Синтез модифицированных аналогов олигонуклеотидов с повышенной прочностью комплексообразования тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. М. М. ШЕМЯКИНА И Ю. А. ОВЧИННИКОВА

На правах рукописи

СТЕЦЕНКО ДМИТРИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

СИНТЕЗ МОДИФИЦИРОВАННЫХ АНАЛОГОВ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ С ПОВЫШЕННОЙ ПРОЧНОСТЬЮ КОМПЛЕКСООБРАЗОВАНИЯ

Специальность 02.00.10- биоорганическая химия, хтаия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1997

Работа выполнена в Институте биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН

Научный руководитель: доктор химических наук В. К. Потапов

Официальные оппоненты: доктор химических наук В. А. Ефимов

доктор химических наук В. Л. Флорентьев

Ведущая организация: Химический факультет МГУ им. М. В. Ломоносова

Зашита состоится • // « _ Сис+сА' 1997 г. в на

заседании Специализированного совета Д 002.35.01 при Институте биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН по адресу: 117871, Москва В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБХ РАН.

Автореферат разослан " '/У" 1997 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат химических наук

В. А. Несмеянов

Актуальность проблемы. За прошедшее десятилетие сильно увеличился объем работ в области синтеза модифицированных аналогов олигонуклеотилов как в целях применения га в качестве потенциальных терапевтических средств^ для антисенс- и антиген-терапии, так и в молекулярно-биологических исследованиях. В сфере применения производных олигонуклеотилов для терапии вирусных заболеваний, злокачественных опухолей и лр. болезней, связанных с изменениями генома, в последнее время наметился переход от исследований in vitro к непосредственно клиническому применению первых представителей этого класса - фосфоротиоатов. Развивается также комбинаториальный подход к синтезу высокоспецифических лигандов на основе синтетических олигодезокси- и рибонуклеотидов (т.н. аптамеры). Однако, несмотря на множество описанных модификаций структуры, остается весьма актуальной разработка новых аналогов олигонуклеотилов, обладающих набором требуемых свойств, как то: повышенная прочность связывания с комплементарной последовательностью при высокой специфичности, определяемой Уотсон-Криковскими взаимодействиями, устойчивость к спонтанной и ферментативной деградации, способность проникать через клеточную мембрану, низкая общая токсичность при доминировании сиквенс-специфической активности и т.д. Широкое использование обширного арсенала современного органического синтеза позволяет получать все более сложные и отдаленные структурные молели нуклеозидов, содержащие разнообразные заместители и гетероатомы, сильно расширяющие возможности межмолекулярного узнавания лиганла и мишени. Тем не менее, до ак пор можно говорить лишь об ограниченном соответствии существующих аналогов, в том числе переданных уже для клинических испытаний, перечисленным требованиям.

Замена природной фосфодиэфирной связи различными группировками, в частности, амидной связью различной пространственной ориентации, привела к получению электронейтральных полиамидных аналогов олигонуклеотилов. Одним из интереснейших представителей этого нового класса соединений, напоминающих природные пептиды, являются "пептидные нуклеиновые кислоты" или PNA, предложенные в 1991 г. группой П.Э.Нильсена (Дания). Природа PNA позволила широко использовать для их синтеза традиционные методы химии пептидов, что наряду с интересными свойствами этих соединений сделало их весьма перспективным средством для решения задач физико-химической биологии нуклеиновых кислот.

Целью настоящей работы явилась разработка эффективного метода синтеза как собственно полиамидных аналогов олигонуклеотидов (PNA), так и их конъюгатов с олигодезоксирибонуклеоткдами. Такой метод должен отвечать требованиям твердофазного синтеза олигодезоксирибонуклеотидов и включать эффективные способы получения защищенных мономеров для последующего наращивания цепи PNA твердофазным способом с использованием соответствующего полимерного носителя, что позволяет использовать автоматический синтезатор.

Научная новизна и практическая значимость. Разработан общий метод твердофазного синтеза полиамидных аналогов нуклеиновых кислот, полностью совместимый с условиями олигодезоксирибонуклеотидного синтеза и позволяющий получать олигомеры PNA, их аналоги и производные, в том числе конъюгаты с олигодезоксирибонуклеотидами, содержащие ДНКовую часть со свободной З'-гидроксильной группой, до последнего времени не описанные в литературе, путем последовательного твердофазного олигонуклеотидного и пептидного синтеза на одном полимерном носителе с одновременным деблокированием. Показано, что полученные таким' методом "химерные" олигомеры могут участвовать в ферментативных реакциях, характерных как для полиамидного, так и олигонуклеотидного фрагментов, что открывает перспективы их использования как новых инструментов молекулярно-биологических исследований (сильносвязывающиесн праймеры для ПЦР, нерадиоактивно меченные зонды для картирования ДНК методом сканирующей электронной микроскопии и т.д.). Разработано семейство полимерных носителей для твердофазного органического синтеза на основе коммерчески доступного хроматографического сорбента TS К Gel Toyopearl™, пригодных для эффективного синтеза как полиамидов, так и олигодезоксирибонуклеотидов. Предложен ряд новых реагентов для активации карбоновых кислот в синтезе амидов и сложных эфиров на основе аренсульфонатов, фосфониевых и иминиевых солей. Некоторые из предложенных реагентов могут найти применение в синтезе пептидов, в особенности содержащих остатки пространственно затрудненных аминокислот, входящих в состав природных антибиотиков полипептидной структуры из семейства пептаиболов. Предложен также новый тип активированных эфиров карбоновых кислот - производных

доступного Л^пшрокси-3,4,5,6-тетрахлорфталимида - для быстрой пептидной конденсации в мягких условиях__________

Полученные при выполнении данной работы результаты были использованы при проведении различных исследований, выполняемых в лаборатории структуры и функций генов человека ИБХ РАН и лаборатории биофизики ИМГ РАН.

Апробация работы. Результаты работы были опубликованы в четырех печатных работах, еще одна готовится к печати. По итогам работы был подготовлен стендовый доклад на III Международном симпозиуме по биоорганической химии 17-23 сентября 1995 г. в Дагомысе (Россия).

Объем работы и структура диссертации. Диссертация изложена на 134 страницах печатного текста, включая 10 рисунков, 47 схем, 5 таблиц и список цитируемой литературы из 276 наименований, и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, обсуждение результатов, экспериментальная часть (материалы и методы), выводы, список литературы.

Конкретный личный вклад диссертанта. Экспериментальные результаты получены лично автором либо при его непосредственном участии. Начальный этап работы был выполнен совместно с к.х.н. С. В. Веселовской, продолжение работы - совместно с Е. Н. Лубяко. Молекулярно-биологические эксперименты были проведены к.б.н. Т. Л. Ажикиной, при этом автор принимал участие в постановке задачи, а также в обсуждении и интерпретации результатов.

Содержание работы.

Разработка схемы синтеза Р^. Целью работы была разработка эффективного и экономичного метода синтеза полиамидных аналогов нуклеиновых кислот и их конъюгатов с олигодезоксинуклеотидами с использованием набора защитных групп, удаляемых в условиях, при которых гликозидная связь кислотолабильных пуриновых нуклеозидов остается незатронутой. Существующие методы синтеза пептидных нуклеиновых кислот (РЫА) не отвечают этому требованию, так как основаны на применении хорошо разработанных методик из арсенала пептидного синтеза, основанных на применении комбинации Вое- и г-групп, удаляемых при жесткой кислотной обработке, несовместимой с наличием в составе пептидно-дезоксинуклсинового

3

конъюгата пуринов. В то же время сочетание других защитных групп, зарекомендовавших себя при синтезе олигонуклеотидов, таких, как комбинация 4-метокситритильной группы (Mint) для зашиты алифатической аминогруппы, лабильной в кислой среде, и 2-(4-нитрофенил)этоксикарбонильной группы (Npeoc), удаляемой |3-элиминированием под действием сильного основания, для блокирования экзоциклической аминогруппы цитозина (а также, в принципе, аденина и гуанина), позволило бы решить проблему последовательного твердофазного синтеза олигонуклеотидной и полипептидной частей на общем полимерном носителе. При этом достигалась бы совместимость условий деблокирования защитных групп для пептидного фрагмента с диапазоном стабильности олигодезоксинуклеотидов, а процедура твердофазного синтеза состояла бы из следующих операций:

а) деблокирование Л'-концевой Mmt-группы при помощи 3%-го р-ра трихлоруксусной кислоты в дихлорметане;

б) образование амидной связи на полимере с нейтрализацией in situ и использованием подходящего конденсирующего реагента;

в) блокирование непрореагировавших аминогрупп ацетилированием;

г) повторение описанного цикла до окончания наращивания цепи;

д) после завершения синтеза деблокирование Ыреос-группы (обработка носителя 0.5М DBU в ацетонитриле);

е) отщепление от полимера и деблокирование /V-защитных групп оснований в олигодезоксинуклеотидной части аммонолизом (25% NH^OH, 55%, 18 ч).

Описанная схема синтеза позволяет получать как разнообразные конъюгаты

полиамидных аналогов с олигодезоксинуклеотидами (как Д НК-3PNA, так и,

«

в особенности, РЫА-С->5'-ДНК), так и собственно PNA, поскольку вполне совместима с условиями пептидного синтеза. В последнем случае первая аминокислота присоединяется к носителю сложноэфирной связью, при этом деблокирование осуществляется насыщенным аммиаком метанолом с образованием С-концевого амида.

Получение защищенных мономеров для синтеза PNA. Для реализации предложенной схемы синтеза PNA и конъюгатов PNA-ДНК требуется получение соответствующим образом защищенных мономеров. Необходимый N-2-аминоэтилглицин 1 получали по известной методике из хлоруксусной кислоты и

этилендиамина, затем переводили в дигидрохлорид этилового эфира /V-2-аминоэтилглииина_ 2 и обработкой МпИ-С1 в присутствии триэтиламина в дихлорметане превращали с количественным выходом в /У-2-моно-4-метокситритильное производное эфира аминоэтилглишша 3 (схема 1). Следует отметить высокую региоселективность алкилировлния, так как образования как дитритштьного, так и изомерного монотритильного производного по вторичной аминогруппе не удалось зарегистрировать. Продукт 3 был выделен в виде масла после экстракции, пригоден для последующих превращений без дополнительной очистки и стабилен при хранении при -20°С в течение года.

НЗ

^Л/ V — нсм^А/ 47 -'МйШ V 47

,0

А. — А N СО^Х

МпНИ ^ МпгШ 47 ^

ба-в 7а-в

¡) С1СН,СО,Н. 24 .(. 53%; и) 7М НС1/ЕЮН, Д. 3 ч. 72%; Ш) МтЬСЛ. ^з/ОСМ. 0"С, 2 ■(. 99%; ¡V) ВРСН2СО,РГр 4а-в (Вч=ига. ТЪу. Су^"*), МЕ13/0МР, 71-91%; V) 0.1М ЫаОН/диоксзн (6а-6) или ОДМ КОНДНР (6в). затеи ЫВип4Н504, 88-97%.

Схема 1.

В качестве гетероциклических оснований для триплекс-образующих Р^ достаточно включение только пиримшшновых производных: тимина, урацила и цитозина. В то время, как для получения тиминового и урацильного мономеров, как правило, не требуется защитной группы, для цитозина необходима защита /V-аминогруппы, для чего была использована Креос-группа. Получение карбоксиметильных производных оснований в случае тимина и урацила достигается алкилированием бромуксусной кислотой в щелочной среде. В случае цитозина после зашиты аминогруппы при помощи тетрафторбората /У-2-(4-нитрофенил)этоксикарбонил-Лг-этилимидазолия Л^-Мреос-цитозин алкилировали трет-бутилбромацетатом с использованием поташа в качестве основания и после кислотного расщепления треш-бутилового эфира выделяли целевую карбоновую

I

кислоту (схема 2). Выходы при получении алкилированных гетероциклов варьировали от высоких до удовлетворительных. Структура всех целевых и промежуточных продуктов в серии была подтверждена спектрами 'Н-ЯМР и данными масс-спектроскопии.

ООО

4а-б 5а-б

i) BrCH2C02H. NaOH, Д, 2 ч. 52.5% (R=H), 44.2% (R=Me); u) DCC, PfpOH, 88% (R=H), 57% (R=Me).

Жг М^феос Ш^еос ЖГфеос Ml^eoc

о^ 'jfy "cAn^ СЛ^

Н Н I II

4CQH ОСЬНр

8 9 4в 5в

iii) Npeoc-Etlm+BFj-, DMF, 73%; iv) BrCH2CO,Bu', K2COj. Cs2COj. DMF, 78%; v) TFA, DCM, 92.5%; vi) DCC, PfpOH, 81%.

Схема 2.

Полученные карбоксиметилированные производные были активированы путем превращения в пентафторфениловые эфиры 5а-в, которые использовали для ацилирования аминокомпонента 3. Реакция конденсации проходит в диметилформамиде или смеси его с ацетонитрилом или дихлорметаном при 20°С за 6-12 ч с высоким выходом. Продукты сочетания ба-в выделяли при помощи колоночной хроматографии и подвергали щелочному гидролизу при помощи 0.1н NaOH в диоксане для тимина и урацила или более селективного реагента - 0.1н LiOH в тетрагидрофуране для предотвращения гидролиза уретановой группы защищенного цитозина с последующей экстракцией тетра-«-бутиламмониевых солей. Извлеченные соли 7а-в выделяли высаживанием в холодный к-гексан из раствора в дихлорметане. Защищенные тетра-н-бутиламмониевые соли мономеров для синтеза PNA, содержащие Mint-группу, отличаются от коммерческих Boc/Z-

защищенных синтонов большей растворимостью в органических растворителях (до 0.5М_ в ацетонитриле для 7а-б или диметилформамиде для 7в), что существенно для обеспечения высокой концентрации при твердофазном синтезе. —

Образование амцоной связи на твердой фазе и подбор подходящих конденсирующих реагентов. Для эффективного создания пептидной связи межлу аминогруппой, иммобилизованной на носителе, и карбоновой кислотой в растворе необходимо присутствие подходящего конденсирующего реагента, активирующего карбоксильную группу. В качестве подобных реагентов в твердофазном синтезе нашли применение карбодиимиды, а также более эффективные реагенты на основе солей фосфония и урония. Большинству существующих соединений этого типа присущ ряд недостатков, которые ограничивают их применение для синтеза полиамидных аналогов нуклеиновых кислот по разработанному нами варианту. Отсутствие протонного катализа в случае тетра-я-бутиламмониевых солей мономеров РИА делает невозможным карбодиимидную активацию. В то же время для высокореакционноспособных урониевых солей описан ряд побочных реакций в синтезе пептидов, связанных с их взаимодействием с аминогруппой на полимере с образованием пентаалкилгуаншшна, что может стать проблемой в случае РИЛ, обладающих более основной первичной аминогруппой, чем в а-аминокислотах. Производные же фосфония, которые не реагируют с аминогруппой, требуют для своего получения токсичных или дорогостоящих исходных веществ. Поэтому поиск более селективных реагентов для твердофазной конденсации РЫА являлся для нас актуальной задачей. В ходе работ был синтезирован ряд ранее не описанных соединений, структура всех продуктов была подтверждена спектрами 'Н-ЯМР и данными масс-спектроскопии.

Хлорангидриды ароматических сульфокислот - мезитилен-2-сульфохлорид и 2,4,6-триизопропилбензолсульфохлорид - хорошо зарекомендовали себя в синтезе олигонуклеотидов фосфотриэфирным способом. Для активации карбоновых кислот были предложены 1-сульфонаты замещенных бензотриазолов. Нами был осуществлен синтез ряда сульфонилькых производных 1-гидроксибензотриазола (рис. 2). Эти соединения показали в основном сходные результаты в конденсации на твердой фазе, наиболее предпочтительным все же оказался 2,4,6-триизопропилбензолсульфонилокси-1-бензотриазол (ТРБ-ОВ!, рис. 2, 11д).

Этот реагент легко образуется при взаимодействии 2,4,6-триизопропил-бензолсульфохлорида и 1-гидроксибензотриазола в тетрагидрофуране в присутствии триэтиламина и является негигроскопичным кристаллическим веществом, стабильным при хранении при +4°С в течение нескольких лет. Опыты показали, что ТРЗ-ОШ практически не взаимодействует с аминогруппой на полимере и может быть использован в избытке до 1.5 экв по отношению к карбоксильному компоненту для более эффективной конденсации. Положительный эффект оказало также введение в реакционную смесь 1.5 экв 1-гидроксибензотриазола. С использованием реагента 11д была синтезирована модельная последовательность РЫЛ и ряд конъюгатов РЫА-ДНК.

Рис. 2. Различные соединения, использованные в качестве конденсирующих реагентов для получении амидной связи на твердой фазе.

К недостаткам ТР$-0[к можно отнести умеренную реакционную способность, поэтому мы продолжали поиск более эффективных реагентов в семействе производных ароматических сульфокислот. Варьирование уходящей группы при атоме серы может привести к заметному изменению реакционной способности активирующих реагентов. Использование в твердофазном синтезе реакциокноспособных аренсульфофгоридов (Мб-Р и ТРЗ-И), сульфонилазидов (Мв-^ и ТР5-Кз) и сульфонильных производных азотистых гетероциклов

О

Я

11а Тз-ове (Я=Н, Я(=Ме); 12 ТР5-ООЬЫ 116 Вг8-ОВ1 (Я=Н, К[=Вг); Ив МЬ8-ОВ1 (Я=Н, а!=Ы02); Иг М5-ОВ1 (Я=Я1=Ме); 11д ТР8-ОВ1 ((^Я^Рг'У

13а Я=Ме; 136 Я=Рг/.

(имидазола, 4-нитроимилазола, 4-нитротриазола), которые хорошо известны по синтезу олигонуклеотидов фосфотриэфирным методом, fie привело к положительным результатам. Нами были также синтезированы сульфонильные производные сильнокислого (рКа=5.2) изонитрозоцианацетамида 13а и 136), а также реагент на основе 1-пшрокси-2-пиридона 14. которые показали сходную с TPS-OBt активность. Лучших результатов, чем в случае TPS-OBt, удалось достичь только с производным 12 - 3-(2,4,6-триизопропилбензолсульфонилокси)-1,2,3-бензотриазин-4-оном (TPS-ODhbt), который показал более высокую активность.

¡) КИ. МеСИ, 20°С. 24 ч, 85%.

Схема 3.

Для твердофазного синтеза большое значение имеет скорость протекания конденсации, особенно в случае автоматизированного варианта. Для быстрой конденсации в пептидном синтезе были предложены реакционноспособные аиилфториды. Поиск реагентов, способных генерировать ацилфториды т .яги в ходе конденсации, продолжает оставаться актуальным для синтеза пептидов в целом. Применение ацилфторидов могло оказаться предпочтительным и для получения РМА. Известная реакционная способность фосфониевых солей, содержащих хорошую уходящую группу, стимулировала поиск фторирующих реагентов среди производных фосфора. Известный реагент гексафторфосфаг /л/н/с-диметиламино-хлорфосфония 15 при действии безводного фторида калия в ацетонитриле был превращен в соответствующий гексафторфосфат трис-диметилзмино-фторфосфония 16.

Аналогичные фторирующие реагенты 17 и 19, созданные на основе солей иминия, были получены из /У-тримегалацетилпирролилина и бис-пентаметиленмочевины через соответствующие соли хлорформамшшния (см. схему 3). Однако, реакционная способность этих трех реагентов оказалась существенно различной. В модельной реакции взаимодействия 2-УУ-МпИ-

аминоэтил-М-(1-урацилилацетил)-глицина с пирролидином, промотируемой реагентами 16, 17 и 19, только в случае иминиевых производных реакция протекала быстро и количественно за 10-15 минут (причем реагент 17 был активнее реагента 19), тогда как соль фгорфосфония взаимодействовала совсем по другому механизму, повидимому, не включавшему промежуточного образования • фторангидрида, но с участием иного, стабильного интермедиата, который медленно реагирует с пирролидином. Реагенты 17 и 19 также оказались эффективны в твердофазном синтезе РИА, тогда как фосфониевая соль 16 - нет.

¡) (СОС|)2, Е1гО/ОСМ, 0°С, 3 ч; ¡¡) КР^, MeCN, 20"С, 6 ч, общий выход 88%; Ш) КОЕк, МеОЧ, 20°С, 4 ч, 74%.

Для более быстрого синтеза РМ на твердой фазе было решено впоследствии использовать ранее описанный реагент гексафторфосфат 3-оксидо-1-бензотриазолил-бмс-пентаметиленформамидиния (НВР1р11, 20), который был синтезирован из хлориминиевой соли 18 и калиевой соли I-гидроксибензотриазола с последующей обработкой гексафгорфосфатом калия по разработанной нами методике (схема 4). Реагент НВРфи с успехом применялся для получения ряда последовательностей РКА, причем показал лучшие результаты, чем более часто используемый реагент тетрафторборат бензотриазолил-1 N-тетраметилурония (ТВТ11).

Из реагентов иминиевого типа для амидной конденсации в растворе при синтезе урацильного мономера РКА был успешно использован тетрафторборат «^е/я-бутил-Лг,Л'-диметш1-хлорформамидиния 21, легко образующийся из доступного 2,2,Д',Л'-тетраметилпропионамида при действии оксалилхлорида и тетрафторбората калия (схема 5). При получении цитозинового мономера стадия конденсации карбоксиметилированного основания и тритшшрованного эфира

18

20

Схема 4.

аминоэтилглицина была проведена с помощью дипентафторфенилкарбоната, ранее предложенного для активации карбоновых кислот путем образования пентафторфениловых эфиров. Этот реагент также был успешно использован в твердофазном синтезе.

21

i) (COCth, ЕьО, 20°С, 2 ч. Ш: ii) KBF4, MeCN, 20»С, 2 ч, 76%.

Схема 5.

Производные солей иминия могут найти применение в синтезе пептидов, содержащих остатки пространственно затрудненных а,а-диалкиламинокислот (а-аминоизомасляной кислоты, изовалина и др.), которые входят в состав природных антибиотиков (пептаиболов). В модельном опыте реагент реагент 19 успешно промотировал конденсацию a-A'-Fmoc-аминоизомасляной кислоты и п-толуолсульфоната бензинового эфира L-пролина. Наши эксперименты показывают, что в этом направлении можно добиться заметных результатов.

Изучение нового вида активированных эфиров для быстрого синтеза карбоксамндов. С целью поиска ускоренных методов амидной конденсации в качестве перспективных кандидатов на роль "суперактивных эфиров" были исследованы производные 1-гидрокси-3,4,5,6-тетрахлорфталимида 21, который легко получается из дешевых и доступных тетрахлорфталевого ангидрида и солянокислого гидроксиламина при нагревании в пиридине (схема 6). На основе гидрокситетрахлорфталимида было разработано семейство реагентов, включающее как активирующие карбоксильную группу производные 25 и 27, так и реагенты для введения Fmoc- и Вос-защит тре/я-бутил-(3,4,5,6-тетрахлорфталимидо)-карбонат 26 и 9-флуоренилметил-(3,4,5,6-тетрахлорфталимидо)карбонат 24. Синтез активированных тетрахлор-фталимидных эфиров может быть осуществлен как с использованием карбодинмида (в качестве примера был синтезирован тетрахлорфталимидный эфир Вос-глииина), так и с применением новых реагентов бнс-(3,4,5,6-тетрахлорфталимидо)-оксалата 27 и гексафторфосфата 3,4,5,6-тетрахлор-фталимидо- \-N.N -пентаметиленурония 25.

tBu

п

tBu

¡) МНгОН.НС1. Ру, 90°С, ч, %: и) Ру, ЕЮН; ш) Киос-а, МЕ13, диоксан, %\ ¡V) Вос20, ЫЕ13, ТНР, %; V) (С5Н|оМ)2С+-С|.РН(1- 18, Ру, МсС1М, %; VI) (СОС|)2, Ру, МеС[Ч. %.

Схема 6.

Высокая кислотность Л'-гидрокситетрахлорфталимида позволяет образование устойчивой пиридиниевой соли 23 оранжевого цвета, которая кристаллизуется из горячего этанола. Эта соль может быть использована как донор тетрахлорфталимидного остатка во многих реакциях. Все изученные соединения представляют собой хорошо кристаллизующиеся твердые вещества, охарактеризованные при помощи масс-спектроскопии по характерной фрагментации тетрахлорфталимидного остатка при электронном ударе. Реагенты для введения защитных групп разработаны с учетом возможности дальнейшего синтеза 3,4,5,6-тетрахлорфталимидных эфиров защищенных аминокислот с использованием карбодиимида после совместной экстракции кислоты и Ы-гидрокситетрахлорфталимида в органическую фазу. Урониевый реагент 25 был успешно испытан в твердофазном синтезе РЫА с эффективностью, аналогичной реагентам на основе 1-гиароксибензотриазола.

Наши исследования показали, что Л'-гидрокси-3,4,5,6-тетрахлорфталимид является подходящим структурным компонентом для получения различного рода активированных производных и может найти применение в синтезе пептидов как возможная альтернатива более дорогим пентафторфениловым эфирам.

Синтез реагентов для введения 2-(4-нитрофенил)этоксикарбонильной группы. Применение ^еос-группы в качестве защиты для экзоциклической аминогруппы остатка цитозина и е-аминогруппы защищенных производных Ь-лизина потребовало синтеза специальных реагентов для ее введения. Так как описанный в л:ггературе для этой цели 2-(4-нитрофенил)-этилхлорформиат не является продажным реагентом, то было решено исходить из доступных компонентов.

2-(4-Нтрофенил)этанол был превращен с высоким выходом под действием Л^УУ'-карбонилдиимидазола в имидазолилкарбамат 27, легко образующий при алкилировании тетрафгорборатом триэтилоксония тетрафторборат УУ-2-(4-нитрофенил)этоксикарбонил-Лг -этилимидазолия 28 (схема 7). Последний является реакнионноспособным кристаллическим веществом, устойчивым при хранении при -5°С в течение нескольких лет. Реагент 28 отличается от описанного в литературе для получения /V-защищенных производных нуклеозидов гигроскопичного хлорида Л^реос-УУ-метилимидазолия большей устойчивостью и способом получения, не требующим использования токсичного фосгена.

а

27 28

¡) 1т2СО, ОСМ, 20°С, 4 ч, 94.5%; ¡¡) Е130+ВР4\ ОСМ. 20°С, 3 ч, 84%.

Схема 7.

Тетрафторборат Л'-Ыреос-/1/-этилимидазолия был использован для получения Л^-Мреос-защищенного цитозина. Суспензию цитозина в диметилформамиде обрабатывали при 20°С реагентом 28, при этом исходная суспензия растворялась и через некоторое время выпадал осадок Ыреос-производного цитозина 8. В отличие от описанных в литературе Ы4-2,- и Л^-Вг-производных вещество 8 достаточно растворимо в диметидсульфоксиде, чтобы

быть охарактеризованным при помощи 'Н-ЯМР. Реагент 28 был использован также для получения е-Мреос-производного лизина.

29

¡) л-нитрофенилхлорформиат. РуДЭСМ, 20°С, 4 ч, 85%.

Схема 8.

Для введения Креос-группы на алифатическую аминогруппу был также предложен устойчивый кристаллический реагент 2-(4-нитрофенил)этил-4'-нитрофенилкарбонат 29, полученный с высоким выходом при обработке 2-(4-нитрофенил)этанола 4-нитрофенилхлорформиатом (схема 8). Реагент 29 взаимодействует с а-Вос-лизином в водном ацетоне с образованием е-Мреос-производного, которое может быть без дальнейшей очистки превращено в 4-нитрофениловый эфир.

Реагенты 28 и 29 были синтезированы нами впервые, их структура подтверждена спектрами 'Н-ЯМР, а свойства позволяют надеяться, что они найдут применение в органическом синтезе для введения Креос-группы, в частности, по экзоцикпическим аминогруппам производных нуклеозидов.

Синтез защищенных производных Ь-лизина. Известно, что введение в состав РИА (как на /У-конец, так и на С-конец) остатков лизина, протонированных при физиологических значениях рН (рКа= 10.53), облегчает образование комплекса с ДНК и увеличивает его стабильность за счет электростатического взаимодействия е-алкиламмониевых катионов с фосфодиэфирными группами. В настоящей работе для введения на С-конец синтезированных олигомеров РИА положительно заряженных групп был получен ряд защищенных производных Ь-лизина, некоторые из них синтезированы впервые.

Ортогонально защищенное производное [.-лизина 32, необходимое для иммобилизации на твердой фазе, было получено из исходного а-Вос-лизина путем ацилирования в-аминогруппы 9-флуоренилметил-Л,-сукцинимшшл-карбонатом с образованием /V, Л"-диуретанового производного 30 и превращения в р-гидроксиэтиламид через промежуточный сукцинимидный эфир 31 (схема 9).

Этаноламид Л^-Вос.А^-Риюс-Ь-лизина был привит к полимерному носителю, содержащему карбоксильную группу, путем образования сложного эфира, который аммонолитически расщепляется (25% МНдОН, 20°С,2 ч), давая С-концевой этаноламид лизина. При этом предполагалось на основе литературных данных, что Рпюс-группа выдержит условия наращивания пептидной цепи на твердой фазе и будет удалена при помощи БВЫ после окончания синтеза олигомера одновременно с Л^-Ыреос-группой цитозина. Однако модельные эксперименты по синтезу тетрамера РИА на Ртос-защюценном полимере показали, что эта группа, повидимому, не вполне стабильна в условиях многократной обработки третичным амином, что может привести к появлению разветвленных олигомеров. Поэтому было решено в дальнейшем использовать более стабильную 2-(4-нитрофенил)-этоксикарбонильную группу в качестве защиты для е-аминогруппы лизина.

NHBoc

32

i) Fmoc-OSu, Na2C03, волн, ацетон, 2.5 ч, 95%; u) DCC, HOSu, DCM, 91%; Ш) этиноламин, THF,

0»С, 2 ч, 93%.

Схема 9.

A^-Boc.AT-Npeoc-L-лизин был получен с высоким выходом при обработке суспензии ос-Вос-лизина в диметилформамиде тетрафторборатом N-Npeoc-N'-этилимидазолия без использования третичного амина (схема 10). Продукт был выделен в в иле некристаллизующегося масла и без дальнейшей очистки использован для иммобилизации на твердой фазе, содержащей 4-гидроксиметилбензоильный линкер, расщепляющийся при обработке насыщенным аммиаком метанолом с образованием С-концевого амида лизина.

UN Л Л CQ.H-- tyœcNH л л CQH

МНВос №Вос

33

¡) Ыреос-ЕИт+ВР4\ ЭМИ. I ч. 98%.

Схема 10.

Для получения р-гидроксиэгиламида Л"*-Вос,Л*-Креос-Ь-лизина 35, аналогичного 32, был использован 2-(4-нитрофенил)этил-4'-нитрофенилкарбонат, который дает возможность применить метод последовательной зашиты е-аминогруппы Ыреос-группой и активации карбоксильной группы посредством 4-нитрофенилового эфира с образованием производного 34 (схема 11). Целевой этаноламид был выделен с низким выходом (28%) ввиду трудности очистки от следов 4-нитрофенола, наличия которого следовало избегать при прививке к карбоксильному полимерному носителю. Амид 35 был иммобилизован на карбоксильном полимере путем этерификации.

О

NBx МВос ЬШзс

34 35

i) Npcoc-ONp, NajCOj, поди, ацетон, 2 ч; ii) DCC, ЕЮАс. общий выход 64%; iii) этанол амин. THF, затем очистка на AJ2O3, 28%.

Схема 11.

Для иммобилизации лизина через образование сложного эфира полиэтиленгликоля были использованы известные производные L-лизина /V-Ртос,Л*-Вос-лизин и ^-Ртос.ЛГ-трифторацетил-^лизин, также содержащие независимо деблокируемые защитные группы. Структура всех полученных продуктов была доказана при помоши 'Н-ЯМР спектров, для производных 34 и 35, кроме того, были записаны спектры 'Н-'Н COSY.

Получение полимерных носителей. Для успешного твердофазного синтеза решающее значение имеет правильный выбор полимерного носителя. В последнее время хорошо зарекомендовавшие себя в синтезе пептидов носители на основе

функционализованного полистирола, сшитого 1 -2% дивинилбензола, вытесняются новым поколением сополимеров полиэтиленгликоля и полистирола (PEG-PS, Tentagel™), содержащих до 70% вес. полиэтиленоксида и равномерно набухающих в широком спектре органических растворителей. Синтез на такого рода носителях более эффективен, они нашли применение как для получения пептидов, так и олигонуклеотидов, а также в комбинаториальном синтезе различных органических соединений. В хроматографии широкой известностью пользуется семейство носителей TSK Gel Toyopearl,M, органическая основа которых представляет собой сополимер поливинилового спирта с метакрилатом. К достоинствам этого типа полимеров необходимо отнести малое изменение объема при смене растворителя, высокую механическую прочность и устойчивость в широком диапазоне pH. Кроме того, структура полимера, представляющая собой повторяющийся фрагмент 1,3-диола, предоставляет широкие возможности для химической модификации. Все эти положительные качества побудили нас выбрать TSK Gel в качестве основы для получения носителя для твердофазного синтеза полиамидных аналогов нуклеиновых кислот (PNA).

СН i,ü О

Ш " VdVvVvvVvvVWWv®

i) POCIj, DCM, 0 "С, 15 мин, 20"С, 45 мин; ¡¡) ПЭГ-400, NMI, Ру, 20°С, 24 ч, затем ß-цианэтанол. 20°С, 24 ч.

Схема 12.

Для создания носителя на основе TS К Gel было решено следовать двум схемам химической модификации: с образованием полиэтиленгликольного и полиамидного линкеров. Для решения первой задачи была разработана методика модификации с помошыо хлорокиси фосфора. При этом высушенный TSK Gel обрабатывали хлорокисью фосфора в дихлорметане при 0°С, а затем полученный полимерный фосфохлоридат при помощи PEG-400 в пиридине переводили в фосфотриэфир (схема 12). Гидроксильная группа полиэтиленгликоля (емкость 0.192 ммоль/г по поглощению Dmt-группы) служила местом присоединения первой аминокислоты PNA при помощи сложного эфира, который расщепляли

щелочным гидролизом с образованием соли кислоты или аммонолизом при помощи аммиака в метаноле с образованием амида. Полимер PEG-TSK Gel был использован для прививки Fmoc-Lys(Boc)-OH (емкость 0.22 ммоль/г) и Fmoc-Lys(Tfa)-OH (емкость 0.26 ммоль/г).

V-CH i,ü,iü >-СИс су.у,vi y—QAc

i) Im2CO, MeCN, 20°C, 24 ч; ii> HCI.H2N(CH2)6NHBoc, DIEA/DMF, 50°C, 24 ч; iü) Ac20, Py; iv) TFA, DCM, 0.5 ч; v) H0CH2C6H4C02Pfp. DMF, 24 ч; vi) Ac-OSu, DMF, 6 ч.

Схема 13.

^ н

¡) 1,2.7,8-лиэпоксиоктан. ЫаОН. волн. ОМЭО, 40°С, 3 ч; и) 1,10-диаминодекан. МеОН, 50°С, 48 ч; ш) ВосЫН(СН2)5С02Н, 01РС. НОВ1, ОМР/ОСМ, 24 ч; ¡V) Ас20, Ру. 1 ч; V) ТРА, ОСМ, 0.5 ч; »¡) янтарный ангидрид, ОМАР, Ру, 20°С, 24 ч.

Схема 14.

Другой способ модификации состоял в обработке носителя УУ.Л^-карбонил-диимидазолом с получением активированного карбамата, который при обработке диамином образует аминоалкильный полимер, пригодный для присоединения подходящего линкера (схема 13). Для эффективной генерации С-терминального карбоксамида при помощи метанольного аммиака был использован полимерный п-карбоксамидобензиловый эфир концевой аминокислоты Вос-Ьу$(Креос)-ОН (емкость 0.15 ммоль/г). Для введения линкера использовали пентафторфениловый эфир 4-гидроксиметилбензойной кислоты.

Аналогичный длинноцепочечный аминоалкильный носитель разветвленной полиамидной структуры был получен путем активации исходного TSK 1,2,7,8-диэпоксиоктаном в 40% водном DMSO с ЗМ NaOH. Эпоксиактивированный гель далее обрабатывали 1,10-диаминодеканом в метаноле с образованием амино-алкильного полимера, который ацилировали б-Л^-Вос-аминокапроновой кислотой и деблокировали Вос-группу при помощи 50% трифторуксусной кислоты в дихлорметане. Полученный таким образом носитель обрабатывали янтарным ангидридом в пиридине с образованием карбоксильного полимера (схема 14). Этот полимер использовали для прививки Boc-Lys(Fmoc)-NHCHiCH20H (емкость 0.1 ммоль/г) и Boc-LysiNpeocVNHCHiCHjOH (емкость 0.19 ммоль/г). Оба носителя пригодны для синтеза PNA с С-концевым этаноламидом.

Использование различных методов модификации носителя TSK Gel позволило нам создать на основе коммерчески доступного хроматографического сорбента семейство полимеров для твердофазного органического синтеза с различной загрузкой функциональными группами и пространственными линкерами различной структуры, которые были успешно адаптированы для твердофазного синтеза как олигонуклеотидов, так и полиамидных аналогов ДНК.

Твердофазный синтез олнгомеров PNA и конъюгатов PNA с ДНК. Получение олнгомеров PNA на твердой фазе проводилось в ручном варианте с применением колонки от ДНК.-синтезатора MilliGen-Biosearch 7500. В качестве модельной последовательности PNA был выбран декамер, содержащий урацил в качестве гетероциклического основания. Полимерным носителем служил PEG-TSK Gel с привитым посредством сложного эфира АЧ-Мтс-аминоэтил-//-(урацилил-1-ацетил)-глицином (емкость 0.207 ммоль/г). Mmt-защгаценный урацильный мономер 7а использовали в количестве 7 экв при длительности конденсации 45 мин-1 ч. В качестве конденсирующего реагента использовался TPS-OBt, средний выход на стадию составил 96%. По окончании конденсации носитель ацетилировали для блокирования непрореагировавших аминогрупп ("кэпирование"). После повторения цикла в течение девяти раз Mmt-содержащий олигомер PNA отщепляли от полимера при помощи 0.5н NaOH в 90% водном метаноле, осторожно нейтрализовали уксусной кислотой и очищали обращенно-фазовой ВЭЖХ, выделяя тритильную фракцию. Далее декамер PNA детритилировали 80% уксусной кислотой и вновь хроматографировали. Структура урацил содержаще го PNA была подтверждена при помощи масс-спектроскопии.

Конъюгаты РЫА-С->5'-ДНК (рис. 3), содержащие десять урацильных звеньев PNA и пять, семь и десять тимидиновых нукдеотидов были получены по сходной методике. Олигодезоксинуклеотидная часть была синтезирована на тимидиновом CPG с помощью автоматического синтезатора Applied Biosystems 381В стандартным ß-иианэтильным фосфорамидитным методом с использованием 2',5'-дидезокси-5'-аминотимидина в качестве мостикового звена между олигонуклеотидным и пептидным фрагментами. По окончании синтеза ДНКовой части полимер переносили в колонку для синтеза PNA и проводили наращивание пептидной цепи по описанной выше методике с применением урацильного мономера и TPS-OBt. Средний выход на стадию составлял 91-99%. Олигомеры отщепляли от носителя концентрированным водным аммиаком и хроматографировали. Попытка использовать Mmt-группу в качестве липофильного элемента при обрашенно-фазовой хроматографии не удалась, поскольку наблюдалось спонтанное деблокирование защитной группы в ходе аммонолиза. Очистка конъюгатов проводилась путем ионообменной ВЭЖХ.

Синтез тимин- и цитозинсодержащих PNA проводился на базе полиамидного носителя TSK Gel, содержащего остаток лизина, присоединенный при помощи этаноламидного и 4-карбоксамидобензильного линкеров, с применением Mmt-зашищенного мономера Т 76 и Mmt,Npeoc-3anwuteHHoro мономера С 7в (5 экв) и урониевого реагента 20 (4.5 экв). Время конденсации варьировали от I до 24 ч. Реакционная способность цитозинового мономера не отличалась от таковой тиминового. После завершения синтеза полимер с 4-карбоксамидобензильным линкером обрабатывали 0.5М DBU в ацетонитриле в течение 24 ч для удаления Npeoc-группы с Л^-цитозина и е-аминогруппы лизина, после чего олигомер отщепляли от носителя в виде С-концевого амида при помощи насыщенного аммиаком метанола в течение 24 ч. Полимер, содержащий привитой ß-ацилоксиэтиламид лизина, вначале обрабатывали 25% водным аммиаком для гидролиза сложноэфирной связи, после чего отщепленный от носителя олигомер обрабатывали DBU. Деблокированные олигомеры выделяли обрашенно-фазовой ВЭЖХ. Синтезированные последовательности PNA, содержащие тимин и цитозин, были использованы для изучения кинетики и термодинамики образования триплекса с радиоактивно-меченной двухцепочечной ДНК методом ко-миграции в полиакриламидном геле.

Предварительные результаты молехулярно-биологического тестирования.

Стабильность комплексов, образованных урацилсодержащими олигомерами РИА и химерными конъюгатами РМА-С-»5'-ДНК с комплементарными последовательностями ДНК была исследована методом термической денатурации. Так как включение в состав РМА остатков урацила было осуществлено нами впервые, представляло интерес влияние замещения тимина урацилом на общую стабильность образующегося комплекса. Результаты опытов по плавлению комплекса, образованного урацильным декамером РМА с матрицей показали, что включение урацила снижает Тт менее чем на 1°С на единичную модификацию (65°С для Н-Ыю-ОН против 73°С для Н-Тю^ух-МНг), при этом так же, как и в случае тиминового декамера, повидимому, образуется высокостабильный триплекс (РИА^ДИК.

н-р

О

И

N

-ГО]пШ-д^уПту

[рТ]пРН

Рис. 3. Структура конъюгатов РМА-С->5'-ДНК, и=5,Ю, 111=4,6,9.

Табл. 1. Стабильность комплексов олигомеров РЫА и конъюгатов РЫА-ДНК с матрицей с!А2о-

Структура олигомеров Р^ и конъюгатов Р^-ДНК Т„„ "С

н-иш-он 65

Н-и5-С-^5'-Т5 <25

Н-иш-С->5'-Т5 65

Н-и10-С->5'-Т7 67

Н-ию-С^'-Тш 70

Была изучена также термическая стабильность конъюгатов PNA с ДНК структуры Н-из-С-^'-Тз, Н-иш-С-^З'-Тз-, Н-ию-С-^'-Т/, Н-и,0-С->.5'-Т10. Для

первого конъюгата стабильность оказалась слишком низкой (Тт<25°С), для остальных были зарегистрированы обычные кривые плавления со значениями Т,п от 65 до 70°С в зависимости от длины ДНКовой части, что свидетельствует об участии последней в Уотсон-Криковском взаимодействии (табл. 1). Следует отметить, что температура плавления конъюгатов, содержащих урацилсодержащий декамер РМА, более чем на 40°С выше, чем у соответствующего ёТю^Аю-

Была исследована способность PNA и конъюгатов PNA-ДНК останавливать синтез ДНК in vitro, осуществляемый ДНК полимеразами на матрице, в качестве которой использовали одноцепочечную форму рекомбинантной плазмиды pGEM-7Zf(+), содержащую вставку dA^. В качестве затравки использовали 5'-|32Р|-меченный универсальный М13-праймер, который отжигали на матрице в присутствии избытка PNA H-U|o-OH или конъюгата H-U|o-C->5'-T5. К образовавшемуся комплексу прибавляли фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I Е. coli и дезоксинуклеозидтрифосфаты. Длину синтезированных фрагментов анализировали электрофорезом в денатурирующем полиакриламидном геле. В присутствии PNA или конъюгата наблюдался сигнал, соответствующий поли(с!А)-области матрицы, смесь, не содержащая производные PNA, не давала такого сигнала. При 37°С триплекс, образованный PNA и коньюгатом, полностью блокировал продвижение по матрице ДНК-полимеразы (рис. 4). Следует отметить, что в случае H-U|o-OH наличие нескольких полос соответствует набору нескольких возможных мест посадки декамера PNA на вставке dAn> тогда как кокыогат полностью перекрывает комплементарную область, давая единственный продукт терминации синтеза ДНК.

Рис. 4. Ингибирование матричного синтеза ДНК в присутствие PNA H-Uio-OH и конъюгата PNA-ДНК H-U|0-C->5'-T5. Дорожки: а) матричный синтез без ингибитора; Ь) ингибирование PNA; с) ингибирование коньюгатом. Справа первичная структура матрицы в качестве контроля длины.

Была изучена также способность конъюгатов PNA-ДНК служить субстратами ферментативных реакций, ассоциированных с ДНКовой частью, содержащей-свободную З'-гидроксильную группу. Конъюгат H-U|0-C->5'-T5 оказался столь же эффективным субстратом для терминальной дезокси-нуклеотидилтрансферазы, как и олигодезоксинуклеотид Тю, тогда как PNA Um не способен участвовать в катализируемой этим ферментом реакции с меченным дезоксинуклеозидтрифосфатом.

Таким образом, мы показали, что синтезированные нами впервые урацилсодержащие конъюгаты PN А с ДНК проявляют свойства, присущие обоим структурным фрагментам - пептидному и олигонуклеотидному, и могут быть перспективными агентами в молекулярно-биологических исследованиях.

Выводы

1. Разработан новый метод твердофазного синтеза триплекс-образующих полиамидных аналогов нуклеиновых кислот (PNA), основанный на

использовании кислотолабильной 4-метокситритильной группы для защиты алифатической аминогруппы и удаляемой при помощи ß-элиминирования 2-(4-нитрофенил)этоксикарбонильной группы для экзоциклической аминогруппы цитозина.

2. Предложен ряд новых активирующих реагентов различной реакционной способности и селективности для синтеза карбоксамидов в растворе и на твердой фазе, показана их применимость для получения PNA и их производных.

3. Описана новая разновидность активированных эфиров карбоновых кислот на основе 1-гидрокси-3,4,5,6-тетрахлорфгалимида, которая может найти применение в синтезе пептидов.

4. Разработано получение ряда новых полимерных носителей для твердофазного синтеза на основе коммерчески доступного хроматографического сорбента TSK Gel Toyopearl1", предложена новая схема дериватизации гидроксилсодержащего полимера с получением полиэтиленгликольного линкера.

5. Показана применимость нового метода для получения конъюгатов PNA с ДНК, в частности, содержащих свободную З'-гидроксильную группу, в ходе

последовательного твердофазного синтеза обоих фрагментов на одном полимерном носителе.

6. Получены предварительные результаты молекулярно-биологического тестирования нового класса соединений, показывающие перспективность их дальнейшего использования.

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

1. Д. А. Стеценко, С. В. Веселовская, Е. Н. Лубяко, В. К. Потапов, Т. Л. Ажикина, Е. Д. Свердлов. Твердофазный синтез урацилсодержаших полиамидных аналогов олигонуклеотидов (ПАО) и их взаимодействие с комплементарными последовательностями.// Докл. Акад. Наук, 1994, т.338, N.5, стр. 695-697.

2. Д. А. Стеценко, Е. Н. Лубяко, В. К. Потапов, Т. Л. Ажикина, Е. Д. Свердлов. Синтез и свойства новых смешанных биополимеров, содержащих олигонуклеотиды и их полиамидные аналоги (ПАО). Конъюгаты пента- и дека-Л'-2-аминоэтил-Лг-(урацил-1-ил)-ацетилглицина и 5'-дезокси-5'-аминопента-тимидиловой кислоты.// Докл. Акад. Наук, 1995, т.343, N.6, стр. 834-837.

3. D. A. Stetsenko, Е. N. Lubyako, V. К. Potapov, Т. L. Azhikina, Е. D. Sverdlov. Solid phase synthesis of uracil-containing polyamide nucleic analogues (PNA) and PNA-oligonucleotide conjugates. // Third International Symposium on Bioorganic Chemistry abstracts. Dagomys, Russia, Sept. 17-23, 1995.

4. D. A. Stetsenko, E. N. Lubyako, V. K. Potapov, T. L. Azhikina, E. D. Sverdlov.

New approach to solid phase synthesis of polyamide nucleic acids analogues (PNA) and PNA-DNA conjugates.//Tetrahedron Letters, 1996, V.37, N.20, p.3571-3574.