Разработка химических основ увеличения чувствительности анализа пептидов

Мосина, Алёна Геннадьевна

Разработка химических основ увеличения чувствительности анализа пептидов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Мосина, Алёна Геннадьевна АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ

2013 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.10 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Разработка химических основ увеличения чувствительности анализа пептидов»

Автореферат диссертации на тему "Разработка химических основ увеличения чувствительности анализа пептидов"

На правах рукописи

Мосина Алёна Геннадьевна

РАЗРАБОТКА ХИМИЧЕСКИХ ОСНОВ УВЕЛИЧЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ АНАЛИЗА ПЕПТИДОВ

Специальность: 02.00.10- Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

15 АВГ 2013

МОСКВА 2013

005532111

Диссертационная работа выполнена в лаборатории искусственного антителогенеза Научно-исследовательского института физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства России и на кафедре аналитической химии им. И.П. Алимарина Московского государственного университета тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова

Научный руководитель:

Позмогова Галина Евгеньевна, доктор химических наук, профессор Официальные оппоненты:

Северин Евгений Сергеевич, доктор химических наук, член-корр. РАМН, профессор, начальник отделения молекулярной биологии НБИКС-Центра Национального Исследовательского Центра «Курчатовский институт»

Кириллова Юлия Геннадьевна, кандидат химических наук, доцент кафедры биотехнологии и бионанотехнологии Московского государственного университета тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук

Защита состоится 23 сентября 2013 года в 15.00 в аудитории М-119 на заседании Диссертационного Совета Д 212.120.01 при Московском государственном университете тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, пр. Вернадского, 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского государственного университета тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан <О» августа 2013 года

Ученый секретарь Диссертационного Совета кандидат химических наук

старший научный сотрудник

А.И. Лютик

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Выявление пептидов и последующее изучение аминокислотного состава является важной задачей для контроля качества лекарственных препаратов и клинической диагностики социально-значимых заболеваний. В связи с этим возрастает необходимость разработки простых и недорогих чувствительных методов анализа пептидов, проявляющих биологическую активность. Также актуально на сегодняшний день развитие новых подходов в протеомном анализе для обнаружения низкокопийных пептидных биомаркеров. Это необходимо для определения особенностей индивидуального развития в области персонифицированной, спортивной медицины, геронтологии, а также для ранней диагностики заболеваний.

Перспективная задача клинической диагностики сегодня связана с идентификацией биомаркеров патологических состояний белковой природы, в качестве которых могут выступать низкокопийные пептиды. Большая часть имеющихся методов анализа не позволяют, к сожалению, в ходе одного эксперимента обнаружить присутствие низкокопийных пептидов. Поэтому для повышения предела чувствительности детекции маркерных пептидов необходимо использовать сочетание инструментальных микрометодов анализа (ВЭЖХ, MALDI TOF MS, электрофоретические и др.) и новых приемов аффинного обогащения пептидов (Sigdel and Sarwal 2011; Sigdel, Gao et al. 2012).

Прогресс в области разработки и внедрения медицинских микроаналитических методов диагностики в значительной мере обусловлен использованием ДНК и ее фрагментов. Предпосылкой для этого служит способность полинуклеотидов высоко специфически ассоциироваться с различными биополимерами и низкомолекулярными соединениями. Наиболее перспективный сегодня метод определения содержания в образцах сиквенс-специфичной ДНК (ПЦР, полимеразная цепная реакция) основан на использовании комплементарных взаимодействий олиго- и полинуклеотидов. Развитие методов ПЦР в реальном масштабе времени (Real Time ПЦР) позволяет сегодня не только идентифицировать целевую последовательность ДНК в клиническом образце, но и достоверно оценить ее количество (На, Lee et al. 2013; Sommeregger, Prewein et al. 2013).

Список сокращений: АК- аминокислоты, ВЭЖХ- высокоэффективная жидкостная хроматография, ДНК-дезоксирибонуклеиновая кислота, КЗЭ —капиллярный зональный электрофорез, МС-масс-спектрометрия, ПААГ- полиакриламидный гель, ПЦР- полимеразная цепная реакция, АСЛ-акридин, НЕХ-гексахлорфлуоресцеин, МАЫ31- ионизация лазерной десорбцией

Автор выражает благодарность проф., к.х.н. кафедры аналитической химии МИТХТ им. М.В. Ломоносова | Глубокову Ю.М.1 и завкафедрой биотехнологии и бионанотехнологии МИТХТ им. М.ВЛомоносова акад.РАМН, д.х.н., проф. Швецу В.И. за помощь и участие в работе.

В настоящее время остается актуальной разработка и оптимизация методов аминокислотного анализа как синтетических, так и природных биологически активных пептидов. Это связано с тем, что некоторые пептиды могут иметь модификации в аминокислотном составе. Поэтому при контроле качества лекарственных препаратов необходимо подтверждение их подлинности, что особенно важно в связи с перспективами использования бактерицидных пептидов (Мок and Li 2013). При классических условиях кислотного гидролиза происходит частичная потеря некоторых аминокислот, что не дает полной информации о составе исследуемого пептида. Для проведения анализа с помощью традиционных методов требуется сложное аппаратурное оформление и большой объем дорогостоящих токсичных реактивов для предколоночной или постколоночной дериватизации.

На основании всего выше изложенного становится очевидной необходимость разработки и оптимизации методов анализа для повышения чувствительности и надежности количественного определения низкокопийных пептидных биомаркеров и аминокислотного состава биологически активных пептидов в клинико-диагностических и фармакологических целях.

Представленная работа является частью научных исследований, проводимых в лаборатории искусственного антителогенеза Федерального государственного учреждения НИИ ФХМ ФМБА России в рамках проекта № 09-04-12133-офи_м «Нуклеопротеиновые конъюгаты для повышения эффективности протеомного анализа».

Цель работы заключается в разработке химических основ повышения чувствительности определения единичных молекул пептидных биомаркеров и оптимизации методов анализа аминокислотного состава биологически активных пептидов.

Задачи исследования.

1. Разработка принципиальной схемы анализа низкокопийных пептидов с использованием химико-ферментативных систем амплификации сигнала, включающей стадии:

- аффинного связывания пептидов с модифицированными ДНК-аптамерами, снабженными реакционноспособной группой и маркерной нуклеотидной последовательностью;

- получение нуклеопротеиновых конъюгатов;

- исчерпывающее ферментативное расщепление исходного олигомера и частичное расщепление конъюгата;

- анализ содержания целевого пептида в составе конъюгата с использованием приемов флуоресцентного анализа ПЦР в режиме реального времени.

2. Оптимизация известных методов анализа:

- аминокислотного состава биологически активных пептидов без стадии модификации методом капиллярного зонального электрофореза. Для увеличения выхода мономеров в работе необходимо рассмотреть влияние условий пробоподготовки образцов на процессы химической деградации аминокислот; провести его верификацию на примерах анализа образцов препаратов пептидов;

- флуоресцентного ПЦР-анализа ДНК с регистрацией сигнала в реальном масштабе времени с использованием олигонуклеотидных зондов, содержащих лабильную гексахлорфлуоренильную метку (HEX). Разработка усовершенствованных методов получения зондов и испытание полученных препаратов в ДНК-анализе клинических образцов.

Научная новизна.

1. Разработана новая схема высокочувствительного анализа низкокопийных пептидных биомаркеров в виде нуклеопротеиновых коньюгатов с помощью амплификации сигнала методом ПЦР в реальном масштабе времени.

2. Разработан новый способ деблокирования синтетических гексахлорфлуоресцеин олигонуклеотидов, препятствующий модификации метки и накоплению трудно отделяемого побочного продукта. Оптимизированы условия очистки олигонуклеотидных зондов с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ.

3. Оптимизирована методика определения аминокислотного состава биологически активных пептидов без стадии модификации с помощью капиллярного зонального электрофореза с прямым УФ-фотометрическим способом детектирования. Подобраны условия кислотного гидролиза пептидов, позволяющие увеличить выход образующихся аминокислот.

Практическая значимость

для определения широкого круга патогенов (Bacteroides spp., Chlamydia trachomatis, CMV, Epstein-Barr virus , Gardnerella vaginalis, HSV 1, HSV 2, Lactobacillus spp., Mobiluncus curtissi, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis и др.). Проведение подобных исследований особенно актуально в связи с постоянной потребностью в расширении арсенала диагностических методов с жесткими критериями надежности. Оптимизированный метод аминокислотного анализа биологически активных пептидов позволяет определять состав без их модификации. Это существенно при контроле качества лекарственных белковых препаратов, как брадикинин, инсулин, дарбэпоэтин.

На защиту выносятся:

принципиальная схема обнаружения низкокопийных пептидов в виде нуклеопротеиновых коньюгатов с использованием химико-ферментативных систем амплификации сигнала;

- разработка нового способа деблокирования меченных олигонуклеотидов, которая приводит к уменьшению образования примеси и увеличению чувствительности ПЦР-анализа;

- оптимизированная методика определения аминокислотного состава биологически активных пептидов без предварительной стадии химической дериватизации с использованием капиллярного зонального электрофореза.

Апробация работы.

Основные результаты работы были представлены на XIV Международной

конференции студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам

«Ломоносов - 2007» (2007, Москва, Россия), 17-ой Менделеевской конференции молодых

ученых (2007, Самара, Россия), Всероссийском симпозиуме «Хроматография в

химическом анализе и физико-химических исследованиях» (2007, Москва, Россия), Life

Sciences 2007 (2007, Глазго, Великобритания), 22ndInternational Symposium on MicroScale

Bioseparations and Methods for Systems Biology, (2008, Берлин, Германия), 34th International

Symposium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques (2009,

Дрезден, Германия), XVII Международной конференции студентов, аспирантов и

молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов - 2010» (2010, Москва,

Россия), Съезде аналитиков России «Аналитическая химия - новые методы и

возможности» (2010, Москва, Россия), Всероссийской конференции «Аналитическая

хроматография и капиллярный электрофорез» (2010, Краснодар, Россия), 2-ой

Международной конференции Российского химического общества им. Д. И. Менделеева

«Инновационные химические технологии и биотехнологии новых материалов и

продуктов» (2010, Москва, Россия), V Всероссийской конференции студентов и аспирантов с международным участием «Химия в современном мире» (2011, Санкт-Петербург, Россия), 36th International Symposium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques, HPLC 2011 (2011, Будапешт, Венгрия), VI Всероссийской конференции студентов и аспирантов с международным участием «Менделеев-2012» (2012, Санкт-Петербург, Россия), FEBS 2012 (2012, Севилья, Испания).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 4 статьи в научных рецензируемых журналах, 1 патент на изобретение методики и 15 тезисов докладов на международных и федеральных конференциях.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 120 страницах и состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 132 источника отечественной и зарубежной литературы, иллюстрирована 53 рисунками, содержит 10 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Разработка принципиальной схемы анализа низкокопнйных пептидов с использованием химико-ферментативных систем амплификации сигнала

В настоящее время наиболее эффективным и чувствительным способом определения пептидов является иммуно-ПЦР (Luk, Compta et al. 2012; Makam, Majumder et al. 2013). В данном методе применение антител и их аналогов ограничено порядком констант диссоциации комплексов, что затрудняет расчет концентрации анализируемого комплекса. Задача нашего исследования была направлена на нахождение потенциала для увеличения чувствительности метода обнаружения низкокопнйных пептидов. Нами было решено заменить антитела белковой природы на нуклеотидные, а для стабилизации аффинных комплексов связывание нуклеотидного антитела и пептида сделать ковалентным за счет введения в ДНК-аптамер реакционных групп. Также преимуществом нуклепротеиновых коньюгатов заключается в возможности проводить получение комплексов в растворе, а не только на твердотельной подложке.

Выявление пептидных биомаркеров осуществлялось в виде нуклеопротеиновых коньюгатов, образованных из самого пептида и синтетических олигодезоксирибонуклеотидов, снабженных активными группами (остаток 5-Вг-уридина).

На первом этапе в состав выбранного нуклеотидного аптамера вводят активный заместитель, в данном случае 5-бромуридин (обзор Редько 2007). Выбор такой метки заключается в совместимости с биореакциями. При поиске фотоактивных меток одним из

основных препятствий была частичная замена брома на ОН-группу. Найденные условия получения олигонуклеотидов, содержащих Вги-звенья, были достоверно подтверждены методами инструментального (ВЭЖХ и МС) контроля. Как видно из представленных хроматограмм на рис. 1., после подобранных условий не было зафиксировано накопление производных уридина (хроматограмма Б).

Рис. 1. Хроматограммы и масс-спектры (в рамках) полученных олигонуклеотидов, содержащих Вги-звенья: А- стандартные условия, Б- после подобранных условий; 1- 5-гидроксиуридин, 2- 5-бромуридин.

Для синтеза конъюгатов к раствору синтезированного олигонуклеотида, добавляли пептид в молярном соотношении 1:10 и 45 мин облучали при 254 нм в среде аргона при 4 °С (иУ-81га1аПпкег, США). Важным условием проведения реакции оказалась полнота удаления из раствора кислорода. Ход реакции анализировали методами ВЭЖХ и масс-спектрометрии. В результате был получен модельный конъюгат пептида (ангиотензин) и олигонуклеотида, несущего 5-бромуридин, 5'-

СССААОТСТ(Вги)ТОТСАССТССАСОССОСО. На рис. 2 приведены хроматографический профиль и масс-спектр, подтверждающие синтез этого конъюгата.

После получения коньюгатов, важным этапом является исчерпывающий

экзонуклеазный гидролиз несвязанных олигонуклеотидов, что необходимо для

достоверности проведения ПЦР-анализа. Были подобраны условия ферментативного

расщепления 5-бромуридин содержащих олигонуклеотидов в присутствии

фосфодиэстеразы BSP (0.05U BSP/ -10 пмоль олигонуклеотида, 37°С, pH 5.0) . Время исчерпывающего гидролиза составило 10-15 мин. Следует отметить, что в спектре не наблюдается увеличения сигнала фрагмента, несущего концевое 5-бромуридиновое звено (5806,9 Да). Это подтверждается MC-анализом гидролитической смеси на стадии неполного расщепления ДНК (см. рис.3). Следовательно, такая модификация не влияет на скорость и полноту экзонуклеазного гидролиза несвязанных с пептидом олигонуклеотидов и такой обработкой они могут быть полностью удалены.

Рис. 2. А- ВЭЖХ- анализ реакции получения конъюгата ангиотензина и олигонуклеотида , 5'- GCCAAGTGT(BrU)TGTCACCTGCACGCCGCG (в рамке - MC-спектр выделенного конъюгата).

Рис. 3. MALDI ТОР MS-анализ экзонуклеазного гидролиза несвязанного олигонуклеотида, GCCAAGTGTU(5-Br)TGTCACCTGCACGCCGCG, m/z - 8607.

Условия гидролиза: фосфодиэстераза (BSP, Sigma), 0.05 U/мкл, концентрация олигонуклеотида - 10 пмоль/мкл, 37оС, 5 мин, pH 5.0.

В тех же условиях проводили и гидролиз конъюгатов, который приводил только к их частичному расщеплению. На рис. 4 приведены масс-спектры конъюгата 5'СССААСТОТ(5[ОКУУ1НРР]и)ТОТСАССТССАСОССОСО до (рис. 4А) и после гидролиза (рис. 4В).

Рис. 4 .Масс-спектры конъюгата GCCAAGTGT(UDRVYIHPF)TGTCACCTGCACGCCGCG до (А) и после гидролиза (В). Условия гидролиза: фосфодиэстераза (BSP, Sigma), 0.05 U/мкл, концентрация конъюгата - 10 фмоль/мкл, 37оС, 15 мин, pH 5.0.

Интересно отметить, что расщепление конъюгата останавливается за одно основание до позиции сшивки с пептидом и структура конечного продукта, 5'-Т(5[DRVY1HPF]-U)TGTCACCTGCACGCCGCG (7076 Да), включает 5'-концевой остаток Т (см. рис.4 В). Такая особенность может быть связана со стерическими затруднениями, возникающими в активном центре экзонуклеазы. В результате этих исследований была экспериментально подтверждена возможность использования ферментативного гидролиза для удаления из раствора избытка несвязанных олигонуклеотидов, несущих 5-бромуридин.

Образование ковалентных конъюгатов пептидов с олигонуклеотидами позволяет рассчитать содержание биомаркера исходя из количественного анализа содержания ДНК-составляющей конъюгата с помощью ПЦР в режиме реального времени.

Для разработки модельной системы Real-Time ПЦР анализа содержания ДНК-компоненты в составе конъюгата были синтезированы олигонуклеотид- мишень, содержащий маркерную нуклеотидную последовательность (5'-

GCCCACTTTCATATGACGACAATGCAGCGGATGTCCTGGCGTGGGATAGCATAACCC GCTGGCAACACA), прямой и обратный праймеры (GCCCACTTTCATATGACG и TGTGTTGCCAGCGGG) и сконструированный по типу Perfect Probe зонд (НЕХ-CCCACGCCAGGACATCCGCTGCATTGTCGCGTGGG-BHQ2, где НЕХ-

гексахлорфлуоресцеин, BHQ2-Black hole quenchers, 4'-(2-нитро-4-толуилдиазо)-2'-метокси-5'-метил-азобензол-4"-(К-этил)-Ы-этил-2-цианоэтил-(1Ч,Т^[-диизопропил)). Далее мы получили конъюгат сшивкой пептида UDRVYIHPF с олигонуклеотидом, содержащим 5-Вг-уридиновое звено и маркерную нуклеотидную последовательность (на схеме рис. 5А этот фрагмент в последовательностях подчеркнут сверху) и провели ПЦР-анапиз по разработанной схеме. Результаты кинетики накопления продуктов амплификации ДНК после нуклеазного гидролиза полученного конъюгата представлены на рис.6.

мзриериая нуклеотвдная последовательность

5' -GCCCACTTTCATATGACGACMTGCAGCGGATGTCCTGGCGTGGGATAGCATAACCCGCTGGCAACACA

ттясотсевялстшесеехсес тожеттт-у Чхябве-мэ MIX1

3' -СОвОТОАМСГГАТАСТвСТвТГАСвТСОССТАСАваАССйСАССеТАТСвТАТТОООСвАСССТТвТОТ

5' -<кес*сгггсАТк»с«

lt3'A<?ii<44H:c;GCCCACTrrCATATGACGACAATGCAGCCGATGTCCTGGCGTGGGATAGCATAACCCGCTGGCÄACACA

CCTCTTACGTCCCCTACAGGACCGCACCC GGGCCACCCTrGTGT.}'

lcctggs-bhq HEX;J

Рис. 5. Схема проведения Real-Time ПЦР анализа содержания DRVYIHPF в составе конъюгата с ДНК.

1800

-1---•--'-1-•-1-•-г------1

0 5 10 15 20 25 30 35 40

ЦИКЛ

Рис. 6. Кривые кинетики накопления продуктов амплификации ДНК (амплификатор MiniOpticon, Bio-Rad, США) после нуклеазного гидролиза. 1-6 конъюгат . Концентрации по ДНК-компоненте (М): 1- 1,11(Г",2- 1,110 "|2, 3-1,1-10-",4-1,1-10"14, 5- 1,1-10"'5,6- 1,110-".

Результаты кинетики накопления продуктов амплификации ДНК после нуклеазного гидролиза конъюгата показывают, что пределом обнаружения пептида в составе модельного конъюгата является несколько десятков копий молекул в образце (примерно 1,1-10"16 моль/л).

Таким образом, нами была разработана принципиальная схема анализа низкокопийных пептидов с использованием системы амплификации сигнала, исследованы условия проведения ключевых стадий метода. Показано, что зафиксированные в виде нуклеопротеиновых конъюгатов биомаркеры доступны для идентификации с использованием ПЦР-амплификации.

2. Оптимизация флуоресцентного ПЦР-анализа ДНК в режиме реального времени с использованием зондов, содержащих гексахлорфлуоренильную метку

При разработке анализа нуклеопептидных конъюгатов методом ПЦР в режиме реального времени мы столкнулись с проблемой нестабильности результатов анализов, что привело к оптимизации данного метода. Среди факторов, влияющих на чувствительность и воспроизводимость ПЦР-анализа, одну из ключевых ролей играет структура и качество олигонуклеотидного зонда, снабженного флуоресцентной меткой и гасителем флуоресценции.

Существующая нестабильность результатов связана с присутствием в зондах, содержащих гексахлорфлуоренильную метку, трудно отделяемых примесей - продуктов трансформации НЕХ-метки во время синтеза (СЬшаНп, ЗегеЬгуакоуа е1 а1. 2009). Итак, ранее было доказано, что на стадии аммонолиза часть метки переходит в акридиновое производное II (АСЯ) (рис. 7), искажающие флуоресцентные свойства зондов (А^щ = 516±2 пт, а чистые НЕХ-производные имели ^т = 553±1 пт).

С1 С1

NH,

YYC00H °учАс|

HNR

Н20 or ОН"

Рис. 7. Схема трансформации НЕХ-меченных олигонуклеотидов в акридиновые производные. R-олигонуклеотид.

Разделение смеси HEX- и ACR-производных олигонуклеотидов методом электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) не дало эффективных результатов. Только небольшую долю из синтетических НЕХ-олигомеров удается очистить от примеси обращенно-фазовой ВЭЖХ. Предложен модифицированный способ деблокирования, основанный на использовании смесей аммиака с аминами, несущими разветвленный алифатический остаток. Исследования процесса деблокирования НЕХ-олигонуклеотидов позволили найти условия, снижающие вероятность накопления примеси (см. схему на рис.8).

HNR

Рис. 8. Схема взаимодействия остатка гексахлорфлуоресцеина с третичными аминами. R -олигонуклеогид, RI — трет-бутил.

Для того, чтобы провести анализ эффективности применения данных условий синтеза было получено три ДНК-зонда, несущие 5'-метку HEX и З'-гаситель флуоресценции BHQ2 (табл.1).

Таблица 1.

Формулы и условия ВЭЖХ-выделения олигодезоксирибонуклеотидов

Название Формула Условия ВЭЖХ

MeCN градиент Температура, С0

НВ37 5'-НЕХ-(1(А7С,2012Тб) -3'-ВНС>2 30-55%/25 гшп 50

НВ38 5'-НЕХ-(1(А4С 1709Т8)-3 '-ВН(}2 12-20%/25 гшп 42

НВ28 5'-НЕХ-с1(А9С505Т9)-3'-ВН(22 25-32.5% /20 гшп 45

Часть реакционной смеси обрабатывали концентрированным водным раствором аммиака, а часть - смесью водного раствора аммиака с 15% трет-бутиламина. На рис. 9 приведены хроматограммы трех зондов, полученные двумя разными способами. Видно, что удовлетворительная ВЭЖХ-очистка НЕХ-зондов, которая проходила в градиенте ацетонитрила в 0.1 М ацетате аммонния, рН 6.7, при 40-50 °С, позволяет полностью отделить акридиновую примесь (Рис. 9 НВ37,НВ38, I). Однако, некоторые НЕХ-производные не удается эффективно разделить в данных условиях, например как НВ28 (Рис. 9, I), что подтверждается УФ-видимым спектром 1 (Рис. 9). Новый способ деблокирования НЕХ-зондов минимизирует содержание АСЯ-производных и существенно упрощает хроматографическую очистку. Так, на приведенных хроматограммах НЕХ-зондам соответствуют индивидуальные пики 2 (Рис. 9, II).

Рис. 9. Хроматограммы и УФ-видимые спектры НЕХ-олигонуклеотидов (0,2 цто1) после стандартного аммонолиза (I) и после использования нового метода деблокирования (II).Уф-спектры: 1 — АСЯ-производное, 2 - НЕХ-олигонуклеотид.

На рис. 10А представлены кривые накопления флуоресцентного сигнала в процессе Real-Time ПЦР с зондом, полученным стандартным (кривая 1) и модифицированным (кривая 2) методами. При одинаковой эффективности амплификации (рис. 10В) преимущества нового метода получения зонда очевидна.

Рис. 10. Кривые кинетики накопления продуктов амплификации ДНК (из клинического образца урогенитального соскоба эпителиальных клеток) в процессе Real-Time ПЦР и электрофоретический анализ (2% агароза, бромистый этидий) их результирующего содержания при использовании набора Флуоропол-Chltr ЕР (ООО "НПФ Литех", Россия) с зондом, полученным стандартным (кривая 1) и новым способом (кривая 2).

Таким образом, метод получения НЕХ-производных олигонуклеотидов, заключающийся в использовании новых условий деблокирования олигонуклеотидов в процессе их синтеза способствует повышению чувствительности ДНК- диагностики.

Предложенный метод получения НЕХ-зондов успешно используются при разработке и производстве новых диагностических тестов для определения широкого круга патогенов, в частности, Bacteroides spp., Chlamydia trachomatis, CMV, Epstein-Barr virus , Gardnerella vaginalis, HSV 1, HSV 2, Lactobacillus spp., Mobiluncus curtissi, Mycoplasma genitalium и Mycoplasma hominis.

3. Оптимизация анализа аминокислотного состава биологически активных пептидов без стадии модификации методом КЗЭ

Другая проблема исследования связана с тем, что при контроле качества лекарственных препаратов на основе пептидов предусмотрен анализ их аминокислотного состава. Поэтому второй частью работы является оптимизация методов аминокислотного состава.

Традиционно аминокислотный анализ предусматривает гидролиз пептидной цепи до аминокислот, их модификации посредством введения хромофорной группы и хроматографический анализ. Использование капиллярного электрофореза позволяет анализировать гидролизаты пептидов без стадии дериватизации, тем самым значительно упрощает пробоподготовку.

Для разделения свободных аминокислот были оптимизированы следующие параметры анализа: состав и рН фонового электролита, напряжение, состав, в котором растворяют лиофилизованный образец перед вводом в систему

Для достижения более эффективного разделения были использованы добавки различных модификаторов к фоновому электролиту. Проведенные предварительные исследования показали, что добавка метанола к фосфатному буферу (150 мМ, рН 2,0) существенно улучшает степень разрешения компонентов, при относительно небольшом увеличении времени миграции аминокислот (АК) (Мосина, Мельников и др., 2009). Для этих целей практичнее использовать фоновые электролиты с рН<7, поскольку при добавке органических растворителей в щелочной среде происходит высаливание компонентов фонового электролита и анализируемая система становится гетерогенной.

На примере модельной смеси из 17 аминокислот, входящих в состав любого белкового гидролизата, было изучено влияние различного процентного содержания метилового спирта в фоновом электролите на эффективность разделения (рис. 11). Исходя из полученных данных видно, что добавка 20% метанола приводит лучшему разделению смеси аминокислот. При концентрации метанола, не равной указанной, наблюдается худшее разделение.

Приведенные данные свидетельствуют об эффективном разделении 17 АК. Общее время разделения не превышает 90 мин. Относительное стандартное отклонение времени миграции составляет менее 3%. Полученный уровень разрешения позволил провести изучения возможности количественного определения рассмотренных АК. Был проведен

анализ модельной смеси 17 АК известного состава. Правильность количественного анализа дополнительно контролировали по способу «введено - найдено». Полученные данные приведены в табл. 2.

Рис. И. КЗЭ смеси 17 свободных аминокислот с прямым УФ- детектированием (А.,,,,™ = 208 нм)

Условия: диаметр капилляра - 75 мкм, полная длина - 80 см, эффективная длина - 60 см. Буфер: 150мМ фосфат натрия, 20%об. метанола, рН 2,0. Напряжение: 17кВ. Сила тока: 76 мкА. Температура: 30 "С. Время ввода пробы: 30 сек (вакуум).

Идентификация: 1 - лизин , 2 - аргинин, 3 -гистидин, 4 - глицин, 5 - апанин, 6 -валин, 7 -изолейцин, 8 - лейцин, 9 - серин, 10 - треонин, 11 - метионин, 12 - фенилаланин, 13 -глутаминовая кислота, 14 - пролин, 15 — тирозин, 16- цистеин, 17 -аспарагиновая кислота.

Из полученных результатов можно сделать вывод, что метод капиллярного зонального электрофореза с прямым УФ- детектированием при использовании фосфатного буферного раствора, содержащего 20% метанола позволяет количественно определять 17 аминокислот с максимальной погрешностью (8Г) 5-7%.

. 5.1

56 Вреия, кйн

Таблица 2.

Результаты определения содержания аминокислот методом КЗЭ. (п=5, Р=0,95)

Аминокислота Первоначальное содержание, нг Добавлено, нг Найдено, нг в в.

Лизин 10,00 50,00 61,58+2,11 1,766 0,029

Аргинин 6,67 50,00 57,15+3,81 3,186 0,056

Гистидин 0,83 25,00 25,71+2,29 1,912 0,074

Глицин 6,67 50,00 57,67+3,11 2,605 0,045

Алании 6,67 50,00 54,88±1,16 0,134 0,002

Валин 3,33 25,00 27,34±1,79 1,498 0,055

Изолейцин 3,33 25,00 29,72+1,37 0,313 0,011

Лейцин 1,67 25,00 27,79±1,28 0,235 0,008

Серии 3,33 25,00 29,43±1,76 0,637 0,022

Треонин 6,67 50,00 57,80±1,27 0,224 0,004

Метионин 0,67 10,00 10,50+0,67 0,559 0,053

Фенилаланин 0,13 1,00 1,12+0,05 0,022 0,020

Глутаминовая кислота 6,33 50,00 57,47+2,71 0,593 0,010

Пролин 3,33 25,00 29,51+1,34 0,548 0,019

Тирозин 0,13 1,00 1,17±0,08 0,034 0,029

Цистеин 6,70 50,00 55,85+2,94 1,084 0,036

Аспарагиновая кислота 3,33 25,00 30,03±1,94 0,168 0,003

Разработанная методика была применена для определения аминокислотного состава некоторых синтетических и природных биологически активных пептидов. Аминокислотный анализ лекарственных соединений состоит из двух стадий: гидролиз образцов с получением свободных генетически кодируемых аминокислот и непосредственно электрофоретический анализ на основе разработанной методики. Из

литературных данных известно, что в общепринятых условиях исчерпывающего кислотного гидролиза (6 М НС1, 24 ч, 110 °С) происходит частичная потеря некоторых аминокислот (Степанов 2005). Триптофан разрушается полностью, а цистеин, метионин, глутамин и аспарагин окисляются до соответствующих кислот. Для сохранения полученных в результате реакции свободных АК были оптимизированы условия проведения гидролиза. Для этого выяснили, что добавление 1% раствора фенола к хлороводородной кислоте предотвращает окисление метионина и цистеина, уменьшает потери других аминокислот. Это происходит за счет того, что добавка фенола имеет преимущество при взаимодействии с кислородом, тем самым не давая окисляться индольной системе триптофана и серосодержащим группам цистеина и метионина. Гидролиз при 115 °С в течение 24 ч с добавкой 0,2 М фенола значительно повышает выход анализируемых аминокислот. Данная концентрация была выбрана исходя из концентрационного соотношения анализируемого пептида: количество фенола должно во много раз превышать количество анализируемого пептида. Благодаря этому фенол блокирует доступ кислорода к аминокислотам, содержащихся в микроколичествах. Таким образом, добавка 1 % об. 0,2 М фенола улучшает выход триптофана, цистеина и метионина.

По окончанию гидролиза образец лиофилизуют. Это делается, чтобы избавиться от следов соляной кислоты. После этого образец вновь растворяют. Экспериментально было выяснено, что лучшим буфером для растворения является 200 мМ фосфат натрия (рН 11,0), тогда как другие буферные системы (200 мМ фосфат с рН 2,0; 100 мМ фосфат, 40% об. метанола с рН 2,0), а также вода заметно ухудшают разделение образованных в процессе гидролиза смеси аминокислот. Кроме того, это служит причиной уширения пиков, что затрудняет количественную обработку результатов. Если пренебречь стадией лиофилизации, то присутствие соляной кислоты в анализируемом образце приведет к существенному искажению пиков. Выбор рабочего буфера и растворов пробы с различными значениями рН приводит к концентрированию молекул пробы за счет эффекта электростекинга. Подвижность ионов при прохождении скачка рН на приграничной поверхности между буфером и раствором пробы изменяется и происходит концентрирование. Благодаря этому получаются более симметричные пики на электрофореграмме. Далее было проведено разделение кислотного гидролизата брадикинина. Это девятичленный пептид, в структуре которого присутствуют 5 индивидуальных аминокислот: аргинин, глицин, серии, фенилаланин, пролин. При прочих равных условиях анализа было проведено разделение модельной смеси 5 АК, эквимолярное соотношение которых соответствует составу исследуемого пептида, и

непосредственно самого кислотного гидролизата (рис. 12). Совпадение времени выхода пиков, а так же их интенсивности, позволяет говорить о принципиальной применимости данного метода для определения аминокислотного состава коротких пептидов.

Рис. 12. А- разделение модельной смеси аминокислот методом КЗЭ с прямым УФ-детектированием; Б- разделение кислотного гидролизата брадикинина методом КЗЭ с прямым УФ- детектированием ( Х„огл = 208 нм)

Идентификация: 1 - Аргинин, 2 - Глицин, 3 - Серин, 4 - Фенилаланин, 5 - Пролин.

Также был проведен анализ кислотных гидролизатов А-цепи и В-цепи инсулина крупного рогатого скота. В состав первого пептида входят 21 аминокислотный остаток, из которых индивидуальных 11: валин, аспарагин, глутамин, лейцин, цистеин, глицин, серин, глутаминовая кислота, аланин, тирозин, изолейцин; в состав второго - 30, из которых индивидуальных АК 16: лизин, аргинин, гистидин, глицин, аланин, валин, лейцинерин, треонин, фенилаланин, глутаминовая кислота, пролин, тирозин, цистеин, аспарагин, глутамин. На рис. 13 и 14 представлены электрофореграммы разделения кислотных гидролизатов А-цепи и В-цепи инсулина, соответственно. Так как до сих пор при гидролизе не удается сохранить аспарагин и глутамин, их анализируют в виде аспарагиновой и глутаминовой кислот, соответственно. Таким образом, на электрофореграмме рис. 14, где представлен анализ гидролизата В-цепи, можно увидеть 15 пиков. Достигнутая степень разрешения пиков, соответствующих каждой индивидуальной аминокислоте гидролизата, демонстрирует высокую эффективность разработанной методики аминокислотного анализа.

Рис. 13. Разделение кислотного гидролизата A-цепи инсулина крупного рогатого скота методом КЗЭ с прямым УФ-детектированием ().погл = 208 нм) Диаметр капилляра - 75 мкм, общая длина - 80см, эффективная длина - 60 см.

Буферный раствор: 150мМ фосфат, 20%

об. метанола, рН 2,0.

Напряжение 17 кВ. Сила тока 76 мкА,

температура 30°С.

Время ввода пробы: 30 с (вакуум).

Идентификация: 1 - Глицин, 2 -

Алании, 3 - Валин, 4 - Изолейцин, 5 -

Лейцин, 6 - Серии, 7 - Треонин, 8 -

Глутами новая кислота, 9 - Тирозин, 10 -

Цистеин, 11 - Аспарагиновая кислота

Рис. 14. Разделение кислотного гидролизата В-цепи инсулина методом КЗЭ с прямым УФ- детектированием ( ^-погл = 208 нм). Условия см. рис. 13. Идентификация: 1 - Лизин, 2 - Аргинин, 3 - Гистидин, 4 - Глицин,5 - Алании, 6 - Валин, 7 - Лейцин, 8 - Серин, 9 -Треонин, 10 - Фенилаланин, 11 -Глутаминовая кислота, 12 - Пролин, 13 - Тирозин, 14 - Цистеин, 15 -Аспарагиновая кислота..

Таким образом, предложенный метод перспективен для определения аминокислотного состава синтетических и природных биологически активных пептидов без стадии предварительной дериватизации АК, что значительно упрощает схему анализа.

Выводы

1. Впервые предложена принципиальная схема анализа низкокопийных пептидов с использованием антител нуклеотидной природы, их ковалентной сшивки с мишенью и ПЦР-системы амплификации сигнала. Исследованы условия проведения ключевых стадий метода. Проведено достоверное определение содержания модельного пептида DRVYIHPFHL в составе конъюгата с чувствительностью 1,1-10"|6М (66 копий в 1 мкл образца = 11-Ю"21 mol).

2. Оптимизирован способ получения НЕХ-производных олигонуклеотидов, заключающийся в применении новых условий деблокирования олигонуклеотидов в процессе их синтеза. На примерах широкого круга патогенов (Bacteroides spp., Chlamydia trachomatis, CMV, Epstein-Barr virus , Gardnerella vaginalis, HSV 1, HSV 2, Lactobacillus spp., Mobiluncus curtissi, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis и др.) показано, что использование зондов, полученных в соответствии с новым методом, способствует повышению чувствительности ПЦР-анализа ДНК с регистрацией сигнала в реальном масштабе времени.

3. Оптимизирована методика определения аминокислотного состава пептидов без стадии модификации с помощью капиллярного зонального электрофореза с прямым УФ-фотометрическим способом детектирования. Эффективность метода продемонстрирована на примерах определения аминокислотного состава ряда препаратов биологически активных пептидов (брадикинин, А- и В-цепи инсулина крупного рогатого скота, дарбэпоэтин).

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Мосина А.Г.. Мельников И.О., Назимов И.В., Глубокое Ю.М. Капиллярный электрофорез немодифицированных генетически кодируемых аминокислот //Журн. аналит. химии. -2009. -Т.64. -№6. -С. 655-659.

2. Мосина А.Г.. Чувилин А.Н., Смирнов И.П., Позмогова Г.Е., Травкин В.Ф. Анализ эффективности очистки НЕХ-олигонуклеотидов, полученных с использованием модифицированного метода деблокирования // Вестник МИТХТ. - 2012. -№ 4. -Т.7. - С.72-75

3. Нурбаков АЛ., Лобанова Н.В., Савинова И.Н., Шукуров Р.Р., Орлова Н.В., Мосина А.Г.. Ермолина Л.В., Сауткина Е.Н., Хамитов Р.А., Серегин ЮЛ. Оптимизация технологии

периодического культивирования с подпиткой клеток СНО, экспрессирующих рекомбинантный дарбэпоэтин-альфа, в замкнутом объем // Биотехнология. - 2012. -№5. - С. 55-65.

4. Шукуров P.P., Лобанова Н.В., Савинова И.Н., Воробьева И.Г., Нурбаков АА., Ермолина JI.B., Орлова Н.В., Мосина А.Г.. Антонова Л.П., Хамитов РА., Серегин Ю.А. Создание стабильной клеточной линии - продуцента рекомбинантного дарбэпоэтина-альфа на основе клеток СНО. // Биотехнология.-2013. -№2. - С. 46-54.

5. Мельников И.О., Глубокое Ю.М., Мосина А.Г.. Назимов И.В. Способ разделения свободных генетически кодируемых аминокислот // Патент на изобретение № 2346931 выдан 20 февраля 2009.

6. Mosina A.G.. Chuvilin A.N., Smirnov I.P., Pozmogova G.E. Nucleoprotein conjugates for the identification of protein biomarkers of pathological states // FEBS J. - 2012. -V. 279.-S. l.-P. 226.

7. Mosina A.G.. Melnikov I.O., Nazimov I.V., Patrushev L.I., Alekseev Ya.I., Glubokov Yu.M. Determination of human leiden gene mutation by high performance capillary gel electrophoresis // 26th International Symposium on the Separations of Proteins, Peptides and Polynucleotides, LMP, abstracts, Инсбрук, Австрия, октябрь 2006, -P.24.

8. Мосина А.Г. Разделение свободных генетически кодируемых аминокислот методом капиллярного электрофореза // Материалы докладов XIV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов - 2007», материалы докладов, Москва, апрель 2007, -Т. 1 . -С. 38 . ISBN 5-7776-0079-4.

9. Мосина А.Г.. Глубокое Ю.М. Анализ свободных генетически кодируемых аминокислот методами капиллярного зонального электрофореза и мицеллярной электрокинетической хроматографии // 17-ая Менделеевская конференция молодых ученых, материалы докладов, Самара, апрель 2007, -С. 17.

10. Мосина А.Г.. Назимов И.В. Глубокое Ю.М. Разделение свободных генетически кодируемых аминокислот методом капиллярного электрофореза с прямым УФ-фотометрическим детектированием // Всероссийский симпозиум «Хроматография в химическом анализе и физико-химических исследованиях», материалы докладов, Москва, апрель 2007, -С. 161.

11. Mosina A.G.. Melnikov I.O., Nazimov I.V. Analysis of free coded amino acids by capillary electrophoresis // Life Sciences 2007, abstracts, Глазго, Великобритания, июль 2007, -P. 113.

12. Mosina A.G.. Melnikov I.O., Nazimov I.V., Glubokov Y.M. Amino acid analysis of biologically active peptides by capillary electrophoresis // 22nd International Symposium on MicroScale Bioseparations and Methods for Systems Biology, abstracts, Берлин, Германия, март 2008, -P. 350.

13. Mosina A.G.. Nazimov I.V., Glubokov Y.M. Capillary zone electrophoresis for amino acid analysis and identification of c-terminal sequence of peptides // 34th International Symposium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques, HPLC2009, abstracts, Дрезден, Германия, июнь 2009, -P. 666.

14. Мосина А.Г. Влияние способов ВЭЖХ-очистки олигодезоксирибонуклеотидных зондов на эффективность ДНК-диагностики // Материалы докладов XVII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов - 2010», материалы докладов, Москва, апрель 2010, hllp:/Avvv\v.lomonosov-ms\i.ru/archive/Lomonosov 2010/28.htm.

15. Мосина А.Г.. Чувилин А.Н., Смирнов И.П., Позмогова Г.Е. Химические основы повышения достоверности количественного определения ДНК методом ПЦР в реальном масштабе времени // Съезд аналитиков России «Аналитическая химия -новые методы и возможности», материалы докладов, Москва, апрель 2010, - С.195.

16. Мосина А.Г.. Чувилин А.Н., Смирнов И.П., Позмогова Г.Е., Глубокое Ю.М. Повышение чувствительности ПЦР генодиагностики с использованием метода ОФ ВЭЖХ // Всероссийская конференция «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез», тезисы докладов, Краснодар, сентябрь 2010, -С. 273.

17. Мосина А.Г.. Чувилин А.Н., Смирнов И.П., Позмогова Г.Е., Глубокое Ю.М. Разработка основ повышения предела чувствительности протеомного анализа для детекции единичных молекул белковых биомаркеров // 2-я Международная конференция Российского химического общества им. Д. И. Менделеева «Инновационные химические технологии и биотехнологии новых материалов и продуктов», тезисы докладов, Москва, октябрь 2010, -С. 303-305.

18. Мосина А.Г.. Травкин В.Ф., Позмогова Г.Е. Идентификация биомаркеров патологических состояний белковой природы спомощью ВЭЖХ, MALDI TOF MS и RT-PCR // V Всероссийская конференция студентов и аспирантов с международным участием «Химия в современном мире», тезисы докладов, Санкт-Петербург, апрель 2011, -С. 27-28.

19. Mosina A.G.. Chuvilin A.N., Smirnov I.P., Pozmogova G.E. Improvement in the sensitivity of RT-PCR assays by using RP-HPLC probe purification // 36lh International

Symposium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques, HPLC 2011, abstracts, Будапешт, Венгрия, июнь 2011, -P. 275.

20. Мосина А.Г.. Травкин В.Ф., Позмогова Г.Е. Химическое повышение стабильности ДНК-диагностики, основанной на использовании гексахлорфлуоресцеин-меченных олигонуклеотидов // VI Всероссийская конференция студентов и аспирантов с международным участием «Менделеев-2012», тезисы докладов, Санкт-Петербург, апрель 2012, - С. 237-238.

Заказ № 37-Р/07/2013 Подписано в печать 18.07.13 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,25

ООО "Цифровичок", тел. (095) 797-75-76 www.cfr.ru; е-таИ: info@cfr.ru

Текст научной работы диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Мосина, Алёна Геннадьевна, Москва

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЫ ФЕДЕРАЛЬНОГО МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО АГЕНТСТВА РОССИИ И МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ТОНКИХ ХИМИЧЕСКИХ

ТЕХНОЛОГИЙ им М.В. ЛОМОНОСОВА

На правах рукописи

04201360986

Мосина Алёна Геннадьевна

РАЗРАБОТКА ХИМИЧЕСКИХ ОСНОВ УВЕЛИЧЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ АНАЛИЗА ПЕПТИДОВ

Специальность: 02.00.10- Биоорганическая химия

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: д.х.н., проф. Позмогова Г.Е.

МОСКВА 2013

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ .... 4

ВВЕДЕНИЕ..........5

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР........10

1.1.Основные способы определения низкокопийных пептидов. . . 10

1.1.1. Иммуно-ПЦР.........10

1.1.2. ДНК-аптамеры . . . . . . . . 16

1.1.3. Полимеразная цепная реакция . . . . . . 18

1.1.3.1. Принцип метода полимеразной цепной реакции . . . 18

1.1.3.2. Компоненты реакции . . . . . . . 18

1.1.3.3. Температурные режимы программы ПЦР . ... 20

1.1.3.4. Оценка результатов реакции . . . . . . 21

1.1.3.5. Полимеразная цепная реакция в реальном масштабе времени. 22

1.1.3.6. Факторы, влияющие на чувствительность и достоверность количественной ДНК-диагностики ..... 26

1.1.3.7. Визуализация накопления ДНК при проведении ПЦР «в реальном времени» .......... 27

1.1.3.8. Типы зондов в специфических системах детектирования. . 32

1.1.3.8.1. Праймеры-зонды («скорпионы») .... 32

1.1.3.8.2. «Вытесняющие» зонды ..... 33

1.1.3.8.3. Линейные зонды (TaqMan) ..... 34

1.1.3.8.4. Зонды «молекулярные маячки» (Molecular beacons) . 3 5

1.1.3.8.5. Примыкающие пробы. ..... 36

1.1.3.8.6. Зонды типа «Perfect probe» ..... 37 1.2. Анализ аминокислотного состава биологически активных пептидов . 38

1.2.1. Исчерпывающий гидролиз биологически активных пептидов . 38

1.2.2. Методы разделения и анализа аминокислот .... 40

1.2.3. Капиллярный электрофорез ...... 43

1.2.4. Особенности капиллярного электрофореза аминокислот . . 46

1.2.5. Способы детектирования аминокислот .... 47

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.......50

2.1. Реактивы и материалы ........ 50

2.2. Приборы и оборудование ......

2.3. Приготовление рабочих буферных растворов

2.4. Общая методология работы ......

2.4.1. Приготовление кислотных гидролизатов природных пептидов

52 56 56

2.4.2. Анализ смеси стандартных аминокислот и гидролизатов биологически активных пептидов . . . . . . . . 57

2.4.3. Синтез нуклеопротеиновых конъюгатов .... 58

2.4.4. Масс-спектрометрический анализ ..... 59

2.4.5. Нуклеазный гидролиз ....... 59

2.4.6. ПЦР в режиме реального времени конъюгата ... 59

2.4.7. Синтез олигонуклеотидов, содержащих гексахлорфлуоренильную метку........... 60

2.4.8. Очистка зондов методом вертикального гель-электрофореза . 60

2.4.9. Выделение зондов из ПААГ ...... 60

2.4.10. ВЭЖХ-очистка НЕХ-зондов......61

2.4.11. ПЦР в режиме реального времени на основе НЕХ-зондов . 61 2.5. Статистическая обработка результатов КЭ ..... 62

2.5.1. Расчет селективности разделения ..... 62

2.5.2. Оценка воспроизводимости ...... 62

2.5.3. Оценка правильности. ....... 62

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ......63

3.1. Разработка принципиальной схемы анализа низкокопийных пептидов с использованием химико-ферментативных систем амплификации сигнала . 63

3.2. Оптимизация флуоресцентного ПЦР-анализа ДНК в режиме реального времени с использованием зондов, содержащих гексахлорфлуоренильную метку . 76

3.3. Оптимизация анализа аминокислотного состава биологически активных пептидов без стадии модификации методом капиллярного электрофореза 87

Приложение А . . . . . . . . . . 107

4. ВЫВОДЫ..........108

5. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ .......109

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АК - аминокислота

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ГЖХ - газожидкостная хроматография

ГХ - газовая хроматография

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

дНТФ - дезоксирибонуклеозидтрифосфат

ИОХ - ионообменная хроматография

ИФА - иммуноферментный анализ

КЗЭ - капиллярный зональный электрофорез

КЭ - капиллярный электрофорез

МС - масс-спектрометрия

ОФ ВЭЖХ - обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПААГ - полиакриламидный гель

РНК - рибонуклеиновая кислота

СТВ - стрептавидин

Темед - N,N,N',N"- тетраметилэтилендиамин

ТСХ - тонкослойная хроматография

УФ - ультрафиолетовый

ЭОП - электроосмотический поток

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат натрия

ACR-акридин

BHQ2 - 4'-(4-нитро-фенилдиазо)-2'- метокси-5'-метокси-азобензол-4"-(М-этил)-М-этил-2-циапоэтил-(М,Ы-диизопропил)

BSP - фосфодиэстераза II из селезенки крупного Рогатого скота CMV -цитомегаловирус

Су5-1-(3-(4-монометокситри'1илокси)про11ил)-Г-(3-((2-цианоэтил)-(М,Н-

диизопропил)фосфорамидитил)пропил)-3,3,3',3'- тетраметилиндодикарбоциан

EI - ионизация электронным ударом

ESI - ионизация электрораспылением

FAM - б-флуоресцеинил-б-карбоксиамидогексил

HEX - гексахлорфлуоресцеин

HS V - вирус герпеса

MALDITOF MS (Малди) - ионизация с помощью лазерной десорбции из матрицы

Real Time ПЦР - ПЦР в режиме реального времени

ROX - карбокси-Х-родамин

Tris (Трис) - трис(гидроксиметил)аминометан

ВВЕДЕНИЕ

сегодня не только идентифицировать целевую последовательность ДНК в клиническом образце, но и достоверно оценить ее количество [3,4].

В настоящее время остается актуальной разработка и оптимизация методов аминокислотного анализа как синтетических, так и природных биологически активных пептидов. Это связано с тем, что некоторые пептиды могут иметь модификации в аминокислотном составе. Поэтому при контроле качества лекарственных препаратов необходимо подтверждение их подлинности, что особенно важно в связи с перспективами использования бактерицидных пептидов [5]. При классических условиях кислотного гидролиза происходит частичная потеря некоторых аминокислот, что не дает полной информации о составе исследуемого пептида. Для проведения анализа с помощью традиционных методов требуется сложное аппаратурное оформление и большой объем дорогостоящих токсичных реактивов для предколоночной или постколоночной дериватизации.

Задачи исследования.

- получение нуклеопротеиновых конъюгатов;

- исчерпывающее ферментативное расщепление исходного олигомера и частичное расщепление конъюгата;

анализ содержания целевого пептида в составе конъюгата с использованием приемов флуоресцентного анализа ПНР в режиме реального времени.

2. Оптимизация известных методов анализа:

Научная новизна.

1. Разработана новая схема высокочувствительного анализа низкокопийных пептидных биомаркеров в виде нуклеопротеиновых коньюгатов с помощью амплификации сигнала методом ПТ IP в реальном масштабе времени.

2. Разработан новый способ деблокирования синтетических гексахлорфлуоресцеин олигонуклеотидов, препятствующий модификации метки

и накоплению трудно отделяемого побочного продукта. Оптимизированы условия очистки олигонуклеотидных зондов с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ.

Практическая значимость.

Разработан и предложен способ повышения чувствительности определения пептидных биомаркеров в виде нуклеопротеиновых коньюгатов методом ПЦР в режиме реального времени. Для создания системы ПЦР-амплификации ДНК-фрагмента конъюгата была отработана методика синтеза и режимов анализа для модификаций и очистки олигонуклеотидных зондов. Предложенные подходы для оптимизации способов получения зондов успешно использовались при создании и в производстве новых наборов для определения широкого круга патогенов, таких как Bacteroides spp., Chlamydia trachomatis, CMV, Epstein-Barr virus , Gardnerella vaginalis, HSV 1, HSV 2, Lactobacillus spp., Mobiluncus curtissi, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis и dp (приложение А). Проведение подобных исследований особенно актуально в связи с постоянной потребностью в расширении арсенала диагностических методов с жесткими критериями надежности. Оптимизированный метод аминокислотного анализа биологически активных пептидов позволяет определять состав без их модификации. Это существенно при контроле качества лекарственных белковых препаратов, как брадикинин, инсулин, дарбэпоэтин.

На защиту выносятся:

- принципиальная схема обнаружения низкокопийных пептидов в виде нуклеопротеиновых коньюгатов с использованием химико-ферментативных систем амплификации сигнала;

Апробация работы.

Основные результаты работы были представлены на XIV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов - 2007» (2007, Москва, Россия), 17-ой Менделеевской конференции молодых ученых (2007, Самара, Россия), Всероссийском симпозиуме «Хроматография в химическом анализе и физико-химических исследованиях» (2007, Москва, Россия), Life Sciences 2007 (2007, Глазго, Великобритания), 22ndInternational Symposium on MicroScale Bioseparations and Methods for Systems Biology, (2008, Берлин, Германия), 34th International Symposium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques (2009, Дрезден, Германия), XVII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов - 2010» (2010, Москва, Россия), Съезде аналитиков России «Аналитическая химия -новые методы и возможности» (2010, Москва, Россия), Всероссийской конференции «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез» (2010, Краснодар, Россия), 2-ой Международной конференции Российского химического общества им. Д. И. Менделеева «Инновационные химические технологии и биотехнологии новых материалов и продуктов» (2010, Москва, Россия), V Всероссийской конференции студентов и аспирантов с

международным участием «Химия в современном мире» (2011, Санкт-Петербург,

th • Россия), 36 International Symposium on High Performance Liquid Phase Separations

and Related Techniques, HPLC 2011 (2011, Будапешт, Венгрия), VI Всероссийской

конференции студентов и аспирантов с международным участием «Менделеев-

2012» (2012, Санкт-Петербург, Россия), FEBS 2012 (2012, Севилья, Испания).

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 1.1.0сновные способы определения низкокопийных пептидов

Одна из актуальных задач в протеомных исследованиях сегодня состоит в поиске новых биомаркеров различных, в том числе патологических, процессов, причем наиболее информативным оказывается анализ состава низкокопийных белков. Развитие инструментальных методов, в частности, высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией и ПЦР-диагностикой, позволило значительно расширить пределы детекции низкокопийных белков, и провести инвентаризационные протеомные исследования различных биологических объектов [6]. Новые возможности увеличения чувствительности количественного протеомного анализа так же связаны с такими приемами, как аффинное обогащение с помощью искусственных антител нуклеотидной природы (ДНК-аптамеров)[7]. 1.1.1. Иммуно-ПЦР

Среди современных методов анализа низкокопийных биомаркеров особое значение имеет метод иммуно-ПЦР, который впервые позволил количественно определять фемтомолярные концентрации белков и пептидов в составе сложных смесей без их предварительного обогащения. Основное преимущество этого прогрессивного подхода состоит в использовании биоспецифических взаимодействий целевых молекул в сочетании с амплификацией сигнала с помощью приемов полимеразной цепной реакции. Метод иммуно-ПЦР основан на использовании антител или антител-связанных реагентов для определения компонентов образца [8]. Избирательная природа связывания антител позволяет им быть использованными для развития метода, который является высокоспецифичным и может быть направлен на анализ таких физиологических жидкостей, как кровь, плазма или моча. Для того, чтобы расширить масштаб полимеразной цепной реакции (ПЦР) до высокочувствительного определения пептидов, была изучена система иммуно-ПЦР, преимуществом которой является специфичные конъюгаты, включающие антитела и маркерную

олигонуклеотидную последовательность. Если объединить многосторонность иммуноферментного анализа (ИФА) с чувствительностью амплификации ПЦР-анализа, то иммуно-ПЦР основывается на конъюгатах специфических антител и молекул нуклеиновых кислот, которые затем используются как маркеры для амплификации сигнала с помощью ПЦР. Высокая эффективность амплификации обычно приводит к увеличению чувствительности в 100-10,000 раз [9,10]. Для визуализации результатов ПЦР- анализа используют горизонтальный электрофорез в агарозном геле или флуориметрический способ детекции. В добавление к этому свойст