Физико-химические характеристики аналогов оливомицина A и их комплексов с ДНК тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

На правах рукописи

Дурандин Никита Александрович

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ АНАЛОГОВ ОЛИВОМИЦИНА А И ИХ КОМПЛЕКСОВ С ДНК

Специальность 02.00.04 - физическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

21 АВГ 2014

Москва-2014

005551904

005551904

Работа выполнена в лаборатории процессов фотосенсибилизации ФГБУН Института биохимической физики имени Н. М. Эмануэля Российской академии наук.

Научный руководитель: Владимир Александрович Кузьмин, доктор химических

наук, профессор, заведующий лабораторией процессов фотосенсибилизации ФГБУН Института биохимической физики имени Н. М. Эмануэля Российской академии наук.

Официальные оппоненты: Комиссаров Геннадий Германович, доктор химических

наук, профессор, заведующий лабораторией фотобионики ФГБУН Института химической физики им. H.H. Семенова Российской академии наук, Москва Олейников Владимир Александрович, доктор физико-математических наук, заведующий лабораторией молекулярной биофизики ФГБУН Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, Москва

Ведущая организация: ФГБУН Институт элементоорганических соединений им.

А.Н. Несмеянова Российской академии наук, Москва.

Защита состоится «15» октября 2014 г. в 1330 часов на заседании диссертационного совета Д 002.039.01 в конференц-зале Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимической физики имени Н. М. Эмануэля Российской академии наук по адресу: 119334, Москва, улица Косыгина, 4.

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке ФГБУН Института химической физики им. H.H. Семенова Российской академии наук и на сайте http://ibcp.chph.ras.ru/2014/

Автореферат разослан « О »пДи/вТЯ- 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 002.039.01 кандидат химических наук

Л.И. Мазалецкая

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность

Оливомицины (производные оливомицина А) относятся к природным антибиотикам группы ауреоловой кислоты, широкое применение которых ограничено их высокой общерезорбтивной токсичностью, Изучение комплексообразования антибиотиков с мишенью и физико-химических параметров образующихся комплексов важно для направленного синтеза высокоэффективных и малотоксичных противоопухолевых препаратов с выраженной биологической (противоопухолевой, противомикробной) активностью и меньшей неспецифической токсичностью.

Важнейший современный подход при создании новых противоопухолевых лекарств основан на идентификации молекулярных мишеней, специфических для раковой клетки, и направленном поиске ингибиторов этих мишеней, что должно обеспечить более эффективную селективную (менее токсичную) терапию опухолей.

Взаимодействие лигандов с ДНК - развивающаяся в настоящее время область исследований. В отдельное и весьма разветвленное направление сформировались исследования по взаимодействию с ДНК различных низкомолекулярных лигандов (красителей, антибиотиков, коротких пептидов и других биологически активных соединений). Эти лиганды являются не только объектами самостоятельного изучения, но и нашли широкое применение в противоопухолевой и противовирусной терапии, а также в качестве ДНК-специфичных молекулярных зондов в медицинских и научных исследованиях.

Основная внутриклеточная мишень аналогов ауреоловой кислоты -двухцепочечная ДНК (дцДНК). С дцДНК производные ауреоловой кислоты прочно взаимодействуют в виде магний-координированного димера, состоящего из двух молекул антибиотика и одного атома магния. Нарушения структуры и функций ДНК в результате комплексообразования являются пусковым механизмом цитотоксичности аналогов ауреоловой кислоты. Таким образом, изучение констант комплексообразования для ряда аналогов оливомицина А с дцДНК и физико-химических характеристик их комплексов с дцДНК формируют экспериментальную основу для целенаправленного синтеза новых соединений указанного химического класса.

Повышенная активность семейства транскрипционных факторов Бр является часто встречающимся и критическим показателем при развитии рака, отвечающим за рост опухоли, ее метастазирования и ангиогенеза. Сайт связывания -транскрипционного фактора, взаимодействующего с вС-обогащенными сайтами в регуляторных областях

генов (в т.ч. онкогенов) - важная мишень анти-траскрипционного эффекта ауреоловой кислоты, так как антибиотик связывался с этим сайтом и снижал Бр1-зависимую транскрипцию. Производные ауреоловой кислоты селективно связываются с ОС-парами в малой бороздке двойной спирали ДНК. Эти участки могут являться сайтами связывания транскрипционных факторов, таких как По этой причине изучение

термодинамических и кинетических характеристик взаимодействия представителей класса ауреоловой кислоты с ОС-богатыми олигонуклеотидами, несущими сайты связывания транскрипционных факторов, таких как Бр1, КРАТ, и видоизмененными олигонуклеотидами важно для углубления представлений о механизмах цитотоксичности соединений указанного химического класса.

В клетке ДНК упакована в высокоорганизованную структуру в виде хроматина. Одной из систем, моделирующих ДНК в условиях ее высокой компактизации, является холестерическая жидкокристаллическая дисперсия на основе дцДНК (хжкд-ДНК). Определение физико-химических параметров комплексообразования физиологически-активных соединений ДНК-направленного действия с хжкд-ДНК представляет особый интерес в силу того, что хжкд-ДНК может наилучшим образом отображать структуру ДНК в нативном состоянии (в структуре хроматина) и характер взаимодействия антибиотиков с ДНК в ядре.

Дель работы - изучение влияния структуры аналогов оливомицина А на их комплексообразование с дцДНК и определение физико-химические характеристик этих аналогов и образующихся комплексов.

В соответствии с указанной целью были поставлены следующие задачи:

- исследовать влияние О-ацильных заместителей А-олиозы и Е-оливомикозы оливомицинов на процесс комплексообразования этих соединений с дцДНК и физико-химические характеристики этих комплексов;

- исследовать влияние заместителей в боковой цепи агликона оливомицина А на процесс комплексообразования с дцДНК и параметры комплексов;

- количественно охарактеризовать взаимодействие оливомицина А с олигонуклеотидом, несущим сайты связывания транскрипционных факторов 8р1 и КРАТ, и его видоизмененными аналогами с заменами отдельных нуклеотидов;

- определить кинетический механизм реакции комплексообразования оливомицина А с олигонуклеотидом, несущим сайты связывания транскрипционных факторов Бр1 и ЫРАТ, и его видоизмененными аналогами;

- определить константы скоростей реакции комплексообразования оливомицина А с олигонуклеотидом, несущим сайты связывания транскрипционных факторов Spl и NF AT, и его видоизмененными аналогами;

исследовать комплексообразование оливомицина А с холестерической жидкокристаллической дисперсией на основе дцЦНК. Научная новизна

Впервые установлено влияние заместителей в боковой цепи агликона и О-ацильных заместителей А-олиозы и Е-оливомикозы оливомицина А на константы комплексообразования с дцДНК и цитотоксичность. Впервые определены константы комплексообразования и константы скоростей реакции комплексообразования оливомицина А и олигонуклеотида, несущего сайты связывания транскрипционных факторов Spl и NFAT, и 2-х аналогов с изменениями отдельных азотистых оснований. Впервые установлено комплексообразование оливомицина А в отсутствие ионов магния с высокоорганизованными структурами на основе дцДНК, а именно холестерической жидкокристаллической дисперсией (хжкд-ДНК). Накопление оливомицина А в структуре хжкд-ДНК приводит к переходу из холестерической формы дисперсии в нематическую. Практическая значимость

Впервые полученные количественные данные (константы комплексообразования, значения квантовых выходов, константы скоростей реакции и др.) для ряда аналогов оливомицина А формируют фундаментальные основы для рационального дизайна новых лекарственных средств данного химического класса. Результаты исследования комплексообразования оливомицина А с олигонуклеотидом, несущим сайты связывания транскрипционных факторов Spl и NFAT, и его аналогами позволили выявить высоко специфическую мишень действия оливомицина А. Обнаруженное влияние оливомицина А на упорядоченные структуры на основе ДНК, характеризующееся изменением организации жидкокристаллической дисперсии, дает представление о взаимодействии антибиотика с ДНК в ее нативном состоянии внутри клеток.

Полученные данные служат основой для создания новых лекарственных средств и могут позволить улучшить уже существующие селективные мишень-направленные противоопухолевые препараты на основе оливомицина А. Апробация работы

Работа представлена на следующих научных конференциях: международная молодежная конференция ИБХФ РАН-ВУЗЫ, Москва, Россия, (2011, 2012); конгресс «Anticancer Agents Research Congress», Antalya, Turkey (2011); 1-я конференция^ International conference on Fluorescent Biomolecules and their Building Blocks - Design and

Applications (FB3), Gothenburg, Sweden (2012); 4-я школа-конференция 4th Photochemistry Summer School 2012 «Photochemistry, Fundamentals and Applications", Wijk aan Zee, the Netherlands (2012); 38-й конгресс 38 FEBS Congress "Mechanisms in Biology", Saint-Petersburg, Russia (2013). Публикации

По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, 2 статьи в сборниках трудов конференций, 4 тезиса докладов на конференциях. Структура и объем работы

Работа изложена на 102 страницах, включает 55 рисунков, 6 таблиц и список литературы. Диссертация состоит из введения, обзора литературных данных, методической части, обсуждения результатов и выводов, списка литературы (89 источников).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе были исследованы процессы комплексообразования лигандов с высокомолекулярной ДНК из спермы лосося (salmon Sperm DNA), состоящей из ~ 500 пар оснований («Sigma Aldrich», США); молекулярная масса ДНК (0,3-0,7)-106 Да. Для создания жидко-кристаллической дисперсии на основе ДНК применяли полиэтиленгликоль с молекулярной массой 4000 Да (Sigma Aldrich, США). Комплексообразование исследовано также для олигонуклеотидов d(TGGCGGGAAAAAG)2 (Spl/NFAT), d(TGTAGGGAAAAAG)2 (Spl/NFAT-ml), d(TGTAGGTAAAAAG)2 (Spl/NFAT-m2) («Литех», Москва). В экспериментах с «внешними» хромофорами использовались митоксантрон (Sigma Aldrich, США) и тиазоловый оранжевый (Sigma Aldrich, США). В качестве внутреннего стандарта для измерения квантового выхода использовали антибиотик из группы ауреоловой кислоты -хромомицин A3 (Sigma Aldrich, США).

Концентрацию оснований ДНК определяли из коэффициента экстинкции 6,7х103 М''см"\ Концентрацию олигонуклеотидов рассчитывали исходя из коэффициентов экстинкции, рассчитанных при помощи программного обеспечения OligoAnalyzer 3.1 от Integrated DNA Technologies (США).

В качестве лигандов были выбраны производные оливомицина А, полученные в в лаборатории химической трансформации антибиотиков Научно-исследовательского института по изысканию новых антибиотиков имени Г.Ф. Гаузе (с.н.с. к.х.н. А.Н. Тевяшовой и др.) под руководством заведующего лабораторией, д.х.н., профессора М.Н. Преображенской;

В - 0ЛНВ0М031

Рисунок 1. Структурные формулы олнвомицниа А и его аналогов.

Название соединения R,

LCTA-254 -ОСОСЩСНз): -ОСОСНз -СН(ОН)СН(ОН)СНз

LCTA-255 -ОСОСН(СНзЬ -он -СН(ОН)СН(ОН)СНз

LCTA-1721 -ОСОСНз -ОСОСНз -СН(ОН)СН(ОН)СН3

LCTA-1839 -ОН -ОН -СН(ОН)СН(ОН)СНз

LCTA-1840 -он -ОСОСНз -СН(ОН)СН(ОН)СНз

LCTA-1498 -OCOCH(CHj)2 -ОСОСНз -он

LCTA-1599 -OCOCH(CHjb -ОСОСНз -NHCjfV^CHjk

В качестве растворителя лигандов и ДНК использовали трис-HCl буфер. Концентрацию ДНК определяли по известному коэффициенту экстинкции и оптической плотности раствора ДНК. Эксперименты были проведены в трис-HCl буфере с концентрацией 0,01М, рН~7,5 в присутствии хлорида магния с концентрацией 5*10~2 М.

Концентрации лигандов подбирались таким образом, чтобы оптическая плотность в экспериментах по поглощению не превышала 1 O.E., что соответствует концентрации Ю^-Ю"4 М, и определялись по известным коэффициентам экстинкции в этиловом спирте.

В экспериментах по флуоресценции концентрация красителей была значительно меньше, порядка lO'MO"6 М. Растворы красителей приготавливались в этиловом спирте и разбавлялись трис-HCl буфером. Все растворы были приготовлены непосредственно перед проведением эксперимента и оставлялись на 60 минут.

Измерения спектров поглощения проводились на спектрофотометре «Shimadzu UV-3101 PC» (Япония) в кварцевых кюветах 10x10 мм. Для получения спектров флуоресценции применяли спектрофлуориметр «Shimadzu RF-5301 PC» (Shimadzu, Япония). Из кривых зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации ДНК в

растворе антибиотиков определяли концентрации связанного и свободного лигандов, после чего эти зависимости преобразовывали в координатах Скэтчарда, чтобы рассчитать равновесные константы комплексообразования.

Зависимость Скэтчарда: 9/[DNA] = 1/К.-9/К. (1) [DNA](rte=[DNA]t-[DNA]b=[DNA]r-[LCTA]tx(I-Io)/(Ima<-Io)

[LCTA]free=[LCTA]tx(U^I)/(Imax-I„)

[LCTA]b=[LCTA]tx(I—Io)/0imii—lo)

9=[LCTA]b/[LCTA],

В данных уравнениях Ka - константа связывания, 10, 1тах, I - значения интенсивности флуоресценции, минимальной, максимальной и текущей соответственно, [LCTA] и [DNA] - концентрации красителя и ДНК, индексы b и free соответствуют концентрациям лиганда, связанного с ДНК и свободного, соответственно.

Квантовый выход флуоресценции определяли методом сравнения со стандартом по уравнению:

_jf. v ^fl образ * ^сганд Х ^сгалд Х^образ

Побрм~ flcT™ s„ xg xc« xn2 '

f. сганд образ обра» ствид

где Фя 0браз - квантовый выход флуоресценции исследуемого образца, Фц эта„д -квантовый выход флуоресценции стандарта, Sn образ - площадь спектра флуоресценции образца, Sa ств„д - площадь спектра флуоресценции стандарта, сши -молярный коэффициент экстинкции стандарта, е0браз - молярный коэффициент экстинкции образца, Побраз - коэффициент преломления среды образца, па,„л -коэффициент преломления среды стандарта, с0бРаз - концентрация образца (в М), Ссганд - концентрация стандарта (в М).

Стандартом служил комплекс хромомицина Аз с ДНК с известным квантовым выходом. Квантовые выходы флуоресценции лигандов в комплексах с ДНК определяли при высоких концентрациях ДНК, когда в буферных растворах лиганды присутствовали только в виде комплексов с ДНК.

Для определения типов образующихся комплексов антибиотиков с ДНК и олигонуклеотидами проводились измерения спектров кругового дихроизма (КД) на дихрометре СКД-2М (Троицк, Россия), оборудованным термостатируемой ячейкой.

Для того, чтобы детектировать кинетики взаимодействия оливомицина А с олигонуклеотидами в миллисекундном/секундном диапазоне, а также фиксировать промежуточные продукты на основе их флуоресцентных характеристик использовали установку остановленной струи SX-20 (Applied Photophysics, Великобритания).

Обработку полученных данных проводили с использованием программного обеспечения OriginPro8 (О^тЬаЬ, США).

Физико-химические свойства аналогов оливомицина А с ацильными заместителями в составе А-олиозы и Е-оливомикозы и их комплексов с ДНК.

Определение констант комплексообразования аналогов оливомицина А с ацильными заместителями в составе А-олиозы и Е-оливомикозы с ДНК.

При помощи спектрофлуорометрического метода регистрировалось образование комплексов аналогов оливомицина А ЬСТА-255, ЬСТА-254, ЬСТА-1721, ЬСТА-1839, ЬСТА-1840 с дцДНК. Образование комплексов А ЬСТА-255, ЬСТА-254, ЬСТА-1721, ЬСТА-1839, ЬСТА-1840 с дцДНК регистрировали по увеличению интенсивности спектров флуоресценции на длине волны Я*т=535 нм при возбуждении Хех=420 нм (рисунки 1 и 2).

Рисунок 1. Спектры флуоресценции ЬСТА- Рисунок 2. Зависимость интенсивности 254 (1*10"7 М) при увеличивающихся флуоресценции при 535 нм для ЬСТА-254 от концентрациях дцДНК (от О М до в^хЮ"4 М концентрации дцДНК.

С использованием данных флуоресценции, константы комплексообразования (Ка) ЬСТА-255, ЬСТА-254, ЬСТА-1721, ЬСТА-1839, ЬСТА-1840 с дцДНК рассчитывали по методу Скэтчарда (рисунки 3 и 4).

Из-за слабого взаимодействия антибиотиков ЬСТА-1840 и ЬСТА-1839 с дцДНК и, как следствие, отсутствия характерной кривой насыщения, полученной для других антибиотиков, К, для ЬСТА-1840 и ЬСТА-1839 с ДНК точно определить не представляется возможным. Оценочное значение Ка для ЬСТА-1840 и ДНК составляет Ка<2,5хЮ2 М"1, а для ЬСТА-1839 и ДНК оно составляет Ка<1,5*102 М"1.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

4Ы Ж ЯП 320 М» $8*

Дшиа В0.1НЫ (и*)

♦

•л ШИ"*

ЫИКНМ)

П.о.).

î-îll»' ÎJJi!«'

j^lMt' S »«'

7, li*

S.H?

Jili' II]«*

Рисунок 3. График Скэтчарда для LCTA-254 Рисунок 4. График Скэтчарда для LCTA-

(звезды) и LCTA-1721 (шестиугольники) и 255 и дцДНК

дцДНК.

Ка для LCTA-255, LCTA-254, LCTA-1721, LCTA-1839, LCTA-1840 с дцДНК, определенные по методу Скэтчарда, приведены в таблице 1.

Таблица 1. Константы комплексообразования с дцДНК аналогов оливомицииа А с ацильными заместителями в А-олнозе и Е-оливомикозе.

Соединение К, (M1)

LCTA-254 2,4xl05±2,2xl04

LCTA-255 4xl04±5xl0J; Ixl03±3xl02

LCTA-1721 1x104±2,8X10j

LCTA-1840 <2,5 xlO2

LCTA-1839 <l,5xl02

Исследование комплексообразования с ДНК аналогов оливомицина А с ацильными заместителями в составе А-олиозы и Е-оливомикозы (метод кругового дихроизма).

Для соединений ЬСТА-254, ЬСТА-255, 1ХТА-1721 наблюдалось значительное возрастание длинноволновой положительной полосы в спектре КД при их комплексообразовании с дцДНК (1 мМ) (рисунки 5 и б). Спектры КД комплексов антибиотиков ЬСТА-254, ЬСТА-255, ЬСТА-1721 с дцДНК свидетельствуют о том, что взаимодействие с дцДНК вызывает сходные изменения в структуре соединений и образуется один тип комплекса, а именно, комплекс по малой бороздке дцДНК. Длинноволновые максимумы КД в комплексах соединений 1ХТА-254, ЬСТА-255, ЬСТА-1721 совпадают, однако их амплитуды существенно различаются. Амплитуды длинноволновых полос в спектрах КД комплексов лигандов с дцДНК при прочих равных условиях возрастают в ряду ЬСТА-1839<ЬСТА-1840<ЬСТА-255<ЬСТА-1721<ЬСТА-254,

что обусловлено увеличением в данном ряду прочности образующихся комплексов лигандов со спиральной структурой молекулы дцДНК.

I г

'•о- ЮТА М«

ЬСТА-ЗМ »ДНК . 1ГТА-1Н

-*~1сгл-:я«дик

V- 1СТА-«Ив ♦-иТ41«4в|,ТНГ

• /» I

'¿-чА

з« яа «и 4» «и ш Длиив волны (мм)

Рнсунок 5. Спектры КД ЬСТА-254 (красные незаштрихованные квадраты), ЬСТА-255 (коричневые незаштрихованные

треугольники) и ЬСТА-1840 (зеленые незаштрихованные ромбы) (1x10"® М) а их комплексов с дцДНК (при [ДНК|= ХхЮ"3 М п.о.) (заштрихованные красные квадраты, коричневые треугольники и зеленые ромбы, соответственно).

Итак, более сильное взаимодействие лиганда со спиральной структурой дцДНК вызывает больший эффект наведенного КД.

! 4

!!

- и-тытп

- ЬСТА-ШI «ДНК

- идч-ии

- 1ХТА*11МгЛНК

Рисунок б. Спектры ВД ЬСТА-1721 (незаштрихованные синие круги) и ЬСТА-1839 (незаштрихованные черные треугольники) (1*10": М) и их комплексов с дцДНК ([ДНК] = МО'3 М п.о.) (заштрихованные синие круги, черные треугольники, соответственно).

М Я) « «I 4« 4М 4М N0 ДгЧНИШ волны (лм)

Определение квантовых выходов флуоресценции аналогов оливомщина А с аципъньши заместителями в составе А-олиозы и Е-оливомикозы и их комплексов с ДНК.

Для расчета значений квантовых выходов флуоресценции использовали метод сравнения со стандартом согласно уравнению, приведенному в главе «Материалы и методы исследования». В качестве внутреннего стандарта использовали хромомицин Аз в комплексе с дцДНК с известным квантовым выходом.

Данные, представленные в таблицах 1 и 2, свидетельствуют о том, что ацильные

Таблица 2. Квантовые выходы флуоресценции аналогов оливомицина А с ацильными заместителями в А- олиозе и Е-оливомикозе и их комплексов с дцДНК.

Соединение Флт(%) Фкомпл(%)

ЬСТА-254 0,18 2,5

ЬСТА-255 0,12 1,8

ЬСТА-1721 0,15 2,3

ЬСТА-1840 0,1 1,17

ЬСТА-1839 0,07 0,3

заместители в составе А-олиозы и Е-оливомикозы сильно влияют на квантовые выходы флуоресценции 1ХТА-255, ЬСТА-254,1ХТА-1721, ЬСТА-1839, 1ХТА-1840 и их комплексов с ДНК и определяют изменения констант комплексообразования

этих лигандов с ДНК. Так, константа комплексообразования для ЬСТА-254 примерно в 5 раз выше, чем для ЬСТА-255 и в 20 раз выше по сравнению с ЬСТА-1721, а квантовые выходы флуоресценции лигандов в буферных растворах и в комплексах с ДНК изменяются в широких пределах: от 0,07 до 2,5 %. Данные, представленные во 2-й и 3-й колонках таблицы 2, свидетельствуют о том, что заместители в составе А-олиозы и Е-оливомикозы в разной степени влияют на квантовые выходы флуоресценции лигандов в буферных растворах и в комплексах с ДНК. Это может быть обусловлено различием в микроокружении молекул лигандов в буферных растворах и в комплексе с ДНК. Взаимодействие лигандов с ДНК приводит к изменению квантовых выходов флуоресценции. Действительно, квантовые выходы флуоресценции, например, для ЬСТА-

254 и ЬСТА-255 в комплексе с ДНК возрастают, соответственно, в 13,7 и 14,4 раз (таблица 2). При наличии сложноэфирных заместителей в Яг (ЬСТА-254) возможно образование водородной связи между А-олиозой одной молекулы антибиотика и О-оливозой другой молекулы антибиотика в составе магниевого комплекса. Образование такой межмолекулярной водородной связи делает комплекс более компактным, придает жесткость структуре, в которой понижена подвижность заместителей. Поэтому квантовые выходы в этих соединениях должны быть выше, чем в соединениях, содержащих ОН-группу (ЬСТА-255), в которых такая внутримолекулярная водородная, по-видимому, связь не образуется. Структура ЬСТА-255 представляется более «рыхлой» по сравнению с ЬСТА-254. Действительно, ЬСТА-254 обладает более высокими квантовыми выходами флуоресценции, чем ЬСТА-255, и в комплексе с ДНК, и в буфере.

Значения квантовых выходов флуоресценции в ряду соединений ЬСТА-254, ЬСТА-

255 в буферных растворах изменяется под влиянием внутримолекулярной водородной связи (ЬСТА-254). Поэтому более «рыхлая» структура ЬСТА-255 обусловливает меньшее, чем для ЬСТА-254, значение квантового выхода флуоресценции, как в буферном растворе, так и в комплексе с ДНК.

Структуры соединений ЬСТА-254, ЬСТА-255 различаются только заместителями в дисахаридной цепи, структура же трисахаридной цепи для этих соединений одинакова. Заместители в трисахаридной цепи обусловливают взаимодействие оливомицинов А с малой бороздкой двухцепочечной ДНК. Поэтому важно исследовать влияние структуры заместителей трисахаридной цепи на Ка ЬСТА-1721, ЬСТА-1839, ЬСТА-1840 с дцДНК. С этой целью были изучены соединения ЬСТА-1721, у которого ацетильный заместитель в положении Я], ЬСТА-1839, у которого Я, = Я2 = ОН, и ЬСТА-1840 с Я1 = ОН.

Из данных, представленных в таблице 1, видно, что ЬСТА-1721 характеризуется значением Ка = 1 х 104 ± 2,8* 103 М, которое по порядку величины сопоставимо со

значением константы для ЬСТА-255. Оценочное значение Ка для ЬСТА-1840 и ЬСТА-1839 почти на 3 порядка меньше, чем для ЬСТА-254, и почти на 2 порядка меньше, чем для ЬСТА-255 и ЬСТА-1721.

В таблице 2 представлены значения квантовых выходов флуоресценции для ЬСТА-1721, ЬСТА-1839 и ЬСТА-1840. Для ЬСТА-1721 значения квантовых выходов близки к ЬСТА-254, в то время как ЬСТА-1840 и ЬСТА-1839 характеризуются значительно более низкими значениями. Структура ЬСТА-1721 отличается от структуры ЬСТА-254 наличием ацетильного заместителя вместо изобутирильного в трисахаридном фрагменте. Как видно из сравнения ЬСТА-254 и ЬСТА-1721, замена изобутирильного заместителя на ацетильный приводит к снижению константы комплексообразования и квантовых выходов. Это может быть обусловлено изменением гидрофобного вклада при взаимодействии антибиотиков и ДНК: изобутирильный заместитель в ЬСТА-254 характеризуется большей гидрофобностью по сравнению с ацетильным в ЬСТА-1721. Еще более существенное снижение Ка и Фп наблюдается при замене ацетильной группы на гидроксильную в этом же положении при сопоставлении ЬСТА-1721 и ЬСТА-1839 и ЬСТА-1840. Подтверждением этому служат результаты, полученные при замене ацетильного заместителя на гидроксильный в дисахаридной цепи в составе А-олиозы (ЬСТА-1840 и ЬСТА-1839), что вызывает столь резкое снижение и Ка, что ее вычисление не представляется возможным: в ЬСТА-1839, помимо снижения гидрофобности трисахаридной ветви, отсутствует внутримолекулярная водородная связь. Также для ЬСТА-1839 зафиксированы самые низкие значения Фп как лиганда в буфере, так и в составе комплекса с ДНК, в ряду исследованных аналогов оливомицина А.

Таким образом, соединения с двумя ацильными заместителями в сахаридных цепях - ЬСТА-254 и ЬСТА-1721 - характеризуются наибольшими К, с ДНК (2,4x105 М и 1х104 М, соответственно), Флиг и Ф„омпл и амплитудами индуцированного КД в комплексе с ДНК. Замена ацетильного заместителя в составе А-олиозы на гидроксильный (ЬСТА-255) приводит к уменьшению Флиг и ФКОмпл, а также амплитуды индуцированного КД в присутствии с ДНК. Де-О-ацилирование изобутирильного остатка в составе Е-оливомикозы (ЬСТА-1840), как и полное деацилирование в составе А-олиозы и Е-оливомикозы (ЬСТА-1839) полностью нарушают комплексообразование этих лигандов с ДНК (К,<2,5х102 М"' и Ка<1,5х102 М"1, соответственно), существенно уменьшают Флиг и Фюмпл и амплитуды индуцированного КД в комплексе с ДНК. Следовательно, замена заместителей в дисахаридной и трисахаридной цепях антибиотика, позволяет варьировать физико-химические свойства соединений и их комплексов с ДНК в широких пределах.

Физико-химические свойства аналогов оливомицина А с карбоксильным и Г^-диметиламиноэтиламидиым заместителями в боковой цепи агликона и их комплексов с ДНК.

Определение констант комгшексообразования и квантовых выходов флуоресценции комплексов аналогов оливомицина А с карбоксильным и диметиламиноэтиламидным заместителями в боковой цепи агликона с ДНК.

Исходя из полученных зависимостей интенсивности флуоресценции (при Х=530 нм) от концентрации дцДНК (рисунок 7) определяли константы комплексообразования ЬСТА-1498 и ЬСТА-1599 с дцДНК по методу Скэтчарда (рисунок 8). Квантовые выходы флуоресценции комплексов 1ХТА-1599 и ЬСТА-1498 с дцДНК определяли методом сравнения со стандартом, как было сделано для ЬСТА-254. Полученные данные сведены в таблицу 3.

/

I

Т.

§ и»иС-

5 • 1« 2» М 4« м и « м м м м м м и»

[ДНК1.Н.Ч 9

Рисунок 7. Зависимость интенсивности Рисунок 8. График Скэтчарда для ЬСТА-флуоресценции при 530 нм для ЬСТА-1599 от 1498 (ромбы) и ЬСТА-1599 (круги) и дцДНК. концентрации дцДНК.

Таблица 3. Константы комплексообразования данных таблицы 3

аналогов оливомицина А с карбоксильным и Г»Л- следует> что амидная „

диметиламиноэтиламидным заместителями в

боковой цепи агликояа с дцДНК и квантовые структуре 1ХТА-1599 облегчает выходы флуоресценции их комплексов с дцДНК.

встраивание лиганда в малую бороздку ДНК. Действительно, наличие N,14-

диметиламиноэтиламидной группы

Соединение К, (М-1) Фкомпл (%)

ЬСТА-1599 1,35х103±1,6хЮ4 2,0

ЬСТА-1498 2,1х104±1,24хю3 1,9

увеличивает сродство 1ХТА-1599 к ДНК в 6,4 раза по сравнению с ЬСТА-1498. Можно предположить, что резкое снижение Ка обусловлено наличием отрицательно заряженной при нейтральном рН карбоксильной группы, которая затрудняет комплексообразование антибиотика с ДНК, имеющей в своей структуре отрицательно заряженный сахарофосфатный остов, то есть электростатическим барьером. Важно отметить, что нивелирование отрицательно заряженной группы 1ХТА-1498 при переходе к амидной

группе ЬСТА-1599 приводит к увеличению квантового выхода флуоресценции в комплексе с ДНК (таблица 3). В отсутствие электростатического барьера ЬСТА-1599, по-видимому, более прочно закреплен в малой бороздке ДНК, что уменьшает количество степеней свободы молекулы антибиотика, замедляя безызлучательные процессы. В свою очередь, это увеличивает Фк0*пл и К,. Немаловажным представляется тот факт, что ЬСТА-1599 за счет амидной группы представляет собой более гидрофобную молекулу, чем ЬСТА-1498. Это позволяет лиганду ЬСТА-1599 образовать более прочный комплекс с ДНК, что подтверждает доминирующую энтропийную природу данного взаимодействия. Потеря гидрофобности при переходе от амидной группы к карбоксильной существенным образом сказывается на Ка, уменьшая ее в 6,4 раза.

При сравнении К, ЬСТА-1599 и ЬСТА-1498 с ЬСТА-254 видно, что Ка для первого и последнего соединений в ряду отличаются менее, чем в 2 раза, в то время как для ЬСТА-1498 и ЬСТА-254 Ка различаются более, чем в 10 раз. Несмотря на более гидрофобную амидную группу ЬСТА-1599, Ка этого антибиотика с ДНК в 2 раза меньше по сравнению с К, для ЬСТА-254. Важную роль при комплексообразовании играет стерический фактор, так как объемный Ы,К-диметиламиноэтиламидный заместитель затрудняет взаимодействие ЬСТА-1599 с малой бороздкой ДНК. Наличие отрицательно заряженной карбоксильной группы в ЬСТА-1498 и вовсе снижает К» в 10 раз.

Исходя из вышесказанного, можно заключить, что заместители в боковой цепи агликона играют важную роль в комплексообразовании с ДНК, а также влияют на Фкомпл* Замена вицинальных гидроксилов ЬСТА-254 на карбоксильную группу в ЬСТА-1498 приводит к уменьшению Ка в 10 раз, в то время как амидирование карбоксильной группы на >Г,М-диметиламиноэтиламиднук> группу приводило к росту Ка в 6,4 раза.

Спектрально-кинетические характеристики комплексов оливомицина А с олигонуклеотидом врХ/ОТАТ и его аналогами 8рШРАТ-т1и 8р1ЛЧРАТ-т2.

Исследование комплексе/образования оливомицина А с олигонуклеотидами Бр1/ЫРАТи его аналогами 5р1/НРАТ-т1 и 8р1/МРАТ-т2 методом кругового дихроизма

Поглощение в области индуцированного КД в полосе ЬСТА-254 в присутствии олигонуклеотидов БрШРАТ, 5рШРАТ-т1, Бр1/ОТАТ-т2 имеют положительный знак, что свидетельствует о комплексообразовании с олигонуклеотидами по малой бороздке. Поглощение в спектре индуцированного КД для комплекса ЬСТА-254 с олигонуклеотидом 8р1/ОТАТ в 3,5 раза выше по сравнению с амплитудой свободного лиганда. Поглощение КД комплексов ЬСТА-254 с олигонуклеотидами увеличиваются в ряду 8р1/МРАТ-ш2<8рШРАТ-т1<8рШРАТ при одинаковых условиях измерения

(рисунок 9), что может говорить об увеличении взаимодействия между лигандом и спиральной структурой олигонуклеотида, т.к. более сильное взаимодействие между лигандом и мишенью вызывает больший сигнал индуцированного КД.

5» Л5 ЛИ» 415 450 475 «И Длина волны (иц)

Рисунок 9. Спектры КД ЬСТА-254 (непрерывная линия) и комплексов ЬСТА-254 ([ЬСТА-254]= 1x1 (Г5 М) с олигонуклеотидами 8р1/ОТАТ

([8рШРАТ]=2хЮ-5 М) (черный со звездами), 8рЮТАТ-т1 ([8р1/ОТАТ-т1 ]=2 хЮ"5 М) (пунктир), 8р1/ЯРАТ-т2 ([врШКАТ-т2]=2х10'5М) (точки).

Определение констант комплексообразования оливомицина А с олигонуклеотидом ЯрШЕАТиего аналогами 8р1МРАТ-т1 и 5р1/ЫРАТ-т2

Последовательное увеличение концентрации олигонуклеотидов 8р1/ЫРАТ, 8р1/№АТ-т1 в растворе ЬСТА-254 приводило к увеличению интенсивности флуоресценции лиганда (Хех—425 нм; Хеш-470 нм и 535 нм) (рисунок 10). Изменения интенсивности спектров флуоресценции ЬСТА-254 при последовательном увеличении концентрации 8р1/МРАТ-т2 не наблюдалось.

Исходя из кривых насыщения, были рассчитаны концентрации свободного и связанного антибиотика. Эти данные были преобразованы в координатах Скэтчарда (рисунок 11) в соответствии с уравнением Скэтчарда:

г/Сг = К0 х(п-г), где г = [ЬСТА-254]ь/[о^о]! - соотношение концентрации связанного антибиотика на добавленную концентрацию олигонуклеотида; Cf = [ЬСТА-254]Ггее -концентрация свободного (несвязанного) антибиотика; Ка - равновесная константа комплексообразования, п-стехиометрический коэффициент.

1.0,10 ' дав ' 4Л>\ 10'

Рисунок 10. Зависимость интенсивности Рисунок 11. График Скэтчарда комплексо-

флуоресценции ЬСТА-254 (2 мкМ) (Х,т=535 образования ЬСТА-254 и олигонуклеотида

пт) от концентрации олигонуклеотида врУМРАТ. 8р1/ГОГАТ.

Полученные константы комплексообразования производного ЬСТА-254 с тремя олигонуклеотидами и стехиометрические коэффициенты представлены в таблице 4.

Олигонуклеотиды БрШРАТ, 8р1/ЫРАТ-т1, 8р1/ЫРАТ-т2 отличаются друг от друга последовательностью пар оснований. ЭрШРАТ является самым ОС-насыщенным, в то время как у 8р1/ЫРАТ-т1 и 8р1/ЫРАТ-т2 заменены отдельные О/С-основания на АЯ, что сильно влияет на комплексообразование с ЬСТА-254. Исходя из данных стехиометрии, можно предположить, что в структуре олигонуклеотидов ЭрШРАТ и 8р1/ЫРАТ-т1 имеется только один сайт связывания ЬСТА-254. Для системы олигонуклеотида 8рШРАТ-т2 и ЬСТА-254 К», как и стехиометрию, определить не удалось из-за слабого изменения спектров флуоресценции. Так, в ряду олигонуклеотидов ЭрШРАТ, 8р1/МРАТ-т1, 5р1/№АТ-т2 оливомицин А проявлял наибольшую аффинность к Эр1/ЫРАТ (~5,2><106 М"1), что может говорить о крайне высокой специфичности антибиотика к данной последовательности ДНК (Ка оливомицина А с дцЦНК спермы лосося составляла лишь 2,4x105 М'1). Нарушение состава бС-насыщенного участка в 8рШРАТ-га1 по сравнению с 8р1/№АТ привело к существенному снижению К, (-7,5*105 М"1), что почти на порядок меньше, чем для исходного олигонуклеотида 8р1/МРАТ. Это согласуется с данными о высокой специфичности комплексообразования оливомицина А с олигонуклеотидом БрШРАТ. Дальнейшее изменение состава исходного олигонуклеотида БрШРАТ, как в врШРАТ-тг, а именно, увеличение количества А/Т оснований вместо в/С, привело к еще более существенному снижению К„, которую рассчитать не удалось. По оценочным данным она составляет < 2,5х 104 М"1 (таблица 4).

Исследование комплексообразования оливомицина А с олигонуклеотидом БрШРАТ и его аналогами 8рШРАТ-т1 и 5р1ШАТ-т2 методом остановленной струи с флуоресцентной детекцией.

Кинетика комплексообразования оливомицина А с олигонуклеотидами БрШРАТ, 8р1/ЫРАТ-т1 регистрировалась по возгоранию флуоресценции ЬСТА-254 (при Х*т>450 и Х,х=425 им) в миллисекундном/секундном диапазоне. Из рисунков 12 и 13 видно, что исследуемый процесс аппроксимируется двумя временами релаксации, изменяющимися от концентрации олигонуклеотида (на примере 8р1/ЫРАТ).

Таблица 4. Параметры комплексообразования оливомицина А с олигонуклеотидами врШРАТ, врЮТАТ-шХ и БрШРАТ-тг._

Олигонуклеотид К. (М-1) п

врЮТАТ 5,2хЮь±5, бхЮ* 0,9±0,03

8рШРАТ-т1 7,5x10^ х103 0,94±0,165

8рШРАТ-т2 <2,5x10* -

•Л5' М>

-•JS AU -119

•4J«'

Вргма (с)

время (с) ' '

Рисунок 12. Представление кинетической Рисунок 13. Кинетические кривые

кривой изменения интенсивности изменения интенсивности флуоресценции

флуоресценции в логарифмическом масштабе (U) комплекса оливомицина А (1 мкМ) с

(logU) комплекса оливомицниа А (1 мкМ) с ионамн магния (50 мМ) прк связывании с

ионами магния (50 мМ) при связывании с олигонуклеотидом Spl/NFAT (1-4 мкМ, 2 -

олигонуклеотидом Spl/NFAT (20 мкМ) в виде 5 мкМ, 3-10 мкМ, 4-20 мкМ).

суммы двух экспонент U(t)=Aie'Y+A2e'V:

экспериментальная кривая U(t) (серый),

аппроксимация экспериментальной кривой

U(t) (1); экспонента Aie'Y (2), экспонента А2е"

V(3).

Наблюдаемые кинетические кривые можно объяснить механизмом двух последовательных реакций:

Оливомицин А + олигонуклеотид ( Ь" > комплекс I < к" > комплекс II

k2l Ь32

Первая стадия процесса характеризуется быстрым временем релаксации, вторая -более медленным, и их можно связать следующей серией уравнений:

для первой стадии:

для второй стадии:

— = Л! = ¿12 • [о(/0о] + к21 » кгз + к32

1 . . • [ol'ffQ]

— - Л2 = К32 + /с2з т;-. г„г(.„1 , 1

Т2 л,,1 • [ollflo] + 1

кгз

В соответствии с серией уравнений зависимость обратного времени релаксации первой стадии процесса Х| представляет собой прямую. На рисунках 14 и 15 показана экспериментальная и аппроксимированная, исходя из серии уравнений, зависимость и %2 от концентрации олигонуклеотида 8р1/ЫРАТ. Константу комплексообразования рассчитывали с использованием уравнения: Кеч = Кц! • (1 + Кеч2)

Значения констант скоростей реакций и равновесных констант комплексообразования приведены в таблице 5.

Данные, полученные кинетическим методом, согласуются с результатами флуоресцентного титрования, что может говорить о верности предложенной кинетической схемы.

№>1«ГЛТ| (М) |9р1ЛЧГАТ| (М)

Рисунок 14. Зависимость обратного времени Рисунок 15. Зависимость обратного релаксации 1-й стадии 7.1 процесса времени релаксации 2-й стадии}«процесса комплексообразования оливомицина А с комплексообразования оливомицива А с

8р1/КРАТ в зависимости от концентрации 5р1/ТчТАТ в зависимости от концентрации

8р1/1ЧГАТ. 5р1/1ЧТАТ.

Таблица 5. Кинетические параметры комплексообразования оливомицина А с олигонуклеотидами 5р1/ТЧГАТ и 8р1/ОТАТ-т1.

олигонуклеотид ки, М'с1 кги с"' КсЧ1, м1 к23, с1 кц, с'1 Кы,2

врЮТАТ 4x10" 0,13 3,08х 10^ 0,1 2,25x10"3 44,4 1,37x10'

врЮТАТ-ш! 3,9x1 о' 0,17 2,3 х10" 0,12 2,3x10"2 5,2 1,2x103

Анализ кинетических кривых позволяет сделать вывод о том, что механизм комплексообразования оливомицина А с олигонуклеотидами БрШРАТ, 5рШРАТ-т1 хорошо аппроксимируется моделью двух последовательных реакций: одной быстрой и второй - более медленной. Модель рассматривает образование промежуточного комплекса (комплекс I) на первой стадии процесса с последующей его перестройкой в более стабильный комплекс (комплекс II) на второй стадии. Каждая стадия зависит от состава олигонуклеотида. В связи с этим, первая стадия, вероятно, характеризует взаимодействие сахарных цепей антибиотика с основаниями олигонуклеотидов, а вторая, более медленная - встраивание хромофора антибиотика в узкую бороздку олигонуклеотидов. Константы скоростей реакций оливомицина А с олигонуклеотидом 8р1/ОТАТ в среднем на порядок выше таковых для 8р1/НРАТ-т1, что подтверждает данные о высокой специфичности данного взаимодействия. Константы равновесия, полученные на основе кинетических данных, согласуются с константами, полученными методом флуоресцентного титрования, что свидетельствует, по-видимому, в пользу предложенной кинетической модели.

Физико-химические характеристики взаимодействия оливомицина А с жидкокристаллической дисперсией на основе ДНК.

Исследование изменения структуры холестерической жидкокристаллической дисперсии на основе дцДНК под действием оливомицина А методом кругового дихроизма

Важно отметить, что полоса КД при длине волны около 270 нм для ДНК, конденсированной в холестерическую форму, может быть на несколько порядков более интенсивной (рвьполоса), нежели для линейной дцДНК, что делает данную систему крайне привлекательной для изучения методом КД.

Как показано на рисунках 16 и 17, при увеличении концентрации оливомицина А изменяется интенсивность рвьполосы хжкд-ДНК, в то время как в диапазоне длин волн поглощения 1ХТА-254 появились две полосы отрицательного и положительного знаков при 380 нм и 425 нм, соответственно.

Рисунок 16. Спектры КД хягкд-ДНК 3*10'5 М Рисунок 17. Зависимость нормализованной

п.о. при увеличивающихся концентрациях амплитуды спектров КД (Х=270 нм) хжкд-

оливомицива А: 1 (чериый) - 0 М; 2 ДНК ЗхЮ"5 М п.о. от концентрации

(красный) - 1,6x10"® М; 3 (синий) - 2,4х10"5 добавленного оливомицина А. М; 4 (зеленый) - 4,8x10"* М; 5 (фиолетовый) -

При достижении концентрации 1,6х 10"4 М антибиотика аномальная полоса дальнего порядка хжкд-ДНК практически исчезает (рисунок 17), что может говорить о переходе холестерической упаковки жидкокристаллической структуры в нематическую.

Эффект был подробно изучен методом КД с применением известного интеркалятора тиазолового оранжевого (ТО) (метод «внешнего» хромофора). Интеркалятор ТО использован в качестве метки для мониторинга состояния высокоорганизованной структуры на основе ДНК (рисунок 18).

М 1,410* имС 1ЛИ' и»«-* ичг1 (Олявямкаив А) (М)

1,04x10-' М.

Рисунок 18. Спектры КД комплекса ТО 1,5x10"® с хжкд-ДНК 3x10"® М п.о. прп увеличивающихся концентрациях олпвомицина А (от 0 до 1x10"* М).

4!Н> ММ 95в Н* «5*

ДЛпнж вамы (ИМ)

Изменение амплитуды полосы при >.=270 нм, связанной с поглощением азотистых оснований ДНК, и при А,=510 нм, характерной для индуцированного КД ТО, в зависимости от концентрации оливомицина А представлены на рисунках 19 и 20. Важно отметить схожий характер концентрационных зависимостей амплитуд спектров КД при обеих длинах волн. Аномальная р5ьполоса хжкд-ДНК на длине волны азотистых оснований практически полностью исчезает при концентрации оливомицина А 1x10"4 М. В то же время при увеличении концентрации антибиотика резко сокращается амплитуда спектров индуцированного КД контрольной молекулы ТО, что подтверждает эффект изменения структуры хжкд-ДНК.

8. !

в -2»

М 4*»1в4 №11* ЦыГ

[Акшикш (Ч|

в.* 4Л.1«' ЬЫО* 14111* 1Д11в*

|Олнмминн» А] (М)

Рисунок 19. Зависимость значения амплитуд Рисунок 20. Зависимость значения амплитуд

спектров КД комплекса красителя ТО спектров КД комплекса красителя ТО

1,5x10"® М с хжвд-ДНК ЗхЮ * М п.о. на длине 1,5*10"® М с хжвд-ДНК 3x10"® М п.о. на длине

волны хжкд-ДНК 270 нм от концентрации волны красителя ТО 510 нм от

оливомицина А. концентрации оливомицина А.

Данные, полученные методом КД, указывают на комплексообразование олиовомицина А с хжкд-ДНК. По-видимому, взаимодействие оливомицина А со сверхконденсированной ДНК приводит лишь к нематизации слоев в структуре хжкд-ДНК, но не нарушает или слабо дезорганизует вторичную структуру ДНК в составе квазинематических слоев. Это предположение также подтверждается тем фактом, что в диапазоне концентраций оливомицина А, при которых рБ^полоса хжкд-ДНК почти не

проявлялась, амплитуда полосы индуцированного КД ТО сравнима с амплитудой индуцированного КД комплекса ТО с дцДНК.

В соответствии с теорией, вклад взаимодействия между цепочками поперечных диполей строго зависит от расстояния между полярными или заряженными группами молекул, образующих комплексы с хжкд-ДНК. Таким образом, находясь на коротком расстоянии друг от друга, заряженные группы молекул, расположенных на ДНК в виде поперечных диполей, обеспечивают значительный вклад в общий потенциал взаимодействия хиральных молекул. Данный вклад может быть достаточным, для того чтобы обратить в ноль или инвертировать закрутку хжкд-ДНК, превращая, холестерический жидкий кристалл в нематический, а затем нематический жидкий кристалл в холестерический, но с обратной первоначальному состоянию закруткой. Такая ситуация может быть реализована при высоких концентрациях антибиотика, связанного с хжкд-ДНК, когда уровни заполнения хжкд-ДНК оливомицином А достаточны для обеспечения малых расстояний между полярными группами антибиотика в цепочке поперечных диполей. Объяснением эффекта инвертирования полосы дальнего порядка хжкд-ДНК под действием оливомицина А может служить наличие в составе В-оливомозы антибиотика метокси-группы с высокой полярностью, что позволяет выстроить спираль диполей на цепочке дцДНК в составе хжкд-ДНК.

ВЫВОДЫ

1. Оливомицин А (1ХТА-254) имеет наибольшую константу комплексообразования с ДНК и квантовый выход в комплексе с ДНК по сравнению с другими его производными, несущими различные ацильные заместители в составе А-олиозы и Е-оливомикозы, что объясняется наиболее высокой гидрофобностью ЬСТА-254. Частичное или полное деацилирование ЬСТА-254 и ЬСТА-1721 с получением новых производных ЬСТА-1840 и ЬСТА-1839 привело к снижению гидрофобности молекул и, как следствие, к утрате способности образовывать комплексы с ДНК.

2. Производное ЬСТА-1498, содержащее карбоксильную группу в боковой цепи агликона, обладает на порядок меньшей константой комплексообразования с ДНК по сравнению с его М,М-диметиламиноэтиламидом, 1ХТА-1599, в связи с меньшей гидрофобностью первого и электростатическим барьером между отрицательно заряженными карбоксильной группой лиганда и сахарофосфатным остовом ДНК.

3. Оливомицин А проявляет высокое сродство и специфичность к сайту связывания транскрипционного фактора Бр1 в составе олигонуклеотидов. Константа комплексообразования этого антибиотика с олигонуклеотидом 8р1/ОТАТ на два порядка

выше, чем с дцДНК, а замена GC-оснований на AT в структуре дуплекса Spl/NFAT приводит к существенному уменьшению константы комплексообразования оливомицина А с модифицированными олигонуклеотидами.

4. Установлен кинетический механизм взаимодействия оливомицина А с олигонуклеотидом Spl/NFAT и его модифицированными аналогами. Согласно предложенной модели процесс комплексообразования оливомицина А с олигонуклеотидом Spl/NFAT и его аналогами состоит из двух последовательных реакций. Константы скоростей реакций комплексообразования резко изменяются в зависимости от состава олигонуклеотидов.

5. Взаимодействие оливомицина А с холестерической жидкокристаллической дисперсией на основе ДНК приводит к нарушению холестерической структуры дисперсии, связанному с переходом дисперсии из холестерической формы в нематическую.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Tevyashova, А. N. Modification of olivomycin A at the side chain of the aglycon yields the derivative with perspective antitumor characteristics / A. N. Tevyashova, A. A. Shtil, E. N. Olsufyeva, Y. N. Luzikov, M. I. Reznikova, L. G. Dezhenkova, E. B. Isakova, V. M. Bukhman, N. A. Durandin, A. M. Vinogradov, V. A. Kuzmin, M. N. Preobrazhenskaya // Bioorg. Med. Chem. - 2011. - V. 19. - Issue 24. - P.7387-7393.

2. Tevyashova, A. N. Role of the acyl groups in carbohydrate chains in cytotoxic properties of olivomycin A / A. N. Tevyashova, N. A. Durandin, A. M. Vinogradov, V. B. Zbarsky, M. I. Reznikova, L. G. Dezhenkova, E. E. Bykov, E. N. Olsufyeva, V. A. Kuzmin, A. A. Shtil, M. N. Preobrazhenskaya // J. Antibiot. (Tokyo). - 2013. - V. 66 - Issue 9. - P.523-530.

3. Durandin, N. Inhibition of c-Myc transcription by olivomycin a involves preferential drug binding to NFAT/ Spl promoter site / N. Durandin, A. Vinogradov, A. Shtil, V. Kuzmin // FEBS journal. - 2013. - V. 280. - P.86-87.

4. Durandin, N. On The Road To Olivomycin A-based Antitumor Therapeutics: A Novel Modification Of The Aglycone Side Chain / N. Durandin, A. Tevyashova, A. Vinogradov, E. Olsufieva, V. Bukhman, A. Shtil, M. Preobrazhenskaya, V. Kuzmin // Book of abstracts of «Anticancer Agents Research Congress», Antalya, 2011. - С. 112

5. Штиль А. А. Разработка противоопухолевых препаратов нового поколения на основе аналогов ауреоловой кислоты и исследование физико-химических свойств их комплексов с ДНК / А. А. Штиль, А. Н. Тевяшова, Н. А. Дурандин, А. М. Виноградов, E. Н. Олсуфьева, M. Н. Преображенская, В. А. Кузьмин //

Сборник тезисов докладов на конференциях и семинарах по научным направлениям Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине», Москва. - М.: «Слово», 2011. - С. 113-115

6. Дурандин Н. А. Противоопухолевая терапия на основе Оливомицина А: Новая модификация боковой цепи агликона / Н. А. Дурандин, А. Н. Тевяшова, А. М. Виноградов, Е. Н. Олсуфьева, В. М. Бухман, А. А. Штиль, М. Н. Преображенская, В. А. Кузьмин // Сборник научных трудов XI Ежегодной международной молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗЫ, ИБХФ, Москва. - М.: РУДН, 2012.-С. 126-127

7. Durandin N. A role of acyl substituents in drug:DNA complex formation and antitumor properties of novel olivomycin A derivatives / N. Durandin, A. Vinogradov, A. Tevyashova, E. Olsufyeva, E. Bykov, L. Dezhenkova, A. Shtil, M. Preobrazhenskaya, V. Kuzmin // Book of abstracts of 1st International conference on Fluorescent Biomolecules and their Building Blocks - Design and Applications (FB3). - Gothenburg: Chalmers University of Technology, 2012. - P. 93

8. Durandin N. DNA complex formation of Olivomycin A derivatives and furodihydroquinolines: Drug-DNA Binding for Medicinal Therapies / N. Durandin, A. Vinogradov, O. Lygo, A. Tevyashova, E. Khodot, A. Shtil, M. Preobrazhenskaya, T. Nekipelova, V. Kuzmin // Book of abstracts of 4th Photochemistry Summer School 2012 on «Photochemistry, Fundamentals and Applications» (Wijk aan Zee). -Amsterdam:University of Amsterdam, 2012. - P. 47

9. Durandin N. A. Role of the acyl groups in carbohydrate chains in biological properties of olivomycin A and its analogs / Durandin N. A., Tevyashova A. N., Vinogradov A. M., Olsufyeva E. N., Shtil A. A., Preobrazhenskaya M. N., Kuzmin V. A. // Сборник научных трудов XII Ежегодной международной молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗЫ, ИБХФ, Москва.-М.: РУДН, 2012.-С. 54-58

Отпечатано в ООО «Издательство Спутник+» ПД № 1-00007 от 26.09.2000 г. Подписано в печатьЮ.07.2014 г. Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,0 Печать авторефератов (495)730-47-74, 778-45-60