Синтез и изучение свойств хиральных пептидно-нуклеиновых кислот тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

ЛЬЯНОВ Махмуд Алиханович

СИНТЕЗ И ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ХИРАЛЬНЫХ ПЕПТИДНО-НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

02.00.10 - Биоорганическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 6 июн 2011

Москва-2011

4850497

Работа выполнена на кафедре биотехнологии и бионанотехнологии Московской Государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова.

Научный руководитель:

академик РАМН, доктор химических наук,

профессор

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, доцент кандидат химических наук

Швец Виталий Иванович

Чулин Владимир Викторович Зиневич Татьяна Витальевна

Ведущая организация: Учреждение Российской Академии Медицинских Наук Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе

Защита состоится «27» июня 2011 г. в 15-00 на заседании диссертационного совета Д 212.120.01 при Московской Государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова по адресу: 119571, г. Москва, проспект Вернадского, д. 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской Государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова.

С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте www.mitht.ni.

Автореферат разослан «27» мая 2011 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат химических наук,

старший научный сотрудник -чУ ¡/¿¿у-х

А.И. Лютик

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ*

Актуальность проблемы. Развитие геномных технологий открыло несколько новых направлений в диагностике и лечении болезней человека. В генетике привлечение молекулярной техники привело к возникновению новых методов для повышения специфичности, быстроты и достоверности диагностических и предсказательных ДНК-анализов. Основой большинства методов молекулярной биологии и диагностики служит связывание молекулы зонда с комплементарным участком нуклеиновой кислоты - «мишенью». В этом ключе, разработка аналогов и миметиков нуклеиновых кислот становится важным направлением вследствие использования этих новых биомаркеров в генетической диагностике и исследованиях генома.

Радикальная замена сахаро-фосфатного остова в структуре ДНК на псевдопептидный, построенный из повторяющихся единиц М-(2-амино-этил)глицина (aeg), была положена в основу создания полиамидных ДНК-миметиков - пептидно-нуклеиновых кислот («классические», aeg-ПНК) (Р. Nielsen et al., 1991). Проведенные исследования показали, что ПНК проявляют высокую химическую и биологическую стабильность. Благодаря способности образовывать высокопрочные дуплексы, триплексы и квадруплексы с комплементарными последовательностями, они нашли свое применение в технологии биосенсоров и микрочипов, систем для селективного расщепления нуклеиновых кислот, определения генетических мутаций и др. Однако, «классические» ПНК имеют ряд недостатков: они обладают слабой проникающей способностью через мембраны и плохой растворимостью в воде, что

* В руководстве работой принимала участие к.х.н., доц. Кириллова Ю.Г.

Список используемых сокращений: aeg - ¡Ч-(2-аминоэтил)глицин; АН - аллил; Вое - пгрет-бутилоксикарбонил; Bzl - бензил; Cbz - бензилоксикарбонил; DEAD - диэтилазодикарбокси-лат; DIEA - диизопропилэтиламин; DMF - диметилформамид; DMS - диметилсульфид; HBTU - гексафторфосфат 0-(бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония; NMM - N-метилморфо-лин; oNBS - o/wjo-нитробензолсульфонилхлорид; Ру - пиридин; TEA - триэтиламин; TFA -трифторуксусная кислота; THF - тетрагидрофуран; НК - нуклеиновая кислота; ПНК -пептидно-нуклеиновая кислота; ПАНКМ - полиамидные миметики нуклеиновых кислот.

ограничивает их использование in vivo, а также не подвергаются действию ферментов нуклеаз и протеаз.

В настоящее время проводятся исследования по синтезу и изучению свойств хиральных полиамидных миметиков нуклеиновых кислот (ПАНКМ), содержащих различные заместители в а- и у-положениях псевдопептидного фрагмента. Было показано, что введение заместителей различного строения способствует лучшей растворимости ПАНКМ, их прохождению через клеточную и ядерную мембраны, а также определяет направление закручивания спирали олигомера и гибридизационные свойства при связывании с природными нуклеиновыми кислотами. Олигомеры ПАНКМ, построенные из у-замещенных мономеров, образуют (по данным КД- и ЯМР-спектроскопии) правозакрученные спирали и способны к более прочному и селективному связыванию с комплементарными участками нуклеиновых кислот по сравнению с а-ПАНКМ и «классическими» незаряженными ахиральными aeg-ПНК (D.H. Ly et al.). Еще одно интересное свойство одноцепочечных у-замещенных ПАНКМ - это их способность к вытеснению из дуплекса ДНК одной из цепей. Эти свойства представляют собой огромный интерес из-за потенциального использования в генной терапии, в качестве молекулярных инструментов в ДНК-диагностике, геномике и биотехнологии.

На кафедре биотехнологии и бионанотехнологии МИТХТ им. М.В. Ломоносова проводится систематическое изучение модификаций нуклеиновых кислот - хиральных отрицательно заряженных (03) ПАНКМ и незаряженных а- и у-ПАНКМ. В частности, были синтезированы в препаративных количествах и полностью охарактеризованы четыре тиминсодержащих мономера 03-ПАНКМ, а также два новых тиминсодержащих декамера 03-ПАНКМ на основе L-глутаминовой кислоты и глицина. При этом была продемонстрирована высокая аффинность 03-ПАНКМ к природным комплементарным олигомерам ДНК, а также зависимость устойчивости полученных дуплексов 03-ПАНКМ:ДНК от ионной силы раствора (Н.П. Боярская, 2007).

В этой связи актуальной является разработка универсальных технологичных методов синтеза хиральных а- и у-замещенных ПАНКМ. С одной стороны, эти методы синтеза должны обеспечивать высокую эффективность и региоселективность процессов, с другой стороны, стратегия и тактика применяемых временных и постоянных защитных групп, а также выбранные методы конденсации должны обеспечивать отсутствие рацемизации в процессе синтеза.

Работа является частью плановых научных исследований, проводимых на кафедре биотехнологии и бионанотехнологии МИТХТ им. М. В. Ломоносова в рамках госбюджетной темы 1Б-5-356 «Исследование липидов, нуклеозидов, пептидов, ретиноидов методами биотехнологии и химического синтеза с целью создания препаратов медицинского назначения (онкологические и вирусные болезни, возрастные паталогии)», по грантам РФФИ 09-04-01026а, НШ-903-2008.4, гранту Президента РФ для поддержки ведущих научных школ, государственному контракту № 14.740.11.0634

Цель настоящего исследования заключалась в разработке универсального синтетического подхода к синтезу хиральных мономеров полиамидных миметиков нуклеиновых кислот различного строения, содержащих все четыре природных гетероциклических основания.

Основными задачами настоящего исследования явились:

1. Разработка оригинальных универсальных схем синтеза хиральных мономеров а- и у-замещенных полиамидных миметиков нуклеиновых кислот на основе ¿-аланина и глицина.

2. Препаративный синтез хиральных незаряженных мономеров а- и у-замещенных ПАНКМ, содержащих все 4 природных гетероциклических основания.

3. Доказательство структуры синтезированных хиральных мономеров а- и у-замещенных ПАНКМ, на основе псевдопептидов ауц/А1а и А1ау/Ыу, в том числе с использованием двумерной ЯМР-спектроскопии.

4. Разработка подходов к определению оптической чистоты синтезированных мономеров.

Научная новизна работы

В результате проведенной работы разработан и оптимизирован эффективный способ получения незаряженных хиральных мономеров ПАНКМ.

Впервые синтезированы Ade012-, Cytcbz-, Gua0Bzl-, Gua0Bz1' СЪг-содержащие мономеры на основе Alaij/Gly и Gua0Bzl-, Gua0Bz1' СЬг-содержащис мономеры на основе Glyy/Ala.

Полностью охарактеризованы восемь мономеров, а также изучена региоселективность реакции алкилирования нуклеиновых оснований (тимина, цитозина, аденина и гуанина) бромацилированными псевдопептидами GlyyAla и Alay/Gly методами двумерной ЯМР-спектроскопии. Разработаны подходы к определению оптической чистоты мономеров ПАНКМ с использованием ВЭЖХ.

Практическая ценность работы

Осуществлены препаративные синтезы тимин-, цитозин-, аденин- и гуанинсодержащих мономеров на основе псевдопептидов GlyyAla и AlayGly.

Отработаны оптимальные условия алкилирования защищенных гетероциклических оснований бромацильными производными псевдопептидов Glyy/Ala и A!ai//Gly, показана воспроизводимость методов.

Доказана региоселективность реакции алкилирования по Ni-положению пиримидиновых и ^-положению пуриновых нуклеиновых оснований методами ЯМР-спектроскопии.

Реализован метод определения энантиомерной чистоты хиральных мономеров через С-концевые диастереомерные производные.

Результаты фундаментальных исследований, полученные в настоящей работе могут быть использованы для получения, подтверждения структуры методами двумерной ЯМР-спектроскопии и оценки энантиомерной чистоты любых хиральных ациклических и циклических мономеров ПАНКМ, пептидов, псевдопептидов, нуклеозидов,пептидных антибиотков.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Оптимизация схемы получения незаряженных хиральных мономеров ПАНКМ на основе псевдопептидов Glyy/Ala и Alay/Gly.

2. Препаративный синтез тимин-, цитозин-, аденин- и гуанинсодержащих мономеров на основе псевдопептидов Glyy/Ala и Alay/Gly.

3. Подтверждение структуры полученных мономеров, в том числе методами двумерной ЯМР-спектроскопии.

4. Разработка подходов к определению оптической частоты мономеров ПАНКМ.

Публикации и апробация работы

По материалам диссертационной работы опубликовано 2 статьи и 3 тезисов на Всероссийских и международных конференциях. Результаты настоящего исследования были представлены на X Всероссийской выставке научно-технического творчества молодежи (2010, Москва), пятом Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (2009), Научно-технической конференции молодых ученых МИТХТ им. М.В. Ломоносова «Наукоемкие химические технологии-2009» (Москва, 2009).

Структура диссертации и объем работы

Диссертация изложена на 1 hO страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, посвященного свойствам различных модификаций полиамидных миметиков нуклеиновых кислот, их применению в различных областях молекулярной биологии, диагностике и медицине, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы, включающего Ibb источника. Диссертация иллюстрирована 4«L рисунками и содержит схем и tb таблиц.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

По своей функции «классические» ПНК (Р. Nielsen, 1991) являются миметиками нуклеиновых кислот (рис. 1А), а по структуре представляют собой олигомеры на основе Ы-(2-аминоэтил)глицина с присоединенными через карбоксиметильный спейсер нуклеиновыми основаниями (рис. 1Б).

В настоящее время были предложены два главных направления модификации структуры ае§-ПАНКМ: модификация оснований и модификация полиамидного скелета. Базовый скелет ае§-ПАНКМ служит основой для конструирования новых соединений с использованием концепции «преорганизации», т.е. способности принимать конформацию, которая наиболее подходит для связывания ДНК и минимизирует потерю энтропии в процессе связывания. Преорганизация достигается либо циклизацией скелета aeg-ПAHKM (в аминоэтильной части или в глициновой части), либо добавлением заместителей в С2- или С5-положения, что главным образом влияет на способность ПАНКМ образовывать право- и левозакрученные спирали, в соответствии с конфигурацией вновь возникшего асимметрического центра. Таким образом, конфигурация хирального центра определяет направление закручивания спирали, что в свою очередь воздействует на стабильность ПАНКМ:ДНК-дуплекса.

В данной работе реализована общая схема синтеза хиральных мономеров а- и у-метилзамещенных полиамидных миметиков нуклеиновых кислот (рис. 1В и 1Г), а также получены тиминовые, адениновые, цитозиновые и гуаниновые мономеры на основе псевдопептидов ауу/А1а и А1ау/С1у.

Рис. 1. Структура ДНК (А), «классических» (ае§) (Б), хиральных ПАНКМ с заместителем в а-положении (В) и в у-положении (Г) псевдопептидного остова.

1. Синтез псевдопептидов

Ключевыми интермедиатами в синтезе как а-, так и у-метилсодержащих мономеров ПАНКМ являются оЫВБ-защищенные псевдопептиды 11, 12 и 13,

/

А

Б

В

Г

которые были получены конденсацией по Мицунобу (схема 1, табл. 1) из соответствующих спиртовых и кислотных компонент.

ВосНМ

он

ВосНМ

ш МаВН,,

УС1/

он

он

1 ЭОС^ Ву 2а П Вос20 / 2Ь

Вос20

ВосНЫ

ОАП

К 4а 4Ь

ОМе

СЯ3СООН о *

Н2М

Я

N85-01 ТЕА

Схема 1

ывв о

0Я3

ОАП Й 5а 5Ь

пеав, ВосНМ ^^./'- ОРз ривн,

РРЬг Т 1 П *гСОз

^ МВБ й

ТНР

СН3СМ

1*2

8,9,10

11,12,13

"1 О

14,15,16

Таблица 1. Выходы реакций на стадии синтеза псевдопептидных интермедиатов.

Схема 1 Я,=Н; Я2=СН3; К3=АИ Я1=СН3; Кл=Н; Я,=Ме Я1=СН,; К2=Н; Я3=Л11

№ соединения 11 15 12 14 13 16

Выход, % 77 52 85 50 70 75

Спиртовую компоненту 7 (111=СНз) синтезировали в три стадии из 1-аланина 2Ь: 1) синтез метилового эфира 1-аланина; 2) введение Вос-группы в качестве защиты аминофункции; 3) восстановление полученного сложного эфира 3 до спирта 7 действием боргидрида натрия в присутствии безводного хлорида лития. Общий выход составил 78%. Другую спиртовую компоненту 6 (Я|=Н) получали из этаноламина 1 с выходом 90%.

Был осуществлен синтез трех кислотных компонент 8, 9 и 10, две из которых были получены из глицина (Я2=Н) (8, 10) и одна из /,-аланина (К2=СН3) (9). Аллилзащищенные производные 9 и 10 получали в четыре стадии: 1) Вос-защита аминогруппы; 2) введение аллильной защитной группы действием аллилбромида в присутствии карбоната цезия в БМБ; 3) удаление Вос-группы с М-конца; 4)

введение oNBS-группы. Общий выход составил 65% для соединения 10 и 59% для соединения 9. Метиловый эфир vV-NBS-глицина 8 был синтезирован в две стадии, с общим выходом 85% в расчете на исходный глицин. Полностью защищенный псевдопептид 11, содержащий метальный радикал в а-положении, был получен реакцей Мицунобу из спирта 7 и кислотной компоненты 9. В случае у-замещенных производных было получено два псевдопептида 12 и 13 из спирта 6 и кислотных компонент 8 и 10, содержащих метальную и аллильную защитные группы соответственно (выходы приведены в табл. 1).

Реакцию Мицунобу проводили в стандартных условиях с использованием DEAD и PPh3 в абсолютном THF (при 0°С в атмосфере инертного газа). С помощью тонкослойной хроматографии было установлено, что практически полная конверсия производных аминокислот происходит через 4-5 ч. Трифенилфосфиноксид, образующийся в ходе реакции, удаляли кристаллизацией в безводном диэтиловом эфире при 4°С. oNBS-замещенные псевдопептиды 11,12, и 13 выделяли с помощью колоночной хроматографии.

Для удаления орто-нитробензолсульфонилыюй группы в производных 11, 12 и 13 использовали пятикратный избыток тиофенола и двухкратный избыток К2СО3 в ацетонитриле; реакция протекала в течение 6 ч. Выходы соединений 1416 приведены в табл. 1, структуру данных соединений подтверждали с помощью 1Н-ЯМР-спектров.

2. Синтез а-метилсодержащих мономеров ПАНКМ

Псевдопептид с открытой вторичной аминогруппой 15 вводили в реакцию ацилирования с тимин-1-ил-уксусной кислотой 17а (схема 2), полученную алкилированием тимина хлоруксусной кислотой. Конденсацию тимин-1-илуксусной кислоты 17а с производным 15 проводили аналогично схеме синтеза отрицательно заряженных ПАНКМ (Н.П. Боярская, 2007), используя два метода: смешанных ангидридов и карбодиимидный. В результате исследований в качестве наиболее оптимального подхода к созданию амидной связи между псевдопептидным фрагментом и производным тимина нами был выбран карбодиимидный метод конденсации с использованием 1-[3-

(диметиламино)пропил]-3-этилкарбодиимида гидрохлорида (ЕОС*НС1) как конденсирующего агента с нуклеофильной добавкой 3-гидроксо-4-оксо-3,4-дигндро-1,2,3-бензотриазином (БЬЬЮН) (схема 2). Активация карбоксильной группы проходила в течение 30 мин, после чего вводили вторичный амин. Реакция протекала в течение 5 ч при 40°С с полной конверсией, выход составил 96%. Производное 18а выделяли, используя колоночную хроматографию. Выходы на данной стадии были намного выше по сравнению с методом конденсации на основе смешанных ангидридов (56%).

Удаление аллильной защиты с карбоксильной группы в соединении 18а проводилось в мягких нейтральных условиях с помощью палладиевого комплекса - тетракис(трифенилфосфин)палладия [Рс1(РРЬз)4] в морфолине (5. Епес1псЬ-ВосИпШскек е/ а1.,1989). Реакция протекала в ТНР в атмосфере инертного газа при комнатной температуре. Целевой тиминовый мономер 19а выделяли колоночной хроматографией, структуру подтверждали 'Н-ЯМР-спектроскопией.

Данная схема синтеза тиминсодержащего мономера оказалась неприемлемой для СЬг-цитозина и СЬг-аденипа из-за низкого выхода (не более 10%) на стадии конденсации псевдопептида с карбоксиметилированными производными СЪг-цитозина и СЬг-аденина.

Схема 2

19а

Другая стратегия синтеза, разработанная для получения отрицательно-заряженных мономеров ПАНКМ (А.В Баранов, 2008), предполагала 14-алкилирование защищенных гетероциклических оснований бромацильными

производными псевдопептидов. Синтез защищенных гетероциклических оснований представлен на схеме 3. Блокирование экзоциклической аминогруппы цитозина осуществляли действием бензилоксикарбонилхлорида (Cbz-Cl) в пиридине с выходом 54% (соединение 17Ь). Экзоциклическую аминогруппу аденина блокировали действием Cbz-Cl в диметилформамиде, выход соединения 17с составил 48%. Для защиты экзоциклического кислорода гуанина использовали Bzl-группу, которая устойчива как в условиях, использующихся в ходе получения мономера, так и в ходе последующего твердофазного синтеза олигомерной последовательности (в частности, в условиях удаления Вос-защиты). Ее введение осуществляли реакцией бензилата натрия с 2-амино-6-хлорпурином с выходом 47% (соединение 17d). Введение Cbz-группы на экзоциклическую аминогруппу гуанина осуществляли реакцией Об-бензилгуанина с Cbz-Cl в присутствии гидрида натрия с выходом 50%. Необходимость введения Cbz-защитной группы на экзоциклическую аминогруппу гуанина продиктована тем соображением, что описанные ранее протоколы твердофазного синтеза олигомеров после введения в олигомерную цепь гуанинсодержащего мономера требуют для проведения кэпирования незащищенной экзоциклической аминогруппы реагента Раппопорта, тогда как в случае использования дизащищенного производного гуанина 17е, возможно использование более простого кэпирующего реагента - уксусного ангидрида. Структуру соединений 17Ь-17е подтверждали данными 'Н-ЯМР-спектроскопии, а также элементным анализом.

Псевдопептид с открытой вторичной аминогруппой 15 вводили в реакцию ацилирования с бромацетилбромидом в присутствии TEA (схема 4). Бромацилыюе производное 20 выделяли с помощью колоночной хроматографии, выход составил 73%. Алкилирование нуклеиновых оснований бромацильным производным 20 проводили в присутствии карбоната цезия (в случае Cbz-цитозина) и гидрида натрия (в случае Cbz-аденина, OBzl-гуанина). Полностью защищенные мономеры 18b, 18с, 18d были очищены с использованием колоночной хроматографии, выходы составили 51, 41, 49% соответственно.

Структуру данных защищенных мономеров подтверждали методами двумерной ЯМР-спектроскопии.

Схема 3

NH2 NHCbz NH2 Cbrci NHCbz

CbzCI i I NaH

¡Ao 54% VS, ЧА/ ЧА/

17b 17c

CI BzlOH

А. м NaH dmf

Н2м ^ Н 47% Н2М ™ н йи"Л СЬгНМ' N Д

Л7Л 17е

Удаление аллильной защиты с карбоксильной группы в соединениях 18Ь, 18с и 18(1 проводили, используя палладиевый комплекс [Рс1(РРЬз)4] в присутствии 14-этиланилина. Выходы целевых продуктов 19Ь, 19с, 19(1 составили 73, 41 и 50% соответственно.

Схема 4

Вг

Y V

О В,

N. OAII _NaH

TEA, B°CHN I DMF

ch2CI2 20

В В

L^O [Pd(PPh3)J

[ II N-этиланилин, THF (

°0

BocHN ^^ ^Г ^^ BocHN ^^

(18b) B=CCM (19b) B=Ccl"

(18c) B=Adecta (19c) B=Adecb»

(18d) B=G°Bzl (19d) B=GoSzi

3. Синтез у-метилсодержащих мономеров ПАНКМ

Ранее реализованный в нашей лаборатории подход для получения хиральных мономеров, содержащих карбоксиэтильный или метальный заместители в а-

положении, путем алкилирования защищенного гетероциклического основания бромацильным псевдопептидным производным послужил основой для синтеза у-метилзамещенных ПАНКМ.

При синтезе ае§-ПНК для защиты С-конца используются как аллильная, так и метальная защитные группы, причем использование второй предпочтительнее из-за ее относительно более низкой стоимости. Однако, в случае синтеза а-замещенных ПАНКМ использование метальной или этильной защитных групп недопустимо, поскольку в условиях их удаления происходит рацемизация по а-положению аминокислотного остатка и продукт теряет свою оптическую активность, что неприемлемо в случае с хиральными ПАНКМ. Также метальная защитная группа нецелесообразна в случае синтеза отрицательно заряженных ПАНКМ, получаемых на основе ¿-Ии, как а-, так и у-ПАНКМ, из-за неустойчивости бензильной защитной группы, вводимой в качестве постоянной в боковой радикал.

На данном этапе работы мы осуществили получение цитозинового мономера у-метилзамещенных ПАНКМ с использованием для защиты С-конца как аллильной, так и метальной групп (схема 5, табл. 2), с последующим доказательством идентичности углов оптического вращения продуктов, полученных в ходе удаления этих защитных групп,

Псевдопептиды с открытой вторичной амногруппой 14 (Я=А11) и 16 (Я=Ме) вводили в реакцию ацилирования с бромацетилбромидом в присутствии ТЕА.

Бромацильные производные 21 и 22 выделяли с помощью колоночной хроматографии, выходы составили 73 и 85% соответственно. Алкилирование СЬг-защищенного цитозина 17Ь бромацильными производными 21 и 22 проводили по схеме, аналогичной для а-замещенных мономеров ПАНКМ. Защищенные мономеры 23 и 24 были очищены с использованием колоночной хроматографии, выходы реакций приведены в табл. 2. Метальная защитная группа в соединение 24 удалялась в щелочных условиях в смеси 30 мл ЕЮН/Н^О (1:2), содержащей 1 мл 2М №ОН. Конечный продукт 29 выделяли с помощью колоночной хроматографии, общий выход продукта составил 27%. Удаление аллильной

защиты с карбоксильной группы в соединении 23 проводили по ранее описанным методикам, общий выход продукта 29 при этом составил 26%. Целевой мономер 29 был охарактеризован методом 'Н-ЯМР-спектроскопии. Также были определены углы оптического вращения, которые оказались одинаковы в случае цитозинсодержащего мономера при использовании обоих методов удаления С-концевых защитных групп и равны 4 .

Схема 5

23-28 29 В=ССЬг

30 В=ТЬу

31 В=Ас1еСЬ1

32 В=С0Вг|

Таблица 2. Выходы реакций на стадии синтеза у-метилсодержащих мономеров ПАНКМ.

№ соединения 23 24 25 26 27 28

В= ТИу ТЪу Айесьг

АН Ме Ме АН Ме Ме

Выход, % 64 50 30 87 67 52

На основе этих экспериментальных данных можно с уверенностью утверждать, что использование метальной защитной группы в ходе синтеза не оказывает влияния на оптическую чистоту мономеров. Ее использование является более предпочтительным, чем аллильной защиты, вследствие более низкой

стоимости и меньшего количества стадий, необходимых для блокирования карбоксильной группы.

Далее нами был проведен синтез целевых мономеров 30, 31 и 32 через алкилирование бромацильным производным 22 (Я=Ме) тимина, СЬг-защищенного аденина 17с и ОЕЫ-гуанина 17(1 (выходы соединений 25, 27, 28 приведены в табл. 2) с последующим удалением метальной защитной группы в указанных соединениях. Кроме того, ранее нами был синтезирован у-замещенный тиминовый мономер 30, который получали аналогично а-замещенному тиминовому мономеру 18а, вводя псевдопептид 16 (Я=А11) в реакцию ацилирования с тимин-1-ил-уксусной кислотой 17а. Полностью защищенный мономер 26 выделяли, используя колоночную хроматографию, с выходом 87%. Удаление аллильной защиты проводили по описанным ранее методикам. Структуру защищенных мономеров 23-28 подтверждали методами двумерной ЯМР-спектроскопии.

Таким образом, алкилирование защищенных гетероциклических оснований бромацильными псевдопептидными производными, оказалось универсальным подходом, позволяющим эффективно получать как а-, так и у-замещенные хиральные мономеры ПАНКМ.

4. ЯМР-эксперименты по доказательству структуры полностью защищенных мономеров а- и у-ПАНКМ (18а-18Ь, 24, 25, 27,28)

Для подтверждения структуры полностью защищенных мономеров хиральных а- и у-ПАНКМ 18а-18Ь, 24, 25, 27, 28, полученных алкилированием производных нуклеиновых оснований 17а-17<1 бромацильными производными 14, 15,16, данных одномерных 'Н- и 13С-ЯМР-спектров недостаточно. Поэтому были проведены ЯМР-эксперименты по соотнесению сигналов ядер 13С и 'Н в вышеуказанных мономерах, на основе псевдопептидов А1а-¥-Оу и С1у-Ч/-А1а с привлечением двумерных методик 'Н/'Н-спектров СОБУ, 13С/'Н-спектров НБ(ЗС, показывающих ближние взаимодействия ядер атомов, и -спектров НМВС, основанных на дальних взаимодействиях. Спектры регистрировали в дейтерированном ацетоне при 303К на приборе Вгикег АУАИСЕ-бОО с рабочей

частотой 150.92 МГц для ядер 13С и 600.13 МГц для ядер 'Н. В качестве реперных использовали сигналы ядер 13С, входящих в состав полностью защищенных мономеров а- и у-ПАНКМ защитных групп (Вое, Cbz, Bzl) и гетероциклических нуклеиновых оснований (Thy, Cyt, Ade, Gua).

Анализ спектров а-ПАНКМ

Структура мономеров была условна разделена на фрагменты, соответствующие гетероциклу (Thy, Cytcbz, Adecbz, Gua0Bzl), карбоксиметильному остатку (СМ), псевдопептиду (РР) и защитным группам - аллильной (ОА11), метальной (ОМе) и язре/и-бутилоксикарбонильной (Вое). Углеродные атомы каждого из фрагментов были пронумерованы согласно рис. 2. Расшифровка спектров позволила отнести все сигналы 'Н- и 13С-ЯМР-спектров. Данные представлены в табл. 3.

Рис. 2. Нумерация атомов псевдопептидного фрагмента в мономерах а-ПАНКМ 18а-18<1

на основе псевдопептидов &у-Ч/-А1а. Таблица 3. Данные 13С-ЯМР-спектров (8, м. д).

№ Het. CM 1 CM 2 All 1 All 2 All 3 PP 1 PP 2 PP 2-Me PP 4 PP 5 Boc 1 Boc 2 Boc 3

18а Thy 167.9 48.1 65.2 132.6 117.7 170.8 55.6 14.01 39.4/ 46.2 39.4/ 46.2 155.9 78.4 27.71

18b Cyt02 167.0 49.9 65.17 132.6 117.9 170.7 55.56 14.12 39.47 /46.34 46.34 /39.47 156.0 78.31 2 27.70

18с Adecbz 166.3 44.51 65.18 136.5 117.2 170.6 55.82 14.02 5 39.5/ 46.62 39.5/ 46.62 156.1 78.48 27.75

18d qOBZ! 166.7 43.52 65.15 132.5 117.1 170.7 55.74 14.07 39.6/ 46.51 39.6/ 46.51 156.0 78.48 27.75

Структуру пиримидиновых мономеров 18а и 18Ь подтверждали наличием в НМВС-ЯМР-спектре (рис. 3) корреляций 2H-(2CM)-C6-(Het), 2H-(2CM)-C2-(Het)

и 2H-(2CM)-C5-(Het). Структуру пуриновых мономеров 18с и 18d подтверждали наличием в НМВС-ЯМР спектре корреляций 2H-(CM)-C8-(Het) и 2H-(2CM)-C4-(Het).

| C6-W Thy a Л ill C2CM-2H I . .Al A

CSThy - 0 ti Ш »1 t « » -11c

"íV -12c

• 9 ■ - 4; -13c

CB-Thy • с^с>* jcí-cm - «

C2-Thy - - 15c

C4Thy - 16c

C1CM C1PP -17c -pires"

1 1 1 1 i ■ 1 1 1 i ■ 1 1 1 i ■ ■ ■ ■ i ' ■ ' ■ i ' ' ' ' i 7.С0 6.53 60С 5.50 5СС 450

OOTÜÍ21

Рис. 3. Фрагмент НМВС-спектра полностью защищенного тиминсодержащего мономера а-ПАНКМ 18а на основе псевдопептида &у-Ч/-А1а.

Анализ спектров у-ПАНКМ

ЯМР-эксперименты по соотнесению сигналов ядер |3С и 'н были проведены для полностью защищенных мономеров у-ПАНКМ 24 и 27 на основе псевдопептидов АЬ-Ч'-ау. Структура мономеров была условна разделена на фрагменты, аналогично фрагментам а-ПАНКМ. Углеродные атомы каждого из фрагментов были пронумерованы согласно рис. 4. Расшифровка спектров позволила отнести все сигналы *Н- и 13С-ЯМР-спектров. Данные представлены в табл. 4.

см-< ¥е<

Рис. 4. Нумерация атомов псевдопептидного фрагмента в мономерах у-ПАНКМ, 25,27, 28 на основе псевдопептида Ala- f-Gly.

№> Het. CM-I CM-2 Vfe-1 PP-1 PP-2 PP-4 PP-5 PP5-Me Boc 1 Boc г Boc !

25 Hiy 167.55 47.8 51.35 169.84 47.9 52.8 45.09 17.34 155.54 78.3 27.75

24 Cytcbz 169.81 48.01 51.2 168.41 49.53 53.11 45.04 17.42 156.00 78.312 27.74

27 AdcU2 166.87 43.79 51.24 169.34 48.03 53.26 44.91 17.41 155.66 78.38 27.72

28 ^jUBzi 167.55 43.56 51.41 169.64 48.1 53.05 44.9 17.42 155.57 78.43 27.73

CS-Ade

CS-Ade

CS-Ade

CA-Ade

2H-CM2

-i-iU-i

-Hon'

Щ

.« «I»

1 I 1 ' 1 ' I '

900 650

PDm (52)

5 00

1 1 I '

700

'' I '

600

1 I 1 1 1 1

55С

Рис. 5. Фрагмент НМВС-спектра полностью защищенного аденинсодержащего мономера у-ПАНКМ 27 на основе псевдопептида Ala- f-Gly.

Структуру цитозинового мономера 24 подтверждали наличием в НМВС-ЯМР-спектре корреляций 2H-2CM-C6-Het, 2H-2CM-C2-Het и 2H-2CM-C5-Het. Структуру аденинового мономера 27 подтверждали наличием в НМВС-ЯМР-спектре (рис. 5) корреляций 2H-2CM-C8-Het и 2H-2CM-C4-Het. Корреляция 2Н-2CM-C5-Het на этом спектре не проявляется, что позволяет судить об отсутствии в образце изомерного целевому соединению продукта алкилирования бромацилированным псевдопептидом Ade01" по положению N-7. Также с

использованием двумерных методик 'Н/'Н-спектров COSY, |3С/1Н-спектров HSQC, показывающих ближние взаимодействия ядер атомов, и 13С/'Н-спектров НМВС, основанных на дальних взаимодействиях, было сделано подтверждение структуры полностью защищенных тиминового 25 и гуанинового 28 мономеров у-ПАНКМ.

Таким образом, данные спектральных характеристик дают исчерпывающие доказательства структуры а- и у-замещенных мономеров ПАНКМ и региоселективности реакции алкилирования по Ni-положению пиримидиновых и Ыд-положепию пуриновых оснований.

5. Разработка теста для определения оптической чистоты мономеров ПАНКМ

Из опубликованных ранее источников известно, что конфигурация оптических центров хиральных миметиков нуклеиновых кислот напрямую определяет их физико-химические свойства и биохимическое поведение (направление закручивания спирали, стабильность образуемых комплексов с нуклеиновыми кислотами и др.) {Chandrasekhar et al., 2001).

В этой связи, актуальной задачей является разработка новых методов для оценки и контроля оптических чистоты мономеров и олигомеров ПАНКМ.

Первоначально нами были предложен подход, основанный на использовании ВЭЖХ в сочетании с хиральным сорбентом на основе иммобилизованного антибиотика - эремомицина, который обладает высокой энантиоселективностью по отношению к модифицированным а- и ß-аминокислотам и их производным (МЛ. Кузнецов, 2008).

В ходе исследования был осуществлен дополнительный синтез восьми а-замещенных мономеров ПАНКМ с использованием четырех природных нуклеиновых оснований на основе рацемических аминокислот (DL-Glu и DL-Ala) (рис. 6). Синтез данных рацематов осуществляли по разработанной нами общей стратегии, используемой для получения хиральных мономеров ПАНКМ (А.В Баранов, 2008).

Все полученные соединения были охарактеризованы с использованием 'Н-ЯМР-спектроскопии, их хроматографическая подвижность по данным ТСХ совпадала с подвижностью аналогичных ¿-мономеров.

Следующий этап исследования заключался в определении селективности выбранного сорбента в отношении синтезированных нами соединений 19а-с1; ЗЗа-(1. В результате оптимизации условий хроматографирования, наиболее подходящим для разделения энантиомеров элюентом оказалась система: 0.02 М ацетат аммония в смеси метанол-вода, 9 : 1, рН 3.4.

BocHN

В

V°o

№□ R

19aD-CH3D 19bD-CH30 19cG-CH3D 19dD-CH3D

□ В

т

Ccbz Acbz

qOBZI

OH

R

33 a □ -CH2CH2COOBzl □ T 33b □ -CH2CH2COOBzl □ Ccb2 33 c □ -CH2CH2COOBzl □ Acbz 33d □ -CH2CH2COOBzl □ G0Bzl Рис. 6. Структура мономеров ПАНКМ, полученных на основе DL-аланина и DL- глугаминовой кислоты.

Рис. 7. ВЭЖХ-хроматограмма гуанинового мономера 19d ПАНКМ на основе Ш-аланина. (колонка Диасфер-110-Chirasel-E-PA (7 мкм, 4x150 мм), скорость потока 0.7 мл/мин).

Для большинства анализируемых нами веществ в данных условиях наблюдалось энантиомерное разделение, но добиться полной селективности не удалось. Однако при разделении некоторых мономеров, в частности, гуанинового мономера ПАНКМ на основе /Я,-аланина (рис. 7), было зафиксировано наличие дополнительных пиков в хроматограмме, которые скорее всего соответствуют

ротамерным структурам, возникающим в результате затрудненного вращения вокруг амидной связи в мономере ПАНКМ (рис. 8).

V0! — V |

I* к

Рис.8. Образование ротамерных структур в молекуле ПАНКМ.

В качестве альтернативного подхода к определению энантиоселективности синтеза мономеров ПАНКМ нами был предложен способ, основанный на получении диастереомеров, с последующим разделением их с помощью ВЭЖХ. В частности, данный метод был опробован на тиминовых мономерах ПАНКМ 19а, 30 и 33а. Для этого данные соединения конденсировали с /,-Пе и £>!-Не (только для 19а и 30) (схема 6). В результате были получены диастереомеры 34а-Ь, 35а-Ь, 36а-Ь соответственно, структура которых была подтверждена данными 'Н-ЯМР-спектроскопии.

Thy

BocHN

+ [Гс J, *НС1 й

19а (L) R,=H; R2=CH3 30 (L) R,=CH3; R2=H 33a (L)R,=H; R2=CH2CH2COOBzl 33b (D)R,=H; R2=CH2CH2COOBzl

DHbtOH EDC*HCI

TEA

L-lle-OMe DL-lle-OMe

Схема 6

Thy

BocHN

Ri ,

34a (L-L) R,=H; R2=CH3

34b (L-DL) R^H; R2=CH3

35a (L-L) R,=CH3; R2=H

35b (L-DL) R,=CH3; R2=H

36a (L-L)R,=H; R2=CH2CH2COOB2l

36b (D-L)R,=H; R2=CH2CH2COOBzl

Определение оптической чистоты и разделение полученных диастереомеров проводили, используя обращенно-фазовую ВЭЖХ, на колонке Separon SGX RP-S С18 (5 мкм, 4x150 мм), скорость потока 1 мл/мин (рис. 9).

; I ! !

' I

я

и. А I 1 I !

13 и И

Рис. 9. ВЭЖХ-хроматограммы: (а) смеси диастереомеров 36а и 36Ь, (Ь) диастереомера 36а, (с) смеси диастереомеров 35а и 35Ь, (с1) диастереомера 35а.

Системы для разделения: 0.02 М ацетат аммония в смеси метанол-вода, 9:1, рН 3.4 (а, Ь); ацетонитрил-вода, 1:1 (с, (1).

На рис. 9а показана ВЭЖХ-хроматограмма разделения смеси диастереомеров 36а и 36Ь в системе 0.02 М ацетат аммония в смеси метанол-вода, 9:1, рН 3.4, содержание которых составило: ¿¿ - 47.9% и ВЬ - 52.1%. ВЭЖХ-анализ содержания ¿¿-диастереомера 36а в подобранной системе дал следующий результат: Ы - 84.5% и йЬ - 15.5% (рис. 9Ь). Также была подобрана система для разделения диастереомеров 35а и 35Ь (рис. 9с) и 34а и 34Ь: ацетонитрил-вода, 1:1. ВЭЖХ-анализ показал практически 100% содержание ¿¿-диастереомера 35а (рис. 9с1); похожие результаты получены и для ¿¿-диастереомера 34а.

Полученный результат показывает, что синтез незаряженных мономеров 34 и 35 идет энантиоселективно, разработанные нами подходы к определению энантиомерной чистоты мономеров с использованием ВЭЖХ позволяют

однозначно подтвердить высокое значение энантиомерных избытков, достаточных для проведения последующих стадий олигомеризации. В случае заряженного мономера 33 возможна дополнительная рацемизация в процессе получения диастереомеров 36а, Ь, поэтому остается актуальным поиск альтернативных путей, исключающих возможность рацемизации в ходе дериватизации. Одним из решений данной проблемы может служить использование других хиральных селекторов для прямого анализа ВЭЖХ (на основе хитозана и др.), а также получение других диастереомерных производных, например модификацией по Ы-концу исследуемых мономеров ПАНКМ, с последующим анализом как методом ЯМР-спектроскопии, так и ВЭЖХ.

Выводы:

1. Разработана и оптимизирована универсальная схема синтеза незаряженных хиральных мономеров ПАНКМ.

2. Синтезированы в препаративных количествах и полностью охарактеризованы четыре мономера хиральных а-ПАНКМ на основе псевдопептида аууЬ-А1а и четырех нуклеиновых гетероциклических оснований, три из них получены впервые.

3. Синтезированы в препаративных количествах и полностью охарактеризованы четыре мономера хиральных у-ПАНКМ на основе Ь-А1ац/С1у и четырех гетероциклических оснований, три из них получены впервые.

4. Проведен анализ структуры полученных по разработанной схеме тимин-, аденин-, цитозин-, гуанинсодержащих мономеров на основе псевдопептидов ауу/1-А!а и ¿-Аки/у&у с помощью методов двумерной ЯМР-спектроскопии, который показал однозначность структуры выделенных продуктов реакции алкилирования гетероциклических нуклеиновых оснований бромацильными производными защищенных псевдопептидов (71ууЬ-А1а и Ь-А1ау/С1у.

5. Показано, что синтез незаряженных мономеров ПАНКМ идет энантиоселективно; разработанные нами подходы к определению энантиомерной чистоты мономеров с использованием ВЭЖХ позволяют однозначно подтвердить

высокое значение энантиомерных избытков, достаточных для проведения последующих стадий олигомеризации.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Льянов М.А., Кириллова Ю.Г., Прохоров Д.И., Лютик А.И., Есипова О.В., Швец В.И. Синтез двух тиминсодержащих мономеров ПНК на основе L-аланина и глицина // Вестник МИТХТ, 2010. -Т. 5, -№ 1. -С. 104-108.

2. Прохоров Д.И., Льянов М.А., Есипова О.В., Еремин C.B., Кириллова Ю.Г. Разработка теста для определения оптической чистоты хиральных мономеров ПАНКМ // Вестник МИТХТ, 2010. -Т. 5,- № 6. -С. 63-65.

3. Льянов М.А., Прохоров Д.И., Еремин C.B., Кириллова Ю.Г. Разработка метода определения оптической чистоты хиральных мономеров ПНК // Тезисы докладов III молодежной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии-2009». - Москва, 2009. -С. 49.

4. Прохоров Д.И., Боярская Н.П., Льянов М.А., Кириллова Ю.Г. Хиральные ПНК: синтез и исследование свойств // Тезисы докладов v Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». - Москва, 2009. -Т. 1. -С. 193.

5. Ширяева М.В., Никольская Е.Д., Льянов М.А. Синтез и изучение свойств хиральных полиамидных миметиков нуклеиновых кислот // Тезисы докладов X Всероссийской выставки научно-технического творчества молодежи. - Москва, 2010. -С. 62

Подписано в печать 26.05.11г.. Тираж 100 экз. Отпечатано в типографии «ГЕЛИОПРИНТ». Заказ № 845

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1. Структура ПНК и ее особенности

2. Физико-химические свойства пептидно-нуклеиновых кислот

2.1. Растворимость

2.2. Химическая стабильность

2.3. Гибридизационные свойства

2.3.1. Образование дуплексов

2.3.2. Образование триплексов

2.3.3. Образование квадруплексов

3. Биологические свойства ПНК

4. Применение ПНК

4.1. Технология РБ-петли

4.1.1 Захват ДНК-дуплекса

4.1.2. Топологическое мечение ДНК

4.1.3. Секвенирование неденатурированной ДНК

4.1.4. Гибридизация «молекулярных маяков» с дцДНК

5. Подходы к синтезу ПНК

5.1. Синтез мономеров

5.1.1. Стратегии синтеза Aeg-ocтoвa

5.1.2. Стратегии синтеза карбоксиметилированных производных гетероциклических оснований

5.1.3. Синтез мономера Aeg-ПHK

6. Модифицированные ПНК (ПАНКМ)

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

1. Синтез хиральных незаряженных а- и у-метилзамещенных мономеров ПАНКМ, на основе С1у\|/А1а и А1а\|/С1у

1.1 Синтез псевдопептидов

1.2 Синтез а-мети л содержащих мономеров ПАНКМ

1.3 Синтез у-метилсодержащих хиральных мономеров ПАНКМ

2. ЯМР-эксперименты по доказательству структуры полностью защищенных мономеров а- и у-ПАНКМ.

2.1 Анализ спектров а-ПАНКМ

2.2 Анализ спектров у-ПАНКМ

3. Разработка теста для определения оптической чистоты мономеров ПАНКМ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ВЫВОДЫ

Полиамидные миметики нуклеиновых кислот (ПАНКМ), первоначально описанные как пептидно-нуклеиновые кислоты (ае^-ПНК) [1], нашли широкое применение в различных областях физико-химической биологии. В частности на основе ПАНКМ {aeg-ПHK) предложены и реализованы технологии биосенсеров и микрочипов, системы для селективного расщепления нуклеиновых кислот, определения генетических мутаций и др [2, 3].

По своей функции классические ПАНКМ {aeg-YШK) являются миметиками нуклеиновых кислот, а по структуре представляют собой олигомеры на основе 14-(2-аминоэтил)-глицина с присоединенными через карбоксиметилированный спейсер нуклеиновыми основаниями [4].

Большой интерес представляет исследование свойств хиральных ПАНКМ, содержащих различные заместители в а- и у-положениях псевдопептидного фрагмента. Как известно, введение заместителей различного строения оказывает влияние на свойства ПАНКМ: растворимость, прохождение через клеточную и ядерную мембраны, направление закручивания спирали олигомера и гибридизационные свойства при связывании с природными нуклеиновыми кислотами [45].

На кафедре биотехнологии и бионанотехнологии МИТХТ им. М.В. Ломоносова проводится систематическое изучение модификаций нуклеиновых кислот - хиральных отрицательно заряженных ПАНКМ и незаряженных а- и у-ПАНКМ. Ранее в нашей лаборатории были синтезированы в препаративных количествах и полностью охарактеризованы четыре тиминсодержащих мономера ОЗ-ПАНКМ, а также два новых тиминсодержащих декамера ОЗ-ПАНКМ на основе ¿-глутаминовой кислоты и глицина.

В данной работе представлен разработанный универсальный метод синтеза незаряженных хиральных мономеров полиамидных миметиков нуклеиновых

В руководстве работой принимала участие к.х.н., доц. Кириллова Ю.Г. кислот различного строения на примере а- и у-метилзамещенных мономеров ПАНКМ, а также подход к определению оптической чистоты данных мономеров.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Разработка модифицированных олигонуклеотидов занимает одно из центральных мест в биотехнологии и медицинской химии ввиду использования их в качестве терапевтических агентов и инструментов молекулярной биологии. «Классические» пептидно-нуклеиновые кислоты (ПНК) представляют собой аналоги нуклеиновых кислот и являются полностью синтетическими ДНК/РНК-распознающими лигандами с нейтральным пептидо-подобным остовом и природными гетероциклическими основаниями. Такие свойства ПНК, как способность образовывать высокопрочные комплексы с нуклеиновыми кислотами даже при низкой ионной силе, биологическая и химическая устойчивость, могут служить основой для усовершенствования обычных, достаточно длительных и трудоемких методов диагностики нуклеиновых кислот.

выводы

1. Разработана и оптимизирована универсальная схема синтеза незаряженных хиральных мономеров ПАНКМ.

2. Синтезированы в препаративных количествах и полностью охарактеризованы четыре мономера хиральных а-ПАНКМ на основе псевдопептида 01уу/Ь-А1а и четырех нуклеиновых гетероциклических оснований, три из них получены впервые.

3. Синтезированы в препаративных количествах и полностью охарактеризованы четыре мономера хиральных у-ПАНКМ на основе Ь-А1ау/С1у и четырех гетероциклических оснований, три из них получены впервые.

4. Проведен анализ структуры полученных по разработанной схеме тимин-, аденин-, цитозин-, гуанинсодержащих мономеров на основе псевдопептидов С1уц/Ь-А1а и Ь-А1а\]/01у с помощью методов двумерной ЯМР-спектроскопии, который показал однозначность структуры выделенных продуктов реакции алкилирования гетероциклических нуклеиновых оснований бромацильными производными защищенных псевдопептидов 01уц/Ь-А1а и Ь-А1ац/01у.

5. Показано, что синтез незаряженных мономеров ПАНКМ идет энантиоселективно; разработанные нами подходы к определению энантиомерной чистоты мономеров с использованием ВЭЖХ позволяют однозначно подтвердить высокое значение энантиомерных избытков, достаточных для проведения последующих стадий олигомеризации.

1. Nielsen P.E., Egholm M., Berg R.H., Buchardt О. Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide. // Science. 1991. -V. 254. P. 1497-1500.

2. Ratilainen Т., Holmen A., Tuite E., Haaima G., Christensen L., Nielsen P. E., Norden В. Hybridization of peptide nucleic acid // Biochemistry, 1998. V. 37. - P. 12331-12342.

3. Demers D. В., Curry E. Т., Egholm M., Sozer A. C. Enhanced PCR amplification of VNTR locus D1S80 using peptide nucleic acid (PNA) // Nucleic Acids Res., 1995. V. 23. - P. 3050-3055.

4. Corradini R, Sforza S, Tedeschi T, Totsingan F, Marchelli R. Peptide nucleic acids with a structurally biased backbone: effects of conformational constraints and stereochemistry // Current Topics in Medicinal Chemistry 2007, V. 7. - P. 681-694.

5. Srinivas Rapireddy, Gaofei He, Subhadeep Roy, Bruce A. Armitage, and Danith H. Ly Strand Invasion of Mixed-Sequence B-DNA by Acridine-Linked, y-Peptide Nucleic Acid (y-PNA) // J. Am. Chem. Soc. 2007. V. 129. - P. 15596-15600.

6. Tackett A.J., Corey D.R., Raney K.R. Non-Watson-Crick interactions between PNA and DNA inhibit the ATPase activity of bacteriophage T4 Dda helicase. Nucleic Acid Res. 2002. V. 30. - P. 950-957.

7. Hyrup, В., Egholm, M., Nielsen, P.E., Wittung, P., Norden, В., Buchardt, О. Structure-Activity Studies of the Binding of Modified Peptide Nucleic Acids (PNAs) to DNA // J. Am. Chem. Soc. 1994. V. 116. - P. 7964-7970.

8. Uhlmann E., Peyman A., Breipohl G., Will D.W. PNA: Synthetic Polyamide Nucleic Acids with Unusual Binding Properties. // Angew. Chem. Int. Ed. 1998. V. 37. - P. 2796-2823.

9. Hyrup В., Nielsen P.E. Peptide nucleic acids (PNA): synthesis, properties and potential applications. // Bioorg. Med. Chem. 1996. V. 4. - P. 5-23.

10. Christensen L., Fitzpatrick R., Gildea В., Petersen; К. H., Hansen H.F., Egholm M., Buchardt O., Nielsen P.E., Coull J., Berg R.H. Solid-phase synthesis of peptide-nucleic acids. // J. Pept. Sei. 1995. V. 3. - P. 175-183.

11. Gambari R. Peptide-Nucleic Acids (PNAs): a tool for the development of gene expression modifiers. // Curr. Pharmaceutical Design. 2001. V. 7. - P. 18391862.

12. Анцыпович С. И. Пептидно-нуклеиновые кислоты: структура, свойства, применение, стратегии и практика химического синтеза. // Успехи химии. 2002. Т. 71, № 1. - С. 81-96.

13. Wittung P., Nielsen P.E., Buchardt О., Egholm М., Norden В. DNA-like double helix formed by peptide nucleic acid. // Nature. 1994. V. 368. - P. 561-563.

14. Wittung P., Eriksson M., Lyng R., Nielsen P.E., Norden В. Induced chirality in PNA-PNA duplexes. // J. Am. Chem. Soc. 1995. V.l 17. N 41. - P. 1068-1073.

15. Egholm M., Nielsen P.E., Buchardt O., Berg R.H. Recognition of guanine and adenine in DNA by cytosine and thymine containing peptide nucleic acids (PNA). // J. Am. Chem. Soc. 1992. V. 114. - P. 9677-9678.

16. Igloi G.L. Variability in the stability of DNA-peptide nucleic acid (PNA) single-base mismatched duplexes: real-time hybridization during affinity electrophoresis in PNA-containing gels. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1998. V. 95. -P. 8562-8567.

17. Ratilainen Т., Holmen A., Tuite E., Nielsen P.E., Norden В. Thermodynamics of sequence-specific binding of PNA to DNA. // Biochemistry. 2000. -V. 39.-P. 7781-7791.

18. Tomas S., Sarkar M., Ratilainen Т., Wittung P., Nielsen P.E., Norden В., Cräslund A. Ionic effects on the stability and conformation of peptide nucleic acid complexes. // J. Am. Chem. Soc. 1996. V. 118. - P. 5544-5552.

19. Pellestor F., Paulasova P. The peptide nucleic acids, efficient tools for molecular diagnostics. // Int. J. Mol. Medicine. 2004. V. 13. - P. 521-525.

20. Rastrup J.S., Pilgaard M., Jorgensen F.S., Nielsen P.E., Rasmussen H. Crystallization and preliminary X-ray analysis of PNA-DNA complex. // FEBS Lett. 1995.-V. 363.-P. 115-117.

21. Soliva R., Sherer E., Luque F.J., Laughton C.A., Orozco M. Molecular dynamics simulations of PNA-DNA and PNA-RNA duplexes in aqueous solution. // J. Am.Chem. Soc. 2000. V. 122. - P. 5997-6008.

22. Rasmussen H., Kustrup J.S., Nielsen J.N., Nielsen J.M., Nielsen P.E. Crystal structure of a peptide nucleic acid (PNA) duplex at 1.7 Ä resolution. // Nat. Struct. Biol. 1997.-V. 4.-P. 98-101.

23. Eriksson M., Nielsen P. PNA-nucleic acid complexes. Structure, stability and dynamics. // Quarterly Review of Biophysics. 1996. V. 29, N 4. - P. 369-394.

24. Zamechnik P.C., Stephenson M.L. Inhibition of Rous sarcoma virus replication and cell transformation by a specific oligodeoxyribonucleotide. // Proc. Natl. Acad. Sei.' USA. 1978. V. 75. - P. 280-284.

25. Nielsen P.E., Egholm M., Buchardt O. Evidence for (PNA)2/DNA triplex structure upon binding of PNA to dsDNA by strand displacement. // J. Mol. Recognition. 1994. V. 7, N 3. - P. 165-170.

26. Egholm M., Christensen L., Dueholm K.L., Buchardt O., Coull J., Nielsen P.E. Efficient pH independent sequence-specific DNA binding by pseudoisocytosine-containing bis-PNA. // Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. N 2. - P. 217-222.

27. Kosaganov Yu.N., Stetsenko D.A., Lubyako E.N., Kvitko N.P., Lazurkin Yu.S., Nielsen P.E. Effect of temperature and ionic strength on the dissociation kinetics and lifetime of PNA-DNA triplexes. // Biochemistry. 2000. V. 39. - P. 11742-11747.

28. Wittung P., Nielsen P.E., Norden B. Extended DNA-recognition repertoire of PNA. // Biochemistry. 1997. V. 36. - P. 7973-7979.

29. Nielsen P.E., Christensen L. Strand1 displacement binding of a duplex forming homopurine PNA to a homopyrimidine duplex DNA target. // J. Am. Chem. Soc. 1996. V. 118. - P. 2287-2288.

30. Lohse J., Dahl O., Neilsen P.E. Double duplex invasion by peptide nucleic acid: a general principle for sequence-specific targeting of double-stranded DNA. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1999. V. 96. N 11. - P. 804-811.

31. Nielsen P.E., Egholm M. Strand displacement recognition of mixed adenine-cytosine sequences in double-stranded DNA by thymine-guanine PNA (Peptide nucleic acid). // Bioorg. & Med. Chem. 2002. V. 9. - P. 2429-2434.

32. Smolina I.V., Demidov V.V., Soldatenkov V.A., Chasovskikh S.G., Frank-Kamenetskii M.D. End invasion of peptide nucleic acids (PNA) with mixed-base composition into linear DNA duplexes. // Nucleic Acids Res. 2005. V. 33. N 17. - P. el46.

33. Datta B., Sehmitt C., Armituye B.A. Formation of a PNA2-DNA2 hybrid quadruplex. // J. Am. Chem. Soc. 2003. V. 125. - P. 4111-4118.

34. Krishnan-Ghosh Y., Stephens E., Balasubramanian S. A PNA4 Quadruplex. // J. Am. Chem. Soc. 2004. V. 126. N. 19. - P. 5944-45.

35. Dueholm K.L., Nielsen P.E. Chemistry, properties and applications of PNA (Peptide Nucleic Acids) // New J. Chem. 1997. V. 21. - P. 19-31.

36. Nielsen P.E., Haaima G. Peptide Nucleic acid (PNA). A DNA mimic with a pseudopeptide backbone // Chem. Soc. Rev. 1997. V 26. - P. 73-78.

37. Nielsen P.E. Peptide nucleic acid: a versatile tool in genetic diagnostics and molecular biology // Curr. Opin. Biotech. 2001. V. 12. - P. 16-20.

38. Demidov V.V. PNA and LNA throw light on DNA // Trends in Biotech. 2003.-V. 21.-P. 4-7.

39. Stender H., Fiandaca M., Hyldig-Nielsen J.J., Coull J. PNA for rapid microbiology // J. Microbiol. Meth. 2002. V. 48. - P. 1-17.

40. Lundin K.E., Good L., Stromberg R., Graslund A., Smith C.I.E. Biological activity and biotechnological aspects of peptide nucleic acid // Advances Genet. 2006. -V. 56.-P. 1-51.

41. Nielsen P.E. Gene targeting using peptide nucleic acid // Methods Mol. Biol. 2005.-V. 288.-P. 343-358.

42. Nielsen PE (Ed.). Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications, Second Edition, Horizon Bioscience // Norfolk (UK). 2004.

43. Nielsen P.E., Egholm M., Berg R.H., Buchardt O. Peptide nucleic acids (PNAs): potential antisense and anti-gene agents // Anticancer Drug Des. 1993. V. 8. -P. 53-63.

44. Good L., Awasthi S. K., Dryselius R., Larsson O., Nielsen P. E. Bactericidal antisense effects of peptide-peptide nucleic acid conjugates // Nature Biotech. 2001. -V. 19.-P. 360-364.

45. Nielsen P. E., Good L. Peptide nucleic acids antisense to mRNA or rRNA as antibacterial or bacteriostatic antibiotics // U.S. patent application. 2004. P.2000-486623.

46. Kaushik N., Basu A., Pandey V.N. Inhibition of HIV-1 replication by anti-trans-activation responsive polyamide nucleotide analog // Antiviral Res. 2002. — V. 56. -P. 13-27.

47. Mc Mahon B.H., Stewart J.A., Bitter M.D., Fauq A., McCormick D.J., Richelson E. Peptide nucleic acids specifically cause antigene effects in vivo by systemic injection // Life Sci. 2002. V. 71. - P. 325-337.

48. Adlerz L., Soomets U., Holmlund L., Viirlaid S., Langel U., Iverfeldt K. Down-regulation of amyloid precursor protein by peptide nucleic acid oligomer in cultured rat primary neurons and astrocytes // Neurosci. Lett. 2003. V. 336. - P. 5559.

49. Shiraishi T., Nielsen P.E. Down-regulation of MDM2 and activation of p53 in human cancer cells by antisense 9-aminoacridine-PNA (peptide nucleic acid) conjugates // Nucleic Acids Res. 2004. V. 32. - P. 4893-4902.

50. Rasmussen F.W., Bendifallah N., Zachar V., Shiraishi T., Fink T., Ebbesen P., Nielsen P.E., Koppelhus U. Evaluation of Transfection Protocols for Unmodified and Modified Peptide Nucleic Acid (PNA) Oligomers // Oligonucleotides 2006. V. 16.-P. 43-57.

51. Koppelhus U., Nielsen P.E.Cellular delivery of peptide nucleic acid (PNA) // Adv. Drug Del. Rev. 2003. V. 55. - P. 267-280.

52. Doyle D.F., Braasch D.A., Simmons C.G., Janowski B.A., Corey D.R. Inhibition of Gene Expression Inside Cells by Peptide Nucleic Acids: Effect of mRNA Target Sequence, Mismatched Bases, and PNA Length // Biochemistry 2001. V. 40. — P. 53-64.

53. Braasch D.A., Corey D.R. Novel Antisense and Peptide Nucleic Acid Strategies for Controlling Gene Expression // Biochemistry 2002. V. 41. - P. 45034510.

54. Dykxhoorn D.M., Palliser D., Lieberman J. The silent treatment: siRNA as small molecule drugs // Gene Ther. 2006. V. 13. - P. 541-552.

55. Liu Y., Braasch D.A., Nulf C.J., Corey D.R. Efficient and Isoform-Selective Inhibition of Cellular Gene Expression by Peptide Nucleic Acids // Biochemistry 2004. -V. 43.-P. 1921-1927.

56. Karras J. G., Maier M.A., Lu T., Watt A., Manoharan M. Peptide nucleic acids are potent modulators of endogenous pre-mRNA splicing of the murine interleukin-5 receptor-R chain // Biochemistry 2001. V. 40. - P. 7853-7859.

57. Shiraishi T., Bendifallah N., Nielsen P. E. Cellular Delivery of Poly-heteroaromate-Peptide Nucleic Acid Conjugates Mediated by Cationic Lipids // Bioconj. Chem. 2006.-V. 17.-P. 189-194.

58. Ittig D., Liu S., Renneberg D., Schumperli D., Leumann C.J. Nuclear antisense effects in cyclophilin A pre-mRNA splicing by oligonucleotides: a comparison of tricyclo-DNA with LNA // Nucleic Acids Res. 2004. V. 32. - P. 346353.

59. Xodo L.E., Cogoi S., Rapozzi V. Anti-Gene Strategies to Down-Regulate Gene Expression in Mammalian Cells // Current Pharmaceutical Desig 2004. V. 10. -P. 805-819.

60. Cutrona G., Carpaneto E.M., Ulivi M., Rondella S., Landt O., Ferrarini M., Boffa L.C. Effects in live cells of a c-myc anti-gene PNA linked to a nuclear localization signal //Nat. Biotech. 2000. -V. 18. P. 300-303.

61. Kaihatsu K., Janowski B.A., Corey D.R. Recognition of Chromosomal DNA by PNAs // Chem. Biol. 2004. V. 11. - P. 749-758.

62. Pellestor F., Paulasova P. The peptide nucleic acids (PNAs), powerful tools for molecular genetics and cytogenetics. // Eur. J. of Human Genetics. 2004. V. 12. - P. 694-700.

63. Wilks S.A., Keevil C.W., Targeting species-specific low-affinity 16S rRNA binding sites by using peptide nucleic acids for detection of Legionellas in biofilms. // Appl. Env. Microbiol. 2006. V. 72. - P. 5453-5462.

64. Rufer N., Dragowska W., Thornbury G., Roosnek E., Lansdorp P.M., Telomere length dynamics in human lymphocyte subpopulations measured by flow cytometry. // Nature Biotechnol. 1998. -V. 16. P. 743-747.

65. Robertson K.L., Yu L., Armitage B.A., Lopez A.J., Peteanu L.A. Fluorescent PNA probes as hybridization labels for biological RNA. // Biochemistry 2006. V. 45. -P. 6066-6074.

66. Brandt O., Hoheisel J.D. Peptide nucleic acids on microarrays and other biosensors. // Trends in Biotechnology. 2004. V. 22. N 12. - P. 617-622.

67. Orum H., Nielsen P.E., Egholm M., Berg R.H., Buchardt O., Stanley C. Single base pair mutation analysis by PNA directed PCR clamping. // Nucleic Acids Res. 1993.-V. 21.-P. 5332-5336.

68. Popescu D-L., Parolin T.J., Achim C. Metal incorporation in modified PNA duplexes. // J. Am. Chem. Soc. 2003. V. 125. - P. 6354-6355.

69. Williams K.A., Veenhuizen P.T., de la Torre B.G., Eritja R., Dekker C. Carbon nanotubes with DNA recognition. // Nature 2002. V. 420. - P. 761.

70. Turner J.L., Becker M.L., Li X., Taylor J-Sa., Wooley K.L. PNAdirected solution- and surface-assembly of shell crosslinked (SCK) nanoparticle conjugates. // Soft Matter 2005. V. 1. - P. 69-78.

71. Cao R., Gu Z., Patterson G.D., Armitage B.A. A recoverable enzymatic microgel based on biomolecular recognition. // J. Am. Chem. Soc. 2004. V. 126. - P. 726-727.

72. Demidov V.V. PD-loop technology: PNA openers at work. // Expert Rev. Mol. Diagn. 2001. V. 1. N. 3. - P. 343-351.

73. Demidov V.V., Kuhn H., Lavrentieva-Smolina I.V., Frank-Kamenetskii M.D. Peptide nucleic acid-assisted topological labeling of duplex DNA // Methods. 2001.-V. 23. P.123-131.

74. Haaima G., Lohse A., Buchardt O., Nielsen P. E. Peptide Nucleic Acids (PNAs) containing Thymine monomers derived from chiral amino acids: hybridization and solubility properties of D-Lysine PNA // J. Chem. Int. Ed. 1996. V. 98. N 17. - P. 1939-1941.

75. Dueholm K.L., Egholm M., Buchardt O. An efficient synthesis of Boc-aminoacetaldehyde and its application to the synthesis of N-(2-Boc-aminoethyl)glycine esters // Organic preparations and procedures int. 1993. V. 25. N. 4. - P. 457-461.

76. Agami C., Couty F. The reactivity of the N-Boc protectinc group: an anderrated feature // Tetrahedron. 2002. V. 58. - P. 2701-2724.

77. Thomson S. A., Josey J. A., Cadilla R., Gaul M. D., Hassman C. F., Luzzio M. J., Pipe A. J. Reed K. L., Ricca D. J., Wiethe R. W., Noble S. A. Fmoc mediated synthesis of peptide nucleic acids. // Tetrahedron 1995. -V. 51. — P. 6179-6194.

78. Ferrer E., Eisenhut M., Eritia R. A convenient route for the preparation nucleic acid monomers carrying acid-labile groups for the protection of the amino function // LUWER/ESCOM. Letters in peptide science. 1999. V. 6. - P. 209-219.

79. Sforza S., Galaverna G., Dossena A., Corradini R., Marchelli R. Role of Chirality and Optical Purity in Nucleic Acid Recognition by PNA and PNA analogs // Chirality 2002. V. 14. - P. 591-598.

80. Ganesh K.N., Nielsen P.E. Peptide Nucleic Acids: analogs and derivatives // Curr. Org. Chem. 2000. V. 4. - P. 931-943.

81. Falkiewicz B. Peptide nucleic acids and their structural modifications // Acta Chem. Polonica 1999. V. 46. - P. 509-529.

82. Sforza S., Corradini R., Ghirardi S., Dossena A., Marchelli R. DNA binding of a D-lysine-based chiral PNA: direction control and mistmatch recognition. // Eur. J. Org. Chem. 2000. P. 2905-2913.

83. Puschl A., Sforza S., Haaima G., Dahl O., Nielsen P.E. Peptide nucleic acids (PNAs) with a functional backbone // Tetrahedron Lett. 1998. V. 39. - P. 711714.

84. Dueholm K.L., Petersen K.H., Jensen D.K., Egholm M., Nielsen P.E., Buchardt O. Peptide nucleic acid (PNA) with a chiral backbone based, on alanine // Bioorg. Med. Chem. Lett 1994. -V. 4. P. 1077-1080.

85. Sforza S., Haaima G., Marchelli R., Nielsen P.E. Chiral peptide nucleic acids (PNAs): Helix handedness and DNA recognition // Eur. J. Org. Chem. 1999. P. 197-204.

86. Tedeschi T., Sforza S., Corradini R., Dossena A., Marchelli R. Lysine-based peptide nucleic acids (PNAs) with strong chiral constraint: control of the helix handedness and DNA binding by chirality // Chirality 2005. V 1. - P. 196-S204.

87. Sforza S., Tedeschi T., Corradini R., Ciavardelli D., Dossena A., Marchelli R. Fast Solid-Phase Synthesis of Chiral Peptide Nucleic Acids with a High Optical Purity by a Submonomeric Strategy // Eur. J. Org. Chem. 2003. P. 1056-1063.

88. Bentin T., Nielsen P.E. Superior Duplex DNA Strand Invasion by Acridine Conjugated Peptide Nucleic Acids // J. Am. Chem. Soc. 2003. V.125. - P. 6378-6379.

89. Sforza S., Tedeschi T., Corradini R., Dossena A., Marchelli R. Direction control in DNA binding of chiral D-lysine-based peptide nucleic acid (PNA) probed by electrospray mass spectrometry // Chem. Commun. 2003. P. 1102- 1103.

90. Corradini R., Feriotto G., Sforza S., Marchelli R., Gambari R. Enhanced Recognition of Cystic Fibrosis W1282X DNA Point Mutation by Chiral Peptide Nucleic Acids Probes by a Surface Plasmon Resonance Biosensor // J. Mol. Ree. 2004. -V. 17.-P. 76-84.

91. Ficht S., Dose C., Seitz O. As fast and selective as enzymatic ligations: unpaired nucleobases increase the selectivity of DNA-controlled native chemical PNA ligation // Chem. Bio. Chem. 2005. V. 6. - P. 2098-2103.

92. Englund E.A., Appella D.H. Synthesis of gamma-substituted peptide nucleic acids: a new place to attach fluorophores without affecting DNA binding // Org. Lett. 2005.-V. 7.-P. 3465-3467.

93. Tedeschi T., Sforza S., Corradini R., Marchelli R. Synthesis of new chiral PNAs bearing a dipeptide-mimic monomer with two lysine-derived stereogenic centres // Tetrahedron Lett. 2005. V. 46. - P. 8395-8399.

94. Falkiewicz В., Kowalska К., Kolodziejczyk A.S., Wisniewski К., Lankiewicz L. Synthesis of new chiral Peptide Nucleic Acid (PNA) monomers by simplified-reductive amination method. //Nucleosides & Nucleodites. 1999. — V. 18'. N 3.-P. 353-361.

95. Kosynkina L., Wang W., Chyau Liang T. A convenient synthesis of chiral Peptide Nucleic Acid (PNA) monomers. // Tetrahedron Letters. 1994. V. 35. - P. 5173-5176.

96. Falkiewicz В., Kolodziejczyk A.S., Liberek В., Wisniewski K. Synthesis of achiral and chiral Peptide Nucleic Acid (PNA) monomers using Mitsunobu reaction. // Tetrahedron Letters. 2001. -V. 57. P. 7909-7917.

97. T. Ishizuka, J. Yoshida, Y. Yamamoto, J. Sumaoka, T. Tedeschi, R. Corradini, S. Sforza and M. Komiyama. Chiral introduction of positive charges to PNA for double-duplex invasion to versatile sequences // Nucleic Acids Research. 2008. P. 1-8

98. Zhou P., Wang M.M., Fisher G.W., Waggoner A., Ly. D.H. Novel Binding and efficient Cellular Uptake of Guanidine-Based Peptide Nucleic Acids (GPNA) // J. Am. Chem. Soc. 2003. V. 125. - P. 6878-6879.

99. Dragulescu-Andrasi A., Zhou P., He G.F., Ly D.H. Cell-permeable GPNA with appropriate backbone stereochemistry and spacing binds sequence-specifically to RNA // Chem.' Comm. 2005. P. 244-246.

100. Dragulescu-Andrasi A., Rapireddy S., Frezza B.,Gayathri C., and Ly D.H. A Simple y-Backbone Modification Preorganizes Peptide Nucleic Acid into a Helical Structure//J. Am.Chem. Soc. 2006. -Vol. 128. N. 31. -P. 10258-10267.

101. Боярская, H. П. Синтез тиминсодержащих отрицательно заряженных пептидно-нуклеиновых кислот различного строения иисследование их гибридизационных характеристик // дис. канд. хим. наук : 02.00.10 : защищена 12.11.07. -М., 2007. С. 127.

102. Friedrich-Bochnitschek, S. Allyl esters as carboxy protecting groups in the synthesis of O-glycopeptides // S. Friedrich-Bochnitschek, H. Waldmann, H. Kunz//J. Org. Chem. 1989. V. 54. - P. 751-756.

103. Баранов A.B., Цвид H.C., Лукьяненко В.И., Прохоров Д.И., Кириллова Ю.Г., Швец В.И. Исследование путей синтеза цитозинового мономера отрицательно заряженных пептидно-нуклеиновых кислот. // Вестник МИТХТ. 2007. Т. 2. № 5 - С. 28-32.

104. Кузнецов М.А., Нестеренко П.Н., Васияров Г.Г., Староверов С.М. Высокоэффективная жидкостная хроматография энантиомеров а-аминокислот на силикагеле с иммобилизованным эремомицином // Журн. аналит. хим. -2008.-Т. 63. № 1.-С. 64-72.