Тритерпеновые гликозиды голотурий семейств Holothuriidae, Stichopodidae, Synallactidae и Cucumariidae тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

Силъченко Александра Сергеевна

ТРИТЕРПЕНОВЫЕ ГЛИКОЗИДЫ ГОЛОТУРИЙ СЕМЕЙСТВ НОШТНиШГОАЕ, вТЮЮРОБГОАЕ, SYNALLACTШAE И

СиСиМАШШАЕ

02.00.10. - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Владивосток 2005

Работа выполнена в Тихоокеанском институте биоорганической химии Дальневосточного отделения РАН.

Научный руководитель:

доктор химических наук, ведущий научный сотрудник Авилов С. А.

Официальные оппоненты: доктор химических наук,

профессор Высоцкий В. И.

доктор химических наук, профессор Усов А. И.

Ведущая организация: Институт органической химии УНЦ РАН Защита состоится .» октября 2005 г. в 13 часов на заседании

биоорганической химии ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс: (4232)31-40-50; e-mail: science@piboc.dvo.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (Владивосток-22, пр. 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН).

диссертационного совета jEL, 005.005.01 в Тихоокеанском институте

Автореферат разослан

Ученый секретарь

диссертационного совета кандидат химических наук старший научный сотрудник

Прокопенко Г. И.

Иг А^ГЛЬ*

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Голотурии и некоторые виды Губок уникальны тем, что содержат нехарактерные для других групп животных вторичные метаболиты -тритерпеновые гликозиды. До их обнаружения в голотуриях соединения этого класса считались метаболитами исключительно высших наземных растений. Первоначально интерес к вторичным метаболитам голотурий определялся высокой ихтиотоксичностью экстрактов из этих животных, что и послужило стимулом к развитию структурных исследований тритерпеновых гликозидов. В дальнейшем был также выявлен и широкий спектр их биологической активности: гемолитические, цитостатические, антигрибковые, противоопухолевые, иммуномодулирующие свойства. Сейчас гликозиды голотурий являются действующими началами лекарственных препаратов и биологически активных пищевых добавок, используемых как в медицине, так и в ветеринарии.

По мере накопления данных о химическом строении тритерпеновых гликозидов голотурий различных систематических групп, стала очевидной специфичность этих соединений для таксонов разного уровня. Появилась возможность использовать тритерпеновые гликозиды в качестве хемотаксономических маркеров. Кроме того, анализ особенностей строения основных и минорных гликозидов, выделенных из голотурии-продуцента, может быть использован для построения гипотетических схем биосинтеза тритерпеновых гликозидов.

Голотурии семейства Но1оЙшги<1ае (отряд Азр1с1осЫгой<1а), обитающие на мелководье в тропической зоне мирового океана, изучены достаточно полно. Однако, представители этого семейства, населяющие зоны умеренного и субтропического климата, например, Средиземноморье, практически не изучались. В то же время известно, что гликозиды атлантической НоШИигш /опкаШ, отличаются от гликозидов голотурий - обитателей тропиков. Поэтому изучение гликозидов средиземноморских представителей рода НоШИипа было интересно не только с химической точки зрения, но и в плане хемосистематики.

Представлял интерес и состав гликозидных фракций голотурий семейства 8упа11асй<1ае (отряд Азр1<1осЫгойс1а), включающего в основном глубоководных обитателей. Так, к началу наших исследований была известна структура только одного гликозида из голотурии РзешЬмйскориз Раских, однако, принадлежность данного вида к семейству 8упа11асйс1ае оспаривалась рядом систематиков.

В состав семейства Сиситагнёае (отряд ВепсЬосЫгойёа) входят массовые промысловые виды голотурий рода Сиситапа, которые, как правило, содержат сложные гликозидные суммы. Изучение гликозидов различных видов Сиситапа представляет не только научный, но и прикладной интерес, так как они являются сырьем для изготовления ряда лекарственных препаратов и биологически активных

пищевых добавок. Поэтому знание состава || иЕфдцц^цзшмтцми тачных видов

1ШМТШ

кукумарий, точных структур гликозидов и проявляемой ими биологической активности необходимо для расширения практического применения этих препаратов. В связи с этим изучались гликозиды из двух видов голотурий рода Cucumaria: атлантической С. frondosa и камчатской С. okhotensis.

Целью данной работы является:

1) выделение и установление структур тритерпеновых гликозидов из 6 видов голотурий семейств Holothuriidae, Stichopodidae и Synallactidae (отряд Aspidochirotida), а также из 2 видов голотурий рода Cucumaria (семейство Cucumariidae, отряд Dendrochirotida);

2) анализ особенностей химического строения гликозидов в целях разрешения некоторых спорных вопросов систематики класса Holothuroidea;

3) выяснение возможности и перспективности использования гликозидов промысловой голотурии С. frondosa в составе иммуномодулируютцих препаратов.

Научная новизна и практическая ценность работы. Из 8 видов голотурий было выделено 36 тритерпеновых гликозидов: для 25 новых соединений установлены полные химические структуры, а 11 - идентифицированы с известными. Впервые из голотурий выделены гликозиды, содержащие: сульфатную группу при С-3 остатка хиновозы, два остатка З-О-метилксилозы, а,Р-ненасьпценный кето-фрагмент в боковой цепи агликона. Впервые из одного вида голотурий выделено 3 пары гликозидов, являющихся изомерами только по положению двойной связи в ядре агликонов. Кроме того, выделены новые гликозиды, содержащие глюкозу во втором положении углеводной цепи, вместо типичной для большинства гликозидов хиновозы. Показано, что для средиземноморских представителей рода Holothuria специфичны голотурины групп А и В, как и для видов Holothuria, обитающих в тропиках. Изучен гликозидный состав голотурии Australostichopus mollis, учитывая полученные данные, а также данные сравнительной морфологии произведен пересмотр её таксономического статуса. На основе анализа структур 7 гликозидов, выделенных из голотурий Synallactes nozawai и Pseudostichopus trachus предложено считать последнюю принадлежащей к семейству Synallactidae. Установлено отличие фракции моносульфатированных гликозидов нового вида голотурии - Cucumaria okhotensis, от гликозидов аналогичных групп других изученных представителей рода Cucumaria. Изучен гликозидный состав промысловой голотурии Cucumaria frondosa. Показана перспективность применения в медицине и ветеринарии гликозидных препаратов из С. frondosa в качестве иммуностимуляторов.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на 3-й Европейской Конференции по* ''«Морским Природным Соединениям», Мюнхен, 2002;

международной конференции по сапонинам «Phytochemistry & Application of Plant Saponins», Пулавы (Польша), 2004.

Публикация результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 6 статей в научных журналах: Journal of Natural Products, Canadian Journal of Chemistry, Biochemical Systematics and Ecology, Natural Products Research и 2 тезисов.

Структура диссертации. Диссертация состоит из Введения, Литературного обзора, посвященного структурам тритерпеновых гликозидов голотурий, Обсуждения результатов, где описаны и проанализированы полученные результаты, Экспериментальной части, а также Выводов и Списка литературы, включающего 150 цитируемых работ. Работа изложена на 171 странице, содержит 43 таблицы, 6 схем и 6 рисунков.

Автор выражает глубокую признательность научному руководителю д.х.н. Авилову С.А., академику Стонику В.А., д.б.н. Калинину В. И., к.х.н. Антонову A.C. за консультации и помощь в работе. Автор благодарит д.х.н. Калиновского А.И. за съемку и интепретацию ЯМР-спектров, Дмитренка П.С. за результаты масс-спектрометрии, д.б.н. Левина В. С., к.б.н. Смирнова А. В. и д.б.н. Гудимову Е. Н. -за определение голотурий, а также к.б.н. Аминина Д. Л. и к.б.н. Агафонову И.Г. - за проведение биоиспытаний.

Часто используемые сокращения: ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография; (HR)FABMS - масс-спектрометрия (высокого разрешения) с ионизацией быстрыми атомами; (HR)MALDI-TOF - масс-спектрометрия (высокого разрешения) с лазерной десорбцией/ионизацией усиленной матрицей; COSY - корреляционная спектроскопия; DEPT - неискаженное усиление переносом поляризации; НМВС - гетероядерная многополосная корреляция; HSQC - гетероядерная одноквантовая корреляция; NOESY - спектроскопия ядерного эффекта Оверхаузера (ЯЭО) и обмена.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Тритерпеновые гликозиды выделялись из упаренных спиртовых экстрактов голотурий с помощью гидрофобной хроматографии на тефлоновом порошке «Полихром-1», колоночной хроматографии на силикагеле и ВЭЖХ на колонках с обращенной фазой С-8 или С-18. В некоторых случаях применялась ионообменная хроматография на DEAE-Sephadex, гель-фильтрация на сефадексе LH-20. Строение новых гликозидов уставливали с помощью ЯМР спектроскопии (|3С, 'Н, DEPT, HSQC, НМВС, COSY, NOESY, TOCSY) и масс-спектрометрии ((HR)MALDI-TOF и (HR)FAB). В ряде случаев проводили сольволитическое десульфатирование гликЬзидов, моносахаридный анализ и периодатное окисление.

1. Гликозиды средиземноморских голотурий рода HolothuHa (сем. Holotburiidae, отр. Aspidochirotida)

Представители рода Holothuria - обитатели тропической зоны мирового океана - содержат голотурины групп А и В. В то же время атлантическая Holothuria forskalii, обитающая у берегов Испании и Португалии, характеризовалась наличием необычных для других Holothuria гликозидов - голотуринозидов. Поэтому изучение гликозидов представителей рода Holothuria, обитающих в Средиземном море, представляло интерес в плане хемосистематики. Был изучен гликозидный состав 3 видов голотурий: Holothuria polii, Holothuria tubulosa и Holothuria sp., собранных недалеко от г. Неаполя (Италия). Из гликозидной фракции Я. tubulosa были выделены и идентифицированы (по данным ЯМР и физическим константам) голотурины А (1) и В (2), в то время как в организме Holothuria sp. накапливался только голотурии А (1). Из экстракта голотурии Я. polii, наряду с 1 и 2, были выделены три новых гликозида - голотурины В2 (3), В3 (4) и В4 (5).

Сравнение углеводных частей спектров ЯМР голотуринов 3 - 5 и изученного ранее голотурина В говорило об идентичности углеводных цепей этих соединений.

Голотурии Вч (31 (по данным ЯМР) имел в качестве агликона голост-9(11)-ен-3ß, 12а, 17а,22-тетраол, обнаруженный ранее в составе голотурина А), выделенного из Я. floridana. В HR MALDI-TOF (+) масс-спектре 3 наблюдался пик с m/z 907.3689 [М + Na]+ (брутго-формула C41Hi5017SNa), фрагментарный ион с m/z 715 в MALDI-TOF (-) масс-спектре демонстрировал отрыв остатка хиновозы. Эти данные подтверждали соответствие структуры голотурина В2 формуле 3.

Голотурин В, (4t (брутго-формула - C4iH630|6SNa (пик с m/z 889.3569 [М + Na]+ в HR MALDI-TOF (+) масс-спектре) представлял собой 17-дезоксиголотурин В и имел агликон, идентичный агликону голотуринозидов С и D, выделенных ранее из голотурии Я. forskalii. Асимметрическому центру при С-22 была приписана S-конфигурация по аналогии с ацетатом 17-дезокси-22,25-оксидоголотурингенина, артефактным генином, полученным после кислотного гидролиза голотурина А (1), в котором конфигурация С-22 была определена на основе рентгено-сгруктурного анализа.

Голотурин Вд (5). Сигналы полициклической системы в ЯМР спектрах соединений 3 и 5 совпадали, а сигналы боковой цепи в ЯМР |3С спектре 5 (120.64,

не

143.56 и 69 53 м.д.), указывали на наличие 23(24)-двойной связи и гидроксильной группы при С-25. Это подтверждалось присутствием кросс пиков в НМВС спектре 5 между: Н-23 (6.13 м.д.) и С-22, С-24, С-25; Н-24 (6.03 м.д.) и С-22, С-23.С-25; Н3-26 (1.54 м.д.) и С-24; Н3-27 (1.55 м.д.) и С-24 Молекулярная формула голотурина В4 - C4iH63017SNa (пик с тк 905.3632 [М + Naf в HR MALDI-TOF (+) масс-спектре) -соответствовала структуре 5.

Результаты исследований показали, что для изученных средиземноморских представителей рода Holothuria специфичны голотурины групп А и В, как и для видов Holothuria, обитающих в тропиках. В этой связи становится тем более актуальным пересмотр такономичсского статуса Н. forskalii, характеризующейся наличием необычных голотуринозидов.

2. Гликозиды голотурии Australostichopus (=Stichopus) mollis (сем. Stichopodidae, отр. Aspidochirotida)

Тритерпеновые гликозиды новозеландской голотурии Stichopus mollis ранее не изучались, и интерес к их структурам усиливался еще и неоднозначностью таксономического статуса данного вида, так как по данным сравнительной морфологии и анатомии S mollis отличался от других представителей семейства Stichopodidae. Из гликозидной фракции S. mollis было выделено 4 тритерпеновых гликозида: описанный ранее неотионидиозид (6) и новые моллисозиды А (7), В| (8) и В2 (9).

Неотионидиозид (6). По данным моносахаридного анализа, ЯМР и масс-спектров, а также физическим константам основной компонент гликозидной фракции был идентифицирован как описанный ранее неотионидиозид (6).

Моллисозид А (7) содержал голоста-7,25-диен-ЗР-ол-22-он в качестве агликона, что следовало из анализа ЯМР спектров. Присутствие в боковой цепи 7 кето-группы при С-22 и 25(26)-двойной связи подтверждалось наличием в COSY и ЯМР 'Н спектрах сигналов Н2-23 (2.96 и 2.86 м.д., J = 18.5, 7.5 Гц) и Н2-24 (2.40 м.д. т, J =7.5 Гц), образующих изолированную спиновую систему типа A2XY. По данным

ЯМР и MALDI-TOF (-) масс-спектра, в котором наблюдались фрагментарные ионы с mir. 987.5, 825 5 и 679.3, образовавшиеся при последовательном отщеплении моносахаридов от 7, углеводная цепь моллисозида А была идентична линейной тетрасахаридной моносульфатированной цепи голотурина А (1). Бругто-формула моллисозида А - Cj^O^SNa (пик с m/z 1209.4825 [M + Naf в HR MALDI-TOF (+) масс-спектре) - соответствовала формуле 7.

Моллисозид В, (8). как и неотионидиозид (6), содержал в качестве агликона голотоксиногенин - голоста-9(11),25(26)-диен-ЗР-ол-16-он (по данным ЯМР). ЯМР 13С спектр углеводной цепи моллисозида В! свидетельствовал о наличии тетрасахаридной линейной сульфатированной по С'-4 (а- и ß-эффекты сульфатной группы) углеводной цепи с остатком глюкозы во втором положении (отсутствие сигнала С-6 хиновозы в области 17 м.д., но наличие сигнала С2-6 при 60.9 м.д. в ЯМР 13С спектре и сигналов соответствующих протонов: Н2-6' при 4.41 (дц, ,/=2.1, 10.9 Гц) м.д. и Н2-6" при 4.59 (шд, J = 11.1 Гц) мд. в ЯМР *Н спектре). Молекулярная формула 8 (C53H8i025SNa) определена по наличию в HR MALDI-TOF (+) масс-спектре пика [M + Na]+ с m/z 1195.4516. В MALDI-TOF (-) масс-спектре моллисозида В, наблюдалась фрагментация, аналогичная наблюдаемой для моллисозида А, что наряду с наличием соответствующих корреляций в НМВС и NOESY спектрах подтверждало структуру 8.

Моллисозид Вт (9). Анализ ЯМР спектров показал, что агликоном 9 является голоста-7,25-диен-Зр-ол-16-он, обнаруженный ранее в составе гликозидов голотурии С. japónica, а углеводная цепь 9 была идентична цепи моллисозида Вь о чем свидетельствовало совпадение соответствующих частей ЯМР спектров. В HR MALDI-TOF (+) масс-спеюгре наблюдался пик с m/z 1195.4502 [M + Na]+ (брутто-формула C53Hg|025SNa), а пики фрагментарных ионов с m/z: 973.4, 841.4 и 679.3 в MALDI-TOF (-) масс-спектре характеризовали последовательность моносахаридов в углеводной цепи моллисозида В2 (9).

Полученные результаты, наряду с морфологическими признаками, свидетельствовали о существенном отличии голотурии S. mollis от остальных представителей семейства Stichopodidae. Так, все выделенные из S mollis гликозиды были сульфатированными тетраозидами и значительно отличались по строению от несульфатированных стихопозидов и теленотозидов, являющихся хемотаксономическими маркерами рода Stichopus. На основе полученных результатов систематическое положение голотурии Stichopus mollis было изменено, и она была выведена в новый род Australostichopus Levin.

3. Гликозиды голотурий семейства SytiaUactidae (отр. Aspidochirotida) 3.1 Гликозиды голотурии Synalloctes nozawai

Большинство представителей семейства Synallactidae обитает на больших глубинах и, следовательно, труднодоступны и слабо изучены. В связи с этим

точный видовой состав семейства неизвестен, а принадлежность ряда видов к семейству ЗупаИасМае - неоднозначна. Голотурия ЗупаИасЬев пога\мм, собранная в южной части Японского моря, - первый (и пока единственный) представитель рода БупаПаМез, из которого были выделены тритерпеновые гликозиды синаллактозиды А! (10), А2 (11), В! (12), В2 (13) и С (14).

Агликонные части спектров ЯМР синаллактозидов 10-14 совпадали друг с другом и с соответствующей частью спектра ЯМР ,3С астихопозида С, выделенного ранее из карибской голотурии Astichopus multifldus. Это позволило сделать вывод, что агликоном синаллактозидов являлся 23(5)-ацетоксиголоста-7,25-диен-Зр-ол.

Синаллактозид Ai И 01 по данным моносахаридного анализа, ЯМР спектров и физическим константам был идентифицирован с 25(26)-дегидропроизводным теленотозида А из голотурии Thelenota ananas. Брутго-формула CssHgíOa, соответствующая структуре 10, подтверждалась данными HR FAB (+) масс-спектра.

Синаллактозид С (14Y Данные моносахаридного анализа (З-О-метилпокоза, глюкоза, ксилоза и хиновоза, 1:1:2:1) и анализ ЯМР спектров указывали на появление дополнительного остатка глюкозы в углеводной цепи синаллактозида С, по сравнению с синаллактозидом Присоединение остатка глюкозы к С-4 остатка первой ксилозы было установлено исходя из сдвигов в ЯМР ,3С спектре 14 (по сравнению со спектром 10) сигнала С'-4 на 6.49 м.д. в слабое поле, а сигналов С'-З и С'-5 - на 2.36 и 2.54 м.д., соответственно, в сильное поле. Положение пятого остатка - глюкозы - подтверждалось и наличием кросс-пика Н5-1/Н'-4 в NOESY спектре. Структура 14, предложенная для синаллактозида С, соответствовала брутто-формуле С61Н%027 и подтверждалась данными HR FAB (+) масс-спекгра (пик [М + Na]+ с m/z 1283.6054).

Синаллактозид Вт ИЗ) отличался от синаллактозида С строением четвертого моносахаридного остатка, которым была З-О-метилксилоза. Об этом свидетельствовало отсутствие сигнала С-6 З-О-метилглюкозы (при 62.02 мд.) и сдвиг сигнала С-5 в сильное поле на 11.18 м.д. в ЯМР 13С и DEPT спектрах 13, по сравнению со спектрами 14. В протонном спектре 13 отсутствовали сигналы Н4-5,

Н -6' и Н4-6 ", но при этом наблюдались сигналы Н4-5' (4.20 М.Д.) и " (3.63 м.д.), характерные для терминального остатка З-О-метилксилозы. Брутто-формула синаллактозида В2 - С^Нд^в (пик [М + Na]+ с m/z 1253.5932 в HR FAB (+) масс-спектре).

Синаллактозид А-> (11) имел гексасахаридную углеводную цепь, о чем свидетельствовало появление в его Я MP |3С спектре сигналов дополнительного моносахаридного остатка З-О-метилксилозы, по сравнению со спектром синаллактозида В2. Положение второго (терминального) остатка З-О-метилксилозы при С-3 глюкозы следовало из сдвига в спектре 11 (по сравнению со спектром 13) сигнала С5-3 в слабое поле на 8.33 м.д., а сигналов С5-2 и С5-4 - в сильное поле на 0.92 и 2.20 м.д., соответственно. Это подтверждалось наличием корреляции Н6-1/С5-3 в НМВС спектре 11. Данные HR FAB (+) масс-спектра подтвердили структуру 11 для синаллактозида А2 (пик [М + Na]+ с m/z 1399.6568, брутто-формула О^ИццОзо).

Синаллактозид Bi_(12) имел гексасахаридную углеводную цепь, как и

синаллактозид А2 и отличался от последнего строением одного из терминальных моносахаридных остатков. В ЯМР |3С и 'Н спектрах синаллактозида В| наблюдались дополнительные (по сравнению со спектрами 11) сигналы при 62.02 м.д. (С4-6), 4.46 (дд, Н4-6') м.д. и 4.27 (м, Н4-6") м.д., соответственно, что указывало на замену одного из терминальных остатков З-О-метилксилозы (в 11) на остаток 3-О-метилглюкозы (в 12). Кросс-пики между Н4-1 и С3-3 (Н3-3) в НМВС (NOESY) спектрах 12, указывали на присоединение остатка 3-О-метилглюкозы к С-3 третьего моносахаридного остатка - ксилозы. Это подтверждалось и сравнительным анализом ЯМР спектров синаллактозидов В[ и С, который показывал наличие сигналов дополнительного остатка З-О-метилксилозы в 12, присоединенного к С-3 глюкозы (сдвиг сигнала С5-3 в слабое поле на 8.33 м.д., а сигналов С5-2 и С5-4 - в сильное поле на 0.84 и 2.19 м.д., соответственно). Данные HR FAB (+) масс-спектра подтвердили структуру 12 для синаллактозида В! (пик [М + Na]+ с m/z 1429.6592, брутто-формула С67Н10бОз1).

Таким образом, в результате изучения тритерпеновых гликозидов голотурии S. nozawai были установлены структуры пяти компонентов гликозидной фракции, среди которых были обнаружены тетраозид, пентаозиды и гексаозиды, не содержащие сульфатной группы. Характерными чертами трех синаллактозидов являлось наличие необычного остатка З-О-метилксилозы, найденного ранее только в гликозидах представителей отряда Dendrochirotida.

3.2. Гликозиды голотурии Pseudosdchopus trachus

Из голотурии P. trachus (о. Уруп, 1986 г.) ранее был выделен основной компонент гликозидной фракции - псевдостихопозид А (15). В ходе данной работы, с целью выделения минорных компонентов из гликозидной фракции Р trachus, был исследован другой сбор этой голотурии (о. Онекотан, 1988 г.), из которого,

и

наряду с псевдостихопозидом А, был выделен новый гликозид - псевдостихопозид

Псевдостихопознд А (15) по ЯМР спектрам и физическим константам был идентифицирован с псевдостихопозидом А, выделенным ранее из голотурии P. trachus.

Псевдостихопозид В (16) имел голост-7-ен-ЗР-ол-22-он в качестве агликона, о чем свидетельствовало совпадение агликонных частей ЯМР спектров 15 и 16. Данные ЯМР, моносахаридного анализа (З-О-метилглюкоза, ксилоза и хиновоза, 1:2:1) и сольволитического десульфатирования (производное 17) позволили заключить, что псевдостихопозид В (16) имел такую же моносахаридную последовательность, как псевдостихопозид А и отличался от него характером сульфатарования углеводной цепи. Положение двух сульфатных групп в 16 определяли по ЯМР спектрам (а- и ß-эффекты сульфатных групп) и по данным периодатного окисления, которые указывали на присоединение одной из них к С-4 ксилозы, а второй - к С-3 хиновозы. Данные HR MALDI-TOF (+) (брутто-формула C53H82027S2Na2, пик [М + Na]+ с m/z 1283.4149) подтвердили структуру псеводстихопозида В (16). Гликозид с сульфатной группой, расположенной при С-3 остатка хиновозы выделен из голотурий впервые.

3.3. Тритерпеновые гликозиды голотурий и филогения отряда Aspidochirotida

Тритерпеновые гликозиды голотурий являются хемотаксономическими маркерами и используются для разрешения спорных вопросов таксономии. Хотя голотурии отряда Aspidochirotida считаются наиболее полно изученной группой, существует ряд вопросов, касающихся систематической принадлежности некоторых видов, в частности - Р. trachus. Проанализировав строение агликонов и углеводных цепей псевдостихопозидов, мы посчитали более обоснованным мнение систематиков, относящих голотурию Р. trachus к сем. Synallactidae (отр. Aspidochirotida), а не к сем. Gephyrothuriidae (отр. Gephyrothuriida).

Кроме того, полученная нами новая информация о структурах тритерпеновых гликозидов 3 видов голотурий семейств Synallactidae и Stichopodidae, наряду с накопленными ранее сведениями, позволяет сделать вывод, о том, что семейства Stichopodidae и Synallactidae это две близкородственные груйпы голотурий,

которые, однако, эволюционировали параллельно и независимо друг от друга. Действительно, о близости семейств Synallactidae и Stichopodidae свидетельствует ряд морфологических признаков, а также сходство структур их гликозидов, например:

— Агликон синаллактозидов (S. nozawai) типичен также для теленотозидов и стихопозидов - маркеров группы родов Astichopus, Thelenota, Stichopus, сем. Stichopodidae;

- Агликон моллисозида A (A. mollis) отличается от агликона псевдостихопозидов А и В (Р trachus) только наличием терминальной двойной связи, а агликон неотионидиозида (A. mollis) идентичен агликонам голотоксинов А] и В) (A. japonicus, P. californicus);

— Наблюдается одинаковая последовательность моносахаридных остатков в линейных тетрасахаридных углеводных цепях синаллактозида А, (=25 - деги дро производному теленотозида А), теленотозида А, псевдостихопозидов и неотионидиозида (при этом сульфатированные цепи неотионидиозида и псевдостихопозида А идентичны);

- «Архитектура» построения гексасахаридных разветвленных углеводных цепей синаллактозидов А2 и В( и стихопозидов С, D и Е аналогична.

Astichopus Pearsonothuria

Stichopus \ Thelenota Actinopyga j Holothuria

Parastichopus californicus Apostichopus japonicus ^^

Australosdchopus mollis

Pseudostichopus trachus Synallades nozawai

Bohadschi,

Holothuria forskalii

Но1о№игш1ае

\

вйсЬороШёае^ БупаНасйдде

А$р1(1осЫгоиёа

Схема 1. Филогенетические отношения голотурий отряда А5р)ёосЫго^а.

С другой стороны, нетипичные для стихоподид структурные особенности синаллактозидов и псевдостихопозидов указывали на некоторую обособленность семейства вупаИас^ае в отряде Aspidochirotida. Например: редкий среди гликозидов голотурий остаток З-О-метилксилозы синаллактозидов А2, В, и В2; нечетное количество моносахаридных остатков в углеводных цепях синаллактозидов В2 и С; и, наконец, необычное положение сульфатной группы при С-3 хиновозы в псевдостихопозиде В.

Некоторые морфологические характеристики голотурий семейств 5упа11асМае и Stichopodidae свидетельствуют о наибольшей примитивности этих семейств в

отряде Aspidochirotida, по сравнению с семейством Holothuriidae. Наличие З-О-метилксилозных остатков в синаллактозидах и выделение неотионидиозида из А. mollis, обнаруженных ранее у представителей отряда Dendrochrotida, сближали голотурий семейств Synallactidae и Stichopodidae с голотуриями отряда Dendrochirotida, филогенетически более древнего, чем Aspidochirotida, что подтверждало большую филогенетическую примитивность семейств Synallactidae и Stichopodidae в отряде Aspidochirotida. На основе анализа структур гликозидов изученных представителей семейств Synallactidae и Stichopodidae предложена схема филогенетических отношений голотурий отряда Aspidochirotida (схема 1).

4. Гликозиды голотурий семейства Cucumariidae (отр. Dendrochirotida)

В настоящее время на основе гликозидов промысловых голотурий рода Cucumaria - С. japónica и С. frondosa - разрабатываются лекарственные препараты, предназначенные для применения в ветеринарии и медицине. Поэтому стало необходимо детальное изучение гликозидного состава С. frondosa (гликозиды С. japónica изучены ранее), а также биологической активности индивидуальных соединений из этой голотурии и композиций на их основе.

4.1. Гликозиды голотурии Cucumaria frondosa

Гликозидная фракция голотурии С. frondosa представляет собой сложную смесь, дающую на ТСХ целый ряд пятен, соответствующих различным группам гликозидов, различающихся строением углеводных цепей и количеством и положением сульфатных групп. В пределах одной группы вещества отличаются строением агликонов.

Из гликозидной фракции С. frondosa (штат Мэн, США), были выделены в индивидуальном виде гликозиды 18 и 19, идентифицированные как ранее известные фрондозиды А и А], а также подфракции, соответствующие группам: моносульфатирован-ных фрондозидов А2, дисульфатированных - Аз/А« и трисульфатированных - А7, которые подвергались дальнейшему разделению.

Моносульфатированные фрондозиды

С помощью ВЭЖХ из подфракции фрондозидов группы А2, было выделено 7 индивидуальных соединений: фрондозиды А2-1 (20), А2-2 (21), А2-3 (22), А2~4 (23), А2-6 (24), А2-7 (25), А2-8 (26).

Анализ углеводных частей ЯМР спектров фрондозидов 20 - 26 и кукумариозцда А3-2, основного компонента группы А2 из голотурии С. japónica, показал идентичность их разветвленных пентасахаридных углеводных цепей.

Фрондозид А->-1 C20Y Данные ЯМР спектров указывали на то, что агликоном 20 являлся голоста-7,24-диен-Зр-ол-16-он. Данные HR MALDI-TOF (+) масс-спекгрометрии (брутто-формула C^H^Cb^SNa, пик [М + Na]+c m/z 1341.5098) и фрагментация молекулы в MALD1-TOF (-) спектре, характеризующая

последовательность моносахаридов в углеводной цепи, подтверждали соответствие структуры фрондозида А2-1 формуле 20.

Фрондозид А?-2 (21) имел голостановый агликон без заместителей в ядре. При этом в ЯМР 13С и ОЕРТ спектрах 21 присутствовали сигналы четвертичных атомов углерода при 144.50 (С-25) и 200.32 (С-24) м.д. и сигналы метиленовой (С-26, 124.80 м.д.) и метальной групп (С-27, 17.58 м.д.). Наличие кросс-пиков в НМВС спектре фрондозида А2-2 между протонами метиленовой и метальной групп и сигналом при 200.32 м.д., характерным для кето-группы, указывало на наличие в боковой цепи 21 кето-группы при С-24, сопряженной с терминальной двойной связью - уникального структурного фрагмента, ранее не встречавшегося в гликозидах голотурий Присутствие а,Р-ненасыщенного кетона в боковой цепи 21 подтверждалось его УФ-спектром (А.пвх=249 6 им, £=2127). Анализ НЯ МА1Л)1-ТОР (+) масс-спектра (брутго-формула С5дН9|02<)8Кта, пик [М + 1Ча]+ с т/г 1341.5148) и наличие характеристичных фрагментарных ионов в МА1Л)1-ТОР (-) масс-спектре подтвердили структуру фрондозида А2-2 (21).

Фрондозид АтЗ (22) содержал в качестве агликона голоста-7,23-диен-Зр,25-диол (по данным ЯМР). Брутто формула С59Н<,зОм5№, определенная на основе НЯ МАЫЭ1-ТОР (+) масс-спектра (пик [М + №]+ с т/г 1343.5387) и фрагментация углеводной цепи в МА1Л)1-ТОР (-) масс-спектре подтверждали соответствие структуры фрондозида А2-3 формуле 22.

Фрондозид А->-4 (23) имел голостановый агликон с 7(8)-двойной связью без заместителей в ядре и 24(25)-двойной связью в боковой цепи (по данным ЯМР). Анализ НИ МА1Л51-ТОР (+) и МАЬЭМОР (+) масс-спектров подтвердил структуру фрондозида А2-4 (23) (брутто-формула С59Н93С)285Ыа, пик [М + №]+ с т/г 1327.5271).

Фрондозид Атб (24) (по данным ЯМР) содержал голотоксиногенин (голоста-9(11),25-диен-ЗР-ол-16-он) в качестве агликона. Наличие типичных фрагментарных

ионов в MALDI-TOF (-) масс-спектре и данные HR MALD1-TOF (+) масс-спектра (пик [М + Na]+ с m/z 1341 5145, брутто-формула C59H9|029SNa) показывали соответствие структуры фрондозида А2-6 формуле 24.

Фрондозид А->-7 (251 (брутто-формула C61H99029SNa, пик [М + Na]+ с m/z 1373.5874 в HR MALDI-TOF (+) масс-спектре). ЯМР 13С спектр 25 характеризовался сигналами, указывающими на наличие ланостанового (без лактона) агликона: отсутствовал сигнал 18(20)-лактона в области 180 м.д., но наблюдался сигнал метальной группы (С-18) при 16.40 м.д. Дальнейший анализ ЯМР спектров показал, что агликоном 25 является 22(К)-ацетоксиланоста-9(11),24-диен-20(К),Зр-диол, идентифицированный ранее во фрондозиде С (27) (С. frondosa). В масс-спектрах 25 наблюдались не только ионы, отвечающие фрагментации углеводной цепи, но и пик с m/z 1231, указывающий на отрыв боковой цепи по связи С-20 - С-22.

Фрондозид Ат8 (26) являлся изомером фрондозида А2-7 только по положению двойной связи в ядре агликона (7(8)-, а не 9(11)-), на что указывали данные ЯМР и одинаковые брутто-формулы этих соединений CejHssC^SNa. Кроме того, в MALDI-TOF (+) масс-спектрах 25 и 26 наблюдались аналогичные фрагментарные ионы, что подтверждало структуру фрондозида А2-8 как 26.

В ходе данной работы обнаружено, что в состав подфракции моносульфатированных гликозидов С. frondosa, наряду с обычными голостановыми гликозидами, входят и гликозиды с агликонами ланостанового типа (без лактона) с неукороченной боковой цепью.

Трисульфатированные фроидозиды

Из подфракции фрондозидов группы А7 с помощью ВЭЖХ было выделено 8 индивидуальных соединений, среди которых было 5 новых гликозидов: фрондозиды А7-1 (30), А7-2 (31), А,-3 (32), А7-4 (33) и изофрондозид С (34), а 3 гликозида идентифицированы с известными соединениями: фрондозидом С (27) из голотурии С frondosa, кореозидом А (28) из С. koraiensis и изокореозидом А (29) из С. conicospermium. Причем, фрондозид С и изокореозид А были впервые выделены в нативном виде.

Анализ ЯМР спектров показал, что фрондозиды 30 - 34 имеют одинаковые углеводные цепи, совпадающие по строению с углеводными цепями кукумариозидов группы А7, выделенных ранее из голотурии С. japónica.

Фрондозид Ач-1 (30) имел голостановый агликон, идентичный агликону фрондозида А2-1 (20), описанного выше. Брутто-формула (СздНвдС^ЗзЫаз - пик [М + Na]+ с m/z 1545) и фрагментация молекулы в MALDI-TOF (+) масс-спектре (пики с т/г. 1443, 1341), характеризующая строение углеводной цепи, подтверждали структуру фрондозида А7-1 (30).

Фрондозид Ач-2 (31) отличался от 30 только отсутствием кето-группы при С-16 и, соответственно, имел агликон, идентичный агликону фрондозида А2-4 (23), описанного выше. Брутто формула CssHjiO^SjNaj, определенная на основе MALD1-TOF (+) масс-спектра (пик [М + Na]+ с m/z 1531) и фрагментация углеводной цепи соответствовали формуле 31 для фрондозида А7-2.

Фрондозид АтЗ (32) характеризовался наличием такой же ланостановой полициклической системы, как и фрондозид С (27). В боковой цепи 32 также имелась 24(25)-двойная связь (сигналы при 123.1 и 132.1 м.д. в ЯМР 13С спектре). Однако, в спектрах ЯМР 32, по сравнению со спектрами 27, сигналы С-22 и Н-22 находились в более сильном поле (76.96 и 3.88 м.д., соответственно), а сигналы, соответствующие О-ацетатной группе, отсутствовали. Это указывало на наличие атома углерода (С-22), связанного с гидроксильной группой. Конфигурация асимметрического центра при С-20 была определена как Я, по аналогии с фрондозидом С, и подтверждалась наличием в >ЮЕ8У спектре фрондозида А7-3 кросс-пиков Н21/Н12 и Н22/Н|6. Конфигурация асимметрического центра при С-22 также была определена как К, что следовало из одинаковых значений химических сдвигов С-20 и С-22 в ЯМР "С спектре 32, которые совпадают в случае

й-Д-конфигураций этих асимметрических центров в модельных соединениях такого типа, а в случае 11,8-конфигураций отличаются на 2 м.д. Таким образом, агликон 32 - ланоста-9(11),24-диеи-Зр,20(11),22(Д)-триол. Данные MALDI-TOF (брутго-формула C59H95034S3Na3, пик [М + Na]+ с m/z 1535) подтвердили соответствие структуры фрондозида А7-3 формуле 32.

Фрондозид Ат-4 (33) являлся изомером фрондозида А7-3 по положению двойной связи в ядре агликона (ланоста-7,24-диен-Зр,20(R),22 (Я)-триол) и, следовательно, отличался от последнего только некоторыми сигналами полициклической системы в ЯМР 13С и 'Н спектрах. Наличие в NOESY спектре 33 кросс-пиков между Н-9 и Н-18, Н-9 и Н-19, а также между Н-18 и Н-19, свидетельствовало о конформации ванны для кольца С в неголостановом агликоне фрондозида А7-4.

Изофрондозид С (341 был выделен в нативном виде из подфракции трисульфатированных гликозидов. 34 представлял собой изомер фрондозида С (27) только по положению двойной связи в полициклической системе (7(8)-, а не 9(11)-двойная связь). Агликон изофрондозида С - 22(К)-ацетоксиланоста-7,24-диен-Зр,20(Я)-диол - был идентичен агликону фрондозида А2-8 (26), описанного выше. Структура агликона изофрондозида С устанавливалась на основе ЯМР спектров его десульфатированного производного (35). Таким образом, фрондозид С и изофрондозид С представляли собой пару изомеров, аналогичную фрондозидам А7-3 и А7-4, кореозиду А и изокореозиду А.

Обычно в гликозидных фракциях голотурий содержатся гликозиды, имеющие в агликонах либо 7(8)-, либо 9(11)-двойную связь, и лишь в четырех видах голотурий (С. conicospermium, P. australis, N. magnum, Р. fabricií) были одновременно обнаружены гликозиды и с 7(8)-, и с 9(11)-двойной связью. Причем, только в случае С. conicospermium - это были изомеры по положению двойной связи в ядре агликонов.

В то же время, из подфракции трисульфатированных гликозидов голотурии С. frondosa впервые были выделены три пары изомеров, различающихся только по положению двойной связи в агликонах (7(8)- или 9(11)-). Еще одной характерной чертой фракции трисульфатированных фрондозидов было то, что из 8 выделенных гликозидов - 6 содержали неголостановые агликоны и только два соединения -фрондозида А7-1 и А7-2 - типичные для большинства голотурий голостановые агликоны.

Дисульфатированные фрондозиды

Из подфракции дисульфатированных фрондозидов группы А3/А6, содержащей, как и две предыдущие подфракции, сложную сумму гликозидов, удалось выделить только один компонент - новый гликозид - фрондозид А3-1 (36).

СНгОН CHjOSO^Na

ОН

Фрондозид А?-1 (36). Положение двух сульфатных групп в углеводной цепи 36 при С'-4 и С3-6 было определено по наличию а- и р-сдвигающих эффектов сульфатных групп в ЯМР 13С спектре и подтверждено двумерными ЯМР спектрами, которые говорили об идентичности углеводных цепей 36 и кукумариозида А3 из С. japónica.

Данные ЯМР свидетельствовали о том, что агликоном фрондозида А3-1 являлся голоста-7ДЗ-диен-ЗР,25-диол, как и в случае фрондозида А2-3 (22).

4.2. Количественное содержание гликозидов в некоторых частях тела голотурии Cucumaria frondosa

Сравнительное изучение ' количественного содержания компонентов гликозидной фракции в различных частях тела голотурии С. frondosa (стенка тела с покровным эпителием, покровный эпителий, щупальца и глоточное кольцо) показало, что суммарное содержание гликозидов в покровном эпителии (1.4 % от массы сухого остатка) примерно в 2,5 раза превышает этот показатель в стенках тела (0.6 % от массы сухого остатка) и почти в 4 раза - в щупальцах и глоточном кольце (0.4 % от массы сухого остатка). Таким образом, максимальное количество гликозидов накапливается в кожных покровах голотурий, что вполне согласуется с теорией о внешней защитной функции тритерпеновых гликозидов. Отражением этой функции тритерпеновых гликозидов служит их гемолитическая активность, напрямую связанная с мембранотропным действием. Установлено, что фрондозид А, проявляющий достаточно высокую гемолитическую активность, является одним из основных компонентов гликозидной фракции и максимальное его количество обнаруживается именно в покровном эпителии (17 % от суммы гликозидов) В то же время, суммарная фракция трисульфатированных фрондозидов доминирует по процентному содержанию во всех частях тела голотурий (от 46 до 58 % от суммы гликозидов), хотя известно, что гемолитическая активность гликозидов с тремя сульфатными группами в три раза ниже, чем активность моносульфатов. Такое высокое содержание фрондозидов группы А7, очевидно, свидетельствует о выполнении этими веществами каких-то других биологических функций, помимо защиты организма-продуцента от хищников и обрастателей. Резкое различие между типами накапливаемых гликозидов во фракциях «моносульфатов»

(2 неголостановых из 9 выделенных) и «трисульфатов» (6 неголостановых из 8 выделенных), вероятно, также подтверждает разделение их биологических функций. Неголостановые трисульфатированные гликозиды могут выполнять некую «гормональную функцию», аналогичную функциям стероидных гормонов. Подобие некоторых агликонов гликозидов С. frondosa структурам стероидных гормонов и их предшественников может служить подтверждением высказанного предположения.

Схема 2. Возможные пути биосинтетических трансформаций гликозидов.

В процессе биосинтеза стероидных гормонов из холестерина происходит укорочение его боковой цепи через стадию окисления 20-го и 22-го положений. Биосинтетическим предшественником тритерпеновых гликозидов голотурий является ланостерин, который, вероятно, претерпевает аналогичные холестерину (у животных) трансформации в организме голотурий (вопросы миграции двойной связи в ядре агликонов не рассматривались). Так, при сопоставлении структур фрондозидов А7-3 (32) и А7-4 (33); фрондозида С (27) и изофрондозида С (34), и, наконец, кореозида А (28) и изокореозида А (29) можно проследить реализацию данных трансформаций. Схема биосинтеза норланостановых (с укороченной боковой цепью) агликонов была предложена ранее, однако вновь полученные данные позволяют дополнить недостающие промежуточные стадии и проследить её реализацию непосредственно на гликозидах одного вида голотурии.

На схеме 2 в качестве начальной, после ланостерина, стадии биосинтеза гликозидов приведены фрагменты структуры пенаустрозидов А и В, выделенных японскими учеными из голотурии Pentacta austral is, т.к. фрондозидов с такой степенью окисленности агликонов выделить пока не удалось. Пенаустрозиды наиболее близки к ланостерину, по сравнению с остальными гликозидами голотурий, т.к. содержат только одну гидроксильную группу - при С-20. В голотурии С. frondosa обнаружены гликозиды, находящиеся на следующей ступени биосинтетических превращений: фрондозиды А7-3 (32) и А7-4 (33), у которых появляется вторая гидроксильная группа - при С-22. Далее превращения могут идти по двум путям: (За) - ацетилирование гидроксила при С-22

{фрондозид С (27), изофрондозид С (34)} и/или (36) - расщепление боковой цепи по связи С-20 - С-22 с образованием агликонов кореозида А (28) и изокореозида А (29), обнаруженных в гликозидной фракции С. frondosa, которые, возможно, выполняют гормональную функцию в организме голотурии, что оправдывает возникновение такой биосинтетической схемы.

4.3. Гликозиды голотурии Cucumaria okhotensis

Голотурия Cucumaria okhotensis является массовым промысловым видом, обитающим в Охотском море у берегов Камчатки. Этот вид был описан совсем недавно и его гликозидный состав еще не изучался. Выделение гликозидов голотурии С. okhotensis было важно не только с научной, но и с прикладной точки зрения.

Гликозидная фракция голотурии С. okhotensis, как и других видов рода Cucumaria, состоит из нескольких групп гликозидов различной полярности, которая зависит от строения углеводных цепей и числа сульфатных групп. В ходе данной работы была изучена подфракция моносульфатированных гликозидов, из которой было выделено два соединения: основной компонент данной подфракции -кукумариозид Ао-1 (37) и минорный компонент - охотозид А,-1 (38).

........... ff^Zl 38 Х

НО4—f \ ..*■

он ---------"'

Кукумариозид Ал-1 (37). По данным ЯМР спектров и физическим константам гликозид 37 был полностью идентичен кукумариозиду Ао-1, выделенному ранее из С japónica.

Охотозид A¿-1 (38) имел линейную тетрасахаридную углеводную цепь, такую же как фрондозид А| (19) из С. frondosa (по данным ЯМР). Агликоном 38 был 1бР-ацетоксиголост-7-ен-Зр-ол-23-он, как и в кукумариозиде Ао-1 (37), о чем свидетельствовало совпадение соответствующих частей ЯМР спектров 37 и 38. Таким образом, отличие охотозида АГ1 от кукумариозида Ао-1 состоит в отсутствии терминального остатка ксилозы, как и в случае фрондозидов At и А из С. frondosa.

Начатые исследования гликозидов голотурии С okhotensis показали отличие ее фракции моносульфатированных гликозидов от аналогичных групп гликозидов других видов рода Cucumaria и подтвердили обоснованность выделения нового вида в составе рода Cucumaria. Необходимо отмстить, что при использовании гликозидных фракций разных видов дальневосточных кукумарий в качестве сырья

для изготовления каких-либо лекарственных препаратов, требуется их тщательный анализ, тк. свойства препаратов могут изменяться из-за вариаций гликозидного состава.

5. Физиологическая активность глнкозидов Cucumaría frondosa

В связи с разработкой иммуномодулирующего препарата на основе гликозидов С. frondosa, были изучены некоторые аспекты биологического действия как основного компонента гликозидной фракции - фроидозида А, так и нескольких подфракций. Работа проводилась совместно с фирмой «Coastside Bioresources» (США) и была поддержана грантом американского фонда CRDF.

5.1. Биологическое действие фрондозида А (18)

Было обнаружено, что фрондозид А в низких, субтоксических концентрациях (0,002 - 2,0 мкг/мышь) проявляет значительный иммуностимулирующий эффект, а именно: вызывает повышение лизосомальной активности перитонеальных макрофагов мышей при внутрибрюшиниом введении (максимальное - более, чем в 2 раза - в концентрации 0,2 мкг/мышь). При этом эффект фрондозида А нарастает очень быстро, и значительная стимуляция наблюдается уже на следующий день после введения и достигает максимума на 4 - 5-й день. Кроме того, фрондозид А оказывает двойственное влияние на образование активных форм кислорода (АФК -синглетный кислород, перекись водорода, пероксинитрит и продукты их взаимодействия друг с другом - так называемый окислительный взрыв), необходимых макрофагам для обезвреживания инфекционных патогенных микроорганизмов. В диапазоне концентраций 0,0001 - 0,01 мг/мл фрондозид А стимулирует образование АФК (на 3 - 45 % от уровня контроля), причем максимальный эффект (45 %) наблюдается при концентрации гликозида 0,001 мг/мл. В цитотоксической концентрации 1,0 мкг/мл фрондозид А значительно ингибирует образование АФК (на -9 % от уровня контроля). Аналогичные результаты были получены при оценке уровня фагоцитоза в макрофагах под влиянием фрондозида А (максимальная стимуляция - на 20 % от уровня контроля -наблюдалась при концентрации гликозида 0,001 мг/мл). Таким образом, фрондозид А является прямым иммуномодулятором клеточного иммунитета.

Кроме того, были изучены некоторые аспекты действия фрондозида А на систему гуморального иммунитета, в частности его влияние на образование антителообразующих клеток селезенки (АОК) и на антительный ответ на антиген. Установлено, что фрондозид А в низких субтоксических концентрациях от 0,02 до 2,0 мкг/мышь вызывал слабый иммуностимулирующий эффект: увеличение числа антителообразующих клеток, максимальное - при концентрации 0,2 мкг/мышь (индекс стимуляции 1.86) и незначительное повышение титра антител (на 40 - 60 %) по сравнению с контролем в дозах 0,02 - 0,2 мкг/мышь. Таким образом,

фрондозид А вызывает слабое повышение активности системы гуморального иммунитета. Такое сочетание иммуномодулирующих свойств: повышение активности макрофагов без значительного повышения уровня антител (губительного в случае ряда заболеваний, например, алеутской болезни норок) является весьма перспективным для создания лекарственных препаратов.

Важно отметить и значительную разницу между токсическими дозами фрондозида А и дозами, в которых он проявляет полезные для применения свойства. Так, для проявления гемолитической и эмбриотоксической активности, необходимы достаточно высокие концентрации фрондозида А: ЕСюо = 12,5 мкг/мл для гемолитического действия (по отношению к эритроцитам мышей) и ЕС)(Ю = 3,12 мкг/мл для эмбриотоксического действия (по отношению к развивающимся эмбрионам морских ежей).

5.2. Влияние фрондозндов различных групп на лизосомальную активность перитонеальных макрофагов

Фрондозиды проявляли следующие иммуномодулирующие свойства: моносульфатированные (фрондозид А, фрондозиды группы А2, композиция фрондозид А/фрондозиды группы А2 (13%)) стимулировали лизосомальную активность перитонеальных макрофагов, а дисульфатированные (фрондозиды группы Аз/А«) и трисульфатированные (фрондозиды группы А7) - угнетали

Таблица 1. Синергизм действия композиции фрондозидов А/А2 (13 %) на

лизосомальную активность перитонеальных макрофагов

Стимуляция, % от контроля

Вещество Концентрация, мкг/мл

0.025 0,05 ■ ' ОМ 0,19 0.38

Фрондозид А 0 0 ъгз 18.9 15.7

Фрондозиды А2 62.7 42.9 "0. » 0

Фрондозиды А/А2 (13%) 10.9 -55.5 . 48.8 44.4 0

При этом, моносульфатированные глнкозиды в разной степени стимулировали макрофаги, например: фрондозид А вызывал повышение активности на 16 - 33 % по сравнению с уровнем контроля (в диапазоне концентраций 0.38 - 0,1 мкг/мл); фрондозиды группы А2 оказывали больший эффект (43 - 63 %) в меньших концентрациях (0,05 - 0,025 мкг/мл); композиция фрондозидов А/А2 проявляла усредненные эффекты (стимуляция на 44 - 55 % при концентрациях 0.19 - 0.05 мкг/мл). Но при этом чрезвычайно интересен был наблюдаемый синергизм действия этой композиции (табл. 1, стр. 20).

Результаты тестирования биологической активности гликозидов голотурии С. frondosa весьма интересны и важны для дальнейшего прикладного использования этих соединений. В настоящее время подана заявка на патент США

«S.A. Avilov, V. I. Kalinin, A.S. Silchenko, D.L. Aminin, I.G. Agafonova, V.A. Stonik,

P.D. Collin and C. Woodward "Process for Isolating Sea Cucumber Saponin Frondoside

A, and Immunomodulatory Methods of Use" Attorney Docket: 2898/102, USPTO

Application Number: 60/579,335». В дальнейшем планируется оформление данной

заявки в форме международного патента в соответствии с РСТ протоколом.

5. ВЫВОДЫ

1. Изучен гликозидный состав 8 видов голотурий семейств Holothuriidae, Stíchopodidae и Synallactidae отряда Aspidochirotida и семейства Cucumariidae отряда Dendrochirotida. Выделено 36 тритерпеновых гликозидов, структуры 25 из них установлены впервые, 11 гликозидов идентифицированы с известными.

2. Впервые в голотуриях найдены тритерпеновые гликозиды, содержащие: два остатка З-О-метилксилозы, а,Р-ненасьпценный кето-фрагмент в боковой цепи агликона, сульфатную группу при С-3 остатка хиновозы. Впервые из одного вида голотурий выделены 3 пары гликозидов, являющихся изомерами только по положению двойной связи в ядре агликонов.

3. Изучен гликозидный состав трех видов рода Holothuria, собранных в Средиземном море, выделено 5 гликозидов (из них 3 - новых). Показано, что для средиземноморских представителей рода Holothuria специфичны голотурнны групп А и В, как и для видов Holothuria, обитающих в тропиках.

4. Проведен сравнительный анализ структур 5 выделенных гликозидов голотурии

Synallactes nozawai и 2 гликозидов Pseudostichopus trachus, предложено считать голотурию Pseudostichopus trachus принадлежащей к семейству Synallactidae.

5. Найдено, что гликозиды голотурии Stichopus mollis значительно отличаются от

гликозидов других видов рода Stichopus. Учитывая особенности структур тритерпеновых гликозидов, а также морфологические признаки S. mollis, выполнена ревизия таксономического статуса этого вида, который выведен в новый род - Australostichopus.

6. Изучена фракция моносульфатированных гликозидов голотурии Cucumaria okhotensis, показано её отличие от гликозидов других изученных представителей рода Cucumaria, что подтверждает правомерность описания Cucumaria okhotensis как нового вида.

7. Изучен гликозидный состав промысловой голотурии Cucumaria frondosa, выделено 18 нативных гликозидов (из них 13 - новых). Проведен анализ количественного распределения гликозидов в некоторых частях тела С. frondosa и изучена биологическая активность фрондозидов. Показана перспективность применения в качестве иммуностимуляторов гликозидных препаратов из С. frondosa.

Основные публикации по теме диссертации

l.Silchenko A.S., Avilov S.A., Antonov A.S., Kalinin V.I., Kalinovsky A.I., Stonik V.A., Smirnov A.V., Riguera R., Jimenez C. Triterpene glycosides from the deep-water North-Pacific sea cucumber Synallactes nozawai Mitsukuri // J. Nat. Prod. 2002. Vol. 65, № 12. P. 1802-1808.

2.Silchenko A.S., Avilov S.A., Kalinin V.I., Antonov A.S., Stonik V.A., Kalinovsky A.I., Riguera R., Jimenez C. Triterpene glycosides from the sea cucumber Synallactes nozawai Mitsukuri (Synallactidae, Aspidochirotida) // Abstr. of 3-rd European Conference on Marine Natural Products, September 15 -20, 2002, Munich. Munich, 2002. P. 83.

3.Silchenko A.S., Avilov S.A., Kalinin V.I., Kalinovsky A.I., Stonik V.A., Smirnov A.V. Pseudostichoposide В - new triterpene glycoside with unprecedent type of sulfatation from the deep-water North-Pacific sea cucumber Pseudostichopus trachus II Nat. Prod. Res. 2004. Vol.18, № 6. P. 565 - 570.

4.Moraes G., Northcote P.T., Kalinin V.I., Avilov S.A., Silchenko A.S., Dmitrenok P.S., Stonik V.A., Levin V.S. Structure of the major triterpene glycoside from the sea cucumber Stichopus mollis and evidence to reclassify this species into the new genus Australostichopus // Biochem. Syst. Ecol. 2004. Vol. 32. P. 637 - 650.

5.Silchenko A.S., Avilov S.A., Antonov A.S., Kalinin V.I., Kalinovsky A.I., Woodward C., Collin P. Structure of eight new monosulfated triterpene oligoglycosides from the Northern Atlantic sea cucumber Cucumaria frondosa II Abstr. of the International Conference on Saponins "Phytochemistry & Application of Plant Saponins", September 8- 10, 2004, Pulawy (Poland). Pulawy: Institute of Soil Science and Plant Cultivation, 2004. P. 113

6.Silchenko'A.S., Avilov S.A., Antonov A.S., Kalinovsky A.I., Dmitrenok P.S., Kalinin • V.I., Stonik V.A., Woodward C., Collin P. Glycosides from the sea cucumber Cucumaria frondosa III. Structures of frondosides A2-l, A2-2, A2-3 and A2-6, four new minor monosulfated triterpene glycosides // Can. J. Chem. 2005. Vol. 83, № 1. P. 21-27.

7.Silchenko A.S., Stonik V.A., Avilov S.A., Kalinin V.I., Kalinovsky A.I., Zaharenko A.M., Smirnov A.V., Mollo E., Cimino G. Holothurins B2, B3 and B4, New Triterpene Glycosides from the Mediterranean Sea Cucumbers of the genus Holothuria H J. Nat. Prod. 2005. Vol. 68. P. 564 - 567.

8.Moraes G., Northcote P.T., Silchenko A.S., Antonov A.S., Kalinovsky A.I., Dmitrenok P.S., Avilov S.A., Kalinin V.I., Stonik V.A. Mollisosides A, Bi and B2 - three new minor triterpene glycosides from the New Zealand and South Australian sea cucumber Australostichopus mollis (Hutton) // J. Nat. Prod. 2005. Vol. 68, № 6. P. 842 - 847.

Соискатель

Сильченко А. С.

Силъченко Александра Сергеевна

НОВЫЕ ТРИТЕРПЕНОВЫЕ ГЛИКОЗИДЫ ИЗ 8 ВИДОВ ГОЛОТУРИЙ СЕМЕЙСТВ НОЬОТШШГОАЕ, ЭТТСНОРООЮАЕ, SYNALLACTIDAE И СиСиМАШГОАЕ

Автореферат

Отпечатано 19.08.2005 г. в типографии ООО «Былина Ко., ЛТД» г. Владивосток, ул. Комсомольская, 1, тел. 45-77-40 Заказ № 3038. Тираж 100 экз.

in

»15969

РНБ Русский фонд

2006-4 12990

1. введение.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР ТРИТЕРПЕНОВЫЕ ГЛИКОЗИДЫ ГОЛОТУРИЙ И ИХ ТАКСОНОМИЧЕСКОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ.

2.1. Введение.

2.2. Структуры и таксономическая специфичность гликозидов голотурий отряда Aspidochirotida.

2.2.1. Гликозиды голотурий семейства Ilolothuriidae.

• Голотурины.

• Бохадшиозиды.

• Голотуринозиды.

2.2.2. Гликозиды голотурий семейства Stichopodidae.

• Теленотозиды и стихопозиды.

• Голотоксины.

2.3. Структуры тритерпеновых гликозидов голотурий отряда Dendrochirotida.

2.3.1. Гликозиды голотурий семейства Cucumariidae.

• .< Подсемейство Cucumariinae.

• ! Подсемейство Colochirinae.

• , Подсемейство Thyonidiinae.

2.3.2. Гликозиды голотурий семейства Phyllophoridae.

2.3.3. Гликозиды голотурий семейства Sclerodactylidae.

• Подсемейство Sclerodatylinae.

• Подсемейство Cladolabinae.

2.3.4. Гликозиды голотурий семейства Psolidae.

2.4. Гликозиды голотурий химически малоисследованных групп.

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

3.1. Гликозиды голотурий отряда Aspidochirotida.

3.1.1. Гликозиды средиземноморских голотурий рода Holothuria семейства Ilolothuriidae.

3.1.2. Гликозиды голотурии Australostichopus mollis семейства Stichopodidae.

3.1.3. Гликозиды голотурий семейства Synallactidae.

• Гликозиды голотурии Synallactes nozawai.

• Гликозиды голотурии Pseudostichopus trachus.

3.1.4. Тритериеновые гликозиды и филогения отряда Aspidochirotida.

3.2. Гликозиды голотурий семейства Cucumariidae отряда Dendrochirotida. 9

3.2.2. Гликозиды голотурии Cucumaria frondosa.

• Моносульфатированные фрондозиды группы А2.

• Трисульфатированные фрондозиды.

• Дисульфатированные фрондозиды.

• Количественное содержание групп гликозидов в некоторых частях тела голотурии Cucumaria frondosa.

3.2.3. Гликозиды голотурии Cucumaria okhotensis.

3.2.4. Физиологическая активность гликозидов Cucumaria frondosa.

4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

4.1. Приборы и материалы.

4.2. Биологический материал.

4.3. Стандартные методики.

4.3.1. Моносахаридный анализ.

4.3.2. Сольволитическое десульфатирование.

4.3.3. Периодатное окисление.

4.4. Установление строения гликозидов.

4.4.1. Гликозиды голотурии Holothuria tubulosa.

4.4.2. Гликозиды голотурии Holothuria sp.

4.4.3. Гликозиды голотурии Holothuria polii.

4.4.4. Гликозиды голотурии Australostichopus mollis.

4.4.5. Гликозиды голотурии Synallactes nozawai.

4.4.6. Гликозиды голотурии Pseudostichopus trachus. ф 4.4.7. Гликозиды голотурии Cucumaria frondosa.

4.4.8. Гликозиды голотурии Cucumaria okhotensis.

5. ВЫВОДЫ.

Актуальность проблемы. Голотурии и некоторые виды губок уникальны тем, что содержат нехарактерные для других групп животных вторичные метаболиты - тритерпеновые гликозиды. До их обнаружения в голотуриях соединения этого класса считались метаболитами исключительно высших наземных растений. Первоначально интерес к вторичным метаболитам голотурий определялся высокой ихтиотоксичностью экстрактов из этих животных, что и послужило стимулом к развитию структурных исследований тритерпеновых гликозидов. В дальнейшем был также выявлен широкий спектр их биологической активности: гемолитические, цитостатические, антигрибковые, противоопухолевые, иммуномодулирующие свойства. Сейчас гликозиды голотурий являются действующими началами лекарственных препаратов и биологически активных пищевых добавок, используемых как в медицине, так и в ветеринарии.

По мере накопления данных о химическом строении тритерпеновых гликозидов голотурий различных систематических групп, стала очевидной специфичность этих соединений для таксонов разного уровня. Появилась возможность использовать тритерпеновые гликозиды в качестве хемотаксономических маркеров.

Для некоторых групп голотурий характерно наличие чрезвычайно сложных и разнообразных по составу сумм гликозидов. При этом, выделение основных и минорных гликозидов и анализ особенностей их строения может быть использован для построения гипотетических схем биосинтеза тритерпеновых гликозидов.

Голотурии семейства Но1о11шгнс1ае (отряд Азр1с!осЫгоис1а), обитающие на мелководье в тропической зоне Тихого и Индийского океанов, имеющие высокое содержание гликозидов и несложные гликозидные суммы, изучены достаточно полно. Однако, представители этого семейства, населяющие зоны умеренного и субтропического климата, например, Средиземноморье, не изучались. В то же время известно, что гликозиды атлантической НоШИипа /опкаШ, отличаются от гликозидов голотурий - обитателей тропиков. Поэтому изучение гликозидов средиземноморских представителей рода НоЫИипа было интересно не только с химической точки зрения, но и в плане хемосистематики.

Представлял интерес и состав гликозидных фракций голотурий семейства Synallactidae (отряд Aspidochirotida), включающего в основном глубоководных обитателей. К началу наших исследований была известна структура только одного гликозида из голотурии Pseudostichopus írachus, однако, принадлежность данного вида к семейству Synallactidae оспаривалась рядом систематиков.

Представители отряда Dendrochirotida содержат гораздо более сложные смеси тритерпеновых гликозидов, по сравнению голотуриями отряда Aspidochirotida. В связи с тем, что в состав этого отряда входят массовые промысловые виды рода Cucumaria, изучение их гликозидов представляет не только научный, но и прикладной интерес. Эти виды голотурий не только употребляются в пищу, но и А* являются сырьем для изготовления ряда лекарственных препаратов и биодобавок. Поэтому знание состава гликозидных сумм из различных видов рода Cucumaria, точных структур гликозидов и проявляемой ими биологической активности необходимо для расширения практического применения этих препаратов. В связи с этим изучались гликозиды из двух видов голотурий рода Cucumaria: атлантической Cucumaria frondosa и камчатской Cucumaria okhoíensis.

Ь Целью данной работы является:

• Выделение и установление полных структур тритерпеновых гликозидов из 6 видов голотурий семейств Holothuriidae, Stichopodidae и Synallactidae (отряд Aspidochirotida), а также из 2 видов голотурий рода Cucumaria (семейство Cucumariidae, отряд Dendrochirotida).

• Анализ особенностей химического строения гликозидов голотурий в целях ф разрешения некоторых спорных вопросов систематики класса I lolothuroidea.

• Выяснение возможности и перспективности использования гликозидов промысловой голотурии С. frondosa в составе иммуномодулирующих препаратов.

Научная новизна и практическая ценность работы. Из 8 видов голотурий было выделено 36 тритерпеновых гликозидов: для 25 новых соединений установлены полные химические структуры, а 11 гликозидов идентифицированы с * известными.

Впервые из голотурий выделены гликозиды, содержащие: сульфатную группу при С-3 остатка хиновозы, два остатка З-О-метилксилозы, а,р-ненасыщенный кето-фрагмент в боковой цепи агликона. Впервые из одного вида голотурий выделено 3 пары гликозидов, являющихся изомерами только по положению двойной связи в ядре агликонов. Кроме того, выделены новые гликозиды, содержащие глюкозу во втором положении углеводной цепи, вместо типичной для большинства гликозидов голотурий хиновозы.

Показано, что для средиземноморских представителей рода Holothuria специфичны голотурины групп А и В, как и для видов Holothuria, обитающих в тропиках. Изучен гликозидный состав голотурии Australostichopus mollis. На основе полученных данных, а также данных сравнительной морфологии произведен пересмотр её таксономического статуса. В результате анализа структур 7 гликозидов, выделенных из голотурий Synallacíes nozawai и Pseudostichopus trachus, предложено считать последнюю принадлежащей к семейству Synallactidae. Установлено отличие фракции моносульфатированных гликозидов нового вида голотурии - Cucumaria okhotensis от гликозидов аналогичных групп других изученных представителей рода Cucumaria. Изучен гликозидный состав промысловой голотурии Cucumaria frondosa. Показана перспективность применения в медицине и ветеринарии гликозидных препаратов из С. frondosa в Л качестве иммуностимуляторов.

Публикация результатов исследования. Основные результаты данной работы опубликованы в таких научных журналах как: Journal of Natural Products, Canadian Journal of Chemistry, Biochemical Systematics and Ecology, Natural Products Research. Материалы работы были представлены на третьей Европейской % Конференции по Морским Природным Соединениям, проходившей с 15 по 20 сентября 2002 года в Мюнхене; а также на международной конференции по сапонинам "Phytochemistry & Application of Plant Saponins", проводившейся с 8 по 10 сентября 2004 года в г. Пулавы (Польша). По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 6 статей в рецензируемых журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из Введения и

5. ВЫВОДЫ

Изучен гликозидный состав 8 видов голотурий семейств Holothuriidae, Stichopodidae и Synallactidae отряда Aspidochirotida и семейства Cucumariidae отряда Dendrochirotida. Выделено 36 тритерпеновых гликозидов, структуры 25 из них установлены впервые, 11 соединений идентифицированы с известными гликозидами.

Впервые в голотуриях найдены тритерпеновые гликозиды, содержащие: два остатка З-О-метилксилозы, а,р-ненасыщенный кето-фрагмент в боковой цепи агликона, сульфатную группу при С-3 остатка хиновозы. Впервые из одного вида голотурий выделены 3 пары гликозидов, являющихся изомерами только по положению двойной связи в ядре агликонов.

Изучен гликозидный состав трех видов рода Holothuria, собранных в Средиземном море, выделено 5 гликозидов (из них 3 - новых). Показано, что для средиземноморских представителей рода Holothuria специфичны голотурины групп А и В, как и для видов Holothuria, обитающих в тропиках. Проведен сравнительный анализ структур 5 выделенных гликозидов голотурии Synallactes nozawai и 2 гликозидов Pseudostichopus trachus, предложено считать голотурию Pseudostichopus trachus принадлежащей к семейству Synallactidae.

Найдено, что гликозиды голотурии Stichopus mollis значительно отличаются от гликозидов других видов рода Stichopus. Учитывая особенности структур тритерпеновых гликозидов, а также морфологические признаки S. mollis, выполнена ревизия таксономического статуса этого вида, который выведен в новый род - Australostichopus.

Изучена фракция моносульфатированных гликозидов голотурии Cucumaria okhotensis, показано её отличие от гликозидов других изученных представителей рода Cucumaria, что подтверждает правомерность описания Cucumaria okhotensis как нового вида.

Изучен гликозидный состав промысловой голотурии Cucumaria frondosa, выделено 18 нативных гликозидов (из них 13 - новых). Проведен анализ количественного распределения гликозидов в некоторых частях тела С. frondosa и изучена биологическая активность фрондозидов. Показана перспективность применения в качестве иммуностимуляторов гликозидных препаратов из С. frondosa.

1. Смирнов А.В. К вопросу о системе класса IIolothuroidea // Зоол. Журн. 1984. Т.63.С. 547-553.

2. Kerr A., Kim J. Phylogeny of Holothuroidea (Echinodermata) inferred from morphology // Zool. J. Lin. Soc. 2001. Vol. 133. P. 63 81.

3. Smith A. B. Echinoderm larvae and phylogeny // Annual Review of Ecology and Systematics. 1997. Vol.28. P.219 241.

4. Pawson D. L. Synopsis and Classification of living organisms // Holothuroidea. N. Y.:Mc Graw Hill, 1982. P. 813-818.

5. Smiley S. Microscopic Anatomy of Invertebrates // Echinodermata. N. Y.: Wiley-Liss, 1994. Vol. 14. P. 401 471.

6. Калинин В. И., Левин В. С., Стоник В. А. Химическая морфология: ■фитерпеновые гликозиды голотурий (Holothurioidea, Echinodermata).-Владивосток: Дальнаука, 1994. 284 с.

7. Nigrelli R.F., Chanley J.D., Kohn S., Sobotka H. The chemical nature of holothurin, a toxic principle from the sea cucumber (Echinodermata, Holothuroidea) // Zoologica. 1955. Vol. 40, № 1. P. 47 48.

8. Yamanouchi T. On the poisonous substance contained in holothurians // Publ. Seto Marine Biol. Lab. 1955. Vol. 4. P. 184 202.

9. Chanley J. D., Ledeen R., Wax J., Nigrelli R. F., Sobotka H. Holothurin. I. The Isolation, Properties and Sugar Components of Holothurin A // J. Am. Chem. Soc. 1959. Vol. 81, № 17. P. 5180-5183.

10. Chanley J. D., Mezzetti Т., Sobotka H. The Holothurinogenins // Tetrahedron. 1966. Vol. 22, №6. P. 1857- 1884.

11. Burnell D.J., ApSimon J.W. Echinoderm saponins // Marine Natural Products. Chemical and Biological Perspectives. N. Y.: Acad. Press, 1983. Vol. 5. P. 287-321.

12. Habermehl G.G., Krebs H.C. // Studies in Natural Products Chemistry. Elsevier Science Publishers. В. V.: Amsterdam, 1990. Vol. 7. P. 265 316.

13. Еляков Г. Б., Стоник В.А. Терпеноиды морских организмов. М.: Наука, 1986. -270 с.

14. Habermehl G., Volkvein G. Aglycones of the Toxins from the Cuverian Organs of Holothuria forskali and a New Nomenclature for the Aglycones from Holothuroidea // Toxicon. 1971. Vol. 9, № 4. P. 319 326.

15. Kitagawa I., Nishino T., Matsuno T., Akutsu H., Kyogoku Y. Structure of holothurin В a pharmacologically active triterpene-oligoglycoside from the sea cucumber Holothuria leucospilota Brandt // Tetrahedron Lett. 1978. № 11. P. 985 988.

16. Стоник В. А., Чумак А.Д., Исаков B.B., Белогорцева Н.И., Чирва В .Я., Еляков Г.Б. Гликозиды морских беспозвоночных. VII. Строение голотурина В из Holothuria atra II Химия природ, соедин. 1979. № 2. С. 522 527.

17. Калинин В.И., Стоник В.А., Авилов С.А., Еляков Г.Б. Гликозиды голотурии•

18. Holothuria edulis II Химия природ, соедин. 1981. № 3. С. 403 404.

19. Bhatnagar S., Dudouet В., Ahond A., Poupat С., Thoison О., Clastres A., Laurent D., Potier P. Invertebres marins du lagon neocaledonien IV. Saponines et sapogenines d'une holothurie, Actinopyga flammea II Bull. Chim. France. 1985. № 1. P. 124-129.

20. Еляков Г.Б., Калиновская Н.И., Калиновский А.И., Стоник В.А., Кузнецова Т.А. Гликозиды морских беспозвоночных. XIII. Новые голотуриногенины голотурина Bi из голотурии Holothuria floridana II Химия природ, соедин. 1982. №3. С. 323-327.

21. Олейникова Г.К., Кузнецова Т.А. Двухступенчатая деградация по СмитуIголотурина Bj из голотурии Holothuria floridana II Химия природ, соедин. 1983. № 4. С. 534 536.

22. Олейникова Г.К., Кузнецова Т.А. Гликозиды голотурии Holothuria atra II Химия природ, соедин. 1986. № 5. С. 652.

23. Parameswaran P. S., Naik C. G., Das В., Kamat S. Y. Echinoside В from the Lakshadweep sea cucumber Actinopyga mauritiana (Quoy and Gaimard) // Indian J. Chem. 1991. Vol. ЗОВ. P. 375 376.

24. Kitagawa I., Kobayashi M., Kyogoku Y. Marine natural products. IX. Structural elucidation of triterpenoidal oligoglycodides from the bachamean sea cucumber Actinopyga agassizi Selenka // Chem. Pharm. Bull. 1982. Vol. 30, № 6. P. 2045-2050.

25. Kitagawa I., Nishino Т., Kyogoku Y. Structure of holothurin A a biologically active triterpene-oligoglycoside from the sea cucumber Holothuria leucospilota Brandt // Tetrahedron Lett. 1979. № 16. P. 1419 1422.

26. Иванова П.С., Сметанина О.Ф., Кузнецова T.A. Гликозиды морских беспозвоночных. XXVI. Голотурин А из тихоокеанской голотурии Holothuria squamifera. Выделение нативного агликона // Химия природ, соедин. 1984. № 4. С. 448-451.

27. Олейникова Г.К., Кузнецова Т.А. Гликозиды голотурии Holothuria atra II Химия природ, соедин. 1986. № 5. С. 652.

28. Cordeiro M. L., Djerassi С. Biosynthetic Studies of Marine Lipids. 25. Biosynthesis of A900 Sterols and Saponins in Sea Cucumbers // J. Org. Chem. 1990. Vol. 55. P. 2806-2813.

29. Олейникова Г.К., Кузнецова T.A., Калиновский А.И., Стоник В.А., Еляков Г.Б. Голотурин Aj новый тритерпеновый гликозид голотурии Holothuria floridana II Химия природ, соедин. 1981. № 1. С. 101 - 102.

30. Олейникова Г. К., Кузнецова Т. А., Ровных Н. В., Калиновский А. И., Еляков Г. Б. Гликозиды морских беспозвоночных. XVIII. Голотурин А2 из карибской голотурии Holothuria floridana II Химия природ, соединений. 1982. № 4. С. 527 528.

31. Калинин В.И., Стоник В.А. Гликозиды морских беспозвоночных. Структура голотурина А2 из голотурии Holothuria edulis II Химия природ, соедин. 1982. №2. С. 215-219.

32. Калинин В.И., Стоник B.A. Гликозиды голотурии Bohadschia graeffei II Химия природ, соедин. 1982. № 6. С. 789 790.

33. Иванова Н.С., Кузнецова Т.А. Голотурин А основной тритерпеновый гликозид юовьеровых органов голотурии Bohadschia graeffei И Химия природ, соедин. 1985. № 1. С. 123 - 124.

34. Левин B.C., Калинин В.И., Стоник В.А. Опыт использования химических признаков при пересмотре таксономического статуса голотурии Bohadschia graeffei с выделением нового рода // Биология моря. 1984. № 3. С. 33 38.

35. Kitagawa I., Kobayashi M., Ilori M., Kyogoku Y. Structures of four new triterpenoidal oligoglycosides, bivittoside А, В, C, and D, from the sea cucumber Bohadschia bivittata Mitsukuri // Chem. Pharm. Bull. 1981. Vol. 29, № 1. P. 282-285.

36. Антонов A.C., Стоник B.A. Гликозиды голотурий рода Bohadschia II Химия природ, соедин. 1986. № 3. С. 379 380.

37. Rodriguez J., Castro R., Riguera R. Holothurinosides: new antitumor non sulphatedtriterpenoid glycosides from the sea cucumber Holothuria forskalii II Tetrahedron.1991. Vol. 47, № 26. P. 4753 4762. v

38. Elyakov G.B., Stonik V.A., Levina E.V., Slanke V.P., Kuznetsova T.A., Levin V.S. Glycosides of marine invertebrates -1. A comparative study of the glycoside fraction of Pacific sea cucumbers // Сотр. Biochem. Physiol. 1973. Vol. 44B. P. 325 336.

39. Шарыпов В.Ф., Чумак А.Д., Стоник B.A., Еляков Г.Б. Гликозиды морских беспозвоночных. X. Строение стихопозидов А и В голотурии Stichopus chloronotus II Химия природ, соедин. 1981. № 2. С. 181-184.

40. Стоник В.А., Мальцев И.И., Еляков Г.Б. Строение теленотозидов А и В из голотурии Thelenota ananas И Химия природ, соедин. 1982. № 5. С. 624 627.

41. Стоник В.А., Мальцев И.И., Калиновский А.И., Кондэ К., Еляков Г.Б. Гликозиды морских беспозвоночных. XI. Два новых тритерпеновых гликозида из голотурий сем. Stichopodidae II Химия природ, соедин. 1982. № 2. С. 194-199.

42. Мальцев И.И., Стоник В.А., Калиновский А.И. Стихопозид Е новый тритерпеновый гликозид из голотурий сем. Stichopodidae И Химия природ, соедин. 1983. № 3. С. 308 - 312.

43. Maltsev I.I., Stonik V.A., Kalinovsky A.I., Elyakov G.B. Triterpene glycosides from sea cucumber Stichopus japonicus Selenka // Сотр. Biochem. Physiol. 1984. Vol. 78B, № 2. P. 421-426.

44. Левин B.C., Калинин В.И., Федоров СЛ., Смайли С. Структура тритерпеновых гликозидов и систематическое положение двух видов голотурий семейства Stichopodidae II Биология моря. 1986. № 4. С. 72 77.

45. Еляков Г.Б., Стоник В.А., Афиятуллов Ш.Ш., Калиновский А.И., Шарыпов В.Ф., Коротких Л Л. Нативные генины из гликозидов голотурий // Докл. АН СССР. 1981. Т. 259, № 6. С. 1367 1369.

46. Stonik V.A., Kalinin V.I., Avilov S.A. Toxins from sea cucumbers (Holothuroids): chemical structures, properties, taxonomic distribution, biosynthesis and evolution // J. Nat. Toxins. 1999. Vol. 8, № 2. P. 235-248.

47. Стоник B.A., Авилов C.A., Калинин В.И. Биологически активные вещества из голотурий (морских кубышек) // Успехи в изучении природных соединений. Владивосток: Дальнаука, 1999. С. 105 123.

48. Miyamoto Т., Togawa К., Higuchi R., Komori Т. Constituents of Holothurioidea, I. Isolation and structures of three triterpenoid aglycones, cucumechinol A, B, and C, from the sea cucumber Cucumaria echinata I I Liebigs Ann. Chem. 1990. № 1. P. 39-42.

49. Findlay J.A., Daljeet A. Frondogenin, a new aglycone from the sea cucumber Cucumariafrondosa 11 J. Nat. Prod. 1984. Vol. 47, № 2. P. 320 324.

50. Rodriguez J., Riguera R. Lefevriosides: four novel triterpenoid glycosides from the sea cucumber Cucumaria lefevrei II J. Chem. Research (M). 1989. P. 2620 2636.

51. Miyamoto Т., Togawa K., Iliguchi R., Komori Т., Sasaki T. Constituents of Holothurioidea, II. Six newly identified biologically active triterpenoid glycoside sulfates from the sea cucumber Cucumaria echinata H Liebigs Ann. Chem. 1990. P. 453-460.

52. Girard M., Belanger J., ApSimon J. W., Garneau F.-X., Harvey C., Brisson J.-R. Frondoside A. A novel triterpene glycoside from the holothurian Cucumaria frondosa И Can. J. Chem. 1990. Vol. 68. P. 11 18.

53. Yayli N., Findlay J.A. A triterpenoid saponin from Cucumaria frondosa II Phyto-chemistry. 1999. Vol. 50. P. 135 138.

54. Findlay J.A., Yayli N., Radies L. Novel sulfated oligosaccharides from the sea cucumber Cucumaria frondosa II J. Nat. Prod. 1992. Vol. 55, № 1. P. 93 101.

55. Авилов C.A., Калинин В.И., Дроздова О., Калиновский А.И., Стоник В.А., Гудимова Е.Н. Тритерпеновые гликозиды голотурии Cucumaria frondosa II Химия природ, соедин. 1993. №2. С. 260-263. ■•••?.

56. Yayli N. Minor saponins from the sea cucumber Cucumaria frondosa II Indian J. Chem. 2001. Vol. 40B. P. 399 404.

57. Авилов C.A., Тищенко Л.Я., Стоник B.A. Строение кукумариозида А2-2 -тритерпенового гликозида из голотурии Cucumaria japónica // Химия природ, соедин. 1984. № 6. С. 799 800.

58. Дроздова О.А., Авилов С.А., Калиновский А.И., Стоник В.А. Новый ацетилированный гликозид из голотурии Cucumaria japónica II Химия природ, соедин. 1992. № 5. С. 590 591.

59. Дроздова О.А., Авилов С.А., Калиновский А.И., Стоник В.А. Минорный гликозид из голотурии Cucumaria japónica II Химия природ, соедин. 1992. № 5. С. 593.

60. Дроздова О.А., Авилов С.А., Калиновский А.И., Стоник В.А., Мильгром Ю.М., Рашкес Я.В. Новые гликозиды из голотурии Cucumaria japónica II Химия природ, соедин. 1993. № 2. С. 242 248.

61. Авилов С.А. Новый тритерпеновый гликозид из голотурии Cucumaria japónica II VII Молодежная конференция по синтетическим и природным физиологически активным соединениям, 1984 г., Ереван: тезисы. Ереван, 1984.-с. 141.

62. Авилов С.А., Стоник В.А., Калиновский А.И. Строение четырех новых тритерпеновых гликозидов из голотурии Cucumaria japónica II Химия природ, соедин. 1990. № 6. С. 787 792.

63. Drozdova О.А., Avilov S.A., Kalinin V.I., Kalinovsky A.I., Stonik V.A., Riguero R., Jimenes C. Cytotoxic triterpene glycosides from Far-Eastern sea cucumbers belonging to the genus Cucumaria И Liebigs Ann. 1997. № 11. P. 2351 2356.

64. Дроздова O.A., Авилов C.A., Калиновский A.M., Стоник B.A., Мильгром Ю.М., Рашкес Я.В. Трисульфатированные гликозиды из голотурии Cucumaria japónica II Химия природ, соедин. 1993. № 3. С. 369 374.

65. Avilov S.A., Kalinovsky A.I., Stonik V.A., Kalinin V.I., Riguero R., Jimenes C.J. Koreoside A, a new nonholostane triterpene glycoside from the sea cucumber Cucumaria koraiensis II J. Nat. Prod. 1997. Vol. 60, № 8. P. 808 810.

66. Ilasegava S., Kaneko N., Ilirose Y. Triterpenes from the seed of Abies firma II Phytochemistry. 1987. Vol. 26, № 4. P. 1095 1099.

67. Blund J.W., Stothers J.B. ,3C NMR spectra of steroids a servey and commentary // Org. Magn. Res. 1977. Vol. 9, № 8. P. 439 - 464.

68. Maier M. S., Roccatagliata A. J., Kurriss A., Chludil II., Seldes A. M. Two new cytotoxic and virucidal trisulfated glycosides from the Antharctic sea cucumber Staurocucumis liouvillei И J. Nat. Prod. 2001. Vol. 64. P. 732 736.

69. Chludil II. D., Muniain С. C., Seldes A. ML, Maier M. S. Cytotoxic and antifungal triterpene glycosides from the Patagonian sea cucumber Hemioedema spectabilis // J. Nat. Prod. 2002. Vol. 65. P. 860 865.

70. Miyamoto Т., Togawa K., Higuchi R., Komori Т., Sasaki T. Structures of four new triterpenoid oligoglycosides: ds-penaustrosides А, В, C, and D from the sea cucumber Pentacta australis II J. Nat. Prod. 1992. Vol. 55, № 7. P. 940 946.

71. Калинин В.И., Стоник B.A., Авилов C.A. Гомологическая изменчивость и направленность в эволюции тритерпеновых гликозидов голотурий (Holothurioidea, Echinodermata) // Журн. общ. биологии. 1990. Т. 51, № 2. С. 247-260.

72. Авилов С.А., Калиновский А.И., Стоник В.А. Два новых тритерпеновых гликозида из голотурии Duasmodactyla kurilensis II Химия природ, соедин. 1991. №2. С. 221-226.

73. Калиновский А.И., Авилов С.А., Степанов В.Р., Стоник В.А. Гликозиды морских беспозвоночных. XXIII. Курилогенин новый генин из гликозидов голотурии Duasmodactyla kurilensis II Химия природ, соедин. 1983. № 6. С. 724-727.

74. Zou Zheng Rong, Yi Yang Hua, Wu Hou Ming, Wu Jiu Hong, Liaw Chih Chaung & Lee Kuo Hsiung // Intercedensides A C, three new cytotoxic triterpene glycosides from the sea cucumber Mensamaria intercedens Lampert. J. Nat. Prod. 2003. Vol. 66. P. 1055-1060.

75. Zou Zheng Rong, Yi Yang Hua, Xu Qiang Zhi, Wu Hou Ming & Lin Hou Wen // A new disul fated triterpene glycoside from the sea cucumber Mensamaria intercedens Lampert. Chin. Chem. Lettters. 2003. Vol. 14. P. 585 587.

76. Афиятуллов Ш. Ш., Калиновский А. И., Стоник В. А. Строение кукумариозидов Ci и C2 двух новых тритерпеновых гликозидов из голотурии Eupentacta fraudatrix II Химия природ, соединений. 1987. № 6. С. 831 - 837.

77. Калинин В. И., Афиятуллов Ш. Ш., Калиновский А. И. Тритерпеновые гликозиды голотурии Eupentacta pseudoquinquesemita II Химия природ, соединений. 1988. № 2. С. 221 225.

78. Калинин В. И., Авилов С. А., Калиновский А. И., Стоник В. А. Кукумариозид G3 минорный тритерпеновый гликозид из голотурии Eupentacta fraudatrix II Химия природ, соедин. 1992. № 5. С. 729 - 730.

79. Zurita M.B., Ahond A., Poupat C., Potier P., Menou J.L. Invertebres marins du lagon Neo-Caledonien, VII. Etude structurale d'un nouveau saponoside sulfate extrait de l'holothurie, Neothypnidium magnum II J. Nat. Prod. 1986. Vol. 49, № 5. P. 809-813.

80. Авилов C.A., Калиновский А.И., Стоник B.A. Новый тритерпеновый гликозид из голотурии Neothionidium magnum II Химия природ, соедин. 1990. № 1. С. 53-57.

81. Авилов С. А. Тритерпеновые гликозиды голотурий отряда Dendrochirotida: дис. д-ра. хим. наук / Тихоокеанкий ин-т биоорган, химии ДВО РАН. Владивосток, 2000.-313 с.

82. Авилов С. А., Калинин В. И., Калиновский А. И., Стоник В. А. Кукумариозид G2 минорный тритерпеновый гликозид из голотурии Eupentacta fraudatrix II Химия природ, соедин. 1991. № 3. С. 438 - 439.

83. Bonnard I., Rinehart K. L. Thyonosides A and B, two new saponins isolated from the holothurian Thyone aurea II Tetrahedron. 2004. Vol. 60. P. 2987 2992.

84. Афиятуллов Ш.Ш., Тищенко Л.Я., Стоник В.А., Калиновский А.И., Еляков Г.Б. Структура кукумариозида Gj — нового тритерпенового гликозида из голотурии Cucumaria fraudatrix Н Химия природ, соедин. 1985. № 2. С. 244 248.

85. Avilov S.A., Kalinin V.I., Makarieva T.N., Stonik V.A., Kalinovsky A.I. Structure of cucumarioside G2, a novel nonholostane glycoside from the sea cucumber Eupentacta fraudatrix И J. Nat. Prod. 1994. Vol. 57, № 8. P. 1166 1171.

86. Авилов C.A., Калинин В.И., Калиновский А.И., Стоник В.А., Мильгром Ю.М., Рашкес Я.В. Кукумариозид G4 новый тритерпеновый гликозид из голотурии Eupentacta fraudatrix II Химия природ, соедин. 1992. № 6. С. 691 - 694.

87. Encarnación R., Carrasco G., Espinoza M., Anthoni U., Nielsen P.H., Christophersen С. Neothyoside A, proposed structure of a triterpenoid tetraglycoside from the pacific sea cucumber, Neothyone gibbosa И J. Nat. Prod. 1989. Vol. 52, № 2. P. 248 251.

88. Encarnación R., Murillo D. J. I., Nielsen J., Christophersen C. Neothyoside В, a triterpenoid diglycoside from the Pacific sea cucumber Neothyone gibbosa И Acta Chem. Scand. 1996. Vol. 50, № 9. P. 848 849.

89. Авилов C.A., Стоник B.A. Новые тритерпеновые гликозиды из голотурии Cladolabes sp. // Химия природ, соедин. 1988. № 5. С. 764 765.

90. Garneau F.-X., Simard J.L., Harvey О., ApSimon J.W., Girard M. The structure of psoluthurin A, the major triterpene glycoside of the sea cucumber Psolus fabricii И Can. J. Chem. 1983. Vol. 61, № 7. P. 1465 1471.

91. Калинин В.И., Калиновский А.И., Стоник В.А. Структура псолюсозида А -основного тритерпенового гликозида из голотурии Psolus fabricii II Химия природ, соедин. 1985. № 2. С. 212 217.

92. Калинин В.И., Калиновский А.И., Стоник В.А., Дмитренок П.С., Елькин Ю.Н. Структура псолюсозида В неголостанового тритерпенового гликозида из голотурий рода Psolus И Химия природ, соедин. 1989. № 3. С. 361 - 368.

93. Murray A. P., Muniain C., Seldes A. M., Maier M. Patagonicoside A: a novel antifungal disulfated triterpene glycoside from the sea cucumber Psolus patagonicus II Tetrahedron. 2001. Vol. 57. P. 9563 9568.

94. Avilov S.A., Kalinin V.I., Smirnov A.V. Use of triterpene glycosides for resolvingtaxonomic problems in the sea cucumber genus Cucumaria (Holothurioidea, Echinodermata) // Biochem. Syst. Ecol. 2004. Vol. 32. P.715 733.

95. Шашков A.C., Чижов O.C. Спектроскопия ,3C ЯМР в химии углеводов и родственных соединений // Биоорг. химия. 1976. Т. 2, № 4. С. 437 497.

96. P.S., Stonik V.A., Levin V.S. Structure of the major triterpene glycoside from the seacucumber Stichopus mollis and evidence to reclassify this species into the new genus Australostichopus II Biochem. Syst. Ecol. 2004. Vol. 32. P. 637 650.

97. Hutton F. W. Catalogue of the Echinodermata of New Zealand with diagnosis of the species. Wellington: Colonial Museum Geological Survey Department, 1872. -17 p.

98. Dendy A. Observations on the holothurians of New Zealand // J. Linnaean Soc. Lond. (Zool.). 1897. Vol. 26. P. 22 52.

99. O'Loughlin P.M. A review of the holothurian family Gephyrothuriidae // Proceedings of Ninth international echinoderm conference, August 5 9, 1996, San Francisco, California, USA. Balkema, Rotterdam, 1998. P.493 - 498.

100. Deichmann E. Report on the Ilolothurians, collected by the Harvard expedition 1938 and 1939, with a revision of the Molpadonia of the Atlantic Ocean // Mem. Soc. Cubana Hist. Nat. 1940. Vol. 14, № 3. P. 183 240.

101. Левин B.C., Калинин В.И., Стоник B.A. Строение тритерпеновых гликозидов и систематика щитовиднощупальцевых голотурий // Биология моря. 1985. № 2. С. 3 11.

102. Новый эффективный препарат для ветеринарии КМ-2 (кукумариозид-2) // Новости звероводства. 1991. № 2. С. 4.

103. Левин В. С. Cucumaria okhotensis (Echinodermata: Ilolothuroidea) новый вид голотурий из Охотского моря // Биология моря. 2003. Т. 29, № 3. С. 202 - 205.

104. Hikino II., Okuyama Т., Arihara S., Hikino Y., Takemoto Т., Mori II., Shibata K. Shidasterone, an Insect Metamorphosing Substance from Blechnum niponicum: Structure // Chem. Pharm. Bull. 1975. Vol. 23, № 7. P. 1458 1479.170t

105. Хефтман Э. Биохимия стероидов M.: Мир, 1972. - 176 с.

106. Мецлер Д. Биохимия: в 3 т. М.: Мир. - Т. 2: Химические реакции в живой клетке. - 1980.-606 с.

107. Лукнер М. Вторичный метаболизм у микроорганизмов, растений и животных. -М.: Мир, 1979.-560 с.

108. Физер Л., Физер М. Стероиды М.: Мир, 1964. - 982 с.

109. Sheikh Y. М., Djerassi С. Byconversion of Lanosterol into Holotoxigenin a Triterpenoid from the Sea Cucumber Stichopus californicus II Chem. Communs. 1976. №24. P. 1057- 1058.

110. A.C. Allison, M.R.Young. Vital Staining and Fluorescence Microscopy of Lysosomes // "Lysosomes in Biology and Pathology." North Holland: Amsterdam, 1969. Vol. 2. P. 600-628.

111. Millot С. Characterization of Acidic Vesicles in Multidrug-Resistant and Sensitive Cancer Cells by Acridine Orange Staining and Confocal Microspectrofluorometry // J. Ilistochem. Cytochem. 1997. Vol. 45. P. 1255 1259.

112. Childs E.W., Udobi K.F., Wood J.G., Hunter F.A., Smalley D.M., Cheung L.Y. In vivo Visualization of Reactive Oxidants and Leukocyte-Endothelial Adherence Following Hemorrhagic Shock // Shock. 2002. Vol. 18. P. 423 427.

113. Emmendorffer S.F, Hecht M., Lohman-Mattes M.-L., Roester J. A Fast Easy Method to Determine the Production of Reactive Oxygene Intermediates by Human and Murine Phagocytes Using Dihydrorodamine 123 // J. Immunol. Meth. 1990. Vol. 131. P. 269-275.

114. Uff C.R., Pockley A.G., Phillips R.K. A Rapid Microplate-Based Fluorometric Assay for Phagocytosis // J. Immunol. Invest. 1993. Vol. 22 P. 407.

115. Wan C.P., Park C.S., Lau B.H. A Rapid and Simple Microfluorometric Phagocytosis Assay // J. Immunol. Meth. 1993. Vol. 162. P. 1.

116. Aminin D.L., Agafonova I.G., Berdyshev E.G., Isachenko E.G., Avilov S.A., Stonik V.A. Immunomodulatory properties of cucumariosides from the edible Far-Eastern holothurian Cucumaria japónica //J. Med. Food. 2001. Vol. 4, № 3. P. 127 135.