Тритерпеновые гликозиды голотурий отряда Dendrochirotida тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

РГБ ОД

Авилов Сергей Анатольевич 4 ДсК 23^1

Тритерпеновые гликозиды голотурий отряда Dendrochirotida

02. 00. 10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора химических наук

Владивосток 2000

Работа выполнена в Государственном учреждении - Тихоокеанском институте биооргашгческой химии Дальневосточного отделения РАМ

Научный консультант:

член-корреспондент PAIL доктор химических наук

Официальные оппоненты:

Стоите В.А.

член-корреспондент HAU Беларуси, доктор химических наук

s " Хрнпач В.А.

■доктор химических наук,

профессор Высоцкий В.И. доктор химических наук,

профессор Усов А. И.

Ведущая организации:

Иркутский институт химии СО РАН

Защита состоится " ' " декабря

2000 г. в " часов на заседании

Диссертационного совета Д.003.99.01 по защите диссертаций в Тихоокеанском институте биооргашгческой химии ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100-летия Владивостока, 159, ТИБОХ.

С ;щссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ТИБОХ ДВО РАИ (Владивосток, пр. 100-летия Владивостока, 159).

Автореферат разослан '' ^ '* ноября 2000 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Представители класса голотурий (Holothurioidea, Echinodermata) широко распространены по всему Мировом)' океану. Многие голотурии являются ведущими видами биоценозов, а на больших глубинах, где они часто бывают господствующей группой, их общий вес может достигать до 90 % от суммарной биомассы. Более 70 видов голо'1урий, в основном тропических, употребляются в пищу человеком и используются в традиционной восточной медицине. Кукумария японская (Cucumaria japónica), кукумария фропдоза (Cucimiaría frondosa) и дальневосточный трепанг (Apostichopus japonicus) являются в пашей стране объектами промысла.

Отличительной чертой голотурий является наличие в них биологически активных веществ - тритерпеновых гликозидов, свойственных преимущественно растениям. Гликозиды голотурий имеют характерные особенности химического строения, отличающие их от всех нзвеслсых растительных соедшешш этого класса. Тритерпеновые гликозиды, определяюодге биологическую активность экстрактов голотурий, привлекли внимание химиков, фармакологов и биохимиков еще в начале пятидесятых годов. Начатые тогда исследования не прерываются до настоящего времени, а статьи, посвященные этим веществам, публикуются в ведущих научных журналах мира. Этот интерес во многом определяется разнообразной биологической активностью гликозидов голотурий. Для них установлено гемолитическое и ихтиотоксическое, антигрибковос и противоопухолевое действие, а в последние годы открыты иммуностимулируюпше, адыовантные и ра.шопротекторные свойства. В то же время изучите биологической роли и физиологической активности этих соединений и создание на их основе новых лекарственных средств и биопрепаратов невозможны без знания полных структур этих соединений.

К началу 80-х гг. были хорошо изучены гликозиды только одного отряда голотурий - отряда Aspidochirotida, представители которого широко распространены в тропических морях на небольших глубинах.

Настоящая работа посвящена изучению гликозидов голотурий отряда

Dendrochirotida. ">гот отряд - один из самых многочисленных в классе Ilolothu-

rioidea (более 70 родов, 7 семейств) - оставался неизученным. В то же время к нему относятся, например, такие крупные и массовые голотурии как Cucumaria japónica и Cucumaria frondosa, имеющие существешюе промысловое значение. К начал>' наших исследований были опубликованы только данные о строении двух агликонов и сведения о том, что гликозиды голотурий этого отряда обладают биологической активностью. В то же время, скршпшговые работы, проведенные в 70-е годы, показали существенное отличие гликозидов голотурий этого отряда от гликозидов других отрядов как по строению агликонов, так и по строению углеводных цепей.

11аш интерес к гликозидам голотурий определялся также тем, что эти вещества обладают определенной таксономической специфичностью и могут быть использованы в качестве признаков для уточнения систематики голотурий и установления путей их эволюции. Вопросы систематики отряда древовиднощупальцевых голотурий (Dendrochirotida) сложны и противоречивы. В частности, чрезвычайно запутана система рода Cucumaria, до последнего времени систематики не были едины в понимании даже объема типового вида этого рода - Cucumaria frondosa.

Це.'и>ю настоящей работы являлось:

- выделите, установление структуры и изучение свойств тритерпеновых гликозидов из голотурий отряда Dendrochirotida;

- изучение таксономического распределения тритерпеновых гликозидов в голотуриях этого отряда и использование полученных данных в целях решения проблем их систематики;

- выяснение возможности и перспективности использования тритерпеновых гликозидов промысловой голотурии Cucumaria japónica в качестве компонентов лекарственных и.ветеринарных препаратов.

Научная ' повита и практическая ценность работы. Из спиртовых экстрактов 11 видов голотурий отряда Dendrochirotida было выделено 45 тритерпеновых гликозидов. Для 39 ранее неизвестных гликозидов установлена полная структура, а для 6 соединении проведена структурная идентификация с известными веществами.

Впервые получены гликозиды с принципиально новыми типами агликонов, не

относящимися к голостановому ряда. Ц частности, были выделены гексанорла-ностановые производные без лактонного цикла и пентанорланостановые гликозиды с 18(1б)-лакто1шым кольцом. Установлено строение 13 новых агликонов.

Впервые были выделены гликозиды с нечетным числом моносахаридных звеньев в углеводных цепях, в то время как все изученные ранее гликозиды голотурий отряда Aspidochirotida имели четное число моносахаридных остатков. Впервые из голотурий выделены гликозиды с необычными углеводным! цепями, в том числе: содержащие ацетатную группу в углеводной цепи, трисульфатирован-ные пентаозиды и гликозиды содержащие два хгаювозных остатка. Установлено строение 14 новых вариантов углеводных цепей гликозидов.

Установлено, что в голотуриях отряда Dendrochirotida строение гликозидов специфично для видов и, в некоторых случаях, родов, в то время как для представителей отряда Aspidochirotida гликозиды специфичны на уровне рода или групп родов.

Впервые показаны достоверные отличия п гликозидном составе голотурий Cucumaria japónica и Cucumaria frondosa, что дало возможность подтвердить видовую самостоятельность Cucumaria japónica. Показано, что диагностическим химическим признаком рода Cucumaria является строение углеводных цепей тритерпе-новых гликозидов, в то время как строение агликонов является видоспецифичным.

Получите в ходе данной работы серий веществ, различающихся как по строению углеводных цепей, так и но строению агликонов, позволило провести различные биоиспытания. Были получены данные о влиянии особенностей строения гликозидов (моносахаридного состава, числа и положения сульфатных групп, наличия кетогруппы в агликопе) на гемолитическую активность и выход ионов К+ из эритроцитов, а также на лизосомальную активность макрофагов.

При биологических испытаниях препаратов, полученных в ходе данной работы на основе тритерпеновых гликозидов из голотурии Cucumaria japónica, показана способность этих веществ усиливать иммунный ответ и стимулировать неспецифическую устойчивость к бактериальным и вирусным инфекциям. Введение соответствующих препаратов животным улучшали показатели кроветворной и иммунной систем. Данные препарата не индуцировали генные мутации и не обладали ДНК-повреждающей активностью. Прошел промышленные испытания и был

разрешен к применению в России ветеринарный препарат "КД", созданный на основе гликозидов промысловой голотурии Cncumaria japónica.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на VU (1984) и IX (1988) Молодежных конференциях по синтетическим и природным физиологически активным соединениям, Ереван; Всесоюзных совещаниях "Биологически активные вещества при комплексной утилизации гидробионтов", Владивосток, 1988, "Эффекторные и регуляторные функции иммунной системы в облученном организме", Суздаль, 1990, "Биологически активные вещества гидробионтов -новые лекарственные, лечебно-профилактические и технические препараты", Владивосток, 1991; Научной конференции "Экспериментальная и клиническая иммунология на Востоке страны", Красноярск, 1988; VI (Дакар, 1989) и XI (Австралия, 1998) Международных симпозиумах по морским природным соединениям; Всесоюзном симпозиуме "Объем и методы генотоксической оценки и побочных эффектов биологически активных веществ", Ленинград, 1989; Международных конференциях: 8-й по органической и биоорганической химии, Латвия, 1991, "Сапонины в пище, пищевом сырье и лекарственных растениях" Польша, 1999; 210-й Конференции Американского национального химического общества, США, 1995; 1-й (Греция, 1997) и 2-й (Испаши, 1999) Евроконфсренциях по морским природным соединениям; 1-й рабочей встрече по природным токсинам, Тайланд, 1998; Международной конференции по морской биотехнологии, Австралия, 2000.

Публикация результатов исследования. Основные результаты настоящего исследования опубликованы в таких научных журналах как: Антибиотики и химиотерапия, Журнал общей биологии, Новости звероводства, Радиобиология, Химия природных соединений, Canadian .Tournai of Chemistry, Journal of Natural Toxins, Journal of Natural Products (Lloydia), Liebigs Annalen Chemie, Toxicon. Кроме того, отдельные части работы были опубликованы в материалах Всесоюзных и Международных конференций, симпозиумов и совещаний.

По теме диссертации опубликована 51 работа, в том числе 32 статьи и глава в международном сериальном издании "Echinoderm Studies". Получено авторское свидетельство СССР и два патента Российской федерации.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из Введения, Литературного обзора, посвященного тритерпеновым гликозидам голотурий и особенностям их распределения по таксономическим группам, Обсуждения результатов, где описаны и обсуждены полученные результаты и Экспериментальной части, в которой описаны приборы, биологический материал, использованный в работе, а также основные методики и эксперименты. В конце диссертации приведены Выводы и Список цитированной литературы.

Работа изложена на 313 страницах, содержит 68 таблиц, б рисунков и 40 схем.

Список литературы включает 213 цитируемых работ.

*****

Автор выражает признательность сотрудникам ТИБОХ ДВО РАН Антонову A.C., к.х.н. Афиятуллову Ш.Ш., к.х.н. Дроздовой O.A., д.б.н. Калинину В.И. - за помощь в работе и проведите ряда химических экспериментов, к.х.н. Калинов-скому А.И., к.х.н. Денисенко A.B., к.х.н. Исакову В.В. - за получение и помощь в обработке спектральных данных.

Автор благодарит сотрудников ТИБОХ ДВО РАН к.б.н. Ковалевскую A.M., Гришина Ю.И., к.б.н. Амишша Д.Л., Агафонову И.Г., к.б.н. Прокофьеву Н.Г., Лихацкую Г.Н. и сотрудника НИЛБАВГ МЗ к.б.н. Седова A.M. (г. Москва) за проведение исследований по изучению физиологической активности кукумариозидов, а также д.б.н. Левши B.C. (КамчатНИРО, г. Петропавловск-Камчатский), к.б.н. Смирнова A.B. (ЗИП РАН, г. Санкт-Петербург) и к.б.н. Гудимову E.H. (ММБИ КНЦ РАН, г. Мурманск) определивших видовую принадлежность изученных голотурий и участвовавших в обсуждении проблем систематики этих животных.

Постоянно используемые сокращения-. ЖХВД - жидкостная хроматография высокого давления; Полнхром - сорбент "Полихром-I" (тефлоиовый порошок); FABMS - масс-спектрометрия с ионизацией быстрыми атомами; LSIMS - масс-спектрометрия с ионизацией ускоренными ионами цезия; MALDI-TOF - масс-спектрометрия с лазерной десорбцией/ионизацией усиленной матрицей; КССВ -константа спин-спинового взаимодействия; ЯЭО - ядерный эффект Оверхаузера; API MS - масс-спектрометрия с ионизацией при атмосферном давлении.

1. ГЛИКОЗИДЫ ГОЛОТУРИЙ ОТРЯДА ЭЕКШЮСНтОТША 1.1. Получение гликошдных фракции из экстрактов голотурии и

выделеппе индивидуальных соединений

Гликозидные фракции из голотурий отряда БспскосЫго^а представляют собой (за редким исключишем), сложные смеси родственных по структуре и биогенезу' веществ, различающихся между собой как по строению утлеводных цепей, так и по строению агликонов. ГЗ состав таких фракций могут входить несульфатированные гликозиды с 4 - 5 моносахаридными остатками в углеводной цепи, а также, моно-, ди- и трисульфатированные тетра- и пентаозиды. Подобная многокомпонентность гликозидных фракций была характерна почти для всех исследованных голотурий отряда БепскосЫгоШа и существенно затрудняла наработку исходных сумм тгих веществ и получение индивидуальных соединений.

Схема 1. Методы выделения тритерпеновых гликозидов голотурий, использованные в данной работе.

Методы выделения индивидуальных гликозидов, использованные в данной

работе, обобщены на схеме 1 и обычно включат 2 этапа: получение суммарной фракции гликозидов и разделение полученной смеси на индивидуальные соединения.

Для получения суммарных фракций тритерпеновых гликозидов в нашей работе использовались 3 основных варианта обработки исходных экстрактов. А. Экстракты с большим содержащим гликозидов (и с относительно малым - липидов) сразу после упаривания подвергали колоночной гидрофобной хроматографии на полихроме. Б. Экстракты с повышенным содержанием компонентов липидной природы предварительно хроматографировали на колонке с крупным силикагелем. Затем фракции, содержащие тритерпеновые гликозиды, хроматографировали на полихроме. В. Экстракты со значительным содержанием полярных веществ предварительно экстрагировали смесью хлороформ - метанол (1:1), что позволяло избавиться от значительной доли балластных веществ, не растворявшихся в данной смеси экстрагентов, а уже потом проводили гидрофобную хроматографию на полихроме.

Следующей стадией очистки гликозидов была многократная колоночная адсорбционная хроматография на силикагеле с анализом получаемых фракций методом ТСХ па пластинках со слоем силикагеля. Как правило, этим методом нарабатывали подфракции тритерпеновых гликозидов, гомогенные по углеводным цепям, но различающиеся деталями строения агликонов.

Для выделения индивидуальных компонентов из подфракций, полученных после хроматографии на силикагеле, применяли методы ЖХВД на обращешю-фаювых колонках. Контроль за чистотой выделяемых веществ обеспечивался методам ТСХ (в том числе па пластинках со слоем закрепленного силанизированного силикагеля, работающих по принципу обращешю-фазовой хроматографии), но окончательный вывод делался на основе данных спектров ЯМР 'Н и "С.

Ионы металлов определяли атомно-абсорбционным спектральным анализом. Отнесение моносахаридов к В-ряду проводили, определяя удельное вращение или сумм моносахаридов, полученных при кислотном гидролизе, или индивидуальных моносахаридов, выделенных методом бумажной хроматографии.

1.2. ГЛИКОЗИДЫ ГОЛОТУРИЙ СЕМЕЙСТВА CUCUMARI1DAE

1.2.1. Глпкозиды голотурии Ciicumaria japónica подссм. Cucumariinac

Cucwvaria japónica содержит сложную смесь тритерпеновых гликозидов голос-танового ряда (0,2 - 0,3 % от веса сухого остатка животных), дающую на 'ГСХ семь основных пятен. Каждое из пятен представляет собой подфракцию родственных гликозидов, имеющих одинаковые углеводные uemi, но различающихся строением агликонов. Они полмили обозначения Ао (~ 3 % от веса суммарной гликозидной фракции), А, (5 %), Аз (17 %), А3 (7 %), А4 (13 %), А0 (14 %) и А7 (26 %).

Кукумарнозиды групп Аг и А4

К\"кумариозид A(1) - одащ из основных компонентов гликозидной суммы -первый тритерпеновый гликозид с нечетным 1шслом моносахаридных остатков в углеводной цега!, выделешый из голотурий. Знание его структуры в дальнейшем помогло установить строешге всех остальных гликозидов голотурии С. japónica и других голотурий рода Cucumaría.

В агликошюй части спектра ЯМР 13С 1 наблюдшшсь сигналы 7(8)- (121,9 и 144,2 м.д.) и 25(26)- (145,7 и 110, 4 м.д.) двойных связей, 16-кетогруппы (213,2 м.д.), 18(20)-лактона (178,8 и 83,5 м.д.) - характершле для голоста-7,25-диен-3(3-ол-16-она, а в составе углеводной цепи 1 идентифицировали пять углеводных

остатков, связанных между собой и с аглнконом Р-гликозидными связями. Это следовало из спектров ЯМР |3С (пять сигналов С-1 атомов моносахаридов в области 102,3 - 105,6 м.д.), а также данных моносахаридного анализа: О-ксшгоза, О-хиновоза, Э-глюкоза и З-О-метнл-В-глюкоза в соотношении 2:1:1:1.

Метилирование десульфатировашюго производного 2 по Хакомори, последующий метанолиз и ацетшшрова1ше продуктов метанолиза дали а- и Р- метилглико-зиды 3,4-ди-0-мет1и-2-0-ацетилксилопиранозы, 3-0-метил-2,4-ди-0-ацетилхино-вопиранозы, 2,4.6-три-О-метил-З-О-ацетилглюкопиранозы, 2,3,4,6-тетра-О-метил-глюкопиранозы и 2,3,4-три-О-метилксилопиранозы.

При ферментативном расщеплении 1 был получен прогешш (3), а при десуль-фатировании 3 - производное 4. Моносахаридный анализ для 4 показал наличие ксилозы и хиновозы (2:1), а метилирование (с последующей обработкой) дало смесь а- и Р-метилгликозидов 3,4-ди-0-метил-2-0-ацетилксилопиранозы, 3,4-ди-О-метил-2-О-ацетилхиновопиранозы и 2,3,4-три-О-метилксилопиранозы.

Распадом по Смиту продукта каталипиеского гидрирования кукумариозида -соединения 5 - получили прогешш (6), содержащий ксилозу, хиновозу, глюкозу и З-О-метилглюкозу (1:1:1:1). Десульфатирование 6 с последующим метилированием привело к образованию смеси а- и Р- метилгликозидов 3,4-ди-0-метил-2-0-ацетил-ксилогафанозы, 2,3-ди-0-метил-4-0-ацетилх1пювога1ранозы, 2,4,6-три-О-метил-З-О-ацетилглюкопиранозы, 2,3,4,6-тетра-О-метилглюкошфанозы.

Положите сульфатной группы при СЧ установлено по дашли! ЯМР "С и результатам периодатного окисления 1 и 2: в 2 разрушались оба ксилозных остатка, а сигнал С'-4 находился на 5,7 м.д. в более сильном поле (по сравнению с 1), соответственно, сигналы С'-З и С'-5 - в более слабом поле на 1,5 и 1,8 м.д.. Такие сдвиги характерны для а- и Р- эффектов сульфатной группы. Из всех данных однозначно следовало, что строение кукумариозида Аг-2 соответствует формуле 1.

Кукумариозид А2^3 (5) - минорный компонент подфрагадаи - по спектральным данным и физико-химическим свойствам был идентичен дигидропроизводному 5, полученному при каталитическом гидрировании кукумариозида Аг-2 (1).

Кукумариозид Л2;4 (7) - второй минорный компонент подфракции - имел одинаковые с 1 и 5 углеводные цепи, о чем говорило совпадение соответствующих

сигналов в спектрах ЯМР "С этих соединении, а также результатов их моносахаридного анализа. Для подтверждения этого вывода, провели двойное расщепление 7 по Смиту. На первой стадии получили прогенин, содержащий ксилозу, хиновозу, глюкозу и З-О-метилглюкозу (1:1:1:1). При втором расщеплешш -прогенин, содержащий только сульфатированную ксилозу (подтверждено десуль-фатированием и кислотным гидролизом), а также производное биозида (глюкоза и З-О-метилглюкоза, 1:1). В агликошюй части спектра ЯМР "С 7 сигнал С-16 был сдвинут (по сравнению с 1) в сильное поле от 213,2 до 24,6 м.д, что привело к выводу, что агликоном кутсумариозида Аг-4 является голоста-7,25-диен-ЗР-ол. Все эти данные соответствовали формуле 7.

Содержание 5 и 7 составляло около 1-1,5 % от содержания 1.

Кукумариознд А.ц2 (8) - один из основных компонентов гликозидной суммы голотурии С. japónica 10 %) - имел в качестве агликона голоста-7,25-диен-ЗР-ол-16-он, что следовачо из анализа спектров ЯМР. Моносахаридный анализ дйя 8 показал наличие D-ксилозы, D-хиновозы и D-глюкозы (2:1:2), а в спектрах ЯМР 13С имелись сигналы концевой неметилировашюй глюкозы (по сравнению с 1). При обработке 8 целлюлазой был получен ранее описанный прогенин 3. Метилирование по Хакомори десульфатировашюго производного (9) с последующей обработкой дало набор производных моносахаридов, аналогичный полученному из кукума-риозида Аг-2 (1). Все полученные результаты отвечали формуле 8.

Кукумарнознды групп Ао и Ai

При изучении подфракции малополярных гликозидов было установлено строение четырех новых веществ - кукумариозидов Ао-1 (10), Ао-2 (11). Ао-3 (12) и Ai-2 (13). При десульфатировашш исходной подфракции были получены производные (14, 15, 16 и 17). Их содержание составляло 4,0, 7,6, 15,2 и 35,4 %, соответственно, от'общего веса десульфатированных производных.

Нативные гликозиды подфракции были близки друг к другу по хроматографическим свойствам. Обработка исходной смеси раствором ЫНз в 50 % МеОН превращала Ai-2 (13) в его более полярное дезацетшшрованное производное (8), но не затрагивала lófl-ацетаты агликонов. Только после такой обработки оставшуюся смесь гликозидов удалось разделить на отдельные компоненты.

Сравните данных моносахаридного анализа (О-ксилоза, Б-хиновоза и З-О-.ме-тил-О-глюкоза, 3:1:1), спектров ЯМР |3С и ЬЭШЗ масс-спектров 10, 11 и 12, изу-чешюго ранее фрондозида А (18) (см. раздел 1.2.2.) и их десульфатированных производных показало, что у этих гликозидов одинаковые углеводные цепи.

Клтсумариозид Ао^ (10) имел в качестве агликона 1бР-ацетоксиголост-7-ен-3|5-ол-23-он, ранее не встречавшийся в гликозидах голотурий. Его строение было установлено при изучении спектров ЯМР. Сигнал С-23 в боковой цепи агликона (по сравнению с 18) был смещен в слабое поле с 22,4 до 207,4 м.д., что позволило предположить наличие кетогруппы у С-23. Это подтверждалось спектрами ЯМР 'Н, в которых наблюдались сигналы 2Н-22 (дд, 3,15 и 3,95 м.д., КССВ 18,6'Гц), образующих изолированную АВ систему, и сигналы двух СНз-грутш (0,88 (д) и 0.89

(д) м.д., КСС13 - 6,0 Гц).

Кукумариозид Aozl (11). Сопоставление спектров ЯМР 13С 11 и 18 показало, что 11 имеет дополнительную двойную связи в боковой цепи агликона. В спекзрах ЯМР "С 11 имелись сигналы при 145,9 и 110,9 м.д., а в спектрах ЯМР 'Н - при 4,77 м.д. (2Н-26) и 1,68 м.д. (СНз-27), что характерно дтя терминальной 25(26)-даойной связи. Кагачитическое гидрирование Ао-2 (11) над катализатором Адамса привело к получению дигидропроизводного (18), идентифиплровапного как фрон-дозид А, чго окончательно подтвердило строение кукумариозида Ао-2.

Кукумариозид Ао;3 (12). Изучите спектров ЯМР кукумариозида Ао-3 и его десульфатированного производного (16) показало, что агликопом гликозида шляется гoлocтa-7,25-диeн-Зß-oл-16-oн, а полное строение отвечает формуле 12.

Кукумариозид Ai;2 (13). Структура 13 была установлена при изучешш его десульфатированного (17) и дезацетилированного (8) производных, так как натив-ный гликозид выделить в чистом виде не удалось.

Сравнаше спектров ЯМР |3С 17 с ранее описанным 9, показало, что сигнал С-6 одной из глюкоз был сдвинут с 62,5 до 64,5 м.д., что объяснялось эффектом ацилирования. Отнесение сигналов к терминальной глюкозе было сделано после снятия серии частично релаксированных спектров, в которых для атомов углерода концевого моносахарида отмечена более медленная релаксация. Кроме того, в LSIMS(-) масс-спектрах наблюдалось отщепление от псевдомолекулярного иона с m/z 1243 (М - Н)" фрагментов с массой 132 и 204 (ионы с m/z 1111 и 1039) отвечающих потере терминальных звеньев пентозы и ацетилгексозы.

Таким образом, строение агликона, последовательность соединения моносаха-ридных остатков и положение ацетатной группы в углеводной наш 13 устанавливалось при сравнительном изучении 17 и 9, а положегше сульфатной группы становилось яСным после получения из Ai-2 (13) кукумариозида Aj-2 (8), как описано выше. Ai-2 (13) - первый (и пока единственный) выделенный из голотурий гликозид, содержащий в углеводной цепи ацетатную группу.

Дпсульфатпрованные кукумариозиды групп Аз и А<;

Из подфракции полярных гликозидов были выделены индивидуальные кукумариозиды Аз (19) и Ао-2 (20), сольволигическое дссульфатирование которых приво-

дило к получению ранее щученного производного (2). Из этого следовало, что 19 и 20 отличаются между собой только числом и положением сульфатных групп, что

Кук\ мариозид Аз (19). Из РАВ(-) масс-спектров и спектров ЯМР "С кукума-риозида Аз и его десульфатированного производного (2) следовало, что в 19 сульфатные группы находятся при С'-4 и С'-б. Это однозначно было доказано химическим методом. Ацетилирование 19 до перацетата с последующим сольволити-ческим десульфатированием привело к производному, имеющему свободные гид-роксильные 1руппы на месте О-сульфатных Метилирование этого производного диазометаном в присутствии л[>ирата ВРз, а затем кислотный гидролиз дали (по сравнению с 19) не to.ti.ko ксилол, хиновозу и 3-0-метилглюко?у, но и 4-0-метил-ксилозу и 6-()-ме'1 и.11 люко5у. Идентификация последних производных точно показу,шала число и расположение сульфатных групп в кукумариозиде Аз.

КЧкумарпо'.ид А012 (20). Сравнение спектров ЯМР 13С 20 и его десульфати-рованного произво.шого (2), анализ РАВ масс-спектров показал, что сульфатные группы находятся при С'-4 и С'-6. Это также доказывалось описанным выше химическим методом. При этом идентифицировали ксилозу, хиновозу, глюкозу, а также 4-О-мегилксилозу и 3,6-дн-О-метилглюкозу, что указывало на число и расположение дву х сульфатных групп в 20.

Кукумарпозиды г руппы А7

Из подфракции трисульфатированных гликозидов были выделены кукумарпозиды А:-1 (21). Ат-2 (22) п А--3 (23). Эта вещества имели одинаковые

При сольволитическом десульфатировашш подфракции полиции 2, 24 и 25, содержание которых составляло около 53,6, 6,4 и 21,3 %, соответствешю, от веса фракции десульфатироваиных производных. По своим свойствам они полностью совпадали с веществами, полученными из ранее изученных кукумариозидов А2-2 (1), Аг-З (5) и Аг-4 (7), соответствешю. Следовательно 21, 22 и 23 отличались от 1, 5 и 7 только числом сульфатных групп в углеводной цепи.

КУкумариозид АуА (21). Сравнешю Масс- и ЯМР спектров А~1 и его десуль-фа'тированного производного (2) показало, что 21 имеет сульфатные группы при С'-4, С3-6 и С4-6. Сигналы этих атомов в спектрах ЯМР 13С 21 находились в более слабом поле на 5,4, 5,7 и 5,6 м.д., соответствешю, чем в спектрах 2, что характерно для а- эффектов сульфатных групп. Это полностью отвечало формуле 21.

К\ кумариозид A^¿ (22) имел голост-7-ен-ЗР-ол-16-оп в качестве агликона, что следовало из данных спектров ЯМР. Поскольку углеводные цени кукумариозидов А-1, Ат-2 и А7-З идентичны, что следовало из данных моносахаридного анализа, массгспектроскопии и спектров ЯМР, был сделан вывод, что строение кукумарио-зида А7-2 описывается формулой 22.

Кукумариозид Ат^З (23). Сравнеште спектров ЯМР ,3С АтЗ (23), А7-1 (21) и их дссульфатироваштых производашх (24 и 2) показало, что эти соединения отличаются только деталями строения агликона: в 23, по сравнению с 21, отсутствовала кетогруппа у С-16 атома утлерода.

1.2.2. Глпкозндм голотурии Cuciiinariafrondosa подсем. Cucumariinae Моносульфатированные глнкозиды

Из подфракции моносульфатированных гликозидов (0,045 % от веса сухого остатка) голотурии С. frondosa (Баренцево море) были выделены два соединения: основной компонент - фрондозид А (18) и минорный - фрондозид Ai (26).

Фрондозид А (18). Моносахаридный анализ, спектры ЯМР 13С фрондозида А и его десульфатировашюго производного (27), другие физико-химические характеристики позволили идентифицировать 18 как фрондозид А, выделенный канадскими учеными из этой же голотурии, но собранной у побережья Канады.

Фрондозид А] (26). По данным моносахаридного анализа (Б-ксилоза, Б-хино-воза и З-О-метил-Б-глюкоза, 2:1:1) и спектров ЯМР в линейной углеводной цепи 26 было только четыре моносахаридных остатка (но сравнению с 18, отсутствовали сигналы терминального остатка ксилозы). Для доказательства строения фрондозида А] была проведена деградация 18 по Смиту, при которой произошло отщепление ксилозного остатка и был получен прогенин, полностью совпавший с 26. Содержание 26 составляло около 0,6 % от массы 18.

Трисульфатнрованные глнкозиды

Фрондозид С (28). При изучении полярных гликозидов голотурии (0,03 % от сухого остатка животных) была выделена подфракция трисульфатированных пента-озидов. Основным ее компонентом был фрондозид С (28), строение которого устанавливалось при изучении его десульфатировашюго производного (29) (27 % от суммы производных).

НС

ОН

ОАс

Сравнение спектров ЯМР исходной подфракции и 29 со спектрами кукумарио-зида A7-I (21) и его десульфатированного производного (2) показало совпадите сигналов углеводных цепей, что говорило об их идентичности в 21 и 29.

В спектрах ЯМР 13С 29 сигналы С-1 - С-19, С 30 - С-32 были близки или совпадали с сигналами ланостановых агликонов, содержащими 9(11)-двойную связь. Дальнейшее изучение 1 и 2D спектров ЯМР, проведите экспериментов по разностному декаплингу, регистрация ЯЭО привели к выводу, что агликоном фрондо-зида С (28) является 22(Я)-ацетокси-ланоста-9(11),24-диен-Зр,20(11)-диол. Конфигурации С-20 и С-22 асимметрических центров в 28 как R определили при сравнении спектров 29 со спектрами ацетатов крустэкдизоновых производных. В FAB(+) масс-спектре 29 наблюдались muai при m/z 1271 (M + Na)+ (брутто-формула C61H100O26), 505 (Agi - il + Na)+ и 507 (Agi + H + Na)+, демонстрирующие отрыв агликона от утлеводной цепи, а также пики при m/z 163, 164 и 1129 и 1130 (С-20 -С-22 разрыв боковой цепи). Также наблюдались фрагментарные ионы, образовавшиеся как при последовательном отщеплении моносахаридов от 29, так и ионы, соответствующие отдельным фрагментам утлеводной цепи.

1.2.3. Гликозиды гологурнн Cucumaria miniata подсем. Cucumariinae

Из спиртового экстракта голотурии Cucumaria miniata выделили гликозидную фракцию, содержащую сложную смесь веществ (0,28 % от сухого остатка живот-пых), в которой преобладала полярная подфракция трисульфатированных пентао-зидов. Дальнейшее разделите этой фракции на сшшкагеле и методом ЖХВД на колонке Силасорб С-18 позволило выделить основной компонент (21 % от суммы гликозидов) - описанный ранее кукумариозид А?-3 (23).

1.2.4. Глнкозиды голотурии Cucumaria koraiensis подсем. Cucumariinae

Кореозид А (30) - основной компонент гликозидной фракции, строение которого устанавливалось только спектральными методами. Содержание 30 составляло около 0,025 % от сухого остатка животных и 12 % - от суммы гликозидов.

В агликошюй части спектра ЯМР 13С 30 наблюдались сигналы только 24 атомов углерода. Сигналы С-1 - С-8, С-10, С-14, С-19, С-30 - С-31 были близки к сигналам ланостановых агликонов с 7(8)-двойной связью, а сигналы С-16 (22,5 м.д.), С-17 (62,1 м.д.), С-20 (211, 5 м.д.), С-21 (30,7 м.д.) - в прогестероне. Эти данные говорили, что агликоном 30 является 22,23,24,25,26,27-гексанорланоста-7(8)-ен-ЗР-ол-20-он, что подтверждалось спектрами ЯМР 'Н. Пространствешюе расположите протонов и метальных групп а агликоне кореозида А (30) устанавливали с помотцью регистрации ядерного эффекта Оверхаузера (30а).

Спектры ЯМР углеводной компоненты 30 однозначно указывали на его гликозидную природу и полностью совпадали с соответствующтш сигналами углеводных цепей кукумариозидов A7-I (21), А?-2 (22) и Av-3 (23), что говорите об их идентичности. Все эти данные привели к выводу, что строение кореозида А описывается формулой 30. Анализ FAB масс-спектров подтвердил предположите о строении кореозида А (брутто-формула C53H83O33S3M3, где М: Na, К гаи Н). Фрагментация молекулы приводила к образованию характеристичных ионов, найденных в спектрах аналогичных трисульфатированных разветвленных пентао-зидов и соответствовала формуле 30.

он

1.2.5 Глнк'озпды голотурии Ciicuniaria sp. иодсем. Cucumariinae

В 1997 г. у северного побережья Приморья были собраны голотурии, принятые за молодые экземпляры С. japónica. Морфологические исследования не привели к определению пойманных животных, но было предположено, что это новый вид рода Сиситапа (до описания - Сиситапа sp.). Нами было предложено использовать результаты структурного изучешю тритерпеновых гликозидов этого вида с целью подтвердить (или опровергнуть) это предположение. Для этого было необходимо установить строение соответствующих гликозидов и сравнить их структуры со структурами уже известных гликозидов кукумарий (подробнее см. раздел 2.3.).

Сиситапа sp. содержала сложную смесь гликозидов (содержание - 0,76 % от сухого остатка животных), при этом в ней преобладали соединения, совпадающие по хроматографическому поведению с кукумариозидами групп Аз, Аз и А7 из голотурии С. japónica. Содержание этих подфракций составляло 18,2, 16,4 и 19,6 %, соответственно, от веса суммарной гликозидной фракции.

Кукумариознды группы Аг

Кукумариозид А:^ (31). При изучении соответствующей нодфракции было установлено, что она состоит из большого числа компонентов. Среди них преоб-

В агликошюй части спектров ЯМР 13С 31 наблюдались сигналы характерные для голостанового агликона, содержащего 7(8)-двойную связь (120,6 и 145,6 м.д.), 1бР-ацетатную группу (169,3 и 21,3 м.д.) и кетогруппу при С-23 (207,9 м.д.). Дальнейшее изучение спектров ЯМР показало, что агликоном 31 является 16(3-ацетоксиголост-7(8)-еи-ЗР-ол-23-он, который был идентифицирован ранее в

составе кукумариозида Ло-1 (31) (см. раздел 1.2.1.).

Углеводная часта спектров ЯМР кукумариозида Аг-5 и данные моносахарид-ного анализа (Б-ксилоза, Б-хиновоза, Б-глюкоза и З-О-метил-Б-глюкоза, 2:1:1:1) полностью совпадали с аналогичными данными изученных нами ранее кукума-риозидов Аг-2 (1). А:-3 (5) и Аз-4 (7), что позволило сделать вывод об их идентичности. Следовательно строение кукумариозида Аг-5 отвечает формуле 31.

Брутто-формура C61H95031SNa 1355( MNa - Na

r-,J79( + H-Na,r,017, + H-Na)_739 ( + HNa) OS03Na ^

З-О-Ме-С с | Г О-G cG-i-О-Qui-1-O-Xy-О—S—Ag

i l, \ ¿, \ 845 ( + H - Na )•«—•'

\ 4......—-........................-|............>-1047 ( + H - Na )

...............-.....-..................j——1223 ( + H - Na )

Xy

Схема 2. Фрагментация кукумариозида A:-5 (31) в MALDI-TOF(-) масс-спектре.

Это предположите полностью подтверждено MALDI-TOF масс-спектрами, в которых наблюдались пики псевдомолекуляршлх ионов при m/z 1355 (Mn3 - Na)" и 1401 (Мц а + Na) . Расшифровка MALDI-TOF(-) мдсс-спектра, наиболее информативного для таких соединений, приведена на схеме 2.

Кукумарнозидм группы Аз

Подфракция дисульфатировашсых гликозидов представляла собой сложнуто смесь веществ, различавшихся строешюм агликонов. Удалось установит!, структуры двух новых соединений, входтшшх в состав чтой подфракции: кукумариозидов Аз-2 (32) и Аз-3 (33). Пативные гликозида подфракции не поддавались хромато-графическому разделению, и только сольволитическое десульфатирование с последующим разделе!шем полученных продуктов колоночной хроматографией на сили-кагеле и методом ЖХВД на обращенной фазе позволите получить: 34 - в индиви-дуашюм виде, а 35 - в виде смеси, в которой соотношешге 35 к 34 было 7:1 (по дашсым ЯМР 'Н). Содержание 34 составляло около 11,8, а 35 - 28,3 % от веса фракции десульфатированных производных.

Анализ спектров ЯМР 13С исходной и десульфатированной подфракций, их хро-матографического поведения, а также данные моносахаридного анализа (смесь В-ксилозы, В-хиновозы, D-глюкозы и З-О-метил-В-глюкозы, 2:1:1:1), привели к зак-

лючешпо. что пативиые соединения этой подфракции 32 и 33 имеют углеводные цепи, идентичные таковым в кукумариозидах группы Аз из голотурии С. japónica.

Кукумариозид Аз;2 (32). Совокупность спектральных, хроматографических и химических данных дала возможность идентифицировать 34 как десульфатировэнное производное ранее изученного кореозида А (30), выделенного нами из голотурии С. кога/'ст!^ (см. раздел 1.2.4.), а строение кативного кукумариозида Аз-2 - как отвечающее формуле 32.

Кукумариозид Аз^ (33). Второе десульфатировашюе производное (35), было изомером 34 по положению двойной связи и содержало 9(11)-двойную связь (147,6 и 114,3 м.д.), а не 7(8)-, как в 34. Спектры ЯМР 13С и 'Н агликонной части 35 были получены вычитанием сигналов 34 из суммарных спектров. На основании имеющихся данных кукумариозиду Аз-3 приписано строение 33.

Обнаружение в голотурии Сиситапа Бр. описываемых соединений представляет собой уштеальный случай. Ранее в одном и том же виде ни разу не обнаруживали гликозиды, которые отличались бы между' собой только по положению двойной связи в полициклическом ядре агликона.

Кукумарношды группы А?

Изучение наиболее полярной подфракции гликозидов голотурии Сиситапа Бр. показало, что она обладает теми же свойствами, которые характерны для аналогичных нодфракций из ранее изученных видов рода Сиситапа. Она представляла собой сложную смесь гликозидов, различающихся между собой строением агликонов, но имеющих одинаковые углеводные цепи.

Разделение подфракции методом ЖХВД на обращенной фазе не привело к

выделению индивидуальных соединений, но позволило получить смесь, обогащенную по двум основным компонентам: 30 и 36. Десульфатирование этой смеси и разделите полученных продуктов привело к выделению индивидуального 34, а 35 - в виде смеси, в которой соотношение 35 к 34 было 7:1 (по данным ЯМР 'Н). Содержание 34 составляло около 8,7 %, а 35 - приблизительно 20,4 % от веса полученной фракции десульфатированных производных.

Анализ хроматографического поведешы, данных моносахарид!гого анализа, спектров ЯМР как исходной и обогащешюй подфракций, так и десульфатированных производных 34 и 35, позволил сделать вывод, что нативные соединения (30 и 36) имеют одинаковые утлеводные цепи, идентичные таковым в кукумариозидах группы А? из голотурии С. japónica. Более того, все имеющиеся в нашем распоря-жешш данные привели к выводу, что гликозидом, давшим при десульфатировашш 34, был кореозид А (30), а исходное соединение, десульфатирование которого привело к 35, соответствовало формуле 36 и было названо "изо-кореозидом А".

1.2.6. Гликозидм голотурии Duasmodactyla kurilensis нодсем. Thionidiinae

Курилогешш (37). Кислотный гидролиз суммы гликозидов (2 н HCl), дал арте-

фактный "курилогешш", существенно отличавшийся своим строением от всех

ранее известных гешшов. В масс-спектре 37 пик молекулярного иона наблюдался

при m/z 356 (СздНзоСЬ), а спектре ЯМР 13С имелись сигналы только 24 атомов.

Строение курилогешша устанавливали при сравнении спектров ЯМР 37 и его

кетопроизводного (38). В спектрах ЯМР 'Н 38 исчезал сигнал протона при Н-3

(3,22 м.д.) и проявлялись сигналы 2Н-1 и 2Н-2 (1,82 - 2,74 м.д.), а сигналы СНз-30

и СНз-31 смещались в слабое поле и образовывали синглет (фрагмент 37А).

ОН

Экспериментами по разностному' декаплипгу показали наличие фрагмента 37В. Сравнение со спектрами 1 б-дегидропрогестерона и аллопрегн-16-ен-20-она позволило выяснить строите фрагмента 37С: хромофорная группа в 37 имела в УФ-спектре Хгаах при 242,6 нм (с 7200), а в спектре ЯМР |3С наблюдались четыре сигнала, характерные для такой системы: 144,3 (С-16), 152,4 (С-17), 197,0 (С-20) и 27,0 (С-21) м.д. Эти данные привели к выводу, что курилогенин (37) является 4,4,14-триметилпреп и-9( 11), 16-диен-З р-ол-20-оном.

Немогешш (39) был выделен при гидролизе гликозидной суммы в более мягких условиях (90°, НгЗОУбутанол). ИК-, Масс- и УФ-спектрьг 39 указывали на то, что в нем отсутствовал фрагмент а,Р-непредельного кетона, но имелись две ацетатные группы. Разностным декаплингом было установлено, что одна ацетатная группа находилась в положении 16Р-, а другая - при С-20. Значения КССВ Н-16 и Н-17 свидетельствовали об их а-конфигурации, что подтверждалось результатами измерения ядерного эффекта Оверхаузера: при облучении с частотой, соответствующей сигналу Н-16, было получено усиление сигналов П-15а, Н-17 и СНз-32.

Курилозид А (40) - основной компонент гликозидной суммы £>. кип1е>т$ - при кислотном гидролизе дал курилогенин (37) и смесь П-ксилозы, О-хиновозы,

D-глкжозы и З-О-метил-О-глюкозы (1:1:2:1). В спектрах ЯМР агликонной части 40 отсутствовали сигналы a.p-непредельного кетона, но имелись сигналы ацетатной группы при С-16, что отвечаю фрагменту 40А. По данным спектров ЯМР для ацетатной группы наиболее вероятной представлялась 1 ба-конфигурация.

Наличие в 40 пяти моносахаридных остатков, связанных между собой и с агликоном'Р-гликозидными связями, подтверждалось спектром ЯМР 13С, в котором имелось пять сигналов в области 100,0 - 103,7 м.д. Метилирование по Хакомори десульфатированного производного 41 (с дальнейшей обычной обработкой) дало смесь а- и Р-метилгликозидов 3-0-метил-2,4-ди-0-ацетилксилопиранозы, 2,3-ди-О-метил-4-О-ацетилхиновопиранозы, 2,4,6-три-О-метил-З-О-ацетилглюкопиранозы, 2,3,4,6-тетра-О-метилглюкопиранозы. Растцеплегагем 40 по Смиту была получена смесь двух изомерных (по С-20), прогенинов, имевших одинаковую углеводную цепь и давших при моносахаридном анализе смесь ксилозы, глюкозы и З-О-метилглюкозы (1:1:1). Их десульфатироваиие и метилирование по Хакомори привели в дальнейшем к образованию смеси а- и р-метилгликозидов 2,3-ди-О-метил-4-О-ацетилксилопиранозы, 2,4,6-три-О-метил-З-О-ацетилглюкопиранозы и 2,3,4,6-тетра-О-метилглюкопиранозы. При повторном распаде была получена сумма гешшов (не содержащих моносахаридных остатков), а также производное биозида (глюкоза и З-О-метилглюкоза, 1:1). Все эти данные отвечали формуле 40.

Сравнение спектров ЯМР "С 40 и 41 показало, что сульфатная группа находится у С-6 одной из глюкоз. Не положение устанавливалось на продукте ферментативного расщепления курилознда Л целлюлозой. Моносахаридный анализ полученного нрогенина (42) дал смесь ксилозы, хинопозы, глюкозы и З-О-метилглюкозы (1:1:1:1). Замена в 42 сульфатной группы на метальную (по ранее описанному способу) и последующий гидролиз привели к образованию 6-О-метилглюкозы, идентификация которой показывала, что сульфатная группа присоединена к С4-6.

Клрилозид С (42) - минорный компонент гликозидной фракщш голотурии Duasmodactyla karilensis - был полностью идентичен продукту ферментативного расщепления курилозида А (40) целлюлазой и соответствовал формуле 42.

Курилозиды А (40) и С (42) - были первыми неголостановыми гликозидами, выделенными из голотурий, и, соответственно, первыми представителями глико-

зидов с 4,4,14-триметилпрегнановым (22,23,24,25,26,27-гексанорланостановым) скелетом агликона.

1.3. ГЛИКОЗИДЫ ГОЛОТУРИЙ СЕМЕЙСТВА БСЬЕКОВАСТУЬШАЕ

1.3.1. Гликознды голоту рии ЕиреШас(а/гаи(1Шг1х подссм. 8с1его(1ас1уПпае

Кукумариозид А1 (43) - основной компонент шторной подфракцин А (0,32 % от суммы гликозидов). Он полностью совпадал по своим характеристикам с опи-саниым ранее десульфатированным производным, полученным из основного компонента гликозидной фракции голотурии Н. /гаис1а!пх - кукумариозида (44) и,

Кукумариозиды группы F

Из суммы глдаозидов Е. fraudatrix колоночной хроматографией на спмикагеле была получена шторная подфракция дисульфатированных тетраозидов, имевших одинаковые углеводные цени и различавшихся между собой деталями строения агликонов. Из этой подфракции были выделены два основных компонента - кукумариозида Fi (45) и F? (46). Их содержание составляло: 45 - около 1,94, а 46 -0,44 % от веса суммарной гликозидной фракции.

Кукумариозид Fj (45). При десульфатировашш 45 было получено производное, которое идентифицировали как ранее описанный 43. Таким образом, строение агликона и последовательность моносахаридов в кукумариозиде Fi становились ясны.

В MALDI-TOF(-) масс-спектрах 45 пик псевдомолекулярного иона наблюдался при т'г 1279 (Мгка - Na)\ что соответствовало наличию в углеводной цепи кукумариозида Fi двух сульфатных групп (брутго-формула CjsHs^sSjNaj). Сравните спектров ЯМР 13С 45 и 43 показало, что в 45 одна сульфатная группа присоединена к С'-4. друтая - к С3-6. Об этом говорили сдвиги сигналов С'-4 и С3-6

в более сильное поле при переходе от 45 к 43 на 6,1 и 5.8 м.д., соответственно, а соседних с ними атомов углерода - в более слабое поле, что характерно для а- и Р-эффектов сульфатных групп. Их положение подтверждалось и результатами перио-датного окисления 43 и 45.

Кукумариозид F: (46) имел в качестве агликона 1бР-ацетоксиголоста-7,22Е,24-триен-ЗР-ол (данные спектров ЯМР), ранее обнаруженный в тритерпеновых гли-козидах голотурии Е. fraudatrix. Совпадешь результатов моносахаридного анализа (D-ксилоза, D-хиновоза, D-глюкоза и З-О-метил-О-ксилоза в соотношении 1:1:1:1) и спектральных дашллх по углеводным компонентам кукумариозидов Fi и F2 говорило об идентичности углеводных цепей этих соединений. На основе этих данных кукумариозиду F: прштисано строение 46.

Минорные глик'озиды группы G

Кукумариозид О: (47) имел так\то же углеводисто цеш>. что и к\тсумариозид Gi (44). Это следовало из сравнения спектров ЯМР 47, его десульфатировагаюго производного (48), а также данных моносахаридного анализа (D-ксилоза, D-хино-воза, D-глюкоза и З-О-метил-О-ксилоза, 1:1:1:1). Для окончательного подтверждения этого вывода провели аналитический распад кукумариозида G2 по Смиту, в результате чего получили прогенин (49), содержащий сульфатированную ксилозу, что было доказано десульфатированием и моносахаридным анализом, и производное биозида (глюкоза и З-О-метилксилоза, 1:1).

Строение агликона кукумариозида G? (47) было установлено сравнитем его спектров ЯМР со спектрами 20(8)-ацетокси-ланоста-7,25-диен-18(16)-лактон-ЗР-ола, идентифицированного в гликозидах голотурии Psoitis fabricii. По данным

спектров ЯМР эти соединения имели одинаковые ланостановыс полициклические фрагменты агликонов, но различались строением боковых цепей.

ОН он он

В спектрах ЯМР 13С 47 имелись еще три сигнала, не принадлежащих к полициклической системе: двойной связи (139,5 и 113,7 м.д.) и метальной группы (21,0 м.д.). В спектрах ЯМР 'Н имелись сигналы при 1,74 м.д. (с, СНз-21) и сигналы двух винильных протонов при 4,98 и 5,07 м.д. (два уш.с, 2Н-22). Это показывало, что к С-17 агликона присоединен изопропенильнй фрагмент, и, следовательно, агликоном 47 является 18(16)-лактон-23,24,25,26,27-нентанорланоста-7,20(22)-диен-ЗР-ол, получивший название "посьстогенин" (50).

Таким образом, строешю кукумариозида в: в целом описывалось формулой 47, что подтверждалось фрагментацией в ЬБЕМБ масс-спектрах (схема 3).

Брутто-формула С^^О^Ми >-903 ( + Н-№)

сн2он

1049 (М - Иа)

741 ( + Н - Ма)

195 (-N8)

—ЧО /ОМе\

НО

; ] ЫаОзБО ;

-Ху|4-0-

г 211 ( - Ыа) 'г 227 (- Ыа)

- Ад!

ОнЧ.». 931 (•- N3) ОН"*" 769 ' ■ Ма) ОН

.-«. 595 ( + Н - Ыа)

Схема 3. Фрагментация кукумариозида Ог (47) в Ь81М8(-) спектре.

Кукумариозид Ог (47) был первым из пентанорланостановых гликозидов голотурий, имевших в агликоне 18(16)-лактон и укороченную боковую цепь.

Кукумариозид (51) имел углеводную часть идентичную с кукумариозидами 01 (44) и 02 (47) (результаты моносахаридного анализа и данные спектров ЯМР

для 51 и его десульфатировшшого производного 52), а сигналы агликона в спектрах ЯМР совпадали с сигналами 1бр-ацетоксиголоста-7,222,24-триен-ЗР-ола. Был сделан вывод, что строение кукумариозида Сз соответствует формуле 51. 1

СН2ОН

о

сн, о

51, 52. Я = 53. К

он он он

Для доказательства этого вывода 52 было подвергнуто каталитическому гидрированию, в результате которого получили тетрагидропроизводное 53, которое было полностью идентично десульфатированному дигидропроизводному кукумариозида Оь что подтвердило сделашюе выше предположе1ше о строении 51 и 52.

Кукумариозид (54) отличался от кукумариозидов С[ (44) и Оз (51) только строением боковой цепи агликона, структуру которой определили при сравнительном изучением спектров ЯМР 54. его десульфатированного производного (55) и кукумариозида Оь

но—Г но

он он он

В спектре ЯМР |3С 54 наблюдались шесть сигналов атомов углерода, принадлежащих к боковой цепи агликона: два - двойной связи (143,5 (д) и 120,2 (д) м.д), один - атома, связанного с гидроксильной группой (69,9 (с) м.д.), два - СНз-групп (30,0 (к) и 30,1 (к) м.д.) и один - атома утлерода СРЬ-группы (41,6 (т) м.д). В спектрах ЯМР 'Н, кроме синглета при 1,53 м.д. (СНз-26 и СНз-27). наблюдалась

изолированная четырехспиновая система типа АВ/Х, в которой два протона относились к метиленовой группе (XX), а два других - к винильным протонам (КССВ = 15,5 Гц соответствовала их транс-конфигурации). Этим данным отвечали два варианта боковой цепи: 54А и 54В. Сравнение спектров ЯМР |3С 54 и холеста-7,22Е-диен-ЗР-ола, расчет возможного сдвига сигнала С-24 в спектре последнего в случае гидроксилирования по С-25, привели к выводу, что агликоном кукумарио-зида 64 является 16[^цетоксиголоста-7,23Е-диен-Зр,25-диол (вариант 54А).

• 1137 ( 1239 -S03Na + H)

1239(MNa + Na)

„О —Agl

Na03S -я-!-

j 331 (- H +№)-•—■. 3-O-NIe-Xyl -i— О-Glc-i-

■ 991 ( +2H +Na)

.—-»- 551 ( AglOH + Na) -Xvf-O""" 609 ( + Na) 533 ( 551 - HzO ) 683 (+2H + Na)

*"477(-H+Na)

—...............829 ( +2H + Na)

- Qui

О

Схема 4. Фрагментация кукумариозида G4 (54) в LSIMS(+) спектре.

Строите кукумариозида G4 (54) было подтверждено данными LSIMS(+) масс-спектра (схема 4). Распад псевдомолекулярного иона с m/z 1239 (Mns + Na)+ (бругто-фор.\гула CssifeChoSNa) давал ион с m/z 1137 (1239 - SOjNa + Н)+, который в свою очередь распадался путем последовательного удаления углеводных звеньев, начиная с терминального (m/z 991, 829, 683, 551). В спектре имелись также пики, отвечающие фрагментам углеводной цепи (m/z 609, 477, 331).

Минорные кукумарнозндм группы Н

Кукумариозид И: (56) - один из минорных компонентов подфракшш И голотурии Е. fraudathx - был выделен хроматографией на силикагеле и методом ЖХВД на обращенной фазе. Основной компонент этой подфракции, названный кукумариозидом П (57), был выделен ранее. Изучение 1 и 2D спектров ЯМР 56 показало, что агликоном этого соединения является 1бР-ацетоксиголоста-7,23Е-диен-Зр,25-диол, впервые найденный наш в кукумариозиде G4 (54).

Сравнительное изучение 56 и 57 показало, что oim имеют идентичные углеводные цепи. В пользу этого говорило совпадение данных моносахаридного анализа (З-О-метил-Б-ксилоза, D-глюкоза, D-хиновоза и D-ксилоза, 1:1:1:2), периодатного ою1слеш!я (разрушался остаток ксилозы) и спектров ЯМР углеводных частей этих соединений.

он

сн2он

он

он

ОАс

Предложенную для кукумариозида Нг структуру и его брутто-формулу подтверждал АР1-Е8(-) масс-спектр, в котором наблюдалась фрагментация, соответствующая формуле 56 (схема 5).

Брутто-формула (', ¡,1 !ч1ОуЛ\л г--«-1179( + Н-Ма| • г~>И161(-Н-Ма) З-О-Ме-Ху!-1-О—I-01с-

1325 ( - N8 )

1242 ( Мна - СНзСООН - № )"

—1017 ( + Н - Ыа )

Г--» 999(-Н-Ыа)

-С2ш-

i

ОХу!

г—739 ( + Н - Иа ) О—Ху1 —О-Ад!

i

ОБОзМа

О

Схема 5. Фрагментация кукумариозида Н2 (56) в АР1-Е8(-) масс-спектре.

1.3.2. Гликозиды голотурии рода СкиЫаЬе? подсем. С1ас1о1аЫпае

Из суммарной гликозидной фракции голотурии С1Ыо1аЬех зр. (содержание -3,36 % от сухого остатка животных), собранной на о. Занзибар (Танзания), были выделены два основных компонента, названные кладолозидами А (58) и В (59). Как природные соединения 58 и 59 ранее известны не были.

Кладолозид А (58). Данные спектров ЯМР *Н и 13С, моносахаридного анализа (D-ксилоза, D-хиновоза и З-О-метил-О-ппокоза, 2:1:1), периодагного окисления (разрушались ксилозный и хнновозный остатки) и другие физико-химические характеристики показали, что кладолозид А идентичен описанному ранее прогени-ну, полученному при ферментативном расщегшешш целлюлазой голотоксина Bi, выделе!шого из Stichopus japonicus, и описывается формулой 58.

Кладолозид В (59) при моносахаридном анализе дал смесь D-ксилозы, D-хино-возы, D-глюкозы и З-О-метил-Б-глюкозы (2:1:1:1). При периодатим окислении гликозида разрушались глюкозный и хиновозный остатки. Дальнейшее сравнение спектральных и физико-химических характеристик показало, что кладолозид В идентичен другому прогенину, получетшому из голотоксина Bi - соединению 59.

Из суммы гликозидов голотурии Cladolabes bifurcatus (содержание - 3,95 % от сухого остатка животных), собранной на о. Мадагаскар, также были выделены и идентифицированы кладолозиды А и В.

Выделите этих соединений из разных видов голотурий рода Cladolabes, позволило предположить, что кладолозиды А (58) и В (59) специфичны для рода Cladolabes и их наличие, наряду с результатам морфологических исследований, может служить таксономическим признаком рода.

1.4. ГЛИКОЗИДЫ ГОЛОТУРИЙ СЕМЕЙСТВА PHYLLOPHORIIDAE

1.4.1. Глпкошды голоту рии Neothyonidium maguían подсем. Scmpcriellinae

I leoгионидиозид С (60) - основной компонент гликозидной фракции - имел 1бр-ацетоксиголоста-7,25-диен-ЗР-ол в качестве агликона, что было установлено при сравнении спектров ЯМР его десульфатированного производного (61) и куку-мариозида Gi (44):

Действительно, 44 и 60 имели одинаковый полициклический фрагмент, но в спектре ЯМР 13С 60 сигналы двойной связи в боковой цепи наблюдались при 145,6 (С-25) и 110,7 (С-26) м.д., а в спектрах ЯМР 'Н - сигналы при 4,82 (2Н-26) и 1,50 (СНз-27) м.д., что характерно для терминальной 25(26)-двойной связи.

Моносахаридный анализ для неотионидиозида С (D-ксилоза, D-хиновоза и З-О-метил-П-глюкоза, 2:1:1) и данные спектров ЯМР 13С углеводной части 61

совпадали с аналогичными данными для нрогешша 58, полученного из голотоксина В], что позволило предположить идентичность углеводных компонент 58 и 61.

Последовательность моносахаридных остатков в 60 проверили аналитическим распадом по Смиту. При этом получили прогешш (62), содержащий сульфати-рованную ксилозу (подтверждено десульфатированием и кислотным гидролизом), и производное биозида (З-О-метилглюкоза и ксилоза, 1:1). Последовательность моно-сахаридных остатков в углеводной цепи неотионидиозида С (60) из этих данных следовала однозначно. Изучите спектров ЯМР |3С 60 и 61 показало, что 60 имеет две сульфатные группы в углеводной цепи: одна присоединена к С'-4, вторая - к С4-6. Это было доказано описанным выше хгошческим способом. Замена сульфатных групп на метальные и последующий моносахаридный анализ дали ксилозу, хиновозу, 4-О-метилксилозу и 3,6-ди-О-метилглюкозу. Получение этих метил-производных точно указало на число сульфатных гр\пп и их местоположение в углеводной цепи 60.

Неотионидиозид А (63) был основным компонентом подфракции моносуль-фатированных гликозидов. По данным спектров ЯМР "С агликоном 63 был 16Р-ацетоксиголоста-7,25-диен-ЗР-ол. На основании данных мопосахаридного анализа (Э-ксилоза, О-хшювоза и З-О-метил-Б-глюкоза, 2:1:1), периодатного окисления, спектров ЯМР 1?С строение неотионидиозида А определено как 63.

1.4.2. Глпкознды голотурии РеМатега са1Ы«еги подссм. ТЬуошпае

Из голотурии Р. calcige^■a выделили сложную смесь тритерпеновых гликозидов, дающую на ТСХ пять пятен. После разделения на силикагеле выделенные подфракции получили обозначения А, В, С, О и Е (по мере увеличения полярности).

Подфракцня А представляла собой практически индивидуальный кукумарио-зид в: (47), выделешгый нами ранее из голотурии ЕиреШасСа/\audatrix (см. раздел 1.3.1.). Содержание 47 составляло около 33,4 % от веса всей суммы гликозидов.

Подфракцня В. В составе этой подфракции обнаружили только одно соединение - кальцигерозид В (64). Его содержание составляло около 9,3 % от веса суммы гликозидов. По данным 1 и 2Б спектров ЯМР агликоном 64 был ранее описанный посьетогешш (50). В состав углеводной цепи кальцигерозида В входило пять моносахаридных остатков (О-ксилоза, Б-хиновоза, О-глюкоза и З-О-метил-Б-ксилоза, 1:2:1:1), связашшх между собой и с агликоном Р-гликозидными связями.

Сольволитическое десульфатировапие 64 привело к получению производного 65. При периодатном окислении 64 окислялся хиновозный остаток, а при окислении 65 - еще и ксилозный, что говорило о наличии сульфатной группы при ксилозе. Положение сульфатной группы у С'-4 определи по характерным сдвигам сигналов в спектрах ЯМР 13С при переходе от 64 к 65: С'-4 - в более сильное поле (на 6,4 м.д.), а С'-З и С'-5 - в более слабое поле (на 2,02 и 1,78 м.д., соответствешю).

З-О-Ме-Ху! -

1049 ( + Н - №) -0-С1с -

I___________

Брутто-формула ('«^Н^О^^Ха

► 903( + 2Н-Ыа) —*888( + 2Н-Ма) -О-9и! -

СНл

1195 (Мна-Ыа)

------ 596 ( + 2Н - N3)

■О—Ху! — О-Ад!

ОЭОзМа г:::::::::::» 1049 ( + Н - N3)

Схема 6. Фрагментация кальцигерозида В (64) в РАВ(-) масс-спектре.

Последовательность моносахаридных остатков в углеводной цепи 64 установили по результатам двойного распада по Смиту и данным FAB масс-спектров. При окислении 64 получили прогенины: на первой стадии - 47, на второй -' 49, описанные нами ранее при изучешш гликозидов голотурии Eupentacta fraudatrix (см. раздел 1.3.1.)- В FAB масс-спектрах кальцигерозида В наблюдалась фрагментация, соответствующая формуле 64 (схема 6).

Кальцигерозид В (64) - единственный гликозид, выделенный из голотурий, в составе углеводной цепи которого обнаружено два хиновозных остатка.

Подфракция С содержала кальцигерозиды С] (66) и С~, (67), которые имели идентичные углеводные цепи и различались строением агликонов. Содержагае 66 составляло около 22,3 % от общего содержания гликозидов, а 67 - 9,3 %.

65. R = S03Na 68. R = Н

-------/он°\

сн2он f J

°—7Г°\/ нонл

но1*—f

0

он

67. R = S03Na 69. R = Н

Кальцигерозид С] (66) по своему химическому строению отличался от кальцигерозида В только тем, что имел терминальный глюкозный остаток (а не хиновозный, как в 64). С троение 66 и его десульфатированного производного (68) устанавливали теми же методами, что и строение 64: 1 и 2Э спектры ЯМР, РАВ(+) и (-) масс-спектры (схема 7), а также результаты моносахаридного анализа, перио-датного окисления и двойного распада по Смилу (на первой стадии получили прогешш 47, на второй - 49).

и.

66А

66В

66С

Кальцигерозид Ci (66) был первым гликозидом, выделенным из P. calcigera, и

при его изучении методами 1 и 20 ЯМР спектроскопии высокого разрешешы были проверены все сделанные ранее выводы о строении посьетогенина (50). Было проведено отнесите всех сигналов 50, проведена корреляция между сигналами в спектрах ЯМР 'Н и 13С, выявлены три изолировашше спиновые системы: 66А, 66В и 66С и изучено пространственное строение по спектрам Ж)Е8У (ббИ). Получен-

1211 ( Мма - N8 )

З-О-Ме-Ху! — О -

-С1с

1047 (-Н-Ыа)

г-— 903 ( + Н - Ма)Г».885.(.:.Н;^)

Ерупшю-формула С\

»-708 I. ( + Н - N3) С!с~""—М049( + Н •

-595 ( + Н - Ыа) —»-577(-Н-Ыа) -Ху!-О - Ад1

i

ОБОзЫа

Ыа)

Схема 7. Фрагментация кальцигерозида С1 (66) в РАВ(-) масс спектре.

Кальцигерозид Сг (67) В спектрах ЯМР 13С агликошюй части 67 кроме сигналов полициклического фрагмента голостанового агликона с 7(8)-двойной связью наблюдалось еще шесть сигналов, относящихся к боковой цепи. С помощью 1 и 2Г) спектров ЯМР высокого разрешения (500 МГц) было проведено отнесение этих сигналов, выявлено две изолированные системы протонов (67а и 67Ь), а также установлено, что агликоном 67 является голоста-7-ен-23-он-ЗР-ол и по спектрам МОЕБУ изучено его пространственное строение (67С).

Поскольку калыдагерозиды С1 и Сз имели полностью идентичные углеводные цепи, что следовало из данных моносахаридного анализа, РАВ масс-спектров (схема 8), совпадения углеводных частей 1 и 213 спектров ЯМР как 66 и 67, так и их десульфатированных производных (68 и 69), становилось ясно, что в целом строение кальцигерозида С2 соответствует формуле 67.

1297 ( Mfja - Na )

r-------»-1151 ( + H - Na )

i r-»-1135( + H-Na) 3-O-Me-Xyl-^O-j-Glc-

Брутто-формула CssII^C^SNa

- 989 ( + H - Na )

г........»808(-H-Na)

! г......► 971 (-H-Na)

— O+i-Qui-

! I I к

—-. [ 4 0

'-O::::::^::::-...!-^ (. н - Na ) Glc

—681 ( + H - Na ï I

r—665 ( ♦ H - Na ) О —i—Xyl — o—Agi Ч I

0S03Na

Схема 8. Фрагментация кальцигерозида С2 (67) в РАВ(-) масс-спектре.

Подфракция Б содержала кальцигерозиды 0[ (70) и 1)2 (71), которые имели идентичные углеводные цепи и различались строением агликонов. Содержание 70 составляло около 14,8 % от общего содержания гликозидов, а 71 - 3,3 %.

Кальцнгерозид Di (70). Десульфатировашк 70 привело к производному1 68, ранее полученному из кальцигерозида Ci (66). Из этого следовало, что 66 и 70 отличаются друг от друга только числом и расположением сульфатных групп в углеводной цепи. Изучение спектров ЯМР 70 показало, что в нем имеется дополнительная сульфатная группа у С-б одной из глюкоз. Натичие в API-ES(-) масс-спектрах 70 пиков фрагментных ионов с m/z 387 (3-O-Me-Xyl-O-GlcfSChNa] - H -Na)" и 903 (MjNa - 3-0-Me-Xyl-0-Glc[S03Na] - II - Na)", соответствующих разрыву связей между терминальным биозидным блоком и хиновозным остатком, позволило поместить вторую сульфатную группу у С3-6, что отвечало формуле 70.

Это предположение было подтверждено и с помощью различных экспериментов 2Б ЯМР спектроскопии. Кроме того, например, было проведено определение времен релаксации, которое показало, что для атомов сульфатированного глюкоз-ного остатка наблюдается существенно меньшее время АТ| (схема 9). Это подтвердило структуру 70, так как известно, что в гликозидах у атомов углерода терминальных моносахаридных остатков времена релаксации больше.

"Т31тлгт-т-»л1я1аст" ГШЛ1'ПТ1 /"I Л 1П1 "Трпшыня т.ия а" гтгм.тчт 0 191

Схема 9. Результаты измерения ЛТ| атомов углерода глюкозных остатков в 70.

Кальцигерозид Бг (71) имел углеводную цепь идентичную таковой в 70, отличаясь от кальцигерозида Сг (67) только наличием дополнительной сульфатной группы у С3-6. Это подтверждалось данными моносахаридного анализа, масс-спектроскогаш и 1 и 2В спектрами ЯМР.

Подфракция Е представляла собой практически индивидуальный гликозид -кальцигерозид Е (72), содержание которого составляло около 3,3 % от общего веса гликозидной фракции.

По спектрам ЯМР было определено, что агликоном 72 являлся 1бр-ацетокси-голоста-7,23Е-диен-Зр,25-диол, ранее обнаруженный в кукумариозиде 64 (54). Строение утлеводной цепи 72 также устанавливалось физическими методами.

Тщательный анализ 1 и 20 спектров ЯМР, а также изучение фрагментации 72 в РАВ(+) и (-) масс-спектрах (схемы 10 и 11) позволил определить строение кальцигерозида Е как соответствующее формуле 72.

НС

'"он

он

Г-12°9..,-*".:.1®,.»1193 ( ♦ Н - Ма) 1385 - 50зМа + Н " Ма'~

ИаОзБО : • --------------------------------------

I

3-0-МеЧ31с -•-О—I—в1с-

547 (-М -»-

Н-Ош-

"•■1047 ( + Н - N3) -О-Ху1 —О —Ад!

255 (- Н - Ыа) -«-' ! 417*-- 867 (- Ыа|

273 ( + Н - Ыа)-<-----^ (-Н-Ма) [......О ОБОзМа

Брутто-формула СиНдеОде^Каг 61с

Схема 10. Фрагментация кальцигерозида Е (72) в РАВ(-) масс-спектре.

1533 ( Мца^а N3 )

1431 (ГЛма,Ма - ЭОзМа + Н + Иа )+]

ЫаОзБО г—1255 ( + Н + Ма) .------► 1075 ( - Н + Ма) ^ -^769 ( + Н + N3)

З-О-Ме-в 1с —I— О — С1с—|— О—I—Н-СЗш-О-1-Ху|-О— Ад1

. 464 ( +Ыа ) .......-> ^ -4—>-897( + Ма) Ч I

"........ ...................................•-—-^--».1370 ( + Н + Ыа) 05°^а

Брутто-формула С^Н^О^Г^ С|с

Схема 11. Фрагментация кальцигерозида Е (72) в РАВ(+) масс-спектре.

2. ТРИТЕРПЕНОВЫЕ ГЛИКОЗИДЫ И ВОПРОСЫ ХЕМОСИСТЕМА-ТИКИ ГОЛОТУРИЙ ОТРЯДА БЕМЖОСНтОТГОА

2.1. Таксономическое распределение гликозидов в голотуриях отряда Оеп(1госЫго11(1а

Выполнен анализ таксономического распределив« 66 гликозидов из 18 видов голотурий отряда Dendrochirotida. Установлено, что в данном таксоне имеют место вариации от почти полного качественного и количественного совпадения глико-зидного состава голотурий в пределах одного рода, до случаев, когда отнесешгые к о;цюму и тому же роду голотурии имеют различный состав гликозидных фракций. Таким образом, наши исследования привели к выводу, что таксономическая специфичность этих соединешй в разных таксонах отряда ВепёгосЫго^сЬ не одинакова. Примером специфичности гликозидного состава на уровне рода могут служить голотурии рода С1ас1о!аЬез (см. раздел 1.3.2.), а на уровне вида - ситуация с тритер-пеновыми гликозидами голотурий рода Сиситапа (см. разделы 1.2. и 2.2. - 2.З.). Эта ситуация отличается от наблюдаемой в ранее изученном отряде А8р1<1ос1нго-Ма, где химическое строение компоннггов гликозидных фракций может служить таксономическим признаком на уровне родов или групп близкородственных родов.

2.2. Трнтерпеновые гликозиды н таксономические отношения голотурий Cucumariafrondosa и Cucumariajapónica

Голотурии Cucumaria frondosa (типовой вид рода) и Cucumaria japónica относятся к числу наиболее крупных и массовых голотурий отряда Dendrochirotida. Вопрос о видовой самостоятельности голотурии С. japónica неоднократно подвергался сомнению. Од1Ш исследователи считали, что С. japónica - только подвид, другие - вариетет С. frondosa. По внешнему виду эти голотурии практически не отличаются, очень сходно и внутреннее строение обоих видов. Проведенные нами исследования С. frondosa и С. japónica позволили получить для решения отмеченных таксономических проблем информацию совершенно нового Tima, а именно, сведения о химическом строении тритерпеновых гликозидов.

Таблица 1. Сравнительное распределение тритерпеновых гликозидов

в голотуриях Cucumaria frondosa и Cucumaria japónica

Cucumaria frondosa (фрондозиды) | Cucumaria japónica (кукумариозиды)

Фракция мопосулъфашироваппых гликозидов

Ai (26) (минорный кошюнент) (линейный тетраозид) аналогов нет

А (18) (основной компонент) D (73) (минорный компонент) Ао-1 (10), Ао-2 (И)иАо-З (12)

аначогов нет А,-2 (13)

аналогов пет А2-2 (1), А2-3 (5) и А2-4 (7)

аналогов нет А4-2 (8)

Фракция дисульфатированпых гликозидов

■ В (74) (основной компонент) Аз (19)

аналогов нет Аб-2 (20)

Фракция трисульфатироваппых гликозидов

С (28) (гликозид ланостанового ряда) (основной компонент) А7-1 (21), А7-2 (22) и Ат-З (23),

Сравните состава гликозидиых фракций голотурий С. frondosa и С. japónica показывает, что они не совпадают ни по одному компоненту (табл. 1). Рассматривая гликозиды этих голотурий как таксономический признак, можно сделать

вывод, что Cucumaria frondosa и Cucumaria japónica - хорошо отграниченные, самостоятельные виды, содержащие характерный для каждого животного набор тритерпеновых гликозидов. Полученные нами результаты были использованы биологами-систематиками для окончательного решения проблемы отношения этих видов.

2.3. Трнтерпеновые гликозиды и таксономические отношения голотурий рода Cucumaria семейства Cucumariidae

При разграничении видов внутри семейства Cucumariidae возникают большие трудности. Неудовлетворительность системы кукумариид была признана давно. Попытки устранить ее недостатки почти всегда приводили к созданию большого числа монотипических родов, что вносило еще большую путаницу.

Поиск общих закономерностей в структурах и таксономическом распределении гликозидов голотурий рода Cucumaria привел к заключению, что различные фрагменты гликозидов (углеводная цепь/агликон) отвечают различному уровню таксономической специфичности. Был сделан вывод, что для этих голотурий строение и набор агликонов, как и гликозидов в целом, является скорее видоспецифичным и не несет таксономической информации на родовом уровне.

Иная картина наблюдается при анализе распространения различных утлевод-шлх цепей. В таблице 2 приведены типы углеводных цепей и их распределение в тритерпеновых гликозидах кукумарий (использованная классификация основана на нумерации гликозидов из С. japónica, раздел 1.2.1.). При этом хорошо видны как сходство, так и различия в составе гликозидных фракций у видов, относимых к роду Cucumaria и исследованных к настоящему времетг Это прослеживается даже в тех случаях, когда были выделены только основные компоненты гликозидных фракций (С. koraiensis и С. miniata).

Из таблицы 2 видно, что все исследованные кукумарии можно разделить на две группы. К первой группе относятся голотурии С. frondosa, С. japónica, С. miniata, С. koraiensis и С. sp., имеющие в составе гликозидных фракций вещества с одинаковыми углеводными цепями: Все они - пентаозиды, разветвленные по второму (хиновозному) моносахаридному остатку, с различными вариантами расположения сульфатных групп.

Таблица 2. Распределение тритерпеновых гликозидов голотурий рода

Cucumaria по типам углеводных цепей ***

Типы углеводных цепей ( классификация типов углеводных цепей основана на нумерации гликозидов голотурии Cucumaria japónica ) ТГ / r 0 It d 0 s a ¿1 j a P 0 n 1 с a m i n i a t a "c k 0 r a i e n s i s ¿! s p- C~ e с h i /i a t a C. 1 e f e V r e i

- Тип An- 30MeGlc-«-Xyl-»-Qui-«-Xyl-»Agi t ■ 1 Xyl S03Na + + min min min - -

- Tun A i - Glc ——»-Glc-»-Qui-»-Xyl-»"Agi Ac Xyl S03Na - + ? ? - - -

- Tun A;- 30MeGlc-»- Glc-»-Qui-»-Xyl-»-Agi t 1 Xy| S03Na - + min min + - -

- Tun Aj- Glc-»-Glc-»-Qui-»-Xyl-►Agi t 1 Xy| S03Na ? + ? ? min - -

- Tun A i - 30MeGlc -»-Glc-»-Qui-»-Xyl-»-Agi 1 t 1 S03Na xy| S03Na + + min min + - -

- Tun Ar, - 30MeG!c -»-Glc-»-Qui-►Xyl-»-Agi 1 f 1 S03Na ¿y, S03Na min + min min min - -

-Тип A-- 30MeGlc -»-Glc-»-Qui-►Xyl-»-Agi 1 J t 1 S03Na S03Na S03Na + + + + + - -

*** Пояснешш к таблице: порядок связей моносахаридных остатков неуказан;

"+" -углеводная цепь данного типа идентифицирована в составе гликозидной фракции; "—" -углеводная цепь данного типа не найдена в составе гликозидной фракции: "пил" - углеводная цепь данного типа идентифицирована только по данным ТСХ; "?" - Оостоверных данных нет.

Ко второй - относятся С. echinata и С. h'fevrei. Все кукумэхинозиды (С. echinata) - линейные ди- и трисульфатированные тетраозиды, лефеврейозиды (С. lefevrei) - также линейные тетраозиды, но только три из mix содержат сульфатную группу в углеводной цепи. Анализ химического строения гликозидов С. levefrei и С. echinata говорит о том, что эти два вида отличаются от "настоящих" кукумарий й скорее всего вообще не относятся к роду Cucumaria.

Значительные различия в строении гликозидов С. levefrei и С. echinata позволяют предположить, что эти виды таксономически удалены и друг от друга. Это мнение разделяется и некоторыми систематиками.

Таким образом, наши исследования привели к выводу, что для гликозидов голотурий рода Cucumaria общим таксономическим признаком является не строение этих веществ в целом, а строение содержанщхся в mix углеводных цепей. "Типовым" можно считать набор углеводных цепей, идентифицированный в голотурии С. japónica.

Необходимо отметить, что возможны отклонения от этого набора в зависимости от вида, времени и места сбора образцов и т.д. Тот или иной компонент может накапливаться, присутствовать в минорных количествах или совсем отсутствовать.

Исходя из этих теоретических предположений нами был проведен анализ гликозидов из голотурии, пойманной у северного побережья Приморского края. Ее таксономическая пршюдлежностъ не была однозначно определена, но предположительно это была голочурия рода Cucumaria (до описания - Cucumaria sp.). Проведенное нами исследование показало, что в состав гликозидов Cucumaria sp. вхо,чят утлеводные цепи, характерные для рода Cucumaria (см. раздел 1.2.5.). Это позволило сделать вывод, что изученная голотурия: во-первых, относится именно к роду Cucumaria, о чем свидетельствует идентифицированный в ее гликозидах набор углеводных цепей; во-вторых, не является голотурией С. japónica, так как гли-козиды этих двух видов не совпадают между собой по качественному составу.

2.4. Об относительной таксономическом древности отряда Dendrochirotida и возможных направлениях н этапах биосинтеза трнтерпеновых гликозидов голотурий

Одним из вопросов, возникающих при изучении голотурий, является вопрос о

происхождении и развитии этих беспозвоночных, о том, представители какого из отрядов наиболее близки к предковым формам современных голотурий. Среди биологов нет единого мнения о путях эволюции данного класса. На наш взгляд, результаты химического исследования тритерпеновых гликозидов дают некоторую возможность проследить пути эволюции как самих голотурий, так и их гликозидов, опираясь на предположения о возможных направлениях и этапах биосинтеза агликонов этих веществ.

Биосинтетическими предшествешшками агликонов гликозидов голотурий являются продукты циклизации сквалена: ланостерин (75) и, в некоторых случаях, паркеол (76), которые при трансформации в агликоны проходят ряд биосинтетических стадий. Естественно предположить, что в процессе эволюции голотурий структуры гликозидов и комплекс ферментов, отвечающий за их биосинтез, развивались и совершенствовались параллельно. Исходя из этого, обнаружение агликонов, отвечающих по своем}1 строению промежуточным биосинтетическим стадиям, может быть рассмотрено как отражение пути биосинтеза и эволюции агликонов гликозидов. В таком случае нахождение в составе гликозидных фракций отдельных голотурий (или групп голотурий) агликонов близких к 75 и 76 (и не встречающихся у других видов, ушедших дальше по эволюционному пути), может говорить о большей древности таких животных.

В тритерпеновых гликозидах голотурий отряда Dendrochirotida обращает на себя внимание значительное структурное разнообразие их агликонов. На схеме 11 показаны направления и этапы развития биосинтеза в процессе трансформации лапостерипа (75) в агликоны гликозидов (схема составлена опираясь на химическое строение гликозидов, выделенных из дендрохиротид).

Наиболее близки к 75 ланостановые агликоны пенаустрозидов А (77) и В (78) (.Pentacta australis). Скорее всего для всех агликонов введите гидроксила в С-20-положение было первой стадией на пути биотрансформаций. Далее развитие биосинтетических процессов шло по нескольким направлениям.

I. Введение дополнительной кислородной функции по С-22 (фрондозид С (28) -Cticuniaria frondosa). Этот путь в дальнейшем ведет к расщеплению боковой цепи по связи С-20 - С-22 (кореозид А (30) из Cucumaria koraiensis\ 30, кукумариозиды

Аз-2 (32), Аз-3 (33) и изо-кореозид А (36) из Сиситапа Бр.). Последующие трансформации приводят к структурам 39, 40 и 41 - такие фрагменты были обнаружены в гликозидах голотурии Виаатсн1ас1у1а кгт1сп.^1х. Такие процессы хорошо известны по биосинтезам стероидных гормонов и агликонов гликозидов морских звезд.

Схема 12. Гипотетическая схема возможных этапов и направлений биосинтеза агликонов гликозидов голотурий отряда Вепс1госЫгоШа. Все агликоны, кроме специально отмеченных Д9(11):..., относятся к 7(8)-непределыюму ряду.

II. Окисление С-18, с последующим образованием 18(20)-лактошюго цикла. Этот путь приводит к агликонам, не имеющим кислородной функции при С-16 (кукумэхинозиды С (79), F (80) из Cucumaria echinata, фрондозид В (74) из Сиси-maria frondosa; неотиозид А (81) из Neothione gibbosa; кукумариозиды А2-4 (7) и АтЗ (23) из Cucumaria japónica; калыщгерозиды С 2 (67) и D2 (71) из Pentamera calcigera).

III. Окислите по С-16 и С-18, в одном случае происходит замыкание 18(16)-, а в другом - 18(20)-лактона. Известно всего два варианта агликонов, имеющих 18(16)-лактон: первый - агликон псолюсозида В (82) (Psolus fabricii), второй вариант - посьетогенин - встречается чаще: кукумариозид G2 (47) {Eupentacta fraudatrix), 47, кальцигерозиды В (64), Ci (66) и Di (70) (Pentamera calcigera).

Соединения с 18(20)-лактоном и 1бр-ацетатной группой, являются одними из самых распространенных голостановых гликозидов (фрондозиды А (18), А\ (26) и D (73) из Cucumaria frondosa; лефеврейозиды Ai (83), А2 (84), В (85) и С (86) из Cucumaria lefevrer, кукумариозиды Ai (43), Ci (87), С2 (88), Fi (45), F2 (46), Gi (44), G3 (51), G4 (54), H (57), и Ib (56) из Eupentacta fraudatrix, C2 (88) и H (57) из Eupentacta pseudoquinquesemita', эксомисозид A (89) из Psolus eximius', неотиони-диозиды А (63) и С (60) из Neothyonidium magmim; кальцигерозид Е (72) из Pentamera calcigera; кукумариозиды Ао-1 (10) и Ао-2 (11) из Cucumaria japónica). Среди близких им по строению был и необычный агликон 90 из гликозидов голотурии Parathionci sp..

Вероятно именно соединения с 1бр-ацетоксигругтой являются эволюционными предшествешгаками гликозидов с 16-кетогрушой (кладолозиды А (58) и В (59) из Cladolabes bifurcatus и Cladolabes sp.; кукумэхинозиды А (91), В (92), D (93) и Е (94) из Cucumaria echinata-, пенаустрозиды С (95) и D (96) из Pentacta australis-, неотионидиозид (97) из Neothyonidium magnum; псолюсозид А (98) из Psolus fabricii, кукумариозиды Аг-2 (1), А?-3 (5), А4-2 (8), Ао-3 (12), Ai-2 (13), Аз (19), А6-2 (20), Ат-1 (21) и А7-2 (22) из Cucumaria japónica).

Таким образом, в гликозидах голотурий отряда Dendrochirotida найдены различные агликоны: от минимально окисленных (только по С-20: 77, 78) и, соответственно, минимально отличающихся от своих биосинтетических пред-

шествешшков; через ряд форм, отвечающих разлитым промежуточным биосинтетическим стадиям, до наиболее окисленных, как, например, неотиозид А (81) из голотурии К'еовиопе gibbosa.

На наш взгляд, наличие такого широкого спектра агликонов (отражающего интенсивный эволюционный поиск удачных структурных вариантов), свидетельствует о тбм, что дендрохиротиды в эволюционном отношении более близки к предковым формам. Известно, что такая ситуация вообще характерна для близких к предковым организмам. Палеонтологи отмечают в группах, находившихся у основания филогенетических стволов, большую интенсивность формо- и таксоно-образования, по сравнению с группами, эволюциошю более продвинутыми. Очевидно, что эти закономерности можно распространить и на биохимическое разнообразие вторичных метаболитов.

В гликозидах голотурий отряда Азр1(1осЫгойс1а, по сравнению с дендрохиро-тидами, содержится небольшой набор агликонов. Практически все гликозиды голотурий семейства Ио1оШигпс1ае имеют голоста-9(11)-ен-ЗР,12а-диольный фрагмент, а все остальные различия сводятся к вариациям в детачях строения боковой цегш и наличию/отсутствию 17а-гидроксильной группы. В гликозидах голотурий семейства Б^сИоросШае найдены только три агликона: 23(8)-ацетоксиголост-7-ен-ЗР-ол, его 25(26)-дегидроаналог, а также голоста-9(11)-диен-ЗР-ол-16-он. На наш взгляд, это объясняется тем, что большинство аспидохиротид живет на мелководье тропических морей в условиях интенсивной борьбы за существование. На гликози;июм уровне отражением жесткого (по сравнетпо с другими регионами) эволюционного отбора является то, что в этих голотуриях содержатся в больших количествах всего по 1 - 2 гликозида, обладающих большой биологической активностью, в том числе и значительной ихтиотоксичностыо, что прямо способствует выживанию этих беспозвоночных.

Исходя из предположения о более быстрых эволюционных процессах у голотурий коралловых рифов, можно допустить, что виды Но1оШигпс1ае, обитающие в более умеренном климате (в условиях менее ожесточенной борьбы за существование), сохранят в строении гликозидов больше "предковых" элементов, сходных или повторяющих элементы структур гликозидов из дендрохиротид. При этом

количество структурных разновидностей гликозидов будет расти, а их биологическая активность - падать. Так, с высокой степенью вероятности можно предположить, что эндемичные виды рода Holothuria, обитающие в Средиземном море (H. polit, H. tubulosa), будут отличаться от тропических видов по гликозидному составу. С другой стороны, у голотурий отряда Dendrochirotida, проживающих в тропиках, разнообразие гликозидов будет падать, но должно возрастать содержать отдельных компонентов гликозидной фракции и их "защитное" действие.

Это предположение подтверждается химическими исследованиями: Holothuria forskali (ареал обитания - от Средиземного моря до Скандинавии), резко отличается по гликозидному составу от тропических видов. Выделенные из нее голоту-ринозиды А и В не имеют аналогов по углеводным цепям среди голотуршюв и сходны по "архитектуре" с кладолозидом В (59) из голотурий рода Cladolabes (Dendrochirotida). Аналогичные примеры можно привести для дендрохиротид. Тропические голотурии рода Cladolabes накапливают только два гликозида: кладо-лозиды А (86) и В (89) (см. раздел 1.3.2. ), а в Neothione gibbosa (Мексика), обнаружили только неотиозид А. Интересно, что и в северо-атлантической голотурии Cucumaria frondosa, в отличие от северо-тихоокеанских кукумарий, накапливается в очень больших количествах только один компонент - фрондозид А (18).

Гликозиды из других отрядов голотурий практически не изучены, тем не менее, нужно отметить, что отряды Gepherothuriidae, Molpadiida и Sinaptida сходны с Aspidochirotida тем, что из их представителей выделены гликозиды только голос-танового ряда, которые далеки по строению от своих биосшггетических предшест-вешшков.

3. ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ГЛИКОЗИДОВ

ГОЛОТУРИИ CUCUMARIA JAPONICA И ПЕРСПЕКТИВЫ ИХ ПРАКТИЧЕСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

Испытания физиологической активности гликозидов из голотурии Cucumaria japónica проводились в лабораториях Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН (г. Владивосток), в НИИ эпидемиологии и микробиологии СО АМН (г. Владивосток), в Научно-исследовательской лаборатории биологически

активных веществ гидробионтов МЗ (г. Москва), а также в Центральном НИИ вакхцш и сывороток имени И.И. Мечникова (г. Москва).

Исследовались следующие препараты, полученные из суммарной гликозидной фракции, голотурии Cucumaria japónica. КД (или "кукумариозид") - подфракция моносульфатированных пентаозидов, в состав которой входят кукумариозиды групп Ао, Ai, А2 и Ají, и КМ - подфракция кукумариозидов группы А2. Кроме того, в некоторых тестах изучали свойства индивидуальных соединений.

3.1. Мембраиолитическая активность

В ходе изучешм свойств гликозидов голотурии Cucumaria japónica было изучено влияние моносахаридного состава, числа и расположения сульфатных групп (связанных с моносахаридами углеводных цепей), наличия 16-кетогрутгпы в агликоне на гемолиз, включая измените кинетических параметров этого процесса, а также выход ионов К+ из эритроцитов белых мышей. Были изучены свойства кукумариозидов А2-2 (1), Аз (19). А4-2 (8), А6-2 (20), А7-1 (21), А7-3 (23) и ряда десульфатированных производных (2, 9, 25).

Было показано, что для гликозидов, имеющих один и тот же агликон, тип взаимодействия гликозида с мембраной определяют структурные особенности углеводной части молекулы: количество и расположите сульфатных групп, наличие 3-О-метилыюй и 6-О-ацетилыюй групп в терминальном моносахарид!юм остатке углеводной цепи. Найдено, что З-О-метнльная и б-О-ацетатная группы увеличивают гидрофобное взаимодействие изученных соединений с мембранами, а присутствие ¡порой сульфатной группы в углеводной части молекулы, наоборот, уменьшает гиброфобное взаимодействие с линидным бислоем.

Исследование гемолиза и выхода ионов К^ из эритроцитов белых мышей показати, что для разветвленных пентаозидов, имеющих З-О-метильную группу в терминальном моносахаридном остатке, сульфатные группы, присоединенные к С-4 первого остатка ксилозы и к С-6 третьего глюкозного остатка, увеличивают скорость выхода ионов К+. Сульфатная группа при С-4 первого ксилозного остатка повышает гемолитическую активность, а при С-6 третьего моносахаридного остатка - снижает ее. Сульфатная группа при С-б терминальной З-О-метил-глюкозы резко снижает как гемо.щгпиескуто активность, гак и скорость выхода

ионов 1С. Наличие 16-кетогруппм в агликонах гликозидов, имеющих 7(8)-двойную связь, заметно уменьшает гемолитическую активность.

3.2. Иммуиомодулнрующис свойства ***

Установлено, что некоторые из тритерпеповых гликозидов голотурии Cucumaria japónica обладают выраженной способностью повышать естественную резистентность животных к инфекциям, обусловленным довольно широким кругом микроорганизмов, хотя при этом антибактериальной активности не проявляют. Дальнейшие исследования привели к выводу, что в основе этого эффекта лежит активация мононуклеарной фагоцитарной системы, включающая в себя усиление фагоцитарной и переваривающей способности макрофагов.

Схема 13. Влияние кукумариозидов (0,2 мкг/мышь) на лизосомальную активность мышиных макрофагов.

Для изучения свойств кукумариозидов и выяснения связи между их строением и активностью была испытана серия веществ, имевших одинаковые агликоны и различные углеводные цепи: кукумариозиды Аг-2 (1), Аз (19), Ад-2 (8), Аб-2 (20),

Исследоваштя проводились в ТИБОХ, в Научно-исследовательской лаборатории биологически активных веществ гидробионтов Министерства здравоохранения и Центральном НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова.

A-l (21) и jix десульфатированные производные 2 и 9. Выбор исследованных соединений определялся тем, что о!ш являются основными компонентами суммы гликозидов голотурии Cucumaria japónica.

Критерием оценки было измените лизосомальной активности перитонеальных макрофагов у мышей линии BALB/C после введения животным соответствующих индивидуальных кукумариозидов (схема 13). Оценку активности внутриклеточных лизосом проводами путем окрашивания последних флуоресцентным красителем Акридиновым оранжевым с последующим измерением флуоресценции обработанных клеток.

По сравнению с контрольными животными, наибольший рост лизосомальной активности макрофагов вызывало введение кукумариозида Аг-2 (1). Способность нативных гликозидов к активащш макрофагов понижалась почти до нуля в ряду: А3-2 (1) -> Аз (19) -> А4-2 (8) -> Ай-2 (20) -> А?-1 (21). Таким образом, увеличите числа полярных групп в углеводной цепи гликозидов приводит к снижению их активности. Следует отметить, что наименее полярные из числа исследованных соединений - десульфатированные производные кукумариозидов Аз-2 и A.i-2 (соединения 2 и 9, соответственно) - активности практически не проявляют.

Схема 14. Изменение лизосомальной активности перитонеальных макрофагов после введешм препаратов кукумариозидов.

1. Контроль;

2. Моносульфатированный кукумариозид А:-2 (1) (0,2 и 0,02 мкг/мышь);

3. Фракция моносульфатированных кукумариозидов (4,0 и 0,4 мкг/мышь);

4. Фракция ди- и трисульфатированных кукумариозидов (4,0 и 0,4 мкг/мышь).

Отдельно оцнгивалось воздействие на живой организм (мыши линии DBA) некоторых гликозиднмх фракций, представляющих интерес в качестве основы для потенциальных лекарственных препаратов. Интересно отметить, что если введение

препарата КД (суммарная фракция моносульфатированных кукумариозидов) вызывало увеличите активности макрофагов, хоть и не столь высокое как при введении индивидуального Аз-2 (1), то введение мышам суммарной фракции ди- и трисульфагированных соединений приводило .к резкому падению лизосомальной активности, оказывая явно негативное воздействие на организм (схема 14). Следовательно, препараты, планируемые к применению, должны быть очищены от таких полисульфатированных гликозидов.

Установлено, что КД оказывает протективное действие по отношению к целому ряду представителей энтеробактерий родов Escherichia, Proteus, Salmonella и грам-отрицательных кокков рода Neisseria, стимулируя неспецифическую антибактериальную резистентность мышей к -условно-патогенным грамотрицательным микроорганизмам. Так, при внугрибрюшинном заражешт мышей заведомо летальным количеством микроорганизмов Е. coli и Proteus mirabilis однократная инъекция кукумариозида в очень низких дозах (до 1 мкг/мышь и ниже) предотвращала гибель, соответственно, 20 -40 и 50 - 80 % зараженных животных при 100 % гибели в контроле. Кроме того, исследования показали, что введение КД ускоряло очищение организма животных от возбудителя, уменьшало цитопатогепнос действие бактерий на макрофаги, приводило к активизации системы мопопуклеарных фагоцитов.

Показано, что препарат КД оказывает выраженное адыовантное действие, вызывая увеличите антительного ответа на корпускулярные антигены, усиливает протективное действие некоторых других бактериальных вакцин. Введение гликозидов снижало эффективную дозу вакцины и оказывало стимулирующее действие на организм. При этом процент выживших животных увеличивался в 2 - 2,5 раза, а образование антител стимулировалось даже у наследственно слабо отвечающих мышей. Кукумариозид, например, достоверно усиливает протективный эффект корпускулярной энтеробактериалыюй вакцины на основе Salmonella minnesota. При введении мышам растворимого комплекса антител сальмонелл, инъекция кукумариозида увеличивает выживших животных число с 27 % (только вакцина) до 94 - 98 % (вакцина +. кукумариозид) в группе иммунизированных животных (при 100 % гибели в котроле).. , - .¡;. - 1

3.3. Радиозащптнос действие

Установлено, что препарат КМ оказывает профилактическое и лечебное действие при поражении организма ионизирующмш излучениями. Было изучено восстанавливающее действие гликозидов на первичное звено иммунной и кроветворной систем - популяцию плюрипотентных стволовых клеток, учитывая, что система кроветворения - наиболее радиочувствительная система организма. Ее повреждения являются основной причиной развития лучевой болезни. В качестве экспериментальной модели использовались мыши, облученные в сублетальной дозе 6,5 Гр (источник излучения - Со-60). При этом в течение одного месяца в динаштке исследовали влияние КМ и индивидуального Ау2 (1) на интегральные показатели облученного организма животных, отражающие состояние иммунитета и кроветворной системы: клеточность миелокариоцитов, число лейкоцитов крови, показатели селезенки и тимуса.

Полученные результаты привели к выводу, что некоторые гликозиды голотурии Cucumaria japónica проявляют выраженную противолучевую активность, что приводит к восстановлению показателей кроветворной и иммунной систем, а также к возрастанию числа выживших стволовых клеток костного мозга.

3.4. Исследование мутагенных, генотокспческих и эмбрнотокспчсскнх свойств

В связи с тем, что тритерпеновые гликозиды из голотурии Cucumaria japónica предполагалось использовать в качестве лекарственного или ветеринарного средства, исследовано токсическое и повреждающее действие этих веществ на хромосомном, клеточном и организменном уровне.

Была проведена цитогенетическая оценка мутагенной активности кукумариозида на клетках костного мозга мышей двумя тестами: микроядерным и путем учета хромосомных аберраций. Были получены однозначные результаты: кукумариозиды в данных тестах не обладают мутагенной активностью.

При испытании кумариозида на генотоксичность, в тесте Эймса, SOS-хромотесте, тестах на индукцию сестринских хроматидных обменов кукумариозид не индуцировал генных мутаций.

При доклиническом фармакологическом испытании кукумариозида на

эмбриотоксичпостъ (эмбриолетальность, тератогенность), при оценке их влияния на репродуктивную функцию крыс (лшши Вистар) и на постнатальное развитие потомства не было зафиксировано ни одного случая возникновештя аномалии. На основании проведенных исследований можно было считать, что гаметогенез нечувствителен к действию кукумариозида. Несомненный интерес представляет выявленный контрацептивный эффект кукумариозида.

3.5. Использование трптсрпеновых гликозидов для профилактики и лечения вирусных заболеваний

При изучении антивирусной активности тритерпеновых гликозидов проводились как скриншгговые исследования (на вирусах везикулярного стоматита, полиомиелита и др.), при которых антивирусная активность определялась но ингибированию цитопатического эффекта, так и испытания in vivo на мышах (клещевой энцефалит) и на норках, пораженных алеутской болезнью.

Клещевой энцефалит. Исследование препарата КМ проводилось на модели экспериментальной инфекции, индуцированной у неинбредных мышей внутрибрюшинным введением 10 ЛД50 вируса клещевого энцефалита (штаммы "Николаенко" и "155", выделенные в Приморском крае). Была установлена достаточно высокая эффективность КМ как иммуномодулятора для профилактики и лечения клещевого энцефалита, как при профилактической (введение препарата до заражения), так и лечебной (введение - после заражения) схемам.

Лчеутская болезнь порок. Исслсдоваштя лечебного действия кукумариозида проводили на стаде норок из 2.680 самок, пораженных алеутской болезнью, которая является главной причиной падежа, снижения продуктивности норок и ценности их шкурок. В экспериментах использовали препарат КМ и кукумариозид Аг-2 (1). Действие препаратов оценивали по динамике нарастания титра антител при экспериментальном заражении норок штаммом П-1 вируса алеутской болезни.

В дальнейшем, действие этих препаратов было проверено в ряде зверохозяйств Приморского края при различных показаниях на поголовье более 1.000.000 норок. Полученные при этом данные позволили рекомендовать эти препараты для широкого применения в ветеринарии при алеутской болезни, с профилактической целью для повышения резистентности и увеличения продуктивности здоровых и

больных норок, а также при других заболеваниях. Применение КМ увеличивало плодовитость на 0,7 - 1,4 щенка, сокращало падеж щенков в 1,7 - 2,2 раза, повышало сохранность при диарее, абсцессах и др. случаях, снижало зараженность норок алеугской болезнью (на 20 %), увеличивало число благополучных щенений, сокращало процент мертворожденных щенков.

Результаты исследований позволили предположить, что лечебное и профилактическое действие кукумариозидов обуславливается двумя механизмами действия: во-первых, усиливается взаимодействие Т- и В-лимфоцитов и гуморальный ответ у животных, благоприятно влияющий на пролиферацию стволовых клеток; во-вторых, наблюдается противовирусная защита на стадии взаимодействия вирус -клетка. Высокая эффективность препарата в низких концентрациях (10"', 10"5 мкг/кг) указывала на возможное гормоноподобное действие препарата.

Препарат был разрешен к применению Главным управлением ветеринарии. Был, также, получен патент: "Средство для профилактики и лечения алеутской болезни норок"'.

*********

Основываясь на результатах изучешш иммуномодулирующих свойств тритерпеновых гликозидов ! мо гурии Cuctimaria japónica и крупномасштабных промышленных испытаний. Департамент ветеринарии Министерства сельского хозяйства н продовольствия Российской Федерации утвердит в 1995 г "Наставление по применению кукумариозида (К,'О в ветеринарии". Ныло констатировано, что препарат обладает иммуномодулирующим, а;ц>ювантным и адапгогеппым действием и способствует нормализации белкового и \глепо;оюго обмена у животных. Он был рекомендован для применения в качестве иммуно-моду.тирующего и биостимулирутощего средства при заболеваниях, сопровождающихся понижением иммунитета у молодняка сельскохозяйственных животных, в том числе норок, поросят, телят, свиней, собак. Отмечалось, что КД в рекомендуемых дозах не вызывает осложнений и не оказывает побочного действия. Препарат зарегистрирован в Департаменте ветеринарии Министерства сельского хозяйства и продовольствия Российской Федерации ''а № ГТВР2.01.0001-95 от 29 мая 1995 г. и получил государственное регистрационное удостоверение № Р004-2 0105.

5. ВЫВОДЫ

1. Разработаны общие подходы к выделению суммарных гликозидных фракций и

индивидуальных соединений из экстрактов голотурий отряда Венс1гос1нго1тс1а. Они основаны на широком использовании гидрофобной, адсорбционной колоночной и тонкослойной хроматографии, а также хроматографии на обращенной фазе, включая жидкостную высокого давления и тонкослойную на закрепленном слое силанизированного силикагеля.

2. Из спиртовых экстрактов 11 видов голотурий, принадлежащих к семействам Сиситагпс1ае, БскгоёайуНёае и Р1ту11ор1юпс1ае отряда Вепс1госЫгоис1а, выделено 45 тритерпеновых гликозидов. Строение 39 гликозидов было установлено впервые, а 6 гликозидов были идентифицированы с ранее известными соединениям. Для этого использовали как физические, так и химические методы исследования.

3. Впервые в голотуриях найдены тритерпеновые гликозиды с нечетным числом

мопосахаридных остатков в углеводной цепи. Показано, что именно такие соединения составляют основную часть изученных гликозидов голотурий о гряда Беп(1госЫгои(1а. Впервые выделены гликозиды с ацетатной группой, тремя сульфатными группами в пентасахаридной углеводной цепи, с двумя хиновозными остатками. Всего установлено строение 14 новых вариантов углеводных цепей гликозидов голотурий.

4. Впервые найдены и химически изучены тритерпеновые гликозиды голотурий с

частично деалкидировашплми в боковой цепи тригерпеноидами в качестве агликонов, в том числе гликозиды с 22,23,24,25,26,27-гексанорланостаповыми агликонами и серия гликозидов с 18(16)-лактон-23,24,25,26,27-пентанор-ланоста-7,20(22)-диен-ЗР-олом в качестве агликона. Показано, что агликон фрондозида С является ланостановым производным, окисленным в положения 20 и 22. Всего установлено строение 13 новых агликонов гликозидов.

5. Проведен анализ таксономического распределения тритерпеновых гликозидов

голотурий отряда БепскосЫгоШа. Показано, что уровень таксономической специфичности этих соединений для разных таксонов не одинаков. В некото-

рых случаях роду или группе близкородственных родов соответствует определенный гликозид или 2-3 таких соединения, в других - у отдельных видов голотурий имеется свой характерный набор гликозидов. Показано, что кладоло-зиды А и В могут служить одним из таксономических маркеров голотурий рода Cladotabes.

6. При изучении хгошческого строения гликозидов голотурий Cucumaria frondosa и

Cucumaria japónica установлено, что они являются самостоятельными видами, содержащими специфичный для каждой голотурии набор тритерпеновых гликозидов. Полученные данные опровергают мнение о том, что Cucumaria japónica является подвидом или вариететом голотурии Cucumaria frondosa и были использованы биологами-систематиками для окончательного решения проблемы соотношения этих видов. Показано, что для голотурий рода Cucumaria общим таксономическим признаком является не строение тритерпеновых гликозидов в целом, а набор содержащихся в них углеводных цепей.

7. На основе анализа структур агликонов тритерпеновых гликозидов сделано пред-

положение, что голотурии отряда Dendrochirotída наиболее близки к предковым формам этих беспозвоночных. Это предположение основано на наличии в голотуриях отряда Dendrochirotída гликозидов с агликонами более близкими rio строешпо к биосинтетическим предшественникам этой группы веществ, а также на значительно большем разнообразии структур гликозидов в дендро-хиротидах по сравнению с животными, принадлежащими к другим отрядам.

8. Установлено, что кукумариозиды оказывают профилактическое и лечебное действие при поражении организма ионизирующими излучениями. Как при профилактическом (до облучения), так и при лечебном (после облучения) введении кукумариозиды увеличивали выживаемость подопытных животных.

9. Продолжено изучите иммуномодулирующей и адьювантной активности куку-

мариозидов из голотурии Cucumaria japónica. Установлена зависимость имму-номодулирующих свойств кукумариозидов от элементов строения углеводных цепей. Показана перспективность использования гликозидов голотурии Cucumaria japónica в качестве средства, усиливающего протективное действие

вакцин и естественную резистентность организма к инфекциям, вызываемым грамотрицательными бактериями. Показано, что кукумариозиды проявляют иммуностимулирующую активность при заболеваниях, вызывающих вторичный иммунодефицит. Выполненные исследования и промышленные испытания, проведенные на норках, свиньях, собаках и других животных позволили создать ветеринарный препарат (КД) для профилактики и лечения различных заболеваний, защищенный патентами Российской федерации и разрешенный к применению в России. КД характеризуют высокая эффективность при низких дозах, отсутствие токсичности и вредных побочных эффектов, а также относительная простота получения при надежной сырьевой базе. Препарат зарегистрирован в Департаменте ветеринарии Министерства сельского хозяйства и продовольствия Российской Федерации за № ПВР2.01.0001-95 от 29 мая 1995 г. и получил государственное регистрационное удостоверите № Р004-2.0105.

Основные публикации по теме диссертации:

1. Капиновский А.И., Авилов С.А., Степанов В.Р., Стоник В.А. Гликозиды морских

беспозвоночных. ХХГП. Курилогешш - новый гешш из гликозидов голотурии Duasmodactyla kurilensis // Химия природ, соедин. 1983. № 6. С. 724 - 727.

2. Авилов С.А., Тшценко Л.Я., Стоник В.А. Строение кукумариозида А?-2 -тритерпенового гликозида из голотурии Ciicumaria japónica И Химия природ, соедин. 1984. № б. С. 799 - 800.

3. Шарыпов В.Ф., Калиновский А.И., Стошж В.А., Авилов С.А., Еляков Г.Б Выделите нативных агликонов из тритерпеновых гликозидов тихоокеанской голотурии Cucumaría japónica II Химия природ, соедин. 1985. № 1. С. 55 - 59.

4. Купера Е.В., ''Панков Ю.Л., Кузнецова Т.А., Авилов С.А., Тшценко Л.Я., Анисимов М.М., Малей С.М. Способ получения тритерпеновых гликозидов, обладающих антифунгалыюй активностью // Авт. свидетельство № 1166371 от 01.03.1985.

5. Авилов С.А., Стошж В.А. Новые тритерпеновые гликозиды из голотурии Cladolabes sp. // Химия природ, соедин. 1988. № 5. С. 764 - 765.

6. Авилов С.А., Калгаювский А.И. Новый тритерпеновый агликон из голотурии

Duasmodactyla hirilensis И Химия природ, соедин. 1989. № 3. С. 359 - 361.

7. Седов A.M., Аполлошш А.В., Севастьянова Е.К., Алексеева И.А., Батраков С.Г.,

Саканделидзе О.Г., Лиходед В.Г., Стоник В.А., Авилов С.А., Кутюра Е.В. Стимуляция тритерпеновыми гликозидами голотурий неспецифической антибактериальной резистентности' мышей к условно-патогенным грамотри-цательным микроорганизмам // Антибиотики и химиотерапия. 1990. Т. 35. № 1. С. 23 - 26.

8. Авилов С.А., КалиновскшЧ А.И., Стоник В.А. Новый тритерпеновый гликозид

из голотурии Neothionidium magnum // Химия природ, соедин. 1990. № 1. С. 53 -57.

9. Калшшн В.И., Стоник В.А., Авилов С.А. Гомологическая изменчивость и нап-

равленность в эволюции тритерпеновых гликозидов голотурий (Ilolothurioidea, Echinodermata) // Ж. общей биологии. 1990. Т. 51. № 2. С. 245 - 260.

10. Гришин Ю.И., Беседнова Н.Н., Стоник В.А., Ковалевская A.M., Авилов С.А. Регуляция гемопоэза и иммуногенеза тритерпеновыми гликозидами из голотурий // Радиобиология. 1990. Т. 30. Вып. 4. С. 556.

11. Авилов С.А., Стошпс В.А., Калгаювский А.И. Строение четырех новых -тритерпеновых гликозидов из голотурии Cucumaria japonica II Химия природ, соедин. 1990. № 6. С. 787 - 792.

12. Гришин Ю.И., Ковалевская A.M., Стошпс В.А., Авилов С.А., Плазнев В.П., Слутин B.C. Иммуностимуляторы для звероводства КМ и КМ-2 // Новости тероводства. 1991. № 2. С. 19 - 23.

13. Авилов С.А., Кашшовский А.И., Стошпс В.А. Два новых тритерпеновых гликозида из голотурш! Duasmodactyla hirilensis II Хтптя природ, соедин. 1991. №2. С. 221 -226.

14. Авилов С.А., Калинин В.И., Калгаювский А.И., Стошпс В.А. Кукумариозид G2 -шторный тритерпеновый гликозид из голотурии Eupentacta fraudatrix II Химия природ, соедин. 1991. № 3. С. 438-439.

15. Kalinin V.I., Volkova O.V., Likhatskaya G.N., Prokofieva N.G., Agafonova I.G., Anisimov M.M., Kalinovsky A.I., Avilov S.A., Stonik V.A. Hemolytic activity of

triterpene glucosides from the Cucumariidae family holothurians and evolution of this group of toxins // J. Nat. Toxins. 1992. V. 1. № 2. P. 17 - 30.

16. Дроздова O.A., Авилов C.A., Кашшовский А.И., Стошж В.А. Новый ацети-лировапный гликозид из голотурии Cucumaria japónica II Химия природ, соедии. 1992. №5. С. 590-591.

17. Дроздова О.А., Авилов С.А., Калиновский А.И., Стошж В.А. Минорный гликозид из голотурии Cucumaria japónica II Хилом природ, соедин. 1992. № 5. С. 593.

18. Авилов С.А., Калинин В.И., Калиновский А.И., Стоник В.А., Мильгром Ю.М., Рашкес Я.В. Кукумариозид G4 - новый тритерпеновый гликозид из голотурии Eupentacta fraudatrix II Химия природ, соедин. 1992. № 6. С. 691 - 694.

19. Калинин В.И., Авилов С.А., Кашшовский А.И., Стошж В.А. Кукумариозид G3 -минорный тритерпеновый гликозид из голотурии Eupentacta fraudatrix И Химия природ, соедин. 1992. № 6. С. 729 - 730.

20. Дроздова О.А., Авилов С.А., Калиновский А.И., Стошж В.А., Мильгром Ю.М., Рашкес Я.В. Новые гликозиды из голотурии Cucumaria japónica II Химия природ, соедин. 1993. № 2. С. 242 -248.

21. Авилов С.А., Калинин В.И., Дроздова OA, Калиновский А.И., Стоник В.А., Гудимова Е.Н. Тритерпеновые гликозиды голотурии Cucumaria frondosa И Химия природ, соедин. 1993. № 2. С. 260 - 263.

22. Дроздова О.А., Авилов С.А., Калиновский А.И., Сгошж В.А., Мильгром Ю.М., Рашкес Я.В. Трисульфатированные гликозиды из голотурии Cucumaria japónica II Химия природ, соедин. 1993. № 3. С. 369 - 374.

23. Avilov S.A., Kalinin V.I., Makarieva T.N., Stonik V.A., Kalinovsky A.l. Structure of cucumarioside G2, a novel nonholostane glycoside from the sea cucumber Eupentacta fraudatrix II J. Nat. Prod. 1994. V. 57. № 8. P. 1166 - 1171.

24. Гришин Ю.И., Ковалевская A.M., Стошж В.А., Авилов C.A., Влазнев В.П., Слутин B.C. Средство для профилактики и лечения алеутской болезни норок // Патенг№ 2036654 от 09.09.1995. Б.И. 1995. №16.

25. Kalinin V.I., Prokofieva N.G., Likhatskaya G.N., Shentsova E.B., Agalonova I.G., Avilov S.A., Drozdova O.A. Hemolytic activities of triterpene glycosides from the

holothurian order Dendrochirotida: some trends in the evolution of this group of toxins U Toxicon. 1996. V. 33. № 4. P. 475 - 483.

26. Kalinin V.I., Prokofleva N.G., Likhatskaya G.N., Shentsova E.B., Agafonova I.G., Avilov S.A., Drozdova O.A. Hemolitic activity of triterpene glycosides from the Dendrochirotida order Holothurian // Saponins used in traditional and modem medicine / Ed. Waller G.R., Yamasaki K. N.Y.: Plenum Press. 1996. P. 557 - 564.

27. Kalinin V.I., Anisimov M.M., Prokofleva N.G., Avilov S.A., Afiyatullov Sh.Sh., Stonik V.A. Biological activities and biological role of triterpene glycosides from holothuroids (Echinodennata) // Echinoderm studies / Ed. Jangoux M., Lawrense J.V. Rotterdam, Brookfield: A.A.Balckema, 1996. V. 5. P. 139 - 184.

28. Avilov S.A., Kalinovsky A.I., Stonik V.A., Kalinin V.I., Riguero R., Jimenes C.J. Koreoside A, a new nonholostane triterpene glycoside from the sea cucumber Cucumaria koraiensis H J. Nat. Prod. 1997. V. 60. № 8. P. 808 - 810.

29. Drozdova O.A., Avilov S.A., Kalinin V.I., Kalinovsky A.I., Stonik V.A., Riguera R., Jimenez C. Cytotoxic triterpene glycosides from far eastern sea cucumbers belonging to the genus Cucumaria II Liebigs Ann. 1997. № 11. P. 2351 - 2356.

30. Avilov S.A., Drozdova O A., Kalinin V.I., Kalinovsky A.I., Stonik V.A., Gudimova E.N., Riguero R., Jimenes C. Frondoside C, a new nonholostane triterpene glycoside from the sea cucumber Cucumaria frondosa : structure and cytotoxicity of its desulfated derivative // Can. J. Cliem. 1998. V. 76. № 2. P. 137 - 141.

31. Стоник B.A., Авилов С.А., Федоров С.II., Богуславский В.М. Способ получения суммы тритерпеновых гликозидов (варианты) // Патент РФ № 2110522 от 10.05.98 г. Б.И. 1998. № 13.

32. Стоник В.А., Авилов С.А., Калинин В.И. Биологически активные вещества из голотурий (морских кубышек) // Успехи в изучении природных соединений. Владивосток: Дальнаука, 1999. С. 105 - 123.

33. Stonik V.A., Kalinin V.I., Avilov S.A. Toxins from sea cucumbers (Holothuroids): chemical structures, properties, taxonomic distribution, biosynthesis and evolution // J. Nat. Toxins. 1999. V. 8. № 2. P. 235 - 248.

34. Avilov S.A., Antonov A.S., Drozdova O.A., Kalinin V.I., Kalinovsky A.I., Stonik V.A., Riguera R., Lenis L.A., Jimenez C. Triterpene glycosides from the Far-

Eastern sea cucumber l'allumera calcigera. 1 Monosulfated glycosides and cytotoxicity of their unsulfated derivatives // .1. Nat. Prod, 2000. V. 63. № I. P. 65 - 71.

35. Kalinin V.I.. Avilov S.A., Stonik V.A. Triterpene glycosides from sea cucumbers (Holothurioidea): structure, function and evolution // Saponins in Food, Feedstuffs and Medicinal Plants / Ed. Oleszek W.. Marston A. Dordrecht, Boston, London: Kluwer Academic Publishers. 2000. P. 155 - 162.

36. Avilov SA.. Antonov A.S., Drozdova O.A.. Kalinin V.I., Kalinovsky A.I.. Stonik V.A., Riguera R., Lenis L.A., Jimenez C. Triterpene glycosides from the Far-Eastern sea cucumber Pentamera calcigera. LI. Disulfated glycosides // J. Nat. Prod. 2000. V. 63. № 10. P. 1349 - 1355.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

СТРОЕНИЕ И ТАКСОНОМИЧЕСКОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ

ТРИТЕРПЕНОВЫХ ГЛИКОЗИДОВ ГОЛОТУРИЙ

2.1. Введение.

2.2. Гликозиды голотурий семейства Но1оШигнс1ае отряда \spidoehirotida.

2.2.1. Голотурины.

2.2.2. Бохадшиозиды.

2.2.3. Таксономическое распределение тритерпеновых гликозидов в голотуриях семейства Но1оЙшгМае.

2.3. Гликозиды голотурий семейства 8^с1юро<Шае отряда .\spidochirotida.

2.3.1. Теленотозиды и стихопозиды.

2.3.2. Голотоксины.

2.3.3. Таксономическое распределение тритерпеновых гликозидов в голотуриях семейства .ЧиеИоросМае.

2.4. Гликозиды голотурий отряда Бег^госЫгоШа.

2.4.1. Гликозиды голотурий семейства Сиеипшпн1ае.

2.4.2. Гликозиды голотурий семейства 8с1егос1ас1уШае.

2.4.3. Гликозиды голотурий семейства РЬ\ ПорЬопскю.

2.4.4. Гликозиды голотурий семейства РяоМае.

2.5. Гликозиды голотурий отряда \Iolpadiida.

2.6. Гликозиды голотурий отряда СерЫгоШиг^а.

2.7. Гликозиды голотурий отряда 8шарис1а ( = Apodida ).

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

3.1. Введение.

3.2. Получение суммарных гликозидных фракций из экстрактов голотурий и выделение индивидуальных соединений.

3.2.1. Введение.

3.2.1. Получение суммарных фракций тритерпеновых гликозидов голотурий . 54 3.2.1. Получение индивидуальных тритерпеновых гликозидов голотурий.

3.3. Гликозиды голотурий семейства Cucumariidae.

3.3.1. Гликозиды голотурий рода Cucumaria подсемейства Cucumariinae.

3.3.1.1. Гликозиды голотурии Cucumaria japónica.

3.3.1.1.1. Кукумариозиды групп А2 и A4.

3.3.1.1.2. Кукумариозиды групп Ао и А\

3.3.1.1.3. Дисульфатированные кукумариозиды групп А3 и А6.

3.3.1.1.4. Трисульфатированные кукумариозиды группы А7.

3.3.1.2. Гликозиды голотурии Cucumaria frondosa.

3.3.1.2.1. Моносульфатированные гликозиды.

3.3.1.2.2. Трисульфатированные гликозиды.

3.3.1.3. Гликозиды голотурии Cucumaria miniata.

3.3.1.4. Гликозиды голотурии Cucumaria koraiensis.

3.3.1.5. Гликозиды голотурии Cucumaria sp.

3.3.1.5.1. Кукумариозиды группы А;.

3.3.1.5.2. Кукумариозиды группы A3.

3.3.1.5.3. Кукумариозиды группы А:.

3.3.2. Гликозиды голотурии Duasmodactyla kurilensis подсемейства Thionidiinae.

3.4. Гликозиды голотурий семейства Sclerodactylidae.

3.4.1. Гликозиды голотурий рода Eupentacta подсемейства Sclerodactylinae.

3.4.1.1. Гликозиды голотурии Eupentacta fraudatrix.

3.4.1.1.1. Кукумариозид Ai.

3.4.1.1.2. Кукумариозиды группы F.

3.4.1.1.3. Минорные кукумариозиды группы G.

3.4.1.1.4. Минорные кукумариозиды группы Н.

3.4.2. Гликозиды голотурий рода Cladolabes подсемейства Cladolabinae.

3.4.2.1. Гликозиды голотурии Cladolabes sp.

3.4.2.2. Гликозиды голотурии Cladolabes bifurca tus.

3.5. Гликозиды голотурий семейства Phyllophoridae.

3.5.1. Гликозиды голотурии Neothyonidium та gnu т.

3.5.2. Гликозиды голотурии Pentamera caícigera.

3.5.2.1. Кальцигерозид В.

3.5.2.2. Кальцигерозиды группы С.

3.5.2.3. Кальцигерозиды группы D.

3.5.2.4. Кальцигерозид Е.

3.6. Тритерпеновые гликозиды и вопросы хемосистематики голотурий отряда Dendrochirotida.

3.6.1. Введение.

3.6.2. Таксономическое распределение гликозидов в голотуриях отряда Dendrochirotida.

3.6.3. Тритерпеновые гликозиды голотурий рода Cladolabes.

3.6.4. Тритерпеновые гликозиды и таксономические отношения голотурий Cucumaria frondosa и Cucumaria japónica.

3.6.5. Тритерпеновые гликозиды и таксономические отношения голотурий рода Cucumaria семейства Cucumariidae.

3.6.6. Об относительной таксономической древности отряда Dendrochirotida и возможных направлениях и этапах биосинтеза тритерпеновых гликозидов голотурий.

3.7. Физиологическая активность гликозидов голотурии Cucumaria japónica и перспективы их практического применения.

3.7.1. Введение.

3.7.2. Мембранолитическая активность.

3.7.3. Иммуномодулирующие свойства.

3.7.4. Радиозащитное действие.

3.7.5. Исследование мутагенных, генотоксических и эмбриотоксических свойств.

3.7.6. Использование тритерпеновых гликозидов для профилактики и лечения вирусных заболеваний.

4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

4.1. Приборы и материалы.

4.2. Биологический материал.

4.2.1. Семейство Cucumaiidae, отряд Dendrochirotida.

4.2.2. Семейство Sclerodactylidae, отряд Dendrochirotida.

4.2.2. Семейство Sclerodactylidae, отряд Dendrochirotida.

4.3. Стандартные методики.

4.3.1. Моносахаридный анализ.

4.3.2. Сольволитическое десульфатирование.

4.3.3. Метилирование по Хакомори.

4.3.4. Периодатное окисление.

4.3.5. Определение положения сульфатных групп.

4.3.5. Распад по Смиту.

4.4. Установление строения гликозидов.

4.4. ]. Гликозиды голотурии Cucumaria japónica.

4.4.2. Гликозиды голотурии Cucumaria frondosa.

4.4.3. Гликозиды голотурии С'натшпа mmiaia.

4.4.4. Гликозиды голотурии Cucumaria koraensis.

4.4.5. Гликозиды голотурии С uatmaria sp.

4.4.6. Гликозиды голотурии Duasmodactyfa kurilensis.

4.4.7. Гликозиды голотурии Eupentacía fraudalnx.

4.4.8. Гликозиды голотурии Chulolahcs sp.

4.4.9. Гликозиды голотурии C.ladolabes bifurcaius.

4.4.10. Гликозиды голотурии Neothyonidium magnum.

4.4.11. Гликозиды голотурии Pentamera calcigera.

5. ВЫВОДЫ.

Актуальность проблемы. Представители класса голотурий (класс Holothurioidea, тип Echinodermata) - "морских кубышек" - широко распространены по всему Мировому океану от Арктики до берегов Антарктиды и от литорали до глубины 11 км во всех океанах и морях с нормальной соленостью воды. Многие голотурии являются ведущими видами биоценозов, а на больших глубинах, где они часто бывают господствующей группой, их общий вес может достигать до 90 % от суммарной биомассы. Голотурии детритофаги существенно трансформируют верхний слой грунта, пропуская его через свой кишечник. Сами голотурии служат пищей для донных рыб и других беспозвоночных.

Более 70 видов голотурий, в основном тропических, употребляются в пищу человеком и используются в традиционной восточной медицине. Кукумария японская (Cucumaria japónica), кукумария фрондоза (Cucnmaria frondosa) и дальневосточный трепанг (.Apostichopus japonicus) являются в нашей стране объектами промысла.

Отличительной чертой голотурий является наличие в них биологически активных веществ - тритерпеновых гликозидов, свойственных преимущественно растениям и не встречающихся в других высокоорганизованных животных. Гликозиды голотурий имеют характерные особенности химического строения, отличающие их от всех известных растительных соединений этого класса.

Тритерпеновые гликозиды, открытые в голотуриях и определяющие биологическую активность их экстрактов, привлекли внимание химиков-природников, фармакологов и биохимиков еще в конце сороковых, начале пятидесятых годов. Начатые тогда исследования не прерываются до настоящего времени. Помимо нашей группы, продолжают работу в этой области научно-исследовательские группы из Испании, Дании, Японии, Канады, а статьи, посвященные этим веществам, публикуются в ведущих научных журналах мира. Этот интерес во многом определяется самой разнообразной биологической активностью тритерпеновых гликозидов голотурий. Для них установлено гемолитическое и ихтиотоксическое, антигрибковое и противоопухолевое действие, а в последние годы открыты иммуностимулирующие, адьювантные и радиопротекторные свойства. В то же время изучение биологической роли и физиологической активности этих соединений и создание на их основе новых лекарственных средств и биопрепаратов невозможны без знания полных структур этих соединений.

К началу 80-х гг. были хорошо изучены гликозиды только одного отряда голотурий - отряда Aspidochirotida, представители которого широко распространены в тропических морях на небольших глубинах.

Настоящая работа посвящена изучению гликозидов голотурий отряда Dendrochirotida. Этот отряд - один из самых многочисленных в классе Holothu-rioidea (более 70 родов, 7 семейств) - оставался неизученным. В то же время к нему относятся, например, такие крупные и массовые голотурии как Cucumaria japónica и Cucumaria frondosa, имеющие существенное промысловое значение.

К началу наших исследований были опубликованы только данные о строении двух агликонов и сведения о том, что гликозиды голотурий этого отряда обладают биологической активностью. В то же время, скрининговые работы, проведенные в 70-е годы, показали существенное отличие гликозидов голотурий этого отряда от гликозидов других отрядов как по строению агликонов, так и по строению углеводных цепей.

Наш интерес к гликозидам голотурий определялся также тем, что эти вещества обладают определенной таксономической специфичностью и могут быть использованы в качестве признаков для уточнения систематики голотурий и установления путей их эволюции. Вопросы систематики отряда древовиднощупальцевых голотурий (Dendrochirotida) сложны и противоречивы. В частности, чрезвычайно запутана система рода Cucumaria, до последнего времени систематики не были едины в понимании даже объема типового вида этого рода - Cucumaria frondosa.

Целью настоящей работы являлось:

- выделение, установление структуры и изучение свойств тритерпеновых гликозидов из голотурий отряда Dendrochirotida;

- изучение таксономического распределения тритерпеновых гликозидов в голотуриях этого отряда и использование полученных данных в целях решения проблем их систематики;

- выяснение возможности и перспективности использования тритерпеновых гликозидов промысловой голотурии Cucumaria japónica в качестве компонентов лекарственных и ветеринарных препаратов.

Научная новизна и практическая ценность работы. Из спиртовых экстрактов 11 видов голотурий отряда Dendrochirotida было выделено 45 тритерпеновых гликозидов. Для 39 ранее неизвестных гликозидов установлена полная структура, а для 6 соединений проведена структурная идентификация с известными веществами. Установлены структуры новых 13 агликонов и 14 новых вариантов углеводных цепей гликозидов.

Впервые получены гликозиды с принципиально новыми типами агликонов, не относящимися к голостановому ряду. В частности, были выделены гексанорла-ностановые производные без лактонного цикла и пентанорланостановые гликозиды с 18(16)-лактонным кольцом.

Впервые были выделены гликозиды с нечетным числом моносахаридных звеньев в углеводных цепях, в то время как все изученные ранее гликозиды голотурий отряда Aspidochirotida имели четное число моносахаридных остатков.

Впервые из голотурий выделены гликозиды с необычными углеводными цепями, в том числе: содержащие ацетатную группу в углеводной цепи, трисульфа-тированные пентаозиды и гликозиды содержащие два хиновозных остатка.

Установлено, что в голотуриях отряда Dendrochirotida строение гликозидов специфично для видов и, в некоторых случаях, родов, в то время как для представителей отряда Aspidochirotida гликозиды специфичны на уровне рода или групп родов.

Впервые показаны достоверные отличия в гликозидном составе голотурий Cucumaria japónica и Cucumaria frondosa, что дало возможность подтвердить видовую самостоятельность Cucumaria japónica.

Показано, что диагностическим химическим признаком рода Cucumaria является строение углеводных цепей тритерпеновых гликозидов, в то время как строение агликонов является видоспецифичным.

Получение в ходе данной работы серий веществ, различающихся как по строению углеводных цепей, так и по строению агликонов, позволило провести различные биоиспытания. Были получены данные о влиянии особенностей строения гликозидов (моносахаридного состава, числа и положения сульфатных групп, наличия кетогруппы в агликоне) на гемолитическую активность и выход ионов К+ из эритроцитов, а также на лизосомальную активность макрофагов.

При биологических испытаниях препаратов, полученных в ходе данной работы на основе тритерпеновых гликозидов из голотурии Cucumaria japónica, показана способность этих веществ усиливать иммунный ответ и стимулировать неспеци-фигческую устойчивость к бактериальным и вирусным инфекциям. Введение соответствующих препаратов животным улучшали показатели кроветворной и иммунной систем. Данные препараты не индуцировали генные мутации и не обладали ДНК-повреждающей активностью. Прошел промышленные испытания и был разрешен к применению в России ветеринарный препарат "КД", созданный на основе гликозидов промысловой голотурии Cucumaria japónica.

Публикация результатов исследования. Основные результаты настоящего исследования опубликованы в таких научных журналах как: Химия природных соединений, Journal of Natural Products (Lloydia), Canadian Journal of Chemistry, Journal of Natural Toxins, Liebigs Annalen Chemie, Toxicon, Антибиотики и химиотерапия, Журнал общей биологии, Новости звероводства, Радиобиология,. Кроме того, отдельные части работы были опубликованы в материалах Всесоюзных и Международных конференций, симпозиумов и совещаний.

По теме диссертации опубликована 51 работа, в том числе 32 статьи и глава в международном сериальном издании "Echinoderm Studies". Получено авторское свидетельство СССР и два патента Российской федерации.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из Введения, Литературного обзора, в котором дан обзор структур тритерпеновых гликозидов

5. ВЫВОДЫ

1. Разработаны общие подходы к выделению суммарных гликозидных фракций и индивидуальных соединений из экстрактов голотурий отряда Оепс1госЬ|гойс1а. Они основаны на широком использовании гидрофобной, адсорбционной колоночной и тонкослойной хроматографии, а также хроматографии на обращенной фазе, включая жидкостную высокого давления и тонкослойную на закрепленном слое силанизированного силикагеля.

2. Из спиртовых экстрактов 11 видов голотурий, принадлежащих к семействам Сисшпашёае, 8с1егос1ас1уНс1ае и РЬуИорЬопёае отряда Оепс1госЫгойс1а, выделено 45 тритерпеновых гликозидов. Строение 39 гликозидов было установлено впервые, а 6 гликозидов были идентифицированы с ранее известными соединениями. Для этого использовали как физические, так и химические методы исследования.

3. Впервые в голотуриях найдены тритерпеновые гликозиды с нечетным числом моносахаридных остатков в углеводной цепи. Показано, что именно такие соединения составляют основную часть изученных гликозидов голотурий отряда □епс1госЫгоПс1а. Впервые выделены гликозиды с ацетатной группой, тремя сульфатными группами в пентасахаридной углеводной цепи, с двумя хиновоз-ными остатками. Всего установлено строение 14 новых вариантов углеводных цепей гликозидов голотурий.

4. Впервые найдены и химически изучены тритерпеновые гликозиды голотурий с частично деалкилированными в боковой цени тритерпеноидами в качестве агликонов, в том числе гликозиды с 22,23,24,25,26,27-гексанорланостановыми агликонами и серия гликозидов с 18(16)-лактон-23,24,25,26,27-пентанорланоста-7,20(22) - д и е н - 3 [3 - о л о м в качестве агликона. Показано, что агликон фрондозида С является ланостановым производным, окисленным в положения 20 и 22. Всего установлено строение 13 новых агликонов гликозидов.

5. Проведен анализ таксономического распределения тритерпеновых гликозидов голотурий отряда ВепскосЬиойёа. Показано, что уровень таксономической специфичности этих соединений для разных таксонов не одинаков. В некоторых случаях роду или группе близкородственных родов соответствует определенный гликозид или 2-3 таких соединения, в других - у отдельных видов голотурий имеется свой характерный набор гликозидов. Показано, что кладоло-зиды А и В могут служить одним из таксономических маркеров голотурий рода Cladolabes.

6. При изучении химического строения гликозидов голотурий Cucumaria frondosa и Cucumaria japónica установлено, что они являются самостоятельными видами, содержащими специфичный для каждой голотурии набор тритерпеновых гликозидов. Полученные данные опровергают мнение о том, что Cucumaria japónica является подвидом или вариететом голотурии Cucumaria frondosa и были использованы биологами-систематиками для окончательного решения проблемы соотношения этих видов. Показано, что для голотурий рода Cucumaria общим таксономическим признаком является не строение тритерпеновых гликозидов в целом, а набор содержащихся в них углеводных цепей.

7. На основе анализа структур агликонов тритерпеновых гликозидов сделано предположение, что голотурии отряда Dendrochirotida наиболее близки к предковым формам этих беспозвоночных. Это предположение основано на наличии в голотуриях отряда Dendrochirotida гликозидов с агликонами более близкими по строению к биосинтетическим предшественникам этой группы веществ, а также на значительно большем разнообразии структур гликозидов в дендрохиротидах по сравнению с животными, принадлежащими к другим отрядам.

8. Установлено, что кукумариозиды оказывают профилактическое и лечебное действие при поражении организма ионизирующими излучениями. Как при профилактическом (до облучения), так и при лечебном (после облучения) введении кукумариозиды увеличивали выживаемость подопытных животных.

9. Продолжено изучение иммуномодулирующей и адьювантной активности куку-мариозидов из голотурии Cucumaria japónica. Установлена зависимость имму-номодулирующих свойств кукумариозидов от элементов строения углеводных

288 цепей. Показана перспективность использования тликозидов голотурии Сиси-maria japónica в качестве средства, усиливающего протективное действие вакцин и естественную резистентность организма к инфекциям, вызываемым грамотрицательными бактериями. Показано, что кукумариозиды проявляют иммуностимулирующую активность при заболеваниях, вызывающих вторичный иммунодефицит. Выполненные исследования и промышленные испытания, проведенные на норках, свиньях, собаках и других животных позволили создать ветеринарный препарат (КД) для профилактики и лечения различных заболеваний, защищенный патентами Российской федерации и разрешенный к применению в России. КД характеризуют высокая эффективность при низких дозах, отсутствие токсичности и вредных побочных эффектов, а также относительная простота получения при надежной сырьевой базе. Препарат зарегистрирован в Департаменте ветеринарии Министерства сельского хозяйства и продовольствия Российской Федерации за № ПВР2.01.0001-95 от 29 мая 1995 г. и получил государственное регистрационное удостоверение № Р004-2.0105.

1. Nigrelli R.F., Chanley J.D., Kohn S., Sobotka H. The chemical nature of holothurin, a toxic principle from the sea cucumber (Echinodermata, Holothurioidea) // Zoologica. 1955. V. 40. № 1. P. 47-48.

2. Yamanouchi T. On the poisonous substance contained in holothurians // Publ. Seto Marine Biol. Lab. 1955. V. 4. P. 184 202.

3. Chanley J.D., Ledeen R., Wax J., Nigrelli R.F., Sobotka H. Holothurin. I. The isolation, properties and sugar components of holothurin A// J. Am. Chem. Soc. 1959. V. 81. № 17. P. 5180-5183.

4. Chanley J.D., Mezzetti Т., Sobotka H. The holothurinogenins // Tetrahedron. 1966. V. 22. № 6. P. 1857- 1884.

5. Habermehl G., Volkwein G. Aglycones of the toxins from the cuvierian organs of Holothuria forskali and a new nomenclature for the aglicones from Holothurioideae // Toxicon. 1971. V. 9. № 4. P. 319 326.

6. Ильин С.Г., Тарнопольский Б.Л., Сафина З.И., Соболев А.Н., Дзизенко А.К., Еляков Г.Б. Кристаллическая и молекулярная структура ацетата 17-дезокси-22,25-оксидо-голотуриногенина // Докл. АН СССР. 1976. Т. 230. С. 860 862.

7. Chanley J. D., Rossi С. The holothurinogenins П. Methoxylated neo-holothurino-genins // Tetrahedron. 1969. V. 25. № 9. P. 1897 - 1909.

8. Chanley J. D., Rossi C. The neo-holothurinogenins III. Neo-holothurinogenins by enzymatic hydrolysis of desulfated holothurin A // Tetrahedron. 1969. V. 25. № 9. P. 1911 - 1920.

9. Стоник В.А., Шарыпов В.Ф., Кузнецова Т.А., Калиновский А.И. Нативные агликоны тритерпеновых гликозидов голотурии Bohadschia argus // Химия природ, соедин. 1982. № 6. С. 790 791.

10. Tursch В., Guimaraes I.S., Gilbert В., Aplm R.T., Duffield A.M., Djerassi С.

11. Chemical studies of marine invertebrates II. Teipenoids - LVIII. Griseogenin, anew triterpenoid sapogenin of the sea cucumber Halodeima grisea L. // Tetrahedron. 1967. V. 23. P. 761 -767.

12. Tursch В., Cloetens R., Djerassi C. Chemical studies of marine invertebrates VI. Terpenoids LXV. Praslinogenin, a new holothurinogenin from the Indian ocean sea cucumber Bohadschia koellikeri // Tetrahedron Lett. 1970. № 7. P. 467 470.

13. Habermehl G., Volkvein G. Uber Gifte der mittelmeerischen Holothurien // Naturwissenschaften. 1968. V. 55. № 2. P. 83 84.

14. Kitagawa I., Nishino T., Matsuno T., Akutsu H., Kyogoku Y. Structure of holothurin В a pharmacologically active triterpene-oligoglycoside from the sea cucumber Hoiothuria leucospilota Brandt // Tetrahedron Lett. 1978. № 11. P. 985 988.

15. Стоник B.A., Чумак А.Д., Исаков В.В., Белогорцева Н.И., Чирва В.Я., Еляков Р.Б. Гликозиды морских беспозвоночных. VII. Строение голотурина В из Hoiothuria atra II Химия природ, соедин. 1979. № 2. С. 522 527.

16. Калинин В.И., Стоник В.А., Авилов С.А., Еляков Е.Б. Еликозиды голотурии Hoiothuria ediilis II Химия природ, соедин. 1981. № 3. С. 403 404.

17. Еляков Е.Б., Калиновская Н.И., Калиновский А.И., Стоник В.А., Кузнецова Т.А. Еликозиды морских беспозвоночных. XIII. Новые голотуриногенины голотурина В. из голотурии Hoiothuria floridana II Химия природ, соедин. 1982. № 3. С. 323 327.

18. Олейникова Г.К., Кузнецова Т.А. Двухступенчатая деградация по Смиту голо-турина Bi из голотурии Holothuria floridana II Химия природ, соедин. 1983. №4. С. 534-536.

19. Олейникова Г.К., Кузнецова Т.А. Гликозиды голотурии Holothuria aira II Химия природ, соедин. 1986. № 5. С. 652.

20. Kitagawa I., Nishino Т., Kyogoku Y. Structure of holothurin A a biologically active triterpene-oligoglycoside from the sea cucumber Holothuria leucospilota Brandt // Tetrahedron lett. 1979. № 16. P. 1419- 1422.

21. Иванова H.C., Сметанина О.Ф., Кузнецова Т.А. Гликозиды морских беспозвоночных. XXVI. Голотурии А из тихоокеанской голотурии Holothuria squami-fera. Выделение нативного агликона // Химия природ, соедин. 1984. № 4. С. 448-451.

22. Олейникова Г.К., Кузнецова Т.А., Калиновский А.И., Стоник В.А., Еляков Г.Б. Голотурин А. новый тритерпеновый гликозид голотурии Holothuria floridana //Химия природ, соедин. 1981. № 1. С. 101 - 102.

23. Калинин В.И., Стоник В.А. Гликозиды морских беспозвоночных. Структура голотурина А2 из голотурии Holothuria edulis 11 Химия природ, соедин. 1982. №2. С. 215-219.

24. Kitagawa I., Kobayashi M., Kyogoku Y. Marine natural products. IX. Structural elucidation of triterpenoidal oligoglycodides from the bachamean sea cucumber Actinopyga agassizi Selenka // Chem. Pharm. Bull. 1982. V. 30. JM° 6. P. 2045 -2050.

25. Bhatnagar S., Dudouet B., Ahond A., Poupat C., Thoison O., Clastres A., Laurent D., Potier P. Invertebres marins du lagon neocaledonien IV. Saponines et sapogenines d'une holothurie, Actinopyga flammea II Bull. Chim. France. 1985. № 1. P. 124 129.

26. Rodriguez J., Castro R., Riguera R. Holothurinosides: new antitumor non sulphated triterpenoid glycosides from the sea cucumber Holothuria forskalii II Tetrahedron. 1991. V. 47. № 26. P. 4753 4762.

27. Kitagawa I., Kobayashi M., Hon M., Kyogoku Y. Structures of four new triterpenoidal oligoglycosides, bivittoside A, B, C, and D, from the sea cucumber Bohad-schia bivittata Mitsukuri // Chem. Pharm. Bull. 1981. V. 29. № 1. P. 282 285.

28. Антонов А.С., Стоник В.А. Гликозиды голотурий рода Bohadschia II Химия природ, соедин. 1986. № 3. С. 379 380.

29. Калинин В.И., Стоник В.А. Гликозиды голотурии Bohadschia graeffei 11 Химия природ, соедин. 1982. № 6. С. 789 790.

30. Иванова Н.С., Кузнецова Т.А. Голотурии А основной тритерпеновый глико-зид юовьеровых органов голотурии Bohadschia graeffei // Химия природ, соедин. 1985. № 1. С. 123 - 124.

31. Elyakov G.B., Stonik V.A., Levina E.V., Slanke V.P., Kuznetsova T.A., Levin V.S. Glycosides of marine invertebrates -I.A comparative study of the glycoside fraction of Pacific sea cucumbers // Сотр. Biochem. Physiol. 1973. V. 44B. P. 325 336.

32. Elyakov G.B., Kuznetsova T.A., Stonik V.A., Levin V.S., Albores R. Glycosides of marine invertebrates IV. A comparative study of the glycosides from cuban sublitttoral holothurians // Сотр. Biochem. Physiol. 1975. V. 52B. P. 413 - 417.

33. Левин B.C., Калинин В.И., Стоник В.А. Опыт использования химических признаков при пересмотре таксономического статуса голотурии Bohadschia graejfei с выделением нового рода // Биология моря. 1984. № 3. С. 33 38.

34. Rothberg I., Tursch В.М., Djerassi С. Terpenoids. LXVIII. 23^-acetoxy-17-deoxy-7,8-dihidroholothurinogenin, a new triterpenoid sapogenin from a sea cucumber // J. Org. Chem. 1973. V. 38. № 2. P. 209 214.

35. Стоник В.А., Шарыпов В.Ф., Калиновский А.И., Еляков Г.Б. Строение нативных генинов и миграция двойной связи в тритерпеновых гликозидах голотурий семейства Stichopodidae // Докл. АН СССР. 1979. Т. 245. № 5. С.1133 1134.

36. Калиновский А.И., Шарыпов В.Ф., Стоник В.А., Дзизенко А.К., Еляков Г.Б. Спектроскипия 13С-ЯМР агликонов гликозидов голотурий // Биоорг. химия. 1980. Т. 6. № 1. С. 86-89.

37. Еляков Г.Б., Стоник В.А., Афиятуллов Ш.Ш., Калиновский А.И., Шарыпов В.Ф., Коротких Л.Я. Нативные генины из гликозидов голотурий // Докл. АН СССР. 1981. Т. 259. № 6. С. 1367 1369.

38. Шарыпов В.Ф., Чумак А.Д., Стоник В.А., Еляков Г.Б. Гликозиды морских беспозвоночных. X. Строение стихопозидов А и В голотурии Stichopus chloronotus II Химия природ, соедин. 1981. № 2. С. 181 184.

39. Стоник В.А., Мальцев И.И., Еляков Г.Б. Строение теленотозидов А и В из голотурии Thelenota ananas II Химия природ, соедин. 1982. № 5. С. 624 627.

40. Стоник В.А., Мальцев И.И., Калиновский А.И., Кондэ К., Еляков Г.Б. Гликозиды морских беспозвоночных. XI. Два новых тритерпеновых гликозидаиз голотурий сем. Stichopodidae II Химия природ, соедин. 1982. № 2. С. 194- 199.

41. Мальцев И.И., Стоник В.А., Калиновский А.И. Стихопозид Е новый тритер-пеновый гликозид из голотурий сем. Stichopodidae П Химия природ, соедин. 1983. №3. С. 308 - 312.

42. Стоник В.А., Мальцев И.И., Калиновский А.И., Еляков Г.Б. Гликозиды морских беспозвоночных. XII. Структура нового тритерпенового олигогликозида из голотурий сем. Stichopodidae // Химия природ, соедин. 1982. № 2. С. 200 -204.

43. Elyakov G.B., Kuznetsova T.A., Dzizenko A.K., Elkin Yu.N. A chemical investigation of the trepang (Stichopus japonicus Selenka): the structure of triterpenoid aglycones obtained from trepang glycosides // Tetrahedron Lett. 1969. № 15. P. 1151 1154.

44. Tan W.L., Djerassi C. Teipenoids. LXX. The structure of the sea cucumber sapogenin holotoxinogenin // J. Org. Chem. 1975. V. 40. № 4. P. 466 470.

45. Калиновский А.И., Шарыпов В.Ф., Стоник В.А., Еляков Г.Б. Структура нативного агликона стихопозида А голотурии Stichopus japonicus Selenka // Биоорган, химия. 1980. Т. 6. № 6. С. 951 952.

46. Шарыпов В.Ф., Калиновская Н.И., Стоник В.А. Выделение голоста-9(11),25(26)-диен-Зр-ол-16-она нативного генина из гликозидов голотурии Stichopus japonicus //Химия природ, соедин. 1980. № 6. С. 845 - 846.

47. Maltsev I.I., Stonik V.A., Kalinovsky А.I., Elyakov G.B. Triterpene glycosides from sea cucumber Stichopus japonicus Selenka // Сотр. Biochem. Physiol. 1984. V. 78B. №2. P. 421 -426.

48. Левин B.C., Калинин В.И., Федоров С.Н., Смайли С. Структура тритерпено-вых гликозидов и систематическое положение двух видов голотурий семейства Stichopodidae II Биология моря. 1986. № 4. С. 72 77.

49. Шарыпов В.Ф., Калиновский А.И., Стоник В.А., Авилов С.А., Еляков Г.Б. Выделение нативных агликонов из тритерпеновых гликозидов тихоокеанский голотурии Cucumaria japónica И Химия природ, соедин. 1985. № 1. С. 55 59.

50. Miyamoto Т., Togawa К., Higuchi R., Komori Т. Constituents of Holothurioidea, I. Isolation and structures of three triterpenoid aglycones, cucumechinol A, B, and C, from the sea cucumber Cucumaria echinata 11 Liebigs Ann. Chem. 1990. № 1. P. 39-42.

51. Miyamoto Т., Togawa K., Higuchi R., Komori Т., Sasaki T. Constituents of Holothurioidea, II. Six newly identified biologically active triterpenoid glycoside sulfates from the sea cucumber Cucumaria echinata II Liebigs Ann. Chem. 1990. P. 453 -460.

52. Findlay J.A., Daljeet A. Frondogenin, a new aglycone from the sea cucumber Cucumaria frondosa // J. Nat. Prod. 1984. V. 47. № 2. P. 320 324.

53. Girard M., Belanger J., ApSimon J. W., Gameau F.-X., Harvey C., Brisson J.-R. Frondoside A. A novel triterpene glycoside from the holothurian Cucumaria frondosa //Can. J. Chem. 1990. V. 68. P. 11 18.

54. Yayli N., Findlay J.A. A triterpenoid saponin from Cucumaria frondosa II Phyto-chemistry. 1999. V. 50. P. 135 138.

55. Findlay J.A., Yayli N., Radics L. Novel sulfated oligosaccharides from the sea cucumber Cucumaria frondosa II J. Nat. Prod. 1992. V. 55. № 1. P. 93 101.

56. Rodriguez J., Riguera R. Lefevriosides: four novel triterpenoid glycosides from the sea cucumber Cucumaria lefevrei II J. Chem. Research (M). 1989. P. 2620 2636.

57. Miyamoto Т., Togawa K., Higuchi R., Komori Т., Sasaki T. Structures of four new triterpenoid oligoglycosides: ds-penaustrosides А, В, C, and D from the sea cucumber Pentacla australis II J. Nat. Prod. 1992. V. 55. № 7. P. 940 946.

58. Афиятуллов Ш.Ш., Стоник В.А., Калиновский А.И., Еляков Г.Б. Гликозиды морских беспозвоночных. XVI. Кукумариогенин из гликозидов голотурии Cucumaria fraudatrix II Химия природ, соедин. 1983. № 1. С. 59 64.

59. Ильин С.Г., Решетняк М.В., Афиятуллов Ш.Ш., Стоник В.А., Соболев А.Н., Вельский В.К., Еляков Г.Б. Кристаллическая и молекулярная структура диацетата голост-8(9)-ен-Зр,16р-диола // Докл. АН СССР. 1985. Т. 284. № 2. С. 356 359.

60. Афиятуллов Ш.Ш., Тищенко Л.Я., Стоник В.А., Калиновский А.И., Еляков Г.Б. Структура кукумариозида Gi нового тритерпенового гликозида из голотурии Cucumaria fraudatrix И Химия природ, соедин. 1985. № 2. С. 244 - 248.

61. Афиятуллов Ш.Ш., Калиновский А.И., Стоник В.А. Структура кукумарио-зидов С и С2 двух новых тритерпеновых гликозидов из голотурии Eupcnlacta fraudatrix II Химия природ, соедин. 1987. № 6. С. 831 837.

62. Калинин В.И., Калиновский А.И., Афиятуллов Ш.Ш. Тритерпеновые глико-зиды голотурии Eupentacia psetidoqu i nquesem i ta II Химия природ, соедин. 1988. № 2. С. 221 -225.

63. Encarnación R., Carrasco G., Espinoza M., Anthoni U., Nielsen P.H., Christophers en С. Neothyoside A, proposed structure of a triterpenoid tetraglycoside from the pacific sea cucumber, Neothyone gibbosa II J. Nat. Prod. 1989. V. 52. № 2. P. 248 -251.

64. Zurita M.B., Ahond A., Poupat C., Potier P., Menou J.L. Invertebres marins du lagon Neo-Caledonien, VII. Etude structurale d'un nouveau saponoside sulfate extrait de l'holothurie, Neothypmdium magnum // J. Nat. Prod. 1986. V. 49. № 5. P. 809 813.

65. Garneau F.-X., Simard J.L., Harvey O., ApSimon J.W., Girard M. The structure of psoluthurin A, the major triterpene glycoside of the sea cucumber Psolus fabricii II Can. J. Chem. 1983. V. 61. № 7. P. 1465 1471.

66. Калинин В.И., Калиновский А.И., Стоник В.А. Структура псолюсозида А -основного тритерпенового гликозида из голотурии Psoitis fabricii 11 Химия природ, соедин. 1985. №2. С. 212 -217.

67. Калинин В.И., Калиновский А.И., Стоник В.А., Дмитренок П.С., Елькин Ю.Н. Структура псолюсозида В неголостанового тритерпенового гликозида из голотурий рода Psolus II Химия природ, соедин. 1989. № 3. С. 361 - 368.

68. Калинин В.И., Калиновский А.И., Стоник В.А. Онекотаногенин новый тритерпеновый генин из голотурии Psoitis fabricii // Химия природ, соедин. 1987. №5. С. 674-678.

69. Калинин В.И., Малютин А.Н., Стоник В.А. Каудинозид А новый тритерпе-новый гликозид из голотурии Paracaudina ransonetii II Химия природ, соедин. 1986. №3. С. 378 - 379.

70. Калинин В.И., Стоник В.А., Калиновский А.И., Исаков В.В. Структура псевдостихопозида А основного тритерпенового гликозида из голотурии Pseudostichopus trachus II Химия природ, соедин. 1989. № 5. С. 678 - 684.

71. Кузнецова Т.А., Калиновская Н.И., Калиновский А.И., Еляков Г.Б. Строение синаптогенина В артефактного агликона гликозидов голотурии Synapta maculata // Химия природ, соедин. 1985. № 5. С. 667 - 670.

72. Anisimov М.М., Scheglov V.V., Stonik V.A., Fronert E.B., Elyakov G.B. The toxic effect of cucumarioside С from Cucumaria fraudatrix on early embryogenesis of sea urchin // Toxicon. 1974. V. 12. P. 327 329.

73. Анисимов M.M., Щеглов В.В., Киселева М.И. Влияние некоторых тритерпе-новых гликозидов на проницаемость плазматических мембран для аминокислот в дрожжевых клетках Saccharomyces carlsbergensis // Антибиотики. 1978. № 1. С. 66-69.

74. Anisimov М.М., Prokofieva N.G., Korotkikh L.Y., Kapustina I.I., Stonik V.A. Comparative study of cytotoxic activity of triterpene glycosides from marine organisms // Toxicon. 1980. V. 18. P. 221 223.

75. Батраков С.Г., Гиршович Е.С., Дрожжина Н.С. Тритерпеновые гликозиды с антигрибковой активностью, выделенные из морской кубышки Cucumaria japonica И Антибиотики. 1980. № 6. С. 408 -411.

76. Купера Е.В., Панков Ю.Л., Кузнецова Т.А., Авилов С.А., Тищенко Л.Я., Анисимов М.М., Малей С.М. Способ получения тритерпеновых гликозидов, обладающих антифунгальной активностью // Авт. свидетельство № 1166371 от 01.03.1985.

77. Стоник В.А., Авилов С.А., Федоров С.Н., Богуславский В.М. Способ получения суммы тритерпеновых гликозидов (варианты) // Патент РФ № 2110522 от 10.05.98 г. Б.И. 1998. № 13.

78. Авилов С.А. Новый тритерпеновый гликозид из голотурии Cucumaria japónica // VII Молодежная конференция по синтетическим и природным физиологически активным соединениям. Тезисы докл. Ереван. 1984. С. 141.

79. Авилов С.А., Тищенко Л.Я., Стоник В.А. Строение кукумариозида А2-2 -тритерпенового гликозида из голотурии Cucumaria japónica // Химия природ, соедин. 1984. № 6. С. 799 800.

80. Авилов С.А., Стоник В. А., Калиновский А.И. Строение четырех новых тритерпеновых гликозидов из голотурии Cucumaria japónica II Химия природ, соедин. 1990. №6. С. 787-792.1 Я

81. Шашков A.C., Чижов О.С. Спектроскопия "С ЯМР в химии углеводов и родственных соединений // Биоорг. химия. 1976. Т. 2. № 4. С. 437 497.

82. Калиновский А.И., Шарыпов В.Ф., Афиятуллов Ш.Ш., Кузнецова Т.А., Стоник В.А., Еляков Е.Б. Изучение некоторых вопросов стереохимии агликонов1 3гликозидов голотурий методом спектроскопии "С-ЯМР // Биоорг. химия. 1983. Т. 9. № 11. С. 1558 1564.

83. Калиновский А.И., Мальцев И.И., Антонов A.C., Стоник В.А. Изучение структуры гликозидов голотурий методом спектроскопии 13С-ЯМР // Биоорг. химия. 1984. Т. 10. № 12. С. 1655 1663.

84. Дроздова О.А., Авилов С.А., Калиновский А.И., Стоник В.А. Новый ацетили-рованный гликозид из голотурии Cucumaria japónica II Химия природ, соедин. 1992. №5. С. 590-591.

85. Дроздова О.А., Авилов С.А., Калиновский А.И., Стоник В.А. Минорный гликозид из голотурии Cucumaria japónica П Химия природ, соедин. 1992. № 5. С. 593.

86. Дроздова О.А., Авилов С.А., Калиновский А.И., Стоник В.А., Мильгром Ю.М., Рашкес Я.В. Новые гликозиды из голотурии Cucumaria japónica II Химия природ, соедин. 1993. № 2. С. 242 248.

87. Калиновский А.И. Изучение структуры гликозидов голотурий с помощью времен релаксации Т углеродов // Химия природ, соедин. 1988. № 4. С. 605 -606.

88. Drozdova О.A., Avilov S.A., Kalinin V.I., Kalinovsky A.I., Stonik V.A., Riguero R., Jimenes C. Cytotoxic triterpene glycosides from Far-Eastem sea cucumbers belonging to the genus Cucumaria II Liebigs Aim. 1997. № 11. P. 2351 2356.

89. Дроздова О.А., Авилов С.А., Калиновский А.И., Стоник В.А., Мильгром Ю.М., Рашкес Я.В. Трисульфатированные гликозиды из голотурии Cucumaria japónica II Химия природ, соедин. 1993. № 3. С. 369 374.

90. Авилов С.А., Калинин В.И., Дроздова О., Калиновский А.И., Стоник В.А., Гудимова Е.Н. Тритерпеновые гликозиды голотурии Cucumaria frondosa II Химия природ, соедин. 1993. № 2. С. 260 263.

91. Hikino H., Okuyama Т., Konno C., Takemoto T. Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonanse Spectra of Phytoecdysones // Chem. Pharm. Bull. 1975. V. 23. P. 125 132.

92. Avilov S.A., Kalinovsky A.I., Stomk V.A., Kalinin V.I., Riguero R., Jimenes C.J. Koreoside A, a new nonholostane triterpene glycoside from the sea cucumber Cucumaria koraiensis II J. Nat. Prod. 1997. V. 60. № 8. P. 808 810.

93. Hasegava S., Kaneko N., Hirose Y. Triterpenes from the seed of Abies jirma II Phytochemistiy. 1987. V. 26. № 4. P. 1095 1099.

94. Blund J.W., Stothers J.B. 13C NMR spectra of steroids a servey and commentary // Org. Magn. Res. 1977. V. 9. № 8. P. 439 - 464.

95. Калиновский А.И., Авилов С.А., Степанов В.P., Стоник В.А. Гликозиды морских беспозвоночных. XXIII. Курилогенин новый генин из гликозидов голотурии Duasmodactyla kurilensis 11 Химия природ, соедин. 1983. № 6. С. 724 - 727.

96. Авилов С.А., Калиновский А.И. Новый тритерпеновый агликон из голотурии Duasmodactyla kurilensis II Химия природ, соедин. 1989. № 3. С. 359 -361.

97. Stonik V.A., Kalinin V.I., Avilov S.A., Kalinovsky A.I. Two nowel structural sériés of triterpene glycosides from holothurians // Proceedings of the sixth International symposium on marine natural products. Dakar. 1989. P. 5.

98. Калинин В.И., Стоник В.А., Авилов С.А. Гомологическая изменчивость и направленность в эволюции тритерпеновых гликозидов голотурий (Holothurioidea, Echinodeimata) // Журн. общ. биологии. 1990. Т. 51. № 2.1. С. 247-260.

99. Авилов С.А., Калиновский А.И., Стоник В.А. Два новых тритерпеновых гликозида из голотурии Duasmodactyla kurilensis II Химия природ, соедин. 1991. №2. С. 221 -226.

100. Breitmaier Е., Voelter W. 13С NMR Spectroscopy // Verlag Chemie. 1974. P. 210.

101. Bhacca N.S., Jonhson L.F. NMR Spectra catalog. № 352 // Instrument division of Varian assocites. 1962.

102. Beirbeck H., Saunders J.K., ApSimon J.N. The semiempirical derivation of 13C nuclear magnetic resonanse chemical shifts. Hydrocarbons, alcohol, amines, ketones and olefins // Can. J. Chem. 1977. V. 55. P. 2813 2828.1 "3

103. Eggert H., Djerassi C. Carbon ~ С Nuclear Magnetic Resonance spectra of monounsaturated steroids. Evaluation of rules for predicting their chemical shifts // J. Org. Chem. 1981. V. 46. P. 5399 5401.

104. Авилов С.А., Калинин В.И., Калиновский А.И., Стоник В.А. Кукумариозид G2 минорный тритерпеновый гликозид из голотурии Eupenlacia fraudatrix II Химия природ, соедин. 1991. № 3. С. 438 - 439.

105. Avilov S.A., Kalinin V.I., Makarieva T.N., Stonik V.A., Kalinovsky A.I. Structure of cucumarioside G2, a novel nonholostane glycoside from the sea cucumber Eupenlacia fraudatrix II J. Nat. Prod. 1994. V. 57. № 8. P. 1166- 1171.

106. Калинин В.И., Авилов С.А., Калиновский А.И., Стоник В.А. Кукумариозид G3 минорный тритерпеновый гликозид из голотурии Eupentacta fraudatrix II Химия природ, соедин. 1992. № 6. С. 729 - 730.

107. Авилов С.А., Калинин В.И., Калиновский А.И., Стоник В.А., Мильгром Ю.М., Рашкес Я.В. Кукумариозид G4 новый тритерпеновый гликозид из голотурии Eupenlacia fraudatrix // Химия природ, соедин. 1992. № 6. С. 691 - 694.

108. Баранова З.И. Тип Иглокожие Echinodermata // Животные и растения залива Петра Великого. Л.: Наука, 1976. С. 114 - 120.

109. Akihisa T., Matsumoto Т. 13С NMR spectra of sterols and triterpene alcohols // Yakugaku. 1987. V. 36. №5. P. 301-319.

110. Авилов С.А., Стоник В.А. Новые тритерпеновые гликозиды из голотурии Cladolabes sp. II Химия природ, соедин. 1988. № 5. С. 764 765.

111. Авилов С.А., Калиновский А.И., Стоник В.А. Новый тритерпеновый глико-зид из голотурии Neothionidium magnum // Химия природ, соедин. 1990. № 1. С. 53 57.

112. Климова В.Л., Левин B.C., Маркова И.В. Видовой состав и распределение голотурий в заливе Петра Великого // Исследования иглокожих Дальневосточных морей. Владивосток: ДВО АН СССР, 1987. С. 21 30.

113. Стоник В.А., Авилов С.А., Калинин В.И. Биологически активные вещества из голотурий (морских кубышек) // Успехи в изучении природных соединений. Владивосток: Дальнаука, 1999. С. 105 123.

114. Bumell D.J., ApSimon J.W. Echinoderm saponins // Marine natural products chemistry. Chemical and biological perspectives. N. Y.: Acad. Press, 1983. V. 5. P. 145- 156.

115. Еляков Г.Б., Стоник В.А. Терпеноиды морских организмов // М.: Наука. 1986. 272 с.

116. Левин B.C. О биологической роли и происхождении токсичных гликозидов иглокожих// Журн. общ. биологии. 1989. Т. 50. С. 207 212.

117. Stonik V.A., Kalinin V.l., Avilov S.A. Toxins from sea cucumbers (Holothuroids): chemical structures, properties, taxonomic distribution, biosynthesis and evolution // J. Nat. Toxins. 1999. V. 8. № 2. P. 235 248.

118. Калинин В.И., Левин B.C., Стоник В.А. Химическая морфология: Тритерпе-новые гликозиды голотурий (Holothunoidea, Echmodermata) // Владивосток: Дальнаука, 1994. 284 с.

119. Левин B.C., Калинин В.И., Мальцев И.И., Стоник В.А. Строение тритерпено-вых гликозидов и систематика щитовиднощупальцевых голотурий // Биология моря. 1985. № 2. С. 3 11.

120. Баранова З.И. Голотурии рода Cucumaria морей СССР // Проблемы зоологии. Л.: Наука, 1976. С. 5 7.

121. Баранова З.И. Новое в систематике морских беспозвоночных // Исследования фауны морей. Л.: ЗИН АН СССР, 1980. С. 109 120.

122. Левин B.C., Гудимова E.H. О таксономических отношениях голотурий Cucumaria frondosa и Cucumaria japónica (Dendrochirotida, Cucumariidae) I ! Зоол. ж. 1997. T. 76. №5. С. 575 -584.

123. Гудимова E.H. Голотурия Cucumaria frondosa (Gunnerus) Баренцева моря: систематика, биология, использование // Автореф. канд. биол. наук. Санкт-Петербург, 1999. 24 с.

124. Britten M. Holothurien aus dem Japanischen und Ochotskischen Meer // Изв. Императ. акад. наук. (Bull. l'Acad. Imper. Sei. St.-Peterburg). 1907. Сер. 5. № 1.2. С. 123 157.

125. Савельева Т.С. К фауне голотурий дальневосточных морей, II // Исслед. даль-невост. морей СССР. 1941. Вып. 1. С. 73 103.

126. Lambert P. British Columbia marine faunistic survey report: Holothurians from the Notheast Pacific // Canadian Tech. Rep. Fish. Aquat. Sei. 1984. № 1234. P. 1 30.

127. Möllensen Th. The Godhaab Expeditions 1928. Echinoderms // Medd. GrOnland. 1932. Bd. 79. №2. P. 1-62.

128. Panning A. Versuch einer Neuordnung der Familie Cucumariidae (Holothurioidea, Dendrochirota) // Zool. Jarb. Abt. System. Okol. Geogr. Tiere. 1949. Bd. 78.1. P. 404 -470.

129. Panning A. Bemerkungen über die Holothurien Familie Cucumariidae (Ordnung Dendrochirota) //Mitt. Hamburg. Zool. Mus. Inst. 1955. Bd. 53. P. 33 - 47.

130. McKenzie J.D. The taxonomy and natural history of north European dendr o chirote holothirians (Echinodermata) // J. Nat. Hist. 1991. V. 25. P. 123 171.

131. Гудимова E.H. Методы количественного анализа формы спикул голотурий рода Cucumaria II Биол. моря. 1991. № 6. С. 80 87.

132. Panning A. Bemerkungen über die Holothurien-Familie Cucumariidae (Ordnung Dendrochirota). 4. Die Gattungen Stereoderma, Staurothyone und Trachytione // Mitt. Hamburg. Zool. Mus. Inst. 1964. Bd. 62. P. 159 174.

133. Yingst J. Y. A new species of rock dwelling dendr o chirote holothurian from Catalina Island // Bulletin of the Southern California Academy of Sciences. 1972. V. 71. P. 145 150.

134. Kirkendale L., Lambert P. Cucumaria pallida, a new species of sea cucumber from the northeast Pacific Ocean (Echinodermata, Holothuroidea) // Can. J. Zool. 1995. V. 73. P. 542 551.

135. Lambert P. Sea cucumbers of British Columbia, Puget Sound and southeast Alaska // Royal ВС Museum and University of ВС press. Vancouver, 1997. 192 p.

136. Rowe F. W.E. A note on the British species of cucumarians, involving the erection of two new nominal genera // Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom. 1970. V. 50. № 3. P. 683 687.

137. Panning A. Uber Pseudocnus leoninus (Semper) und verwandte Arten // Zoologischer Anzeiger. 1951. Bd. 146. Hf. 9/10. P. 73 80.

138. Panning A. Bemerkungen über die Holothurien-Familie Cucumariidae (Ordnung Dendrochirota). 3. Teil. Die Gattung Pseudocnus Panning 1949 // Mitteilungen aus dem Hamburgischen Zoologischen Museum und Institut. 1962. Bd. 60. P. 57 80.

139. Elyakov G.B., Stonik V.A., Levina E.V., Levin V.S. Glycosides of marine invertebrates III. Biosynthesis of stichoposides from acetate // Comp. Biochem. Physiol. 1975. V. 52B. P. 321 323.

140. Sheikh Y.M., Djerassi C. Bioconversion of lanosterol into holotoxigenin a triter-penoid from the sea cucumber Stichopus californicus // Chem. Comm. 1976. № 24. P. 1057- 1058.

141. KeiT R.S., Chen Zhengjan. In vivo and vitro biosynthesis of saponins in sea cucumbers // J. Nat. Prod. 1995. V. 58. № 2. P. 172 176

142. Хефтман Э. Биохимия стероидов // M.: Мир, 1972. 176 с.

143. Мецлер Д. Биохимия. Химические реакции в живой клетке // М.: Мир, Т. 2. 1980. 606 с.

144. Еляков Г.Б., Стоник В.А. Стероиды морских организмов // М.: Наука, 1988. 208 с.

145. Лукнер М. Вторичный метаболизм у микроорганизмов, растений и животных //M.: Мир, 1979. 560 с.

146. Физер Л., Физер М. Стероиды // М.: Мир, 1964. 982 с.

147. Мамкаев Ю.В. Методы и закономерности эволюционной морфологии // Современная эволюционная морфология. М.: Наука, 1991. С. 33 55.

148. Rensch В. Evolution above the specieslevel // N.Y.: Columbia University Press, 1960. 483 p.

149. Rowe F.W.E. A review of family Holothuriidae (Holothurioidea: Aspidochirota) // Bull. Brit. Mus. (Nat. His.) Zool. 1969. V. 18. № 4. P. 119 170.

150. Седов A.M. Характеристика иммуномодулирующих свойств тритерпеновых гликозидов голотурий // Автореф. канд. биол. наук. Москва. 1984. 26 с.

151. Shimada S. Antifungal steroid glycoside from sea cucumbers // Science. 1969. V. 163. P. 1462.189. .Anderson R.G.W., Orci L. A View of Acidic Intracellular Compartments // J. Cell. Biol. 1988. V. 106. P. 539.

152. Allison A.C., Young M.R. Vital Staining and Fluorescence Microscopy of Lyso-somes // Lysosomes in Biology and Pathology / Ed. Dingle J.Т., Fell H.B. 1969. Vol. 2. P. 600 628.

153. Zoccarato F., Cavallini L., Alexandre A. The pH-Sensitive Dye Acridine Orange as a Tool to Monitor Exocytosis/Endocytosis in Synaptosomes // J. Neurochem. 1999. V. 72. P. 625.

154. Swanson J. Fluorescent labeling of endocytic compaitments // Methods in cell biology. Fluorescence microscopy of living cells in culture. Part A. N. Y.: Acad. Press, 1989. V. 29. P. 137-151.

155. Рубцов Б.В., Ружицкий А.О., Клебанов Г.И., Седов А.М., Владимиров Ю.А. Действие тритерпеновых гликозидов морских беспозвоночных на проницаемость биологических и искусственных мембран // Изв. АН СССР. Сер. биол. 1980. № 3. С. 402 407.

156. Gorshkova I.A., Gorshkov В.A., Stomk V.A. Inhibition of rat brain Na KT -ATFase triterpene glycosides from holothurians // Toxicon. 1989. V. 27. № 8. P. 927 - 936.

157. Гришин Ю.И., Авилов С.А. Влияние кукумариозида на пролиферацию и миграцию плюрипотентных стволовых клеток // Научная конференция "Экспериментальная и клиническая иммунология на Востоке страны". Тезисы докл. Красноярск. 1988. Т. 1. С.30.

158. Гришин Ю.И., Беседнова Н.Н., Стоник В.А., Ковалевская А.М., Авилов С.А. Регуляция гемопоэза и иммуногенеза тритерпеновыми гликозидами из голотурий // Радиобиология. 1990. Т. 30. Вып. 4. С. 556.

159. Поверенный А.М. Вероятные причины высокой радиочувствительности системы кроветворения// Радиобиология. 1990. Т. 30. Вып. 4. С. 538.

160. Поликарпова С.П., Волкова О.Н., Седов A.M., Стоник В.А., Лиходед В.Г. Цитогенетическое изучение мутагенности кукумариозида // Генетика. 1990. Т. 26. № 9. С. 1682 1684.

161. Шарова Л.В., Седов A.M., Стоник В. А. Доклиническое исследование эмбрио-токсических свойств кукумариозида и его влияния на генеративную функцию взрослых особей // Фарм. и токсикол. 1991. Т. 54. № 1. С. 60-61.

162. Методические рекомендации по проверке мутагенных свойств у новых лекарственных препаратов // М.: Управл. по внедрению новых лекарственных средств и мед. техники МЗ СССР. 1981. 81 с.

163. Пашин Ю.В., Торопцев С.Н. Индукция Сгб+ микроядер в эритроцитах мыши // Бюл. эксп. биол. мед. 1983. № 1. С. 72 75.

164. Бочков И.П., Демин Ю.С. Классификация и методы учета хромосомных аберраций в соматических клетках // Генетика. 1972. Т. 8. № 5. С. 133.

165. Grishin Y., Morozov Е., Avilov S. Priliminary studies of antiviral activity of triter-pene glycosides from holothurians // 8th conference young scientists on organic and bioorganic chemistry. Latvia. Riga. 1991. P. 181.