Синтез мономеров полиамидных миметиков нуклеиновых кислот и исследование их свойств тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

Деженков Андрей Владимирович

Синтез мономеров полиамидных миметиков нуклеиновых кислот и исследование

их свойств

02.00.10 - Биоорганическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

3 ИЮН 2015

Москва-2015

005569585

Работа выполнена на кафедре биотехнологии и бионанотехнологии Московского государственного университета тонких химических технологий им. М. В. Ломоносова (г. Москва).

Научный руководитель академик РАН, доктор химических наук,

профессор

Швец Виталий Иванович

Официальные оппоненты

доктор химических наук, профессор, главный научный сотрудник ФГБНУ «Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков имени Г. Ф. Гаузе» - Евгения Николаевна Олсуфьева

кандидат химических наук, доцент кафедры биоорганической химии биологического факультета ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова» - Дмитрий Станиславович Есипов

Ведущая организация: ФГБУН Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН

Защита состоится «22» июня 2015 года в 16:00 на заседании диссертационного совета Д 212.120.01 при ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет тонких химических технологий имени М. В. Ломоносова» по адресу: 119571, г. Москва, проспект Вернадского, д. 86, аудитория М-119.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет тонких химических технологий имени М. В. Ломоносова» и на интернет-сайте МИТХТ им. М. В. Ломоносова http://mitht.ru.

С авторефератом диссертации можно ознакомиться на интернет-сайтах ВАК РФ http://vak.ed.gov.ru и МИТХТ им. М. В. Ломоносова http://mitht.ru.

Автореферат разослан <¿2» мая 2015 года.

Ученый секретарь Диссертационного Совета кандидат химических наук,

старший научный сотрудник

Общая характеристика работы1

Актуальность проблемы. Современные биохимические и биомедицинские технологии направлены на поиск молекулярных инструментов для диагностики и лечения различных заболеваний. В связи с этим актуальным направлением является исследование взаимодействий различных синтетических молекул с нуклеиновыми кислотами для управления процессами транскрипции РНК (антиген стратегия) и экспрессии белка (антисмысловая стратегия). Ярким примером таких молекул, которые показали хорошие результаты in vitro, являются полиамидные миметики нуклеиновых кислот. Данный тип миметиков сочетает в своей структуре полиамидный скелет (с чередованием амидной связи и её восстановленной формы) и нуклеиновые основания, присоединенные к скелету через ацетамидный линкер [Nielsen et al„ 1991].

aeg-ПНК

H T2

n(H2C).

а-ПНК

'(CH2)íf О ^N2

; ß у-ПНК

B=T,C,A,G X=-OH;-COO;-SH;-NH3*;-

HN^NK NH2

Рисунок 1. Структура «классических» и хиральных ПНК.

«Классические» й^-ПНК (рис. /), состоящие из повторяющихся N-2-аминоэтильных единиц (ае£) показывали низкую растворимость и слабую

1 В руководстве работой принимала участие к.х.и. Кириллова Ю. Г.

Список сокращений: ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография, КД -круговой дихроизм, ОДН - олигодезоксирибонуклеотиды, ОЗ - отрицательно-заряженные, ОН - олигонуклеотнды, ПНК - полиамидные миметики нуклеиновых кислот, Tono I -топоизомераза I, ТФС - твердофазный синтез, ЭЧ - энаптиомерная чистота, ЯМР - ядерно-магнитный резонанс, All - аллил-, Bzl - бензил-, Вое - трет-бутилоксикарбонил-, Cbz - бензилоксикарбонил-, COSY - гомоядерпая корреляционная спектроскопия, DEAD - диэтилазодикарбоксилат, DQF - двухквантовая фильтрация, НМВС - гетероядерная многосвязная корреляция, HSQC - гетероядерная одноквантовая корреляция, 1BCF - гоо-бутилхлорформиат, NMM - Л'-метилморфолин, Ns - орто-иитробеизосульфонил-, PMHS - полиметилгидросилоксаи, TEA - триэтиламин, TFA -трифторуксусиая кислота.

проникающую способность в экспериментах in vivo. Улучшение данных свойств было достигнуто за счет получения различных модификаций ПНК. Недавние разработки показали, что наличие хирального центра, его конфигурация (R или S) и местоположение в структуре мономера (а(2)- или у(5)-положение) (рис. 1) влияют на аффинность олигомеров ПНК к ОН (ОДН) через преорганизацию их вторичной структуры [Corradini R. et al., 2011]. В то же время введение различных функциональных групп, в составе боковых радикалов, может улучшать биодоступность таких соединений, например, для положительно-заряженных ПНК на основе аргинина [Ly D. Н. et al., 2003, 2009] описаны взаимодействие с мембраной эукариотических клеток, способность проходить через нее посредством эндоцитоза и локализация в ядре эукариотических клеток при сохранении аффинных свойств, что является благоприятным фактором для антиген терапии. Введение отрицательного заряда в структуру ПНК за счет фосфонатных групп [Efimov V. A. et al., 2005] существенно не снижает стабильность их комплексов с ОН, а также способствует увеличению биодоступности ПНК при использовании стандартной катионной липофекции [Efimov V. A. et al., 2006]. Таким образом, перспективным является создание хиральных отрицательно-заряженных ПНК (рас. 1), в которых наряду с нуклеиновыми основаниями, обеспечивающими молекулярное узнавание, содержится отрицательный заряд на каждую мономерную единицу подобно природным ОН (ОДН).

В целом, модификации ПНК способны стать новым объектом исследования как медицинской химии, так и молекулярной биологии, и занять значимое место на рынке высоких технологий, в случае разработки эффективной методологии получения модифицированных мономеров и олигомеризации их на полимерном носителе, обеспечивающей синтетическую доступность этих соединений.

На кафедре биотехнологии и бионанотехнологии Московского государственного университета тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова проводятся фундаментальные исследования по созданию хиральных ПНК на основе ¿-Ala и дикарбоновых аминокислот. Исследование последних предполагает наличие отрицательного заряда в структуре модифицированных ПНК, представленного карбоксильной группой, что позволит улучшить растворимость и использовать катионные носители для доставки ПНК через мембрану в цитоплазму, тем самым

способствуя преодолению главных препятствий на пути использования ПНК в качестве терапевтических агентов. Ранее были получены пиримидинсодержащие мономеры а- и -/-03 ПНК (рис. 1) и аденинсодержащий мономер а-03 ПНК на основе ¿-Glu [Боярская Н. П., 2007; Баранов А. В., 2008]. Была продемонстрирована гибридизационная способность гомотиминовых ОЗ ПНК к образованию комплексов с комплементарной ДНК-мишенью [Боярская Н. П., 2007], а также предложены методы по определению оптической чистоты мономеров на основе ¿-А1а [.Пьяное М. А., 2011]. В связи с этим актуальной является задача препаративного получения пуриновых мономеров 03 ПНК (гуанинсодержащих, в случае а-ПНК, и аденин-, гуанинсодержащих, в случае у-ПНК) для разработки протокола синтеза олигомеров, содержащих все четыре нуклеиновых основания в своей структуре, с целью дальнейшего определения эффективности 03 ПНК при взаимодействии с ОН (ОДН).

Представленная работа проводилась в рамках научных исследований на кафедре биотехнологии и бионанотехнологии МИТХТ им. М.В. Ломоносова. Работа финансировалась грантом РФФИ 09-04-01026а, государственными контрактами № 14.740.11.0634, № 14.740.11.0120.

Цель данной работы заключалась в синтезе пуринсодержащих мономеров на основе ¿-Glu полиамидных миметиков нуклеиновых кислот и исследовании их свойств, в том числе и при использовании 2Э-ЯМР спектроскопии.

Основные задачи состояли в:

1. Разработке региоселективного метода синтеза а- и /-замещенных пуринсодержащих мономеров ОЗ ПНК

2. Разработке метода определения оптической чистоты мономеров ПНК на примере тиминсодержащих мономеров ОЗ ПНК

3. Синтезе модельного димера хиральных у-ПНК и изучении его пространственной структуры

4. Исследовании способности гуаниновых производных ингибировать активность топоизомеразы I

Научная новизна. В ходе работы разработан региоселективный метод синтеза пуринсодержащих мономеров ОЗ ПНК. Методами двумерной ЯМР-спектроскопии доказана региоселективность реакций алкилирования производных нуклеиновых оснований. Разработан прямой метод определения энантиомерной чистоты хиральных ОЗ мономеров ПНК.

5

Показана высокая оптическая чистота мономеров 03 ПНК на примере тиминсодержащих мономеров. Впервые получен модельный димер хиральных ПНК, а также проведено исследование его пространственной структуры. Проведены исследования по определению влияния гуаниновых производных на активность топоизомеразы I.

Практическая ценность работы. В ходе работы в препаративных количествах синтезированы пуринсодержащие мономеры 03 ПНК. Разработанный региоселективный метод получения гуанинсодержащих мономеров 03 ПНК может быть применен и в случае использования других хиральных мономеров ПНК. Использование полученных мономеров для создания олигомеров с большим содержанием гуанина даст возможность для проведения исследований взаимодействий таких ПНК с С-квадруплексами ОДН.

Методами одномерной и двумерной ЯМР-спектроскопии проведена расшифровка спектров полностью защищенных пуриновых мономеров 03 ПНК. Получены базы данных химических сдвигов сигналов, характеризующих структуры целевых мономеров, которые могут быть использованы в расшифровке ЯМР-спектров других хиральных мономеров ПНК.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Методология синтеза гуанинсодержащих мономеров а-03 ПНК и пуринсодержащих мономеров у-ОЗ ПНК

2. Доказательство региоселективности реакции алкилирования производных гуанина и аденина

3. Определение оптической чистоты мономеров на примере тиминсодержащих мономеров ОЗ ПНК

4. Синтез модельного димера на основе хирального мономера у-метильных ПНК и исследование его структурной преорганизации методом 20-ЯМР спектроскопии

5. Исследование ингибирования действия топоизомеразы I производными гуанина

Публикации и апробации работы. Результаты диссертации изложены в 3 статьях и 8 тезисах на Всероссийских и международных конференциях. Итоги исследования апробированы на следующих научных конференциях: молодежная научно-техническая конференция «Наукоемкие химические технологии» (2009, 2011, 2013 Москва), Московский международный

конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (2011, 2013, Москва), 10th IUPAC International Symposium on Bio-Organic Chemistry (2015 Pune, India), XXI Round Table on Chemical Biology of Nucleic Acids (2014 Poznan, Poland), FEBS EMBO Conference (2014, Paris, France).

Структура диссертации и объем работы. Диссертация изложена на 108 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы, включающего 116 источников. Диссертация иллюстрирована 48 рисунками и содержит 25 схем, 9 таблиц и 9 приложений. Результаты работы и их обсуждение

В последнее время ПНК, как классические, так и модифицированные используются в исследованиях неканонических структур нуклеиновых кислот [Usui К., 2015], с целью определения регуляторной функции данных элементов в процессе экспрессии генов, а также анализа теломерных повторов. Для изучения таких взаимодействий, необходимо получение олигомеров ПНК с большим содержанием гуаниновых оснований, для чего необходима разработка препаративного, хорошо воспроизводимого синтеза гуаниновых мономеров.

Синтез пуринсодержащих мономеров ПНК.

Синтез защищенных гетероциклических оснований

Ранее было показано, что для синтеза мономеров ОЗ ПНК, использование стратегии с получением карбоксиметилированных производных невыгодно из-за низкого выхода на последующей стадии ацилирования, в случае получения цитозинсодержащих мономеров ОЗ ПНК {схема 1Ä) [Баранов А. В., 2008], а также ввиду склонности псевдопептидов к циклизации (в присутствии основания) с образованием производного пироглутаминовой кислоты (в случае a-мономеров ОЗ ПНК) и <5-лактама (в случае у-мономеров ОЗ ПНК) (схема IB) [Boyarskaya N. Р. et al., 2005].

Схема 1.

Поэтому в нашей лаборатории был использован альтернативный путь синтеза, сочетающий в себе введение защитных групп в нуклеиновые основания (за исключением тимина) и дальнейшее их алкилирование бромацетамидными производными псевдопептидов (схема 1С) [Баранов А. В., 2008; Meitzer Р. С. et al„ 1995].

5ос/С£г-Стратегия твердофазного синтеза подразумевает использование в качестве Л^-концевой защитной группы мономера 03 ПНК ßoc-группу, на остаток глутаминовой кислоты вводят ßzZ-защиту, экзоциклические аминогруппы нуклеиновых оснований защищают Cbz-группой, а С-конец мономера ортогонально защищают аллильной функцией.

8

Для осуществления синтеза мономеров 03 ПНК по бос-протоколу твердофазного синтеза, необходимо предварительно защитить функциональные группы гетероциклических оснований.

Для аденина 1 ранее была показана возможность введения Cfe-защиты на экзоциклическую аминогруппу [Баранов А. В., 2008; Thomson S. A. et ai, 1995] (схема 2). Реакция аденина с CbzCl в присутствии NaH при 0°С в атмосфере Аг приводила к образованию Л/6-(бензилоксикарбонил)аденина 2, который очищали перекристаллизацией в системе СНС13/метанол (9:1) (схема 2). Выход реакции составил 55%, что выше чем предыдущие результаты (26% [Баранов А. В., 2008] и 48% [Пьяное М. А., 2011], при этом стартовая загрузка аденина в нашем случае была увеличена в 15 и в 3 раза, соответственно, по сравнению с загрузкой в данных работах).

Известно, что fleg-гуаниновый мономер для Вос-протокола твердофазного синтеза (ТФС) получают конденсацией псевдопептидного фрагмента либо с Об-бензил-А^-алкильным [Dueholm К. L. et al., 1994], либо Л'",-СЬ2-Л/°-карбоксиметильным производными гуанина [Thomson S. A. et al., 1995]. Однако, незащищенная экзоциклическая аминогруппа гуанина, в первом случае, в дальнейшем не позволяет проводить качественный тест Кайзера и кэпирование аминогрупп растущей олигомерной цепи. Введение же Cfe-защитной группы на аминогруппу гуанина, во втором случае, осуществляли после А^-алкилирования 2-амино-6-хлорпурина 3. Защита в Соположении гуанина способствует предотвращению побочного процесса алкилирования по /У7-положению. Так было показано [Timar Z. et al., 2000], что алкилирование Л'"-изобутирил-0'5-дифенилкарбамоил гуанина метиловым эфиром бромуксусной кислоты приводит к смеси Л'';/Л'7-продуктов замещения, но содержание /У7-региоизомера составляет только 15%. Таким образом, можно сделать вывод, что для того чтобы алкилирование производных гуанина протекало с высокой региоселективностью, необходимо либо проводить алкилирование 2-амино-6-хлорпурина 3, либо ввести защитную группу в ¿/-положение гуанина. Также для уменьшения

Схема 2.

55%

NHCbz

2

побочных процессов в ТФС олигомеров 03 ПНК следует вводить защитную группу на экзоциклическую аминогруппу гуанина.

Схема 3.

Бензильную группу вводили в ¿/-положение гуанина, используя 2-амино-6-хлорпурин в качестве исходного соединения (схема 5). Был осуществлен ряд экспериментов для выбора оптимальной синтетической процедуры получения Ов-бензилгуанина 4 (табл. 1).

условия Выход, % Ссылка

1 BzlOH, NaH, 1,4-диоксан, 100°С 27 [Liu X. et al., 2003]

2 BzlOH (изб.), NaH, 130°С 43 [Dolan M. E. et al, 1990; Льянов M. A., 2011]

3 BzlOH (изб.), NaH, 65°С 62 [Barth C. et al., 2004]

Таблица 1. Способы синтеза 06-бензилгуаиииа, опробованные в работе.

В первом случае, аналогично с работой [Liu X. et al, 2003], при действии бензилатом натрия на 2-амино-6-хлорпурин в 1,4-диоксане при 100°С, с последующим выделением 06-бензилгуанина 4 при помощи колоночной хроматографии, выход продукта оказался 27%. Во втором эксперименте [Dolan М. Е. et al., 1990; Льянов М. А., 2011], реакцию проводили в избытке бензилового спирта при 130°С, после обработки и перекристаллизации из воды выход составил 43%, но трудности с удалением бензилового спирта в ходе обработки реакции и средний выход заставили нас искать иной подход. Наилучшие результаты показал способ, ранее описанный немецкими химиками [Barth С. et al., 2004], реакцию проводили также в избытке бензилового спирта, но температурный режим был уменьшен до 65°С, ввиду побочного процесса алкилирования экзоциклической аминогруппы, протекающего при температуре 120-130°С. Экстракция 2М NaOH и последующая нейтрализация водной фазы позволили

выделить целевой продукт 4. Выход составил 62%. После САг-защита была введена на аминогруппу гуанина реакцией О^-безилгуанина 4 с СЬгС1 в присутствии гидрида натрия, согласно с ранее разработанной нами методикой [Льянов М. А., 2011] (схема 3). Выход реакции составил 44%. В результате было получено дизащищенное производное гуанина 5.

Структуру и чистоту полученных соединений 4 и 5 подтверждали данными Н-, С-спектроскопии, элементный состав - масс-спектрометрией высокого разрешения и данными элементного анализа.

Синтез мономеров ОЗ ПНК

Следующий шаг заключался в синтезе бромацетамидных производных псевдопептидов 10а, 10Ь.

Схема 4.

В случае а-производного (схема 4) синтез начинали с тиолиза полностью защищенного псевдопептида 8а, который вводили в реакцию с тиофенолом в присутствии карбоната калия. Полученный вторичный амин 9а (выход 72%) сразу подвергали бромацилированию. Первоначально использовался ранее разработанный нами подход [Баранов А. В., 2008], который заключался в добавлении TEA к раствору псевдопептида 9а с последующим прибавлением бромацетилбромида. Однако при увеличении загрузки псевдопептида 9а более чем в 5 раз, выход бромида 10а составил только 43%. По-видимому, при первоначальном прибавлении TEA к вторичному амину 9а происходит образование побочного циклического продукта (схема 1В), причем данный процесс происходит с очень высокой скоростью при увеличении загрузки псевдопептида 9а. Поэтому был изменен порядок добавления реагентов, так к раствору псевдопептида 9а в СН2С12 при 0°С добавляли бромацетилбромид, и только после этого медленно

11

прикапывали TEA, не давая нагреться реакционной смеси выше 5°С. Выход реакции при измененном порядке прибавления реагентов составил 85%.

Бромацетамидное производное 10Ь было получено в три стадии, при внесении небольших изменений в ранее разработанный в нашей лаборатории протокол синтеза (схема J). Реакцию Мицунобу между (3-аминоспиртом (Вос-С1и(ОВг1)-ол) 6Ь и АЪ-защищенным аллиловым эфиром глицина 7Ь, проводили при 0°С в атмосфере аргона, добавляя DEAD по каплям к раствору «кислотной», «спиртовой» компонент и PPh3 в свежеперегнанном ТГФ.

Схема 5. COOBzl

BocHN

ОН

6Ь

COOBzl

BocHN

PhSH

к2со3 0°С

COOBzl

BocHN

н <?

9b

BrAcBr TEA

0°C

BocHN

10b, 60% на три стадии

Полученный интермедиат 8b был использован на следующей стадии без выделения в индивидуальном состоянии, так как удаление большего количества примесей возможно на стадии обработки последующего тиолиза. Так экстракция при различных рН реакционной смеси тиолиза защищенного псевдопептида 8Ь, позволила избавиться от большего числа примесей оставшихся после реакции Мицунобу. Вторичный амин 9Ь сразу (из-за побочного процесса циклизации (схема IB)) вводили в реакцию ацилирования (используя измененный порядок прибавления реагентов). К раствору псевдопептида 9Ь в СН2С12 при 0°С добавляли бромацетилбромид, после чего медленно прикапывали TEA. Выход на три стадии составил 60%, что сопоставимо с выходом, при использовании синтетического пути, который включал выделение полностью защищенного псевдопептида 8b, а синтез в этом случае становится более простым и дешевым. Структуру и чистоту бромацетамидных производных 10а, 10Ь подтверждали данными 'Н,

|3С-ЯМР-спектроскопии, элементный состав подтверждали масс-спектрометрией высокого разрешения.

Полностью защищенные мономеры lia, 12а, 13b, 14Ь получали алкилированием защищенных гетероциклических оснований 2, 4 и 5 бромацетамидными производными 10а, 10Ь (схема 6). Алкилирование Cbz-аденина 2 бромацетамидным производным 10Ь проводили в присутствии разных оснований: Cs2C03, смесь CS2CO3/K2CO3 (1:10) и К2С03. В целом результаты оказались сопоставимыми, поэтому последующие реакции проводили в присутствии К2С03.

Схема 6.

Вг

BocHN

10а 10Ь

2, 4, 5

К,СО,

BocHN

OBzl

OBzl

N

Л

NH,

11а, 15а

N

Ж

N NHCbz

12а, 16а 14b, 18Ь

NHCbz

13b, 17b

BocHN

[Pd(PPh3)4]

61% 11a 41% 12a 68% 13b 51% 14b

OH

77% 15a 87% 16a 98% 17b

88% 18b

Ri

11a, 15a -CH,CH,COOBzl

-H

12a, 16a -CH2CH2COOBzl -H

13b, 17b _H -CH2CH2COOBzl

14b, 18b _H -CH2CH2COOBzl

Так алкилирование СЬ2-аденина 2 бромацетамидом 10Ь в присутствии К2С03 приводило к образованию полностью защищенного мономера 13Ь. Выход составил 68%.

Гуанинсодержащие мономеры были получены аналогично аденинсодержащему мономеру 13Ь. Так мономер 11а был получен алкилированием Об-бензилгуанина 4 (1.2 экв.) в присутствии К2С03 (1.2 экв.) бромацетамидным производным псевдопептида 10а с выходом 65%.

13

Алкилирование дизащищенного гуанина 5 (1.1 экв.) бромацетамидными производными 10а, 10Ь в присутствии К2С03 (1.1 экв.) приводило к образованию полностью защищенных мономеров 12а, 14Ь с выходами 41 и 51%, соответственно. Средние значения выходов обусловлены неполной конверсией исходных веществ 10а, 10Ь, избытки гетероциклических оснований при этом были отделены от целевых продуктов при помощи колоночной хроматографии. Структуру и чистоту соединений 11а, 12а, 13Ь, 14Ь подтверждали данными 'Н, |3С-ЯМР-спектроскопии, элементный состав подтверждали данными масс-спектрометрии высокого разрешения. Региоселективность алкилирования была подтверждена методами двумерной ЯМР-спектроскопии.

Ранее удаление С-концевой аплильной защиты а-мономеров 03 ПНК мы проводили в присутствии морфолина при катализе [Pd(PPh3)4], при этом выход целевых продуктов был умеренным (45-53%) [Боярская Н. П., 2007; Баранов А. В., 2008], Применение другой процедуры с использованием PMHS/ZnCl2 [Chandrasekhar S. et al., 2001] и палладиевого катализатора не привело к увеличению выхода (<40%) целевых продуктов. Оптимальным оказался метод удаления С-концевой аллильной защитной группы соединений 11а и 12а при катализе [Pd(PPh3)4] в присутствии Лг-этиланилина [Shiraishi Т. et al., 2008], который позволил получить мономеры 15а и 16а с выходами 77 и 87%, соответственно. В случае у-мономеров ПНК 13b, 14Ь реакцию проводили по стандартной процедуре [Friedrich-Bochnitschek S. et al., 1989] в присутствии морфолина в условиях катализа палладиевым комплексом [Pd(PPh3)4] (схема 6). Выходы мономеров 17b, 18Ь составили 98 и 88%, соответственно. Структура и чистота полученных соединений 15а, 16а, 17b, 18Ь были подтверждены данными 'Н-, |3С-спектроскопии, элементный состав - данными масс-спектрометрии высокого разрешения.

Таким образом, были получены в препаративных количествах мономеры 03 ПНК 15а, 16а, 17b, 18Ь, содержащие в своей структуре пуриновые гетероциклы. В ходе работы было показано, что синтез мономеров ОЗ ПНК при использовании реакции Мицунобу более выгодно проводить без выделения A'.v-защищенного псевдопептида. Также было показано, что при проведении ацилирования псевдопептида бромацетилбромидом важен порядок прибавления реагентов. Для дальнейшей олигомеризации на полимерном носителе лучше использовать дизащищенный гуанинсодержащий мономер ОЗ ПНК, ввиду возможности

14

использования в ходе ТФС стадии кэпирования и качественного теста Кайзера.

Подтверждение региоселективности реакции алкилировапия пуриисодержащих гетероциклов.

При определении региоселективности реакций алкилирования пуриновых производных 2, 4, 5 бромацетамидными производными 10а, 10b, используя только |3С-спектры полностью защищенных мономеров lia, 13Ь, 14Ь, невозможно полностью судить о А^/А^-замещении, ввиду возможной неверной интерпретации близкорасположенных сигналов атома углерода защитной аллильной группы (-СН2-СН=СН2) и С°-атома пуриновых оснований (рис. 2). Поэтому региоселективность алкилирования была подтверждена методами двумерной ЯМР-спектроскопии. Для этого были получены спектры COSY ('Н/'Н-взаимодействия), HSQC ('Н/|3С-взаимодействия) и НМВС ('Н/13С-взаимодействия)2. Таким набором спектров были полностью определены сигналы, соответствующие всем H и С-атомам соединений lia, 13b, 14Ь. В ходе анализа спектров было обнаружено удвоение набора сигналов, что обуславливается тем, что в образцах присутствуют две конформерные структуры, ввиду затрудненного вращения вокруг амидной связи между ацетамидным линкером и псевдопептидом (рис. 2 В).

R,=-H. -NHCbz или NH2 R2=-NHCbz или -OBzl

В

R2V>0

BocHN- ^ B0CHN

R,

Рисунок 2. Гетероядериые корреляции, указывающие на региоселективность реакций алкилированияи (А) и конформации

мономеров (В).

Для определения региоселективности были использованы НМВС-спектры. Анализ спектров показал наличие корреляций между метиленовыми

2 Спектры регистрировали в ГНИИХТЭОС при участии Чешкова Д. А.

протонами ацетамидного линкера (Л) и С\ С'-атомами пуриновых оснований (табл. 2). В то же время корреляции между протонами линкера и С'-атомом пуринового кольца отсутствовали во всех случаях, что свидетельствовало о наличии продуктов Д^-замещения (рис. 2А).

Таблица 2. Химические сдвиги ключевых сигналов для определения региоселективности реакций алкилирования.

Номер в-ва С" С5 С* Линкер(Л)

■н 5 м.д. 11а - - 7.69 5.13-5.03

13Ь - - 8.28-8.18 5.52-5.47 и 5.37-5.33

14Ь - - 8.19-8.01 5.72-5.67 и 4.89-4.83

13С 5 м.д. 11а 154.1 114.1 140.0 45.1

13Ь 152.3 122.2 144.9 44.0

14Ь 153.5 116.8 143.6 42.5

В качестве примера представлен фрагмент двумерного НМВС-спектра мономера 11а, с указанием перекрывающихся сигналов (рис. 3).

J.....1. I . .............

: п.. А

Gua С-5 —

■ф < ■ < -4>

Gua С-8 Gua С-4 V

5 ... , • , , . 1 , | , , : , >0 5 00 4 50

Рисунок 3. Фрагмент НМВС-спектра а-гуанинсодержащего мономера

11а.

Двумерные ЯМР-спектры для мономера 12а не регистрировали, однако одномерные 'Н- и |3С-ЯМР-спектры показали похожие сигналы для всех Н- и С-атомов, с дополнительными сигналами, соответствующими C6z-rpynne. При этом метиленовые протоны ацетамидного линкера (JI) были отнесены как 8 5.16 м.д. major, S 5.08 м.д. minor, а химические сдвиги Cv-, С1- и С°-атомов гуанинового фрагмента отнесены как (5 140.0 м.д.), (5 156.0 м.д.) и (5 119.1 м.д.). Известно, что в случае ^'-замещения химические сдвиги С4- и С5-атомов составляют (5 157-164 м.д.) и (5 108-112 м.д.), соответственно [Timär Z. et al., 2000].

Таким образом, можно сделать вывод, что реакции алкилирования защищенных пуриновых оснований IIa, 12а, 13b, 14Ь бромацетамидными производными псевдопептидов 10а, 10b на основе ¿-глутаминовой кислоты протекают региоселективно.

Определение оптической чистоты тимиисодержащих мономеров.

Поскольку ключевое влияние на взаимодействие ПНК с комплементарными последовательностями нуклеиновых кислот имеет конфигурация хирального центра (R или 5) и его местоположение в псевдопептидном скелете, исключительно важна оптическая чистота (>95%) мономеров хиральных ПНК.

Для определения энантиомерной чистоты (ЭЧ) мономеров ПНК используют три основных метода. Первый включает синтез С-концевых диастереомеров на основе ПНК мономеров и последующее их разделение при помощи ВЭЖХ [Dueholm К. L. et al. 1994, Nielsen P. E. et al. 1996]. Второй подход был применен Ly D. Н. et al. [2009, 2011] и Ganesh К. N. et al. [2012], которые использовали косвенный метод, основанный на получении .ZV-концевых диастереомеров при помощи конденсации мономеров ПНК (после удаления ¿Y-концевой защитной группы) с реагентом Мошера (а-метокси-а-(трифторметил)фенилацетил хлорид) и последующей 19F-flMP-спектроскопии. Третий подход (прямой метод) основан на синтезе двух энантиомеров ПНК мономеров и их разделении при помощи ОФ ВЭЖХ на хиральном сорбенте [Lee W. et al., 2010, 2012].

В нашей работе был реализован прямой метод определения ЭЧ на примере тиминовых мономеров 23а, 24а и 23b, 24Ь, которые были синтезированы, по ранее описанной стратегии (схема 7). Использование прямого метода было обусловлено тем, что в случае проведения

17

предварительной дериватизации мономеров 23а, 24а по С-концу возможна частичная рацемизация, что наблюдалось при проведении анализа диастереомеров на основе L-, D-Ala [Пьяное М. А., 2011] и ¿-Glu, ¿-Ser, ¿-Lys [Nielsen P. E. et al. 1996].

Схема 7.

BocHN

9a, 19a

BrAcBr ^ -

OAII -- BocHN ^^

TEA 0°C 84%

(20a) 10a, 20a

OBzl

BzICL

i H u

bochn^~-n—Л

9b, 19b

TEA 0°C

OAII BocHN 80%

(20b)

10b, 20b

OAII

OBzl

[Pd(PPh3)4] этиланилин

94% 84%

23b, 24b

[Pd(PPh3)4] морфолин

Суть прямого подхода заключалась в подборе системы разделения рацемической модельной смеси Я- и З'-энантиомеров на колонке с хиральным сорбентом и определения ЭЧ отдельных мономеров в подобранной системе. Для разделения смеси Я- и 5-энантиомеров была использована хроматографическая колонка, загруженная новым гибридным сорбентом на основе силикагеля с иммобилизованным антибиотиком - эремомицином. Ранее было показано, что данный хиральный сорбент обладает высокой энантиоселективностью по отношению к модифицированным а- и /?-аминокислотам и их производным [Ктпе1зоу М. А. е/ а1„ 2006]. Результаты разделения представлены на рисунке 4.

Рисунок 4. Хроматограммы разделения рацемической смеси тиминсодержащих мономеров 23Ь, 24Ь (А)" и (З)-пшминсодерж(нцего мономера 23Ь (из Ь-Ыи) (Б)"; рацемической смеси тиминсодержащих мономеров 23а, 24а (В)" и (8)-ти.\шнсодержащего мономера 23а (из

С/и)" (Г).

"колонка Ша.чрИеге-110-Сhira.seI-Е-РА, элюент: МеОН/СН3СООН = 94/6 (у/у), скорость потока 1 мл/мин, ЦУ 254 им, температура 20°С; "колонка 0'ш$рЬеге-СЫга$е1-Е, элюент: МеОН/СН3СООН/ТЕА = 100/0.1/0.1 (у/у/у), скорость потока 0.5 мл/мин, НУ 254 нм, температура 20°С

Расчёт площади хроматографических пиков показал, что оптическая чистота мономера 23Ь составляет 99,1%, а а-мономера 23а - 95%, что представлялось достаточным для проведения дальнейшей олигомеризации на твердой фазе.

Таким образом, было показано, что описанная стратегия синтеза мономеров обеспечивает высокую оптическую чистоту конечных мономеров, также использованный в работе сорбент может быть применен для определения оптической чистоты других хиральных мономеров ПНК.

Определение конформаций хиральных ПНК.

Изучение пространственной конфигурации молекул ПНК является крайне важной задачей. При использовании КД-спектроскопии было показано, что ахиральные ПНК имеют неупорядоченную структуру и

принимают спиральную форму только при образовании комплекса с ОН (ОДН), введение же заместителя в структуру ПНК способствует преорганизации молекулы ПНК, причем важно положение заместителя в структуре ПНК: в случае (5) и (Л)-конфигурации хирального центра в у- и а-положении, соответственно, происходит правозакрученная преорганизация, в случае же y-(R) и «-(^-конфигурации - левозакрученная. Позже было показано, что для доказательства пространственной преорганизации молекул ПНК можно использовать методы ЯМР-спектроскопии. Для этой цели использовался модельный димер, имеющий в своем составе хиральный мономер у-метильных ПНК, изучение методами двумерной ЯМР-спектроскопии подтверждало наличие правозакрученной преорганизации [Ly D. Н. et ai, 2006, 2010], но в тоже время наложение сигналов аминоэтильных протонов псевдопептидных остовов препятствовало четкому определению констант спин-спинового взаимодействия, которые в данном случае являются ключевым фактором для проведения исследования. Мы посчитали рациональным синтез димера, состоящего из хирального мономера на основе L-Ala и oeg-ПНК мономера, причем метиленовые протоны в «классическом» мономере замещены на атомы дейтерия, что должно было способствовать упрощению 'Н-ЯМР спектра димера и легкости интерпретации двумерного COSY-спектра.

С этой целью нами был проведен синтез мономера «классических» ПНК на основе дейтерированного глицина (схема 8). Гидрохлорид метилового эфира дейтерированного глицина 26 был получен из 02-глицина 25 действием тионилхлорида в метаноле, взаимодействие эфира 26 с (трет-бутилокси)пирокарбонатом в присутствии NaHC03 приводило к образованию 5ос-защищенного метилового эфира глицина 27. Реакцией эфира 26 с 2-нитробензолсульфонилхлоридом в присутствии TEA получали Л^-производное метилового эфира дейтерированного глицина 28. Дейтерированный 5ос-этаноламин 29 получали восстановлением соединения 27 действием LiAlD4 в ТГФ. Реакция Мицунобу между спиртовой компонентой 29 и TVs-производным дейтерированного глицина 30 («кислотная» компонента) приводила к образованию полностью защищенного псевдопептида 30. Тиолизом TVj-защищенного псевдопептида 30 получали вторичный амин 31. Ацилированием амина 31 бромацетилбромидом в присутствии TEA получали бромацетамидное производное 32. Последующее алкилирование тимина, полученным

20

бромацетамидным производным 32, приводило к образованию полностью защищенного тиминсодержащего мономера 33. Удалением метальной защиты действием 2М №ОН получали Вос-защищенный дейтерированный «классический» мономер 34.

Схема 8.

О МеОН, SOCI2 О

. 0Н 94% HCI • 25 26

Вос20

•=D,

DEAD TPP

BocHN

S3% Br

31

BrAcBr, TEA, 0°C

BocHN

,N

о T, K2CO: о

71%

PhSH, K2C03

93%

BocHN

Ns

30

BocHN

32

^N 33

2M NaOH

-100% BocHN'

OH

34

Трифторацетат 36 был получен из полностью защищенного тиминсодержащего мономера 35 у-ПНК на основе ¿-Ala при действии на него трифторуксусной кислотой в присутствии .»-крезола. Конденсацию между трифторацетатом 36 и мономером 34 проводили по методу смешанных ангидридов, в результате конденсации был получен целевой димер 37 (схема 9). Структуру и чистоту соединений 26-37 подтверждали данными 'Н-, |3С-ЯМР-спектроскопии и элементного анализа.

Схема 9.

BocHN

TFA, m-крезол, 0°C T

BocHN

V°o ♦ I V°o

OH 34

IBCF, NMM, TEA

CF3COO-

36

29% T

BocHN'

у и I Y и

37

Для установления направления преорганизации димера 37 было необходимо найти в 'Н-ЯМР спектре сигналы, соответствующие метиленовым протонам 4 и 5 (рис. 5).

•г<

зН

i 4 "у О

2 н

Рисунок 5. Структура хиральной части димера 37.

Расшифровка одномерного 'Н-ЯМР спектра является трудоемкой задачей, из-за наличия ротамерных форм димера 37, которые обусловлены затрудненным вращением вокруг амидных связей (рис. 6), что способствует увеличению количества сигналов в четыре раза. Поэтому для получения подробной картины был использован метод двумерной ЯМР-спектроскопии - COSY ('Н/'Н-взаимодействия) с двухквантовой фильтрацией (DQF) для упрощения интерпретации кросс-пиков близкорасположенных к диагонали.

°о , V00

н

О , V0 о

ВосНЫ'

Т I Г

о V о

н

о V О

н

Рисунок 6. Структуры ротамеров хирального димера 37.

В ходе анализа СОБУфС^-спектра была использована следующая последовательность расшифровки сигналов: вначале были обнаружены кросс-пики между протонами метильной группы / и протоном Н2 {рис. 5) из метиленовой части спектра {рис. 7) (ввиду присутствия соседних протонов и наличия заторможенных конформаций димера сигнал отображался большим числом мультиплетов), далее были обнаружены корреляции между протоном Н2 и протоном аминогруппы НЗ, а также корреляции с протонами Н4 и Н5 {рис. 8).

Рисунок 7. Фрагмент СОЯ)'(1)01)-спектра димера 37, показывающий корреляции между метильпой группой 1 и протоном Н2.

3 450 3 400 3 350

Рисунок 8. Фрагмент СО.Ч¥(ПОГ)-ст>ктра димера 37, показывающий корреляции между протонами Н2 и Н4 (Н5).

Таким образом были установлены химические сдвиги, отвечающие протонам Н4 и Н5 {рис. 5), данные представлены в таблице 3.

1 2 3 4

Н4 3.635-3.561 м.д. (сМ, ]Н4Н5=14.7 Гц, ;Н2Н4=Ю.9 Гц) 3.722-3.679 м.д. (ски„4И5=14.5 Гц, -1н2н4~8.5 Гц) 3.797-3.751 м.д. 1н4Н5=13.8 Гц, 1Н2Н4=9.5 Гц) 3.875-3.810 м.д. (сИ, 1Н4Н5=14.6 Гц, 1н2н4=9.2 Гц)

Н5 3.208-3.162 м.д. (скин4н5=13.9 Гц, 1н2н5=4 Гц) 3.329-3.277 м.д. (Жин4н5=14.1 Гц, ^Н2Н5=4.1 Гц) 3.388-3.342 м.д. (<И, Лн4н5=14.8 Гц, 1н2н5=4 Гц) 3.493-3.441 м.д. (скин4н5=15.1 Гц, 1н2н5=4.2 Гц)

Таблица 3. Химические сдвиги протонов 4 и 5.

Для определения преорганизации молекулы димера 37 было использовано уравнение Карплуса (7^=Асоз2ф+Всозф+С, где А, В, С-эмпирические коэффициенты), которое на основе двугранных углов в молекуле дает значения констант спин-спинового взаимодействия.

N3

N6

Правозакрученная спираль Левозакрученная спираль

Рисунок 9. Проекции Ныомана для право- и левозакрученных хиральных

Принимая во внимание, что ранее методами рентгеноструктурного анализа и компьютерным моделированием было установлено, что для правозакрученных молекул ПНК двугранный угол составляет +60° (рис. 9) (для левозакрученных спиралей - -60°) [Ьу О. Н. е/ а1., 2006], можно сделать вывод, что геминальные константы спин-спинового взаимодействия протонов Н4 и Н5 для обоих видов преорганизации равны JmH5=\5 Гц, вицинальные константы между протонами Н2 и Н4 - Jц2m=^ 1 Гц, а вицинальные константы спин-спинового взаимодействия между протонами Н2 и Н5 в случае правозакрученной преорганизации - 4 Гц, а в случае левозакрученной преорганизации -Jн2H5-2 Гц.

В нашем случае, константы спин-спинового взаимодействия для различных ротамерных структур (усредненные значения) составили 4 Гц, Уя2Я7=9.5 Гц и Jн2H5=4A Гц. Вицинальная константа спин-спинового взаимодействия между протонами Н2 и Н5 равная 4.1 Гц (рис. 10) свидетельствовала о том, что димер 37 принимает правозакрученную конформацию.

ПНК.

15.1 Гц А

4.2 Гц

Рисунок 10. Фрагмент одномерного ЯМР спектра димера 37.

Таким образом, наличие метильной группы в у-положение ПНК преорганизует структуру в правозакрученную спираль, что может быть доказано при помощи 20-ЯМР-спектроскопии. Для осуществления данного анализа можно использовать дейтерированную модификацию димеров для уменьшения перекрывающихся сигналов в 'Н-ЯМР-спектре.

Исследование биологической активности полученных гуанинсодержащих производных1.

Как известно, гуаниновые производные являются широко используемыми агентами в терапии онкологических заболеваний. Так О6-бензилгуанин 4 используется, как ингибитор действия алкилтрансферазы, уменьшая токсичность противоопухолевых агентов [Dolan М. Е. el al., 1997], а jY -замещенные аналоги гуанина являются ингибиторами протеинкиназной активности [Gray N. S. et al., 1998]. Поэтому с целью выявления биологической активности гуанин производных 5, 15а было проведено исследование ингибирования активности фермента топоизомеразы I (Tono I) полученными веществами. В качестве образца сравнения использовали О6-бензилгуанин 4, известный как ингибитор этого фермента [Jensen L. Н. et ai, 2005] (рис. 11).

ДнкссТопо1 0,5 1 5 10 20 мкМ

Рисунок 11. Электрофореграмма продуктов реакции релаксации ДНКсс под действием Tono I в присутствии 4.

Электрофорез продуктов взаимодействия суперскрученной ДНК (ДНКсс) с Tono I в присутствии/отсутствии соединений 5 и 15а показал, что в отличие от соединения 4, данные соединения не ингибируют тестируемый фермент [рис. 12).

3 Исследование проводили совместно с лабораторией А. А. Штиля в ФГБНУ РОНЦ им. Н. H. Блохина.

5__ 15а

É 111

■¡■К ¡¿¿¡Шг. ЯЯИЦГ: ЯШ» .Щ i Ыи*. •fHE ж щ

is: i--:« т

j ¡¡Й J i^iijirilgi*!

ДНКсс Топо1 0.1 1 10 20 0.1 1 10 20 КОНЦЕНТРАЦИ Я, мкМ

Рисунок 12. Электрофореграмма продуктов реакции релаксации ДНКсс под действием Tono 1 в присутствии 5 и 15а.

Таким образом, дизащищенное производное гуанина 5 и монозащищенный мономер 15а не являются ингибиторами действия Tono I, по-видимому, это может быть обусловлено тем, что N2 и УУ9 положения гуанина участвуют в связывании с ДНК, блокируя действие Tono I.

Выводы.

Разработан региоселективный метод синтеза пуринсодержащих мономеров ОЗ ПНК. Впервые получены 3 гуанинсодержащих и 1 аденинсодержащий мономеры ОЗ ПНК

Данными двумерной ЯМР-спектроскопии подтверждена региоселективность алкилирования пуринсодержащих гетероциклов. Прямым методом определения оптической чистоты с использованием ВЭЖХ на примере тиминсодержащих мономеров показана высокая энантиомерная чистота мономеров ОЗ ПНК

Осуществлен синтез модельного димера на основе хирального мономера у-метильных ПНК. Показана правозакрученная преорганизация структуры димера при помощи методов 2D-спектроскопии ЯМР

Исследовано действие гуаниновых производных на активность топоизомеразы I

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Dezhenkov A.V., Tankevich M.V., Nikolskaya E.D., Smirnov i.P., Pozmogova G.E., Shvets V.l., Kirillova Yu.G. Synthesis of anionic PNA

1.

2.

3.

4.

5.

oligomers including y-carboxyethyl thymine monomers // Mend. Comm. -2015-V. 25,1. l.-P. 47-48.

2. Деженков A.B., Льянов M.A., Прохоров Д.И., Лысенко Н.Е., Есипова О.В., Кириллова Ю.Г. Синтез мономеров у-замещенных полиамидных миметиков нуклеиновых кислот // Вестник МИТХТ -

2012.-Т. 6, №6.-С. 72-76.

3. Деженков А.В., Прохоров И.А., Лютик А.И., Швец В.И., Кириллова Ю.Г. Рациональный способ получения псевдопептидных фрагментов - ключевых интермедиатов синтеза полиамидных миметиков нуклеиновых кислот (ПАНКМ) // Вестник МИТХТ -

2013. - Т. 8, № 6. - С. 108-110.

4. Kirillova Yu., Dezhenkov A., Tankevich М., Varizhuk A., Smirnov I., Pozmogova G. Studies of polyanionic PNAs derived from L-Glu // Proceeding of 10th IUPAC International Symposium on Bio-Organic Chemistry - January 11-15, 2015. - Pune, India. - P. 221-222.

5. Pozmogova G., Tankevich M., Dezhenkov A., Varizhuk A., Smirnov I., Kirillova Yu. A new type of peptide nucleic acids derived from L-GIu // FEBS Journal -27 Aug. 2014. - V. 281,1, si. - P. 632.

6. Kirillova Yu., Tankevich M., Dezhenkov A., Smirnov I., Pozmogova G. Side products in the solid phase synthesis of alfa-PNAs derived from L-GIu // XXI Round Table on Chemical Biology of Nucleic Acids - 24-28 Aug. 2014. - Poznan, Poland. - P. 119.

7. Деженков А.В., Ширяева M.B., Прохоров Д.И., Кириллова Ю.Г. Синтез мономеров полиамидных миметиков нуклеиновых кислот // Тезисы III Молодежной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии-2009» - Москва, МИТХТ, 1314 ноябрь 2009 г.-С. 40.

8. Ширяева М.В., Никольская Е.Д., Деженков А.В., Кириллова Ю.Г. Синтез и изучение свойств полиамидных миметиков нуклеиновых кислот // Тезисы VI Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» - Москва, 2125 марта 2011 г. - Т. 1. - С. 97-98.

9. Лысенко Н.Е., Деженков А.В., Кириллова Ю.Г. Синтез мономеров у-полиамидных миметиков нуклеиновых кислот // IV Молодежная научно-техническая конференция «Наукоемкие химические технологии-2011» - Москва, МИТХТ, 9-10 ноября 2011 г. - С. 55.

Ю.Деженков A.B., Ширяева М.В., Кириллова Ю.Г. Новый тип полиамидных миметиков нуклеиновых кислот с заданными свойствами: подходы к конструированию и изучению свойств // Тезисы VII Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» - Москва, 1922 марта 2013 г. - С. 85-86.

П.Прохоров H.A., Деженков A.B., Кириллова Ю.Г. Оптимизация синтеза псевдопептидов // V Молодежная научно-техническая конференция «Наукоемкие химические технологии-2013» - Москва, МИТХТ, 9-10 ноября 2013 г. - С. 48.

Деженков Андрей Владимирович

Синтез мономеров полиамидных миметиков нуклеиновых кислот и исследование их свойств Формат 60x90/16 Тираж 100 экз. Подписано в печать 21.04.2015. Заказ №275 Типография ООО «Генезис» 8 (495) 434-83-55 119571, г. Москва, пр-т Вернадского, 86