Создание иммунопотенциирующих систем для пептидных экспериментальных вакцин тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

■ ■ АКАДЕМИЯ НАУК СССР

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИООРГАНКЧЕСКОИ ХИМИИ ИМ. М.М. ШЕМЯКИНА

На правах рукошси УДК 577.112.083.3:615.371 578.835:578.233.2

ИВАНОВ Борис Борисович

СОЗДАНИЕ ИШУНОПОТЫЩШРУПШ СИСТЕМ Ш. ПЕПТИДНЫХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ВАКЦИН

02.00.10 Биоорганяческая химия, химия природных и физиологически активных соединений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата гшиггазских наук

МОСКВА - 1592

Работа выполнена в Институте биоорганической химии од. K.M.Шемякина ¿Я СССР

Научный руководитель:

Академик АН СССР, доктор химических наук,

профессор В.Т. Иванов

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук В.П. Карелин

Кандидат химически наук О.Ы. Волышна

Ведущая организацая: Институт иммунологии АМН СССР

Защита состойся "15 " января_1992 г.

в 10 час на заседании специализированного совета Д 002.35.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук цри Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина АН СССР по адресу: 117871 ГСП Москва В-437, уд. Миклухо-Маклая 16/10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. М.М.Шемякина АН СССР

Автореферат разослан " ^" I 1991 г-

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химически наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблем*. Выдвижение идеи вакцин нового поколения, т.е. синтетических и рекомбинантных вакцин, открыло новые перспективы в борьбе, с заболеваниями инфекционной природы.

В аминокислотных последовательностях белков ряда патогенов были локализованы антигбнше детерминанты (АД), некоторые из которых играют ключевув роль в развитии иммунитета против заболевания. Однако, испытанные синтетические вакцины на основе этих АД оказались недостаточно эффективными, в основеом, вследствие низкой иммуногенкости и ЫНС-ограниченности иммунного ответа па конкретные АД. Кроме того, разработка синтетических пептидных вакцин значительно ослоетена отсутствием эйективных адъюзантов, пригодных для клинического применения.

Современные исследования возможности повышения иммуногзнности синтетических антигенов ведутся по двум основным направлениям. Первое направление подразумевает улучшение шмуногеннкх свойств самого антигена введением дополнительных Т-эиитопов в носитель или антиген для активации специфической Т-клеточЕой помощи, преодоления ' МНС-контроля и создания иммунологической памяти. . Второе направление основывается на неспецифической стимуляции иммунного отезтэ с псмощыо иммуномодулятороз или за счет улучшенного представления антигена иммунной системе. Задачей этого направления явхчется нахождение оптимального пути соединения компонентов вакцпны для повышения эффективности вакцинации.

Настоящая работа посвящена изучения возможности повышения кммуногевности пептидных вакцин без использования дополнительных Т-эпитопов.

Цели и задачи, работ. Целью настоящей работы являлось создание полностью синтетических систем для иммунопотенциирования пептидных В-эштопов за счет Т-независимой не специфической стимуляции иммунной системы.

При разработке иммунопотенциирувдей системы для пептидного В-зпитопа мы выделяли следующие задачи:

- Создание полностью синтетических конструкций на основе пептида (манр) ^ ИЗ сб-белка Р1авко(Иит ¿а1с1рахиа, ВЦбрЗННОГО НЭМИ в-качестве модельного неиммуногенетго пептида, и сравнение их

иммуногенности с классическими пептидно-белковыми конъюгатами. Мы стремились также изучить влияние на ишуЕогенность типа и характера связи пептидных антигенов с синтетическими носителями и адъювантами.

- Изучение возможности преодоления МНС-рестрикции антипептидного ответа .на модельный пептид (иаыр)3 с помощью Т-независимой . стимуляции иммунной системы.

Научная новизна и практическая ценность работ. Синтезирована серия конъюгатов пептида (ыаир)3 с белковыми и синтетическими носителями. Показана возможность создания полностью синтетических . Т-независимых нммунопотенциирущих систем .для пептидных В-эдитодов. В процессе изучения иммуногенности конъюгатов получены новые данные о влиянии иммун&адъввантоз на индукцию антипептидного ответа. Показана возможность преодоления МНС-рестрикции иммунного ответа на неимыуногеншй пептид без использования дополнительных Т-эпитопов.

Методические подхода, разработанные в данной работе, могут быть использованы в синтезе иммуногенных конъюгатов для получения гипериммунных сывороток или вакцин; Разработанные способы повышения иммуногенности пептидов применимы для любых пептидных антигенов в составе синтетических вакцин.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано и направлено в печать 13 работ.

Апробация работ. Результаты настоящего исследования доложены на ряде всесоюзных и международных симпозиумов: на симпозиуме "Структура, биосинтез и функции молекулярных элементов иммунной системы" (Пущино,1987), на vn Всесоюзном симпозиуме "Химия белков и пептидов" (Таллин, 1987), на иол-симпозиуме (Парк-Сити,'' 1988), на 7-ом СССР-ФРГ симпозиуме по химии пептидов и белков (Дилижан, 1989), на исьА-симпозиуме (Фриско, 1990).

Объел работ. Диссертация изложена на I2S страницах, состоит из введения, 3 глав и выводов, содержит II рисунков, 6 схем, 13 таблиц, в списке литературы цитировано 156 названий. Е главе I приведен обзор литературных данных по "Способам повышения иммуногенвости вакцин нового поколения", в главе II содержатся результаты исследований и их обсуждение, в главе III изложень экспериментальные методы.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Повышение кммуногенности антиггшого материала, как правило, выделяется в отдзльнув задачу в каждом случае создания вакцинного препарата или получения гипериммунной сыворотки. Особенио остро стоит эта задача для пептидных антигенов, которые является основой вакцин нового поколения. Свободные короткие пептида (до 20 аминокислотных остатков) часто не способны индуцировать образование антител. Ковалептвое связывание таких пептидов с крушили белками приводит к развитии полноценного иммунного ответа на комплекс белок-пептид. Однако, природные белки-носители обладают рядом существенных недостатков. Включение в состав синтетических и рзкоыбингнтных вакцин пептидных Т-эпитопов позволяет олкминировать недостатки белковых носителей и создавать полноценные синтетические иммуногекы. Тем Ее кзнее, даже при таком подходе создание эффективной вакцины затруднено из-за генетической рестрикции иммунного ответа на тимусзависимые антигены, которая реализуется через ir-гены на уровне Т-лимфоцитов. В генетически неоднородной популяции ir-рестрнкция может привести к тому, что часть индивидуумов слабо ответит иле совсем не ответит на определенный антиген.

Повышение Еммуногенности пептидов за счет неспецифической стимуляции, без подключения дополнительной Т-клеточяой помощи -один из путей решения проблемы эффективности синтетических вакцин. Помимо того, существуют объекты, для которых необходимо создание высокого (хотя и краткосрочного, без эффекта памяти) гуморального ответа на эндогенный В-зпитоп, как например, в случае Ентифзртильных. вакцин, основанных на пептидных гогконах.

К моменту начала настоящей работы было' изезстно несколько подходов к повЕшению иммуногенЕости синтетических пептидов за счет неспецифической стимуляции. Это использование синтетических носителей с тмуномэдулягорными свойствами ( Р.В. Петров и др.), КСВЪЕГаЦЕЯ пептидов С адыованташ (Carelii С. et al., Wiesmuller к.-н. et ai.), дерззатнзация пептидов жирными кислотами (норр et al.) , использование пептидоз 3 составе ЛИПОСОМ (Richards R.L. et

al., Frisch В. et al.). .

Козалентнгя конъюгация с антигеном или ассоциация в составе липосом таких шмуЕоадъювантоз как тафгсин, иурамилпептиды,

липополисахарид ДОС). л-концевой лилопентапептид мембранного лшопрогеша E.coii (Pain3cysssNA) значительно повышает иммунный ответ на антит-еин, содержащие Т-эпитош. Влияние адъювантов на иммуногенность пептидов, не содернащих Т-эпитопов, не было изучено в достаточной мере и представляет определенный интерес.

Основываясь на этих исследованиях, мы предприняли систематическое изучение возможности неспецифической стимуляции антшептидного ответа на неиммуногеняые в свободном состоянии пептиды.

В качестве модельного пептидного антиген'а был выбран додекапептид (какр)3 из центральной части cs-бежа малярийного паразита p.falciparum. Додекапептид (hanp)3 представляет три .тандемных тетрапепшдаых повтора, несет свойства В-эпитопа области повторов cs-белка ж полностью неиммуногенен в свободном состоянии. Область повторов является иммунодоминантным В-эпитопом cs-белка, однако только мыаи Н-2Ь гадлотипа способны индуцировать иымунЕый ответ к этому району и продуцировать анти—(nanpj антитела. С (hanp) , связывается надевды на создание синтетической противомалярийной вакцины, однако, пептидно-белковые и рэкомбинантные вакцины на основе (nanp)3 оказались недостаточно иммуногенными для развития иммунитета в испытаниях на добровольцах.

С целью изучения возможности повышения иммуногенности пептида мы синтезировали ряд конструкций на основе пептида (nanp)3, синтетических носителей и адъюванта gmdp. В синтезированных конструкциях варьировались способы присоединения гаптена и адъюванта к носителям, а такие их эпитопная•плотность. В качестве носителей ш использовали- синтетические полимеры - mavp (сополимер малеинового ангидрида и винилпирролидона) и политафтсил -(rtkp)40, которые обладают собственной иммуноадъювантной активность*) и повышала антипептидный ответ в некоторых исследованиях.

Была исследована серия лилосомальных конструкций, в которых пептид и адазванзн были ковалентно связаны или ассоциированы за счет гидрофобного взаимодействия. В таких .конструкциях в качестве адъювантов использовали липофвльные аналоги тафтсина и gmdp, а также липополисахарид Neisserria meningitidis (ЛПС) и липопептид Palm3CysSSNA.

I. СИНТЕЗ ПЕПТИДОВ И КОНСТгЩШ.

Пептида и лкпопептидо (см. Табл. I) была синтезированы твердофазным методом в неавтоматизированном варианте. Синтез пептидов Т1, ст1, l2ti и l3ti проводили на хлорметилированном сополимере стирола и 1% .давинилбензолз, а пептида tu, t2Ti, r.2t2, L2t2Ti были синтезированы на аминометилирозашюм полимере с использованием в качеству линкера 4-гидроксимехклфенилуксусной кислоты (РАН-полимер). Для конденсациЕ использовали 3-кратный избыток симметричных ангидридов ш I-оксибензтркаэоловых зфиров вос-аминокислот, приготовленных при 0°С в dhf. а-Аыиногрушы аминокислот защищали вос-грушюй. Для защиты трифункциональных а?.0ШОККСЛОТ ИСПОЛЬЗОВаЛИ ТОЗИЛЬНУЮ (Arg) , беНЗИЛЬНУВ (Thr) , бензилоксикарбоняльнуя (Lys) и Б-ацетамндсметильнув (суз) группы. За полнотой прохождения конденсации следили с помощью количественного нингидриноЕого теста, в случае пролива

использовали изатиновый тест. Конденсации повторяли, если оставалось более 0,5% нецрореагировавпшх аминогрупп, меньшее количество блокировали уксусным ангидридом в пиридине. Для присоединения N-концевых липофильных фрагментов использовали пентафторфениловые эфары дапальмитсйшшзина • или смеси диастереомеров (1:1) трипальшиоил-з-глицерилцистеина.

Перед итщеплением от полимера со всех пептидилполимеров снимали вос-группу. Пептиды ti, cti, l2ti, г,.т1 отщепляли при помощи процедуры "low tfhsa", пептида L2t2Ti, l2t2, tri, t,Tl по методу "High HF". После отщепления от полимера гвдрсфйльные пептиды обессоливали на сефэдексе g-io в 1% уксусной кислоте у подвергали дальнейшей очистке с помощью ионообменной или обращзнно-фазовой хроматографии. Для очистки липспепгидов l2ti, l3ti их высаживали водой кз уксусной кислоты, a l2t2ti, l2t2 • эфиром пз уксусной кислоты.

Идентификация полученных пептидов осуществлялась с помощью аминокислотного анализа, мзсс-спектрометрии методом fab и спектроскопии ЯМЕ. Данные этих методов анализа подтверждали структуры синтезированных пептидов. Гомогенность пептидов контролировалась с помощью обращеняо-фазовой и ионообменной ВЭЖХ.

Защищенные тетрзпепткды Boc-AsnAlaAsnPro-OBzl и вое-Arg(Tos)Thr(Bzi)Lys(z)Pro-oFm были получены з расгзоре. После снятия С-концевш: защитных групп пептиды превращали в

Таблица I. Исследованные пептиды и их производные.

Обозначение пептида Последовательность

Т1 Н-(АБПАЗ-аАгпРго) -ОН

СТ1 Н-Суэ(Аст)(АзпД1аАБпРго)3-ОН

Н-ИггЬуЕРгоАга-(АзпА1гхАгпРго) 3~ОН

V1 Н-(Т1иХ.узРгоАгд) 2-'(АзпА1аАепРго) 3~ОН

Ь2Т1 Ра1т2Ьуза1уС1у- (АзпА1аАБпРго) „ -О}:

Ь3Т1 Ра1т3СуБ5егзсгАзпА1а-(АБПА1аАапРго)3~ок

Ра1т2ЬуБС1уС1у- (ИиХузРгоАгд) 2~ (АзпА1аАзпРго) 3~0й

Ра1т2Ьу5С1уС1у- (таигЬуБРгоАгд) 2~он

вЬ-Т1 СМОР-Ьуэ(St)- (АзпА1аАзпРго)3~ОЕ

СМБР-Т1 СМЭР- (АнпА1аАэпРго) 3~ОГ

а-шр-ст! сдар-суэ (Аса) -ДА1а-(АБпА1аАЕпРго) 3~0£

соответствующие пентафторфениловые эфиры с ' ' помощья переэтерифицирущего реагента дипентафторфенилкарбоната. Пептидные полимеры (накр)40 и (еткр)40 получали поликонденсацкег пентафторфзниловых эфиров тетрапептидов после снятия вос-грушк (см. схему I). Защитные группы политафтсина снимали .жидки,' фтористым водородом. После обессоливания полученного полимерного материала определяли кажущуюся молекулярную массу педтвднш полимеров с помощью гель-фильтрации. Для получения поли(наыр) , содержащего включенный в цепь здыоззнт (Па-с) (см. Табл.2), проводили совместную поликонденсацшо тетрапептида и лизинового аналога «тр с помощью дифенилфосфороилазида.

Asn

Boc-Boc-Вос-Е-( -

ЭИр

Ala

Asn

Вос-

Воо-

3 SCp

Вос-Зос-ÏÏ-

зкр

SXX

ХИа

xiii

XlIIa

xiv

xlvb

ХГ7С

xv

Pro

-OBzl -OBzl

-OBzl

-OBzl

-OBzl

-OBSl

-СП -CPfp

Ârç

Boo-Boc-

Б00-

Бос-

4 Г о s

'Tos

4as

"Тоз

Thr

Boc-Eoc-

CPfp Bzl

BEI

Bzl

Вг1

Lys

Boc-

Bzl

Bzl

JPfp

xv г

XVI a

xvii

Pro

XVIIa

xviii

XVIIIb

xv1iic

z xix

-OFm

-от

-OFm

-OFm

-огта

-OH

-OPfp

Схема I. Синтез пептидных полимеров (наэт)п и (еткр)п.

ГЛЕКОПЗПТИД GMDP-T1 И ГЛИКОЛШЮПЗПТИД GL-T1 получали в растворе из свободного додекапептвдг ж • пентафторфзниловнх зфиров GMDP и GMpP-Lys(St) CC0TB3TCTESHH0. ГЛИКОПвПТВД GMDP-cTl ПОЛУЧЭЛИ

конденсацией пзнтафтсрфзннлового пфгра gi-гор с пептидом cri.

Конструкции на .осиове itavp (iii,iv) получали прямым взаимодействием ангидридных групп полимера с аминогруппами пептида и зтияендиаминового производаого gkdp. Для синтеза конструкции v.

к

Таблица 2. Состав коньвгатов пептидов с носителями.

Конструкция*^ N Содераани« в конъюгате(вес.й)**)

ИАКР СМОР носитель

(шип?)40 I 100 - -

Па 09 1 -

[СНОР-Ьуг,(ЫАИР)3]П ПЬ 98 2 -

Х1с 97 3 -

[ММГР]~(ЫАЫР)3 XII 6 - 94

[КАУР]-^ (ИАНР^С-ШР] IV 7 б 87

СКПР-ШСН,

1 [МАУР]~Суз-1ШСН„ 1 ' V 7 4 89

1 БиОАЬх- (КАИР)

КЬН-(КАКР)3-ОН VI 10 - 85

О-ШР—ЫНСН-1 г

1 КЬН-СУБ-ШСН., 1 * VII 8 4 88

\ БиоАЬх- (ЫЛНР) *

КШ-Суг

I 5ис>АЬх- (1Ш!Р) VIII 5 - 95

БиОАЙХ- [ (ЕТКР) ] 1Ха 14 - 86 • <.

Суэ-£А1а-(1ШГР) 3 1ХЬ 50 - 50

Бис>М1Х~ [ (МЖР) 0 ] Ха 3 1.5 95

С МБР-Су (НАНР) ХЬ 28 12 60

[ОШР, £ис>АЬх]~ ( (НТКР) 0 ]

1 Суз-рА1а—(КАЫР)3 XI 9 7 84

Знак ~ обозначает статистический характер связи с носителем. **) Определено аминокислотным анализом.

1. ТЕА

2. ТРА

СТОР-ННСН2СН2НН2 + Бос-Суз(Лет! ОРГр

скпр-лн-сн,

I

Суз(Аси)-Ш-СН2

8

Ма1>АЬх-СКЗи + (КАИР).

С-НОР-КН-СН,

Суз(Аст)-ЫН-СН2 8

1. ид

2. Н23

3. а

Ма1>А1гх-{КАНР)3 %

СМОР-ШСН,

I

Суэ-КН-СК^ | 3

БиОАЬх-СНАКР), 10

'Суз' + Ма1>АИх-(НАКР).

'Су:

БН

Суз

|з

5ис>АЬх-(НАНР)3 10а

[МАУР] + 10

СОТР-ННСН,

I 2

¡МАУР]~су5-1щсн,

|з

БиоАЬх - (КАИР).

7

Схема 2. Синтез трехфункциокального спейсера.

содержащей козалентно связанные пептид и адъювант в эквимолярном соотношении, -использовали трехфуЕкционэльный спейсер на основе цнетеина хо (схема г). Соединение пептида (наш>)3 с тиольной группой цистеина осуществляли при помощи гетероби|ункщ1онального реагента - к-оксисукцинкшдного эфира 6-(малеишдо)-капроновой кислоты (ка1>АЬх-о!чгзи), малеимидяая группа которого превращается в 3-тиосукцйнимидную (в^о) при присоединении тиола.

Конъгагаты яа основе кш (л-шч были получены с помоэье глутарового альдегида. В этих конъюгатзх варьировался пет сьязч пептида о белком. Если в соединении VI белок связывался с пептидом

GA

KLH + H- (NANP) -OH- KLH~ (NANP) jOH

VI

GMDP-NHCH, GMDP-NHCH-

I « Г

KLH + H-Cys-NH-CH- - KLH~Cys-NH-CH,

I I

SuOAhx- (HANP) SuOAhx- (NANP) 3

10 VII

GA

KLH + Cys - KLH~Cys

SuOAhx-(HAHP)3 slc>AhX-(NANP)3

10a VIII

Схема 3. Синтез конъюгатов пептида с ш.

непосредственно через .«-аминогруппу N-концевого аспарагина, то в случае соединений vn и viii к белку присоединяли промежуточные конструкции ¿о и 10а через аминогруппу цистеина (схема з ).

Для получения конъюгатов пептида с политафтсином (ix-xi) использовали реагент Kai>Ahx-0Nsu, регулируя эпитопную плотность пептида количеством использованного для конъюгации реагента. К политафтсину, предварительно обработанному Mai>Ahx-oNSu, присоединяли пептид си (ix,xi) или гликопептид gmdp-cti (x). Статистическое присоединение gmdp к политафтсину в конъюгате xi проводили до обработки носителя Mal>AlÜ£-ONSu. •

г. ИЗУЧЕНИЕ ИММЛЮГЕННОСТИ КОНЫЭГАЮВ ПЕПТИДА С ПОЛИМЕРНЫМИ НОСИТЕЛЯМИ.

Иммуногенность синтезированных конструкций изучалась на мышах двух гэшотшов - h-2d (линия balb/c) И н-2ь(с57в1/б). Мнпги- н-2ь гаплотша способны ицдуцировать антитела на пептидный полимер (nanp)4Q без какого-либо носителя, мыши н-га гашотипа, напротив, не способны. Титр энти-(канр) иммуноглобулинов класса g определяли

ТАБЛИЦА 3. Титры антипептидных антител и условия иммунизации для конструкций, не содержащих носитель?'.

Первая иммунизация Повторная иммунизация Титр анти-(идир)40 антител, lg

Антиген Адъювант Антиген Адъювант С57В1/6 BALB/o

(НАИР)3 (ТЗ.) 1ТАФ Т1 ' НАФ <2,4 <2,4

<НАЫР)40 (I) ПАФ i НАФ 4,9 <2,4

НАФ ' i НАФ 4,3 <2,4

- . i . - 3,0 <2,4

(На) (ИЬ) [ GMDP-Lys,(NANP)3 ]n (1X0) (НО) НАФ X НАФ 4,5 <2,4

НАФ I НАФ 4,3 <2,4

НАФ I НАФ • 5,1 <2,4

- X - 4,8 <3,4

GMDP-(NANP)3-OH (GMDP-T1) НАФ Т1 НАФ <2,4 <2,4

GMDP-Lyu(St)-(NAWP)jOH (GL-T1) НАФ Т1 НАФ 3,0 <2,4

Группы мышей по 5 животных Сыли дважды иммунизированы с интервалом 28 дней в основание хвоста 200 иг/мышь антигена в водно-масляной (1:1) эмульсии. Сыворотку получали через 7 дней после повторной иммунизации.

стандартным твердофазным иммунофзрмеагнш анализом (Elisa) . В качестве тест-антигена мы использовали полимер (nanp)40. В таблицах 3-5 приведены значения титров анти-(ИАОТ)40 антител в исследованных сыворотках.

В таблице 3 представлена иммуногенность конструкций, несодержащих носитель. Пептид (nanp)3, так не как и гликопептид gmdp-ti со встроенным адьювантом, неиммуногенен в свободном состоянии. Полимеризация тетрапептида nanp до (nanpj40 (i) превращает его в кммуноген, однако ответ к х находится под ir-генным контролем, поскольку i иммуногенен только для мышей Н~2Ь гаплотипа (С57В1/6 ). Титры антител слабо зависят от дозы х в интервале от 10 до 500 мкг/мьшь, однако в большой степени зависят от эффективности адъюванта и при иммунизации в физиологическом растворе i слабоиммуногенен. Включение gmdp в полипешэдну» цепь полимера (iia-iic) позволяет заменять микобактерии в ПАФ. Гликолшопелад gl-ti со встроенным адыовантом индуцировал слабый,

но ДОСТОВерНЫЙ ОТВеТ ТОЛЬКО У линии C57B1/6. Возможно, что липофильный фрагмент способствует образованию структур сходных с Т-зпитопом для С57Б1/6 или улучшает связывание антигена с антиген-представляпщши клетками. Применение gkdp не изменило иммуногенность конструкций i-ii для неотвечавдей линии • животных. Ни ковалентное связывание, ни механическое смешение gmdp с антигеном не прлводоо к появлению антител.

Изучив серию хонъюгатов на основе havp, мы показали, что низкоиммуногенный полиэлектрожтный носитель mavp не повышает иммуногенность пептида (шш>)3. Включение адъюванта gmdp, изменение эштопной_ плогнбсти или тала связи между пептидом и носителем не влияло на иммуногенность конструкций iix-v. Титры анти— (nanp} 4 q антител не превышали уровня контроля для*- всех исследованных хонызгатов пептида (nanp)3 с mavp (данные не приводятся). Полученные результаты подтверждают наши более ранние исследования с пептидом 205-213 из белка vpx вируса ящура (Pap В.а. и др., 1990), в которых конъюгаты пептида vpx 205-213 с mavp оказались полностью неиммуногенными.

Конструкции на основе политафтсина (ix-xii) оказались иммуногенными для обеих линий мышей ( см. табл. 4). При этом высокоиммудагенныш оказались только конадгаты с большой эштопной плотностью пептидного гаптена (1хь, хь). Следует отметить, что в НАФ высокоиммуногенными были только конструкции с ковалентно

ТАБЛИЦА 4. Титры антипептидных антител и условия иммунизации для конструкций на основе политафгспна.*'

Первая иммунизация Повторная иммунизация Титр антиантител, ■(НАНР)40 19

Антиген Адъювант Антиген Адъювант С57В1/6 ВкЬВ/с

(1Ха) ПАФ ХХа НАФ 2,8 3,0

2ис>АЬх- [ (Ю?КР) 4 ] (1ХЬ) ПАФ 1ХЬ НАФ 4,2 .. 3,9

Суз-/ЗА1а-(ЫАНР)3 (1хь) НАФ 1ХЪ НАФ 3,7 <2,4

(ХХЬ) - 1ХЬ - ' 2,7 <2,4

1ХЬ + (ЖОР НАФ 1ХЬ 1ХЪ НАФ 3,3 3,0 3,3 <2,4

(Ха) НАФ 1Ха НАФ 3,0 3,3

БиОАЬх-С (ОТКР) . .] I 40 (ХЬ) СМВР-Суз-|ЗА1а- (ИАЫР) 3 НАФ 1ХЬ НАФ 5,1 3,0

(ХЬ) - 1ХЬ - 3,2 2,4

[СМОР,Зис>АЬХ]~[ (ЛТКР) , ]

Суэ-£А1а-(ИАН?)3 <Х1) ПАФ 1ХЪ НАФ 2,8 2,8

Доза антигена 100 ^г/мышь, условия иммунизации см. в примечании к Таб. 3.

связанным смвр, в то время как смесь гхь и смор индуцировала значительно меньшие титры антител, т.е. для конъюгатов на основе политафтсина ковалентное присоединение скор заменяет микобактерш в ПАФ.

В исследованных сыворотках, полученных на конструкции ix-хи, не было обнаружено антител против политафтсина. Отсутствие антител, направленных цротив эндогенного иммуномодулятора, представляется привлекательным качеством политзфтсина как носителя для вакцинации.

При использовании в еыба в качестве тест-антигена мз1>аьх-(кгкр)40, титр антител, направленных против носителя, достигал 20 ООО. Высокая иммуногенность модифицированного поли-тафтсина может быть обусловлена разными причинами. Возможно, что модификация полимера спейсером на основе аминокапроновой кислоты приводит к значительным структурным изменениям носителя, что отражается на его антигенности и способности взаимодействовать с Т-лимфоцихаш, т.е. образуются Т-хелперные зпитопы. Нам представляется более вероятным, что конъюгация антигена с политафтсином стимулирует ответ за счёт реализации адыовантных свойств носителя.

Чтобы проверить возможность использования тафтсина для стимуляции иммунного ответа на короткие синтетические пептиды мы синтезировали "химерный" пептид (тто2(НАШ>)з . В этой

конструкции к н-концу (иаяр) 3 посредством нормальных пептидных связей присоединен димер тафтсина. Такая модификация яеиммуноген-ного пептида (мамр) 3 превратила его в иммуюгенный антиген, причем для обеих линий мышей. На рис. 3 (стр. 22) приведены данные, показывающие что ь2т1 является иымуногенсм и после однократной иммунизации. Это свойство отличает от- сь-т1,

который ишуногенен только для линии с57в1/6 после двукратной иммунизации, т.е. проявляет себя как типичный Т-зависимый антиген. Т-нвзависимый характер ответа на ь2Т1 подтверждают результаты исследования антигенспецифической пролиферации'. Ч-лимфэцатов (данные не приводятся). В этих опытах было показана, что дктзфтсин и далихафтсин нетолько не стимулируют, а даже иягибируют пролиферацию активированных Т-лзафоцитов. Эти данные подтверадают, что стимуляция аятнпептндного ответа не связана с наличием Т-хелперных зштопов.

Как и ожидалось, конъюгаты на основе высокоиммуногенного

ТАБЛИЦА 5. Титры антипептиднцх антител и условия иммунизации для конструкций на основе кш.**

Первая иммунизация Повторная иммунизация Титр антиантител, -(НАЫР)4С 19

Антиген Адьювант Антиген Адьювант С57В1/6 ВАЬВ/С

(VI) ПАФ VI НАФ 4,6 5,1

КШ~(МАЫР)3-ОН (VI) НАФ VI НАФ 4,6 . 5,5

(VI) - VI - 4,6 5,1

СКОР-КНСН, | (VII) 1 2 (VII) БиоАЪх- (НАКР) НАФ VI VI НАФ / 4,8 5,5 4,8 5,3

К1Л~Суз 1 (VIII) Бис>АЬх-(ИАЫР)^ ПАФ VIII НАФ 5,1 4,3

VIII + СМСР НАФ VIII VIII НАФ 4,9 4,9 4,5 5,1

Условия иммунизации см. в примечании к Табл. 3.

белка кьн (vi-viii) оказались иммуногенными для обеих линий мышей (см. Табл. 5). Иммуногенность практически не зависела от типа связи пептида с белком, эпитопной плотности, а также адыованта. Так соединение VI индуцировало одинаковые титры антител как в ПАФ или НАФ, гак и при иммунизации в физиологическом растворе. Для линии с57в1/6 конъюгаты vii, viii, содержащие спейсерную группировку' мевду белком и пептидом, индуцировали ответ, достозерпо цревышащий ответ против конызгата хг. Обратная тенденция просматривается с знай же конъвгатами для линии ваьв/с, поэтому влияние типа связи на иммуногенность в этих конструкциях остается неясным.

По иммуногенности и га отношению к адызвантам исследованные конструкции можно разделить на три группы. К первой группе мы относим полностью неиммуногенные конструкции на основе маур (ш-у) и неиммуногенные для линии ваьб/с конструкции на основе (клир)40 (1,па-с, см. табл. 3). В этих конструкциях отсутствуют Т-эпитопы и они не индуцируют Т-иомощь в генетически неотвечаэдих животных. В этих случаях ни ковалентгое присоединение смор, ни его механическое смешивание с антигеном не оказывает дополнительного адыовантного действия.

Конъюгаты второй группы на основс- кьн (умш) безусловно иммуЕОгенны для всех линий животных (см. табл. 5). Иммуногенность этих конъюгатов обусловливается широким набором Т-эпитопов в белке и практически не зависит от адъюванга.

Третья группа конструкций, конъюгаты на основе политафтсияа (ХХ-Х1) и (каыр)40 (1-иа-с • для С57Е1/6), обладают существенно меньшим набором Т-зпитопов, и, .в общем случае, должны быть менее мощными индукторами иммунного ответа, чем кьн-конъюгаты. Иммуногенность этих конъюгатов явно зависит от выбора адаюванта и максимальна при иммунизации в ПАФ (см. табл.' 3,4). Ковалентное присоединение смо? в таких коныогатах заменяет микобактерии в ПАФ.

Изучение иммуногенности серии конъюгатов пептида с носителями показывает, что применение тор наиболее целесообразно для умеренно иммуногенных антигенов. Ковалентное присоединение агор- в:-этих случаях заменяет микобактерии в ПАФ и повышает уровень иммунного ответа. Использование политафтсина и дитафтсина позволяет создавать иммуногенные низкомслекулярные и высокомолекулярные конструкции на основе, неиммуногенного пептида и индуцировать антипептидный ответ е неотвечаюпщх на пептид животных.

3. ИЗУЧЕНИЕ ИШУНОГЕННОСТИ КОНСТРУКЦИИ НА ОСНОВЕ ЛИПОСОМ.

Включение низкоишуногзннкх белков в состав липосом повышает гуморальный и клеточный ответ на антиген. Для белковых антигенов изучены параметры, влияющие на иммуногенность липосомэльеых препаратов, и установлены условия проявления адъювантных свойств липосом. Противоречивые результаты были получены при включении в состав липосом дополнительных адыозэнтов. До недавних пор очень небольшое число исследований было посвящено изучению иммуноген-ности лжгасомалъшх форм синтетических или рекомбинантных пепти-.:"дов. Для пептидных антигенов было установлено, что необходимым условием иммуногенности является одновременное присутствие в липосомах В-, и Т-хелперных зпитопов.

В .нашем исследовании мы изучали влияние иымуномодуляторов различных типов на иммуногенность пептида (1Ш)Р) 3 при их совмест-- ном включении в лшосомы.

Для встраивания в лишдный бислой ш синтезировали набор липофильных производных пептида (наир)3 (см. табл. I). Липопептид ь2т1 не содержит в своем составе иммуномодуляторов, остатки жирных, кислот, присоединенные к н-концу пептида, служат для более эффективного встраивания антигена в лшосомы. В отличие от ь2т1, липопептид 1<3т1 содержит липофняьеый фрагмент Ра^СузБЗКА,. -который обладает митогенной активностью по отношении к В-лимфоцитам и стимулирует созревание В-лимфэщгтов в антитело-обрэзувдие клетки. Поэтоглу кроме якорной функции ра1Е3суззБМА несет свойства встроенного здысванта. Липопептид Ь21:2Т1 кроме якорной гидрофобной группы содержит димер иммуноактивного гетра-пептида тафтсина, также проявляющего эдъювантнуя активность.

Один из наиболее мощных адъюзантов - ЛПС - значительно повышает иммунный ответ как на Т-завискше, так и на Т-независимые антигены. Кроме того, в некоторых случаях применение ЛПС с другими адъюванташ приводило к синергическому усилению адьявантного эффекта. В связи с этим представляло интерес изучение влияния на антшептидный ответ как ЛПС, так и его комбинаций с другими адъювантами.

Липосомальные конструкции с производными пептида и фосфоли-пидами были получены методом дегидратации-регидратации. Эф$ективность встраивания производных оценивали с помощью аминокислотного анализа кислотных гидролизатов супернатантов. Для

Иммунный ответ, полученный на липосомальные композиции на основе ЛПС и l2ti.

лкпида лшвдш

лпс

дизиды липида

ШО

Рисунок I. Титры аптипептидных 1дн Щ и ige Ц после однократной иммунизация мышей баьб/с (вверху) и с57в1/б (внизу)" различными кошозициями на основе l_,ti на 7-ой и 14-ый (отмечены звездочкой) дни.

конструкции, содержащей l2ti, ЛПС и лшщда, определили диапазон соотношений компонентов, обеспечивающих физико-химическую стабильность системы и полноту включения пептида и ЛПС в липидный бислой. После изучения зависимости иммуногенности пептида от соотношения компонентов выбрали оптимальное соотношение антиген:ЛПС:лшшды, которое составило 1:1:200, и сохранили его в остальных изученных композициях.

Иммуногенность липосомальных конструкций, содернащих адъю-ванты, оказалась достаточной для рззвития антипептидного ответа после однократной иммунизации. Титры аитшепгидных антител J определяли на 7 и 14 дни, когда, как известно, регистрируются максимальные уровни, соответственно, 1дм и igG.

Иммунный ответ на l2ti, введенный в различных формах совместно с ЛПС или без него, изучали на шшзх линий сва, cba/n, balb/c, c57b1/6. На рис. I представлен ответ линий balb/c и С57В1/6. Полученные данные показывают, что титры igG и 1дм, индуцированные липосомами, содержащими пептид я ЛПС, были сравнимыми или превышали ответ на стандартный белково-пеитидный коньюгат для всех изученных линий мышей. Среда всех других комбинаций компонентов только ь2т1. вклиненный в липосома, индуцировал слабое повышение уровня igM на 7-ой день.

Способность ЛПС повышать первичный и вторичный ответ на тгаускезависимые антигены была ранее показана на полисахаридах пневмококков (Yin j.-z. et ai.). В нашем исследовании показано, что включение ЛПС преодолевает МНС-ограниченность антипептидного ответа мышей сва и balb/c, нераспознающих в структуре пептида

Таблица 6. Иммунный ответ мышей сва ж безтимусных мышей (nu/nu) на имиунопотевциирующую систему на основе липосом с ЛПС и липопептидом ь2Т1.

Линия мышей ИЗОТИП Титры анти-(!штр)_)0 антител, lg

день 7 день 14

СВА ХдМ IgG 4,1 2,3 3,6 3,2

Nu/пи IgM IgG 3,5 <2,3 3,2 2,9

Иммунный ответ, полученный нз лзпосомальные композиции на основе ЛПС и

РИСУНОК 2. ТИТРЫ ЁНТИПеПТЙдШП:" IgM J2 и IgG ^ шслз

однократной иммушзации мышей ealb/c (вверху) и cs7bi/g (внизу)

различными композициями на основе l3ti на 7-ой 2 14-ый (отмечены звездочкой) дни.

(naîjp)3 т-хелперный эштоп. Более того, ЛПС индуцирует анттшепти-днкй ответ мышей cba/n, нэ отвечающих на тимус-независимые антигены II типа, и nu/nu безтимусных мышей сва, не способных обеспечивать Т-помощь (см. Табл. 6). Это указывает на тимус-независимый характер индукции антипептидного ответа на липосомы, содержание пептид и ЛПС.

Ковалентное присоединение адъювантного липопептида pain3cysssHA к пептиду привело к образованию высокоиммуногеннсго антигена l3ti (см. Рис. 2). Адъювантные свойства Paim3cysssNA '•ранее были описаны для белковых ко вьюга то в и пептидов, содержащих Т-эпитопы. Нами показана возможность стимуляции иммунного ответа на пептид, не содержащий Т-эштоп. Стимуляция проявляется в равной мерз для мышзй c57b1/6 и balb/c, независимо от присутствия ЛПС. Вероятно повышение иммунного ответа к . пептиду обусловлено стимуляцией В-лимфэцитов встроенным' адъювантом. Использование ЛПС в качестве дополнительного адъюванта в липосомах с l3ti, приводит к позышеншо титров антипептидннх иммуноглобулинов с на 14-й день.

Включение в состав лшосом дитафтсина (см. Рис. 3) и gmdp (данные не приводятся) не привело к дополнительному здъювантному эффекту, независимо от способа ассоциации адъювантов с антигеном и присутствия ЛПС. Хотя удлинение пептида (nanpj3 . дитафтсиновым фрагментом превращало пептид в иммувоген (см. Табл. 4), лшопептид L2t2Ti как в липосомах, так и свободном состоянии оказался не более иммуногенным, чем t ti (см. Рис. 3). Известна неэффективность применения мурамилпешвдов, интерлейкина-2 и у-интерферона для повышения иммунного ответа на липосомзльные Форш антигенов (Gregoriadis G. et al.). В ОТЛИЧИе ОТ перечисленных адъювантов, ЛПС и paim3cysssNA являются поликлональными стимуляторами В-лимфоцитоз. Неэффективность тафтсина и gkdp на фоне сильного адызвантного эффекта paia3cysssna и ЛПС позволяет предположить, что в индукции иммушого ответа на липосомальную форму пептидного В-эпитопа активация В-лшфцитов играет большую роль, чем активация других иммунокомпетентных клеток.

Полученные данные показывают, что липосомы не проявляют собственного адъювантного эффекта для пептидов. Ее содержащих Т-апитопоз, однако включение таких дополнительных адъювантов как ЛПС и Pain3cysssNA позволяет создавать тимус-независимые

Иммунный ответ, полученный на лшгасомальные композиции на основе ЛПС и L2t2Ti.

лпс l2t2 лшщ2и l2fe2 ли!1и1рт лпс

' ДПР

липнттгг

Рисунок 3. йгары антипешэддаых igM g| и igG ' после однократной иммунизации мышей balb/c (вверху) и c57bi/g (внизу) различными композициями на основе i<2t2Ti на 7-ой и 14-ый (отмечены звездочкой) дни.

ишуноштенцщрующие системы для пептидных В-эпитопов. Тимус--независиыая активация иммунного 'ответа на пептидный антиген открывает новые возможности преодоления 1г~контроля иммуноген-ности пептидов и синтетических вакцин.

ВЫВОДЫ

1. Получена серия синтетических конструкций, содержащих пептидный антиген (нгшр)3, различные кммуномодуляторы (смор, тафтсин) и/или полимерные носители.

2. Конъюгация неиммуногенного пептида с датгфтсином или политафтсином приводит к развитию антипептидного ответа и позволяет преодолевать МНС-рестрикцию.

3. Ковалентное присоединение снг>'р к конструкциям на основе политафтсина повышает антипепткдный ответ и заменяет действие мккобактерий в ПАФ.

4. Показано повышение иммуногенности пептида и преодоление ШС-рестрикции иммунного ответа при включении липопептидов в лшхосомы, содержащие лшополисахарид или трипалъмитоилцистеин-тетрапептид.

5. Предложены конкретше модели полностью синтетических систем для повышения иммуногенности пептидного В-эпитопа на основе синтетических носителей, липосом и адыовантов.

Основные результаты диссертационной работы изложены в следующих публикациях:

I. Иванов Б.Б., Макаров Е.А., Еровский В.В., Садовников В.Б., Андронова Т.М. Иммунохимическое исследование поверхностных белков малярийного паразита Plasmodium falciparum. ТеЗИСЫ ДОКЛЭДОВ VII Всесоюзного симпозиума по химии белков и пептидов. Таллин, 1987, стр. 181.

2. Вровский В.В., Окунева Т.О., Иванов Б.Б., Гринберг Л.Н., Алахвердаев A.M. Использование синтетического олигопептида для изучения иммунодоминантного зпитопа белка оболочки возбудителя тропической малярии. Тезисы докладов симпозиума "Структура, биосинтез и функции молекулярных элементоз иммунной систем!". Пущине,1987. Стр.94.

3. Xvanov V.T., Andronova Т.К., Rar V.A., Ivanov В.В., Makarov Е.А. , Meshcheryakova Е.А., Yurovsky V.V.. Immunogenic complexes made of a peptide antigen, glycopaptide adjuvant and high molecular carrier. Abstracts of the UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology. ParK-City 1988, P.35.

4. Andronova Т.Н., Ivanov B.B., Meshcheryakova E.A., Guryanova

5.V., Ivanov V.T. Development of immunopotentiating systems for B-epitope of Plasmodium falciparum cs-protein. Abstracts of the UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology. Frisco 19S0, P.233.

5. Semenov B.F., Petrov А.В., Chulok T.A., Torchilin V.P., Trubetskoi V.S., Koshkina N.V., Ivanov V.T., Andronova Т.Н., Ivanov B.3. Development of ' immunopotentiating system for oligopeptide antigens on the basis of the liposomal form cf ' Neisseria meningitidis lipopolysacciiaxide. simposium "Neisseria-1390", Berlin, 1990, "Patogenic Neisseria", p. 110.

6. Иванов Б.Б., Тертышникова С.М., Юровский В.В., Андронова Т.М., Иванов В.Т.. Синтез пептидов - фрагментов поверхностных белков малярийного паразита Plasmodium falciparum. - ЕИООрГ. ХИМИЯ, 1991, Т. 17, N. 4, стр. 486-493.

7. Иванов Б.Б., Андронова Т.М., Иванов В.Т. Использование синтетических носителей х адызвантов для повышения иммуногенности синтетического пептвда ИЗ CP-белка Plasmodium falciparum. -• ЕИООрГ. ХИМИЯ, 1991, т. 17, N. 6, стр. 732-746.

8. Тертышникова С.М., Иванов Б.Б., Юровский В.Б., Садовников В.Б. Иммунохишческое изучение антигенных детерминант поверхностных белков .возбудителя тропической малярии Plasmodium falciparum С помощью синтетических пептидов. - Баоорг. химия, 1991, т. 17,

4, стр. 494-503.