Разработка направленной модификации и анализ связи структура-активность полифункциональных антибиотиков-гликозидов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

ТЕВЯШОВА АННА НИКОЛАЕВНА

РАЗРАБОТКА НАПРАВЛЕННОЙ МОДИФИКАЦИИ И АНАЛИЗ СВЯЗИ СТРУКТУРА - АКТИВНОСТЬ ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНЫХ АНТИБИОТИКОВ-ГЛИКОЗИДОВ

11 ПАР 2015

02.00.10 - Биоорганическая химия АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

МОСКВА, 2015

005560561

005560561

Работа выполнена в лаборатории химической трансформации антибиотиков Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков имени Г.Ф. Гаузе»

Научный консультант: доктор химических наук, профессор,

заслуженный деятель науки РФ_

Преображенская Мария Николаевна

член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор Кочетков Сергей Николаевич

(Заведующий лабораторией молекулярных основ действия физиологически активных соединений ФГБУН Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН)

член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор Нифантьев Николай Эдуардович

(Заведующий лабораторией химии гликоконъюгатов ФГБУН Института органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН)

доктор химических наук Формановскнй Андрей Альфредович

(Заведующий лабораторией органического синтеза ФГБУН Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН)

Ведущая организация: ФГБОУ ВО «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова», профильное подразделение Научно-исследовательский институт физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского

Защита состоится «25» мая 2015 г. в 15 часов на заседании Диссертационного Совета Д 212.120.01 при ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова» по адресу: 119571, Москва, пр. Вернадского, д. 86, аудитория М-119.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В.Ломоносова» и на интернет-сайте МИТХТ им. М.В. Ломоносова http.7Avww.mitht.ru.

С авторефератом можно ознакомиться на интернет-сайтах ВАК РФ http://vak.ed.gov.ru и МИТХТ им. М.В. Ломоносова http://www.mitht.ru

Автореферат разослан «^Ч» 2015 г.

Официальные оппоненты:

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат химических паук, старшин научный сотрудник

Лютик А.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

Несмотря на значительные успехи в области разработки методов профилактики, диагностики и лечения, инфекционные болезни и злокачественные опухоли по данным Всемирной организации здравоохранения остаются в числе основных причин смертности населения. Сложность химиотерапии этих заболеваний связана с недостаточной эффективностью лекарственных средств, побочными реакциями, возникающими на фоне применения препаратов, и с явлением природной или приобретенной устойчивости микроорганизмов и опухолевых клеток к используемым агентам.

Природные антибиотики, т.е. антибиотики, образуемые различными организмами, в первую очередь микроорганизмами, были и остаются одним из важнейших источников новых высоко активных антимикробных и противоопухолевых агентов. В настоящее время наиболее продуктивными подходами к созданию новых лекарственных средств оказываются методы, связанные с химической трансформацией природных антибиотиков или генной инженерией штаммов-продуцентов. Модификация структуры направлена на расширение спектра действия, изменение фармакологических характеристик молекулы (снижение токсичности и устранение нежелательных побочных эффектов, изменение способа введения препарата) и на создание аналогов, активных в отношении устойчивых микроорганизмов или опухолевых клеток.

Химическая трансформация природных антибиотиков подразумевает изменение определенных функциональных групп исходной молекулы при сохранении структурных элементов, ответственных за проявление биологической активности. Поскольку антибиотики, как правило, представляют собой сложные высоколабильные полифункциональные соединения, для их направленной модификации необходимо решение разнообразных сложных задач в области химического синтеза, что требует внедрения новых методов синтеза, а также использования новых эффективных способов очистки получаемых соединений. Получение новых полусинтетических аналогов антибиотиков должно проводиться параллельно с направленным скринингом на различных биологических моделях, включая фармакологические, имеющем цель выявить особенности действия новых соединений в сравнении с исходными. Результатом таких комплексных исследований могут стать препараты нового поколения, имеющие преимущества перед исходными антибиотиками. В этой связи получение фундаментальных знаний о химических и биологических свойствах антибиотиков, механизме действия и закономерностях структура -биологическая активность приобретают особенную актуальность. Важно отметить, что многие высокоактивные антибиотики являются незаменимыми инструментами молекулярно-биологических исследований живой природы.

В таком ключе проведено настоящее исследование, посвященное разработке методов селективной химической модификации недостаточно изученных классов высокоактивных полифункциональных антибиотиков-гликозидов, а также анализу свойств полученных производных с целью формирования основ для рационального дизайна и последующего создания новых высокоэффективных лекарственных средств.

В соответствии с актуальностью выбранной научной темы, диссертационная работа направлена на комплексное исследование полифункциональных, антибиотиков-гликозидов различных классов (оливомицина А, антрациклиновых антибиотиков, полиеновых макролидов группы амфотершшна В, макролидного антибиотика азитромицина и гликопептидных антибиотиков группы ванкомицина), включающее, прежде всего, разработку методов их селективной модификации, изучение физико-химических свойств, оценку биологической активности производных этого ряда, включая в некоторых случаях изучение молекулярных механизмов действия.

Отдельные разделы диссертации выполнены в соответствии с планами научно-исследовательских работ (НИР) на 2003-2007 гг. и 2008-2012 гг. ФГБНУ «Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков имени Г.Ф. Гаузе» по теме "Направленный синтез препаратов нового поколения на основе антибиотиков и других природных соединений, воздействующих на опухолевые и бактериальные клетки с различным типом

резистентности к существующим лекарственным средствам" (номер государственной регистрации 0120.0 508503).

Цель и задачи работы. Целью настоящей работы является разработка методов химической модификации полифункциональных антибиотиков-гликозидов разных классов и изучение связи структура - биологическая активность в ряду новых полусинтетических производных. Для достижения этой цели поставлены следующие задачи:

1) Разработать методы направленной модификации противоопухолевого антибиотика группы ауреоловой кислоты оливомицина А, осуществить синтез серий новых полусинтетических производных и изучить их биологические свойства и механизм действия.

2) Разработать метод введения по З'-аминогруппе остатка даунозамина антрациклиновых антибиотиков гидрофильных заместителей и осуществить синтез серии З'-N-замещенных производных доксорубицина и 14-гидроксикарминомицина. Изучить влияние введенных заместителей на способность производных ингибировать работу топоизомеразы I.

3) Разработать метод получения пролекарств на основе доксорубицина и высокомолекулярного полисахарида DAVANAT и осуществить синтез водорастворимых конъюгатов доксорубицин-DAVANAT.

4) Разработать методы химической модификации генно-инженерных полиеновых антибиотиков группы амфотерицина В, включая методы двойной модификации, и получить серии новых производных.

5) Разработать методы синтеза гетеродимерных антибиотиков на основе амфотерицина В и бензоксаборолов и синтезировать производные различных типов.

6) Разработать методы синтеза гетеродимерных антибиотиков на основе макролидного антибиотика азитромицина и гликопептидных антибиотиков и получить серию конъюгатов.

7) Для полученных соединений изучить связь структура - биологическая активность в опытах in vitro, а для наиболее активных - в опытах in vivo.

Научная новизна. В ходе выполнения работы впервые проведены систематические исследования по синтезу и изучению больших кластеров модифицированных антибиотиков-гликозидов разных классов (ауреоловой кислоты, антрациклинов, полиенов, макролидов, гликопептидов).

1) Впервые разработаны методы селективной химической модификации антибиотика группы ауреоловой кислоты оливомицина А по боковой цепи агликона, по ароматическому ядру, по фенольным группам агликона и по сложноэфирным группам углеводных остатков и осуществлен синтез различных серий новых полусинтетических производных оливомицина А. Для полученных соединений выявлена связь структура - активность в экспериментах, проведенных на различных линиях опухолевых клеток и вирусов, а для ряда соединений - в опытах на лабораторных животных. Установлены некоторые аспекты молекулярных механизмов действия оливомицина и его производных, в том числе активность в отношении ДНК-топоизомеразы I, а также параметры взаимодействия этих антибиотиков с ДНК.

2) Впервые подробно исследована реакция оливомицина А и оливина с солями диазония. Установлено, что реакция азосочетания оливомицина А сопровождается отщеплением 6-О-дисахаридной ветви и приводит к образованию соответствующих 5-арилдиазенил-б-О-дегликозил производных оливомицина А. Квантово-химические расчеты подтверждают облегченный гидролиз дисахаридного фрагмента в диазенильных производных.

3) Получена серия аналогов оливомицина А, отличающихся набором ацильных заместителей в углеводных цепях и изучены спектральные параметры комплексообразования этих производных с ДНК. Установлено, что ацильные заместители в углеводных цепях оказывают значительное влияние на образование Г^2+-координнрованных димеров антибиотиков и образование комплексов с ДИК, и как следствие, на биологическую активность антибиотиков. Впервые показаны различные роли ацильных заместителей в положении 4-О-А-олиозы и 4-О-Е-оливомикозы для проявления олнвомицином А биологической активности.

4) Впервые получена серия новых производных доксорубицина и 14-гидроксикарминомицина, содержащих по З'-аминогруппе даунозамина полигидроксплированные

заместители, и установлено, что такая модификация увеличивает способность антрациклинов ингибировать активность топоизомеразы I.

5) Разработан метод и получены новые конъюгаты доксорубицина с полисахаридом DAVANAT, отличающиеся содержанием антибиотика и способом его присоединения к полисахариду.

6) Разработаны методы селективной химической модификации генно-инженерных полиеновых антибиотиков группы амфотерицина В по С16-карбоксильной и З'-аминогруппе, включая методы двойной модификации, и осуществлен синтез 49 новых полусинтетических производных. Анализ данных противогрибковой активности in vitro позволил установить критическую роль структуры С7-С10 полиольной области для проявления активности у изученной серии полиеновых антибиотиков группы амфотерицина В и их производных. В опытах на животных показано, что введение гидрофильных функциональных групп в молекулу полиенового антибиотика приводит к улучшению химиотерапевтических характеристик производных.

7) Впервые разработаны методы получения и осуществлен синтез коныогатов амфотерицина В с бензоксаборолами, включая конъюгаты, содержащие спейсер. Изучена связь структура - активность в рядах новых производных и показано, что в случае амидов амфотерицина В с бензоксаборолами введение спейсера между остатком бензоксаборола и молекулой амфотерицина В приводит к усилению противогрибковой активности.

8) Разработан метод получения и осуществлен синтез серии новых гетеродимерных антибиотиков на основе азитромицина и гликопептидов, позволяющий варьировать длину спейсера между остатками антибиотиков. Показано, что все синтезированные соединения не уступают или превосходят по антибактериальной активности азитромицин и ванкомицин в отношении изученных штаммов грамположительных бактерий, при этом производные на основе азитромицина и эремомицина или агликона тейкопланина обладают активностью в отношении штаммов, устойчивых к ванкомицину и азитромицину.

Практическая значимость. Разработаны схемы направленного синтеза и методы очистки новых производных антибиотиков-гликозидов разных классов. Среди полученных серий полусинтетических аналогов антибиотиков выявлены производные, обладающие преимуществами перед исходными антибиотиками в опытах in vitro и in vivo.

Среди серий полусинтетических производных оливомицина А отобраны два соединения, N-(2-адамантил)амид 2'-карбоксиметоксимоливомицина А и Ы-(2-диметиламиноэтил)амид оливомицина SA, обладающие преимуществами перед исходным антибиотиком, а именно, сниженной токсичностью и отсутствием кумулятивного эффекта в экспериментах in vivo.

Впервые продемонстрировано наличие анти HIV-I активности у 5-арилдиазенил-6-0-дегликозил-производного оливомицина А при сниженной цитотоксической активности.

По результатам экспериментов in vitro из серий полусинтетических производных полиеновых антибиотиков группы амфотерицина В отобраны производные для изучения противогрибковой активности и токсичности in vivo. Показано, что новое полусинтетическое производное Ы-(2-диметиламино)этиламид S44HP обладает преимуществами перед амфотерицином В в экспериментах in vivo и является перспективным для дальнейшего предклинического изучения.

Среди синтезированной серии конъюгатов бензоксаборолов с амфотерицином В найдены соединения, проявляющие равную амфотерицину В противогрибковую активность in vitro.

Показано, что все гетеродимерные антибиотики на основе азитромицина и гликопептидов не уступают или превосходят азитромицин и ванкомицин в отношении изученных штаммов грамположительных бактерий, а некоторые из полученных соединений проявляют активность в отношении штаммов, устойчивых к азитромицину и ванкомицину.

В ходе исследования получено два патента на изобретение РФ, подана заявка на изобретение.

Впервые полученные в ходе исследования данные о связи структура - биологическая активность позволяют сформировать основу для рационального дизайна новых лекарственных средств на основе антибиотиков изученных классов. Разработанные подходы к химической

модификации различных полифункциональных антибиотиков-гликозидов носят общий характер и могут быть использованы при трансформации других антибиотиков, а также различных органических соединений близкого строения.

Методология и методы исследования. Для выполнения работы использовались классические и модернизированные методы органического синтеза, современные методы физико-химического и спектрального анализа, включая УФ-, ЯМР-спектроскопшо и масс-спектрометрию, а также квантово-химические расчеты. Исследование комплексообразования оливомицина А и его аналогов с ДНК проводилось с помощью спектрофотометрического и спектрофлуориметрического методов, а также методом индуцированного кругового дихроизма. Для оценки антипролиферативной активности синтезированных производных противоопухолевых антибиотиков использован МТТ-тест. Способность соединений ингибировать ДНК-зависимый фермент топоизомеразу I изучена в реакции релаксации суперскрученной плазмидной ДНК. Для определения минимальной подавляющей концентрации (МПК) противогрибковых антибиотиков использован метод, рекомендованный Национальным Комитетом Клинических Лабораторных Стандартов США [NCCLS, М27-А, М38-А] в варианте микрометода. Сравнительная оценка спектра антибактериального действия на эталонных штаммах и клинических изолятах грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов проводилась с использованием микрометода определения МПК методом серийных разведений в бульоне Мюллера-Хинтон.

Основные положения, выносимые на защиту:

- Методы селективной химической трансформации противоопухолевого антибиотика группы ауреоловой кислоты оливомицина А по боковой цепи агликона, по 5-му положению агликона, по фенольным группам агликона и по ацильным заместителям в углеводных остатках;

- способ введения в молекулу антрациклиновых антибиотиков полигидроксилированных заместителей, в том числе, остатков моно- и дисахаридов, позволяющий избежать восстановления 13-кето-группы антибиотика в ходе реакции восстановительного алкилирования;

- способ получения водорастворимых конъюгатов доксорубицина с высокомолекулярным полисахаридом DAVANAT;

- методы селективной химической модификации полиеновых макролидов группы амфотерицина В по карбоксильной и/или 3'-аминогруппе микозамина, а также методы их очистки, позволяющие получить целевые соединения высокой степени чистоты;

- методы синтеза конъюгатов амфотерицина В с бензоксаборолами;

- методы синтеза гетеродимерных антибиотиков на основе макролидного антибиотика азитромицина и гликопептидных антибиотиков;

- анализ закономерностей структура - биологическая активность для синтезированных типов производных антибиотиков.

Достоверность полученных результатов. Для синтеза полученных соединений были использованы природные антибиотики, полученные на опытной установке ФГБНУ «НИИНА». Генно-инженерные полиеновые антибиотики были предоставлены компанией "SINTEF" (Норвегия) и Норвежским Университетом Науки и Технологии г. Трондхейм. Бензоксаборолы предоставлены фирмой Anacor (Palo Alto, США). Остальные реагенты были коммерчески доступными продуктами известных фирм (Acros Organic, Fluka, Sigma-Aldrich и др.). Чистота синтезированных производных подтверждена методом ВЭЖХ, а структуры подтверждены современными методами физико-химического анализа - УФ- и ИК-спектроскопией, ЯМР-спектроскопией ('Н-ЯМР и |3С-ЯМР), в том числе многоимпульсными методами ЯМР, такими как COSY, HSQC, НМВС. Структуры также подтверждены методом масс-спектрометрии, в том числе масс-спектрометрией высокого разрешения (HR ESI MS) и тандемной масс-спектрометрией (MS/MS). Исследование антипролиферативной, антибактериальной или противогрибковой активности, а также активность в отношении топоизомеразы I синтезированных производных проводилось по международным стандартизированным методикам.

Апробации работы. Основные положения диссертации доложены на международных и российских конференциях, в том числе, на IX научной школе - конференции по органической химии (Звенигород, 2006): И Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых

и специалистов «Окружающая среда и здоровье», (Рязань, 2007); Austrian-German-Hungarian-Italian-Polish-Slovenian 5th Joint Meeting on Medicinal Chemistry (Словения, г. Порторож, 2007); XI Российском онкологическом конгрессе (Москва, 2007); Capri Science Conference (a Nature Conference) (Италия, Капри, 2007); International Symposiums on Targeted Anticancer Therapy (США, г. Бетезда, 2008, 2010); Всероссийских научно-практических конференциях с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (п. Московский, 2008, 2010); 11th MipTec Conference - The Leading European Event for Drug Discovery (Швейцария, г. Базель, 2008), Симпозиуме «Результаты фундаментальных и прикладных исследований для создания лекарственных средств» (Москва, 2008); Московском Международном Конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009 г., диплом и медаль в конкурсе молодых ученых за лучшую научно-исследовательскую работу); Всероссийской конференции по органической химии (Москва, 2009); Международном симпозиуме ASOC «Успехи науки в области органической химии» (Крым, Мисхор, 2010, диплом за лучшее сообщение от оргкомитета); XII Ежегодной международной молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗЫ (Москва, 2010); Russian-Indian Symposium on Glycosciences (Москва, 2011); International Congress «Anticancer Agents Research Congress» (Турция, г. Анталья, 2011); II Всероссийской конференции (с международным участием) к 95-летию со дня рождения Н.С. Простакова «Успехи синтеза и комплексообразования» (Москва, 2011); Всероссийской конференции «Органический синтез: химия и технология», (Екатеринбург, 2012); Ist International Conference on Fluorescent Biomolecules and their Building Blocks - Design and Applications (FB3) (Швеция, г. Гётенбург, 2012); Drug-DNA Binding for Medicinal Therapies, 4th Photochemistry Summer School 2012 on «Photochemistry, Fundamentals and Applications" (Нидерланды Wijk aan Zee, 2012); Joint meeting «Macrocycles -synthesis, medicinal chemistry and biological activity» (Хорватия, г. Загреб, 2014); 20th EuroQSAR (Санкт-Петербург, 2014); «Московская неделя науки» (Москва, 2014); International Conference on Antimicrobial Research (ICAR-2014, Испания, г. Мадрид).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 55 печатных работы, из них 28 статей (включая 19 публикаций в изданиях из списка ВАК), 2 патента и 25 тезисов международных и российских научных конференций и симпозиумов.

Граитовая поддержка работы. Тематика исследований соответствует Приоритетному направлению развития науки, технологии и техники Российской Федерации «Технологии живых систем» и Приоритетному направлению научных медицинских исследований РАМН «Поиск, разработка и изучение новых противоопухолевых, противовирусных и антимикробных антибиотиков». Работа проводилась при частичной финансовой поддержке РФФИ (гранты № 06-04-08127-офи (И), № 07-03-92000-ННС_а (И), № 07-04-01804-э_б (И), № 10-03-00210-а (И), № 10-04-09232-моб_з (Р), № 11-00-14007-ир (И), №13-03-00643 (И), 08-03-01803 (И)), гранта 2010 года по государственной поддержке ведущих научных школ НШ-5290.2010 (И), гранта Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых МК-5422.2007.4 (Р), фанта «Фонда Содействия Отечественной Медицине» 2006-2007 гг. (Р); «Гранта Москвы» в области наук и технологий в сфере образования 2005 г. (Р). Тевяшова А.Н. является лауреатом 2013 г. российского конкурса L'Oreal-UNESCO «Для женщин в науке» (при участии Российской академии наук, Комиссии Российской Федерации по делам ЮНЕСКО, Бюро ЮНЕСКО в Москве). Некоторые части диссертационной работы выполнены в рамках сотрудничества с Институтом Pera Католического Университета (г. Левен, Бельгия), фирмой ProPharmaceuticals Inc (г. Норкросс, Джорджия, США), Норвежским Университетом Науки и Технологии (г. Трондхейм, Норвегия) и фирмой Anacor Pharmaceuticals, Inc (г. Пало Альто, Калифорния, США).

Личный вклад соискателя. В диссертационной работе обсуждены и обобщены результаты, полученные лично автором или в соавторстве. При этом автору принадлежит решающая роль на всех этапах работы: от выбора направления и объектов исследования, постановки задачи, планирования, разработки и обоснования путей решения, реализации, проверки предложенных в работе экспериментальных подходов и непосредственного участия в проведении ключевых экспериментов до обсуждения и оформления полученных результатов.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 342 страницах, содержит 39 рисунков, 35 таблиц, 31 схему. Работа построена по традиционной схеме и состоит из следующих разделов: введения, списка сокращений, 2 глав, описания материалов и методов исследования, выводов, списка литературы (386 источников) и приложений. Обзор литературы (глава 1) посвящен последним достижениям в области получения антибиотиков двойного действия - химерных (гетеродимерных) структур, в которых фармакофорные группы двух молекул антибиотиков, принадлежащих к разным классам, связаны между собой ковалентным линкером. Вторая глава посвящена обсуждению результатов по разработке методов химической модификации, получению и изучению свойств новых полусинтетических аналогов антибиотиков-гликозидов разных классов. Изложенный материал и полученные результаты полностью соответствуют паспорту специальности 02.00.10.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. ХИМИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ АНТИБИОТИКОВ-ГЛИКОЗИДОВ

1.1. Химическая модификация оливомицина А В работе изучены следующие направления селективной химической модификации оливомицина А (1): по боковой цепи агликона, замещение по 5-му положению агликона, по фенольным группам агликона и по ацильным заместителям в углеводных остатках.

1.1.1. Модификация боковой цепи агликона оливомицина А Взаимодействие 1 с карбоксиметоксиламином протекало региоселективно по 2'-кето-группе боковой цепи, приводя к ключевому соединению - 2'-карбоксиметоксимоливомицину А (2). Взаимодействие 2 с соответствующими аминами в присутствии бензотриазол-1-ил-оксипирролидинофосфоний гексафторфосфата (РуВОР) привело к образованию амида 2'-карбоксиметоксимоливомицина А (3), М-(2-гидроксиэтил)амида 2'-

карбоксиметоксимоливомицина А (4), Ы-(2-адамантил)амида 2'-карбоксиметоксимоливомицина А (5), Ы-(/егг-бутил)амида 2'-карбоксиметоксимоливомицина А (6) и М-(1,3-дигидрокси-2-метилпропал-2-ил-пропан)амида карбоксиметоксимоливомицина А (7), которые очищали методом колоночной хроматографии на силикагеле.

Данный метод модификации оливомицина А и структуры производных 2-7 запатентованы.

Другое направление модификации заключалось в разработке метода химического синтеза оливомицина SA (8) (SA - short acid) - аналога описанных в литературе генно-инженерных антибиотиков митрамицина SA и хромомицина SA, содержащих карбоксильную группу в укороченной боковой цепи.

Реакция периодатного окислительного расщепления З'-гидроксильной и 2'-кето-групп боковой цепи приводила к укорочению боковой цепи с образованием оливомицина БА (8), в котором в положении 3 агликона вместо (15,35,4Л)-3,4-дишдрокси-1-метоксипентан-2-оновой цепи содержится (5)-карбокси-(метокси)метильный заместитель. Кислоту 8 далее вводили в реакцию амидирования с соответствующими аминами в присутствии РуВОР или дифенилфосфорилазида (ЭРРА), получая Ы-метиламид оливомицина БА (9), амид оливомицина ЭА (10), Ы-(2-диметиламиноэтил)амид оливомицина БА (11), М-(3-гидроксипропил)амид оливомицина БА (12), Ы-(2-адамантнл)амид оливомицина БА (13), Ы-(4-фторбензил)амид оливомицина БА (16) и амиды оливомицина БА с метиловым эфиром ¿-аланина (14) и О-глюкозамином (15). Соединения 8-16 очищали методом колоночной хроматографии на силикагеле.

Оптимизация условий получения, выделения и очистки оливомицина БА (8) и наиболее активного амида 11 позволили повысить выходы реакций до 86 и 82% соответственно. Для получения водорастворимого производного получена соль амида 11 с ¿-глутаминовой кислотой (соединение 11а), ее структура подтверждена данными элементного анализа. Метод синтеза и соединения 8-16 запатентованы.

1.1.2. Модификация ароматической часта агликона оливомицина А

Исследована возможность введения заместителей в ароматическую часть агликона реакцией азосочетания, т.е., взаимодействием с солями диазония. Оливомиции А (1) вводили в реакции с

осн3

РуВор

(45-82%)

тетрафторборатами арилдиазония в щелочных условиях при охлаждении до 5°С, реакция протекала практически мгновенно с образованием веществ ярко-красного цвета.

Получена серия 5-арилдиазенил-б-О-дегликозил производных: 5-фенилдиазенил-б-О-дегликозилоливомицин А (17), 5-(4-сульфамоилфенил)диазенил-6-0-дегликозштоливомицин А (18), 5-(4-метоксифенил)диазенил-6-0-дегликозилоливомицин А (19), 5-(3,4-

дихлорфенил)диазенил-6-0-дегликозилоливомицин дегликозилоливомицнн А (21).

А (20), 5-(4-метилфенил)диазенил-6-0-

сн

о

но

Оливомицин А (1)

(35-65%)

17 R,=R2=H

18 R,=S02NH2, R2=H

19 R,=OCH3 R2=H

20 R,=R2=CI

21 R1=CH3 R2=H

Анализ данных масс-спектрометрии

и ЯМР-спектроскопии показал, что реакция азосочетания сопровождалась отщеплением 6-О-дисахаридной ветви. Для того чтобы установить место присоединения (5-ое или 7-ое положение ароматического кольца) диазенильного фрагмента, изучены ЯМР-спектры модельных соединений - 6-бромнафталин-2-ола (22) и его диазенильного производного 6-бром-1-((4-метоксифенил)диазенил)нафталин-2-ола (23). Соединение 23 получено взаимодействием 22 с тетрафторборатом (4-метоксифенил)диазония.

Анализ данных Н ЯМР-спектров модельных соединений 22, 23 в сравнении 'Н ЯМР-спектрами производных оливомицина 17, 19, 21 позволил однозначно подтвердить место присоединения диазенильного заместителя.

Квантово-химическим полуэмпирическим методом AMI проведено сравнение энергетических параметров гидролиза 6-О-гликозидной связи для 1 и гипотетического интермедиата 17а, содержащего фенилдиазенильный заместитель в 5-ом положении. Расчеты показали небольшой выигрыш в термохимических параметрах для гидролиза по 5ш~механизму дисахаридной ветви в 17а по сравнению с оливомицином А (1) (9 ккал/моль по энтальпии AH2ys° и 6 ккал/моль по энергии Гиббса Д02ч»°), что, по-видимому, можно объяснить стабилизирующим влиянием Ph-N=N-rpynni>[ (-М-эффект). Фенилдиазенильный остаток в анионе 17Ь находится практически в одной плоскости с ароматическим ядром, что подтверждает возможность дополнительного сопряжения в структуре 17Ь (в 17а диэдральный угол между Ph-N=N-rpynnoi"i и ароматическим ядром составляет 53.8°, в то время как в 17Ь аналогичный угол равен -3.7°). Таким

образом, в замещенном в 5-ом положении производном 17а облегчен гидролиз гликозидной связи по сравнению с незамещенным анионом 1.

оси,

к.ГЙ3 ОСОСНз

о

ОН ОН О О трисахарид

1

17а Г!=

ОН ОН О

1Ь 1?=Н, Д029а=-Ю1.26 кса1/то1, ДН—100.53 кса!Лш1 д0298=-95.77 кса1/то1, ДН—91.55 кса!/то!

Рассчитанные параметры энергетических характеристик щелочного гидролиза дисахаридной ветви согласуются с экспериментальными данными: гидролиз дисахаридной ветви очень быстро протекает при наличии диазенильного заместителя в 5-ом положении, в то время как инкубация 1 в щелочной среде (используемой для проведения реакции азосочетания) при охлаждении до 0°-5°С в течение 2 часов без добавления соли диазония не приводила к отщеплению дисахаридного фрагмента.

Изучено взаимодействие агликона оливомицина, оливина (24), полученного кислотным гидролизом 1, с солями диазония. Оливин (24) вводили в реакции с тетрафторборатами арил диазония в щелочных условиях при охлаждении до 5°С.

но.

МеОН - 0.2 п Н230, Т|

ОН ОН О Оливин (24) (93%)

(50-70%)

25 Р,=К2=Н

26 (^ОСНз Р!2=Н

27 Р,=В2=С1

Методами МАЬ01 масс-спектрометрии установлено, что продуктами реакции азосочетания в случае оливина являются соответствующие дизамещенные производные 5,7-ди-(фенилдиазенил)-оливин (25), 7-ди-(4-метоксифенилдиазенил)-оливин (26) и 5,7-ди-(3,4-дихлорфенилдиазенил)-оливин (27). По данным 'Н ЯМР-спектроскопии соединения 25-27 находятся в виде равновесной смеси изомерных форм, по этой причине нам не удалось сделать полного отнесения сигналов в Н ЯМР-спектрах 25-27.

1.1.3. Получение производных оливомицина, отличающихся набором ацильных групп в углеводных цепях Ранее показано, что углеводные цепи в оливомицине А, также как и в случае с хромомицином Аз и митрамицином, играют важную роль в образовании комплекса антибиотика с ДНК и, соответственно, в проявлении питотоксической активности. Мы исследовали роль ацильных групп в углеводных цепях оливомицина А (1) для проявлении биологической активности. С этой целью изучена серия оливомицинов, отличающихся набором ацильных групп в углеводных цепях.

Природные антибиотики оливомицин А (1), оливомицин С (дез-А4-ацетилоливомицин А) (28), оливомицин В (дез-Е4-изобутирил-Е4-ацетилоливомицин А) (29) выделены из оливомицинового комплекса, полученного при ферментации штамма Б^ерШегИсШит стпатопеит. Два полусинтетических производных, дез-Е4-изобутирилоливомицин А (30) и дез-Е4-изобутирилоливомицин С (31) получены методом селективного щелочного гидролиза Е4-изобутирильной группы оливомицина А (1) или С (28), соответственно.

НзСО он,

ОСОСНз ?СНз Н,СО |-н.

В-оливомоза_

А-олиоза

ОН ОН Ó olivin

о он

'О щелочной гидролиз

ОСОСНз

1 I СН3

Е-оливомикоза -—у- " С-оливоза HsCv-írrV О-0™»0"

у-Е4но

НзС^Ч 3 СН3

НзСО сн,

но^ он

Оливомицин А (1)

НОб^Е/0'

НО-НдС^з)

НО

Дез -Е4-изобутирилоливомицин А (30), (40%)

J^ó он

о S'izfcí

ОН

СН3 Оливомицин В (29)

Оливомицин С(28)

Деэ-Е4-изобутирилоливомицин С (31), (50%)

Очистку соединений 28-31 осуществляли методом полупрепаративной ВЭЖХ, конечная чистота составила >99.5% по данным ВЭЖХ. Структуры всех новых синтезированных соединений 2-21, 23, 28-31 подтверждены данными масс-спектрометрии и 'Н ЯМР-спектроскопии.

1.1.4. Анализ данных биологической активности новых производных оливомицина А Важнейший современный подход при создании новых противоопухолевых лекарств основан на идентификации молекулярных мишеней, специфических для раковой клетки, и направленном поиске ингибиторов этих мишеней, что обеспечивает более селективную, а значит, менее токсичную терапию опухолей. В рамках настоящей работы в ГУ РОНЦ РАМН установлено, что оливомицин А (1) в наномолярных концентрациях вызывал апоптоз (программированную гибель) опухолевых клеток человека. Изучение влияния воздействия оливомицина А (1) на генную транскрипцию методом микрочип-анализа показало, что действие оливомицина А (1) на клетки приводит к изменению экспрессии большого количества генов, причем среди транскрипционных факторов, экспрессия которых была снижена - с-Мус, один из важнейших белков, участвующих в регуляции транскрипции, синтеза ДНК, выживания клеток в неблагоприятных внешних условиях.

Антипролиферативная активность новых производных оливомицина А в сравнении с оливомицином А (1) в отношении опухолевых клеток линии лейкоза К562, мышиного лейкоза L1210, рака толстой кишки НСТ116 и Т-лимфоцитов (Molt4/C8 и СЕМ) (Таблица 1) изучена в НИИ канцерогенеза (ГУ РОНЦ РАМН) и в Институте Медицинских исследований Pera (г. Левен, Бельгия). Способность оливомицина А (I) и новых синтезированных соединений ингибировать активность топоизомеразы I (Tono I) - фермента, ответственного за релаксацию сверхсгшрапизованных молекул ДНК путём образования одноцепочечных разрывов с последующим восстановлением (лигнрованнем), изу чена в ФГБНУ «НИИНА» (Дежеикова Л.Г., пример смотри на стр. 16). Наиболее перспективные по результатам экспериментов in vitro

производные изучены в опытах in vivo на мышах с привитыми опухолями в лаборатории фармакологии и химиотерапии ФГБНУ «НИИНА» (Бухман В.М., Трещалин И.Д.).

Таблица 1. Антипролиферативная активность оливомицина А (1) и его новых производных в отношении опухолевых клеток линии лейкоза К562, мышиного лейкоза Ы210, рака толстой кишки HCTU6 и Т-лимфоцитов (Molt4/C8 и СЕМ), оценка активности в отношении Tono I._

Соед. 1С50" (мкМ) Пнгпбпрованпе Tono Г"

К562 L1210 Molt4/C8 СЕМ HTCU6

Оливомицин А (1) 0.025± 0.002 0.034 ±0.002 0.0040 ±0.0004 0.0025 ±0.0000 0.02± 0.002 +++

2 >3.2 6.5 ± 2.8 1.8 ± 1.4 2.3 ± 1.6 +

3 >3.2 3.6 ±3.1 1.0 ±0.1 0.82 ±0.19 +

4 >3.2 18 ±5 3.7 ±0.8 6.4 ± 0.0 +++

5 0.19 ±0.01 0.026 ± 0.007 0.018 ±0.002 ++

6 0.025 ± 0.002 0.20 ±0.01 0.033 ±0.003 0.032 ±0.001 ++

7 2.47 ±1.8 20 ±11 3.1 ±2.3 4.5 ±1.2 ++

8 2.2± 0.17 2± 0.13 +++

9 0.12 ±0.01 nt

10 0.1 ±0.08 nt

И 0.047± 0.005 0.02± 0.003 ++

11а 0.053± 0.006 0.04± 0.005 ++

12 0.156 ± 0.015 nt

13 0.18 ±0.021 nt

14 0.063± 0.007 0.02± 0.004 nt

15 2.39±0.34 >12.5 nt

16 0.148 ±0.018 0.278 ± 0.045 nt

17 6.1 ±1.3 1.6 ±0.0 1.8 ±0.0 -

18 6.1 ±1.3 1.6 ±0.0 1.8 ±0.0 -

19 >100 >100 >100 -

20 20 ±3 7.3 ±0.3 26 ±4 +

24 308 ±161 265 ±99 338±177 +

25 1.0 ±0.8 0.40 ±0.12 0.85 ±0.19 nt

26 412 ±124 84 ±18 302 ±68 nt

27 67 ±19 172 ±42 266 ± 11 nt

28 0.28±0.05 +

29 0.064±0.006 ++

30 >50 -

31 >50 -

*ICso - концентрация, которая пршюдта к гибели 50% кшток через 4Н ч (1,1210) и:ш через 72 ч (остальные линии); **способность соединении ингибировать активность топоизомеразы 1 выражена полуколичественно; nl - не тестировалось.

Для ряда полусинтетических производных оливомицина А исследована противовирусная активность в отношении различных ДНК и РНК вирусов, и обнаружена активность соединений 17, 19, 20 в отношении вирусов H1V-1 и H1V-1I (Таблица 2). В то время как противовирусная активность оливомицина А (1) проявлялась при цитотоксических концентрациях, соединения 17, 19, 20 ингибировали размножение вируса H1V-1 в концентрациях, которые были значительно ниже, чем ICso- Наличие селективной активности в отношении вируса HIV-1 среди антибиотиков группы ауреоловой кислоты ранее описано только для дурамицина А.

Таблица 2. Антиретровирусная активность оливомицина А (1) и его производных 17-19 в отношении HIV-1 и HIV-2.

Соединение ЕС50 (мкМ)а

HIV-1 HIV-2

Оливомицин А (1) 0.005 ±0.003 0.004 ±0.001

17 0.06 ± 0.03 >0.04

18 50 ± 1 >100

19 0.50 ±0.42 >4

20 0.50 ±0.42 >0.8

°концентрация соединения, требующаяся для защиты 50% теток СЕМ от вируса HIV.

По данным экспериментов по антипролиферативной активности и способности ингибировать топоизомеразу I (Таблица 1) для дальнейшего изучения выбраны N-(2-адамантил)амид 2'-(карбоксиметоксим)-оливомицина А (5) и Ы-(2-диметиламиноэтил)амида оливомицина SA (11).

В предварительных экспериментах на мышах с лейкозом Р388 отмечен выраженный противоопухолевый эффект при однократном введении 5 в дозе 50 мг/кг через 72 часа после имплантации опухолевых клеток - увеличение продолжительности жизни (УПЖ) мышей с лейкозом Р388 составило 62% по сравнению с нелеченным контролем. Пятикратное введение 5 мышам B6D2F1 с лейкозом Р388 достоверно приводило к увеличению продолжительности жизни мышей на 67%. Соединение 5, в отличие от оливомицина А (1), не обладало кумулятивными свойствами.

Противоопухолевую активность на мышах на различных моделях экспериментальных опухолей изучали для Ы-(2-диметиламиноэтил)амида оливомицина SA (11) и его водорастворимой соли - ¿-глутамата М-(2-диметиламиноэтил)амида оливомицина SA (11а) в сравнении с оливомицином А (1). Пятикратное ежедневное (в/в, с третьих по седьмые сутки с момента имплантации опухоли) введение 11 в дозе 4 мг/кг приводило к УПЖ мышей с лейкозом Р388 на 52% при отсутствии лекарственной гибели животных, тогда как пятикратное введение оливомицина А (1) в дозе 2 мг/кг приводило к УПЖ на 35%. Повышение дозы 1 до 4 мг/кг приводило к лекарственной гибели 87% животных в группе.

Производное 11 по противоопухолевой активности практически не уступало оливомицину А (1) при лечении мышей с меланомой В16. Пятикратное внутривенное введение 11 в дозе 6 мг/кг (в дни 1, 4, 7, 10, 13) приводило к торможению роста опухоли (ТРО) до 64% при отсутствии лекарственной гибели животных. Пятикратное введение оливомицина А (1) в дозе 2 мг/кг приводило к ТРО на 76%, однако, увеличении дозы 1 до 4 мг/кг приводило к лекарственной гибели 40% животных в группе.

Сравнение противоопухолевого действия соединения 11а и оливомицина А (1) на модели меланомы В16 показало, что восьмикратное введение (в дни 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 21) соединения 11а в дозе 10 мг/кг приводило к торможению роста опухоли до 85% при отсутствии лекарственной гибели животных. Восьмикратное введение оливомицина А (I) в оптимальной терапевтической дозе 2 мг/кг приводило к торможению роста опухоли на 45%. Таким образом, в этом эксперименте препарат 11а оказался достоверно эффективней, чем оливомицин А (1) для лечения мышей с меланомой В16.

1.1.5. Изучение параметров комплексообразования оливомицина А и его аналогов с ДНК

Поскольку ДНК является основной внутриклеточной мншеныо антибиотиков группы ауреоловой кислоты, изучение параметров комплексообразования оливомицина и его производных с ДНК - важный этап оценки биологической активности данных антибиотиков. Для изучения параметров комплексообразования в Институте биохимической физики им. Н.М Эмануэля РАН (Кузьмин В.А., Дурандпн H.A.) исследованы, в частности, серия аналогов оливомицина А (28-31), отличающихся набором ацильных групп в углеводных цепях.

Образование комплексов соединений в виде димеров с двухцепочечной ДНК регистрировали по изменениям спектров поглощения, флуоресценции и КД. Константу комплексообразования (Кс) определяли из кривой флуоресцентного титрования по уравнению Скэтчарда.

Ацильные заместители в углеводных цепях слабо влияют на УФ-поглощение хромофора (нормализованные спектры поглощения, Рис. 1А). В то же время, заметные различия в нормализованных спектрах флуоресценции (Рис. 1В) и КД (Рис. 1С, Р) комплексов предполагают, что ацильные заместители в ди- и трисахаридных остатках

[антибиотик]2Л^2+

влияют на структуру -координированных димеров антибиотиков.

А, В: 1, 28-31 в виде ^координированных димеров. А -концентрация антибиотика 20 мкМ; В -концентрация антибиотика 0.1 мкМ. 1),Н: 1У^2+-координированные димеры соединений 1, 28-31 в комплексе с ДНК. Г) - концентрация антибиотика 20 мкМ, концентрация ДНК — 3 мМ; Е - концентрация антибиотика 0.1 мкМ, концентрация ДНК = 3 мМ. С, К - КД спектры для соединений 1, 28-31 в Mg2+-кoopдиниpoвaнныx димерах и в комплексе с ДНК. концентрации: антибиотика 10 мкМ, ДНК 3 мМ.

Рис. 1. Нормализованные спектры поглощения (А, Д1, спектры флуоресценции (В, Е) и кругового дихроизма (С, Р) соединений 1, 28-31 в Mg2+-координированных димерах и в комплексе и с ДНК.

2 антибиотик + Мд2+ -- [антибиотик]2Мд2+

I - Е4-/Ви, +6.7 ккал/моль

- А4-Ас, -30.1 ккал/мот

3

- А4-Ас, -21.4 ккапь/мопь

Соед. Е,01 ккал/моль

1 -399.0

28 -420.4

29 -407.3

30 -392.3

31 -422.4

28]

£ - Е4-/Ви, -2 ккал/моль

ш

Рис. 2. Изменение рассчитанных значений общей энергии образования димеров [антибиотик]2М£*.

Квантово-химические расчеты методом Хартри-Фока 3-21 в предполагают различные роли изобутирильной и ацетильный групп: дезацетилирование оливомицинов приводило к облегченному образованию димера [антибиотик]21^2+ по сравнению с исходным оливомицином, в то время как отщепление изобутирильной группы оказывало гораздо меньшее влияние на

образование димера (Рис. 2). Значения квантовых выходов флуоресценции М^+-координированных димеров (0не) убывали в ряду 1>29>28>30>31, что свидетельствуют о том, ацильные заместители в сахарах А и Е могут снижать подвижность олигосахаридных цепей, что влияет на вероятность безызлучательных процессов (Таблица 3).

Взаимодействие 1\%2+-координированных димеров антибиотиков 1, 28-31 с ДНК приводит к значительным изменениям в спектрах поглощения, флуоресценции и КД (Рис. Ш, 1Е, 1С, 1Р). Изменения в спектрах гораздо более выражены в случае соединений, имеющих две ацильных группы в углеводных цепях (антибиотики 1 и 29) и только изобутирильную группу (антибиотик 28).

Квантовые выходы флуоресценции комплексов ДНК-[антибиотик]21^2+ (0сот) были значительно выше, чем квантовые выходы флуоресценции лиганда (9и8), что свидетельствует о значительных изменениях подвижности молекулы антибиотика при взаимодействии димера [антибиотик]2>И^2+ с малой бороздкой ДНК. Измеренные значения констант комплексообразования с ДНК были наибольшими для соединений, имеющих две ацильных группы в углеводных цепях (1 и 29) и только изобутирильную группу (28) (Таблица 3). Для оливомицина С (28) определены две константы комплексообразования, одна того же порядка, что константа комплексообразования для 29, а вторая на порядок меньше, что может быть объяснено наличием двух сайтов связывания 28 с ДНК, причем один из них с большей аффинностью, а другой с меньшей.

Таблица 3. Квантовые выходы флуоресценции М^*-координированных димеров и их

Соед. квантовый выход флуоресценции |антибиотик]2Мв2*, % 9сот, квантовый выход флуоресценции комплексов антибиотика с ДНК, % Кс, М"'

1 0.18 2.50 2.4x105

28 0.12 1.76 4x104, 1хЮ3

29 0.16 2.26 1хЮ4

30 0.10 1.17 н/оа

31 0.01 0.30 н/о

°н/о, не определено (при изученных концентрациях не было зафиксировано образование комплекса). Полученные результаты свидетельствуют о хорошей корреляции значений констант

связывания димеров [антибиотик]21У^

ДНК, способности ингибировать активность

топоизомеразы I и данных об антипролиферативной активности для антибиотиков 1, 29-32. Наличие ацильных групп в углеводных цепях оливомицина А (1) является абсолютно необходимым для проявления антибиотиком противоопухолевых свойств. Как экспериментальные данные, так и результаты квантово-химических расчетов свидетельствуют о различной роли А4-ацетильной группы в моносахаридном остатке А и Е4-изобутирильной группы в моносахаридном остатке Е для проявления биологической активности оливомицина А (1) и его аналогов. Отсутствие Е4-изобутирильной группы незначительно влияет на рассчитанную общую энергию образования димеров [антибиотик]2Р^2+, но приводит к значительным изменениям спектров флуоресценции и индуцированного КД комплексов антибиотиков с ДНК и полностью лишает соединения 30 и 31 аффинности к ДНК, что приводит к утрате способности ингибировать активность топоизомеразы I и отсутствию антипролиферативной активности (Таблица 1, Рис. 3).

Рис. 3. Электрофореграмма продуктов реакции релаксации СС ДНК под действием топоизомеразы I в присутствии оливомицина А (1) и соединений 28-31.

Отсутствие А4-ацетильной группы (соединение 28) приводило к менее выраженным изменениям в спектрах флуоресценции и индуцированного КД комплексов антибиотика с ДНК по сравнению с отсутствием Е4-изобутирильной группы (соединения 30, 31) и к значительному снижению (но не полной потере) аффинности к ДНК, антипролиферативной активности и способности ингибировать топоизомеразу I. Можно предположить, что наличие О-ацильной группы в остатке Е-оливомикозы является критичным для образования комплексов [aнтибиoтик]2Mg2т с ДНК, а остаток в положении 4-О моносахаридного остатка А играет роль во внутримолекулярных взаимодействиях в димере [aнтибиoтик]2Mg2+.

1.1.6. Анализ связи структура- активность для оливомицина А и его аналогов

Анализ данных об антипролиферативной активности, способности образовывать комплексы с дцДНК и ингибировать топоизомеразу I, для синтезированных серий производных оливомицина А позволил установить ряд закономерностей структура-активность (Рис. 4):

- участвует в образовании комплекса [оливомицин^Мд2*;

- отщепление значительно снижает антипролиферативную активность и способность ингибировать топо-1

ацилирование заметно не на антипролиферативную активность и способность ингибировать топо-1

сн

НО

- критична для образования комплексов антибиотика с ДНК;

- более гидрофобная группа предподчительна для усиления связывания с ДНК;

- отщепление лишает оливомицин антипролиферативной активность и способности ингибировать топо-1_

исчезновение антипролиферативной активности и способности ингибировать топо-1

н3со он

отщепление

углеводных цепей II Т Т I П 1 —ч ° он

он он о он

оливин

введение -СООН группы по ^боковой цепи агликона

НэСО он

антипролиферативной активности и способности ингибировать топо-1

Н3СО

отщепление дисахаридной ветви и введение диазенильного заместителя по агликону

оливомицин ЗА (8)

Н3СО

ОН ОН О

-V ОН / О

/Рг

Н3СО

- резкое снижение антипролиферативной активности и способности ингибировать топо-1;

- появление селективной противовирусной активности_

- повышение антипролиферативной активности по сравнению с 2 и 8;

- повышение способности ингибировать топо-1 у производных с объемными заместителями;

- введение третичной аминогруппы (ДМАЭ) обеспечивает растворимость в воде, высокую антипролиферативную активность при снижении способности ингибировать топо-1

Рис. 4. Анализ связи структура-активность для оливомицина А и его аналогов.

1) наличие углеводных цепей является абсолютно необходимым для проявления антибиотиком антипролиферативной активности и способности ингибировать топоизомеразу I;

2) ацильные группы в углеводных цепях исключительно важны для проявления оливомицином антипролиферативной активности и способности ингибировать топоизомеразу I. При этом можно предположить, что О-ацильная группа в остатке Е-оливомикозы критична для образования комплексов [антибиотик]2М§2 " с ДНК. Гидрофобность Е4-ацильного остатка предпочтительна для образования комплекса антибиотика с ДНК. Остаток в положении 4-0 моносахаридного остатка А, помимо участия в образовании комплекса антибиотика с ДНК, играет роль во внутримолекулярных взаимодействиях в димере [антибиотикр\^2+.

3) ацилирование 8-фенольной группы заметно не изменяет способность антибиотика ингибировать топоизомеразу I и не снижает антипролиферативную активность;

4) введение карбоксильной группы по боковой цепи агликона приводит резкому снижению антипролиферативной активности и способности ингибировать топоизомеразу I;

5) амидирование введенной карбоксильной группы приводит к повышению антипролиферативной активности производных, причем амиды, содержащие объемные заместители, являются более активными ингибиторами топоизомеразы I. Введение третичной аминогруппы (ДМАЭ-амид оливомицина SA) обеспечивает растворимость в воде за счет возможности образования солей, высокую антипролиферативную активность при снижении способности ингибировать топоизомеразу I, что, в итоге, приводит к высоко противоопухолевой активности этого производного в опытах in vivo при снижении токсичности;

6) отщепление дисахаридной ветви и введение диазенильного заместителя по ароматической части агликона приводит к резкому снижению антипролиферативной активности, способности ингибировать топоизомеразу I при появлении у одного из соединений изученной серии селективной противовирусной активности.

Полученные данные играют важную роль для рационального дизайна противоопухолевых препаратов на основе оливомицина А, обладающих повышенной аффинностью к ДНК и более селективной антипролиферативной активностью.

1.2. Химическая модификация антрациклиновых антибиотиков

1.2.1. Синтез производных доксорубицина и 14-гидроксикарминомицина, содержащих по 3 '-аминогруппе полигидроксилированные заместители

Ранее показано, что реакция восстановительного алкилирования 3'-аминогруппы даунорубицина (32) в присутствии NaBI^CN сопровождается реакцией восстановления 13-кето-группы антибиотиков и конечными продуктами являются соответствующие 3"-Ы-алкильные-13-(R,S)-,THnupo производные 33.

ДауноруС*п*н (32) к

Для исключения реакции восстановления 13-кетогруппы антибиотика был использован метод, в котором в качестве ключевых интермедиатов используются 13-диметилкетали 14-бромодаунорубицина (35) или 14-бромокарминомицина (36). Соединения 35 или 36 получали исходя из даунорубицина (32) или карминомицина (34) соответственно, и далее вводили в реакцию восстановительного алкилирования с ОЬ-глицеринопым альдегидом в присутствии 1ЧаВН3СК, далее осуществляли гидролиз промежуточных алкилированных 13-диметилкеталей-14-бромодаунорубицина (37) или 13-диметилкеталя-14-бромокарминомицина (38). Соответствующие целевые 3'-Лг-6ис(2,3-дигвдрок'сипропил)доксорубици!г (39) и 3'-Лг-бис(2,3-дигидроксипропил)-14-

гидроксикарминомицин (40), полученные в виде смеси стереоизомеров, очищали методом колоночной хроматографии на силанизированном силикагеле.

н?со_осн3

СН2Вг

>н 1

□Глицериновый альдегид

№ВН3СМ

Я=СН31 Даунорубицин (32) Р=Н, Карминомицин(34)

НО/^ГН

н с • 2 37Н=СНа -¿нон?"0" 3аК=Ннон2с сн>он

39 (?=СН3 (35%Г§'снон

40Р=Н. (11%) СНОН,

ион^ сн>он

По аналогичной схеме впервые проведено алкилирование 13-диметилкеталя 14-бромкарминомицина (36) альдозами - арабинозой и мелибиозой. Целевые 3'-Лг-(1-дезокси-Д-арабинозит-1-ил)-14-гидроксикарминомицин (43) и 3'-Л^-[а-£)-(галактопиранозил-(1—>6)-0-1-дезокси-0-глюцит-1-ил]-14-гидроксикарминомицин (46) получены после гидролиза соответствующих алкилированных 13-диметилкеталей 14-бромокарминомицина42 или 45.

СН;ОН

36

Структура полученных соединений 39, 40, 43, 46 подтверждена методами масс-спектрометрии и 'НЯМР спектроскопии, а также кислотным гидролизом.

1.2.2. Анализ данных биологической активности и связи структура-активность для новых производных антрациклиновых антибиотиков

Таблица 4. Антипролифератнвная активность (1С¡о. нмоль) антрациклинов в отношении клеток лейкоза К562.

Соединение 1С50» мкмоль (К562)

Доксорубицин и его производные Доксорубицин 0.14

39 12.8

Карминомицин и его производные Карминомицин (34) 0.06

14-Гидроксн-карминомнцин 0.18

40 0.30

43 0.40

46 0.59

Антипролифератнвная активность соединений 40, 43 и 46 в отношении клеток лейкоза К.562 практически не уступхта антипролиферативной активности доксорубицина, карминомицина (34) и

14-гидроксикарминомицина, в то же время, антипролиферативная активность производного 39 была значительно снижена (Таблица 4).Новые производные оказались более мощными ингибиторами работы топоизомеразы I, чем доксорубицин и карминомицин (34) (Рис. 5).

«■«kfw.

Рис. 5. Электрофореграмма продуктов реакции релаксации СС ДНК под действием топоизомеразы I в присутствии антрациклиновых антибиотиков доксорубицина, карминомицина (34) и их полусинтетических производных 39, 40, 43, 46.

По противоопухолевой активности в опытах in vivo производное 40 не уступало доксорубицину: однократное внутривенное введение 40 в дозе 10 мг/кг приводило к такому же УПЖ (108%) мышей с лейкозом Р388, что и введение доксорубицина в дозе 8 мг/кг.

Анализ данных по антипролиферативной активности и способности ингибировать топоизомеразу I для антрациклиновых антибиотиков доксорубицина и карминомицина, а их полусинтетических производных позволил выявить следующие закономерности (Рис. 6):

увеличение способности ингибировать толо-1

Рис. 6. Анализ связи структура-активность для антрациклиновых антибиотиков.

1) введение по З'-аминогруппе даунозамина полигидроксилированных заместителей приводит к снижению антипролиферативной активности полученных производных в сравнении с исходными антибиотиками. При этом данный тип модификации приводит к увеличению способности ингибировать топоизомеразу I. Объемные гидрофильные заместители могут вызывать локальные нарушения конформации нуклеотидных цепей и/или препятствуют связыванию фермента с ДНК. .

2) отсутствие метальной группы в 4-положении агликона антрациклинового антибиотика повышает антипролиферативную активность и способность ингибировать топоизомеразу I.

1.2.3. Разработки метода синтеза конъюгатов доксорубицина с DA VANA Т и анализ данных биологической активности новых производных

В рамках настоящего исследования разработан метод синтеза пролекарств на основе доксорубицина и полисахарида DAVANAT (предоставлен фирмой ProPharmaceuticals Inc), в которых молекула антибиотика присоединена к полимеру через иминную связь. DAVANAT является продуктом контролируемого частичного гидролиза 1,4-|3-0-галактоманнан, получаемого из семян Cyamopsis tetragonoloba или Guar gum. DAVANAT прошел вторую фазу клинических испытаний как препарат, усиливающий действие цитотоксических агентов и смягчающий побочные эффекты химиотерапии.

Для активации DAVANAT проводили реакцию периодатного расщепления, полученный окисленный DAVANAT (48) очищали гель-фильтрацией на сефадексе G-20. В реакции использован недостаток окислителя (0.07-0.11 экв. в расчете на количество мономерных остатков), очевидно, что образование альдегидных групп возможно по любому мономерному

сахарному фрагменту полисахарида (галактозе или маннозе) (на схеме для упрощения представлен один из возможных вариантов).

ЫН2-ООХ (49)

Активированный ОАУАМТ (48)

ОН О ОСНз

Активированный ОАУАЫАТ (48) вводили в реакцию с доксорубицином (49), что приводило к образованию связи между альдегидными группами окисленного ОАУАЫАТ и З'-аминогруппой доксорубицина (для упрощения на схеме представлен только один из вариантов структуры такой связи). Конъюгат 50 очищали методом диализа и методом гель-фильтрации. Молекулярная масса полученного конъюгата доксорубицин+БАУАКАТ (51), определенная методом гель-фильтрации, составила ~ 95 кДа (М\У исходного ОАУАМАТ, определенная этим же методом ~ 92 кДа). Конъюгаты доксорубицина с ОАУАЫАТ (50) оказались водорастворимы только при содержании антибиотика не более -5% весовых. Для увеличения содержания доксорубицина в конъюгате с ОАУЛИАТ и введения спейсера между молекулой антибиотика и полисахаридом, использовали 3'-Ы-£-лизилдоксорубицин (55). Соединение 55 имеет две аминогруппы (в доксорубициие - одна), что могло обеспечить лучшее протекание реакции образования основания Шиффа. Кроме того, описано, что ряд И-ацильных конъюгатов даунорубицина или доксорубицина с аминокислотами обладает высокой противоопухолевой активностью.

3'-М-/,-Лизилдоксорубицина (55) получен в 4 стадии, исходя из ¿-лизина (51) и доксорубицина (49).

но;5". °СС ГтосНМ

РтосОви Ргг.';сН\ 93%

РтосНМ

Для защиты аминогрупп ¿-лизина (51) использована Ы-9-флуоренилметоксикарбонил (Бтос) группа, далее карбоксильную группу активировали взаимодействием с Ы-гидроксисукцинимидом в присутствии ОСС. Полученный Ы-гидрокспсукцшшмидный эфир №,МЕ-дн-(9-флуоренилметокспкарбонил)^-лизмна (53) вводили в реакцию с доксорубицином (49), далее удаляли Ртос-групн морфолииом, поулчая целевой З'-Ы-^-лизилдоксорубиции (55), структура которого подтверждена методами масс-спектрометрии и 'Н ЯМР-спектроскопии.

3'-М-£-Лизилдоксорубицин (55) вводили в реакцию с активированным ЦАУАМАТ (50). Выделение и очистку конъюгата 56 проводили методом диализа и гель-фильтрации. Использование спейсера между антибиотиком и ЦАУАЫАТ позволило повысить нагрузку доксорубицина до 10% весовых при сохранении растворимости в воде. Молекулярная масса полученного конъюгата 3'-М-1-лизилдоксорубицин+ОАУАКАТ (56), определенная методом гель-хроматографии, составила ~ 98 кДа.

он

Активированный ОАУА^Т (48) 56 (!_уз)-00Х

Синтезированные конъюгаты доксорубцин+ОАУАЫАТ (50) и З'-М-Т,-лизилдоксорубицин+ОАУАНАТ (56) не содержали свободных доксорубицина и 3'-М-£-лизилдоксорубицина (55) соответственно, что подтверждено методом ТСХ. Методами ТСХ и ВЭЖХ с использованием стандартных образцов 49 и 55 показано, что в условиях мягкого кислотного гидролиза (0.1 н. НС1, 37°С) от конъюгата 50 отщеплялся доксорубицин (49), а от конъюгата 56 - 3'-М-£-лизилдоксорубицин (55) соответственно.

Антипролиферативная активность полученных конъюгатов доксорубицин+ВАУАЫАТ (50) и 3'-1Ч-£-лизилдоксорубицин+ВАУАКАТ (56) изучена фирмой РгоРЬагтасеиНсаЬ (США) на трех линиях опухолевых клеток (Таблица 5).

Таблица 5. Антипролиферативная активность доксорубицина (49) и конъюгата доксорубицин+РА УАЫАТ (50).__

Соединение 1С50, мкг/мл*

В16-Г1 МСР-7 НТ-29 (НТВ-38

Доксорубицин (49) 0.01-0.02 0.08-0.12 0.2-0.3

Доксорубицин+ОАУАЫАТ (50) 0.5-0.8 (0.025-0.04)** 3.0-4.4 (0.15-0.22)** 13-20 (0.65-1)**

К 'у, - концентрация соединения, вызывающая гибель 50% клеток.

** значения ¡С^с учетом 5%-ного содержания доксорубицина в конъюгате 50.

Конъюгат доксорубицин+ОАУАЫАТ (50) обладал антипролиферативной активностью на 1 -2 порядка меньшей по сравнению с доксорубицином. Пересчет данных антипролиферативной активности с учетом количества содержащегося в конъюгате 50 доксорубицина подтверждает, что синтезированный конъюгат 50 представляет собой депо-форму доксорубицина. Антипролиферативная активность конъюгата З'-Ы-^-лизилдоксорубицин+ОАУАЫАТ (56) в отношении исследованных линий опухолевых клеток была значительно ниже (1С5о>50 мкг/мл) по сравнению с цитотоксичностыо конъюгата 50, что, вероятно, может быть связано с большей устойчивостью импнных связей в 56 по сравнению с конъюгатом доксорубицин+ОАУАКАТ (50).

2. ХИМИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ МАКРОЦИЛИЧЕСКИХ АНТИБИОТИКОВ

2.1 Химическая модификация генно-инженерных полиеновых антибиотиков группы амфотерицина В

В рамках настоящего исследования разработаны методы модификации противогрибкового макролидного полиепового антибиотика амфотерицина В (57) и новых генно-пнжеперпых антибиотиков 844НР (59), В5С005 (60), В5С022 (61). В50019 (62), ВЭОООЗ (63) и В5С018 (64) (Рис. 7), полученных в Норвежском институте науки и технологии (проф. Зотчев С.Б. и сотр.) на основе рекомбинантного штамма продуцента нистатина А| (58). Изучаемые антибиотики

отличаются заместителями при С(16) (карбоксильная или метильная группа) и структурой области С(7)-С(10) антибиотика.

Рис. 7. Структура природных антибиотиков амфотерш^на В (57), нистатина А1 (58) и га аналогов, полученных с использованием методов генной инженерии.

Особый интерес представляло исследование оптимального расположения гидроксильных групп в области С(7)-С(10) полиолыюй части агликона для проявления противогрибковой активности, а также влияние структуры заместителя в положении С(16) и по З'-Ы-положеиию микозамина.

Решение поставленной задачи потребовало, в первую очередь, разработки методов очистки сырцов антибиотиков 59-64, выделенных после ферментации и содержащих различные примеси полиеновой и неполиеновой природы. Методы очистки подбирались в зависимости от процентного содержания целевого антибиотика в сырце и характера примесей. После удаления экстракцией примесей неполиеновой природы, целевой антибиотик очищали методом колоночной хроматографии на силикагеле (при содержании целевого компонента более 80%) или в виде соответствующего Ршос-производного (при исходной чистоте менее 80%). З'-Ы-Ршос-производное получали действием на образец РтосОБи в присутствии EtзN (на схеме на примере В5С005 (60)). Далее действием пиперидина с количественным выходом проводили отщепление Ршос-группы.

(вЗС005-)—СН3 ГРтосОБи, Е1зМ, РМБО ^ ^ВЗС005-)— СН3 пиперидин^ (вЗОжГ}— СН3 ^ 2. колоночная хроматография ^ \

60 ЫН2 65 МНРтос 60 ин2

2.1.1. Синтез моно-модифицированных производных полиеновых антибиотиков

Основные направления химической трансформации полиеновых антибиотиков включают модификацию С(16) карбоксильной группы (при ее наличии) и 3'-аминогруппы остатка микозамина.

А. Синтез амидов полиеновых антибиотиков

Синтез амидов полиеновых антибиотиков АтВ, 544НР, ВЗОООЗ и В8й022 осуществлен по двум основным схемам в зависимости от количества побочных продуктов реакции амидпровання и чистоты исходного антибиотика: непосредственно реакцией амидпровання антибиотика (Схема

А) или же с использованием промежуточного интермедиата Ршос-защищенного производного

антибиотика (Схема Б) для облегчения хроматографической очистки синтезированных производных.

(полиен 4—СООН 1. ^"МН-НС!, РуВОР, Е13М _

-V \— у1 II

\ \ 0 (70-90%)

Схема А. N42

^^3-СООН RnocOSu.EbN.DMSO к 1.Я^Н-НС1. РуВОР. ВзМ^

^ -^ 2. колоночная хроматография

Мн2 ЫНРтос

-( полиен 4—

^_О м

\ 0

Схема Б. мнРтос

пиперидин

^полиен—С

Л

о (20-25%)

ЫН,

Таблица 6. Структуры синтезированных амидов полиеновых антибиотиков (к схемам А и Б).

Амиды АтВ Амиды 844НР

N11'Я" Соед. Схема Соед. Схема

"и 66 А 74 А

н -\ он 67 Б 75 А

-ЫН-СНз 68 А 76 А

^ОН 69 А 77 А

н У (01) он 70 А 78 А

н У (1)сн> 71 А 79 А

Н у 72 А 80 А

/-\ /—ОН 73 Б 81 Б

сн3 1 ¿ни ^^ сн3 82 Б

NR'R" Амид В5С022 Амид ВЭСООЗ

СНз 1 ¿'НМ СН3 Соед. Схема Соед. Схема

83 А 84 Б

Таким образом, получена серия амидов АтВ: Ы-(2-адамантил)амнд АтВ (66), N-(2-гидроксиэтил)амид АшВ (67), М-метиламид АтВ (68), 1М-1-[ди-(2-гидроксиэтил)этиламид АтВ

(69), Ы-(гидрокснметил, меткосикарбонил)метиламид АтВ (амид с метиловым эфиром Д£-серина)

(70), 1Ч-(метил, метоксикарбонил)метиламид АтВ (амид с метиловым эфиром ¿-алашша) (71), Ы-(этоксикарбонпл)метнламид АтВ (амид с этиловым эфиром глицина) (72), М-(М"-2-гидроксиэтил)-пнпераразнд АтВ (73), аналогичная серия амидов 544НР (74-81), а также N-(2-диметиламиноэтнл)амнды Б44НР (82), В5С022 (83), и ВБвООЗ (84) (Таблица 6). Структура полученных производных подтверждена данными масс-спектромстрпи и ЯМР-спектроскопии.

Б. Синтез 3'-И-замещенных производных полиеновых антибиотиков

Следующим этапом работы являлась разработка методов модификации генно-инженерных полиеновых антибиотиков по 3'-аминогруппе остатка микозамина. Изучены реакции Г4!-ацилирования, восстановительного Ы-алкилирования, а также перегруппировка Амадори.

По схеме, аналогичной описанной выше для синтеза 3'-1Ч-/,-лизил-доксорубицина (56), исходя из 844НР (59) или ВБОООб (60) и ?<-гидроксисукцинимидного эфира ЪР, №-ди-(9-флуоренилметоксикарбонил)-£-лизина (53) получены 3'-Ы-£-лизил-844НР (87) и 3'->1-£-лизил-В80005 (88), соответственно.

Аи

у:

87 Х=СООН (20%)

88 Х=СН3(21%)

Взаимодействием Б44Р1Р (59) или ВБОООб (60) Ы-Ртос-З-аминопропаналем (91) в присутствии ЫаВНзСЫ и последующем отщеплением Ршос-группы получены моно- и бис- Ы-аминоалкильные производные 95, 96, 97, соответственно.

ртосОБи, Е^М

ОМР, СН2С|2

Альдегид 91 получен из 3-амииопропанола (89) путем введения ртос-группы и окислением с гидроксилыюй группы до альдегидной действием реагента Десс-Мартина (ОМР). N-2-Сульфоиепзпл- (98) или М-(4-(М,М-дпметиламино)бензил- (99, 100) производные полиеновых антибиотиков получены реакцией восстановительного алкилирования 544ПР (59) или ВБСООЗ (60)

2-сульфобензальдегидом или 4-(К,Ы-диметиламино)бензальдегидом в присутствии К'аВПзСЫ, соответственно.

При взаимодействии полиеновых антибиотиков АтВ (57) или 344НР (59) или В80005 (60) с О-глюкозой, О-галактозой или лактозой протекала перегруппировка Амадори с образованием соответствующих Ы-углевод-содержащих производных 101-105.

он

АмВ (57) перегруппировка Амадори

D-глюкоза, или D-галакгоза. S44HP (59) или или лактоза

bsg005 (60) -»

перегруппировка Амадори

101, (43%)

102 х=соон, y=oh, z=h, (45%);

103 х=соон, y=h, z=oh, (43%);

104 х=сн3, y=oh, z=h (37%)

R7

HO HO

¡S/^OH 105 X=COOH. (41 %)

Взаимодействие 3'-аминогруппы микозамина с моносахаридом может приводить к образованию пяти типов структур: основания Шиффа (а), Ы-гликозида (Ь), Ы-углевод-содержащего производного в линейной кето-форме (с), в циклической а,р-пиранозной форме (с1) или а,Р-фуранозной форме (е).

и"

-г

L

«¿-он но—¿н H<j:-Oh

нс-он

¿НгОН

-г

9=0 но-сн нс-он нб-он

¿Н.

¡ОН t

^ОН

It

СН2ОН I 'чз!

Для подтверждения протекания перегруппировки Амадори получено производное N-(1-дезокси-

0-фруктоз-1-ил)-544НР (102а) с 1-|3С

-меченой глюкозой.

На рис. 8 представлен 13С ЯМР-спектр в режиме APT (тест на присоединенный протоны) смеси 1-|3С-102а и 1-|3С-0-глюкозы. Наличие в спектре сигналов, относящихся ко вторичному пли четвертичному атому углерода (51.61 и 50.47 м.д.), свидетельствует об образование равновесной смеси структур «с», «d» и/или «е». В случае структур «а» и/или «Ь» в спектре наблюдались бы сигналы, характерные для третичных или первичных атомов углеродов, т.е. направленные вниз. Сигналы при 96.63 и 91.96 м.д. принадлежат меченому третичному атому углерода 1-ьС в D-глюкозе.

Рис. 8. ,3СЯМР -спектр в режиме APT смеси и 1-,3С-й-глюкозы (DMSO-dc, 35 °С).

Чистота всех полученных N-замещенных производных подтверждена данными ВЭЖХ, структуры полученных соединений подтверждены данными масс-спектрометрии и ЯМР-спектроскопии.

2.1.2. Синтез производных S44HP, модифицированных по С(16)-карбоксильной и 3'-аминогруппе микозамина (дважды модифицированные производные) Разработаны методы двойной модификации антибиотика S44HP (59) по С(16)-карбоксильной группе и 3'-аминогруппе остатка микозамина. Выбор антибиотика S44HP (59) обусловлен данными испытаний 59 in vitro и in vivo, свидетельствующих о его преимуществах перед амфотерицином В и другими полиенами близкого строения - BSG022 и BSG003.

( s44hp-j—conhr nh

I

COCH2NMe2

108 R= -(CH2)2NMe2

109 R= -(CH2)3NMe2 (30-40%)

110 R= -(CH2)3OH

■CONH(CH2)3N(Me)2

NHX

Me2NCH2COOH,N DM SO, Et3N, PyBOP, pH-7.5

[ S44HP]~C

1) FmocOSu, r DMF/MeOH,

2) R-NH2*HCI, PyBOP, DMSO, Et3N, pH-7

колоночная хроматография на силикагеле

3) пиперидин/DMSO

Na,Ne-fln-Fmoc-L-Lys (54), PyBOP, DMSO, Et3N, pH-7.5

[ S44Hpj—CONHR

nh2

82 R=-(CH2)2NMe2

106 R= -(CH2)3NMe2

107 R= -(CH2)3OH

113 R =

114 R =

115 R =

116 R =

117 R =

(CH,)2NMe2 ; X=H; Y=OH (CH2)-,NMe, ; X=OH: Y=H (CH-,)3NMe-,; X=H; Y=OH (CH2)3NMe2 ; X=OH; Y=H (CH2)3OH ; X=H; Y=OH

(15-25%)

p-Me2NC6H4CHO, NaBH3CN, DMF, колоночная хроматография на \ силикагеле

S44HPj— CONHR

NH

I

CH2C6H4NMe2-p

118 R= -(CH,)2NMe2 119R=-(CH,)3NMe, 120 R=-(CH2)3OH

(2535%)

Определяющими факторами при выборе последовательности синтетических превращений S44HP (59) послужили удобство и эффективность очистки целевых или промежуточных производных. Оптимальной являлась хроматографическая очистка антибиотиков в виде гидрофобных Fmoc-защшценных производных. Для модификации использовали два синтетических подхода. Первый подход заключался в получении Fmoc-защищенных С(16) карбоксамидов (82, 106, 107), их очистке хроматографическими методами, удалении защитной Fmoc-группы и последующим превращении 82, 106, 107 в соответствующие З'-К'-ацильные или 3'-N-алкильные производные 108-110, 112-120.

Второй подход заключался в синтезе гидрофобных З'-Ы-ацильных производных S44HP (87, 125), содержащих Fmoc-группу во вводимом ацильном радикале, хроматографической очистке полученных соединений и проведении реакции амидирования с получением дважды модифицированных производных 122, 124, 127,129, 131.

R-NH:>xHCI РуВОР, DMSO. Et3N. рН-7 5,

-122Х=Н; R= -(CH2)2NMe2 , (11%)

,— 123 X=Fmoc; R= -(CH2)3OH 'U-124X=H; R--(CH2)3OH. (11%)

,— 128 X=Fmoc; R= -(CH2)2NMe¡ 'U-127X=H; R=-(CH2)2NMe2 , (30%)

HR .[—128X=Fmoc;R=-(CH2)3NUe2 ' U-129 X=H; R= -(CH2)3NMe2 , (30%)

130 X=Fmoc; R= -(CH2)3OH 11^_131 X=H; R= -(CH2)3OH. (30%)

Чистота полученных производных 108-110, 112-120, 122, 124, 127, 129, 131 подтверждена методам ВЭЖХ, структура соединений подтверждена методом масс-спектрометрии и для некоторых - методом 'Н ЯМР-спектроскопии.

2.1.3. Анализ данных противогрибковой активности полусинтетических производных полиеновых антибиотиков in vitro

А. Анализ влияния структуры области С7-С10 на противогрибковую активность полиеновых антибиотиков

Противогрибковая активность новых синтезированных производных протестирована в секторе разработки методов поиска биологически активных соединений ФГБНУ «НИИНА» в отношении ряда культур дрожжей: Candida albicans (АТСС 14053), Cryptococcus humicolus (АТСС 9949) и несовершенных грибов: Aspergillus niger (АТСС 16404), Fusarium oxysporum (VKM F-140) (Тренин A.C., Галатенко O.A.).

Влияние структуры области С7-С10 на противогрибковую активность полиеновых антибиотиков изучено для серии полусинтетических производных АшВ (66-73, 101) в сравнении с соответствующими производными S44HP (74-81, 105) (Таблица 7). АтВ (57) и его производные имеют две гидроксильные группы в положениях С8 и С9, в то время как в S44HP (59) и его производных гидроксильные группы располагаются в положениях С7 и СЮ. Антибиотики АгпВ и S44HP и их соответствующие производные имеют близкую противогрибковую активность in vitro на различных моделях (Таблица 7). Таким образом, различия в структуре полиольной части 57 и 59 не оказывают значительного влияния на противогрибковые свойства этих антибиотиков п их полусинтетических производных.

Таблица 7. Противогрибковая активность (МПК, мкг/мл) производных АтВ и S44HP в сравнении с исходными антибиотиками АтВ (57) и S44HP (59) в отношении С. albicans АТСС 14053 (А); С. humicolus АТСС 9949 (В); A. nigerATCC 16404 (С); F. oxysporum VKMF-140 (D).

АтВ (57) и его производные S44HP (59) и его производные

МПК, мкг/мл МПК, мкг/мл

Соед. А В С D Соед. А В С D

АтВ (57) 1 1 1 4 S44HP (59) 1 1 1 4

66 4 4 4 16 74 4 4 4 8

67 2 2 2 4 75 2 4 4 4

68 1 2 2 4 76 2 2 4 4

69 2 4 4 8 77 4 4 4 16

70 1 1 2 4 78 2 2 4 4

71 2 2 2 4 79 2 2 4 8

72 2 2 2 4 80 1 1 2 4

73 4 4 4 8 81 1 2 2 4

101 2 4 4 8 105 2 2 2 8

66, 74 - Ы-(2-адамантил)амиды; 67, 75 - К-(2-гидроксиэтил)амиды; 68, 76 - N-метиламиды; 69, 77 - Х-1-[ди-(2-гидроксиэтил)этиламиды; 70, 78 - амиды с метиловым эфиром /)/.-серииа; 71, 79 - амиды с метиловым эфиром L-аланина; 72, 80 - амиды с этиловым эфиром глицина; 73, 81 - ЬГ-(>Г-2-гидроксиэтил)-пипераразиды; 101,105 -продукты перегруппировки Амадори с лактозой.

Далее изучено влияние строения полиольной части молекулы антибиотиков, имеющих различия в С9-С10 области. Так, соединение BSG005 (60), содержащие ОН группу в положении СЮ, обладает несколько более высокой противогрибковой активностью, чем BSG019 (62), у которого гидроксильная группа в положении СЮ отсутствует (Таблица 8). Сдвиг гидроксилыюй группы из положения СЮ (как в 60) в положение С9 (BSG018, 64) привел к значительному снижению противогрибковой активности и почти полной потери активности в отношении С. hwnicolus и F. oxysporum (МПК > 16 мкг/мл) (Таблица 8). Противогрибковая активность антибиотиков уменьшается в ряду BSG005 (60) > BSG019(62) > BSG018 (64).

Таблица 8. Противогрибковая активность (МПК, мкг/мл) антибиотиков АтВ (57), BSG005 (60), BSG019 (62) и BSG018 (64)._

Соединение/структура С7-СЮ области, МПК, мкг/мл

Тест-организм АМВ (57) он яТ 10 он BSG005 (60) ОН 8 10? 71 9 ОН BSG019 (62) в 10 | он BSG018 (64) 0 10 он ОН

С. а/6;с<7/м АТСС 14053 0.5 1 1 2

С. hwnicolus АТСС 9949 0.5 0.5 1 16

Л. n/ge/- АТСС 16404 0.5 1 1 4

F. oxysporum VK.M F-140 2 2 4 >16

Аналогичная закономерность изменения противогрибковой активности прослеживалась для антибиотиков 59, 61 и 63 (данные проф. Зотчева С.Б.), а также соответствующих N-(2-диметиламиноэтил)амидов (ДМАЭ) антибиотиков: ДМАЭ-Б44НР (82) > ДМАЭ-В8С022 (83) > ДМАО-ВЯСООЗ (84) (Таблица 9).

Таблица 9. Противогрибковая активность (МПК, мкг/мл) 2-(Ы,И-диметиламино)этиламидов S44HP (82), BSG022 (83) и BSG003 (84) в сравнении с АтВ (57)._

Соединение/структура С7-С10 области, МПК, мкг/мл

Тест-организм АтВ (57) он vyi- он 82 он « Ч, 83 8 10 7 j 9 ОН 84 8 10

1 он ST or он ОН

С. albicans АТСС 14053 0.5 0.5 1 4

С. humicolus АТСС 9949 0.5 0.5 1 >16

A. niger АТСС 16404 0.5 0.5 2 4

F. oxysporum VKM F-140 2 2 4 8

То есть, выявлены одинаковые закономерности изменения противогрибковой активности в зависимости от расположения гидроксильных групп в области С7-С10 для антибиотиков, имеющих карбоксильную (59, 61, 63) или метальную группу (60, 62, 64) в положении С16, а также для серии ДМАЭ-амидов 82-84. Полученные результаты согласуются с ранее опубликованными данными для аналогов АтВ: удаление одной из ОН-групп из области С7-С10 молекулы АтВ генно-инженерными методами привело к получению 8-дезоксиамфотерицина В, который обладал сниженной активностью по сравнению с АтВ в отношении Saccharomyces cerevisiae.

Б. Анализ влияния заместителей при С16 и 3 '-аминогруппе на противогрибковую активность полиеновых антибиотиков Проведено сравнение противогрибковой активности серии З'-Ы-замещенных производных S44HP (87, 96, 99, 102) и соответствующих З'-И-замещенных производных BSG005 (85, 97, 100, 104) (Таблица 10). Эти серии производных полиеновых антибиотиков имеют одинаковое строение полиольной области С7-С10, в соединении S44HP (60) имеется карбоксильная группа в положении CI6, а в BSG005 (60) в этом положении - метильная группа. Установлено, что химическая модификация аминогруппы полиеновых антибиотиков приводит к разнонаправленным изменениям противогрибковой активности в зависимости от структуры заместителя при С16 (Таблица 10).

Таблиг/а 10. Противогрибковая активность (МПК, мкг/мл) производных S44HP и BSG005 в сравнении с исходными антибиотиками и АтВ (57) в отношении С. albicans АТСС 14053 (А), С. humicolus А ТСС 9949 (В), A. niger АТСС 16404 (С), и F. oxysporum VKMF-140 (D).

МПК, мкг/мл

S44HP и его производные BSG005 и его производные

Соед. А В С D Соед. А В С D

S44HP (59) 1 1 1 4 BSG005 (60) 1 1 2 2

87 8 8 16 >16 88 1 1 1 2

96 1 1 1 1 97 4 8 8 8

99 2 2 4 >16 100 16 >16 >16 >16

102 1 1 2 8 104 2 2 2 8

АтВ (57) 1 1 1 4

87,88 - К-/.-:ппил-зпх'и>ги: 96, 97 - Ы,М-бис(3-аминопрогтил)-аналоги; 99, 100 - Ы-4-(М,Ы-диметплалшно)бен:шл-аналоги; 102, 104 - (I -дезокси-/.>-фруктоз-1 -ил)-аналоги.

Противогрибковая активность исследованных производных полиеновых антибиотиков, модифицированных по аминогруппе микозамина, зависела как от структуры заместителя в

положении CI6 (СНз или СООН группа), так и от структуры вводимого по аминогруппе заместителя. Так, влияние структуры заместителя при С16 (СООН или СН3) в случае полусинтетических производных (102 или 104), имеющих гидрофильный нейтральный углеводный заместитель по 3'-аминогруппе микозамина, оказывается незначительным. Напротив, три других исследованных модификации по аминогруппе микозамина полиеновых антибиотиков 59 и 60 привели к различным изменениям противогрибковой активности (Таблица 10). Таким образом, возможно повышение селективности действия полиеновых антибиотиков в отношении определенных штаммов грибков путем подбора комбинации структур заместителей при С16-группе и аминогруппе микозамина. В недавней статье Kaitlyn С. Gray с сотр. утверждается, что «амфотерицин В убивает дрожжи за счет простого связывания с эргостеролом» и обосновывается критическая роль С35-гидроксильной группы и остатка микозамина АгпВ (58) для проявления антибиотиком биологической активности. Ранее также утверждалось, что остаток микозамина играет критическую роль как для связывания с эргостеролом, так и для образования пор. Однако, среди исследованных нами антибиотиков АтВ (57), S44HP (59) и BSG005 (60) и большинство их полусинтетических производных проявляли противогрибковую активность, в то время как антибиотики 61-64, имеющие в структуре и С35-гидроксильную группу и остаток микозамина, оказались малоактивны. Наши исследования демонстрируют критическую роль структуры С7-С10 полиольной области для проявления противогрибковой активности. Гидроксильные группы в макролидном цикле могут влиять на конформацию макроцикла, образование водородных связей, межмолекулярные взаимодействия и образование пор. Производные антибиотиков АтВ (57), S44HP (59) и BSG005 (60) (с предпочтительными структурами С7-С10 полиольной области), содержащие различные заместители по аминогруппе микозамина, включая гидрофобные и гидрофильные группы, сохраняли высокую противогрибковую активность. Некоторое снижение активности наблюдали только для производных, содержащих объемные заместители, что может быть объяснено стерическими препятствиями для взаимодействия с эргостеролом. Таким образом, наши результаты показали критическую роль структуры С7-С10 области в проявлении активности, в то время как роль аминогруппы при З'-С-положении микозамина не так существенна.

С. Анализ данных противогрибковой активности дважды модифицированных производных

S44HP in vitro

Большинство синтезированных дважды модифицированных производных S44HP обладали высокой противогрибковой активностью, а продукты перегруппировки Амадори с £)-глюкозой и D-галактозой ДМАЭ-амида S44HP (113 и 114 соответственно) по противогрибковой активности превосходили как исходный антибиотик S44HP (59), так и АтВ (57) (Таблица 11).

Анализ полученных данных противогрибковой активности изученной серии дважды модифицированных производных S44HP в сравнении с моно-замещенными карбкосамидами 82, 106, 107 показал, что вторичная модификация аминогруппы микозамина карбоксамидов 82 и 106 заметно не влияла на противогрибковую активность в отношении изученных штаммов грибков и дрожжей (Таблица 11). В то же время, аналогичные модификации 3-гидроксипропиламида S44HP (107) приводили к существенному снижению противогрибковой активности (Таблица 11).

Таблица 11. Противогрибковая активность дважды замещенных производных 344НР в

сравнении с С(16)-карбоксамидалш 82, 106, 107.

МПК, мкг/мл

С. ЫЫсатАТСС 14053 С. ИитШшАТСС 9949 А.тгегАТСС 16404 К охуьрогит УКМ Р-140

82 0.5 0.5 1 1

106 1 1 2 2

107 1 1 2 2

108 1 2 1 4

109 1 2 1 4

110 1 1 2 16

112 1 1 1 2

113 0.5 1 1 2

114 0.5 1 1 2

115 1 1 1 4

116 1 2 2 4

117 4 4 4 16

118 1 1 1 4

119 2 2 2 8

120 2 1 2 4

122 1 2 2 4

124 1 1 2 4

127 2 2 2 4

129 2 2 4 4

131 2 2 4 16

844НР (59) 1 1 1 4

АтВ (57) 1 1 1 4

2.1.4. Анализ связи структура-активность для полиеновых антибиотиков группы АтВ и их полусинтетических производных

Подводя итог, анализ данных по противогрибковой активности для синтезированных серий производных полиеновых антибиотиков группы амфотерицина В позволил установить ряд закономерностей структура-активность (Рис. 9):

АмВ 544НР. ВБСООБ В5С019. В5С022 В5С003, ВБС018

Рис. 9. Связь структура-противогрибковая активность для полиеновых антибиотиков группы АтВ и их полусинтетических производных.

1) Структура С7-С10 полиольной области играет критическую роль для проявления противогрибковой активности антибиотиками группы амфотерицина В. Предпочтительным является наличие гидроксильных групп в положениях С8 и С9 (АтВ В (57)) или С7 и СЮ (Б44НР

(59), BSG005 (60)). Наличие гидроксильной группы в положении С7 при отсутствии второй гидроксильной группы в области С7-С10, а также сдвиг гидроксильной группы из положения СЮ в положение С9 (BSG018, 64) приводит к значительному снижению противогрибковой активности.

2) Замена С16 карбоксильной группы на С16 метильную группу не снижает противогрибковую активность производных полиеновых антибиотиков в тестах in vitro в случаях, когда З'-аминогруппа микозамина остается не модифицированной;

3) Противогрибковая активность производных полиеновых антибиотиков, модифицированных по аминогруппе микозамина, зависит как от структуры заместителя в положении С16 (СНз или СООН группа), так и от структуры вводимого по аминогруппе заместителя.

2.1.5. Изучение противогрибковой активности и острой токсичности новых полусинтетических производных полиеновых антибиотиков в экспериментах in vivo

На основе полученных данных in vitro для изучения биологической активности in vivo отобраны шесть полусинтетических производных разных типов: М-(2-диметиламиноэтил)амиды S44HP (82), BSG022 (83), BSG003 (84), >!-(3-диметиламинопропил)амид S44HP (106), 3'N-L-Lys-BSG005 (88), дважды модифицированное производное S44HP (113).

Определение токсичности изучаемых соединений осуществлено в лаборатории фармакологии и химиотерапии ФГБНУ «НИИНА» на мышах при однократном внутривенном введении (Трещалин И.Д., Мирчинк Е.П., Исакова Е.Б.). Эффективность противогрибкового действия оценивали по количеству колониеобразующих единиц (КОЕ) 1 г ткани почек.

Большинство изученных соединений превосходило АшВ (57) по лечебным и токсическим характеристикам. Так, при введении АшВ (57) животным в дозе 2.0 мг/кг/с, близкой к МПД, число КОЕ/г ткани почек снижалось на 2 порядка. В тоже время, повышение дозы BSG005 (60) или N-(3-диметиламинопропил)амида S44HP (106) до 5.0 мг/кг/с при лечении кандидоза приводило к полному излечению животных (значение КОЕ/г снижается практически до нуля) при отсутствии лекарственной гибели. 3'-N-Z,-JIh3Wi BSG005 (88) проявил высокую эффективность в дозе 2.5 мг/кг/с, однако, соединение оказалось более токсичным по сравнению с 60 и 106 (Таблица 12).

Таблица 12. Значения полулетальной (LD¡o, мг/кг), максимально переносимой (МПД, мг/кг) дозы и эффективности для производных 60, 88, 82, 106. 113 в сравнении с амфотерииином В (57).

Соединение LD50, мг/кг МПД, мг/кг Эффективность, % от МПД

АшВ (57) 2.8 2.01 62

60 17.8 11.0 11

88 5.3 4.48 28

82 32.2 25.9 2

106 16.4 11.9

113 38.6 21.2 6

Максимальный интервал между лечебным и токсическим действием продемонстрировали производные 82 и 113, для которых эффективная доза составила соответственно 2% и 6% от МПД, в то время как АтВ (57) оказался эффективен в дозе, составляющей 62% от МПД.

Противогрибковая активность полиеновых антибиотиков 60, 62, 64, 82, 83 и 84 также изучена на животных с нейтропенией (вызванной подкожным введением циклофосфамида в дозе 100 мг/кг за 3 дня до и через 1 день после заражения С. albicans) (Рис. 10). АшВ (57) продемонстрировал низкую противогрибковую активность в условиях эксперимента (падение КОЕ/г на два порядка) даже в максимально высокой дозе (2.50 мг/кг/с). Антибиотики 62 и 64 проявляли выраженную активность только в высоких дозах. 1Ч-(2-Диметиламиноэтил)амид BSG022 (83) и К-(2-диметиламиноэтил)амид BSG003 (84) были неактивны даже в высоких дозах.

Антибиотики 60 и 82 заметно превосходили по эффективности АтВ (57) и все остальные производные. Полусинтетическое производное, К-(2-диметиламиноэтил)амид 844НР (82), демонстрировал противогрибковую активность в диапазоне доз 0.62-2.5 мг/кг/с, в то время как генно-инженерный полиен В80005 (60) по сравнению в ним проявлял активность в более высоких дозах.

о 0,16 0,31 0,62 1,25 2,5 160 ■ 82 ■ 62 ■ 64 ■ 83 3 84

Рис. 10. Противогрибковая активность полиеновых антибиотиков в сравнении с АтВ (57) на модели кандидозного сепсиса у мышей с искусственно ослабленным иммунитетом.

Таким образом, М-(2-диметиламиноэтил)амид 844НР (82) является наиболее перспективным производным среди изученной серии и рекомендуется для дальнейшего предклинического изучения.

2.2. Химерные антибиотики на основе амфотерицина В и бензоксаборолов 2.2.1. Синтез и изучение противогрибковой активности химерных антибиотиков на основе амфотерицина В и бензоксаборолов Бороновые кислоты и бензоксаборолы являются перспективным классом биологически активных соединений, представляющих интерес, в том числе и для их конъюгации с другими биологически активными соединениями, в частности, антибиотиками. В рамках данной работы разработаны методы получения и осуществлен синтез антибиотиков двойного действия на основе АтВ и бензоксаборолов.

Синтезированы 4 типа конъюгатов бензоксаборолов с АтВ (57): С-16-амиды, З'-Ы-ацильные и З'-Ы-алкильные производные, а также З'-М-сульфо-производные. Взаимодействием АтВ (57) с (5)-3-(аминометил)бензо[с][1,2]оксаборол-1(31Т)-олом в присутствии РуВОР получен амид 132. Для введения спейсера между остатком бензоксаборола и молекулой АтВ использованы производные бензоксаборолов, ацилированные ш-аминокислотами, полученные по описанному методу. Взаимодействием АтВ (57) с 3-амино-М-(1-гидрокси-1,3-дигидробензо[с][1,2]оксаборол-6-ил)пропанамидом или 4-амино-Ы-(1-гидрокси-1,3-дигидробензо[с][1,2]оксаборол-6-ил)бутан амидом или с 4-амино-М-((1-гидрокси-1,3-дигидробензо[с][1,2]оксаборол-7-ил)метил)бутанамидом в присутствии РуВОР получены амиды 133-135.

132 (*= |

О.

133 л =

134

(10%)

п = 2, |Н-(СН2) К., в'

(4-5%)

Рн

Для синтеза N-ацильных производных АшВ с бензоксаборолами, содержащими карбоксильную группу в ароматическом кольце, in situ приготовлены N-гидроксисукцинимидные эфиры (N-OSu) 3-(1-гидрокси-1,3- дигидробензо[с][1,2]оксаборол-7-ил)пропановой кислоты, 1-гидрокси-1,3- дигидробензо[с][1,2]оксаборол-6-ил)карбоновой кислоты или 1-гидрокси-1,3-дигидробензо[с][1,2]оксаборол-5-ил)карбоновой кислоты, исходя из соответствующих карбоксил-содержащих бензоксаборолов и N-гидроксисукцинимида в присутствии DCC. N-OSu-эфиры вводили в реакцию с АшВ (57), получая целевые производные 137-139.

он

HjC, о

137, (20%) 138, (22%)

cP^rd*-

ПН A J—

ОН 139,(18%)

Реакцией АгпВ (57) с 1-гидрокси-1,3-дигидробензо[с][1,2]оксаборол-6-сульфонил хлоридом (140) в смеси пиридин-ДМФА в присутствии Е1зЫ приводила в образованию сульфамида 141. Восстановительное алкилирование АшВ (57) (Я)-2-(1-гидроксн-1,3-

дигидробензо[с][1,2]оксаборол-3-ил)ацетальдегидом (142) в присутствии №ВН3СЫ давало смесь моно- и ди-алкильных производных 143 и 144, которые разделяли методом колоночной хроматографии на силикагеле .

Карбоксильная группа АшВ в Ы-ацилыюм конъюгате 137 и Ы-сульфо-производном 142 амидирована по методу, описанному выше.

ОН \н

137 R=/ О

141 R= ^р он

;R= 'Aj-

(50%) (50%)

Поскольку нам не удалось получить ДМАЭ-амид Ы-алкильпого конъюгата исходя из соответствующего Ы-алкильного производного 138, была использована другая последовательность реакций - на первой стадии проводили синтез ДМАЭ-амида амфотерицина В (147) по отработанной методике взаимодействием амфотерицина В (57) с Ы^Ы'-диметплэтан-!^-

диамином в присутствии РуВОР, а далее алкилировали З'-аминогруппу микозамина альдегидом 142 в присутствии ЫаВНзСК. Преимущественным продуктом реакции алкилирования было моно-Ы-алкильное производное 148.

Очистку производных 132-135, 137-139, 141, 143-148 проводили методом колоночной хроматографии на силикагеле. Выходы целевых соединений оказались низкими (4-22%), выходы в реакции амидирования АшВ и производных 137 и 141, были значительно выше и составили около 50%. Структура полученных производных подтверждена методами масс-спектрометрии и ИК- и УФ-спектроскопии, а также методом ЯМР-спектроскопии, включая многоимпульсные методы ЯМР, такие как COSY, HSQC, НМВС. Для подтверждения структуры синтезированных новых конъюгатов амфотерицина В с бензоксаборолами для ряда соединений получены спектры фрагментации MS/MS.

Противогрибковая активность полученных производных изучена в секторе разработки методов поиска биологически активных соединений ФГБНУ «НИИНА» (Тренин А.С.) (Таблица 13).

Таблица 13. Противогрибковая активность (МПК, мкг/мл) конъюгатов АтВ с бензоксаборолами в сравнении с Am В (57)._

Соед. МПК (мкг/мл)

С. albicans АТСС 14053 С. humicolus АТСС 9949 A. niger АТСС 16404 F. oxysporum VKM F-I40

АтВ (57) 0.5 0.25 0.5 2

132 8 4 8 >16

133 2 1 2 4

134 4 2 2 8

135 0.5 0.25 0.5 1

137 4 2 8 16

138 2 1 4 8

139 4 4 8 16

141 4 2 8 >16

143 1 0.25 0.5 4

144 2 1 1-2 8

145 1 0.5 0.5-1 16

146 1 0.25 1 4

147 0.5 0.5 0.5 1

148 1 1 1 2

Противогрибковая активность Ы-ацильных конъюгатов АтВ с бензоксаборолами 137-139, а также сульфамидного производного 141 в отношении всех изученных штаммов грибков и дрожжей была снижена по сравнению с активностью АтВ (57) (Таблица 13). Введение спейсера между остатком бензоксаборола и молекулой АтВ привело к повышению противогрибковой активности амидов АтВ с бензоксаборолами. Ампдпрование карбоксильной группы N1-модифицированных конъюгатов 137 и 141 привело к повышению противогрибковой активности. Ы-Алкильное производное 143 обладшю противогрибковой активностью, сопоставимой с активностью АтВ (57), активность моно-алкильного производного 143 в отношении всех

изученных штаммов грибков и дрожжей была выше, чем активность диалкилыюго производного 144. Для ряда синтезированных соединений в ФГБНУ «НИИНА» (Деженкова Л.Г.) исследованы антипролиферативная активность в отношении клеток линии НСТ-116, а также способность соединений повреждать мембрану эритроцитов (гемолитическая активность) в сравнении с эдельфозином - противоопухолевым препаратом, имеющим выраженную гемолитическую токсичность. Установлено, что только одно из тестируемых соединений, И-ацильный конъюгат амфотерицина 138, обладал повышенной антипролиферативной активностью и гемолитической токсичностью в сравнении с АгпВ (57). В подавляющем большинстве случаев введение бензоксаборольного заместителя не приводило к значительному повышению антипролиферативной активности, а ряд соединений (137, 139, 144-146) обладали сниженной гемолитической активностью (токсичностью), чем исходный АтВ (57).

2.2.2. Анализ связи структура-противогрибковая активность для химерных антибиотиков на основе амфотерицина В и бензоксаборолов Анализ данный противогрибковой активности синтезированной серии конъюгатов амфотерицина В с бензоксаборолами позволил выявить ряд закономерностей структура-

Рис. ¡1. Связь структура-противогрибковая активность для изученной серии конъюгатов АтВ с бензоксаборолами.

1) введение бензоксаборольного фрагмента по З'-аминогруппе остатка микозамина через ацильную или сульфамидную связь приводит к снижению противогрибковой активности конъюгатов. Присоединение бензоксаборольного фрагмента через Ы-алкильную связь не снижает противогрибковую активность конъюгатов в сравнении с АтВ;

2) в случае амидов амфотерицина В с бензоксаборолами введение спейсера между остатком бензоксаборола и молекулой АтВ приводит к увеличению противогрибковой активности в отношении изученных штаммов грибков и дрожжей;

3) в случае З'М-замещенных конъюгатов амфотерицина В с бензоксаборолами вторичная модификация С16 карбоксильной группы приводит к увеличению противогрибковой активности в отношении изученных штаммов грибков и дрожжей.

2.3. Синтез и изучение антибактериальной активности химерных антибиотиков на основе азитромицина и гликопептидов

Одним из перспективных направлений поиска новых антимикробных препаратов является получение химерных (гетеродимерных) антибиотиков. В рамках настоящей работы разработан метод синтеза новых антибиотиков двойного действия на основе азитромицина (149) и гликопептидпых антибиотиков ванкомнцнна, эремомпцина и агликона тейкопланина и изу чен спектр их антибактериальной активности.

Для защиты наиболее реакционноспособной гидроксильной группы 2'-положении остатка дезозамина в азитромицине использовали ацетильную группу, которую вводили реакцией азитромицина (149) с уксусным ангидридом в присутствии Et3N. Далее реакцией Т-О-ацетилазитромицина (150) с карбонилдиимидазолом (CDI) в толуоле при 55°С в присутствии Et3N одновременно проводили введение 11,12-циклической карбонатной группы и активировали 4"-гидроксильную группу остатка кладинозы, получая 11,12-циклический карбонат 2'-<3-ацетил-4"-О-ацилимидазолилазитромицина (151).

' гн

с 3 I СНз Н3С, ,СН3

н3с ^сн3

НзСм НО_I

на/ снэ Гсн3 2.Нзс сн3 H>°V0 н3с ^J ¿o^iL А 0i e(3N

ОСНз

сн3

Азитромицин, (149) 150,(92%) 151,(93%)

Нам не удалось осуществить селективную модификацию вторичной концевой аминогруппы ванкомицина, по этой причине был использован подход, заключающийся во введении аминоалкильного спейсера в молекулу азитромицина и последующем амидировании полученным производным карбоксильной группы гликопептидного антибиотика.

.. — IS* n=1, R=Ac МеОН —159 n=1, R=H

155 n=2, R=Ac 160 n=2, R=H

156 n=1, R=Ac 161 n—1, R=H

.. ^u-157 n=2, R=Ac Vе"' MeOH —162 n=2, R=H

.. 158 R=Ac MeOH_163 r=h

Взаимодействие 151 с 1,2-днамнноэтаном или 1,3-диаминопропано.м в присутствии ОВи привело к получению соответствующих 4"-аминокарбаматов 152, 153, которые амидировали ванкомицином или эремомицпном или агликоном тейкопланина с использованием РуВОР.

Первоначально очистку полученных химерных антибиотиков пытались осуществить, используя производные 154-158, содержащие защитную ацетильную группу по 2'-0-положению

дезозамина, однако, оказалось, что в ходе хроматографии (силикагель, силанизированный силикагель, LH-20) происходит частичное или полное отщепление ацетильной группы, что существенно затрудняло выделение. Поэтому до проведения хроматографической очистки на силанизированном силигакеле и последующей хроматографии на LH-20 проводили удаление 2'-0-ацетилыюй группы, выдерживая соединения 154-158 в МеОН при 37°С в течение 24 ч. Чистота полученных соединений 159-163 подтверждена методом ВЭЖХ, структура - методом 13С-ЯМР-спектроскопии и методом масс-спектрометрии, включая тандемную масс-спектрометрию MS/MS.

Антибактериальная активность производных 159-163 в сравнении с азитромицином (149) и ванкомицином изучена в лаборатории фармакологии и химиотерапии ФГБНУ «НИИНА» (Мирчинк Е.П, Исакова Е.Б.) на панели штаммов грамположительных и грамотрицательных бактерий (Таблица 14).

Все синтезированные химерные антибиотики на основе азитромицина и гликопептидов 159163 не уступали или превосходили азитромицин и ванкомицин по антибактериальной активности в отношении всех изученных штаммов грамположительных бактерий. Причем, производное на основе эремомицина и азитромицина 162 проявляло заметную активность в отношении штаммов Enterococcus faecium 569 и Enterococcus faecalis 560, устойчивых к ванкомицину (Таблица 14)..

Таблица 14. Антибактериальная активность химерных антибиотиков на основе азитромицина и гликопептидов в сравнении с азитромицином (147) и ванкомиг1ином._

Бактериальные штаммы МПК, мкг/мл

149 ванко 159 160 161 162 163

грамположительные

Staphylococcus aureus 25923 ATCC 1.0 1.0 1.0 2.0 2.0 1.0 1.0

Staphylococcus epidermidis 533 2.0 0.5 1.0 2.0 2.0 1.0 0.5

Staphylococcus aureus 10 1.0 0.25 1.0 1.0 0.06 0.06 0.06

Staphylococcus aureus 3797 >32.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 1.0

Staphylococcus aureus 3798 >32.0 8.0 >32.0 >32.0 8.0 4.0 32.0

Staphylococcus aureus 1025 16.0 8.0 >32.0 >32.0 8.0 16.0 >32.0

Enterococcus faecium 568 8.0 1.0 1.0 1.0 1.0 0.5 0.13

Enterococcus faecium 569 8.0 >32.0 >32.0 >32.0 8.0 4.0 8.0

Enterococcus faecalis 560 >32.0 >32.0 32.0 32.0 16.0 8.0 16.0

Streptococcus pneumoniae 49619 ATCC 8.0 2.0 1.0 1.0 1.0 1.0 0.5

Streptococcus galenarum 35038 A TCC 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 2.0 2.0

Streptococcus agalactis 52 >32.0 8.0 32.0 32.0 8.0 4.0 32.0

ВЫВОДЫ

1. Впервые разработаны методы селективной химической модификации антибиотика группы ауреоловой кислоты оливомшшна А по боковой цепи агликона, по ароматическому ядру и по ацпльным заместителям в углеводных остатках, осуществлен синтез различных серий новых полуспптетических производных оливомицнна А и установлены закономерности структура-активность для полученных соединений.

2. Получена серия аналогов оливомицнна А, отличающихся набором ацпльных заместителей в углеводных цепях, и изучены спектральные параметры комнлексообразовання этих производных с ДНК. Установлено, что ацильные заместители в углеводных цепях оказывают

значительное влияние на образование М§2+-координированных димеров антибиотиков и образование комплексов с ДНК, и как следствие, на биологическую активность антибиотиков, включая действие на топоизомеразу I. Впервые показана различная роль ацильных заместителей в положениях 4-О олиозы и 4-0 оливомикозы для проявления оливомицином А биологической активности.

3. Впервые подробно исследована реакция оливомицина А и оливина с солями диазония. Установлено, что реакция азосочетания оливомицина А сопровождается отщеплением 6-О-дисахаридной ветви и приводит к образованию соответствующих 5-арилдиазенил-б-О-дегликозил-производных оливомицина А, некоторые из которых обладают антиретровирусной активностью в отношении HIV-1 и HIV-2. Квантово-химическими расчетами подтверждена легкость гидролиза дисахаридного фрагмента в диазенильных производных.

4. Впервые показано, что модификация боковой цепи агликона оливомицина А приводит к производным (М-(2-адамантил)амид 2'-карбоксиметоксимоливомицина А и N-(2-диметиламиноэтил)амид оливомицина SA), обладающим преимуществами перед исходным антибиотиком по противоопухолевым свойствам в опытах на животных.

5. Разработан метод введения в молекулу антрациклиновых антибиотиков полигидроксилированных заместителей, включая остатки моно- и дисахиридов, не затрагивающий 13-кето-группу антибиотика в реакции восстановительного алкилирования. Получена серия новых производных доксорубицина и 14-гидроксикарминомицина, содержащих по З'-аминогруппе даунозамина полигидроксилированные заместители, и установлено, что такая модификация увеличивает способность антрациклинов ингибировать активность топоизомеразы I.

6. Разработан метод и получены новые водорастворимые конъюгаты доксорубицина с высокомолекулярным полисахаридом DAVANAT, отличающиеся содержанием антибиотика, а также способом его присоединения к DAVANAT. Показано, что конъюгат доксорубицина с DAVANAT, в котором антибиотик присоединен к полисахариду напрямую, обладает высокой антипролиферативной активностью и представляет собой депо-форму доксорубицина.

7. Разработаны методы селективной химической модификации генно-инженерных полиеновых антибиотиков группы амфотерицина В по С16-карбоксильной и З'-аминогруппе, включая методы двойной модификации, и осуществлен синтез серий новых полусинтетических производных. Установлена критическая роль структуры С7-С10 полиольной области для проявления противогрибковой активности у изученной серии полиеновых антибиотиков группы амфотерицина В и их производных. Показано, что введение гидрофильных функциональных групп в молекулу полиенового антибиотика может приводить к увеличению противогрибковой активности и улучшению химиотерапевтических свойств производных в опытах на животных.

8. Впервые разработаны методы получения и осуществлен синтез новых конъюгатов амфотерицина В с бензоксаборолами, включая конъюгаты, содержащие спейсер, и дважды модифицированные производные. В случае амидов амфотерицина В с бензоксаборолами введение спейсера между остатком бензоксаборола и молекулой амфотерицина В приводит к усилению противогрибковой активности.

9. Разработан метод получения и осуществлен синтез серии химерных антибиотиков нового типа на основе азитромицина и гликопептидов, позволяющий варьировать длину спейсера между антибиотиками. Показано, что синтезированные соединения не уступают или превосходят по антибактериальной активности азитромицин и ванкомицин в отношении изученных штаммов грамиоложительных бактерий, а некоторые из них проявляют активность в отношении резистентных штаммов грамположительных бактерий.

Публикации в изданиях из списка ВАК:

Обзоры:

1. Preobrazhenskaya M.N. Tevvashova A.N.. Olsufyeva E.N., Kuo-Feng Huang, Hsu-Shan Huang. Second generation drugs - derivatives of natural antitumor anthracycline antibiotics daunorubicin, doxorubicin and carminomycin. // J. Med. Sciences.- 2006,- V. 26, №4,- P. 119-128.

2. Тевяшова A.H. Создание пролекарств на основе антрациклиновых антибиотиков. // Вестник МИТХТ,- 2014,- Т. IX, №6,- С. 11-25.

3. Тевяшова А Н. Конъюгаты антрациклиновых антибиотиков с макромолекулами. Хим-Фарм. Журнал,- 2015,- Т. 49, N 1,- С.89-101.

4. Тевяшова А.Н.. Олсуфьева Е.Н., Преображенская М.Н. Создание антибиотиков двойного действия как путь поиска новых перспективных лекарственных препаратов. // Успехи химии,-2015,-V. 84,-Р. 61-97.

Главы в книгах:

5. Klyosov А.А., Tevvashova A.N.. Olsufyeva E.N., Preobrazhenskaya M.N., Zomer E., Piatt D., Synthesis and biological activity of Doxo-Galactose and Doxo-Galactomannan, new conjugates of doxorubicin with D-galactose and 1,4-p-D-galactomannan. // Carbohydrates and Drug Design. Ed. Klyosov A.A., Witczak Z.J., Piatt D. ASC Symposium series 932,- ACS. Washington, DC.-2006,- P. 105-130.

6. Tevvashova A.N.. Klyosov A.A., Olsufyeva E.N., Preobrazhenskaya M.N., Zomer E. Synthesis and biological activity of Galactomycin and DoxoDavanat, new conjugates of doxorubicin with D-galactose and 1,4-beta-D-galactomannan. // Glycobiology and Drug Design. Ed. Klyosov A.A. ACS Symposium Series 1102, Oxford University Press.- 2012,- P. 131-154. ISBN13: 9780841227651.

Статьи:

7. Симонова B.C., Самусенко A.B., Филиппова H.A., Тевяшова А.Н., Лынив JI.C., Кулик Г.И., Чехун В.Ф., Штиль А.А. Оливомиции вызывает апоптоз опухолевых клеток и подавляет р53-индуцированную транскрипцию. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины,- 2005-, №4,- С. 451-455.

8. Тевяшова А.Н.. Олсуфьева Е.Н., Преображенская М.Н., Клёсов А.А., Зомер Е., Платт Д., Новые конъюгаты противоопухолевого антибиотика доксорубицина с водорастворимым галактоманнаном: синтез и биологическая активность. // Биоорг. химия,- 2007,- Т. 33, №1,-С. 148-155.

9. Деженкова Л.Г., Тевяшова А.Н., Олсуфьева Е.Н., Трещалин И.Д., Штиль А.А., Преображенская М.Н. Антрациклиновые антибиотики и их производные - ингибиторы топоизомеразы I. // Биоорг. химия,- 2008,- Т. 34, №3,- С. 430-432.

10. Tevvashova A.N.. Olsufyeva E.N., Balzarini J.N., Shtil A.A., Dezhenkova L.G., Bukhman V.M., Zbarsky V.B., Preobrazhenskaya M.N.. Modification of the antibiotic olivomycin I at the 2'-keto group of the side chain. Novel derivatives, antitumor and topoisomerase I poisoning activity. // J. Antibiotics.- 2009,- V. 62,- P. 37-41.

11. Preobrazhenskaya M.N., Olsufyeva E.N., Solovieva S.E., Tevvashova A.N.. Reznikova M.I., Luzikov Y.N., Terekhova L.P., Trenin A.S., Galatenko O.A., Treshalin I.D., Michink E.P., Bukhman V.M., Sletta H., Zotchev S.B. Chemical modification and biological evaluation of new semisynthetic derivatives of 28, 29-didehydronystatin A1 (S44HP). A genetically engineered antifungal polyene macrolide antibiotic. // J. Med. Chem.- 2009,- V. 52,- P. 189-196.

12. Tevvashova A.N.. Olsufyeva E.N., Turchin K.F., Balzarini J., Bykov E.E., Dezhenkova L.G., Shtil A.A., Preobrazhenskaya M.N. Reaction of the antitumor antibiotic olivomycin I with aryl diazonium salts. Synthesis, cytotoxic and antiretroviral potency of 5-aryldiazenyl-6-0-deglycosyl derivatives of olivomycin I. // Bioorg. Med. Chem - 2009,- V. 17,- P. 4961-4967.

13. Тренин А.С.. Зотчев С.Б., Олсуфьева Е.П., Тевяшова А.И.. Соловьева С.Е., Принцевская С.С., Галатенко О.А., Преображенская М.Н. Создание новых противогрибковых препаратов на основе химической трансформации антпбпотиков-макролпдов, полученных генно-

инженерной модификацией нистатина. // Иммунопатология, аллергология, инфектология,-2009,-№2,- С. 155-156.

14. Preobrazhenskaya M.N., Olsufyeva E.N., Tevyashova A.N.. Printsevskaya S.S., Solovieva S.E., Reznikova M.I., Trenin A.S., Galatenko O.A., Treshalin I.D., Pereverzeva E.R., Mirchink E.P., Zotchev S.B. Synthesis and study of the antifungal activity of new mono- and drsubstituted derivatives of a genetically engineered polyene antibiotic 28,29-didehydronystatin A1 (S44HP). // J. Antibiotics.- 2010,- V. 63,- P. 55-64.

15. Чеглаков И.Б., Тевяшова A.H.. Курбатов JI.K., Татарский В.В. мл., Самусенко А.В., Преображенская М.Н., Штиль А. А. Нарушения транскрипции и репликации как механизмы цитотоксичности противоопухолевого антибиотика оливомицина. // Доклады Академии наук,- 2010,- Т. 435, №4,- С. 554-556.

16. Андреева Е.В., Виноградов A.M., Тевягиова А.Н.. Олсуфьева Е.Н., Бурова Т.В., Гринберг

H.В., Гринберг В.Я., Скуридин С.Г., Преображенская М.Н., Штиль А.А., Кузьмин В.А. Исследование комплексообразования оливомицина А и его производных с ДНК. // Доклады академии наук,- 2010.- Т. 435, № 6,- С. 826-830.

17. Tevyashova A.N.. Olsufyeva E.N., Shtil А.А., Dezhenkova L.G., Isakova E.B., Bukhman V.M., Zbarsky V.B., Korolev A.M., Preobrazhenskaya M.N. Chemical modification of the antibiotic olivomycin A at the side chain of the aglycone moiety yields the derivative with perspective antitumor characteristics.//Bioorg. &Med. Chem.-2011,-V. 19.-P. 7387-7393.

18. Tevyashova A.N.. Durandin N.A., Vinogradov A.M., Zbarsky V.B., Reznikova M.I., Dezhenkova L.G., Bykov E.E., Olsufyeva E.N., Kuzmin V.A., Shtil A.A., Preobrazhenskaya M.N. Role of the acyl groups in carbohydrate chains in cytotoxic properties of olivomycin A. // J. Antibiotics.-2013,-V. 66, №9,-P. 523-530.

19. Tevyashova A.N.. Olsufyeva E.N., Solovieva S.E., Printsevskaya S.S., Reznikova M.I., Trenin A.S., Galatenko O.A., Treshalin I.D., Pereverzeva E.R., Mirchink E.P., Isakova E.B., Zotchev S.B., Preobrazhenskaya M.N. Structure-antifiingal activity relationships of polyene antibiotics of the Amphotericin В group. // Antimicrob. Agents Chemoth.- 2013.- V. 57, № 8,- P. 3815-3822.

Патенты РФ:

20. Патент РФ № 2350621. Производные антибиотика группы ауреоловой кислоты оливомицина

I, обладающие противоопухолевой активностью, и способ их получения. // Преображенская М.Н., Олсуфьева Е.Н., Тевяшова А.Н.. Бухман В.М., Штиль А.А., Деженкова Л.Г. Заявка № 2007139442/04 на получение патента РФ от 25.10.2007. Опубликовано 27.03.2009, бюлл. №9.

21. Патент РФ № 2453552. Полусинтетические аналоги антибиотика группы ауреоловой кислоты оливомицина А, обладающие противоопухолевой активностью, и способ их получения. // Преображенская М.Н., Олсуфьева Е.Н., Тевяшова А.Н.. Бухман В.М., Штиль А.А., Деженкова Л.Г., Исакова Е.Б., Малютина Н.М. Заявка № 2010124855/04 на получение патента РФ от 18.06.2010. Опубликовано 20.06.2012, бюлл. № 12.

Статьи в реферируемых журналах и сборниках трудов:

22. Tevyashova A.N., Solovyeva S.E., Olsufyeva E.N., Preobrazhenskaya M.N. New amphotericin В derivatives: Synthesis, antifungal and haemolitic toxicity. // Farmacevtski vestnik.- 2007,- V. 58,-P. 189.

23. Штиль A.A., Тевяшова A.H.. Деженкова Л.Г., Самусенко А.В., Е.Н.Олсуфьева, М.Н.Преображенская, Оливомицин А - мощный противоопухолевый антибиотик: механизмы цитотоксичности и оптимизация структуры. // Российский Биотерапевтпческий журнал.- 2008.- Т. 7, №2,- С. 23.

24. Tevyashova A.N. Novel derivatives of antitumor antibiotic olivomycin. // Annals of Oncology.-2008,- V. 19, Suppl. 3,- iii. 28-29.

25. Деженкова Л.Г., Тевяшова А.Н.. Збарский В.Б., Олсуфьева Е.Н., Штиль А.А., Преображенская М.Н. Определяющая роль О-ацильных заместителей в углеводных фрагментах оливомицина А в цитотоксичности и ингибироваиии топоизомеразы I. // Российский Биотерапевтический Журнал,- 2010,- Т.9, № 2,- С. 52-53.

26. Бухман В.М., Переверзева Э.Р., Трещалин И.Д., Исакова Е.Н., Олсуфьева Е.Н., Тевяшова А.Н., Преображенская М.Н. Новое полусинтетическое производное антибиотика класса ауреоловой кислоты. // Российский Биотерапевтический Журнал,- 2010.- Т. 9, № 2,- С. 6667.

27. Tevvashova A.N.. Reznikova M.I., Dezhenkova L.G., Zbarsky V.B., Shtil A.A., Preobrazhenskaya M.N. Structure-activity studies of natural and semi-synthetic olivomycins -antitumor antibiotics of aureolic acid group. // Annals of Oncology.- 2010,- V. 21, Suppl. 2,- ii. 3233.

28. Штиль A.A., Тевяшова A.H.. Дурандин H.A., Виноградов A.M., Олсуфьева Е.Н., Преображенская М.Н., Кузьмин В.А. Разработка противоопухолевых препаратов нового поколения на основе производных ауреоловой кислоты и исследование физико-химических свойств их комплексов с ДНК. Сборник тезисов докладов на конференциях и семинарах по научным направлениям Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине»,- М.: фирма «Слово»,- 2011,- С. 113-115,- ISBN 9785-4348-0001-3, УДК 6+61+615.47+615.012.6.

29. Durandin N.A., Tevvashova A.N.. Vinogradov A.M., Olsufyeva E. N., Shtil A.A., Preobrazhenskaya M.N. Role of acyl groups in carbohydrate chains in biological properties of Olivomycin A and its analogs. // Сборник научных трудов XII Ежегодной международной молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗЫ, ИБХФ, Москва. - М.: РУДН,- 2012,- С. 5458,- ISBN 978-5-209-04784-1. УДК 577.1:53(063).

30. Дурандин Н.А, Тевяшова А.Н.. Виноградов A.M., Олсуфьева Е.Н., Бухман В.М., Штиль А.А., Преображенская М.Н., Кузьмин В.А. Противоопухолевая терапия на основе Оливомицина А: Новая модификация боковой цепи агликона. // Сборник научных трудов XI Ежегодной международной молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗЫ. ИБХФ, Москва. - М.: РУДН,- 2012,- С. 126-127,- ISBN 978-5-209-04420-8. УДК 53.

Публикации в сборниках тезисов научных конференций:

31. Тевяшова А.Н.. Соловьева С.Е., Преображенская М.Н. Новые производные полиенового противогрибкового антибиотика амфотерицина В: синтез и изучение биологической активности. // Тезисы докладов для IX научной школы - конференции по органической химии,- Москва,- Россия,- 2006,- С. 355.

32. Олсуфьева Е.Н., Тевяшова А.Н.. Преображенская М.Н. Химическая модификация противоопухолевых антибиотиков антрациклиновой группы. // Тезисы докладов для IX научной школы - конференции по органической химии,- Звенигород,- Россия,- 2006,- С. 274.

33. Принцевская С.С., Тевяшова А.Н.. Преображенская М.Н. Химическая трансформация природных антибиотиков - путь к получению соединений с новыми хнмиотерапевтическими свойствами. // Материалы II Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье».- Рязань. -Россия,- 2007,- С. 258-259.

34. Бухман В.М., Преображенская М.Н., Штиль А.А., Трещалин И.Д., Тевяшова А.Н.. Лавренов С.Н., Исакова Е.Б. Предклиническое изучение новых полусинтетических мишень-направленных противоопухолевых антибиотиков. // Сборник тезисов XI Российского онкологического конгресса,- Москва,- Россия,- 2007,- С. 99-101.

35. Shtil A.A., Dezhenkova L.G., Samusenko A.V., Filippova N.A., Tevvashova A N.. Olsufyeva E.N., Preobrazhenskay a M.N. Olivomycin A induces multiple mechanisms of tumor cell death. // Cancer Therapeutics: the Road Ahead. Capri Science Conference (a Nature Conference).- Capri.- Italy.-2007,- P.70.

36. Tewashova A.N. Novel derivatives of antitumor antibiotic olivomycin. // б"1 International Symposium on Targeted Anticancer Therapy, TAT 2008 Proceedings.- Bethesda, MD.- USA.-2008,- P.43-44.

37. Tewashova A.N.. Olsufyeva E.N., Shtil A.A., Dezhenkova L.G., Preobrazhenskaya M.N. Novel semisynthetic derivatives of antitumor antibiotic olivomycin I: synthesis, antitumor and topoisomerase I poisoning activity. //11th MipTec Conference - The Leading European Event for Drug Discovery.- Basel.- Switzerland.- 2008,- P 93.

38. Преображенская M.H., Тевяшова A.H.. Лавренов C.H., Щекотихин А.Е., Олсуфьева Е.Н., Штиль А.А., Бухман В.М. Создание полусинтетических мишень-специфических противоопухолевых антибиотиков. // Результаты фундаментальных и прикладных исследований для создания лекарственных средств. Материалы симпозиума,- Москва. -Россия,- Слово.- 2008,- С. 163-164.

39. Тевяшова А Н.. Соловьева С.Е., Олсуфьева Е.Н., Тренин А.С., Зотчев С.Б., Преображенская М.Н. Химическая модификация генно-инженерных полиеновых антибиотиков - новый путь получения более эффективных противогрибковых препаратов. // IV Московский Международный Конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития»: материалы, Ч.1.- Москва,- Россия,- 2009,- С. 211-212.

40. Принцевская С.С., Олсуфьева Е.Н., Тевяшова А.Н.. Соловьева С.Е., Зотчев С.Б., Преображенская М.Н. Химическая модификация новых полиеновых макролидов, полученных методом генной инженерии. // Всероссийская конференция по органической химии. Сборник тезисов докладов,- Москва,- 2009,- С. 349.

41. Принцевская С.С., Соловьева С.Е., Тевяшова А.Н.. Тренин А.С., Олсуфьева Е.Н., Зотчев С.Б., Преображенская М.Н. Двойная химическая модификация генно-инженерного полиенового макролида - попытка улучшения свойств противогрибкового препарата. // IV Московский Международный Конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития»: материалы, Ч.1.-Москва,-Россия,- 2009,- С.192-193.

42. Тренин А.С., Зотчев С.Б., Олсуфьева Е.Е., Тевяшова А.Н.. Соловьева С.Е., Принцевская С.С., Галатенко О.А., Преображенская М.Н. Новые противогрибковые антибиотики, полученные на основе химической модификации полиеновых макролидов — амфотерицина В и его генно-инженерных аналогов: отбор и изучение взаимосвязи структура - активность. // IV Московский Международный Конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития»: материалы, ч.1,- Москва,- Россия,- 2009,- С. 86-87.

43. Тевяшова А.Н., Олсуфьева Е.Н., Штиль А.А., Збарский В.Б., Деженкова Л.Г., Преображенская М.Н. Новые производные противоопухолевого антибиотика оливомицина 1: синтез, изучение биологической активности и механизмов цитотоксического действия. // Всероссийская конференция по органической химии,- Москва,- Россия,- 2009,- С. 127.

44. Tewashova A.N.. Reznikova M.I., Dezhenkova L.G., Zbarsky V.B., Shtil A.A., Preobrazhenskaya M.N. Structure-activity studies of natural and semi-synthetic olivomycins -antitumor antibiotics of aureolic acid group. // 8th International Symposium on Targeted Anticancer Therapy, TAT 2010 Proceedings.- Bethesda, MD.- USA.- 2010,- P. 46-47.

45. Тевяшова A.H., Олсуфьева E.H., Штиль A.A., Збарский В.Б., Деженкова Л.Г., Преображенская М.Н. Химическая модификация противоопухолевого антибиотика оливомицина А, изучение биологической активности и механизмов цитотоксического действия новых производных. // Материалы Международного Симпозиума ASOC «Успехи науки в области органической химии» Мисхор,- Крым,- 2010,- С. 201.

46. Принцевская С.С., Тевяшова А Н., Соловьева С.Е., Олсуфьева Е.Н., Зотчев С.Б., Преображенская М.Н. Химическая модификация противогрибковых полиеновых антибиотиков-макролидов. // Материалы Международного Симпозиума ASOC «Успехи науки в области органической химии»,- Мисхор,- Крым,- 2010,- С. 174.

47. Printsevskaya S.S., Olsufyeva E.N., Solovyeva S.E., Tewashova A.N. Olsufyeva E.N., Preobrazhenskaya M.N., Zotchev S.B. New aminosugar derivatives of genetically engineered

Amphotericin В - type antibiotics S44HP and BSG005: synthesis and antifungal activity. // Russian-Indian Symposium on Glycosciences.- Moscow.- Russia.- 2011,- P. 46.

48. Durandin N.A., Tevyashova A.N., Vinogradov A.M., Olsufieva E.N., Bukhman V.M., Shtil A.A., Preobrazhenskaya M.N., Kuzmin V.A. On the road to olivomycin A-based antitumor therapeutics: a novel modification of the aglycone side chain. // International Congress «Anticancer Agents Research Congress».- Antalya.- Turkey- 2011,- P. 112.

49. Принцевская С.С., Олсуфьева Е.Н., Преображенская М.Н., Тевяшова А.Н.. Соловьева С.Е., Зотчев С.Б. Химическая модификация противогрибковых полиеновых антибиотиков-макролидов. // Всероссийская конференция «Органический синтез: химия и технология».-Екатеринбург,- Россия,- 2012,- С. 88.

50. Быков Е.Е., Тевяшова А.Н.. Преображенская М.Н. Квантовохимическое изучение образования комплексов оливомицина с Mg2+. // II Всероссийская конференция (с международным участием) к 95-летию со дня рождения Н.С. Простакова "Успехи синтеза и комплексообразования".- Москва.- Россия,- 2012,- С. 117.

51. Tevyashova A.N.. Olsufyeva E.N., Preobrazhenskaya M.N. Chemical modification and structure activity relationships of polyene macrolide antibiotics of the Amphotericin В group. // Joint meeting "Macrocycles: synthesis, medicinal chemistry and biological activity".- Zagreb.-Croatia.-2014,- P. 2.

52. Принцевская C.C., Тевяшова A.H.. Преображенская М.Н. Полусинтетические производные антибиотиков, преодолевающие резистентность микроорганизмов. Неделя науки в Москве (Moscow Science Week-MSW 2014).- Москва.- Россия,- 2014,- В-37.

53. Tsvetkov V., Durandin N., Tevyashova A.. Bykov E., Shtil A. Docking insight of olivomycin A-Mg2+ dimer binding to SP1/NFAT promoter site of C-Myc oncogene. // EuroQSAR 2014,- Saint-Petersburg.- Russia.- 2014,- P. 215.

54. Printsevskaya S.S., Tevyashova A.N.. Olsufyeva E. N., Preobrazhenskaya M.N., Trenin A.S., Korolev A.M. Benzoxaborol-containing derivatives of amphotherycin B. // ICAR-2014.- Madrid. -Spain.- 2014,- P. 83.

55. Tevyashova A.N.. Printsevskaya S.S., Mirchink E.P., Isakova E.B., Korolev A.M., Preobrazhenskaya M.N. Dual-acting hybrid antibiotics on the basis of azithromycin and glycopeptides - synthesis and antibacterial activity. // ICAR-2014.- Madrid.- Spain.- 2014,- P. 297.

Тевяшова Лина Николаевна Разработка направленной модификации и анализ связи структура - активность полифункцнональнмх антибиотнков-глнкозндов

Формат 60x90/16 Тираж 100 экз. Подписано в печать 19.02.2015 Заказ № 249 Типография ООО «Генезис» 8 (495) 434-83-55 119571, г. Москва, пр-т Вернадского, 86