадыцг» активность ест-эствен-гл гилллров (ЕЮ исспедовали в мембрана-токсическом тесте по методу Шукса (Фукс, 1982). Клетками-мишенями служили опухолевые клетки эритро-миелолейкоза человека К-562. Активность синтеза интерлейкина-2

(ИЛ-2) тестировали, используя 96-часовые Т-клеточные бласты, активированные Конканавалином А (КонА). Активность ЕК и синтез ИЛ-2 изучали на мышах гибридах первого поколения (СВАхС57В1/(^ , полученных из питомника лабораторных животных АМН СССР.

Результаты исследований и их обсуждение I. Выделение и свойства пептидов СММ Для исследования использовали сыворотку крови больных тХПН, у которых уровень пептидов СММ, определяемый известными методами (Габриэлян и др., 1982; Салихов и д^.., 1985), превышал таковой для здоровых людей в 2-10 раз. Первоначальное разделение сыворотки крови проводили с помощью стандартной методики на колонке (1,5x100 см) с сефадексом 0-25, уравновешенным 0,01 М раствором СИдСОМ!^ рН 6,7. При этом было получено 12 белково-пептид-ных фракций (рисЛ). В результате проведения скрининга на бислой-ных липидных мембранах (БЛМ) было показано, что наибольшей активностью обладала фракция 1У, отсутствовавшая в крови здоровых доноров, что согласовывается с литературными данными (Мухамадиева, 1985;ВегсзЪгощ ., 1976).

Рис.1. Разделение сыворотки крови больного тХПН (сплошная линия) и здорового донора (пунктирная линия) на колонке (I,5x100см) с сефадексом 0-25 в 0,01 М растворе СНзССОЫа , рй 6,7. Скорость элюции 20 мл/час.

После накопления в препаративных количествах эту фракцию концентрировали и фракционировали на колонке (1,5x90 см) с 13 К-гелем НW-50,ypat¡HOвешенным О.ОсМ раствором Ktt^HCü-.pH 6,0.При этом было получено 9 фракций (рис.2), из котори;: мембранотропной активности) облпдали фракции пептидов 1У-3, 1У-5, 1У-7 с молекулярной массой (Ц\Р 3000, 2003 и 1500 Да соответственно. ,'1.т-ы<:»

D

фракции были использованы- нами для последующи исследований.

При проведении , N-концевого анализа было установлено," что фракции эти гетерогенны, содержат от 3 до 5 пептидов.

Рис .2. Разделение фракции IУ на колонке (1,5x30 см) с TSK-гелем HW-50 в 0,05 М растворе МНдНСОо, рН 8,0.

Скор§ст 18 мл/ч

ть эгатдяи час.

Наиболее характерными проявлениями активности пептидов СММ является, наряду с нарушением функций биологических мембран, нарушение обмена веществ вызываемое ими иммунодефицитное состояние. Поэтому для характеристики выделенных фракций пептидов исследовали ¡г; не?ротсксическое действие, влияние на проницаемость и термотропнне параметры модельных мембран, яолииорфгше превращения липидной фазы биологических мембран, влияние на реакции! клеточного иммунитета.

Немрото.чсическио свойства пептидов СМИ. Известно, что наиболее высокая концентрация пептидов СММ обнаруживается я '¿роза больных ХПН с периферической; цейрепатаей, а кейрот-.жсичнссто сыворотки крови больных ХПН обусловлена пресинаптическом механизмом действия (Акалаев, 1990; Punk-Bretano , 1976). В работе чэ-to4ov регистрации сюрттотрсясто потечпиала на нервно-мышечном препарат*- чягушк было ьокорано, что пептиды фрвчиаи 1У-3 ъ чо»~ пентрапии 10"? М вызывали дискретное увеличение »«стог!» ичнаа-тлрного потенпкяла kohiwoH пластинки (М1!КП/, т.е. из>глг?1ятг • скаитэдноЛ секрчрди «вдиктора. Увеличение частоты Щф, приисхо-дило в виде "пачек" с частотой в "пачке" о? 10 до 40 с" ^ о латентным периодом от 40 до 120 мин• Снижение частоты мембранного потенциала (МП) было незначительным и составляло от 2 до 6

r.-Б. Пептиды фракции 1У-5 и 1У-7 вызывали аналогичное, но гораздо менее выраженное действие.

Следует отметить, что частота в "пачках" прямо зависела от внеклеточной концентрации кальция. Полученные данные свидетельствовали о пресинаптическом характере действия пептидов СММ и согласовывались с данными литературы ( Funic-Brentano , 1976). Видимо, пептиды СММ определенным образом модифицирует пресинаптичес-кую мембрану, увеличивают поток кальция в аксоплазму нервного окончания и влияют на передачу нервного импульса.

Влияние пептидов СММ на проницаемость и деформируемость мембран- модельных липосом исследовали по их осмотическому поведению. Транспорт соли через мембрану сопровождается осмотическим потоком воды в том же направлении. Вследствие изменения объема частиц меняется мутность суспензии; увеличение объема липосом сопровоада-ется увеличением светопропускания и наоборот. На рисунке 3 представлена кривая изменения светопропускания суспензии липосом при добавлении насыщенного раствора KCl в присутствии пептидов С1®. рголь .....

пептиды " V

Хи, смн '

25

•20

ib

Рис.3. Кривая изменения светопропускания суспензии липосом при добавлении насыщенного раствора KCI в присутствии пептидов СММ.. lio оси абсцисс -время в минутах. По оси ординат -светопропускание (в К).

о ^ 1 г

Величина А характеризует степень сжатия липосом - чем больше А, тем сильнее липосомы сжимаются; величина Аотн характеризует изменение степени сжатия липосом:

А,

отн

VA А„

х 100-',

(А0 и А - амплитуда сжатия липосом в контроле и опыте соответственно).

Угол сХ. характеризует проницаемость мембран липосом: если угол Ы. павен нулю, то мемГрчня не проницаема.

При проведении исследования- было установлена, что пептиды смм в концентрации мг на мг липидов не вызывали изменений проницаемости и деформируемости модельных липосом. Однако увеличение концентрации пептидов СММ до2,2 мг на мг.липидов приводило к росту значений Аотн и угла аС , что свидетельствует об изменении степени сжатия липосом и их проницаемости. Так как эти изменения были примерно одинаковы .для ионов На+, К*и для глюкозы, можно предположить, что наблюдаемое эффекты носили неспецифический характер.

Действие пептидов СМ на термотрепнне параметры модельных ФосФолипидных мембран. исследовали методом дифференциальной сканирующей микрокалориметрии. Добавление пептидов фракции 1У-3 к нейтральной суспензии ДМФХ приводило к уширению пика основного фазового перехода Тп и сдвигу его в область высоких температур (таблД). Эффект действия пептидов СШ фракции 1У-3 значительно возрастал на образцах липидов ДМФХ+5молоФИ, несущих отрицательный поверхностный заряд при рН 7,5. При этом значительно возрастало и значение энтальпии дН, в отличие от неизменного в системе ДМФХ. Из анализа данных таблица I видно, что эффект действия пептидов фракции 1У-5 был аналогичен действию фракции 1У-3, а пептида фракции 1У-7 не вызывали изменений термодинамических параметров исследованных мембран.

Таблигда I.

Образец : 4Н, +1: :Дж- град : тп, °с

ДМФХ, контроль 3,88 24,8 1,0

ДМФХчфракдая 1У-3 ' 3,92 26,2 2,4

ДМФХ+фратшя. ]У-Ь Л, 45 ГМ 7 1,1

„'Ш+фракпия 1У-7 3,86 24,0 1,0

ДМ5Х+5мол£ЙБИ, контроль 3,61 24,3 1.6

ДМФХ+омол^ФИ+фракция 1У-3 4,13 30,2 6,4

Щ1г< »5 мои" 'ЛИ+фракипя 1У-& 3,80 24,8 1,95

ДМ5Х+ймс.т"''5И+фрнккил 1У-7 3,60 24,3 1,6

Видимо, пептиды Фракции 1У-3 и в меньшей степени Фракции 1У-5 связывались с полярной частью липкдпого йяслоя, в результате чего происходит стабилизация структуры мембраны.

Наиболее активная при изучении ыембранотропкых и нейроток-

С

1,1 веских свойств и содержавшая, по-видимому, основную часть пептидных эндотоксинов, фракция 1У-3 была изучена нами на биологических мембранах и в дальнейших исследованиях.

Влияние пептидов СММ на мембраны зритронитов человека. Ранее было показано, что во многих случаях г"диморфизм биологических мембран коррелирует с проявлением их функциональной активности (Шрегин, 1984). Нами было проведено исследование полиморфных превращений липидной фазы мембран эритроцитов больных тХПН и здоровых лиц в зависимости от температуры. Методом ^Р-ЯМР-спектро-скопии было установлено, что при увеличен™ температуры мембраны эритроцитов здоровых людей отвечали полиморфными превращениями липидной фазы (рис.4а). При исследовании мембран эритроцитов больных тХПН подобных эффектов не отмечали (рис.46). Отсутствие полиморфных превращений липидной фазы мембран эритроцитов больных свидетельствует об ограничении динамики их липидной фазы и может быт ь следствием действия пептидов СММ._

| зт

Рио.4.Зависимость от температуры формы Р-ЯМР-спектров; а- мембраны эритроцитов здоровых людей; б- мембраны эритороцитов больных тХПН; в- мембраны эритороцитов здоровых людей в присутствии пептидов СШ (0,1мг пептидов в I мл суспензии меморан эритроцитов).

Для подтверждения этого предположения мы исследовали мембраны эритроцитов здоровых доноров, модифицированные пептидами Фракции 1У-3. Действительно, как видно из рис. 4 С, изотропный сигнал, характерный для мембран эритроцитов здоровых доноров, исчезал при добавлении к ним пептидов С!.£<! и ЯЧР-спектры их соответствовали

ЯМР-спектру мембран-эритроцитов-больныхтХПН. ' — -'- ------------------

Таким образом, можно заключить, что пептиды СММ вызывали ограничение термоиндуцируемых превращений липидной фазы мембран эритроцитов здоровых людей. Если соотнести приведенные нами выше результаты, полученные на модельных мембранах, с результатами исследований мембран эритроцитов, можно заключить, что ограничение полиморфизма биомембран происходит за счет взаимодействия гидрофильнее группировок пептидов с заряженной липидной областью ыеыб-раны. ■■'•--•.

Несмотря на то, что изучению мембранотропной активности пептидов СММ посвящено большое число работ (Галактионов и др.,1982-1935; Мухамадиева, 1985; ЗсЬИерег , 1930), они в основном дают качественную оценку биологической активности пептидов. Полное исследование физико-химических свойств пептидов СММ с количественной оценкой проницаемости, деформируемости, термодинамики и полиморфизма мембран при взаимодействии с пептидными эндотоксинами было проведено нами впервые. Эти подходы могут послужить основой для разработки количественных методов изучения мемб-ранотропных свойств пептидов (М.1.

Влияние грптипое .С.'.Ч на функционирокание системы естественных киллеров и интерлейкина-2. Для более полной характеристики выделенной нами пептидней фракции 1У-3 целесообразно было исследовать ее роль в развитии иммунодефичитного состояния, возникающего при ХПН, в модельных опытах. В настоящее время выявлены и изучены иммуномодулирующие свойства пептидов СММ (дмло et а1., 1975-1930; и др.). Рядом авторов показано, х)то снижение показателей иммунного ответа при ХПН прямо связано с мембранотоксическим и пнтотоксическим действием пептидов С;.М" (Полуэктов и др., 1990).

При исследовании иммукомодулируулцих свойств пептидов СММ изучали их влияние на систему естественного киллинга, в частности, на активность естественных киллеров (ЕК), т.к. биологическая роль ЕК в качестве 2 уровня иммунной защиты имеет практическую янг.««мость дпя клинической редкгапш и влияние пептидных эндотоксинов на нео ье изучена. Одновременно исследовали влияние пептидов СММ на синтез одного из кпюч»рых трегокинов иммунной системы - интерлейкина-2 (ИЛ-2^, т.к. ИЛ-2 является частью системы, регулирующей уровень естественной мембране- и цитотг.лочч-ности в организме, и его присутствие необходимо для потенцирования и поддержания активности ЕК (охЧаЫо et а1,1984 ).

Исследование активности ЕК и синтеза ИЛ-2 проводили в модельных опытах на мышах гибридах первого поколения (СВАхС57В/)

Активность ЕК клеток селезенок животных тестировали, используя мембранотоксический тест с ^Н-уридином (Фукс, 1982) в соотношении эффектор/ мишень 100:1 на 7, 14. и 30 сутки после введения пептидов СММ. В качестве клеток-мишеней использовали линию'эрит-ромиелолейконых клеток человека К-562. Мембранотоксический эффект лимфоцитов оценивали по высвобождению радиоактивной метки, включенной в культуру клетки-мишени.

Контролем служила активность ЕК клеток селезенки интактных животных.

При проведении исследований было установлено, что пептиды СММ не оказывали прямого влияния на функциональную активность ЕК клеток селезенки мышей (рис.5).

30* А €

а*

*>1- 4 г V г 4 г

Рис.5. Мембранотоксическая активность ЕК у мышей: а 7 день, 6-14 день, в - 30 день опыта. 1а, Ю, 1в - контрольная группа животных (интактные) 2а, 26, 2з - опытная труппа животных (пептиды СММ) Соотношение эффектор/мишень - 100:1. По оси ординат -активность ЕК (в %).

Далее исследовали активность синтеза ИЛ-2 в те же сроки, что я определение активности ЕК. При этом оценивали суммарную Т-роетовую активность продуктов лимфоцитов, стимулированных мито-геном КонА. Поскольку основной эффект этих продуктов обусловлен ИЛ-2, мы с определенной долей условности обозначали Т-ростовую активность как активность ИЛ-2.

Изучение синтеза ИЛ-2 проводили с использованием 96-часопнх Т-клеточных бластов, активированных КонА в тех же условиях, что и ИЛ-2. Как показали результаты исследований, пептиды С!>М окапывали влияние на синтез Ш-2, причем эффект носил дпух'гяят!" характер: на 7 сутки после вгедсниг пептидов СП >т':;и отг.ечл.'ч; мр-

чительным - на 54'* - угнетением продукции ИЛ-2. К середине опыта на 14 сутки происходила активация продукции^этого лимфокина на 1Ъ% по сравнению с контролем, а к концу исследований на 30 сутки регистрировали угнетение синтеза ИЛ-2 на 27* (рис.6).

•100% КОНТРОМ Рис.6. Продукция ИЛ-2 у мышей. По оси ординат -продукция 111-2 (в По

оси абсцисс - сроки после введения пептидов СММ (в днях). .

? 30

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о влиянии пептидов СММ на способность лимфоцитов продуцировать ИЛ-2 под действием митогенного стимула в сторону стойкого ингибирования синтеза ИЛ-2.

2. Разработка иммунохимического метода для элиминации пептидных эндотоксинов Высокая биологическая активность и токсичность пептидов СММ требуют их эффективной элиминации из крови больных. Однако, существующие в клинике методы детоксикации крови больных ХГШ (гемодиализ, гемосорбция) неспецифичны, что приводит к удалению жизненно-важных компонентов крови - гормонов, аминокислот, витаминов и др., и недостаточно очищают кровь от пептидных эндотоксинов. Поэтому значительный интерес представляют высокоспецифичные имму-но"имические методы с использованием сорбентов с иммобилизованными антителами к пептидам СХ1. Для получения иммуносорбемта необходимо иметь специфические антитела в достаточном количестве и разработать чувствительные методы определения пептидов СММ в кропи больных для контроля за процессом удаления пептидов.

Получение иммунных сывороток. Для получения иммунных сывороток с высоким титром антител необходимо было получить иммуноген-ные формы пептидов С!,И, т.к. низкомолекулгрные пептигл обладает слабой иммуногенностьа, а такт.е разработать оптимальную схему иммунизации ймеотнму путем определения тшнч'.шни антителоо'рг.зорямиг.

Чтобы перевести небольшие молекулы ь огенное состог'ие, можно конденсировать их п части-ли большего размера к-.к ггрисочдк-

нять к соответствующему высокомолекулярному носителю. Нами были использованы оба подхода.

Для получения конденсата пептидов СЖ! фракцию 1У-3 обрабатывали бифункциональным сшивающим агентом - глутаровым альдегидом (ГА). При разделении продуктов реакции гель-хроматографией на се-фадекез &-50 было получено три фракции с ММ около 60000,10000 и ■3000-5000 Да, Высокомолекулярную фракцию (конденсат с XI 60000 Да) использовали для иммунизации животных.

Для иммобилизации пептидов СШ на высокомолекулярной целлюлозной матрице проводили сначала окисление целлюлозы раствором '.NaOO^ в карбонат-бикарбонатном буфере, рН 9,2. Затем к полученной. диальдегидцеллюлозе добавляли водный раствор пептидов СШ.

• ^ - целлюлозы - „ „

После инкубации суспензии^отмывали несвязавшися пептидным материал физраствором. Полученный конъюгат пептидов СШ с суспензией окисленной целлюлозы (С0Ц) использовали для иммунизации животных.

При разработке оптимальной схемы имцунизации животных исследовали динамику антителообразования.

Для этого мышам вводили эритроциты барана, а через 4 дня животных опытных групп иммунизировали следующими препаратами: пептиды СШ (I группа); конденсат пептидов СШ (2 группа); комь-югат пептидов СШ с С0Ц (3 группа); пептиды СММ с полным адъго-вантом Фрейвда (ПАФ) (4 группа); пептиды СШ в смеси с ООЦ (5 груша).

Контролем служила группа животных, иммунизированных только эритроцитами. Число A0K определяли на 4, 7, 15 и 30 день опыта по методу Ерне (Jeme ( xíoi-dins ■ , 1963).

Рис.7. Влияние пептидов СЬИ на количество А0К к эритроцитам барана у мышей: пептиды СШ (I), конденсат пептидов С'.1М (2), конъюгат пептидов СММ с С0Ц (3), пептиды СШ с ПАФ (4), пептиды СШ в смеси с С0Ц (5). По оси абсцисс - сроки исследования (в днях по оси ординат - А0К (в '„>).

4 г ы

ш

--------------Как, индиец из._рис. 7, коздснсат, коньюгат пептидов с ССЦ и

пептиды o ÍIA5 вызывали значительный рост числа АОК в .ранние сроки эксперимента. Затем происходило резкое снижение числа АОК, что было связано, бипкмо, с проявлением токсического действия модифицированных пептидов СШ. Б группах, получавших пептиды СШ и пептиды в смеси СОЦ,токсическое действие и угнетение числа АОК происходило сразу и постигало максимума на 4 сутки опыта. К концу эксперимента на ¿0 сутки число ЛСК во всех группах животных достигало контрольных значений, что сеязоно, видимо, с химической деструкцией или дезактивацией пептидных эндотоксинов в организыз.

Такт/, образом, установлено, что максимум числа АОК в случае иммунизации конденсатом, коньюгатом пептидов СШ с ССЦ и пептидами с Mí приходится на 4 день. Наиболее активно стимулирует образование зрелых антителопродуцирующих клеток конькзгат пептидов с СОЦ. Зто позволило выбрать схему иммунизации кивотных, которую проводили однократно с последующей реиммунизацией через неделю и забором крови через 15 и 30 дней.

Антигенную специфичность полученных сывороток проверяли с помощью ША метода, в котором сывороточшЯ альбумин человека использовали в качестве антигена для адсорбции на планястах в тех ке весовых концентрациях, что и пептида СЩ. Антисыьоротки к пептидам C'.Zá не обнаружили перекрестного связывания с альбумином. Затем антигенную специфичность иммунных сывороток устанавливали методом ИЗА в реакции конкурентного тормокения активности антител нормальной человеческой сывороткой, сывороточлам альбумином человека, белками острой фазы - церулоплазмиком, орозонукоидом, гаптоглобином.

В результате было установлено, что белки острой фазы, нормальная человеческая сыворотка к сывороточный альбумин <-елогека не ингибируют антитела к пептидам CLÜÍ а ш-илупной сыворотке кролика. Таким образом, полученная сыворотка является специфичной, содержит антитела только к пептидам CI.5Í, a сами пептиды CI.L1 с указанными белкош но иыгат дегермттктнгк участков.

Разработка V.j тост - ей г.?; ..у i. Cy:;ecT¡ ynv.n? moto;".; детекции пептидов СШ в крови Со&ышх нвепедифала: {ГаОри^ллн и др., I9G2; Салкхов и др., 1-Х--). так как при ото;,! а.^ъг^лг^т с.':«»? пул поптн'о'; с по -..ООО XW/0 гу.ч г:-::".:;;" , ;;r.t*r..;r:< с спесг: составе .ппяпн, и комке К'агго фиппологи.'-о.кн

:тл¡ко глптидн. ncr.TOî'v наук '.'ил рязра'.'отпн го^/^гт'^п-о:;:

микрометод определения пептидов СММ с помощью ИФА. В данном варианте ИФА ингибирование антител вели сыворотками крови больных тХПН при сравнении с раствором пептидов СШ известной концентрации. Вывод о наличии пептидных эндотоксинов в крови больных тХПН делали на основании снижения активности антител после предварительной инкубации с сыворотками больных. По калибровочной кривой определяли количество пептидов СММ в анализируемых сыворотках.

При разработка Ш тест-системы были подобраны условия проведения анализа: концентрация антигена, температура и время инкубации, ионная сила и рН буферного раствора ¡:л>- • ч%./ч-л Антигенов на планшетах. Разработанная нами ИЗ? тест-система на 2-3 порядка чувствительнее известных методов (табл.2) и позволяет количественно определять пептиды СММ в сыворотке крови на микроуровне.

Таблица 2.

Количество пептидов СШ, определяемое различными методами

: : Метод Салихо-: Метод Габ-

: ИФА : ва и др. : риэлян и

: (1985) : др. (1982)

Количество сыворотки крови 0,05 400 1000 для анализа (мкл)

Минимальное количество опре- 0,05 5-10 50-100 дедяемого вещества (мкг)

Преимуществом метода Шк является также то, что .в анализе можно использовать не чистые антитела, а иммунные сыворотки животных. Данный метод был успешно апробирован в лаборатории клинической иммунологии 2-го ТаиГос'.М.

Синтез иммунных сорбентов. Следующим этапом работы был синтез иммуносорбента с иммобилизованными антителами к пептидам СММ. Антитела выделяли кз получешшх нами иммунных сывороток. Для этого синтезировали иммуносорбент, где в качестве матрицы использовали высокоемкий пространственно сшитый полимер на основе целлюлозы - целлопор, а в .качестве лиганда - пептиды о'Ш. Ход реакций синтеза иммуносорбента показан на схеме:

■ А

Снг0н

'1

с н,0и

А

/

1\

С'

I.

о

\|с

а

си

ч- НаН-В.

СН.ОН

" CH20ll

о,

О

1/

п

где R - пептиды С'.И или антитела.

Целлопор сначал? окисляли 0,02 М раствором метапериодата натрия в 0,15 М растворе MaCI, затем продавали физраствором и инкубировали с раствором пептидов СММ (фракция 1У-3). Образующиеся И'иффовы основания восстанавливали водным раствором боргидри-да натрия.

Через полученный нимуносорбент пропускали иммунную сыворотку несколько раз для максимального насыщения антителами. Затем элюи-ровали аффинносвязанные антитела с сорбента 0,01 М раствором HCl в 0,15 М растворе MaCI, pH 2,2 (рис.8). Методом ИФА было показано, что 5 мг пептидов СММ, иммобилизованных на I мл целлопора, связывали 42-75 мкг антител. Всего было выделено около 700 мкг антител.

Далее выделенные антитела использовали для синтеза км.чуно-сорбента путем иммобилизации их на целлопоре. Суспензио целлопора после описанно/ вше активапш метапериодатсм натрия инкубировали с рястрором антител. Ход реакции аналогичен представленному на счеме.

Chuwtiponmmr* таким образом длинный кммуносорбент "нел-

юпср-ачтиг',лс" с fwoftu^npmwvK антитела'.".' тстолс-зомд.* длг удаления пептидов СММ из сазоротг:и кроик Со".;ч: •• т'.С'л. ,"ля '-того колонку (2,5x3 см), наполкент") "¡."г/носср^октсм, ургяиэкгжеали 0,15 M pic: горем MaCI, a пяте." через нее ппгл."скт.-и ov.nor.oTj';/

целлопоре пептидами C.V.M. Злэтшгэ антител проводили 0,01 M pacTBotioM HCl з n Т1 M пв^ппм КГяГТ

Рис.3. Выделение антител на колонке (2,5x3 см) с с иммобилизованными на

O.ïo M растворе tiaCI, рЛ 2,2 (указано стрелкой)

MaCI

крови больного тХПН. После этого отмывали сорбент 0,15 М раствором • КаС1 и элшровали аффинносорбкровавшиеся пептиды СММ 0,01 М раствором НС1 в 0,15 М растворе .МаС1, рН 2,2 (рис.9).

0.6 х

0.3

Рис.9. Выделение пептидов СММ из сыворотки крови больного тХПН на колонке (2,5x3 см) "целлопор-анти-тело". Элпцкю пептидов СММ вели 0,01 М раствопом HCI в 0,15 М растворе MaCI, рН 2,2 (указано стрелкой).

2о 40 60

В результате было получено два лика: пик I, который содержал белки и пептиды плазмы крови, не сорбировавшиеся на колонке, и пик П, который элюировался раствором НС1 и, как мы предполагали, содержал аффинносорбирующиеся пептиды СММ. Для доказательства эффективности иммуносорбента "целлопор-антитело- необходимо было установить отсутствие фракции эндотоксинов в материале пика I и идентичность пика II с материалом фракции 1У-3 (см.рисЛ и2).

Материал пика I подвергали гель-хроматографии на колонке (1,0x10 см) с сефадексом 6-25 в условиях, аналогичных для рис Л. Как видно из рисунков I и 10»в данном случае действительно отсутствует фракция пептидных эндотоксинов.

£т

ня

io 10 30 — 10.Л

Рис.10. Разделение фракции I на колонке (1,0x10 см) с сефадексом G-25 в 0,01 М растворе ОЦССОЫа, рН 6,7, скорость элюции 18 мл/час.

Материал пика П пропускали через колонку (1,0x10 см) с Т5К-гелем И№-50 в условиях, аналогичных для рисунка 2 (рис.И). Как видно из рисунков 2 и II-, при этом на плюцконной диаграмме при-тстиуаг только один пик, соотвзтстг/ший по своему пику

«_2с:- ----------—

Рис.11. Разделение фракции II (рис. 10) на колонке (1,0x10 см),с Тгк-гелем, Н$-50 в 0,05 М растворе ЫаН-НСЮч, рН 8,0, скорость элю-ции 16 мл/час.

1У-3 на рис.2 и отсутствует высокомолекулярная фракцяя, содержащая предшественники пептидов CJ.C.f.

Затем определяли содержание пептидов СММ в пике II (рис .11) с помощью разработанной нами ИФ тест-системы по калибровочной кривой. Установлено, что 95% материала фракции составляют пептиды СШ. Таким образом, с помощью колонки с иммуносорбентом "цел-лопор-антитело" удалось очистить образцы крови больных тХПН от пептидных эндотоксинов с высокой степень« избирательности.

Было интересно сравнить свойство связывать пептиды СШ сорбентом "целлопор-антитело" с другим подобным сорбентом. Для этого использовали сорбент, где матрицей служил целлопор, а лиган-дом - сывороточный альбумин человека ("целлопор-альбумин"). Выбор альбумина объясняется известным сродством его к пептидам СММ и тем, что в медицинской практике щироко используют его детокси-кационные свойства. Сорбент "целлопор-альбумин" синтезировали аналогично синтезу иммуносорбента "целлопор-антитело" а затем через него пропускали сыворотку крови больного тХПН при тех же условиях, что и в случае сорбента "иеллопор-антитело" (рис,9). В В результате такте получено два пика. В материале пика II определили содер.-гение пептидны* эндотоксинов с помощью ',!$ тест-системы, При этом было установлено, что токсичные пептиды СММ составляют менее 303 материала пика.

Так- как сорбент "целлопор-альбумин" наряду с пептидными эндотоксинами связывает и нетоксичные пептиды, среди которых могут i'vrk и г'нпнгнноважнкс, то дпнт''-5 сорбент не гвлгетег спег.ифи'-HVJ.

Таким образом, в результате яроведеник'- иссл «копани'< показа ип приш'нпилльилг го.т.'о'-'нссть при"'енлни;: '/'."."'ио^ор'ентор с f'Oüi',;.'.'i3C.'.n!i:!-:'и к пепг.сш'м rmwsrcaHT' апс и?Я-

ческого угалрнкг пептидов С'.Г.! из сыворотки кропи больны.' тХПН. ,1't гчтре'пп цпнчого родчодч " кл:тич'»с!сг'> ппактиг/ необ-">д:г«о ••• 071. nrr.".;trj' C.W '■' е.!патлла к ч'/v в достлю'-üiru о

этого можно достичь использованием синтетических аналогов пептидов и получением антисывороток путем иммунизации крупных жизотных.

ВЫВОДЫ

1. Из крови больных хронической почечной недостаточностью в тер, минальной стадии выделены пептиды среднемолекулярной массы

(1500-3000 Да). Показано, что пептиды СШ нейротоксичш и проявляют неспецифическую меыбранотропную активность, изменяя термотропные параметры и проницаемость мембран, что влечет за собой изменение физиологической активности мембран.

2. Исследовано слияние пептидов СШ на мембранотоксическую активность естественных киллеров и синтез интерлейкина-2. Показано, что пептиды не оказывают прямого дейстьия на активность киллеров и вызывают угнетение синтеза интерлейкика-2, которое носит двухфазный характер.

3. Получены иммуногенные формы пептидов C1.LM, и на основании исследования динамики антителообразования разработана оптимальная схема иммунизации животных.

4. Разработана иммуноферментная тест-система для определения пептидов СММ в сыворотке крови больных на микроуровне.

5. Впервые синтезирован иммуносорбент с иммобилизованными антителами к пептидам СО, позволяющий избирательно удалять пептидные эндотоксины из крови больных тХГШ.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ Д1!ССЕГ

1. Мухамадиева 11.Г., Кадырова А.Исследование иммунохимических свойств пептидных эндотоксинов, накапливающихся при хронической почечной недостаточности, и разработка методов их элиминации// Юбилейная научная конференция молодых ученых и специалистов, посвященная 60-летию Ленинского комсомола Узбекистана. Тезисы докладез.-Ташкент,I98b.-C.I20.

2. Иммунохимическое исследование коньюгатов пептидоз, накапливающихся £ крови больных хронической почечной недостаточностью и острой почечной недостаточностью./А.Ф.Кадырова, 1,.ГЛ!ухама-диева, IL.К.Касимов и др.//1 конференция биохимикоь Згзбекиста-на.Тезисы докладов.-Ташкент, 19£6.-С.2Е4-2Е5.

3. Исследование пептидных эндотоксинов, накапливающихся гри некоторых патологических состояниях почек, г целью разработки методов их удаления./А.Кадырова . М.Ахундганов, I'. .К.КаеымоЕ и др./'/1У Всесоюзный симпозиум w химии белков и пептидов. Сборник тезисов.-Таллинн,\1{ПU.I&7.

Ясс ладо ¡-а»'«* рлияго« пептид arc эндотоксинов на процессы m.i-мунорегулнции./А.Ф.Ьадыроьа, L.K.KactiMoa, !!.'.И,С»лихоя и др.

//ХСм*дтichuhS cw озпуу биохимических обществ"СССР-ГДР""^------------------------

хзнизш х^г^чяции к.геточяой ахтиыюсти". Тезисы докладов.-

. Ксследогение иембрвнотропного действия пептк;;ов, возникающих при хронической почечной недостаточности./А.'2.Ка.чдгрова, Е.Б. Потиевскэд, Б.А.Сгичлутдинов и др.// ДАН УзССР.-1990.-М.-С. Ы-52.

I. Изучение специфических антис.ывороток к "средним молекулам" и

исследование к методом иммуноферыонтного анализа./А.Ф.Кадырова, И:.К.Касымов, Ь-.н.Салихоь и др.// ДА11 УзССР.-1991.-.¥7.-

Stady of atructyre and function of toxic peptides formed during various pathologies / Sh.I.Salikhov, A.F.Kadyrova, E.K. oultanova et al.// 14th International Congre3a of Biochemistry. Prague, July 1988: Abstracts. - Prague, 1988.

- Vol. 5: - P.51.

peptide endotoxins are bioregulators of cells proliferation/ 3h. 1. 3a liVhov , A.F.Kadyrova. 3h. K. Kasytaov et al. //Biotech-nological aspects of protein production by cultured cella. Prague, July 19Ud: Abatracta. - Prague, 1968. - Vol. 5 ;

- P.233.

дгшкзми x j ч.чцгп Ташкент, I" ЕЭ. -С. 34

С .42