Синтез мономеров отрицательно-заряженных пептидно-нуклеиновых кислот и их олигомеризация тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

ПРОХОРОВ Денис Игоревич

СИНТЕЗ МОНОМЕРОВ ОТРИЦАТЕЛЬНО-ЗАРЯЖЕННЫХ ПЕПТИДНО-НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ И ИХ ОЛИГОМЕРИЗАЦИЯ

02.00.10 - Биоорганическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2005

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова (г Москва).

Научный руководитель

академик РАМН, доктор химических

наук, профессор

Швец Виталий Иванович

Официальные оппоненты

доктор химических наук, профессор Олсуфьева Евгения Николаевна

кандидат химических наук Желтухина Галина Александровна

Ведущая организация ФГУ Российский кардиологический

научно-производственный комплекс Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию.

Защита состоится «Л£у> р&саЦбД. 2005 года в час. на заседании диссертационного совета Д 212.120.il при Московской государственной академии тонкой химической технологии им М. В. Ломоносова по адресу: 119571, г. Москва, проспект Вернадского, д. 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова.

Автореферат разослан «¿5*» 2005 года.

Ученый секретарь Диссертационного Совета кандидат химических наук, старший научный сотрудник /) / А.И. Лютик

2ШгА 12ЯШ zi 6-ÍS-

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ*

Актуальность проблемы. Создание и изучение модифицированных олигонуклеотидов становится одним из центральных направлений биотехнологии из-за возможности их использования в качестве терапевтических агентов в медицине и инструментов для проведения исследований в молекулярной биологии. Они способны связываться с молекулами ДНК и мРНК, тем самым влиять на процесс экспрессии генов. Этот принцип получил название антисенс- и антиген-ингибирования биосинтеза белка (J. Milligan et al., 1993).

Однако, для того, чтобы ангисенс- и антигентехнологии нашли свое применение на практике, такие олигонуклеотиды должны обладать высокой специфичностью связывания с молекулами нуклеиновых кислот, способностью проникать через клеточные мембраны, а также быть устойчивыми при физиологических условиях. Поскольку естественные нуклеиновые кислоты (НК) быстро разрушаются нуклеазами, значительный интерес представляют синтетические аналоги олигонуклеотидов, которые достаточно устойчивы в условиях in vivo. Среди последних наиболее интересными соединениями являются пептидно-нуклеиновые кислоты (ПНК).

ПНК по своей структуре являются аналогами ДНК, в которых сахаро-фосфатный остов природных НК заменен на псевдопептидный, построенный из повторяющихся единиц Ы-(2-аминоэтил)глицина (Р. Nielsen et al., 1991). Такая структурная модификация позволила добиться устойчивости к внутриклеточной деградации с сохранением способности к гибридизации с комплементарными участками нуклеиновых кислот. Однако наряду с уникальными гибридизационными свойствами, во многом превосходящими свойства фрагментов природных нуклеиновых кислот, ПНК имеют ряд принципиальных недостатков, в частности, плохо проникают через

В руководстве работой принимала участие к.х.н. Кириллова Ю.Г.

Список используемых сокращений. ПНК - петтщно-нуклеиновая кислота, ОЗПНК - отрицательно-заряженная пептидно-нуклеиновая кислота, АЛ - аллил, АсгО - уксусный ангидрид. Вое - трет-бутилоксикарбонил, ВД-бэвиц Z - беижпоксикарбонил, DEAD - дюгалаэодикарбоксилаг, DIEA - диизопропилэтиламин, IBC -изобутилхлорформ иат, МВНА - 4-мевибетгидриламин, NMM - N-метилморфолин, o-NBS - арто-ншробеюсотсульфониц ® - полимерный носитель, Ру - пиридин, TF.fr цярпимщ ТГА—«рфвруящрная кизила, TFMSA- |риф|ирмегансупьфокислота.

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА

I ■ шш^шшшвллт г

клеточные мембраны, обладают ограниченной растворимостью в воде и способностью к самоагрегации. Одним из способов, позволяющих преодолеть некоторые из этих недостатков, является получение олигомеров ПНК, содержащих в своем составе гидрофильные группировки, в частности несущие отрицательный заряд. Ранее было показано, что наличие карбоксильной группы в структуре псевдопептадного скелета олигомера ПНК, оказывает значительное влияние на свойства дуплекса ПНК/ДНК и делает такого рода олигомеры наилучшими дискриминаторами мутаций по сравнению с классическими ПНК и другими модифицированными ПНК (б Наата е/ я/, 1996). К сожалению, их подробное изучение сдерживается доступностью соответствующих синтетических мономеров.

Работа является частью научных исследований, проводимых на кафедре Биотехнологии МИТХТ им. М.В. Ломоносова в рамках госбюджетной темы 1Б-5-856 «Синтез новых фармакологически активных веществ, изучение их биологических свойств и методов направленного транспорта с целью создания противоопухолевых, противовирусных, антипаркинсонических средств» и по грантам президента РФ по поддержке ведущих научных школ (№ НШ-2329.2003.4 и № РИ-112/001/609).

Цель настоящего исследования состояла в разработке эффективного метода синтеза мономерных единиц отрицательно-заряженных пептидно-нуклеиновых кислот (ОЗПНК), а также в проверке возможности последующей олигомеризации данных мономеров. Основные этапы работы заключались в препаративном синтезе мономеров ОЗПНК на основе производных Ь- и О-глутаминовой кислоты и проведении тест-синтеза тримерной последовательности, исходя из тиминсодержащего мономера ОЗПНК (на основе Ь-глутаминовой кислоты), как на твердой фазе, так и в растворе.

Научная новизна и практическая ценность работы.

В результате проделанной работы нами разработана и оптимизирована стратегия синтеза тиминсодержащего мономера отрицательно-заряженных пептидно-нуклеиновых кислот на основе глутаминовой кислоты. На стадии синтеза псевдопептидного фрагмента мономера ОЗПНК показано значительное

преимущество реакции Мицунобу над стандартным методом, основанным на реакции восстановительного Ы-алкилирования.

На основании полученных значений удельных углов оптического вращения для синтезированных мономеров сделан вывод о стереоспецифичности разработанных методов синтеза. Таким образом, высокая эффективность и незначительная рацемизация на каждой из стадий предложенной схемы синтеза позволяют говорить о возможности создания препаративной технологии для получения мономера ОЗПНК.

Впервые синтезирован мономер ОЗПНК на основе Ь-глутаминовой кислота, содержащий в качестве нуклеинового основания аденин.

Осуществлен тест-синтез трехзвенной последовательности ОЗПНК, структурными блоками в который является тиминсодержащий мономер ОЗПНК, построенный на основе Ь-глутаминовой кислоты.

Представленный в работе метод получения псевдопептидных фрагментов ПИК может быть также использован для синтеза псевдопептидов различного строения, которые в свою очередь могут найти самостоятельное применение в качестве ингибиторов протеаз. Таким образом, выполненная работа разрешает методические аспекты получения псевдопептидных структур и делает их практически доступными для развития новых направлений использования.

Основные положения, выносимые на защиту:

1 Синтез псевдопептидных фрагментов, построенных на основе глицина, аланина и глутаминовой кислоты.

2. Разработка препаративного метода синтеза мономера отрицательно-заряженных пептидно-нуклеиновых кислот (ОЗПНК) на основе Ь- и Б-глутаминовой кислоты, сравнение значений удельных углов оптического вращения для синтезированных мономеров ОЗПНК.

3. Синтез аденинсодержащего мономера ОЗПНК на основе Ь-глутаминовой кислоты.

4. Тест-синтез трехзвенной последовательности ОЗПНК, построенной на основе тиминсодержащего мономера ОЗПНК, в растворе и на твердой фазе.

з

Публикации и апробапия работы. По материалам диссертационной работы опубликовано 2 статьи и 5 тезисов на Всероссийских и международных конференциях. Результаты настоящего исследования были представлены на следующих научных конференциях: III, IV Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития - 2003», - 2005» (2003, Москва; 2005, Москва), 10-ая Международная научно-техническая конференция «Наукоемкие химические технологии» (2004, Волгоград), Первая научно-техническая конференция молодых ученых МИТХТ им. М. В. Ломоносова «Наукоемкие химические технологии» (2005, Москва).

Структура диссертации и объем работы. Диссертация изложена на_страницах

машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, посвященному методам синтеза и изучению гибридизационных свойств пептидно-нуклеиновых кислот, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка

цитируемой литературы, включающего_источника. Диссертация иллюстрирована

_рисунками и содержит_схем и_таблиц.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Начиная с 1991 г, интерес к ПНК непрерывно возрастает в первую очередь благодаря их уникальным гибридизационным свойствам. Они нашли широкое применение в биохимических, генно-инженерных, а также медицинских исследованиях. ПНК могут использоваться как терапевтические агенты нового поколения, позволяющие избирательно воздействовать на внутриклеточные процессы. Олигомеры ПНК являются потенциальными ингибиторами клеточного роста. Особенно перспективным направлением использования ПНК является создание эффективных методов диагностики и детекции генетических мутаций.

Однако следует заметить, что структура «классических» ПНК с N-(2-аминоэтил)глициновым остовом (II) (Рис. 1) не всегда удовлетворяет всем требованиям, которые ставятся перед современными ДНК-миметиками.

I (ДНК) П(ПНК)-»-К = Н

В = Thy, Cyt, Ade, Gu» Ш (03ПНКУ R = (CH^COOH

Рис. 1. Структура ДНК (I), «классических» (II) и отрицательно-заряженных ПНКна основе глутамшовой кислоты (III).

Так, например, не всегда удается достичь эффективного прохождения этих ПНК через клеточные мембраны. Кроме того, ПНК, предложенные П. Нильсеном, недостаточно хорошо растворимы в воде, что также ограничивает их использование in vivo. В этой связи во многих научно-исследовательских лабораториях создаются новые ПНК с усовершенствованной структурой, призванной улучшить способности ПНК к специфическому связыванию с комплементарными нуклеиновыми кислотами.

На наш взгляд несомненный интерес представляет структурная модификация ПИК, в каждом мономере которой содержится отрицательный заряд, представленный карбоксильной группой (III) (Рис. I). По нашему мнению отрицательный заряд в структуре олигомеров ПНК будет способствовать увеличению их растворимости в воде и уменьшению самоагрегации последних за счет сил электростатического отталкивания. С другой стороны, введение заряда предоставит возможность влиять на стабильность дуплексов ПНК с природными НК, например, за счет изменения ионной силы раствора.

В настоящей работе основные усилия были направлены на разработку препаративного метода синтеза мономеров отрицательно-заряженных ПНК, которые могут быть встроены в олигомерную цепь по Вос-протоколу твердофазного синтеза.

К настоящему времени известен ряд синтетических стратегий для получения мономеров и олигомеров ПНК различного строения, в том числе и несущих гидрофильные остатки (S. Sforza et al, 2000). Однако следует отметить, что описанные процедуры синтеза не являются удовлетворительными для получения ПНК, содержащих в своем составе отрицательный заряд.

Таким образом, в данной диссертационной работе предложен оптимальный метод синтеза тиминсодержащих мономеров ПНК la,b (Схема 1) на основе L- и D-

5

глутаминовой кислоты соответственно, а также осуществлена пробная олигомеризация мономера 1а (на основе Ь-глутаминовой кислоты), с использованием как твердофазного синтеза, так и классического синтеза в растворе. Применяя условия, разработанные для синтеза тиминсодержащих мономеров ОЗПНК 1а,Ь, также был осуществлен полный синтез аденинсодержащего мономера ОЗПНК 4 на основе Ь-глутаминовой кислоты.

1.Синтез мономеров отрицательно-заряженных ПНК.

Стратегия синтеза мономерной единицы отрицательно-заряженных ПНК включает в себя следующие экспериментальные этапы (Схема 1).

Схема 1.

В - ТЬу, 6-(ТЧН-г)А(1е

/он

BocHN o-J^BS +

NblXOOAH

ОН + -

В

h2n4

COOBzi СООАИ

k +

NH ХООА11

BocHN ^ t

1 COOBzi

BocHN

COOBzi / п

[—2a,b R « All, В = Thy IV U.la,bR-H,B = Thy

.—3 R - All, В = 6-(NH-Z)Ade IV U4R-H,B-6-(NH-Z)Ad«

I. Синтез карбоксиметилнрованных производных гетероциклических оснований. П. Создание псевдопегггидного фрагмента с восстановленной пептидной связью, несущего отрицательный заряд.

III. Конденсация псевдопептидного фрагмента с карбоксиметилировапными основаниями.

IV. Деблокирование защищенного мономера ОЗПНК.

1.1. Синтез карбоксиметилированных производных гетероциклических оснований.

В данной работе был осуществлен синтез карбоксиметилированных производных тимина и аденина (Схема 2). Синтез этих соединений осуществляли по ранее описанным методикам, алкилируя N-1-положение в тимине 5 и соответственно >1-9-положение в аденине 8 этиловым эфиром хлоруксусной кислоты. Последующий' щелочной гидролиз эфира 6 приводил к тиминил-1-уксусной кислоте 7. Синтез тиминил-1-уксусной кислоты 7 осуществляли также альтернативным способом, алкилируя исходный тимин 5 бромуксусной кислотой в щелочной среде.

Схема 2.

о о

N8011/1120

Г о г- "^¡К" г

гУч гУ">

8 9 Ч*0 «а0Н/Н,0Г 10а = Ш ^

) -к

«аОН/Н2оГ 10а = Ш

.0

9 у' — ю Я = Е1

0Е1

г-Запщту экзоциклической аминогруппы аденина в соединении 9 вводили с использованием предварительно полученного реагента Раппопорта 12. Омыление сложноэфирной группы в соединении 10 действием водного раствора щелочи приводило к целевой кислоте 11. Таким образом, нами были синтезированы таминил-1-уксусная кислота 7 и 6-(ЫН-7)-аденил-9-уксусная кислота 11, физико-химические и спектральные характеристики которых совпадали с литературными данными.

1.2. Синтез псевдопептидного фрагмента с восстановленной пептидной связью.

Классическим вариантом синтеза псевдопептидного фрагмента, предназначенного для синтеза мономеров ПНК, является метод, основанный на реакции восстановительного Ы-алкилирования.

На начальном этапе исследования данный метод был использован нами для получения следующих псевдопептидных фрагментов (Схема 3):

1. Метиловый эфир Н-[2-(трети-бугилоксикарбонил) аминотгал]глицина 13.

2. Метиловый эфир Ы-[2-(тире7и-бутилоксикарбонил) аминоэтил]-Ь-аланина 14.

3. а-Аллиловый, у-бензиловый диэфир И- [2-(от/>е/л-бутилоксикарбонил)

аминоэтил]-Ь-глутаминовой кислоты 15а.

16 он 4 17

О

Схема 3.

О

-5-- ВосНЫ ^^ у 0^1

АсОН/МеОН

18 1*1= СН3,1*2= Н; У 1 13 Я,= СН3, Я2= Н;

191^,= СН3, Я2= СН3; 1^2 14 Иг СН3> К2~ СНз;

20а Я,= АН, Я2= (СН^СООВг!. 15а Я,» АН, (СН^СООВг!

Исходными соединениями для синтеза соединений 13 и 14 являлись М-Вос-аминоацетальдегид 17, метиловый эфир глицина 18 и метиловый эфир аланина 19 соответственно. В качестве аминокомпоненты для получения соединения 15а был взят у-бензиловый, а-аллиловый диэфир 1-глутаминовой кислоты 20а. Последний получали из доступного у-бензилового эфира 1-глутаминовой кислоты в три стадии, последовательно защищая аминогруппу, ацилируя а-карбоксильную группу аллиловым спиртом и удаляя Вос-затциту трифторуксусной кислотой в хлористом метилене. Трифторацетат аминоэфира 20а был получен с общим выходом 62.8%, структура его и промежуточных соединений была подтверждена данными 'Н-ЯМР-спектроскопии.

Защищенный аминоацетальдегид 17 был получен по описанному ранее методу

(К, ЭиеШт е( а!., 1993) из 3-амино-1,2-пропандиола 16 в две стадии. Реакцию

восстановительного Л^-алкэширования между последним и аминоэфирами 18, 19 и

8

20а проводили в метаноле действием цианборогидрида натрия в присутствии уксусной кислоты (Схема 3). Предварительную нейтрализацию соответствующего трифторацетата для соединения 20а осуществляли насыщенным раствором бикарбоната натрия с последующей экстракцией хлористым метиленом (выход 98%) Выход целевых псевдопептидов 13, 14, 15а после хроматмрафической очистки составил 54,47, и 41% соответственно.

Необходимо отметить, что псевдопептидный фрагмент 15а, аминогруппа которого находится в свободном состоянии, оказался довольно неустойчивым из-за склонности к внутримолекулярной циклизации с образованием производного пироглутаминовой кислоты 21 (Схема 4). Данный побочный продукт был выделен в чистом виде и его химическая структура была доказана методом !Н-ЯМР-спектроскопии. Также было замечено, что хранение вещества в форме основания в течение 1 месяца при -20 С приводило к образованию побочного продукта 21 (~50% по данным ТСХ).

Для того, чтобы защитить вторичную аминогруппу и предотвратить возможный процесс циклизации на время хранения вещества, вторичный амин 15а выделяли в виде хлоргидрата.

Таким образом, данный метод является пригодным для получения псевдопептидных фрагментов ПНК, однако наличие некоторых недостатков, а именно:

Схема 4.

н о

невысокий выход реакции восстановительного Я-алкилирования; неустойчивость исходного альдегида 17, а также возможность образования большого ряда побочных продуктов в ходе превращения; возможность частичной или полной рацемизации,

значительно ограничивают его применимость, особенно для синтеза псевдопептидных фрагментов с применением аминокислот, содержащих функциональную группу в боковом радикале.

В качестве альтернативного способа создания псевдопептидных структур нами был использован метод, основанный на региоселекгивной реакции Мицунобу. Известно, что получаемые по этому методу псевдопептиды обладают более высокой оптической чистотой по сравнению с аналогичными структурами, полученными реакцией восстановительного /У-ал копирования, что имеет определяющее значение в нашем случае (В. ЕаШенгкг е? а!., 2001). Применительно к синтезу псевдопептидных фрагментов мономеров ПНК реакция Мицунобу включает в себя взаимодействие спиртовой компоненты (Вос-защищенный этаноламин), кислотной компоненты (о-ИВЗ-производное аминокислоты), трифетшлфосфина и диэтилазодикарбоксилата по следующему механизму (Схема 5).

В данной диссертационной работе вышеуказанный подход был использован для синтеза псевдопептидных фрагментов, построенных на основе Ь- и Б-глутаминовой кислоты. Исходным соединением в данном случае служило N-0-нитробензолсульфамидное производное глугаминовой кислоты (23а для Ь- и 23Ь для Б-изомера соответственно) (Схема 6), поскольку наличие элекгроноакцепторной группы при атоме азота позволяет использовать это соединение в качестве элекгрофильной компоненты, легко вступающей в реакцию нуклеофильного замещения с ТУ-Вос-этаноламином 24. Соединения 23а,Ь получали из соответствующих трифторацетатов 22а,Ь взаимодействием с о-нитробензолсульфохлоридом в присутствии триэтиламина в хлористом метилене, с выходами 74 и 76% соответственно. Реакцию Мицунобу проводили в тетрагидрофуране в атмосфере инертного газа. Продукты конденсации 25а,Ь

Схема 5.

С1П

ЕЮ

ЕЮ

О

О

выделяли с помощью хроматографии на силикагеле с выходом 62 и 65% соответственно.

Схема 6.

О ОЕАО/РРЬз

24

23» (Ь) 23Ь(Р)

СООВЙ

ВосНЫ

25а (Ц 25Ь(0)

15а (Ц 15Ь (О)

СООВЙ

СООВ21

Для получения свободных целевых псевдопептидов 15а,Ь о-нитробензолсульфонильную группу в соответствующих соединениях 25а,Ь удаляли, действуя 3-кратным избытком тиофенола и 1.5-кратным избытком поташа в ацетонитриле. Добавление реагентов осуществляли при охлаждении до 0°С с целью уменьшения скорости побочной реакции циклизации. Реакция проходила в течение 5 ч. Целевые псевдопептиды 15а,Ь отделяли от образующегося в ходе обработки циклического продукта с помощью хроматограф™ и сразу же вводили в конденсацию с тиминил-1 -уксусной кислотой 7 или с 6-(МН-2)-аденил-9-уксусной кислотой 11с целью получения соответствующих мономеров ОЗПНК.

1.3. Конденсация псевдопептидных фрагментов с

карбокснметнлнрованными гетероциклическими основаниями и последующее удаление защитных групп.

Стандартным методом образования амидной связи между псевдопептидным фрагментом ПНК и производными гетероциклических оснований, описанным в

различных литературных источниках {К. ГЫеШт ег а1, 1994; В. РаШетсг е/ а1,

2001), является использование различных карбодиимидов: дициклогексилкарбодиимида (DCC) или 1-[3-(диметиламино)пропил]-3-этилкарбодиимида (EDC) в сочетании с нуклеофильными добавками: 1-гидроксибензотриазолом (HOBT) или 3,4-дигидро-3-гидрокси-4-оксо-1,2,3-бензотриазином (DhbtOH).

В нашем случае данный метод активации показал хорошие резулматы только для синтеза мономеров ПНК, не содержащих в своем составе объемных боковых радикалов. Так, выход защищенного классического мономера ПНК на основе глицина 26 при использовании EDC в сочетании с DhbtOH составил 73%, а мономер на основе L-аланина 27 был синтезирован в аналогичных условиях с выходом 65%. Однако применение такого метода активации или использование специфичного N-ацилирующего реагента бензотриазол-1-илокситрис(диметиламино)-фосфоний гексафторфосфата (ВОР) применительно к синтезу мономера ОЗПНК 2, на основе глутаминовой кислоты не приводило к удовлетворительным выходам (Табл. 1).

Причинами невысоких выходов могут быть, во-первых, недостаточная активация тиминил-1 -уксусной кислоты 7, во-вторых, стерические особенности вторичных аминов 15а,Ь и, наконец, образование в ходе реакции побочных продуктов циклизации 21а и 22Ь соответственно. Таким образом, для однозначного и эффективного проведения процесса N-ацилирования необходимо было, с одной стороны, получить устойчивое и активное производное тиминил-1-уксусной кислоты 7, а с другой стороны, максимально сократить время реакции во избежание побочного процесса циклизации.

Таблица 1. Реакции конденсации псевдопептидного фрагмента 15а с тиминил-1-уксусной кислотой 7 в различных условиях. ___

Методы активации Время Температура, "С Избыток тимин-1 -ил уксусной кислоты 7 Выход, %

DCC/HOBT/DIEA 20 ч 20 1.1 15

DCC/DhbtOH/DIEA 15ч 20 1.1 53

BOP/DIEA 20 ч 20 3.0 32

IBC/NMM/TEA 20 мин -20 1.5 60

IBC/NMM/TEA 20 мин -20 3.0 78

В ходе дальнейших исследований были найдены оптимальные условия для активации тиминил-1-уксусной кислоты 7, позволяющие добиться удовлетворительных выходов целевых мономеров 2а,Ь (Схема 7).

Использование метода смешанных ангидридов с использованием изо-бутилхлорформиата позволило сократить время реакции до 20 мин, и при этом выход целевого продукта 2а (Ь-изомер) составил 60% в случае полуторного и 78% в случае 3-х кратного избытка карбоксильной компоненты по отношению к амину 15а (Табл.1).

Схема 7.

7 В = Thy И В - 6-(NH-Z)Ade ¿H

BocHN

ОА11-

15а (L) 1Sb<D> COOBzl

¡BuOCOCl/NMM

TEA, DMF

'BocHN

OAII e^BocHH морфолив

COOBzl

2a (L), В-Thy 2b (D), В-Thy 4 В = 6-(XH-Z)Ade

COOBzl

la (L), В = Thy Tb (D), В = Thy 3 В = 6-(NH-Z)Ade

Синтез защищенного аденинсодержащего мономера 4 осуществляли также с использованием метода смешанных ангидридов, используя в качестве исходных соединений псевдопептидный фрагмент 15а и 6-(МН-7)-аденил-9-уксусную кислоту 11 (Схема 7). Выход реакции составил 25%, что говорит о необходимости подбора других условий для данного превращения.

Защищенные мономеры 2а,b и 4 выделяли с помощью колоночной хроматографии и характеризовали с помощью 'Н-ЯМР-спекгроскопии. В 'Н-ЯМР-спектрах полученных соединений наблюдали как сигналы протонов псевдопептидного фрагмента ПНК, так и сигналы, характерные для соответствующих гетероциклических оснований.

Обращение значений удельных углов оптического вращения для защищенных мономеров ОЗГТНК 2а,Ь, построенных на основе L- и D-глутаминовой кислоты ([ct]D = -13.9° для L-изомера и [a]D = +13.9° для D-изомера) указывает на то, что осуществленный нами 8-стадийный синтез является однозначным с точки зрения

энантиомсрной чистоты. Во-первых, рацемизация, если и имеет место, то ее значение одно и тоже для кавдой стадии превращения. Во-вторых, степень рацемизации незначительна (~ 2-10%), поскольку, если бы она была существенной, не наблюдалось бы совпадения значений удельных углов оптического вращения.

Непременным условием для практического использования предложенных мономеров в синтезе ПНК является удаление С-концевой защитной группы (Схема 7). Следует отметить, что специфика используемых защитных групп накладывает ограничения на выбор метода деблокирования. Так на заключительном этапе синтеза мономеров ПНК 28, 29, содержащих в своей основе глицин и Ь-аланин соответственно, гидролиз соответствующих метиловых эфиров в соединениях 26 и 27 проводили водно-метанольным раствором гидроксида натрия. Выход для обоих конечных соединений был количественным.

В случае же получения мономеров отрицательно-заряженных ПНК данный способ деблокирования не подходит из-за наличия дополнительной сложноэфирной группы в боковом радикале остатка глутаминовой кислоты. Поэтому для удаления аллильной группировки а-карбоксильной группы мономеров ОЗПНК 2а,Ь и 4 нами был использован метод, впервые нашедший свое применение в химии гликопептидов (5. Рпе^кИ-ВосИпШскек е/ я/, 1989). Данный метод позволяет селективно отщепить аллильную группу в довольно мягких условия с помощью палладаевого катализатора - тегракис(трифенилфосфин)палладий(0) [Р<3(РРЬз)4]°. Реакцию проводили в тетрагидрофуране при комнатной температуре в атмосфере инертного газа (Схема 7). Деблокированные мономеры 1а,Ь и 3 выделяли кристаллизацией из смеси этилацетат-гексан с последующей очисткой этих соединений с помощью колоночной хроматографии, при этом выход соединений 1а,Ь и 3 составил 72,74 и 53% соответственно.

Структуру полученных мономеров 1а,Ь и 3 подтверждали данными 'Н-ЯМР-спектроскопии, которые показали отсутствие в 'Н-ЯМР-спектре сигналов протонов, соответствующих аллильной группе, и сдвиг сигнала соответствующего протона а-СН группы в сторону более слабого поля.

Значения химических сдвигов для мономеров ОЗПНК 1а,Ь и 3, а также для мономеров ПНК 28, 29 полученных на основе глицина и Ь-аланина соответственно, представлены в таблице 2.

Таблица 2 .Данные 'Н-ЯМР-спектроскопии для мономеров 1, 3, 28, 29.

№ 'Вч Вос№ З-ПЩ-ТЬу С6н, 6-Н-ТЬу сн,1ч- о-СН -ШСНг -СЗДЧ у-сн2 Р-сн2 5-СН3 -сн2

СГЬу) -ТЬу -РЬ

1 1.35 7 12 11.25 7.35 7.25 4.45 4.27 3.20 3.51 2.45 2.30 1.75 5.12

8 8 т 8 8 т т т т т 8 в

9Н 1Н 1Н 5Н 1Н 2Н 1Н ЗН 1Н 2Н 1Н ЗН 2Н

1.85

т

1Н

28 1.32 7.10 11.22 - 7.22 3.02 4.40 2.23 3.02 - - 1.64 -

в 5 в ¡> 8 Ч 1 8

9Н 1Н 1Н 1Н 2Н 2Н 2Н 2Н ЗН

5 6.25 .16.33 /6.25

29 1.39 6.89 11 23 - 7.35 4 62 4 34 2 97 3 18 - 1.71 1 74 -

в 8 8 8 в т ш т а в

9Н 1Н 1Н 1Н 2Н 1Н 1Н ЗН ЗН ЗН

-СН3

(А1а)

3 1.42 5.47 8.32 7.36 8.77 4.59 4.04 3.25 3.46 2.51 2.39 - 5.11

в в 8 т 8 в т т т т т т

9Н 1Н 1Н ЮН 1Н 2Н 1Н ЗН ЗН 2Н 2Н 4Н

(2Н-А(1е) (8Н-Аае) СН^

(А<1е)

Таким образом, были получены целевые мономеры отрицательно-заряженных ПИК 1а,Ь и 3, на основе которых возможна дальнейшая олигомеризация, используя Вос-протокол твердофазного синтеза или классический синтез в растворе.

2. Синтез тримерной последовательности ОЗПНК.

Дальнейшей целью наших исследований являлось проведение тест-синтеза тримерной последовательности ОЗПНК, исходя из мономера, построенного на основе Ь-глутаминовой кислоты и тимина.

Синтез тримера ОЗПНК осуществляли двумя способами - твердофазным синтезом с использованием модифицированной полистирольной смолы и классическим синтезом в растворе Основной задачей на данном этапе работы, было выявление возможных трудностей, которые в дальнейшем станут предметом подробных исследований в нашей лаборатории при создании общего протокола синтеза ОЗПНК.

2.1. Твердофазный тест-синтез тримера ОЗПНК.

В настоящее время олигомеры ПНК, также как пептиды и олигонуклеотиды в подавляющем большинстве случаев получают на твердом полимерном носителе. Принцип, основанный на закреплении растущей олигомерной цепи на твердой подложке, позволяет во многом упростить синтез и значительно сократить его время.

В данной работе был проведен твердофазный тест-синтез трехзвенной последовательности ПНК с использованием тиминсодержащего мономера ОЗПНК на основе Ь-глутаминовой кислоты. Общая стратегия синтеза ОЗПНК на твердой фазе представлена на схеме 8. Синтез осуществляли по модифицированному Вос-протоколу, описанному ранее для синтеза «классических» ПНК (I СИ^етеп et а!, 1995) с использованием полимерного носителя МВНА с якорными (4-метилбегагидрил)аминогруппами (содержание ЫН2-групп - 0.6 ммоль/г смолы). Контроль на стадиях протекания реакции образования амидной связи и отщепления Вос-защитных групп в процессе синтеза проводили, используя количественный нингидриновый тест Кайзера.

Из литературных источников известно, что наибольшей эффективности твердофазного синтеза ПНК можно достичь при нагрузке полимерного носителя -0.1-0.2 ммоль/г смолы. Исходя из этих соображений, иммобилизацию на смоле первого мономера ОЗПНК осуществляли при 2-х кратном недостатке последнего. Непрореагировавшие аминогруппы на полимере котировали смесью Ас2ОЛЗМР (1:1) в течение 1 ч. В итоге количество иммобилизованного на смоле мономера составило 0.15 ммоль/г (по данным теста Кайзера).

В качестве конденсирующего агента для проведения твердофазного тест-синтеза был использован гексафторфосфат 0-(бензотриазол-1-ил)-М,НЫ',Ы'-тетраметилурония (НВШ). Данный реагент довольно часто применяется для твердофазного синтеза как пептидов, так и «классических» незаряженных ПНК. Реакцию конденсации между первым Вос-защищенным мономером ОЗПНК и полимерной матрицей, а также в ходе дальнейшего наращивания олигомерной цепи, проводили в безводном БМР, используя в качестве третичного основания 01ЕА. Для того, чтобы добиться максимально возможного выхода реакции были использованы

3-х кратные избытки мономера и конденсирующего агента. В результате реакция протекала за 15-20 мин практически с количественным выходом (по результатам нингидринового теста Кайзера). Избытки мономера и конденсирующего агента удаляли тщательной промывкой полимерного носителя БШ7.

Схема 8.

Вос-группу удаляли действием смеси трифторуксусной кислоты и л/-крезола (95-5) в течение 20 мин. Следует отметить, что при удалении Вос-защиты с первого иммобилизованного мономера ОЗПНК, время деблокирования пришлось увеличить в два раза из-за неполного протекания реакции

В ходе синтеза было установлено, что уже на стадии присоединения 2-го мономера ОЗПНК в вышеуказанных условиях, содержание свободных аминогрупп (растущих олигомерных цепей) сокращалось на 10-15%, что значительно сказывалось на выходе целевого продукта. Это явление может быть объяснено рядом причин, например, обрывом растущих олигомерных цепей от полимерного носителя, протеканием побочных реакций, приводящих к блокированию цепи и др. Одним из наиболее вероятных побочных процессов в ходе твердофазного синтеза ПНК является реакция Ы-ацильного переноса, которая приводит к блокированию первичных концевых аминогрупп и по всей видимости открывает возможность протекания внутримолекулярной циклизации после удаления ВгЬзащиты (Схема 9).

PNA - С-концевой фрагмент олигомера ОЗПНК

Этот процесс имеет место в основных условиях, когда аминогруппа не протонирована. Эффективным способом решения этой проблемы является применение стратегии одновременного депротонирования концевой аминогруппы ПНК и конденсации (методология нейтрализации in situ).

Для того, чтобы исключить возможность протекания вышеуказанного побочного процесса, все дальнейшие конденсации проводили без предварительной нейтрализации, добавляя третичный амин непосредственно в реакционную смесь для конденсации. Однако такой подход незначительно повысил эффективность синтеза и, на наш взпшд, проблема количественного сокращения терминальных аминогрупп требует отдельного исследования.

Схема 9.

COOBzl

сосва

Другой немаловажной проблемой в синтезе ПНК является выбор оптимального метода деблокирования целевых олигомерных последовательностей, а также метод отщепления последних от твердой фазы. В современной пептидной химии существует множество таких методов, однако специфика применяемых в нашем случае защитных групп, а также полимерного носителя (МВНА-смолы) требует использования довольно сильных кислот. Так, процесс деблокирования-отщепления синтезированного нами тримера ОЗПНК проводили, действуя на ПНК-полимер смесью концентрированной трифторуксусной и трифторметансульфокислоты (ТРМ8А). Обработку проводили в два этапа - в начале использовали смесь с низким содержанием ТТМЗА, после чего концентрацию последней увеличивали.

Анализ продуктов олигомеризации осуществляли с помощью обращенно-фазовой ТСХ, а также методом хромато-масс спектрометрии (Рис. 2).

тУ 8

4 | т/г: 1014.4

ф о

со

во 1 т/г: 875.4

/

/

/

см

50 , ' ;!/

! т/г: 785.3 «

40 ■] ®

I I'

30 1 о1 .

1 "<

I - — ___- — I — '___^______^ —___________ГГШ1

0 12 3 4

Рис. 2. Результаты хромато-масс-спектрометрии реакционной смеси после твердофазного синтеза тримерной последовательности ОЗПНК

На основании полученных данных можно сделать вывод, что целевой продукт твердофазного тест-синтеза в реакционной смеси отсутствовал. На это указывает отсутствие сигнала молекулярного иона ([М*] 1032.0) отвечающего конечному продукту и наличие сигнала ([М^НгО] 1014.4). Хроматографические пики со временами удерживания 2.468 и 3.016 мин, по нашему мнению, соответствуют димерным продуктам олигомеризации с одной ([М*] 785.3), и двумя ([М4] 875.7) неудаленными бензильными группами соответственно.

По всей видимости, причинами такого неудовлетворительного результата

синтеза являются плохой выход на стадии конденсации с третьим мономером

19

ОЗПНК, а также неправильно подобранные условия отщепления олигомерной последовательности от полимерного носителя и удаления защитных групп. Таким образом, данный метод синтеза может быть использован для получения олигомеров ОЗПНК, однако требует дополнительной оптимизации.

2.2. Синтез тримера ОЗПНК в растворе.

В настоящей работе также был осуществлен синтез тримерной последовательности ОЗПНК классическим способом в растворе. Наращивание олигомерной цепочки начинали с С-конца, присоединяя последующие мономеры в условиях сходных к таковым для твердофазного синтеза (Схема 10).

На начальном этапе синтеза карбоксильную группу первого мономерного звена трансформировали в соответствующий амид 30. Для этой цели проводили реакцию мономера ОЗПНК 1а с хлористым аммонием, используя в качестве конденсирующего агента гексафторфосфат (бензотриазол-1-

илокси)трис(пирролидино)фосфония (РуВОР). В качестве третичного основания, способствующего увеличению нуклеофильности аминокомпонешы, был выбран БША. Выход целевого амида 30 после хроматографии на силикагеле составил 71%.

Последующее удаление Вос-защитной группы в соединении 30 осуществляли действием 50% раствора ТТА в хлористом метилене. Полученный с количественным выходом трифторацетат 31 сразу же вводили в реакцию конденсации со следующим мономером. Для активации карбоксикомпоненты использовали процедуру, применяемую нами ранее в твердофазном синтезе тримера ОЗПНК. Однако, несмотря на использование 3-х ратного избытка мономера 1а, добиться полной конверсии соединения 31 в применяемых условиях нам не удалось. Выход защищенного димера ОЗПНК 32 после колоночной хроматографии составил 76%.

Удаление Вос-защиты в соединении 32 и последующая конденсация с третьим мономером в аналогичных условиях приводила к защищенному тримеру ОЗПНК 34, выход которого после очистки колоночной хроматографией составил 82%. Структура данного соединения, а также всех промежуточных соединений была подтверждена данными 'Н-ЯМР-спектроскопии. При этом в 'Н-ЯМР-спектрах полученных соединений наблюдали требуемое соотношение для протонов

соответствующих групп в мономерньтх частях (7.35 м.д., (ЗН) для бН-ТЪу, 1.73 м д, (9Н) для 5-СНз-ТЬу и 5.20 м.д., (611) для СТ^РИ) и одной Ы-концевой Вос-группы (1.38 м.д., (9Н)).

Схема 10.

Т

.0

ВосНЫ"

ОН

МН4С1

1а

(СЩг СООВг!

РуВОРЯМЕА ВосШ

.К

ТРА

нн2 СН2С12

30

(СН2)2 СООВг!

Н3Ы

ын2

1а

С¥гСОСР (СН2)2 НВТШМЕЛ

31 I

СООВг!

ВосШ"

Ш2

(СНг)г (СНгЪ

I 32 I

СООВг! СООВг!

ТТА

0 о

СН2С12

Н3И ^ СРзСОСР

ын^'

N42

|СНг)2 (СН^

СООВг! 33 СООВг!

1а

НВТи/ШЕА

ВосНИ'

Ш (СН2)г СООВг!

1.ТРА/СН2С12 Щг 2. Н2, РИС

(СИЛ

|снгЪ |с

СООВг! 34 СООВг!

Н3Ы СР3СООе

NH

(СН2)2 СООН

V0 о

I 1

Ш ^ ^ N42 (СН2)г (СН2)г

СООН 35 СООН

Деблокирование защищенного тримера ОЗПНК 34 осуществляли в два этапа. Сначала удаляли Вос-концевую защитную группу действием ТГА в хлористом метилене, после чего проводили гидрогенолиз бензильных группировок, используя в качестве катализатора 10% Рё на угле. Полностью деблокированный тример ОЗПНК 35 кристаллизовали, добавляя безводный эфир, после чего анализировали с помощью обращенно-фазовой ТСХ, а также методом хромато-масс спектрометрии (Рис. 3).

тУЦ 33

321 31 ч 30 29 28 4 27 4 26

т/г: 1031.3

т/г: 1044.3

«в

<о /

г»-

IV о>

\

л, /V

' 1 1 2

т/г: 1058.3

—,—,—,—,—,--1—I—

3 4 пип

Рис. 3. Результаты хромато-масс-спектрометрии реакционной смеси после синтеза тримерной последовательности ОЗПНК в растворе.

Масс-спектр для соединения со временем выхода 0.594 мин. содержал молекулярный ион ([М*] 1031.3), соответствующий рассчитанному значению.

Таким образом, была продемонстрирована возможность синтеза олигомерной последовательности, исходя из тиминсодержащего мономера ОЗПНК, построенного на основе Ь-глутаминовой кислоты, как классическим способом в растворе, так и с помощью твердофазного синтеза в ручном варианте.

Выводы.

1. Разработан препаративный метод синтеза мономеров отрицательно-заряженных пептидно-нуклеиновых кислот на основе глутаминовой кислоты.

2. На основании значений удельных углов оптического вращения для мономеров ОЗПНК, синтезированных исходя из Ь-и В-глутаминовой кислоты, сделан вывод о стереоспецифичности предлагаемого метода синтеза.

3. Впервые осуществлен синтез аденинсодержащего мономера отрицательно-заряженных ПНК.

4. Проведен тест-синтез тримера ПНК, содержащего тимин и отрицательный заряд в каждом мономерном звене в твердофазном и ручном варианте.

5 Оптимизирована процедура получения псевдопептидных фрагментов с восстановленной пептидной связью, при этом показано преимущество реакции Мицунобу по сравнению с классическим методом образования псевдопептидной связи - реакции N-восстановительного алкилирования.

Основные результаты днссертацни изложены в следующих публикациях:

1. Прохоров Д. И.. Кириллова Ю. Г., Боярская Н. П., Тевяшова А. Н., Есипова О. В., Звонкова Е. Н., Швец В. И. Синтез тиминсодержащего мономера отрицательно-заряженных ПНК // Химико-фармацевтический журнал. 2005, Т. 39, №6, С. 39-43.

2. Boyarskaya N. P., Prokhorov D. I.. Kirillova Y. G, Zvonkova E. N.. Shvets V. I. // Synthesis of protected pseudopeptides from dicarboxylic aminoacids by Mitsunobu condensation. // Tetrahedron Letters. 2005, V. 46, N. 43, P. 7359-7362.

3. Прохоров Д. И., Кириллова Ю. Г., Боярская Н. П., Швец В. И. Синтез тиминсодержащих мономеров отрицательно-заряженных ПНК на основе глутаминовой кислоты. // III Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития)/ Москва, 2003. С. 111-112.

4. Боярская Н. П., Прохоров Д. И.. Баранов А. В. Разработка универсального подхода к синтезу мономеров отрицательно-заряженных пептидно-нуклеиновых кислот. // TV Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» Москва, 2005. С. 142.

5. Кириллова Ю. Г., Боярская Н. П., Прохоров Д. И.. Швец В. И. Универсальный технологический подход к синтезу тиминсодержащих мономеров отрицательно-заряженных ПНК на основе производных дикарбоновых кислот.// X Международная научно-техническая конференция «Наукоемкие химические технологии» Волгоград, 2004. С 263-265.

6 Прохоров Д. И, Кириллова Ю Г. Особенности синтеза отрицательно-заряженных пептидно-нуклеиновых кислот (03ITHK) на твердой фазе. // Первая

научно-техническая конференция молодых ученых МИТХТ им. М. В. Ломоносова «Наукоемкие химические технологии» Москва, 2005. С. 40-41. 7. Боярская Н. П., Прохоров Д. И.. Кириллова Ю. Г. Мономеры ПНК на основе дикарбоновых аминокислот и глицина. // III Съезд общества биотехнологов в России им. Ю. А. Овчинникова. Москва, 25-27 октября 2005 г., С. 11-12.

Принято к исполнению 24/11/2005 Исполнено 24/11 /2005

Заказ № 1353 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш., 36 (095) 975-78-56 (095) 747-64-70 www.autoreferat.tu

№247 51

РПБ Русский фонд

2006-4 27615

ВВЕДЕНИЕ.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Синтез мономеров «классических» пептидно-нуклеиновых кислот.

1.1.1. Синтез аминоэтилглицинового остова.

1.1.2. Синтез карбоксиметильных производных гетероциклических оснований.

1.1.3. Способы создания амидной связи в ходе синтеза мономеров ПНК.

1.2. Олигомеризация мономеров «классических» мономеров ПНК.

1.2.2. Синтез ПНК-олигомеров с использование Fmoc-стратегии.

1.2.3. Синтез ПНК-олигомеров с использованием Mmt-acyl-стратегии.

1.3. Модификации «классических» ПНК.

1.3.1. Модификации, основанные на увеличении количества СНг-звеньев в структуре «классических» мономеров ПНК.

1.3.2. «Обращенные» ПНК.

1.3.3. Хиральные ПНК.

1.3.4. Другие модификации ПНК.

1.4. Свойства пептидно-нуклеиновых кислот.

1.4.1. Гибридизационные свойства.

1.5. Применение ПНК.'.

1.6. Доставка ПНК в клетки.

1.6.1. Использование катионных липосом.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

2.1. Синтез мономеров отрицательно-заряженных ПНК.

2.1.1. Синтез карбоксиметилированных производных гетероциклических оснований.

2.1.2. Синтез псевдопептидного фрагмента с восстановленной пептидной связью.

2.1.3. Конденсация псевдопептидных фрагментов с карбоксиметилированными гетероциклическими основаниями и последующее удаление защитных групп.

2.2. Синтез тримерной последовательности ОЗПНК.

2.2.1. Твердофазный синтез тримера ОЗПНК.

2.2.2. Синтез тримера ОЗПНК в растворе.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ВЫВОДЫ.

В настоящее время синтетические аналоги ДНК привлекают к себе повышенное внимание благодаря своим уникальным свойствам. Они способны к связыванию с молекулами ДНК и РНК, тем самым влияют на процесс экспрессии генов. Этот принцип получил название антисенс- и антиген-ингибирования биосинтеза белка [1,2, 3].

Однако для того, чтобы антисенс- и антигентехнологии нашли свое применение на практике, соответствующие олигонуклеотиды должны обладать некоторыми важными свойствами:

- устойчивостью при физиологических условиях;

- способностью проникать через клеточные мембраны;

- высокой специфичностью связывания с молекулами нуклеиновых кислот;

Поскольку фрагменты природных НК или же синтетические олигонуклеотиды быстро разрушаются нуклеазами [1], существует значительный интерес к синтетическим аналогам олигонуклеотидов и их миметикам, которые достаточно устойчивы при условиях in vivo [4]. Среди последних наиболее интересными соединениями являются пептидно-нуклеиновые кислоты, структура которых впервые была предложена П. Нильсеном с сотр. [5].

Пептидно-нуклеиновые кислоты (ПНК, II) - это аналоги ДНК, в которых нуклеиновые основания присоединены через карбоксметильный линкер к нейтральному, ахиральному остову, состоящему из ]М-(2-аминоэтил)глицшювых звеньев (Рис. 1). и (ПНК)-» R = н

III (ОЗПНК)-*- R = (СН2)2СООН

I (ДНК) В = Thy, Cyt, Ade, Gua

Рисунок 1. Структура ДНК I, «классических:» II и отрицательно-заряженных ПНК III на основе глутаминовой кислоты.

Проведенные исследования показали, что ПНК обладают способностью распознавать комплиментарную последовательность нуклеотидов в цепи ДНК или мРНК и прочно связываться с ней [6, 7, 8, 9], они не разрушаются нуклеазами и их относительно легко синтезировать на основе стандартных методик твердофазного пептидного синтеза.

Начиная с 1991 г, интерес к ПНК непрерывно возрастает в первую очередь благодаря их уникальным гибридизационным свойствам. Они нашли широкое применение в биохимических, генно-инженерных, а также медицинских исследованиях [10, 11, 12, 13, 14]. ПНК могут использоваться как терапевтические агенты нового поколения, позволяющие избирательно воздействовать на внутриклеточные процессы. Олигомеры ПНК являются потенциальными ингибиторами клеточного роста. Особенно перспективным направлением использования ПНК является создание эффективных методов диагностики и детекции генетических мутаций.

Однако следует заметить, что структура «классических» ПНК с N-(2-аминоэтил)глициновым остовом II (Рис. 1) не всегда удовлетворяет всем требованиям, которые ставятся перед современными ДНК-миметиками.

Так, например, не всегда удается достичь эффективного прохождения этих ПНК через клеточные мембраны. Кроме того, ПНК, предложенные П. Нильсеном, недостаточно хорошо растворимы в воде, что также ограничивает их использование in vivo. В этой связи во многих научно-исследовательских лабораториях создаются новые ПНК с усовершенствованной структурой, призванной улучшить способности ПНК к специфическому связыванию с комплементарными нуклеиновыми кислотами [15, 16].

Так, например, для построения цепи ПНК было предложено использование хиральных аминокислот, что также обеспечивало введение определенных функциональных групп в структуру ПНК-олигомера. Такая модификация привела к значительному улучшению растворимости и проницаемости через клеточные мембраны [17].

На наш взгляд несомненный интерес представляет структурная модификация ПНК, в каждом мономере которой содержится отрицательный заряд, представленный карбоксильной группой III (Рис. 1). По нашему мнению отрицательный заряд в структуре олигомеров ПНК будет способствовать увеличению их растворимости в воде и уменьшению самоагрегации последних за счет сил электростатического отталкивания. С другой стороны, введение заряда предоставит возможность влиять на стабильность дуплексов ПНК с природными НК, например, за счет изменения ионной силы раствора.

К настоящему времени известен ряд синтетических стратегий для получения мономеров и олигомеров ПНК различного строения, в том числе и несущих гидрофильные остатки [18]. Однако следует отметить, что описанные процедуры синтеза не являются удовлетворительными для получения ПНК, содержащих в своем составе отрицательный заряд.

Таким образом, в настоящей работе основные усилия были направлены на разработку препаративного метода синтеза мономеров отрицательно-заряженных ПНК, а также проверку возможности олигомеризации таких мономеров стандартными методами пептидной химии.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Первые упоминания о химерных молекулах, сочетающих в себе свойства и структурные особенности пептида и нуклеиновой кислоты, а именно аминокислотах с гетероциклическими основаниями в боковом радикале относятся к середине 70-х годов. Затем неоднократно предпринимались попытки создания полиамидных миметиков нуклеиновых кислот, имеющих регулярную структуру и способных к комплиментарному взаимодействию.

За последние 15 лет было описано более десятка полиамидных ДНК-миметиков самого различного строения. Из всех описанных структур уникальные гибридизационные свойства проявили пептидно-нуклеиновые кислоты (ПНК), созданные группой датских ученых под руководством Нильсена 1991 г (Рис. 1) [5].

Пептидно-нуклеиновые кислоты являются аналогами нуклеиновых кислот (НК) в которых сахаро-фосфатный остов заменен на псевдопептидную последовательность. Мономерные звенья классических ПНК содержат в своем составе N-(2-аминоэтил)глициновый (Aeg) фрагмент и гетероциклическое (пиримидиновое или пуриновое) основание, соединенные между собой ацетильным спейсером. Образование полимерной цепи ПНК из отдельных мономерных остатков осуществляется с помощью амидных связей. Таким образом, основными синтетическими задачами при получении мономеров и олигомеров ПНК являются: а) образование N-алкильной связи в ходе синтеза псевдопептидного фрагмента и при получении карбоксиметилированных гетероциклических оснований; б) выбор метода конденсации гетероциклического основания с псевдопептидным остовом (образование N-ацильной связи); г) образование N-ацильной связи при олигомеризации мономеров ПНК.

Как в зарубежной, так и в отечественной литературе уже был продемонстрирован опыт систематизации по синтезу и свойствам ПНК [19, 20,21,22,23].

Следует отметить, что практически все ПНК мономеры содержат в своем составе N-алкильные и N-ацильные связи, поэтому мы считаем необходимым, провести систематизацию основных методов синтеза и продемонстрировать весь арсенал возможностей для получения ПНК самого различного строения. Кроме того, протокол для синтеза ПНК олигомеров (Вое- или Fmoc-) как правило, вносит определенные ограничения в выборе того или иного метода конденсации и определяет набор используемых защитных групп и способ удаления с полимерного носителя.

выводы

1. Разработан препаративный метод синтеза мономеров отрицательно-заряженных пептидно-нуклеиновых кислот на основе глутаминовой кислоты.

2. На основании значений удельных углов оптического вращения для мономеров ОЗПНК, синтезированных исходя из L-и D-глутаминовой кислоты, сделан вывод о стереоспецифичности предлагаемого метода синтеза.

3. Впервые осуществлен синтез аденинсо держащего мономера отрицательно-заряженных ПНК.

4. Проведен тест-синтез тримера ПНК, содержащего тимин и отрицательный заряд в каждом мономерном звене в твердофазном и классическом варианте.

5. Осуществлен классический синтез в растворе тримерной последовательности отрицательно-заряженных ПНК.

6. Оптимизирована процедура получения псевдопептидных фрагментов с восстановленной пептидной связью, при этом показано преимущество реакции Мицунобу по сравнению с классическим методом образования псевдопептидной связи - реакции N-восстановительного алкилирования.

1. Milligan J. F., Matteucci M. D., Martin J. C. Current concepts in antisense drug design // J. of Med. Chem., 1993, v. 36, n. 14, p. 1923-1937.

2. Nielsen P. E., Egholm M., Berg R. H., Buchardt O. Peptide nucleic acids (PNA). Potential antisense and antigene agents // Anti-Cancer Drug Design, 1993, v. 8, p. 53-63.

3. Mesmaeker A. D., Altmann К. H., Waldner A., Wendeborn S. Backbone modifications in oligonucleotides and peptide nucleic acid systems // J. of Struct. Biol., 1995, v. 5, p. 343-355.

4. Nielsen, P.E., Egholm, M., Berg, R.H., Buchardt, O. Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide// Science. 1991. v. 254, p. 1497-1500.

5. James W. Towards gene-inhibition therapy: a review of progress and prospects in the field of antiviral antisense nucleic acids and ribozymes // Antiviral Chem. And Chemotherapy, 1991, v. 2, n. 4, p. 2796-2823.

6. Giesen U., Kleider W., Berding C., 0rum H., Nielsen P. E. A formula for thermal stability (Tm) prediction of PNA/DNA duplexes // Nucleic Acids Res., 1998, v. 26, p. 16011620.

7. Ratilainen Т., Holmen A., Tuite E., Haaima G., Christensen L., Nielsen P. E., Norden B. Hybridization of peptide nucleic acid //Biochemistry, 1998, v. 37, 12331-12342.

8. Geiger A., Laster A., Kleiber J., Orum H. PNA array technology in molecular diagnostics//Nucleosides&Nucleotides, 1998, v. 17, n. 9-11, p. 1717-1724.

9. Demers D. В., Curry E. Т., Egholm M., Sozer A. C. Enhanced PCR amplification of VNTR locus D1S80 using peptide nucleic acid (PNA) // Nucleic Acids Res., 1995, v. 23, p. 3050-3055.

10. Perry-O'Keeffe H., Yao X.-W., Coull J. M., Egholm M. Peptide nucleic acid pre-gel hybridization: an alternative to Southern hybridization // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, v. 93, p. 14670-14675.

11. Demidov V., Frank-Kamenetskii M. D., Egholm M., Buchardt O., Nielsen P. E. Sequence specific double strand DNA cleavage by peptide nucleic acid (PNA) targeting using nuclease SI //Nucleic Acids Res., 1993, v. 21, p. 2103-2107.

12. Koppelhus U., Zachar V., Nielsen P. E., Liu X., Eugen-Olsen J., Ebbesen P. Efficient in vitro inhibition of HIV-1 gag reverse transcription by peptide nucleic acid (PNA) at minimal ratios of PNA/RNA //Nucl. Acids Res., 1997, v. 25, n. 11, p. 2167-2173.

13. Lee R., Kaushik N., Modak M. J., Vinayak R., Pandey V. N. Polyamide nucleic acid targeted to the primer binding site of the HIV-1 RNA genome blocks in vitro HIV-1 reverse transcription// Biochemistry, 1998, v. 37, p. 900-910.

14. Good L., Nielsen P. E. Inhibition of translation and bacterial growth by peptide nucleic acid targeted to ribosomal RNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, v. 95, p. 2073-2076.

15. Sforza S., Corradini R., Ghirardi S., Dossena A. DNA Binding of D-Lysine-Based Chiral PNA: Direction Control and Mismatch Recognition // Eur. J. Org. Chem., 2000, p. 29052913.

16. Uhlmann E., Peyman A., Breipohl G., Will D. W. PNA: Synthetic polyamide nucleic acids with unusual binding properties. // Angew. Chem. Int. Ed. 1998. v. 37, p. 2796-2823.

17. Hyrup В., Nielsen P. E. Peptide nucleic acids (PNA): synthesis, properties and potential applications // Bioorg. Med. Chem. Lett., 1996, v. 4, n. 1, p. 5-23.

18. Norden В., Ray A. Peptide nucleic acid (PNA): its medical and biotechnical application and promise for the future. // FASEB J. 2000. v. 14, p. 1041-1060.

19. Gambari R. Peptide-nucleic acids (PNAs): a tool for the development of gene expression modifiers. // Curr. Pharm. Des. 2001. v. 7, p. 1839-1862.

20. Анципович С.И. Пептидо-нуклеиновые кислоты: структура, свойства, применение, стратегии и практика химического синтеза. // Успехи химии. 2002. т. 71, № I, с. 81-95.

21. Ferrer E., Eisenhut M., Eritia R. A convenient route for the preparation nucleic acid monomers carrying acid-labile groups for the protection of the amino function. // LUWER/ESCOM. Letters in peptide science. 1999. V. 6. P. 209-219.

22. Thomson S. A., Josey J. A., Cadilla R., Gaul M. D., Hassman C. F., Luzzio M. J., Pipe A. J. Reed K. L., Ricca D. J., Wiethe R. W., Noble S. A. Fmoc mediated synthesis of peptide nucleic acids. // Tetrahedron 1995, V. 51, P. 6179-6194.

23. Stetsenko D. A., Lubyako E. N., Potapov V. K., Azhikina T. L., Sverdlov E. D. New approach to solid phase synthesis of polyamide nucleic acids analogues (PNA) and PNA-DNA conjugates. // Tetrahedron Lett., 1996, v. 37, p. 3571-3574.

24. Breipohl G., Knolle J., Langner D., O'Malley G., Uhlmann E. The synthesis of polyamide nucleic acids (PNAs) using a novel Fmoc/Mmt protecting-group combination. // Bioorg. Med. Chem. Lett., 1996, v. 6, p. 665-670.

25. Will D.W., Breipohl G., Langner D., Knolle J., Uhlmann E. The synthesis of polyamide nucleic acids using a novel monomethoxytrityl protecting-group strategy. // Tetrahedron 1995, v. 51, p. 12069-12082.

26. Dueholm K. L., Egholm M., Buchardt O. An efficient synthesis of Boc-aminoacetaldehyde and its application to the synthesis of N-(2-Boc-aminoethyl)glycine esters. // Org. Prep. Proced. Int., 1993, v. 25, n. 4, p. 457-461.

27. Finn P. J., Gibson N. J., Fallon R., Hamilton A., Brown T. Synthesis and properties of DNA-PNA chimeric oligomers // Nucleic Acids Res., 1996, v. 24, n. 17, p. 3357 3363.

28. Falkiewicz В., Kolodziejczyk A. S., Liberek В., К. Wisniewski. Synthesis of achiral and chiral nucleic acid (PNA) monomers using Mitsunobu reaction. // Tetrahedron, 2001, v.57, p.7909-7917.

29. Kosynkina L., Wang W., Chyan Liang T. A convenient synthesis of peptide nucleic acid (PNA) monomers. //Tetrahedron Lett. 1994, v. 35, n. 29, p. 5173 -5176.

30. Breipohl G., Will D.W., Langner D., Knolle J., Uhlmann E. Innovation and perspectives in solid phase synthesis (Ed.: Epton R.), Mayflower, Birmingham, UK, 1996, S. 6164.

31. Watkins В. E., Kiely J. S., Rapoport H. // Synthesis of oligodeoxyribonucleotides using N-benzyloxycarbonyl -blocked nuclesides // J. Am. Chem. Soc., 1982, v. 104, p. 5702.

32. Konig W., Geiger R. // Chem. Ber. 1970,103, 788-790.

33. Coste J., Le-Nguyen D., Castro B. PyBOP®: a new peptide coupling reagent devoid of toxic by-product. // Tetrahedron Lett., 1990, v. 31, n. 2, p. 205-208.

34. Egholm M., Buchardt О., Nielsen P. E., Berg R. H. Peptide nucleic acids (PNA). Oligonucleotide analogues with an achiral peptide backbone. // J. Am. Chem. Soc., 1992, v. 114, p. 1895-1897.

35. Гершкович А. А., Киберев В. К. Химический синтез пептидов. // Киев: Наукова Думка, 1992.-360.

36. Egholm М., Buchardt О., Nielsen P. Е., Berg R. H.Recognition of guanine and adenine in DNA by cytosine and thymine containing peptide nucleic acids (PNA). // J. Am. Chem. Soc., 1992, v. 114, p. 9677-9678.

37. Christensen L., Fitzpatric R., Gildea В., Petersen К. H., Hansen H. K., Koch Т., Egholm M., Buchardt O., Nielsen P. E., Coull J., Berg R. H. Solid-phase synthesis of peptide nucleic acids //J. Peptide Science, 1995, v. 3, p. 175-183.

38. Koch Т., Hansen H. K., Andersen P., Larsen Т., Batz H. G., Otteson K., Orum H. Improvement in automated PNA synthesis using Boc/Z monomers. // J. Peptide Res., 1997, v. 49, p. 80-88.

39. Scarfi S., Giovine M., Gasparini A., Damonte G., Millo E., Pozzolini M., Benatti U. Modified peptide nucleic acids are internalized in mouse macrophages RAW 264.7 and inhibit inducible nitricoxide synthase. // FEBS Lett., 1999. v. 451, p. 264-268.

40. Tyler-McMahon В. M. Et al. Altering behavioral responses and dopamine transporter protein with antisense peptide nucleic acids. // Biochem. Pharmacol., 2001, v. 62. p. 929-932.

41. Aldrian-Herrada G., Rabie A., Wintersteiger R., Blugidou J. Solid-phase synthesis of peptide nucleic acid (PNA). Monomers and their oligomerization using disulphide anchoring linker. // J. Peptide Science, 1998, v. 4, p. 266-281.

42. Nielsen P. E., Egholm M. In Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications. Synthesis of PNA Oligomers by Boc Chemistry (Eds Nielsen P. E., Egholm M.). Horizon Scientific Press, Wymondham, 1999, p. 34-86.

43. Cantin M., Schutz R., Leumann J. Synthesis of the monomeric building blocks of Z-olefinic (Z-OPA) containing the bases adenine and thymine // Tetrahedron Lett., 1997., v. 38, n. 24, p. 4211-4214

44. Nielsen P. E., Egholm M. In Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications. Synthesis of PNA Oligomers by Fmoc Chemistry (Eds Nielsen P. E., Egholm M.). Horizon Scientific Press, Wymondham, 1999, p. 86-112.

45. Timar Z., Kovacs L., Kovacs G., Schmel Z. Fmoc/acyl protecting groups in the synthesis of polyamide peptide nucleic acid monomers. // J. Chem. Soc. Perkin Trans.I, 2000, v. l,p. 19-26.

46. Sonveaux E. In Protocols for Oligonucleotides Conjugates, Methods in Molecular Biology, v. 26, (Ed. S. Agrawal), Humana Press, Totowa, 1994, p. 1-12.

47. Atherton E. In Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. (Practical Approach Series). (Eds Atherton E., Sheppard R. C.). Oxford University Press, Oxford, 1989. p. 117.

48. Rietman В. H., Peters R. F., Tesser G. I. On the stability of S-(alkylsulfanyl)cysteine derivatives during solid-phase synthesis. // Recl.Trav.Chim.Pays-Bas, 1995, v. 114, n. 1, p. 1-5.

49. Nielsen P. E., Egholm M. In Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications. Synthesis of PNA Oligomers by Mmt Chemistry (Eds Nielsen P. E., Egholm M.). Horizon Scientific Press, Wymondham, 1999, p. 116-145.

50. Hyrup В., Egholm M., Nielsen P.E., Wittung P., Norden В., Buchardt O. Structure-activity studies of the binding of modified peptide nucleic acids (PNAs) to DNA. // J. Am. Chem. Soc., 1994, v. 116, p. 7964-7970.

51. Krotz A. H., Buchardt O., Nielsen P. E. Synthesis of 'Retro-Inverso' Peptide Nucleic Acids: 1. Characterization of the Monomers. // Tetrahedron Lett., 1995, v.36, p. 6937-6940.

52. Li Y., Jin Т., Liu K. Synthesis and binding affinity of a chiral PNA analogue. // Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids. 2001. v. 20. n. 9. p. 1705-1721.

53. Lioy E., Kessler H. Synthesis of a new chiral peptide analogue of DNA using ornithine subunits and solid-phase peptide synthesis methodologies // Liebigs Ann., 1996, p. 201-204.

54. Puschl A., Sforza S., Haaima G., Dahl O., Nielsen P. E. Peptide nucleic acids (PNAs) with functional backbone // Tetrahedron Lett., 1998, v. 39, p. 4707-4710.

55. Sforza S., Haaima G., Marchelli R., Nielsen P. E. Chiral peptide nucleic acids (PNAs): helix handedness and DNA recognition // Eur. J. Org. Chem., 1999, p. 197-204.

56. Falkiewicz В., Kowalska K., Kolodziejczyk A. S., Wisniewski K., Lankiewicz L. Synthesis of new chiral nucleic acid (PNA) monomers by a simplified reductive amination method // Nucleosides & Nuleotides, 1999, v. 18, n. 3, p. 353-361.

57. Mitsunobu O. The use of diethyl azodicarboxylate and triphenylphosphine in synthesis and transformation of natural products // Synthesis, 1981, n. 16, p. 1-29

58. Hyrup В., Egholm M., Buchardt O., Nielsen P. E. // A flexible and positively charged PNA analogue with an ethylene-linker to the nucleobase: synthesis and hybridization properties // Bioorg. & Med. Chem. Lett., 1996, v. 6, n. 10, p. 1083-1088.

59. Wittung P., Nielsen P. E., Buchardt O., Egholm M., Norden B. DNA-like double helix formed by peptide nucleic acid. // Nature. 1994. v. 368. p. 561-563.

60. Demidov V. V., Potaman V. N., Frank-Kamenetskii M. D., Egholm M., Buchard O., Sonnichsen S. H., Nielsen P. E. Stability of peptide nucleic acids in human serum and cellular extracts. // Biochem Pharmacol. 1994. v. 48. p. 1310-1313.

61. Mollegaard N. E., Buchardt O., Egholm M., Nielsen P. E. Peptide nucleic acid-DNA strand displacement loops as artificial transcription promoters. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. v. 91. p. 3892-3895.

62. Nielsen P.E., Hyrup B. Peptide Nucleic Acids (PNA): synthesis, properties and potential applications. // Bioorganic & Medical Chemistry. 1996. v. 4, v. 5-23.

63. Larsen H.J., Bentin Т., Nielsen P.E. Antisense properties of peptide nucleic acid. // Biochimica et Biophysica Acta. 1999. v. 1489, p. 159-166.

64. Lutz M.J., Benner S.A., Hein S., Breipohl G., Uhlmann E. Recognition of uncharged poliamide-linked nucleic acid analogs by DNA polymerases and reverse transcriptases. // J. Am. Chem. Soc. 1997. v. 119, p. 3177-3178.

65. Mollegaard N.E., Buchardt O., Egholm M., Nielsen P.E. Peptide nucleic acid-DNA strand displacement loops as artificial transcription promoters. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. v. 91, p. 3892-3895.

66. Orum H, Nielsen P. E., Egholm M, Berg R. H., Buchardt O, Stanley C. Single base pair mutation analysis by PNA directed PCR clamping. // Nucleic Acids Res. 1993, v. 21, p. 53325336.

67. Isacsson J., Cao H., Ohlsson L., Nordyren S., Svanvik N., Westman G., Kubista M., Sjoback R., Sehlstedt U. Rapid and specific detection of PCR products using light-up propes. // Molecular and cellular probes. 2000. v. 14. p. 321-328.

68. Li X., Zhang Liangren, Lu J., Chen Y., Min J. Zhang Lihe. Signal peptide mimics conjugated to peptide nucleic acid: a promising solution for improving cell membrane permeability. // Bioconjugate Chem. 2003. v. 14. p. 153-157.

69. Richard J.P., Melikov K., Vives E., Ramos C., Verbeure В., Gait M.J., Chernomordik L.V., Lableu B. Cell-penetrating peptides. A revolution of the mechanism of cellular uptake. // J. of Biological Chemistry. 2003. v. 278. p. 585-590.

70. Прохоров Д.И. Синтез тиминосодержащих мономеров отрицательно заряженных ПНК. // Магистерская диссертация. М.: МИТХТ, 2002.

71. Friedrich-Bochnitschek S., Waldmann H., Kunz H. Allyl esters as carboxy protecting groups in the synthesis of O-glicipeptides. // J. Org. Chem. 1989. v. 54. p. 751-756.

72. Sarin K., Kent В., Tarn J., Merrifield R. Quantitative monitoring of solid-phase peptide synthesis by ninhydrin reaction. // J. Anal. Biochem., 1981, v. 117, p. 147-157.1. БЛАГОДАРНОСТИ

73. Автор работы выражает свою благодарность к.х.н. Кирилловой Ю.Г. за непосредственное руководство работой, участие в проведении эксперимента и в обсуждении результатов; д.х.н., проф. Звонковой Е.Н. за консультирование и помощь в выполнении диссертации.