Разработка методов синтеза псевдопептидов и мономеров пептидно-нуклеиновых кислот тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

БАРАНОВ Александр Владимирович

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ СИНТЕЗА ПСЕВДОПЕПТИДОВ И МОНОМЕРОВ ПЕПТИДНО-НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

02 00 10 — Биоорганическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

□ОЗ171848

Москва — 2008

003171848

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Московской Государственной академии тонкой химической технологии им М В Ломоносова

Научный руководитель

академик РАМН, доктор химических наук, профессор

Швец Виталий Иванович

Официальные оппоненты доктор химических наук,

профессор

Юркевич Александр Морисович

кандидат химических наук Тевяшова Анна Николаевна

Ведущая организация Институт молекулярной генетики РАН

Зашита состоится «22» июня 2008 года в 151.Ойч на заседании диссертационного совета Д 212 120 01 при Московской Государственной академии тонкой химической технологии им М В Ломоносова по адресу 119571, г Москва, проспект Вернадского, д 86

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской Государственной академии тонкой химической технологии им М В Ломоносова

С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте иот.пиШЬ .ги

Автореферат разослан мая 2008 года

Ученый секретарь Диссертационного Совета кандидат химических наук,

старший научный сотрудник . А И Лютик

•ЛЬ

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Создание аналогов природных пептидов, содержащих в своем составе восстановленную пептидную связь (Ф), представляет интерес с точки зрения изучения их взаимодействия с протеоли-тическими ферментами с целью применения данных пептидомиметиков в медицине В связи с изучением сигнальных пептидов мозга особый интерес представляют псевдопептиды типа ProGly-Ф-Рго Регулярное чередование пептидной и псевдопептидной связи является основой для другого важного класса аналогов биополимеров — пептидно-нуклеиновых кислот (ПНК) Такая модификация природной пептидной связи позволяет получать не подверженные биодеградации структуры, подобные НК, что в сочетании с аффинностью к олигонуклеотидам определяет их перспективность в различных областях биотехнологии

Таким образом, является актуальной проблема поиска наиболее оптимального подхода к созданию псевдопептидной связи, а также рациональных способов дериватизации псевдопептидов и синтез на их основе новых биологически активных соединений

Результаты, полученные ранее в нашей лаборатории, позволяют говорить о высоком сродстве декамеров 03 ПНК с регулярной структурой, построенной из тиминсодержащих мономеров на основе псевдопептидов Glu-^-Gly и Gly^-Glu, к комплементарным олигонуклеотидам, и о возможности управлять степенью этого сродства посредством изменения состава буферной среды (Боярская, 2007) Таким образом, актуальной становится задача разработки путей синтеза новых мономеров, содержащих остатки других нуклеиновых оснований, и препаративное получение уже

1В руководстве работой принимала участие к х н , доц Кириллова Ю Г Список используемых сокращений НК — нуклеиновая кислота, ПНК — пептидно-нуклеиновая кислота, 03 ПНК — отрицательно заряженная пептидно-нуклеиновая кислота, All — аллил, Вое — торето-бутилоксикарбонил, 'Bu — mpem-бутил, Bzl — бензил, Cbz — бензилоксикарбонил, DCM — дихлорметан, DMF — диметилформамид, DEAD — диэтилазодикарбоксилат, DME — диметоксиэтан, ECF — этилхлорформиат, IBCF — изо-бутилхлорформиат, Im — имидазол, NMM — jV-метилморфолин, Ns — opmo-нитробензолсульфонил, Ph — фенил, Piv — пивалоил, Ру — пиридин, STAB — триацетоксиборгидрид натрия, TEA — триэтиламин, THF — тетрагидрофуран, TFA — трифторуксусная кислота

синтезированных ранее мономеров для получения олигомеров 03 ПНК

Данная работа является частью научных исследований, проводимых на кафедре Биотехнологии МИТХТ им М. В Ломоносова в рамках госбюджетной темы 1Б-5-356 «Исследования липидов, нуклеозидов, пептидов, ретиноидов методами биотехнологии и химического синтеза с целью создания препаратов медицинского назначения (онкологические и вирусные болезни, возрастные патологии)», а также в рамках РНП «Развитие научного потенциала высшей школы» (проект № 2 1 1 3243), госконтрактов с Роснаукой №№ 02 445 11 7355, 02 512 11 2144, 02 522 11 20011

Цель настоящего исследования заключалась в синтезе псевдопептидов и их производных

Основными задачами настоящего исследования явились

1 Оптимизация подходов к созданию псевдопептидной (Ф) связи между остатками различных по строению аминокислот и синтез псевдопептида состава РгоС1у-Ф-Рго

2 Разработка и препаративный синтез новых цитозинсодержащих мономеров 03 ПНК из псевдопептидов различного строения

3 Подтверждение структуры тимин-, цитозин- и аденинсодержащих мономеров 03 ПНК на основе псевдопептидов С1и-Ф-С1у и Иу-Ф-®и

Научная новизна и практическая ценность работы. Разработан новый метод восстановления производных дикарбоновых а-аминокислот до соответствующих /9-аминоспиртов, являющихся амино-, карбокси- и гид-роксилсодержащими трифункциональными хиральными синтонами с ортогональными защитными группами Впервые синтезированы два защищенных производных псевдопептида РгоС1у-Ф-Рго В ходе этого этапа работы была показана принципиальная возможность конструирования псевдопептидов, содержащих остатки пролина

В результате проведенной работы найден и оптимизирован способ получения, впервые осуществлен синтез в препаративных количествах, а также

полностью охарактеризованы два цитозинсодержащих мономера 03 ПНК на основе псевдопептидов С1и-Ф-С1у и С1у-Ф-С1и Разработанный подход был применен к синтезу ранее полученных двух тиминсодержащих мономеров 03 ПНК на основе псевдопептидов С1и-Ф-С1у и С1у-Ф-С1и и одного аденинсодержащего мономера 03 ПНК на основе псевдопептида С1у-Ф-Ои В результате работы были показаны преимущества разработанной схемы по сравнению с использовавшейся ранее для синтеза различных мономеров 03 ПНК

Методами двумерной ЯМР-спектроскопии изучена региоселективность реакции алкилирования нуклеиновых оснований (цитозина, тимина и аде-нина) бромацилированными псевдопептидами С1у-Ф-С1и и С1и-Ф-01у

Основные положения, выносимые на защиту:

1 Изучение восстановления производных дикарбоновых а-амино-кислот

2 Препаративный синтез псевдопептида РгоИу-Ф-Рго

3 Препаративный синтез двух новых цитозинсодержащих мономеров 03 ПНК на основе псевдопептидов С1и-Ф-С1у и С1у-Ф-С1и

4 Оптимизация схемы синтеза двух тимин- и одного аденинсодержащего мономера 03 ПНК на основе псевдопептидов Ии-Ф-Иу и Иу-Ф-

5 Изучение региоселективности реакции алкилирования бромацилированными псевдопептидами Иу-Ф-Ии и 01и-Ф-С1у тимина и защищенных цитозина и аденина методами двумерной ЯМР-спектроскопии

Публикации и апробации работы. По материалам диссертационной работы опубликовано 2 статьи и 3 тезисов на Всероссийских и международных конференциях Результаты настоящего исследования были представлены на следующих научных конференциях Научно-техническая конференция молодых ученых МИТХТ им М В. Ломоносова «Наукоемкие

химические технологии» (2007, Москва), Третий съезд общества биотехнологов России им Ю А Овчинникова (2005, Москва), Московский международный конгресс «Биотехнология состояние и перспективы развития-2005» (2005, Москва)

Структура диссертации и объем работы. Диссертация изложена на 105 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы, включающего 93 источника Диссертация иллюстрирована 31 рисунком и содержит 8 схем и 6 таблиц.

Результаты работы и их обсуждение

Восстановленная амидная связь Ф(СН2-КН) встречается в различных структурах, среди которых следует выделить пептидомиметики и пептидно-нуклеиновые кислоты Первые представляют собой аналоги природных пептидов, в которых произведена структурная замена пептидной связи на Ф-связь, используемые для изучения механизмов действия различных ферментов Вторые являются НК-миметиками, в которых основой для мономерного звена служит дипептид с восстановленной амидной связью

Синтез псевдопептидов

Существует три основных метода создания псевдопептидной связи Ф(СН2-NH) реакция восстановительного аминирования с участием альдегидов и аминов в присутствии мягких восстановителей (Ahmed, 1996), реакция Ми-цунобу между спиртами и модифицированными с помощью электроноак-цепторных заместителей по NH2-rpynne аминами (Mitsunobu, 1981), а также восстановление уже имеющейся амидной (пептидной) связи В нашей лаборатории широко используют первые два метода для создания коротких псевдопептидов с целью их дальнейшей дериватизации до мономеров 03 ПНК и аналогов биологически активных пептидов.

Изучение стадии восстановления защищенных дикарбоновых аминокислот

Восстановление защищенных а-аминокислот до соответствующих /?-аминоспиртов является ключевой стадией в синтезе многих аналогов биологически активных пептидов Из /?-аминоспиртов получают важные в химическом отношении синтоны а, а'-диаминодикарбоновые кислоты, 3-(S)-амино-7-бутиролактон, (8)-7-фторлейцин, различные /3-аминокислоты через /?-иодамины В случае использования дикарбоновых аминокислот возможно получать амино-, карбоксил- и гидроксилсодержащие трифункцио-нальные оптически активные синтоны, использующиеся, в частности, в синтезе мономеров отрицательно заряженных пептидно-нуклеиновых кислот (Боярская, 2005) Стандартный способ селективного восстановления а-карбоксильной группы до спиртовой действием 1 M раствора борана в THF (Схема 1) позволяет получать такие соединения, однако невысокий выход (не более 50%), необходимость осуществления реакции при —78°С, токсичность и высокая стоимость используемого реагента заставили нас искать более дешевый и воспроизводимый способ синтеза /3-аминоспиртов 3 из производных дикарбоновых аминокислот 1

В качестве дешевого селективного восстановителя, способного превратить карбоксильную группу в спиртовую, часто используют боргидрид натрия или лития, растворенный в воде или водно-спиртовой среде, поскольку в ходе гидролиза боргидрид-иона образуется комплекс борана с водой, аналогичный комплексу борана с молекулой THF Однако действие NaBHj в условиях реакции восстановления на Л-ацилированные аминокислоты приводит к расщеплению амидной связи Поэтому карбоксильную группу предварительно активируют, превращая ее чаще всего в смешанный ангидрид Таким образом, одностадийная в случае восстановления комплексом борана в THF реакция превращается в двухстадийную на первой стадии получают активированное производное защищенной аминокислоты 2, которое гп situ восстанавливают раствором боргидрида натрия

Все известные методики восстановления а-карбоксильной группы в защищенных аминокислотах до спиртовой основываются на двух работах (Rubim, 1984, Kokotos, 1990) и являются их незначительными модификациями Согласно этим работам, стадию образования смешанного ангид-

Ri В2 1*3 1*2*3

а Вое (CH2)2C02Bzl 55% 90%

Ь Вое CH2C02Bzl 33% 71%

с Cbz (CH2)2C02'Bu 40% 83%

рида необходимо осуществлять прибавлением к охлажденному раствору аминокислоты в DME или THF третичного основания (NMM или TEA) с последующим добавлением хлорангидрида моноэфира угольной кислоты (IBCF или ECF) Далее в большинстве случаев гидрохлорид третичного основания удаляют фильтрованием, после чего либо к раствору боргидри-да натрия прибавляют раствор интермедиата, либо, наоборот, к раствору интермедиата добавляют раствор NaBH4 В ряде работ после смешивания реагентов по каплям добавляют метанол

В ходе настоящей работы для препаративного синтеза соединения За из 7-бензилового эфира АГ-Вос-Ь-глутаминовой кислоты (1а) были опробованы различные комбинации третичных оснований (TEA и NMM) и растворителей (THF и DME) с использованием IBCF в качестве активирующего агента Во всех случаях образовывался липкий осадок соли 4а, препятствующий перемешиванию реакционной массы Из литературы следовало, что наибольшие выходы при восстановлении защищенных дикарбоновых аминокислот наблюдали в случае использования DME в качестве растворителя и NMM в качестве третичного основания, поэтому все дальнейшие эксперименты мы проводили с использованием именно этих веществ. Известно, что в ходе образования смешанного ангидрида необходимо подцер-

D UM №ВН4

Н20/Ме0Н Т ОН -10°cJ

За-с Ro

живать постоянный избыток IBCF по отношению к аминокислоте с целью подавления побочного процесса — образования симметричного ангидрида аминокислоты. Поэтому нами было предложено изменить порядок добавления реагентов, а именно к охлажденному раствору IBCF в THF добавлять одновременно и с одинаковой скоростью эквимолярные растворы аминокислоты и третичного основания

В ходе исследования стадии восстановления гп situ полученного ин-термедиата 2 мы обнаружили, что оптимальным является трехкратный избыток восстановителя Важен также порядок прибавления к охлажденному раствору смешанного ангидрида порциями следует добавлять раствор восстановителя В противном случае мы наблюдали продукты деблокирования соединения За В качестве среды для растворения боргидрида мы выбрали водно-метанольную систему (1 1), поскольку в ходе пробных экспериментов ее использование давало лучшие результаты по сравнению с водным раствором NaBH4

Нами было установлено, что флеш-хроматография растворенного в этилацетате продукта через слой окиси алюминия освобождает его от примесей, являющихся, вероятно, органическими соединениями бора Без этого этапа очистки соединения За и Зс не вступали в дальнейшие реакции конденсации по Мицунобу

Полученные таким образом соединения За-с были охарактеризованы с помощью 1Н-ЯМР-спектроскопии Степень чистоты подтверждали данными элементного анализа, а энантиомерную чистоту проверяли по значениям удельных углов оптического вращения, которые были аналогичны описанным в литературе

Таким образом, в ходе работы была проведена оптимизация реакции восстановления а-карбоксильной группы защищенных производных ди-карбоновых аминокислот 1 на следующих этапах- (1) стадии получения смешанного ангидрида с моноэфиром угольной кислоты, (2) стадии восстановления гп situ этого интермедиата и (3) стадии очистки полученных /3-аминоспиртов от примесей, препятствующих протеканию последующей конденсации в условиях реакции Мицунобу. Следует (1) одновременно прибавлять два раствора (NMM и защищенной аминокислоты) к охлажденному раствору IBCF, (2) к отфильтрованному от гидрохлорида

СООВг!

За

к

ВосН1\Г

,ОН

№С1уодн (4) сООВг!

РРЬз РЕАО

ТНР У

ВосНЫ

65%

РИЭН К2С03

СН3СМ 67%

/У-метилморфолина и охлажденному раствору смешанного ангидрида следует в несколько приемов добавлять свежеприготовленный раствор ЫаВН4 в водно-метанольной смеси, (3) обезвоженный этилацетатный слой, содержащий продукт восстановления, следует пропускать через окись алюминия

Синтезированные приведенным способом /3-аминоспирты За и Зс были использованы для получения защищенных псевдопептидов ВосС1и(7-0Ва1)-Ф-01у0А11 (6) и СЬ2С1и(7-04Ви)-Ф(№)-Н1з(№)0Ме (12)

Вос-£-С1и(7-ОВ21)-Ф-С1уОА11 (6)

Синтез защищенного псевдопептида Вос-£-С1и(7-ОВг1)-Ф-С1уОА11 (6) осуществляли по разработанной ранее схеме (Боярская, 2005, Схема 2), используя в качестве спиртовой компоненты /?-аминоспирт За, полученный по методу, предложенному в настоящей работе Это позволило повысить общий выход соединения 6 исходя из .ЛГ-Вос-7-бензилового эфира Ь-глутаминовой кислоты (1а) примерно в два раза Структуру всех полученных соединений подтверждали данными 1Н-ЯМР-спектроскопии Степень чистоты оценивали с помощью данных ЬС-МБ и элементного анализа Псевдопептид 6 использовали далее для синтеза мономеров 03 ПНК 30а, Ь

ВосС1у-Ф-Х-С1и(7-ОВг1)ОА11 (12)

Синтез защищенного псевдопептида 12 осуществляли по известной схеме (Боярская, 2005) Ранее ЛГ-Вос-а-аллиловый, 7-бензиловый эфир Ь-глутаминовой кислоты (7) получали из соединения 1а с помощью алли-лового спирта в условиях реакции Мицунобу При этом выход соединения

ВосНЫ. ХООН Я11П

АПВг С82СОз

РМР

ВосНЫ

к2со3

СН3СЫ 62%

ВосНЫ

1а Л,

72%

СООВг!

СООАН ТРА'Н2Ы^,СООА11

тра

РСМ

И 00%

СООВг!

80%

СООВг!

Ч

N3

СООАН ВосНЫ(СН2)2ОН(р10) ^СООАП

ОНАЭ

тня

СООВг!

N801

ТЕА ЭСМ 75%

СООВг!

• 12 У = Н

7 составлял 45%, а сама реакция протекала с образованием большого числа побочных продуктов, из-за наличия которых производное 7 выделяли при помощи колоночной хроматографии на силикагеле Для оптимизации этой стадии нами был использован другой метод введения аллильной защитной группы в соединение 1а- вместо аллилового спирта нами был использован аллилбромид Реакцию осуществляли в безводном БМР в присутствии СэгСОз В результате полученное соединение 8 возможно было использовать в следующей стадии без дополнительной очистки, а выход на данной стадии составил 72% (Схема 3) Таким образом, предложенная нами модификация увеличивает общий выход псевдопептида 12 исходя из соединения 1а примерно в два раза Структуры всех полученных соединений подтверждали данными 1Н-ЯМР-спектроскопии Степень чистоты оценивали с помощью данных ЬС-МЭ и элементного анализа

СЬг-/уС1и(7-0*Ви)-Ф(№)-1г-Шз(№)0Ме (15)

Полностью защищенный псевдопептид 15 синтезировали с целью подтверждения возможности использования защищенных /3-аминоспиртов, полученных из соответствующих производных аминокислот восстановлением КаВН4, в реакциях конденсации по Мицунобу с ^-производными аминокислот (Схема 4) Кислотную компоненту 14 получали из метилового

0°С

HlsOMe->■

92%

13

NsCI Ns TEA |

DCM HN ПОПЫ/*

PPh3 DEAD

THF

CbzGlu(0'Bu)-ol (3c) COO'Bu

Ns

30%

CbzHN

N

.COOMe

14 NsN-^

15

NsN-^

N

эфира Ь-гистидина (13) по стандартной методике Спиртовую компоненту Зс получали двумя различными способами, как это было описано выше (Схема 1), в обоих случаях реакция конденсации по Мицунобу проходила с выходом порядка 30% Структуры всех полученных соединений подтверждали данными 1Н-ЯМР-спектроскопии Степень чистоты оценивали с помощью данных ЬС-МЭ и элементного анализа

Синтез защищенных псевдопептидов, содержащих остатки пролила

Короткие пептиды на основе глицина и пролина (глипролины) обладают широкой физиологической активностью Одним из способов изучения их субстратной активности является замена пептидной связи на псевдопептидную, в частности восстановленную пептидную связь (СНг-ИН) Для исследования возможности конструирования псевдопептидов на основе пролина нами было предложено синтезировать псевдопептид РгоС1у-Ф-Рго В отличие от других псевдопептидов, полученных в ходе настоящей работы, для образования псевдопептидной связи между остатками глицина и пролина не подходила реакция Мицунобу, поскольку в пролине содержится вторичная аминогруппа Поэтому нами был выбран способ восстановительного аминирования.

Синтез двух защищенных псевдопептидов РгоС1у-Ф-Рго, содержащих различные защитные группы (23а,Ь), осуществляли согласно общей схеме (Схема 5) В качестве исходных соединений были выбраны ¿-пролин и аминопропандиол (16). Защищенные производные ¿-пролина 19, 22а

и 22b получали по стандартным методикам (Гершкович, Кибирев, 1992) Вос-Аминопропандиол (17) окисляли периодатом калия с образованием Вос-аминоацетальдегида (18) (Kim L et al, 1993) Реакция протекала быстро и с высоким выходом (78%) Ввиду неустойчивости соединения 18, его без дополнительной очистки сразу вводили в следующую стадию

Реакцию восстановительного аминирования проводили в DCM при комнатной температуре с использованием STAB и TEA с выходом защищенного псевдопептида 20 75% При удалении Вос-группы в интермедиате 20 раствором HCl в диоксане или свежеприготовленными одно- и двух-молярными растворами HCl в абсолютном метаноле наблюдали частичное осмоление продукта, поэтому стадии удаления Вос-защитных групп в соединениях 20 и 23а проводили действием 50% раствора TFA в DCM при 0°С, получая маслообразные трифторацетаты 21 и 24а

Стадии конденсации псевдопептида 21с защищенными по аминогруппе производными пролина 22а,b проводили по методу смешанных ангидри-

дов с использованием IBCF или PivCl В первом случае наблюдали образование ряда побочных продуктов, неразделяемых хроматографически, что приводило к низкому выходу соединений 23а,b (порядка 20%), в то время как использование PivCl приводило к большим выходам (порядка 50%) С помощью ТСХ-контроля было показано, что активация ВосРго (22а) и CbzPro (22b) при действии PivCl протекает довольно быстро — примерно за минуту при загрузке 1 г ВосРго В случае использования соединения 22а увеличение времени активации приводило к разрушению или модификации смешанного ангидрида защищенного пролина, а также сопровождалось протеканием побочной стадии циклизации нейтрализованной соли 21 с образованием лактама 25 Поэтому, с одной стороны, следовало избегать большого избытка третичного основания (TEA) в начальный момент времени в реакционной смеси, с другой стороны, недостаточное количество TEA приводило к неполной конверсии активированного производного пролина, что также снижало выход Поэтому мы предложили использовать шестикратный избыток третичного основания, однако для уменьшения скорости реакции циклизации TEA добавляли порциями Ввиду хорошей растворимости защищенных псевдопептидов 23а,b в воде, количество водно-органических обработок сводили к минимуму с целью избежания дополнительных потерь на стадии выделения

Полностью защищенные соединения 20 и 23а,b с псевдопептидным фрагментом обладают основными свойствами из-за наличия свободной аминогруппы и третичного атома азота, что осложняет их выделение Поэтому для хроматографической очистки этих соединений нами были подобраны системы элюентов, содержащие TEA Удаление Вос-защитной группы в соединении 23а осуществляли действием 50% раствора TFA в DCM с количественным выходом Структуры всех полученных соединений подтверждали данными 1Н-ЯМР-спектроскопии Степень чистоты оценивали с помощью данных LC-MS и элементного анализа

Таким образом, в ходе данного этапа работы была показана принципиальная возможность синтеза псевдопептидов, содержащих пролин

Синтез мономеров 03 ПНК на основе псевдопептидов Glu-$-Gly и Gly-^-Glu

Первоначально для синтеза цитозинсодержащих мономеров 03 ПНК была опробована разработанная ранее схема получения тиминсодержащих мономеров 03 ПНК из защищенных псевдопептидов Вос-1-С1и(7-ОВг1)-Ф-GlyOAll (6) и BocGly(7-OBzl)^-L-GluOAll (12) (Боярская, 2005) Однако выход менее 10% на стадии конденсации псевдопептида 12 с карбоксимети-лированным производным Cbz-цитозина 28Ь оказался неприемлемым для дальнейшего препаративного получения мономера ЗЗЬ (Схема 8) Другая стратегия синтеза, разработанная для получения незаряженных мономеров ПНК (Meitzer et al, 1995), предполагала iV-алкилирование защищенных нуклеиновых оснований 27 бромацильными производными псевдопептидов 26 и 31 Последние, в свою очередь, получали, действуя на псевдопептиды 6 и 12 бромацетилбромидом в DCM в присутствии TEA Выходы бромацилированных псевдопептидов 26 и 31 составили 78 и 86%, соответственно (Схемы 7,8)

Способ, использовавшийся ранее для получения тиминсодержащих мономеров 03 ПНК, основан на реакции ацилирования псевдопептидов карбоксиметилированными производными нуклеиновых оснований 28а-с, полученных из соответствующих гетероциклических нуклеиновых оснований (Схема 6), как это было описано ранее (Nielsen, 1991) Ввиду невозможности селективной защиты этилового эфира (аденил-Э)уксусной кислоты (37) CbzCl, защита экзоциклической аминогруппы была проведена с помощью тетрафторбората 7\Г-(бензилоксикарбонил)-#'-этилимидазолия (реагента Рапопорта), который, в отличие от бензилоксикарбонилхлорида, позволяет провести ацилирование экзоциклической аминогруппы в соединении 37 с более высоким выходом Суммарные выходы для соединений 28а-с составляли 70, 15 и 17%, соответственно.

Путь, включающий реакцию алкилирования соединений 27а-с бромацильными производными защищенных псевдопептидов 26 и 31, требует меньшего числа стадий для модификации исходных гетероциклов Cbz-производное цитозина 27Ь получали в одну стадию из цитозина (34) с помощью CbzCl в Ру с выходом 75%, a CbzAde (27с) — действием на аденин

Д С1СН2С00Н О

в

Су! 34

ЫНСЬг ВГСН2СООЕ1 ынсьг

I N814

СЬгС1 РМЯ

Ру П N 40% N

Н 27Ь

75%

№0Н (ач) /"

87% Ч_

35 У = ОУ

28Ь У = Н

ЫНСЬг

(36) СЪгС1 и ЫаН в БМГ с выходом 26% Невысокий выход реакции получения СЬгАс1е (27с) был связан с образованием побочных продуктов взаимодействия бензилоксикарбонилхлорида с аденином по N-9 положению Целевые продукты 27Ь,с выделяли с помощью кристаллизации Структуру CbzCyt (27Ь) подтверждали данными элементного анализа Структуру СЬ2Ас1е (27с) подтверждали данными 1Н-ЯМР-спектроскопии

Синтез полностью защищенных цитозинсодержащих мономеров 29Ь и 32Ь осуществляли с помощью реакции алкилирования СЬ2С^ (27Ь) полученными бромацилированными псевдопептидами 26 и 31 (Схемы 1, 8) Пробные реакции проводили в БМЕ, используя К2СО3 и КаН в качестве

оснований, при этом выходы оказались сравнимы На стадии конденсации СЬгСу1 (27Ь) с бромпроизводным псевдопептида С1и-Ф-С1у 26 мы использовали К2СО3, что давало продукт 29Ь с выходом 39% и в расчете на исходный псевдопептид 6 составляло 30% Конденсацию СЬгС>^ (27Ъ) с бромпроизводным псевдопептида С1у-Ф-С1и 31 осуществляли в присутствии ИаН и К2СО3 в БМР с выходами 60% и 55%, соответственно В расчете на исходный псевдопептид 12 выход соединения 32Ь составил 52% при использовании КаН в качестве основания на стадии алкилирования Цитозинсодержащие мономеры 03 ПНК ЗОЬ и ЗЗЬ получали удалением а-аллильной защитной группы с помощью палладиевого катализатора — тетракис(трифенилфосфин)палладия (0) [Рс1(РРЬз)4] Выход в реакциях составил 92 и 47% для соединений ЗОЬ и ЗЗЬ, соответственно

С целью проверки универсальности разработанной для получения цито-зинсодержащих мономеров 03 ПНК схемы мы провели синтез двух ранее полученных в нашей лаборатории тиминсодержащих мономеров 03 ПНК 30а и 33а (Схемы 7, 8) Стадии алкилирования бромацшшрованными псевдопептидами 26 и 31 тимина (27а) проводили в ОМР, используя К2СО3 и ^Н в качестве оснований Выходы в случае использования обоих оснований оказались сравнимы, поэтому полупрепаративные синтезы осуществляли в присутствии К2СО3, чтобы избежать возможных побочных процессов в случае использования более реакционноспособного НаН Полностью защищенные тиминсодержащие мономеры 29а и 32а были получены через стадию алкилирования тимина бромацильными производными 26 и 31 с выходами 56 и 91%, соответственно, что в расчете на исходные псевдопептиды 6 и 12 давало суммарные выходы 43 и 78% Для сравнения, конденсация по ранее использованной схеме, включающей реакцию аци-лирования псевдопептидов 6 и 12 карбоксиметилированным производным тимина 28а, давала полностью защищенные тиминсодержащие мономеры 03 ПНК 2Эа и 32а с выходами 56 и 64%, соответственно Тиминсодержащие мономеры 03 ПНК 30а и 33а получали удалением а-аллильной защитной группы с помощью [Рс1(РРЬз)4] с выходами 99 и 45%

Разработанная в ходе настоящей работы для пиримидиновых нуклеиновых оснований схема была также опробована для получения ранее синтезированного аденинсодержащего мономера 33с на основе защищенно-

COOBzl

BocHN

COOBzl

COOAII

BrCH2COBr

TEA DCM

78%

BOCHN

yy

Nv .COOAII ■

M ^ N/

26

BCH2C02H (28a, b)

IBCF

NMM, TEA

DMF

-20°C

BocHN

В 6*29 26*29 6*26*29 30

COOY

a Thy 56% b cteCyt -

56% 39%

43% 30%

99% 92%

В

(27a,b)

K2C03

DMF J

29a,b Y = All ^ [Pd(PPh3)4]

I morpholine

30a,b Y = H

го псевдопептида Gly-tf-Glu 12 (Прохоров, 2005), который первоначально получали реакцией ацилирования карбоксиметилированным производным Cbz -аденина (28с) псевдопептида 12 с выходом 26% (Схема 8) Конденсацию по альтернативной схеме, включающей алкилирование соединения 27с бромацилированным псевдопептидом 31, проводили в безводном DMF, используя в качестве оснований NaH, К2СО3, а также К2СО3 в присутствии CS2CO3 Наилучшие результаты наблюдали в третьем случае В ходе реакции образовывался побочный продукт алкилирования по N-7 положению соединения 27с, что было подтверждено данными 1Н-ЯМР-спектроскопии и LC-MS Идентификация и оценка количества побочного продукта были затруднены в связи с возможностью существования различных конформа-ционных форм продукт^, относительно амидной связи Примерное соотношение продуктов алкилирования по N-9 и N-7 положениям составило 4-1 Защищенный по а-карбоксильной группе аденинсодержащий мономер 32с был выделен с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (система метанол — вода, 75 5) Полностью защищенный аденинсодержащий мономер 32с получали с выходом 41%, что в расчете на исходный

ВосНИ

всн2со2н

(28а-с) 1ВСР

ШМ, ТЕА

йМР

-20°С

ВгСНгСОВг

ТЕА

СООА11

86%

СООВг!

BocHN

в

12»32 31*32 12*31*32

а ТИу 64% Ь СЬгСу1 10% с СЬ2Ас!е 26%

91% 60% 41%

78% 52% 35%

ВосНЫ

СООАН

СООУ

СООВг!

В (27а-с) К2С03 (27а) №Н (27Ь)

К2С0э/С82С03 (27С) йМР

32а-с У = АН—ч , ,

СООВг1 I тогрГюЬпе

ЗЗа-с У = Н -_/тнр

псевдопептид 12 составило 35% Удаление аллильной защитной группы в соединении 32с осуществляли с помощью [Р(1(РРЬз)4] Выход соединения 33с составлял 53%.

Сравнивая два метода синтеза мономеров 03 ПНК, можно сделать вывод о том, что в целом способ, основанный на реакции алкилирования бромацилированными псевдопептидами 26 и 31 нуклеиновых оснований 27а-с, дает лучшие выходы в расчете на исходные псевдопептиды 6 и 12 Кроме того, отпадает необходимость получения карбоксиметилированных производных нуклеиновых оснований, что особенно актуально в случае модификации аденина Следует также отметить, что бромацилированные псевдопептиды 26 и 31 удобно хранить, в отличие от соответствующих псевдопептидов 6 и 12, склонных к циклизации при хранении

Таким образом, была подобрана и отработана оптимальная схема синтеза цитозинсодержащих мономеров 03 ПНК на основе псевдопептидов 6 и 12, пригодная также, на наш взгляд, для получения и других мономеров заряженных ПНК Впервые получены и охарактеризованы два цитозинсодержащих мономера 03 ПНК

ЯМР-эксперименты по доказательству структуры полностью защищенных мономеров 03 ПНК на основе псевдопептидов Gly-if-Glu и Glu^-Gly

Для подтверждения структуры полностью защищенных мономеров 03 ПНК 29 и 32, полученных в ходе реакции алкилирования бромациль-ными производными 26 и 31 нуклеиновых оснований 27, данных одномерных 1Н- и 13С-ЯМР-спектров недостаточно Поэтому были проведены ЯМР-эксперименты по соотнесению сигналов ядер 13С и 1Н в полностью защищенных мономерах 03 ПНК 32а-с на основе псевдопептида Gly-Ф-Glu, а также цитозинсодержащего мономера 03 ПНК 29Ь на основе псевдопептида Glu^-Gly с привлечением двумерных методик 1Н/1Н-спектров COSY и 13С/1Н-спектров HSQC, показывающих ближние взаимодействия ядер атомов, и 13С-1Н-спектров НМВС, основанной на дальних взаимодействиях Спектры регистрировали1 в дейтерированном ацетоне при ЗОЗК на приборе Bruker AVANCE-600 с рабочей частотой 150 92 МГц для ядер

13С

и 600 13 МГц для ядер В качестве реперных использовали сигналы ядер 13 С входящих в состав полностью защищенных мономеров 03 ПНК защитных групп (Вое, Cbz, Bzl) и гетероциклических нуклеиновых оснований (Thy, Cyt, Ade)

На Рис 1 приведены общие формулы всех синтезированных в ходе настоящей работы мономеров 03 ПНК и указана нумерация атомов углерода и водорода, которым соответствуют соотнесенные на фрагментах НМВС-спектров сигналы в и 1Н-ЯМР-спектрах (Рис 2-4) Вследствие наложения друг на друга в спектрах

13С

и *Н ЯМР сигналов

ядер атомов одного бензольного кольца в тиминсодержащем мономере 32а и двух бензольных колец в двух цитозин- и одном аденинсодержащем мономерах 03 ПНК (29Ъ и 32Ь,с), соотнесение сигналов внутри этих групп не осуществлялось Суммарная интенсивность сигналов этих фенильных групп соответствовала ожидаемой (5Н для тиминсодержащего мономера 32а и ЮН для цитозин- и аденинсодержащих мономеров 29Ь и 32Ъ,с) Для тимин-, цитозин- и аденинсодержащего мономеров на сигналы

1ЯМР-спектрометрический анализ мономеров 03 ПНК проводился совместно с ГНИИХТЭОС при участии Чешкова Д А

Н1\1

[С1и-Ц)-С1у1

22

Рис 1 Нумерация атомов псевдопептидного фрагмента в мономерах ОЗ ПНК на основе псевдопептидов С1и-Ф-С1у и С1у-Ф-С1и

остатков соответствующих гетероциклов в спектрах НМВС имеются кросс-пики только от одной метиленовой группы, а именно СН2-25

Структуру цитозинсодержащих мономеров 03 ПНК 29Ь и 32Ь подтверждали наличием в НМВС-ЯМР-спектрах (Рис 2, 3) корреляций Н25-С26, Н25-С29 и Н26-С25 Корреляция Н25-С28, возможная в случае ал-килирования бромацильным производным защищенного цитозина по положению N-3, на обоих спектрах отсутствует

Структуру тиминсодержащего мономера 03 ПНК 32а подтверждали наличием в НМВС-ЯМР-спектре (Рис 4а) корреляций Н25-С26, Н25-С31 и Н26-С25 Корреляция Н25-С29, возможная в случае алкилирования бромацильным производным тимина по положению N-3, отсутствует

Структуру аденинсодержащего мономера 03 ПНК 32с подтверждали наличием корреляции Н25-С30 и Н25-С26 Корреляция Н26-С25 в НМВС-ЯМР-спектре (Рис 4Ь) аденинсодержащего мономера (32с) есть, однако при указанной на рисунке интенсивности пиков она не видна Корреляция Н25-С27 на этом спектре не проявляется, что позволяет судить об отсутствии в образце изомерного целевому соединению продукта алкилирования бромацилированным псевдопептидом СЬгАс1е по положению N-7

о со

о со

о о

о см

о

о со

о 00

.4.......

(

I )

4

:? I

11

I

Е о. а.

Рис. 2: Фрагмент НМВС-спектра полностью защищенного цитозинсодержащего мономера 03 ПНК (32Ь) на основе псевдопептида С1у-Ф-С1и.

J

мономера ОЗ ПНК (29Ь) на основе псевдопептида Glu-^-Gly.

Рис. 4: Фрагменты НМВС-спектров полностью защищенных (а) тимик- и (Ь) аденинсодержащих мономеров 03 ПНК (32а,с) на основе псевдопептида 01у-Ф-С1и.

Выводы

1 Разработан новый метод восстановления дикарбоновых «-аминокислот

2 Впервые синтезированы два защищенных производных псевдопептида РгоИу-Ф-Рго

3 Впервые осуществлен синтез двух цитозинсодержащих мономеров 03 ПНК на основе псевдопептидов С1и-Ф-С1у и С1у-Ф-С1и.

4 Проведена оптимизация схемы синтеза полученных ранее двух ти-минсодержащих мономеров 03 ПНК на основе псевдопептидов С1и-Ф-С1у и С1у-Ф-С1и и одного аденинсодержащего мономера 03 ПНК на основе псевдопептида 01у-Ф-С1и

5 Проведен анализ структуры полученных по разработанной в ходе настоящей работы схеме тимин-, цитозинсодержащих мономеров 03 ПНК на основе псевдопептидов С1и-Ф-С1у и С1у-Ф-С1и, а также аденинсодержащего мономера 03 ПНК на основе псевдопептида С1у-Ф-С1и с помощью методов двумерной ЯМР-спектроскопии, который показал однозначность структуры выделенных продуктов реакции алкилирования гетероциклических нуклеиновых оснований бромацильными производными защищенных псевдопептидов в1и-Ф-в1у и ау-Ф-Ии

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1 Баранов А В , Прохоров Д И , Боярская Н П , Есипова О В , Кириллова Ю Г Синтез нового аналога пептида ProGly Pro //Вестник МИТХТ - 2006 - Т 1, № 6 - С 77-80

2 Баранов А В , Цвид Н. С , Лукьянченко В И , Прохоров Д И , Кириллова Ю Г, Швец В И Исследование путей синтеза цитозиново-го мономера отрицательно заряженных пептидно-нуклеиновых кислот // Вестник МИТХТ - 2007 - Т 2, № 5 - С 28-32

3 Боярская Н П, Прохоров Д И , Баранов А В Разработка универсального подхода к синтезу мономеров отрицательно заряженных пептидно-нуклеиновых кислот // III Московский международный конгресс «Биотехнология состояние и перспективы развития» - Москва, 2005 - Ч 1 - С 142-143

4 Баранов А В., Льянов М А , Лукьянченко В И , Прохоров Д И Синтез хиральных мономеров пептидно-нуклеиновых кислот //II молодежная научно-техническая конференция «Наукоемкие химические технологии» Москва — 2007 — Т 1 — С 34

5 Баранов А В , Кириллова Ю Г Синтез псевдопептидных фрагментов для получения негидролизуемых аналогов физиологически активного пептида СЕМАКС // Третий съезд общества биотехнологов России им Ю А Овчинникова Москва — 2005 — С 31-32

Подписано в печать 20 05 2008 г Печать трафаретная

Заказ № 440 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56, (499) 788-78-56 www autoreferat ru

Список сокращений

Введение

1 Литературный обзор

1.1 ДНК в нанотехнологии.

1.1.1 Линейные ДНК в наноэлектронике.

1.1.2 Агрегация наночастиц посредством ДНК.

1.1.3 Разветвленные мотивы на основе ДНК.

1.1.4 Сложные ДНК-мотивы в качестве структурных строительных блоков.

1.1.5 Протяженные линейные ДНК, свернутые в сложные мотивы

1.1.6 Прототипы молекулярных двигателей на основе ДНК.

1.1.7 Основанные на ДНК биосенсоры

1.1.8 Выводы.19 /

1.2 Обзор методов компьютерной химии.

1.2.1 Различия между методами молекулярной механики, полуэмпирическими и ab initio методами.

1.2.2 Компоненты ab initio вычислений.

1.2.3 Базисы

1.2.4 Методы.

1.2.5 Типы вычислений.

1.2.6 Изучение растворов.

1.2.7 Некоторые примеры использования методов компьютерной химии в современных иследованиях.

1.3 Обзор методов двумерной ЯМР-спектроскопии.

1.3.1 Применение современных методов ЯМР.

1.3.2 Модернизация представления 1D 13С ЯМР-спектров: DEPT

1.3.3 Гомоядерная корреляционная спектроскопия: COSY.

1.3.4 Полная корреляционная спектроскопия: TOCSY.

1.3.5 Гетероядерная односвязная корреляционная спектроскопия: HMQC и HSQC.

1.3.6 Спектроскопия гетероядерной корреляции через несколько связей: НМВС.

1.3.7 Корреляции через пространство: ядерный эффект Оверхаузера и эксперимент NOESY

2 Теоретическая часть

2.1 Синтез псевдопептидов.

2.1.1 Изучение стадии восстановления защищенных дикарбоновых аминокислот.

2.1.2 Синтез псевдопептида Boc-L-Glu(7-OBzl)-^-GlyOAll.

2.1.3 Синтез псевдопептида BocGly-#-L-Glu(7-OBzl)OAll

2.1.4 Синтез псевдопептида Cbz-L-Glu(7-OtBu)-^(Ns)-i^His(Ns)OMe

2.1.5 Синтез защищенных псевдопептидов, содержащих остатки пролина.'1.49 /

2.2 Синтез мономеров 03 ПНК на основе псевдопептидов Glu-^-Gly и Gly-Ф-Glu.

2.3 ЯМР-эксперименты по доказательству структуры полностью защищенных мономеров 03 ПНК на основе псевдопептидов Gly-^-Glu и Glu-Ф-ау.

3 Экспериментальная часть

3.1 Синтез защищенных /3-аминоспиртов.

3.2 Синтез псевдопептида Glu^-Gly.

3.3 Синтез защищенного псевдопептида Gly-^-Glu.

3.4 Синтез защищенного псевдопептида Glu-^-His

3.5 Синтез защищенных псевдопептидов состава ProGly-^-Pro.

3.6 Синтез Cbz-защищенных цитозина и аденина.

3.7 Синтез мономеров 03 ПНК на основе псевдопептида Glu-^-Gly

3.8 Синтез мономеров 03 ПНК на основе псевдопептида Gly-^-Glu

Выводы

Создание аналогов природных пептидов, содержащих в своем составе восстановленную пептидную связь (Ф), представляет интерес с точки зрения изучения их взаимодействия с протеолитическими ферментами с целью применения данных пепти-домиметиков в медицине. В связи с изучением сигнальных пептидов мозга, особый интерес представляют псевдопептиды типа ProGly-Ф-Рго. Регулярное чередование пептидной и псевдопептидной связи является основой для другого важного класса аналогов биополимеров — пептидно-нуклеиновых кислот (ПНК). Такая модификация природной пептидной связи позволяет получать не подверженные биодеградации структуры, подобные НК, что в сочетании с аффинностью к олигонуклеотидам определяет их перспективность в различных областях биотехнологии.

Таким образом, является актуальной проблема поиска наиболее оптимального подхода к созданию псевдопептидной связи, а также рациональных способов де-риватизации псевдопептидов и синтез на их основе новых биологически активных соединений.

Результаты, полученные ранее в нашей лаборатории, позволяют говорить о высоком сродстве декамеров 03 ПНК с регулярной структурой, построенной из тимин-содержащих мономеров на основе псевдопептидов Glu-^-Gly и Gly-^-Glu, к комплементарным олигонуклеотидам, и о возможности управлять степенью этого сродства посредством изменения состава буферной среды [1]. Таким образом, актуальной становится задача препаративного получения уже синтезированных ранее мономеров для получения олигомеров 03 ПНК, а также разработка путей синтеза новых мономеров, содержащих остатки других нуклеиновых оснований.

1 Литературный обзор б

Пептидно-нуклеиновые кислоты активно изучаются последние два десятилетия. В частности, обширный обзор методов получения олигомеров ПНК, а также применения полученных олигомеров в различных областях биохимии, был опубликован менее года назад [1].

ПНК являются эффективными НК-миметиками, поэтому, если говорить об их потенциальных сферах применения, следует рассмотреть новые способы использования самих нуклеиновых кислот. Благодаря совместным наработкам в области нанотех-нологии и кристаллографии появился новый класс материалов, представляющих собой разнообразные дву- и трехмерные упорядоченные структуры, построенные из цепей ДНК. Пока еще рано говорить о реальном применении таких наноразмерных упорядоченных структур, однако исследования ведутся по многим направлениям, начиная от создания наноразмерных проводящих материалов, и заканчивая ДНК-компьютингом и нанороботами. Практически во всех подобных структурах задействованы короткие оцДНК последовательности, поэтому вполне вероятно, что ПНК, как и другие НК-миметики, могут служить им успешной альтернативой, привнося в результирующие структуры новые свойства.

С ростом сложности экспериментальной работы, а также увеличением производительности персональных компьютеров, в химии все чаще используются кванто-вомеханические ab initio вычисления, способные дать точную картину молекулярной структуры, реакционной способности, спин-спиновых взаимодействий и других свойств рассматриваемых веществ. Краткий обзор методов таких расчетов, а также некоторые результаты взаимодействия нуклеиновых оснований в составе НК и ПНК, приведен во второй части данного обзора.

Все более сложные структуры требуют новых методов их исследования. В последние десятилетия происходило развитие методов двумерной ЯМР-спектроскопии, что позволило изучать структуру органических молекул с крайне высокой точностью. Знание двумерных ЯМР-методов необходимо для современного исследователя и кратко изложено в заключительной части данного обзора.

Выводы

1. Разработан новый метод восстановления дикарбоновых си-аминокислот.

2. Впервые синтезированы два защищенных производных псевдопептида ProGly-Ф-Рго.

3. Впервые осуществлен синтез двух цитозинсодержащих мономеров 03 ПНК на основе псевдопептидов Glu^-Gly и Cly-vf-Glu.

4. Проведена оптимизация схемы синтеза полученных ранее двух тиминсодержа-щих мономеров 03 ПНК на основе псевдопептидов Glu^-Gly и Gly^-Glu и одного аденинсодержащего мономера 03 ПНК на основе псевдопептида Gly-Ф-Glu.

5. Проведен анализ структуры полученных по разработанной в ходе настоящей работы схеме тимин-, цитозинсодержащих мономеров 03 ПНК на основе псевдопептидов Glu^-Gly и Gly^-Glu, а также аденинсодержащего мономера 03 ПНК на основе псевдопептида Gly^-Glu с помощью методов двумерной ЯМР-спектроскопии, который показал однозначность структуры выделенных продуктов реакции алкилирования гетероциклических нуклеиновых оснований бромацильными производными защищенных псевдопептидов Glu^-Gly и Gly-Ф-Glu.

1. Боярская Н. П. Кандидатская диссертация. — М. — 2007.

2. Taubes G. Biophysics: Double Helix Does Chemistry at a Distance-But How? // Science. — 1997. — V. 275, N 5305. P. 1420-1421.

3. Porath D. Direct measurement of electrical transport through DNA molecules. // Nature. 2000. - V. 403. - P. 635-638.

4. Braun E., Eichen Y., Sivan U., Ben-Yoseph G. DNA-templated assembly and electrode attachment of a conducting silver wire. // Nature. — 1998. — V. 391. P. 775-778.

5. Kasumov A., Kociak M., GueronS., Reulet В., Volkov V., Klinov D., Bouchiat H. Proximity-Induced Superconductivity in DNA. // Science. — 2001. — V. 291. — P. 280-282.

6. Lee J. A cooperative conformational change in duplex DNA induced by Zn2+ and other divalent metal ions. // Biochem. Cell Biol. — 1993. — V. 71, NN 3-4. — P. 162-168.

7. Wettig S. D. M-DNA: a self-assembling, molecular wire for nanoelectronics and biosensing. //Anal. Sci. 2003. - V. 19. - P. 23-26.

8. Park S. H. Three-Helix Bundle DNA Tiles Self-Assemble into 2D Lattice or ID Templates for Silver Nanowires. // Nano Lett. — 2005. — V. 5, N 4. — P. 693-696.

9. Keren K., Krueger M., Gilad R., Ben-Yoseph G., Sivan U., Braun E. Sequence-Specific Molecular Lithography on Single DNA Molecules. // Science. — 2002. — V. 297. P. 72-75.

10. Keren К., Berman R., Buchstab E., Sivan U., Braun E. DNA-Templated Carbon Nanotube Field-Effect Transistor. // Science. — 2003. — V. 302. — P. 1380.

11. Alivisatos P. Colloidal quantum dots. From scaling laws to biological applications. // Pure Appl. Chem. 2000. - V. 72, N 1-2. - P. 3-9.

12. Mirkin C., Letsinger R., Mucic R., Storhoff J. A DNA-based method for rationally assembling nanoparticles into macroscopic materials. // Nature. — 1996. — V. 382.- P. 607-609.

13. Alivisatos A., Johnsson K., Peng X., Wilson Т., Loweth C., Bruchez M., Schultz P. Organization of 'nanocrystal molecules' using DNA. // Nature. — 1996. — V. 382.- P. 609-611.

14. Mucic R., Storhoff J., Mirkin C., Letsinger R. DNA-Directed Synthesis of Binary Nanoparticle Network Materials. // J. Am. Chem. Soc. — 1998. — V. 120. — P. 12674-12675.

15. Rosi N., Mirkin C. Nanostructures in Biodiagnostics. // Chem. Rev. — 2005. — V. 105. — P. 1547-1562.

16. Maeda Y. Two-dimensional assembly of gold nanoparticles with a DNA network template. // Appl. Phys. Lett. 2001. - V. 79, N 8. - P. 1181.

17. Mirkin C. Programming the Assembly of Two- and Three-Dimensional Architectures with DNA and Nanoscale Inorganic Building Blocks. // Inorg. Chem. — 2000. — V. 39, N 11. P. 2258-2272.

18. Li Y., Tseng Y., Kwon S., d'Espaux L., Scott Bunch J., McEuen P., Luo D. Controlled assembly of dendrimer-like DNA. // Nat. Mater. — 2004. — V. 3. — P. 38-42.

19. Ho Um S., Lee J., Park N., Kwon S., Umbach C., Luo D. Enzyme-catalysed assembly of DNA hydrogel. // Nat. Mater. 2006. - V. 5. - P. 797-801.

20. Seeman, N. C. Nucleic acid junctions and lattices. //J. Theor. Biol. — 1982. — V. 99, N 2. P. 237-247.

21. Seeman, N. С. New motifs in DNA nanotechnology. // Nanotechnology. — 1998. — V. 9. P. 257-273.

22. Chen J., Seeman N. Synthesis from DNA of a molecule with the connectivity of a cube. // Nature. 1991. - V. 350. - P. 631-633.

23. Zhang Y., Seeman N. The Construction of a DNA Truncated Octahedron. // J. Am. Chem. Soc. 1994. - V. 116. - P. 1661-1669.

24. Malo J., Mitchell J., Venien-Bryan C., Harris J., Wille H., Sherratt D., Turberfield A. Engineering a 2D Protein-DNA Crystal. // Angew. Chem. Int. Ed. — 2005. — V. 44, N 20. P. 3057-3061.

25. Li X., Yang X., Qi J., Seeman N. Antiparallel DNA Double Crossover Molecules As Components for Nanoconstruction. // J. Am. Chem. Soc. — 1996. — V. 118, N 26. P. 6131-6140.

26. Winfree E., Liu F., Wenzler L., Seeman N. Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals. // Nature. 1998. - V. 394. - P. 539-544.

27. Sha R., Liu F., Millar D., Seeman N. Atomic force microscopy of parallel DNA branched junction arrays. // Chem. Biol. — 2000. V. 7, N 9. - P. 743-751.

28. Seeman N. DNA Nicks and Nodes and Nanotechnology. // Nano. Lett. — 2001. — V. 1, N 1. P. 22-26.

29. LaBean Т., Yan H., Kopatsch J., Liu F., Winfree E., Reif J., Seeman N. Construction, Analysis, Ligation, and Self-Assembly of DNA Triple Crossover Complexes. // J. Am. Chem. Soc. 2000. - V. 122. - P. 1848-1860.

30. He Y., Tian Y., Chen Y., Deng Z., Ribbe A., Mao C. Sequence Symmetry as a Tool for Designing DNA Nanostructures. // Angew. Chem. Int. Ed. — 2005. — V. 44, N 41. — P. 6694-6696.

31. Mao, C. Signed Two-Dimensional DNA Holliday Junction Arrays Visualized by Atomic Force Microscopy. // J. Am. Chem. Soc. — 1999. — V. 121. P. 54375443.

32. Park S., Yin P., Liu Y., Reif J., LaBean Т., Yan H. Programmable DNA Self-Assemblies for Nanoscale Organization of Ligands and Proteins. // Nano Lett. —2005. V. 5, N 4. — P. 729-733.

33. Yan H., LaBean Т., Feng L., Reif J. Directed nucleation assembly of DNA tile complexes for barcode-patterned lattices. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2003.- V. 100, N 14. P. 8103-8108.

34. Shih W., Quispe J., Joyce G. A 1.7-kilobase single-stranded DNA that folds into a nanoscale octahedron. // Nature. — 2004. — V. 427. — P. 618-621.

35. Rothemund P. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. // Nature. —2006. V. 440. - P. 297-302.

36. Yang X., Liu В., Vologodskii A., Kemper В., Seeman N.C. Torsional Control of Double Stranded DNA Branch Migration. // Biopolymers. — 1998. — V. 45. — 69-83.

37. Yurke В., Turberfield A. J., Mills A. P., Simmel F. C., Neumann J. L. A DNA-fuelled molecular machine made of DNA. // Nature. — 2000. — V. 406, N 6796. — P. 605-608.

38. Shin, J. S., Pierce, N. A. A Synthetic DNA Walker for Molecular Transport. // J. Am. Chem. Soc. 2004. - V. 126, N 35. - P. 10834-10835.

39. Yin P., Yan H., Daniell X. G., Turberfield A. J., Reif J. H. A unidirectional DNA walker that moves autonomously along a track. // Angew. Chem. Int. Ed. — 2004.- V. 43, N 37. P. 4906-4911.

40. Tian Y., He Y., Chen Y., Yin P., Mao C. A DNAzyme that walks processively and autonomously along a one-dimensional track. // Angew. Chem. Int. Ed. — 2005. — V. 44, N 28. P. 4355-4358.

41. Kang J., Klenerman D., Zhou D., Liu D., Bruckbauer A., Abell C., Balasubramanian S. A Reversible pH-Driven DNA Nanoswitch Array. //J. Am. Chem. Soc. — 2006.- V. 128. — P. 2067-2071

42. Liedl Т., Olapinski M., Simmel F. С. A Surface-Bound DNA Switch Driven by a Chemical Oscillator. // Angew. Chem. Int. Ed. 2006. — V. 45, N 30. — P. 5007-5010.

43. Seela F., Budow S. pH-Dependent Assembly of DNA-Gold Nanoparticles Based on the i-Motif: A Switchable Device with the Potential of a Nanomachine. // Helv. Chim. Acta. 2006. - V. 89. - P. 1978-1980.

44. Dittmer W. U., Reuter A., Simmel F. C. A DNA-based machine that can cyclically bind and release thrombin. // Angew. Chem. Int. Ed. — 2004. — V. 43, N 27. — 3550-3553.

45. Stojanovic M. N., Kolpashchikov D. M. Modular Aptameric Sensors. //J. Am. Chem. Soc. 2004. — V. 126, N 30. - P. 9266-9270.

46. Simmel F. C. DNA Nanodevices: Prototypes and Applications. // Nanodevices for the Life Sciences, 1st edition, Kumar, C. S. S. R. (ed.) Wiley-VCH, Weinheim. — 2006. P. 89.

47. Foresman J., Frisch A. Exploring chemistry with electronic structure methods. 2nd edition. // Gaussian, Inc. — 1996. — P. 305.

48. Cheeseman J., Trucks G., Keith Т., Frisch M. A comparsion of models for calculating nuclear magnetic resonance shielding tensors. //J. Chem. Phys. — 1996. — V. 104. P. 5497-5503.

49. Tamulis A., Tamulis V., Graja A. Quantum mechanical modeling of self-assembly and photoinduced electron transfer in PNA based artificial living organism. // Journal of Nanoscience and Nanotechnology. — 2006. — V. 6. — P. 965-973.

50. Sponer J., Leszczynski J., Hobza P. Electronic Properties, Hydrogen Bonding, Stacking, and Cation Binding of DNA and RNA Bases. // Biopolymers. — 2001. — V. 61, N 1. P. 3-31.

51. Sponer J., Hobza P. Structure, energetics, and dynamics of the nucleic Acid base pairs: nonempirical ab initio calculations. // Chem. Rev. — 1999. — V. 99. — P. 3247-3276.

52. Hobza P., Sponer J., Reschel T. Density Functional Theory and Molecular Clusters. // J. Comput. Chem. 1995. - V. 16. - P. 1315-1325.

53. Sponer J., Leszczynski J., Hobza P. Base stacking in cytosine dimer. A comparison of correlated ab initio calculations with three empirical potential models and density functional theory calculations. //J. Comput. Chem. — 1996. — V, 17. — P. 841-850.

54. Sponer J., Hobza P. Sequence dependent intrinsic deformability of the DNA base amino groups. An ab initio quantum chemical analysis. // Theochem.—J. Mol. Struct. 1994. - V. 304. - P. 35-40.

55. Sponer J., Hobza P. Nonplanar Geometries of DNA Bases. Ab Initio Second-Order Mdler-Plesset Study. // J. Phys. Chem. 1994. - V. 98. - P. 3161-3164.

56. Kabelac M., Ryjacek F., Hobza P. Already Two Water Molecules Change Planar H-bonded Structure of the Adenine.Thymine Base Pair to the Stacked Ones: a Molecular Dynamics Simulation Study. // Phys. Chem. Chem. Phys. — 2000. — V. 2. P. 4906-4909.

57. Claridge T. High-resolution NMR techniques in organic chemistry. // Tetrahedron organic chemistry series. Editors: Baldwin J., Williams R. — 1999. — V. 19.-— P. 396.

58. Aue W., Bartholdi E., Ernst R. Two-dimensional spectroscopy. Application to nuclear magnetic resonance. // J. Chem. Phys. — 1976. — V. 64. — P. 2229-2246.

59. Braunschweiler L., Ernst R. Coherence Transfer by Isotropic Mixing: Application to Proton Correlation Spectroscopy. // J. Magn. Reson. — 1983. — V. 53. — P. 521-528.

60. Smith M., Claridge Т., Tranter G., Sansom M., Fleet G. Secondary structure in oligomers of carbohydrate amino acids. // Chem. Commun. — 1998. — V. 39. — P. 2041-2042.

61. Macura S., Huang Y., Suter D., Ernst R. Two-dimensional correlated spectroscopy (COSY) for measurement of 1H-1H spin-spin coupling constants. //J. Magn. Reson. 1981. - V. 43. - P. 259-281.

62. Mitsunobu O. The use of diethyl azodicarboxylate and triphenylphosphine in synthesis and transformation of natural products. //J. Synthesis. —1981. — V. 13, N 1. P. 1-29.

63. Guo Z., Xian M., Zhang W., McGill A., Wang P. G. N-Nitrosoanilines: a new class of caspase-3 inhibitors. // Bioorg. Med. Chem. 2001. - V. 9, N 2. - P. 99-106.

64. Rubini E., Gilon C., Selinger Z., Chorev M. Synthesis of isosteric methylene-oxy pseudopeptide analogues as novel amide bond surrogate units. // Tetrahedron — 1986. V. 42, N 21. - P. 6039-6045.

65. Ho M., Chung J., Tang N. A convenient synthesis of chiral N-Boc-amino ethers as potential peptide bond surrogate units. // Tetrahedron Lett. — 1993. — V. 34, N 41. P. 6513-6516.

66. Trotter N., Brimble M., Harris P., Callis D., Sieg F. Synthesis and neuroprotective activity of analogues of glycyl-L-prolyl-L-glutamic acid (GPE) modified at the a-carboxylic acid. // Bioorg. Med. Chem. 2005. - V. 13, N 2. - P. 501-517.

67. Sibrian-Vazquez M., Spivak D. Convenient synthesis of 3-(S)-amino-7-bytyrolactone. // Synlett. — 2002. N 7. — P. 1105-1106.

68. Truong V., Gauthier J., Boyd M., Roy В., Scheigetz J. Practical and efficient route to (S)-7-fluoroleucine. // Synlett. — 2005. N 8. - P. 1279-1280.

69. Caputo R., Cassano E., Longobardo L., Palumbo G. Chiral N-protected /3-iodamines from ct-aminoacids: a general synthesis. // Tetrahedron Lett. — 1995. — V. 36, N 1. P. 167-168.

70. Boyarskaya N., Prokhorov D., Kirillova Yu., Zvonkova E., Shvets V. Synthesis of protected pseudopeptides from dicarboxylic amino acids by Mitsunobu condensation. // Tetrahedron Lett. 2005. - V. 46, N 43. — P. 7359-7362.

71. Боярская H., Кириллова Ю., Прохоров Д., Стотлаид Е., Звонкова Е., Швец В. Синтез двух новых тиминсодержащих мономеров отрицательно заряженных ПНК. // Доклады Академии наук. 2006. - Т. 408, №1. - С. 55-58.

72. Мальцева Н., Хаин В. Борогидрид натрия // — М.: Наука. — 1985. — 207 с.

73. McKennon М., Meyers A. A convenient reduction of amino acids and their derivatives. //J. Org. Chem. 1993. - V. 58, N 13. - 3568-3571.

74. Falorni M., Porcheddu A., Taddei M. Mild reduction of carboxylic acids to alcohols using cyanuric chloride and sodium borohydride. // Tetrahedron Lett. — 1999. — V. 40, N 23. P. 4395-4396.

75. Kokotos G. A convenient One-Pot Conversion of N-Protected Amino Acids and Peptides into Alcohols. // Synthesis. 1990. - N 4. - P. 299-301.

76. Rodriguez M., Llinares M., Doulut S., Heitz A., Martinez J. A facile synthesis of chiral N-protected /З-amino alcohols. // Tetrahedron Lett. — 1991. — V. 32, N 7 — P. 923-926.

77. Haaima G., Lohse A., Buchardt 0., Nielsen P. E. Peptide Nucleic Acids (PNAs) containing Thymine monomers derived from chiral amino acids: hybridization and solubility properties of D-Lysine PNA. // J. Chem. Int. Ed. — 1996. V. 98, N 17.- P. 1939-1941.

78. Ашмарин И. П. Глипролины в составе регуляторных трипептидов. // Нейрохи-мия. 2007. - Т. 24, Но. 1. - С. 5-7.

79. Гершкович А. А., Кибирев В. К. Химический синтез пептидов. // Киев, Наукова думка, 1992. — 360 с.

80. Dueholm К., Egholm М., Buchardt О. An Efficient Synthesis of Boc-Aminoacetaldehyde and its Application to the • Synthesis of N-(2-Aminoethyl)Glycine Esters. // Organic Preparations And Procedures Int. — 1993. V. 25, N. 4. - P. 457-461.

81. Meltzer P., Liang A., Matsudaira P. Peptide Nucleic Acids: Synthesis of Thymine, Adenine, Guanine, and Cytosine Nucleobases. //J. Org. Chem. — 1995. — V. 60.- P. 4305-4308.

82. Nielsen P., Egholm M., Berg R., Buchardt O. Sequence selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide. // Science. — 1991.- V. 254. P. 1497-1500.