Выделение и установление химического строения тритерпеновых гликозидов голотурий семейства Cucumariidae отряда Dendrochirotida тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

ргБ ОД

1 Ь ФЕВ «98

На пр;нш рукописи

ДРОЗДОВА Ольга Анатольевна

Выделение и установление химического строения тритерпеновых глнкозидов голотурий семейства СиситагИ(1ае отряда Веп(1госЫго11(1а.

02. 00. 10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Владивосток 1998 г.

Работа выполнена и Тихоокеанском институте биоорганической химии Дальневосточного отделения РАН

кандидат химических наук Авилов С.А

доктор химических наук Высоцкий В.И. кандидат химических наук Стригииа Л.И.

Иркутский институт химии СО РАН

Зашита состоится 1998 г. в 10 часов на заседании

диссертационного совета Д 003.99.01 в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100-летия Владивостока, 159, ТИБОХ.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке ДВО РАН (Владивосток-22, пр. 100-летия Владивостока, 159, ДВГИ).

Автореферат разослан

"¿¿3 1998 г.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат химических наук ^^ -

старшим научный сотрудник ¿'¿^¿-¿¿-¿у-г- Прокопенко Г. И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуал ь 11 ость п робл о м ы. Изучение i рптсрпсмо1'.ых глпкозидов голотурии началось более сорока .чет назад п продолжается по ceii день. Интерес к л им соединениям определяется их высокой и разнообразной биологической актшшостыо. Для утих веществ обнаружено гемолитическое, противогрибковое, противоопухолевое действие, а так же иммуностимулирующие, адыовантные и радионротекторные свойства. В настоящее время в ветеринарии применяется препарат КМ, обладающий иммуностимулирующим действием, созданный на основе глпкозидов из голотурии G/c/wiaria japónica. Ведутся работы и по созданию на основе тритерпеновых глпкозидов голотурий лекарственных средств.

Тритерпеновые гликозиды голотурии характеризуются также определенно]"! таксономической специфичностью, что позволяет использовать их для уточнения систематики голотурш"! и изучения путей эволюции этих животных.

Изучение биологической роли и физиологической активности тритерпеновых глпкозидов голотурш'!, взаимосвязи между их структурой и биологической активностью, разработка на основе глпкозидов новых лекарственных препаратов могут основываться только на знании полной химической структуры этих соединении.

Развитие выделительной техники в последние годы сделало возможным разделение самых сложных глпколцных фракций и выделение не только основных, но п минорных компонентов, а совершенствование спектральных методов полюляет устанавливать структуру глпкозидов неразрушающпмп методами, имея минимальное количество нового соединения.

Целью настоящей работы является выделение и установление структуры тритерпеновых глпкозидов из ряда видов голотурий семейства Cucumaríiihic отряда Denilrochirotirfn.

Научная новизна и практическая ценность работы. Из трех видов голотурш"! семейства СисшпапМае было выделено 13 тритерпеновых глпкозидов. Для 11 ранее неизвестных глпкозидов установлена полная структура, а для двух соединений проведена структурная идентификация с пшестпими веществами.

Впервые in голотурии выделом глпкозпд, содержании! ацетатную группу is углеводной цепи. Также установлено строение глнкозида, относящегося к группе редких нетолостановых гликозидов.

Получение в ходе данной работы серий веществ, различающихся как но строению углеводных цепей, так и по строению агликонов, позволило провести различные С::оиспытанпя. Так, били подучены данные о влиянии особенностей строения гликозидов, а именно: моносахаридного состава, числа и положения сульфатных групп в углеводной цепи, наличш: кетогруппы в аглнконе, на гемолитическую активность и выход ионов К+ из эритроцитов.

Апробацчч результатов. Материалы работы докладывались на 210th American Chemical Society National Meeting, Chicago, 1995 r.

Публикации. По итогам исследований опубликовано _9_ печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 96 страницах

машинописного текста, содержит 9 таблиц. Список литературы включает_N7

шгнруемых работ.

Используемые сокращения: ЯМР - ядерный магнитный резонанс; FABMS -масс-спектрометрия с ионизацией быстрыми атомами; ЖХВД - жидкостная хроматографии высокого давления; ЯЭО - ядерный эффект Оверхаузера; ГЖХ -газо-жидкосшая хроматография; LSIMS - масс-спектрометрия с ионизацией ускоренными ионами цезия.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Изучение химической структуры тритерпеповых гликозидов голотурий.

1.1. Трптерпеновые глпкозиды голотурии Cuaunaria japónica.

Голотурия Cucwnaria japónica содержит сложную смесь тритерпеповых гликозидов. Тонкослойная хроматография гликозпдной суммы показала наличие семи основных пятен. Каждое из этих пятен представляет собой фракцию родственных гликозидов, имеющих, как правило, одинаковые углеводные цегш.

но разлпчаюпшхся строением аглпконов. Эг:1 <])р:гкипп получили обозначения /V). Л|, Л2, А1. Л4, Л6 н Л7.

1.1.1. Кукумариозпды групп Ао и Л|-2.

При поучении малополярнон фракции тригерпеповых гликозидов гологурпн Сиситапа ¡п/юпки было установлено строение четырех новых соединении, кукумариозидов Д0-| (I), Л0-2 (2), Л()-3 (3) и А|-2 (4).

■•«- 5. И, =

^ОАс

,Н

^2= 'С

ОАс -Н

Нг= О

-н

^ОАс

Фракция малополярных гликозидов была получена при многократном колоночном .хроматографии на сплнкагеле исходной г.шкозпдноп суммы. Натпвные кукумариозпды (1, 2, 3 н 4) были очень близки друг к другу по хроматографпческому поведению, и их удалось разделить только после обработки исходной фракции мягким дезацетилнрующнм агентом (раствор N11-, в 50% метаноле). При такой обработке происходит превращение 4 в его дезацетшшрованное производное (11), более полярное по хроматографпческому поведению. Это позволило отделить его (с помощью колоночной хроматографии на си.чикагеле) от гликозидов, не содержащих ацетатной группы в углеводной цепи, и, соответственно, значительно "упростило" исходную гликозидпую

сумму, которую затем разделили методом ЖХВД на отдельные компоненты. Мри этом 2 и 3 выделили в индивидуальном виде. а 1 - со степенью очистки около 85% (по данным ЯМР).

Десульфатированпе малополярной фракции глпкозпдов, с последующим делением полученных продуктов на сплпкагеле н методом ЖХВД, привело к выделению соответствующих десульфатированных производных (5, 6, 7 и 8).

Сравнение ЯМР |3С спектров 1, 2. 3 со спектрами выделенного ранее фрондозида А (9) (см. далее), а также анализ спектров десульфатированных производных (5, 6, 7) показали, что эти глпкознды имеют одинаковые углеводные цепи, состоящие из ксилозы, хпноиозы и З-О-метил-глюкозы в соотношении 3:1:1 и различаются только строением агликонов.

Это подтверждается совпадением соответствующих сигналов в ЯМР '-'С спектрах углеводных частей этих соединении, результатами моносахаридного анализа и спектрами и51М5(+) нативных глпкозпдов (2 и 3), содержащими пики, характерные для фрагментации углеводной цепи фрондозида Л (ш/г 741, 609 н 477) (см. таблицу).

Изучение ЯМР 13С спектров гликозпдов этой группы показало, что они имеют такой же иолнцпклическии фрагмоп агликона, как и фропдознд А (9), и различаются, в основном, строением боковых цепей.

о

он

Таблица

Массовые числа и происхождение ионов в спектрах кукумарпозидов

Л()-2 (2), Л()-3 (3) и десульфатированных производных (5, 6 и 7).

Соединение Заряд ионов, матрица т/г и происхождение ионов

2 + Глицерин 1355 (М№,+Ка)+; 1253 (1355-ЯО_^а+Н)1121 (1253-Ху1); 1077 (1253-3-0-Ме-С1с); 945 (1077-Ху1), 741; 609; 477

3 + 'Глицерин 1311 (Мма+^1)+; 1209 (131 1-50з^\+Н)+; 1077; 1033; 901; 741; 609; 477; 451 (Л^)1

5 + Глицерин + К'аС1 1269 (М + Na)+; 529 (АбЮНЗ)1*; 511

Триэтаноламин (ТЭА) 1245 (М-Н)-; 1113 (1245-Ху1); 1069 (1245-3-0-Ме-Ис); 937 (1069-Ху1); 805 (937-Ху1); 659 (805-ОиО; 527 (АзЮ")

6 + Глицерин 1231 (М+Н)+; 513 (АвЮН3)+; 495 +

(ТЭЛ) 1229 (М-Н)"; 1097 (1229-Ху1); 1053 (1229-3-0-Ме-ас); 921 (1053-Ху1); 789 (921-Ху1); 643 (789-Ош); 511 (ЛрЮ)"

7 (ТЭА) 1185 (М-Н)"; 1053 (1185-Ху1); 1009 (1185-3-0-Ме-С1с); 5П (1009-Ху1); 745 (877-Ху1); .599 (745-Ош); 467 (АеЮ)"

Строение аглпкона кукумариозида Ао-1 (1) было установлено при изучении ЯМР спектров десульфатнрованного производного (5), так как 1 является минорным компонентом и его не удалось выделить о чистом виде.

Сигналы атомов углерода боковой цепи 5 (С-22 - 52,Я; С-23 - 207.4; С-24 -51,8 м.д.) были близки или совпадали с соответствующими сигналами, описанными ранее для боковой цепи спнаптогенина, имеющего кетогруппу при С-23. Эти данные подтверждаются ЯМР 'Н спектром, в котором наблюдаются сигналы протонов при С-22 в виде двух дублетов при 3,15 и 3,95 м.д. с константой спин-спинового взаимодействия 18.6 Гц и сигналы двух СНз-групп при 0,88 (д) н 0,89 (д) м.д. (.1=6,0 Гц). Следовательно, агликоном 5 является 1бр-ацетоксн-голоста-7-ен-3(1-ол-23-он, ранее не встречавшийся в гликозпдпх голотурий.

Таким образом, строение натнвного кукумарнознда А(1-1 (1) было определено как 3-0-{3-0-метил-|!-0-глюкопирано ¡ил-(1-->3)-|1-0-ксплоппрапо-

шл-( I ->4)-|р-П-кеилоппрапо 1Ил-( 1—>2)|-р-0-хиповопирапозил-( 1->2)-4-0-иат-рий сульфат-р-О-ксилоппранозил}- 1бр-ацетоксп-голост-7-ен-Зр-ол-23-оп.

Сопоставление ЯМР ''С спектров кукумариозида А0-2 (2), его десульфатированного производного (6) и фроидозида А (9) показало, что 2 отличается от 9 только наличием дополнительной двойной связи в боковой цепи агликона. Действительно, в ЯМР |3С спектре 6 имеются сигналы при 145,9 п 110,9 м.д., а в ЯМР 'Н спектре наблюдаются сигналы при 4,77 (2Н-26) и 1,68 м.д. (СН)-27), характерные для терминальной 25(26)-двойной связи.

Каталитическое гидрирование 2 привело к получению дигидропроизводного

(9), полностью совпадающего по своим физико-химическим характеристикам и спектральным данным с фрондозидом А, что подтвердило предложенную структуру.

Следовательно, кукумариозид Ао-2 (2) является 3-0-{3-0-метил-р-0-глю-копиранозил-(1->3)-р-0-ксилопиранозил-(1—>4)-|р-0-ксилопиранознл-(1->2)|-р-0-хиновоппранозил-(1->2)-4-0-натрий сульфат-р-0-ксилопиранозил}-16р-аце-токси-голоста-7,25-диен-Зр-олом.

Анализ ЯМР |3С спектров кукумариозида /\«-3 (3) и его десульфатпровапното производного (7) показал, что аглнконом 3 является известный голоста-7,25-диен-Зр-ол-16-он.

Следовательно, кукумариозид А<)-3 (3) является 3-0-{3-0-метил-р-0-глю-копиранозпл-(1->3)-р-0-ксилопиранозил-(1—>4)-|р-0-ксилопнрано:»ил-(1->2)|-|}-0-хиновогшранозил-(1->2)-4-0-натрий сульфат-р-0-ксилопиранозил)-голоста-7,25-диен-Зр-ол-16-оном.

Структура кукумариозида А|-2 (4) была установлена при изучении его десульфатированного производного (8) н дезацетилированиого производного (11), так как нативпый глпкозид не удалось выделить в чистом виде.

Сравнение ЯМР |3С спектров производного (8) с приведенными в литературе спектрами десульфатированного производного кукумариозида А4-2

(10), позволило сделать вывод, что в 8 к С-6 атому концевого глюкозного остатка присоединена ацетатная группа (170,4 и 20,6 м.д.). Действительно, г, спектрах 8, по сравнению со спектрами 10, сигнал С-(> одного из глюкозпых

остатков сдвинут с 62.5 до 64,5 м.д., а С-5 - с 78,1 до 75,1 м.д., что объясняется эффектом ацетнлированпя.

Отнесение данных сигналов к терминальной глюкозе подтверждается серией частично релаксированных спектров, в которых для сигналов терминального моносахарпдного остатка наблюдается более медленная релаксация атомов углерода, чем для других моносахаридиых звеньев.

Данные масс-спектров производного (8) согласуются с предложенной структурой. В спектрах LSIMS''1' ч LSIiMS<"\ соответственно, наблюдаю! ся инки псевдомолекулярных ионов с m/z 1267 (M+Na)+ п 1243 (M-rl)". Альтернативное отщепление от последнего фрагментов 132 и 204 а.е.м. (ионы с m/z 1111 и ЮЗУ) показывает наличие в молекуле терминальных звеньев пентозы п ацетилгексозы.

Строение 4 было подтверждено независимым методом. Обработка производного (8) дезацегилирующим агентом (раствор NH3 в 50% метаноле) дает с количественным выходом 10, а аналогичная обработка исходной суммы превращает 4 в более полярный кукумариозид А4-2 (11). выделенный ранее из этой же голотурии.

Таким образом, строение агликона, последовательность моносахаридиых остатков в углеводной цепи и положение ацетатной группы были установлены при сравнительном изучении 8 и 10. Положение сульфатной группы становится ясным после получения 11, как описано выше.

На основании всех этих данных строение натнвного кукумариозпда Аг2 (4) определено как 3-0-{6-0-aueTiw-|!-D-r;iioKoniipano3ii.T-(l->3)-ß-D-[;iioKoiiiipa-нозил-(1->4)-||1-0-ксилоппрапозпл-(1->2)]-р-0-хиновоппранознл-(1->2)-4-0-на-трий сульфат-(!-0-ксилопиранозпл}-голоста-7,25-днен-3[3-ол- 16-он.

1.1.2. Кукумариознды А3 и А(,-2.

Из фракции полярных гликозидов голотурии Сиангшпа jnponico были выделены индивидуальные кукумариознды A3 (12) и А(>-2 (13).

Сольволптпческое дссульфатнрованпе как 12, так и 13 (при нагревании в смеси ппридип-дпоксан) свидетельствовало о наличии в гликозидах сульфатных групп и привело к получению одного и того же производного (14), которое по своим спектральным, физическим и химическим характеристикам было

идентично десульфатированному производному, полученному щ выделенного ранее кукумарпозида А1-2 (15).

На основании этих данных был сделан вывод, чю 12 и 13 имеют одинаковый с Ач-2 (15) агликон и такую же последовательность соединения моносахаридных остатков в углеводной цепи, по отличаются между собой и от 15 числом и положением сульфатных труни в углеводных цепях.

Сравнение углеводных частей ЯМР '-'С спектров кукумариозидов А) (12), Л(,-2 (13) и их десульфатированното производного (14) позволило предположить, что в углеводной цени эти гдикозиды содержат по две сульфатные группы, причем одна из них находится при С-4 первого ксилозного остатка как в 12, так и в 13, а по положению второй сульфатной группы эти соединения являются изомерами: в 12 сульфатирован гидрокспл при С-б остатка, глюкозы, а в 13 -гпдроксил при С-6 концевой З-О-метил-глюкозы.

Действительно, в ЯМР 13С спектрах кукумарпозида Аз (12) сигнал С-4 первого ксилозного остатка (76,2 м.д.) сдвинут на 5,5 м.д. в слабое поле, а сигналы С-3 (75,7 м.д.) п С-5 (64,7 м.д.) сдвинуты па 1,0 м.д. и 1.7 м.д., соответственно, в сильное поле по сравнению с аналогичными сигналами г,

о

13. Я^ЗО^а; = Н; И3 = 503Ыа

14. I*, = Кг = |?з= Н

15. = Г*2 = Н; = БОз^а

ОН

спектре десульфатированного производного (14). Сигнал С-6 ocraiка глюкозы (68,4 мл.) сдвинут в слабое поле на 5,6 м.д., а сигнал С-5 (76,2 м.д.) сдвинут на 1.6 м.д. в сильное поле относительно соответствующих сигналов в спектре 14, что обьисняется аффектом сульфатирования и свидетельствует о присоединении сульфатных групп к С-4 первого кснлозного и С-6 глюкозного остатков.

Это хорошо согласуется с данными FAB<"> масс-спектра Aj (12), в котором сигнал с т/г 1397 (MiNa-Na)," соответствующий бругго-формуле CsijOjjHgoSiNa, подтверждал наличие ксилозы, глюкозы, хпновозы н З-О-метпл-гдюкозы и соотношении 2:1.1:1, двух сульфатных групп и голостадиеноиового агликона. Фрагментация в этом спектре соответствовала последовательности моносахаридных звеньев в углеводной цепи 12, сигналы с m/z 225, 244, 259 и 261 указывали на положение одной из сульфатных групп при остатке глюкозы, а сигнал с т/г 679 свидетельствовал о присоединении другой сульфатной группы к первому ксилозному остатку.

Такое положение сульфатных групп было подтверждено независимым способом. Ацетилирование 12 до перацетата с последующим сольволитическим десульфатированием привело к производному, имеющему свободные гидроксильные группы на месте О-сульфатных групп. Метилирование этого производного диазометаном в присутствии эфирата трехфтористого бора с последующим кислотным гидролизом дали не только ксилозу, хиновозу п З-О-метил-глюкозу, по и 4-О-метил-ксилозу и 6-О-метил-глюкозу, которые были идентифицированы методом ГЖХ-МС в виде перацетатов соответствующих альдононитрилов.

Таким образом, строение кукумариозпда А3 (12) определено как 3-0-{3-0-метил-р-О-глюкопиранозил-П—>3)-6-0-натрип сульфат-Р-О-глюкопиранозил-(1->4)-|р-0-ксилопиранозил-(1->2)|-р-0-хиновопиранозил-(1->2)-4-0-натрнй сульфат-р-0-ксилоппранознл)-голоста-7,25-диен-Зр-ол- 16-он.

При анализе ЯМР 13С спектров кукумариозпда А^-2 (13) обнаружили, что сигналы атомов углерода первого кснлозного остатка в спектрах 12. п 13 совпадают, а различия наблюдаются в химических сдвигах атомов глюкозного и З-О-метил-глюкозного остатков. Сигнал С-6 остатка З-О-метил-глюкозы в спектре 13 (6S.3 м.д.) сдвинут в слабое поле на 5,5 м.д., а сигнал С-5 этого

моносахаридного остатка (77,3 м.д.) сдвинут на 0,9 м.д. в сильное ноле, по сравнению с соответствующими сигналам» в спектре десульфатированного прои ¡водного (14), что свидетельствует о положении сульфатной группы при С-6 остатка З-О-метил-глюкозы.

Данные FAB(') масс-спектра подтверждают предложенную для гликозида (13) структуру. Сигнал с m/z 1397 (M^Na-Na)" в спектре 13, соответствующий бругго-формуле C59 0 32 H9oS2Na, указывал на наличие ксилозы, глюкозы, хиновозы и 3-0-метил-глюкозы (2:1:1:1), двух сульфатных групп и голостадиенонового агликона. Фрагментация в этом спектре соответствовала последовательности моносахаридных звеньев в углеводной цепи А6-2 (13), а сигналы с m/z 1117, 1119 и 1101 характерны для отрыва терминальной сульфатированной З-О-метил-глюкозы. Сигналы с m/z 195, 211, 227 и 661 указывали на положение второй сульфатной группы при первом остатке ксилозы.

Как и в случае с кукумариозидом Аз (12), положение сульфатных групп в 13 было подтверждено химическим методом. Аналогичная обработка диазометаном в тех же условиях и последующий кислотный гидролиз привели к идентификации ксилозы, хиновозы, 4-О-метил-ксилозы, глюкозы и 3,6-ди-О-метил-глюкозы, что подтверждало число и положение сульфатных групп в 13.

На основании всех этих данных строение кукумариозида А,>-2 (13) определено как 3-0-{6-0-натрий сульфат-З-О-метил-р-О-глюкопиранозил-(1->3)-р-0-глюкопиранозпл-(1->4)-|р-0-ксилопиранозил-(1->2)|-ß-D-xnnoßonn-ранозил-(1->2)-4-0-натрий сульфат-р-0-ксилопиранозил}-голоста-7,25-диен-Зр-ол-16-он.

1.1.3. Кукумариозиды группы k-¡.

Из фракции полярных гликозидов голотурии Cuantiaría japónica в результате многократной колоночной хроматографии на силикагеле и обращенно-фазовои хроматографии на ЖХВД были выделены кукумариозиды A7-I (16), А7-2 (17) и А7-З (18), причем 16 и 18 были выделены в индивидуальном виде, а 17 получен со степенью очистки около SO % (по данным ЯМР).

Сольволитическое десульфатнрование суммы этих соединений при нагревании в смеси пиридин-диоксан свидетельствовало о наличии в гликозпдах

сульфатных групп и привело (после разделения методом ЖХВД) к получению соответствующих производных (19, 20 и 21).

Анализ ЯМР ПС спектров десульфатированных производных (19, 20 и 21) обнаружил, что эти вещества имеют одинаковые углеводные цепи и различаются только строением агликонов.

Об этом также говорят данные моносахаридного анализа этих вещеав, который дм смесь ксилозы, хнновозы, глюкозы и З-О-метил-глюкозы в соотношении 2:1:1:1 (идентифицированных ГЖХ-МС в виде перацетатов альдононитрилов). ЯМР |3С спектры углеводных частей 19, 20 и 21 обнаружили по пять сигналов аномерных атомов углерода в области 100-106 м.д.

Наблюдаемая фрагментация углеводных цепей в спектрах 1.31 М5<") десульфатированных образцов подтверждает идентичность строения олпгосахаридных цепей в молекулах производных (19, 20 и 21).

Более того, по своим физико-химическим характеристикам десульфатированные производные (19, 20 и 21) полностью совпали с десульфатированными производными кукумариозидов А2-2, Аз-З и А>-4, которые были получены из соответствующих гликозидов этой же голотурии.

Следовательно, соединения А7-1 (16), А7-2 (17) и А7-З (18) отличаются от кукумариозидов А1-2 , А1-З и Ао-4, соответственно, только числом сульфатных групп в углеводной цепи.

он

Действительно, сравнение ЯМР |:!С спектров кукумариозида Лу-1 (16) и его десульфатированного производного (19) показало, что 16 имеет три сульфатированные гпдроксильные группы в углеводной части молекулы. Так, сигнал С-4 первого ксилозного остатка (76,1 м.д.) в 16 находится на 5,4 м.д. в более слабом поле, а сигналы С-3 (75,5 м.д.) н С-5 (64,6 м.д.) - на 1,6 и 1,9 м.д., соответственно, в более сильном поле. Кроме того, сигналы С-6 (68,3 м.д.) остатка З-О-метил-глюкозы и С-6 (68,5 м.д.) остатка глюкозы в спектре 16 сдвинуты в слабое поле по сравнению с соответствующими сигналами в спекгре 19 (62,7 и 62,S м.д. соответственно), а сигналы С-5 остатков З-О-метил-глюкозы (77,2 м.д.) и глюкозы (76,1 м.д.) сдвинуты в спектре 16 в более сильное поле относительно аналогичных сигналов в спектре десульфатированного производного (78,3 и 77,9 м.д.). Такие сдвиги характерны дня а- и ß-эффектов сульфатных групп и свидетельствуют о том, что в гликознде A7-I (16) сульфатные группы присоединены к С-4 первого кенлозного остатка и к С-6 остатков З-О-метил-глюкозы и глюкозы.

Это подтверждается данными масс-спектроскопин. В LSIMS("> спектре 16 наблюдается пик псевдомолекулярного нона с m/z 1499 (M3N-,-Na)\ Его последовательный распад по гликозидным связям приводит к нонам с m/z 1221 (1499-|NaSO-O-3-O-Me-Glc]) и 957 (1221-|NaSOjO-Me-Glc|).

На основании всех этих данных был сделан вывод, что кукумариозид A7-I (16) является 3-0-{6-0-натрин сульфат-3-0-метил-р-0-глюкопиранозпл-( 1-Л)-6-О-натрии сульфат-р-0-глюкопиранозил-(1->4)-|р-0-ксилопиранозпл-(1->2)]-|)-П-.\иновоппранозил-(1->2)-4-0-натрий сульфат-[!-0-ксилопиранозил}-голос-та-7,25-диен-Зр-ол-16-оном.

Получение одного и того же десульфатированного производного (20) из кукумарнозндов А;-2 (17) и Ai-З однозначно указывало на то, что аглнконом глпкозида (17) является голост-7-ен-ЗР-ол-16-он. Поскольку олнгосахаридные цепи всех, трех гликозидов идентичны, что следует из данных масс-спектроскопин, результатов моносахарндного анализа п практически полного совпадения сигналов углеводных частей в ЯМР IJC спектрах 16, 17 и 18 и, соответственно, в спектрах их десульфатированных производных (19, 20 и 21), был сделан вывод, что натпвный кукумариозид Л7-2 (17) является 3-0-(6-0-

натрий сульфат-3-0-метнл-|!-0-глюкопнрапозил-( 1->3)-6-0-п атрий судьфа1'-|1-D-rjnoKoiinpatiojn.M-( 1—>4)-|(3-0-ксилоппраноз|1л-( 1->2)|-|!-[)-х1|П01',онирано1нл-(1 ->2)-4-0-натрии сульфат-р-0-ксилопиранозил}-толост-7-ен-3(5-ол-16-оном.

Сравнение ЯМР ПС спектров гликозндоз Д7-3 (18) и Л7-1 (16) и п\ десульфатнрованных производных (19 и 21) показано, что эти соединения отличаются только деталями строения агликона: в 18, по сравнению с 16. отсутствует кетогруппа у С-16 атома углерода. 'Ото подтверждается результатами масс-спектроскопип. В LS1MS(") спектре 18 содержатся пики анионов, состоящих из агликона и части углеводных звеньев, аналогичные соответствующим ионам в спектре 16, но отличающиеся на 14 ед. (1207, 943, 925, 665). Фрагментарные ноны, образующиеся из углеводной цепи, имеют совпадающие массовые числа в масс-спектрах этих гликозндов.

Таким образом, кукумарпозид А7-З (18) является 3-0-{6-0-натрип сульфаг-3-0-метил-р-0-глюкопиранозил-(1->3)-6-0-натрии сульфат-[3-0-глк>коппрапо-зил-(1->4)-[Р-0-ксплопиранозпл-(1->2)|-|3-0-хиновоппранозпл-(1->2)-4-0-наг-рий сулы|)ат-р-0-ксилопиранозил)-голоста-7,25-дпен-3(!-олом.

!,2. Тритерпеновые глпкозиды голотурии Сисшпапп miniatn.

Из спиртового экстракта голотурии Cucumaria miníala с помощью колоночной хроматографии на тефлоновом порошке "Полпхром-1" выделили глпкозпдную фракцию, содержащую сложную смесь веществ. В этой смеси преобладал один компонент, который совпадал по своему хроматографпчсскому поведению на пластинках с закрепленным слоем сплпкагеля и на пластинках с слоем силанпзпрованного сплпкагеля с фракцией трпсульфатпрованных гликозндов из голотурии Сисшпапа japónica. Дальнейшее разделение этой фракции на сплпкагеле п последующая очистка методом ЖХВД позволила выделить основной гликознд данной фракции, названный минпатозндом.

Сравнительный анализ спектральных, . химических и физических характеристик миннатозида показал, что выделенное соединение идентично описанному ранее кукумарпозпду А7-З (18), минорному трпсульфатировапному гликозиду из голотурии С. japónica.

Таким образом, было покачано, что основным компонентом гликозидной фракции голотурии Cucumaría miníala является 3-0-{6-0-натрий сульфат-З-О-метнл-[5-0-глюкопиранозил-(1-->3)-0-0-натрий сульфат-р-О-глюкопиранознл-(1->4)-|р-0-ксилопиранозил-(1->2)|-р-0-хиновопиранозил-(1->2)-4-0-натрнй сульфат-|3-й-ксилопиранозил}-голоста-7,25-диен-Зр-ол.

Совпадение структур гликозндов из С. japónica и С. miníala безусловно свидетельствует об их таксономической близости. П то же время различия в качественном и количественном составе гликозидной суммы, а именно отсутствие или очень низкое содержание в С. miníala moho- и дисульфатированных гликозидов, а также преобладание гликозидов, не содержащих какую-либо кислородную функцию при С-16 в агликоне, показывает наличие некоторой дистанции между ними.

1.3.Тритерпеновые гликозиды голотурии СасшпапаJ'rondosa.

1.3.1. Фропдозиды А и А|.

Из суммарной гликозидной фракции голотурии Cucumaría frondosa были выделены два индивидуальных гликозида: основной компонент гликозидной суммы - фрондозпд А (9) и минорный - фрондозид А] (22). При моносахаридном анализе 9 идентифицировали в виде перацетатов . альдононитрилов З-О-метил-глюкозу, ксилозу и хиновозу в соотношении 1:3:1.

Сольволитическое десульфатиров.шие фрондозида А при нагревании в смеси пиридин-диоксан привело к десульфатпрованиому производному (23). что свидетельствовало о наличии сульфатной группы в 9.

Изучение ЯМР |3С спектров 9, результаты моносахаридного анализа и значения физических констант позволили идентифицировать 9 как фрондозид А. выделенный ранее канадскими учеными из этой же голотурии, но собранной у Атлантического побережья Канады.

Сравнение ЯМР ÜC спектров минорного фрондозида А| (22) и фрондозида, А (9) показало, что агликоном обоих гликозндов является 1бр-ацетоксп-голост-7-ен-Зр-ол, а различия заключаются в строении углеводных цепей.

23 *

№503-г-0 |

О

снлэн

сн

о

он

он

НС

он

Действительно, в продуктах моносахаридного анализа 22 идентифицировали З-О-метил-глюкозу, ксилозу и хпновозу в соотношении 1:2:1, а в ЯМР 13С спектрах наблюдаются сигналы только четырех аномерных атомов углерода.

Сравнительное изучение ЯМР 13С спектров 9 и 22 показало, что в спектрах 22 отсутствуют сигналы, соответствующие концевому остатку ксилозы, и, следовательно, имеется неразветвленная олигосахарндпам цепь, состоящая из четырех моносахаридных остатков.

Для подтверждения строения 22 была проведена деградация по Смиту (с отщеплением концевого ксилозного остатка) фрондозпда А (9). Выделенный при этом прогенпн по физическим константам и спектральным данным полностью совпадал с фрондозидом А|.

Из этих данных следует, что фрондозид А| (22) является 3-0-{3-0-метил-0-глюкоппранозил- (1->3)-р-0- ксилопиранознл- (1->4)-р-0- хпновопиранозпл-(1—>2)-4-0-натрий сульфат-р-0-кснлоппранозпл}-1бр-ацетоксн-голост-7-ен-Зр-олом.

1.3.2. Фрондозид С.

При изучении полярных гликозидов голотурии Сиаттпа /гот/от была выделена фракция, содержащая фрондозид С (24). Гликозиды. составляющие эту

фракцию (по данным ЯМР |3С) различались строением агликонов, но имели одинаковые олигосахаридные цепи.

Действительно, сигналы атомов углерода углеводной части в ЯМР IJC спектре глпкозидпой суммы полностью совпали с соответствующими сигналами в спектре трпсульфатированного кукумариознда Ау-1 (16) из голотурии Cucumaría japónica.

Сольволигическое десульфатирование данной фракции смесью пиридпн-диоксан и последующее разделение продуктов десульфатирования на колонке с енликагелем и методом ЖХВД привело к выделению десульфатированного пронззодного (25). Сравнение ЯМР |3С спектров 25 со спектрами десульфатированного производного (19) кукумариознда A7-I из голотурии С. japónica показало полное совпадение сигналов, относящихся к углеводной цепи, что подтвердило предположение об их идентичности.

ОАс

НО.

RiO

ch2or1

/gr-0

но | НО

он

24 R, = S03Na

25 R, = H

В аглпконнои части ЯМР IJC спектра 25 наблюдались сигналы атомов углерода С-9 п С-II при I49.9 и 115,2 м.д., соответствующие 9(1 |)-двоиной

chhíii к ланосишовом ядре, C-24 п C-25 при 121,7 и 123,3 м.д.. характерные .хтя 24(25)-двойной связи, С-20 при 76,4 м.д. соответствующий третичному аюму углерода, связанному с гпдроксплыюи группой, а также сшпалы ацетатом группы при 170,S н 21,3 м.д. Сигналы С-1 - С-16, С-18, С-19 а также С-.Ч) - С-32 атомов углерода агликопной части в ЯМР '-'С спектре десу.,1ы|)атпроваипого производного (25) были близки к соответствующим сигналам в спектрах десульфатпрованных пенаустрозидов Л и В из Ргппаш uustruHs. cip\Kivpa которых была установлена ранее японскими исследователями. чго свидетельствовало об идентичности полицикличееких систем в агликопах лих глпкозидов. Сигнал С-17 при 50,6 м.д. был сдвинут в сильное поле па 2,7 м.д., сигнал С-20 при 76,4 м.д. был сдвинут на 2,2 м.д. в слабое поле, а сипни С-21 при 21,S м.д. на 5,5 м.д. в сильное поле относительно сигналов в спектре десульфатпрованного пенаустрозида А, что соответствовало (!- и у-сдвпгакшшм эффектам ацетатной группы и свидетельствовало о присоединении этой группы в положение 22 боковой цепи агликона.

В ЯМР 'Н спектре производного (25) наблюдались сигналы олефпновых протонов Н-11 и Н-24 при 5,25 и 5,10 м.д., соответствующих 9(11)- и 24(25)-Двойным связям, сигналы двух метальных групп при С-25 терминального пзопропилидеиового фрагмента (1,62 и 1,67 м.д.), метильпой группы при С-20 (1,27 м.д.), пяти метильных групп циклической системы агликона при 0,75 (СН-,-32), 0.88 (СНГ18), 0,88 (СН3-30), 1,04 (СН3-31), 1,06 (СНГ19) м.д. Сигнал метилыюй группы хпновозного остатка наблюдали при 1,33 (д, .1=6.3) м.д., сигнал ацетатной группы - при 2,00 м.д. п пять дублетов аномерных протонов -при 4.40, 4,43, 4.4S, 5,02 и 5,10 м.д. (J=7,5).

При проведении экспериментов по разностному декаплппгу получили одни и тот же широки!! мультпгглет в сильном поле при 2,05 - 2,31 м.д. при облучении как сигналов Н-22 (дд; 4.7S м.д.), так и сигналов олефинового протона Н-24 (м, 5.10 м.д.) В условиях изучения ЯЭО наблюдали взаимное усиление этих сигналов. Это однозначно доказывало положение ацетатной группы в аглпконе при С-22 и подтверждало 24(25)-положепие двойной связи.

В FABMS'1"' десульфатпрованного производного (25) присутствует пик иеевдомолекулярпого иона с т//. 1271 (M + Na)h. соответствующий брупо-

формуле Cf)|H|()()026, пики с т/г 505 (Agl + Na-H)+ и 507 (Agl+Na+H) соответствующие отрыву агликона, а также пики с m/z 163, 164, 165 и 1129 и 1 130, образовавшиеся в результате С-20 - С-22 разрыва боковой цепи агликона. В данном спектре также наблюдаются фрагментарные ионы, соответствующие последовательному отщеплению моносахарндных звеньев в углеводной цепи 25

Схема. Фрагментация десульфатпрованного производного (25) в спектре

FABMS(+>.

Сравнение ЯМР |3С спектров 25 с литературными данными для крустакдизонового производного, ацетплпрованного в положение 22 п имеющего К-конфигурацпи ассиметрическнх центров С-20 и С-22 позволило определить конфигурации соответствующих асспметрических центров в аглпконе производного (25) как Я.

Таким образом, приведенные выше данные позволяют определю!, структуру фрондозпда С (24) как 3-0-{6-0-натрий сульфаг-З-О-метпл-p-D-глюкоииранозил-(1->3)-6-0-нагрий сульфат-р-О-глюкоппрано шл-( I->4)-||i-D-ксплопиранознл-(1—>2)|-р-П-хииовоииранозил-( 1 —>2)-4-С)-на i piiti сульфат-p-D-ксилопиранозил}~20(Я),22(К)-22-ацетокси-лаиоста-9( 11),24-дпеп-Зр,2()-дпо.ча.

Большинство известных к настоящему времени тритерпеновых гликозидов голотурий относятся к гак называемому голостановому ряду. Известно более 70 таких соединений. Неголостановые глпкозиды, которы,: не содержат 18(20)-лактона, менее обычны. Это курнлошды А и С из Duasinodaclyla kiirílcn.si.s, псолюсозид В из голотурий рода Pso/us. пенаустрознды А и В из Paitada atisrmlis, кукумариозид Gi из Eupentacln fraadatríx. Изученный нами фрондозид С (24) также относится к немногочисленной группе гликоьидов неголосгапового ряда. Свойства и биологическая активность таких гликозидов остаются мяло изученными.

Таким образом, основным компонентом гликошдпоп фракции атлантической голотурии Cuantiaría frondosa, собранной как у Кольского побережья Баренцева моря, так и у Атлантического побережья Канады, является один и тот же глпкозид - фрондозид А (9). В го же время, ни фрондозид А, ни фрондознды Ai (22) и С (24), не идентичны по структуре ни одному из выделенных к настоящему времени гликозидов голотурии Cuantiaría japónica. которая морфологически настолько близка к Спсшнппа f/vndoMt. что сравнительно недавно систематики относили их к одному виду. Полученные нами химические данные подтверждают справедливость разделения этих голотурий на два вида.

2. Биологическая активность гликозидов голотурии Cucumaria japónica.

Проведенные ранее исследования фпшологического действия глнкозпдной суммы Cuantiaría japónica показали. что эти вещества обладают иммуностимулирующим, адыовантным и раднопротекторным действием. В настоящее время в ветеринарии применяются препараты, созданные на основе суммы гликозидов С. japónica. Однако биологическая активность индивидуальных глпкошдов згой голотурии практически не была изучена.

В ходе дампом работы и> гликозидной суммы этой голотурии было выделено п установлено полное строение 9 новых тригерпеновых гликозидов, различающихся как по строению углеводных цепей, так н по строению агликонов. Эго позволило изучить влияние особенностей строения гликозидов па их биологическую активность. Так, были получены данные о влиянии моносахаридного сосиава, числа и положении сульфатных групп, наличия ксюгруппы и аглпкопе на гемолитическую активность и выход ионов К+ из эритроцитов. Данные исследования биологической активности гликозидов голотурии С. ]арошса проводились в лаборатории биоиспытаний ТИЬОХ ДВО 1'АН.

Были изучены как впервые выделенные глпкозиды (А3, Ай-2, А;-!, А7-З и их десульфатпрованные производные), так и описанные ранее кукумариозиды (А>-2, А4-2 и их десульфаты). полученные нами специально для проведения биопепы ганпй.

Исследования вызываемых тритерпеновымп гликозидамп и их производными гемолиза и выхода ионов К+ из эритроцитов белых мышей показали, что для разветвленных пентаозидов, имеющих З-О-метильную группу в терминальном моносахарпдном остатке, сульфатные группы, присоединенные к С-4 первого остатка ксилозы п к С-б третьего (глюкозного) остатка, увеличивают ск ярость выхода ионов К+. Сульфатная группа при С-4 первого ксплозного остатка повышает гемолитическую активность, в то время как сульфат при С-6 третьего моносахаридного остатка снижает ее. Сульфатная группа при С-6 терминальной З-О-метпл-глюкозы резко снижает как гемолитическую активность, так н скорость выхода ионов К+. Наличие сульфатной 1руппы при первом остатке ксилозы в гликозпда.х, не имеющих 3-0-метильноп группы в терминальном моносахариде, также снижает гемолитическую активность и уменьшает скорость выхода ионов К+. Наличие 16-кетогруппы в атликонах гликозидов, имеющих 7(8)-двойную связь, заметно уменьшает гемолитическую активность.

Полученные данные позволили сделать выводы о зависимости мембранотропноп активности от детален строения углеводных цепей и агликонов.

выводы

1. Из i.iiikoиlum.in фракции трех видов ro.'ioiypnii. относящихся к семейству Cticiunariiilae отряда Dendwchirolida выделено 13 трнтерпеноиых глико ¡плов. в том числе I 1 ранее неизвестных.

2. Установлено полное химическое строение кук;, марпо зпдов А»-!, ААп-3, Л|-2. Л.), А(,-2, Л7-1, Л;-2. п Л7-З in гологурии Сиатмгм japonica. фрондошдов А| и С из голотурии Cncianaria J'rondosa. Последнее и > ли\ соединении относится к группе редких неголостановы.х т.шкозидов.

3. Выделены и идентифицированы два ранее известных глнкозида -(1)рондозпд А из Cncumaria frondosa и кукумарношд Л7-З из голотурии Cncumaria minima.

4. Впервые в голотуриях найден трнтерпеповыи глпкозпд, содержании'! ацетатную группу в углеводной цепи (кукумариозид А|-2).

5. Исследована зависимость гемолитической актпвносш гликошлов голотурии Cncumaria japonica от деталей строения аглнконов и углеводных ценен. Гак, были получены данные о влиянии моносахарндното состава, числа и положения сульфатных трупп в углеводной цепи, наличия пли огсу1стг.пя 3-0-мешльнон груши,I н терминальном моносахарпдпом остатке, наличия кетогруппы в атлпконе на гемолитическую активность и выход ионов К' iu эритроцитов.

Основные публикации по теме'диссертации:

1. Дроздова O.A., Авилов С.А., Калнновскпн А.П., Сгоппк В.А. Новин ацетнлировлинин глнкознд m голотурии Cncumaria japonica // Химия природ, соеднн. 1992. № 5. С. 590-591.

2. Дроздова O.A., Авилов С.А., Калнновскпн А.И., Стоннк В.А. Минорный глнкознд из голотурии Cncumaria japonica // Химия природ, соедин. 1992. № 5. С. 593.

3. Дроздова O.A., Авилов С.А., Калиновскнн А.П., Стоннк В.А.. Милыром 10.М., 1'ашксс Я.В. Новые гликозпды из голотурии' Cuannaria japonica // Химия природ, соеднн. 1993. № 2. С. 242-24,S.

4. Авилов С.А., Калинин В.И., Дроздова О.Л., Калпновскип А.И., Стоиик В.А., Гудимова Е.Н. Тритерпеновые глнкозилы голотурии Счситапа frondosn // Химия природ, соедин. 1993. N° 2. С. 260-263.

5. Дроздова О.А., Авилов С.А., Калиновский А.И., Стоник В.А., Мильгром 10.М., Рашкес Я.В. Трисульфатнрованные глпкозиды из голотурии Счситапа japonica // Химия природ, сосдпн. 1993. Na 3. С. 369-374.

6. Kalinin V.I., Prokofieva N.G., Likhatskaya G.N., Slientsova E.B., Agafonova I.G., Avilov S.A., Drozdova O.A, Stonik V.A. Hemolitic activity of triterpene glycosides from tlie Dendrochirotida order Holothurian // Abstr. 210"' American Chem. Soc. National Meeting. Chicago. IL. 1995. P. 156.

7. Kalinin V.I., Prokofieva N.G., Likliatskaya G.N., Slientsova E.B., Agafonova I.G., Avilov S.A., Drozdova O.A. Hemolytic activities of triterpene glycosides from the liolotliuriaii order Dendrochirotida: some trends in the evolution of this group of toxins // Toxicon. 1996. V. 33. № 4. P. 475-4S3.

S. Kalinin V.I., Prokofievn N.G., Likliatskaya G.N., Slientsova E.B., Agafonova I.G., Avilov S.A., Drozdova O.A. Hemolitic Activity of Triterpene Glycosides from the Dendrochirotida order Hololhurian // Saponins Used in Traditional and Modern Medicine (G.R. Waller and K. Yamasaki, eds.). 1996. P. 557-564. Plenum Press, New York.

9. Drozdova O.A., Avilov S.A., Kalinin V.I., Kalinovsky А.1., Stonik V.A., PJguera R., Jimenez C. Cytotoxic triterpene glycosides from far eastern sea cucumbers belonging to the genus Cacnmaria // Liebigs Ann. 1997. № II. P. 2351-2356.