Связь структура-активность в ряду противоопухолевых антибиотиков, их аналогов и производных - новых ингибиторов топоизомеразы I тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

у л

003450822

Деженкова Любовь Георгиевна

СВЯЗЬ СТРУКТУРА-АКТИВНОСТЬ В РЯДУ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ АНТИБИОТИКОВ, ИХ АНАЛОГОВ И ПРОИЗВОДНЫХ - НОВЫХ ИНГИБИТОРОВ ТОПОИЗОМЕРАЗЫI

(02.00.10 - Биоорганическая химия)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Я о опт 2003

Москва - 2008

003450822

Работа выполнена в лаборатории химической трансформации антибиотиков ГУ НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе РАМН (г. Москва)

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Преображенская Мария Николаевна Официальные оппоненты: кандидат химических наук

Жузе Алексей Львович доктор химических наук, профессор Каплун Александр Петрович

Ведущая организация: Институт элементоорганических соединений

им. А.Н.Несмеянова РАН

/

Защита состоится <<$!> 2008 года в /' часов на заседании

диссертационного совета Д 212.120.01 при Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В.Ломоносова по адресу: 119571, г. Москва, проспект Вернадского, д.86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В.Ломоносова (119571, г. Москва, проспект Вернадского, д.86).

С авторефератом можно ознакомиться на сайте www.mitht ru Автореферат разослан <Jlj> ÜKT&tySL 2008 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук,

старший научный сотрудник Л /7 А.ИЛютик

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ1 Актуальность темы. Противоопухолевые антибиотики, такие как антрациклины, производные ауреоловой кислоты и другие, являются важными компонентами современной химиотерапии опухолей. Исследования молекулярного механизма действия этих антибиотиков, а также создание и изучение механизмов действия их производных и аналогов с целью отбора веществ с лучшим терапевтическим индексом чрезвычайно актуальны.

В настоящее время наряду с активно развивающимся поиском новых препаратов, способных воздействовать на регулирование жизнедеятельности опухолевой клетки, актуальным и высоко востребованным остается детальное изучение механизмов действия противоопухолевых антибиотиков на нуклеиновые кислоты и зависимые от них ферменты. Особый интерес вызывают ДНК-топоизомеразы - ферменты, катализирующие конформационные перестройки ДНК и играющие ключевую роль во всех аспектах функционирования генома. Целенаправленный поиск противоопухолевых агентов, воздействующих на топоизомеразы, в том числе на топоизомеразу I, способствует созданию лекарственных средств, эффективных в отношении различных злокачественных новообразований, включая опухоли, обладающие множественной лекарственной устойчивостью.

Оценка топо I-ингибируюшего действия и выявление взаимосвязи структура-активность в ряду соединений, относящихся к двум классам противоопухолевых антибиотиков (антрациклинам и производным ауреоловой кислоты), а также к их полусинтетическим производным и синтетическим аналогам антрациклинов (гетероарилантрахинонам), позволяют наметить пути их дальнейшей химической модификации, что крайне важно для эффективного отбора и создания новых противоопухолевых лекарств.

Отработка и оптимизация метода, позволяющего сравнительно быстро в тестах in vitro оценивать способность цитотоксического агента воздействовать на топоизомеразу I -молекулярную мишень действия многих противоопухолевых соединений, облегчает проведение направленного поиска новых активных ингибиторов этого фермента, являющихся потенциальными лекарственными препаратами, что актуально на стадии доклинических исследований изучаемых антибиотиков.

'В руководстве работой и подготовке ее к защите принимал участие зав. лабораторией механизмов гибели опухолевых клеток НИИ канцерогенеза ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН д.м.н. Штиль A.A..

Цель работы. Целью работы являлось изучение влияния противоопухолевых антибиотиков, их новых производных и аналогов различной химической структуры на каталитическую активность ДНК-зависимого фермента топоизомеразы I.

Были поставлены следующие задачи: 1) отработка и оптимизация метода, позволяющего in vitro изучать влияние соединений на каталитическую активность фермента топоизомеразы I в реакции релаксации суперскрученной ДНК; 2) отбор наиболее активных ингибиторов топоизомеразы I в ряду следующих классов соединений: антрациклины, производные ауреоловой кислоты и гетероарилантрахиноны; 3) выявление закономерностей влияния химической структуры исследуемых соединений на каталитическую активность топоизомеразы I, позволяющих путем синтеза или химической модификации получать более активные ингибиторы фермента.

Научная новизна. Впервые оценена и сопоставлена топо 1-ингибирующая активность карминомицина с активностью доксорубицина и даунорубицина, для которых ранее такой систематический анализ не проводился. Впервые изучена ингибирующая активность в отношении топоизомеразы I полусинтетических производных карминомицина и доксорубицина в сравнении с исходными антибиотиками, что позволяет оценить их химиотерапевтический потенциал.

Установлено таргетное влияние на топоизомеразу I нового класса соединений -гетероарилантрахинонов - цитотоксических синтетических аналогов аглихонов антрациклинов.

Впервые сопоставлено влияние на каталитическую активность топо I GC-специфичных узкобороздочных лигандов группы производных ауреоловой кислоты: оливомицина 1, хромомицина А3, митрамицина, а также изучено влияние на фермент десяти полусинтетических производных оливомицина 1.

Выявлены новые перспективные для доклинических исследований производные двух классов противоопухолевых соединений и их аналогов, способные ингибировать каталитическую активность ДНК-зависимого фермента топоизомеразы I - одной их молекулярных мишеней действия химиотерапевтических агентов.

На основании результатов по взаимосвязи структура-активность в ряду производных изученных классов противоопухолевых соединений определены перспективные направления химической модификации с целью получения новых лекарственных препаратов - активных ингибиторов топоизомеразы I.

Практическая значимость. Оптимизирован метод сравнительно быстрого скрининга потенциальных противоопухолевых соединений, позволяющий отобрать наиболее перспективные препараты для их углубленного изучения. Несколько

отобранных производных оливомицина 1 и нафтоиндолдиона в настоящее время исследуются на способность подавлять рост экспериментальных опухолей у лабораторных животных.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на VI Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2007), конференции «Постгеномные технологии разработки противоопухолевых агентов с новыми механизмами действия» (Химки, 2007), 5th International symposium on targeted anticancer therapies (Amsterdam, 2007), Cancer Therapeutics: the Road Ahead. Capri Science Conference (a Nature Conference) (Capri, Italy, October 8-10, 2007), VII Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2008), 6th International symposium on targeted anticancer therapies (Bethesda, MD, USA, 2008), конференции «Органическая химия для медицины» (Черноголовка, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 статьи в отечественных и международных журналах, 7 тезисов докладов на Российских и международных конференциях и получено одно положительное решение о выдаче патента на изобретение.

Объём и структура работы. Диссертационная работа общим объёмом 127 страниц состоит из введения, списка используемых в диссертации сокращений, обзора литературы на тему «Топоизомераза I - специфическая мишень действия противоопухолевых агентов», обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (107 наименований). Работа содержит 10 таблиц, 6 схем и 55 рисунков. Работа поддержана грантами РФФИ: 06-03-32233-а «Синтез и изучение полициклических индольных производных нового типа, направленные на поиск индукторов алоптоза опухолевых клеток»; 07-03-92000-ННС_а «Получение новых противоопухолевых веществ, направленных на мишени противоопухолевой терапии -топоизомеразы I и II, теломеразу и р53» и 06-04-08127-офи «Создание мишень-специфического противоопухолевого антибиотика нового поколения на основе исследования молекулярных механизмов гибели опухолевых клеток».

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Сокращения, применяемые в тексте:

Tono I - топоизомераза I; Tono II - топоизомераза И; МЛУ - множественная лекарственная устойчивость; OK - открытая кольцевая форма ДНК; ЗК - закрытая кольцевая форма ДНК; СС - суперскрученная форма ДНК; PJI - релаксированная форма ДНК; БЭ - бромистый этидий; ДР - доксорубицин; KP - карминомицин; ТСХ-тонкослойная хроматография; ВЭЖХ -высоко-эффективная жидкостная хроматография

Изучено мишень-специфическое действие высоко активных противоопухолевых препаратов в отношении ДНК-зависимого фермента топо I. Для исследований были отобраны представители двух классов противоопухолевых антибиотиков - антрациклинов (доксорубицин, даунорубицин, карминомицин) и производных ауреоловой кислоты (оливомицины 1 и 2, хромомицин Аз, митрамицин), а также их полусинтетические производные (четыре производных доксорубицина и карминомицина и десять производных оливомицина 1). Кроме того, бьшо исследовано действие на топо I гетероарилантрахинонов (двадцать два производных) - синтетических аналогов агликонов антрациклинов. Гидрохлорид даунорубицина, гидрохлорид доксорубицина, гидрохлорид карминомицина и оливомицин были получены на опытной установке НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф.Гаузе РАМН, а также на заводе г. Омутнинска (Россия). Хромомицин Аз и митрамицин - коммерческие препараты (Sigma Chemical Co., USA). Остальные изучаемые соединения были получены синтетически в лаборатории химической трансформации антибиотиков ГУ НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф.Гаузе РАМН и предоставлены для исследований. Чистота соединений контролировалась методами ТСХ, ВЭЖХ и ЯМР. Для скрининга топо 1-ингибирующей активности в реакции релаксации суперскрученной ДНК были отобраны наиболее цитотоксичные соединения. Отбор веществ осуществлялся, исходя из результатов действия соединений исследуемых классов на различные линии опухолевых клеток в МТТ-тесте: К562 (лейкоз человека), НСТ116 (аденокарцинома толстой кишки человека) и их сублинии с МЛУ, обусловленной гиперэкспрессией Pgp (K562Í/S9) или делецией гена р53 (НСТ116р53КО), проведенного в лаборатории механизмов гибели опухолевых клеток НИИ канцерогенеза ГУ Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН под руководством д.м.н. А.А.Штиля и дополненного результатами скрининга, полученными в Институте медицинских исследований Pera Католического университета г. Лейвен (Бельгия) под руководством проф. Я. Бальзарини на клетках лейкоза мышей линии L1210/0 и трансформированных Т-лимфоцитов человека линий Molt4/C8 и СЕМ/О. Метод изучения ингибирования фермента был оптимизирован применительно к тестируемым соединениям; была показана возможность использования в эксперименте ядерных экстрактов опухолевых клеток, содержащих топо I.

1. Изучение цитотоксической и топо I-ингибирующей активности антрациклиновых

антибиотиков и их полусинтетических производных

1.1. Полусинтетические производные антрациклиновых антибиотиков

Полусинтетические производные антибиотиков антрациклинового ряда, представленные на рис.1, были получены в лаборатории химической трансформации

антибиотиков ГУ НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф.Гаузе РАМН. Было показано, что введение гидроксиалкильных остатков в КГНг-груплу даунозамина шгграциклипового антибиотика является перспективным направлением для получения соединений, обладающих противоопухолевыми свойствами. Антибиотики антрациклинового ряда - активные ингибиторы топоизомеразы II, однако некоторые из них способны ингибировать и топоизомеразу I. О

он кз

СН2-СНОН-СН2ОН

ш-

I

сн2

Структура

Соедипение заместителя

1*1 Из Из

Доксорубицин СНз ОН ш2

Даунорубицип СНз Н ш2

Карминомицин Н Н ш2

1 Н он X

2 СНз он X

3 Н он У

4 Н он г

\

н-но-

но-

-он -н

-н

-ЫН-СН2-(СНОН)4-рН2

он

но.

СН2-СНОН-СН2ОН

X

сн2он У

Рис. 1. Аитрациклиновые антибиотики и их полусинтетические производные 1-4 Нашей задачей было установление наличия активности полученных полусинтетических производных и родственных им антибиотиков в отношении фермента топоизомеразы I и определение влияния особенностей химической структуры этих производных на их топо I- ингибирукяцую активность.

1.2. Изучение цптотокснческой активности антрациклинов и их производных

Цитотоксическая активность полусинтетических производных доксорубицина и 14-гидроксикарминомицина 1,2,3,4 в сравнении с даунорубицюгом, карминомицином и доксорубицином была изучена на клетках лейкоза человека линии К562 и ее Pgp-положительной сублинии К5621/$9. Данные, полученные в эксперименте, представлены в таблице 1. Наибольшую активность в отношении клеток лейкоза человека линии К562 проявили карминомицин и его производные 1 и 3 (1С5о= 0,06; 0,3 и 0,4 мкМ соответственно), действие последних сопоставимо с действием доксорубицина на клетки этой линии. Наименьшую активность показало производное доксорубицина 2, отличающееся от соединения 1 заменой гидроксильной группы в 4 положении агликона на метоксигруппу, (1С5о= 12,8 мкМ и 0,3 мкМ соответственно). Введение гликозилгидроксиалкильного остатка приводило к

лониженшоцитотоксических свойств соединения 4 по сравнению с соединением 3 (1С5о= 5,85 мкМ и 0,40 мкМ соответственно).

Таблица 1. Антипролиферативная активность антрациклинов и их производных 1-4

Соединение 1С5о*(мкМ) мб

К562 К5б21/89

Доксорубиции 0,14 1,99 14,2

Даунорубицин 0,20 нив -

Карминомицип 0,060 0,060 1

1 0,30 ни -

2 12,8 ни -

3 0,40 ни -

4 5,85 ни -

11С50 - концентрация вещества, ингибирующая рост клеток на 50%;

5 индекс резистентности К1 = 1С5о(К5621/89)/1С50(К562); " ни - соединение не изучалось. Проведенное исследование показало, что производные доксорубицина и карминомицина,

содержащие по З'-аминогруппе даунозамина гидрофильный гидроксиал котированный

фрагмент (остаток глицеринового альдегида или моносахарида), обладали меньшей

цитотоксической активностью в отношении клеток лейкоза человека линии К562, чем

исходные антибиотики, причём производные карминомицина 1 и 3 оказались более

активными, чем производные доксорубицина 2 и 4.

1.3. Изучение топо 1-активности антрациклинов и их производных

Способность соединений ингибировать ДНК-зависимой фермент топоизомеразу I

была изучена в реакции релаксации суперскрученной плазмидной ДНК. В результате

действия топо I суперскрученная форма ДНК (СС) релаксирует, образуя набор

топоизомеров (РЛ) (см. рис.2). Метод определения ингибирования активности топо I

основан на высокой чувствительности электрофоретической подвижности различных

форм ДНК (исходных веществ и продуктов релаксации суперскрученной ДНК под

действием топо I) к различиям в конформации дуплекса: суперскрученной и кольцевой

(открытой ОК и замкнутой ЗК). Введение в реакцию вещества, ингибируюгцего

активность топо I, нарушает процесс релаксации, что может вызывать уменьшение числа

образованных топоизомеров, увеличение доли ОК и наличие остаточных количеств СС.

Ингибирование каталитической активности топоизомеразы I может быть специфическим

(образование долгоживущих ковалентных комплексов между веществом, топо I и ДНК)

или неспецифическим (ингибирование любой другой стадии каталитического цикла

действия топо I, включая взаимодействие непосредственно с ДНК или с ферментом). При

специфическом (отравляющем) механизме ингибирования стабилизация веществом-

ингибитором ковалентного комплекса ДНК-топо I препятствует лигированию цепи

дуплекса и ведет к накоплению одиночных разрывов ДНК, что нарушает протекание жизненно важных процессов в клетке. Характерным признаком такого типа ингибирования является накопление ОК. Для определения ингибирующей активности и механизма ингибирования электрофорез продуктов одной и той же реакции проводили параллельно в 1%-ном агарозном геле с окрашиванием раствором БЭ после проведения электрофореза и в 1%-ном агарозном геле с добавлением раствора БЭ (0,5-1 мкг/мл) в гель и буфер перед электрофорезом. Скорости миграции ОК и ЗК в геле без БЭ близки, что затрудняет их идентификацию. В геле с БЭ в силу своих структурных особенностей ЗК мигрируют быстрее, чем ОК, поэтому такие гели используют для их более четкого разделения. Возможное действие исследуемых соединений на суперскручениую ДНК контролировалось проведением реакции без топо I, причём проверяемые вещества вносились в тех же концентрациях, что и в реакции с ферментом (гель не приводится).

Было изучено действие на топо I трех природных антрациклинов доксорубицина, даунорубшшна и карминомицина в диапазоне концентраций от 0,025 мкМ до 2,5 мкМ. Действия на изучаемый фермент доксорубицина и даунорубицина были сопоставимы, тогда как карминомищш был более топо 1-активен, что коррелировало с его большей цитотоксической активностью на разных линиях опухолевых клеток (гель не приводится).

В сравнении с исходными антибиотиками было исследовано действие на топо I производных карминомицина 1 и 3 (рис.2) и доксорубицина 2 и 4 (рис.3). Увеличение концентрации изучаемых соединений приводило к уменьшению числа топоизомеров и только частичной релаксации СС, что свидетельствовало о наличие эффекта ингибирования. Судя по остатку СС, присутствие карминомицина в реакционной смеси затрудняло релаксацию СС в меньшей степени, чем присутствие таких же количеств соединений 1 и 3. При этом эффект ингибирования в случае карминомицина наступал при более низких концентрациях, чем у доксорубицина и его производного 2. Это коррелировало с их цитотоксичностью в отношении клеток лейкоза человека линии К562: для карминомицина и доксорубицина (1С5о=0,060 и 0,14 мкМ соответственно), для производных 1, 3 и 2 (0,3; 0,4 и 12,8 мкМ соответственно). Наличие дигликозидного остатка снижало цитотоксическую активность производного 4 при действии на клетки линии К562 по сравнению с 3 (1С;о-5,85 и 0,40 мкМ соответственно), но сохраняло его способность к ингибированию топо I. Возможно, объемные гидрофильные заместители, введенные в аминогруппу даунозамина, препятствовали узнаванию ферментом сайтов связывания с ДНК и/или вызывали локальные нарушения конформации дуплекса, что неспецифически замедляло работу топо I в реакции релаксации СС.

КАРМИНОМИЦИН

OK

Tonol 0,025 0,5 1

5 0,025 0,5 1 2,5 5 0,025 0,5 1 2,5 5 Концентрация,мкМ

Рис.2. Электрофореграмма продуктов реакции релаксации в присутствии карминомицина и производных 1 и 3 (гелъ без БЭ) ДОКСОРУБИЦИН 2 4

ОХ«*,

со*

HS

В'"' .-• " ЯШР'ВР

* - - ж Яр?

Tonol 0,025 0,1 1,0

2,5 0,025

■ сс

2,5 Концентрация, мкМ

Рис.З. Электрофореграмма продуктов реакции релаксации в присутствии доксорубицина и производных 2и4 (гель без БЭ) Проведение разделения в присутствии карминомицина и его производных 1 и 3 в

геле с БЭ показало наличие полосы OK, что может служить признаком специфического

характера ингибирования топо 1 этими соединениями (гель не приводится).

Одновременное присутствие признаков специфического и неспецифического характера

ингибирования каталитической активности топо I антрациклинами и их производными

подтверждает наличие смешанного типа ингибирования этими антибиотиками.

Соединение Диапазон изучаемых концентраций, мкМ Топо 1-активность*

Доксорубицин 0,025-2,5 +

Даунорубицин -//- +

Карминомицин ++

1 0,025-5,0 +++

3 -//- +++

2 0,025-2,5 ++

4 +++

+++ - сильное ингибирование активности топо I (>75%); ++ - среднее ингибирование (25-75%%); + - слабое ингибирование (<25%).

Было определено, что доксорубицин, даунорубицин и карминомицин ингнбируюг

ДНК-зависимый фермент топоизомеразу I в исследованном диапазоне концентраций.

Введение гидрофильных гидроксилсодержащих фрагментов по 3'-аминогруппе остатка

даунозамина доксорубицина и карминомицина является перспективным направлением

химической модификации для получения менее токсичных, но более активных

ингибиторов топо I, чем исходные антрациклины. Производные карминомицина в

сравнении с производными доксорубицина проявили большую способность к ингибированию изучаемого фермента. Полученные результаты суммированы в таблице 2.

2. Изучение цитотоксической и топо 1-активности гетероарилантрахинопов

Митоксантрон (МК): Х=ОН; Аметантрон: Х=Н

Рис.4. Митоксантрон и аметантрон Гетероарилантрахиноны- новый класс синтетических аналогов агликонов

антрациклиновых антибиотиков. Близкие структурные аналоги гетероарилантрахинонов -

митоксантрон и аметантрон (рис.4) обладают цитотоксическим и противоопухолевым

действием.

о г. о

Нафтоиндолдионы

Антрафурандионы Антратиофендионы

Рис.5. Гетероарилантрахиноны

№ 15_

-ОН

/

Г*

/ Ч

г

ОАс

и 21,23-25

Рис. 6. Получение производных нафтоиндолдионое Нами изучено действие на топоизомеразу I двадцати двух производных гетероарилантрахинонов, различающихся структурой гетероцикла (рис.5). Метод их синтеза разработан в лаборатории химической трансформации антибиотиков ГУ НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф.Гаузе РАМН. В работе были исследованы нафтоиндолдионы с различными заместителями, введенными в гетероцикл или в ароматическую часть аглихона (рис.6).

2.1. Изучение цитотоксической активности гетероарилантрахинонов

Возможности преодоления синтетическими гетероарилантрахинонами работы трансмембранных транспортеров, определяющих лекарственную устойчивость опухолей, была изучена на клетках лейкоза человека линии К562 и её сублинии с экспрессией Pgp-транспортера (К5621/89). Клетки аденокарциномы толстой кишки линии НСТ116 и её сублинии НСТ116р53КО использовали для выявления роли гена р53. Результаты были дополнены определением цитотоксических свойств гетероарилантрахинонов в отношении клеток лейкоза мыши линии 1Л210/0 и Т-лимфоцитов человека линий Мо 11:4/08 и СЕМ/О.

5,10-дион (нафтотриптамин) 22

Изучение цитотоксической активности синтезированных соединений показало, что, например, 3-(2-аминоэтил)-4,11-дигидрокси-1Я-нафто[2,3-!]индол-5,10-диона или нафтотриптамин (22) (рис.7), содержащий в структуре фрагмент триптамина, способен подавлять пролиферацию опухолевых клеток с различными механизмами резистентности. Гетероарилантрахиноны проявили себя как высокотоксичные соединения по отношению к опухолевым клеткам линий L1210/0, Molt 4/С8 и СЕМ/О. Если действия доксорубицина и нафтоиндолдиона с 3-аминохинуклидиновым заместителем 25 (рис.8) на клетки Т-лимфоцитов человека линии Molt4/C8 были сопоставимы (1С5о=0,20

Рис.8. Производные нафто[2,3-Диндол-5,10-диона: 4,11-дигидрокси-3-[(хипуклидин-3-ил-амино) метш]-Ш-нафто[2,3-/]индол-5,10-дион 25 и 3-({(15,45)-2,5-диаза-бщикло[2,2,1]гептан-2-т} метил)-4,11-дигидрокси-1Н-нафто[2,3-$индол-5,№-дион 26

и 0,28 мкМ соответственно), то для клеток лейкоза мыши линии Ы210/0 действие последнего оказалось токсичнее доксорубицина (1С5о=0,09 и 0,37 мкМ соответственно). Замена заместителя в нафтоиндолдионе 25 на диазабициклогептановый (26) приводила к снижению цитотоксической активности соединения (1С5о=0,09 и 1,5 мкМ соответственно для клеток лейкоза мыши линии Ь1210/0). Наиболее активно подавляли рост клеток лейкоза человека линии К562 и его Pgp-пoлoжитeльнoй сублинии К5621/Б9 производные

нафтоиндолдиона с остатком З-амияопирролидина в боковой цепи 27, 28, 29, 30, отличающиеся геометрией и местом присоединения хромофора к остатку диамина (рис.9). Так зеркальные изомеры 27 и 28 показали разную активность по отношению к опухолевым клеткам этих линий (1С5о=1,7 и 4,5 мкМ и 1С5о=0,7 и 0,5 мкМ соответственно).

о он о он

Рис.9. Производные пафто[2,3-Диндол-5,10-диона 27, 28, 29 и 30.

Изучение действия производных гетероарилантрахинонов на опухолевые клетки разного тканевого и видового происхождения показало, что антипролиферативная активность соединений этого класса в большинстве случаев была близка к активности препаратов сравнения - доксорубицину и митоксантрону, а иногда даже превосходила её, что особенно ценно в отношении линий клеток резистентных к антрациклинам. 2.2. Изучение топо 1-активности гетероарилантрахинонов

Было установлено, что цитотоксичные производные этого нового класса синтетических соединений ингибируют активность топоизомеразы I дозозависимым способом. На рисунке 10А представлена электрофореграмма разделения продуктов релаксации сулерсхрученной плазмидной ДНК под действием топо I в присутствии разных концентраций нафтотриптамина 22. При действии топо I без соединения 22 СС (дорожка 1) релаксировала, образуя набор топоизомеров (дорожка 2). Присутствие 2 мкМ этого нафтоиндолдиона не оказывало влияния на релаксацию СС (дорожка 3), однако уже при 3 мкМ релаксировала только часть СС (дорожка 4), а при 5 мкМ релаксация полностью прекращалась (дорожки 1 и 6 совпадают). В том же диапазоне концентраций (1,1-5-4,0 мкМ) 22 было токсично для опухолевых клеток линий НСТП6 и К562. Возможный специфический характер ингибирования подтверждается наличием открытой кольцевой формы ДНК при электрофорезе продуктов той же реакции в геле с добавлением раствора бромистого этидия (рис.1 ОБ).

Топо! ДР МК 0,5 1,0 2,0 5,0 0,5 1,0 2,0 5,0

0,25 0,25 Концентрация,мкМ

Рис.П. Электрофореграмма продуктов реакции в присутствии нафтоиндолдионов 25 и 26 (гель без БЭ)

Влияние природа гетероцикла на способность ингибировать топо I было показано на примере производных с одинаковым расположением и структурой фармакофорных групп: производного нафтоиндолдиона 18 и его тиофенового и фуранового аналогов 19 и 20 (рис.12). Наиболее активно ингибировал фермент фурановый аналог аметантрона 20, что коррелировало с его большей антипролиферативной активностью: 1С5о(18)=1,2 мкМ; 1С50(19)=0,95 мкМ; 1С5О(20)=0,15 мкМ для клеток лейкоза мыши линии 1Л210/0. Эффект ингибирования активности топо I в присутствии антрафурандиона 20 наступал при более

4. Tono i

Концентрация, мкМ

сс иу| дигапп^нигнд—в

I 2 3 4 5 6 Номера дорожек

Рис.10. Электрофореграмма продуктов реакции релаксации в присутствии разных доз соединения 22 (А - гель без БЭ; Б - гель с БЭ) В сравнении с доксорубицином и митоксантроном изучалось влияние на топо I

производного нафтоиндолдиона 25, а также его диазабициклогептанового аналога 26

(рис.8). Действие 1,0 мкМ производного 25 было сопоставимо с действием 0,25 мкМ

митоксантрона, а при концентрации 5 мкМ этого соединения релаксация СС полностью

подавлялась (рис.11). Нафтоиндолдион 26 проявил меньшую топо I- ингибирующую

активность в том же диапазоне концентраций.

26 25

3 4 5 6 Номера дорожек

4> 4 4- ф Tono i 2 3 4 5 Концентрация, мкМ

низкой концентрации {0,1 мкМ), чем у 18 и 19, а 2,0 мкМ его практически прекращали релаксацию СС, тогда как при действии соединений 18 и 19 в той же концентрации этого не наблюдалось (гель не приводится).

Рис.12. Гетероциклические аналоги аметаптрпт 18,19 и 20.

Таблица 3. Связь структура-активность в ряду ингибиторов mono I гетероарилантрахинонов.

Кг соединения Диапазон изучаемых концентрацнйций, мкМ Топо 1-активность

15 2,5 ++

16 +++

17 -II- +++

21 -II- ++

23 -II- ++

24 -II- ++

25 0,5-5,0 +++

26 -//- -г

18 0,1-2,0 +

19 -II- ++

20 -II- +++

27 0,5-5,0 ++

28 -II- ++

29 -II- ++

30 -II- +++

Изучение способности гетероарилантрахинонов ингибировать активность

топоизомеразы I показало, что все исследованные соединения этого класса были топо I-

активны, проявляемый эффект зависел от структуры гетероциклического заместителя,

геометрии и места присоединения фармакофорной группы, а также от структуры

введенного заместителя и расположения его в хромофоре. Полученные результаты,

выявляющие закономерности в ряду структура-активность для изученных

гетероарилантрахинонов - ингибиторов топо I, приведены в таблице 3.

2. Изучение цитотоксической и топо 1-ингибирующей активности антибиотиков группы ауреоловой кислоты и полусинтетических производных оливомицина 1

Антибиотики группы ауреоловой кислоты (рис.13) являются высокоэффективными противоопухолевыми препаратами. Ряд имеющихся у них недостатков (высокая токсичность, а также мутагенность, канцерогенность, миело- и иммунодепрессивное

Н3СО

но

но

он он о

СН]

ОСНз он

Оливомидин 1: Я^Н; К2=СН(СН3)2; ЯСОСНз Оливомнщш 2: Я^Н; К2=СН(СН3)2; Я=Н Хромомшцш А2: К1=СН3; ЯуСЩСНзЪ; Я=СОСН:. Хромомпцин А3: Я^ЯгСНз; Я=СОСН3

Мвтрамицип

он он о

ноЛ^^о/ г„ оа-—

но

Рис. 13. Антибиотики группы ауреоловой кислоты. действие) ограничивает их применение в клинической практике, поэтому важен поиск

I

новых производных этого класса, сохраняющих ценные противоопухолевые качества, но обладающих меньшими побочными эффектами. На этом этапе исследований ставилась задача выявления менее токсичных антибиотиков в ряду соединений этого класса, активных в отношении молекулярной мишени действия противоопухолевых антибиотиков-топоизомеразы I. 2.1, Полусинтетические производные оливомицииа 1

Оливомицнн 1: К= 0 СНа 9снэ ОН

5: К== Ы-ОСН3; 6: Я=М-0-СН2-С00Н; н3с

7: К=М-0-СН2-С<ЖН2;

8: Я=м-0-снгч^н

НзСОу^.О НО-/—-Х-1

9: К=№0-СН2-С0Ш-СН2-СН20Н> 10: К=Н-0-СН2-С0Ш-С(СНз)з; 11: К=№0-СН2-С0Ш-С(СН20Н)2СН3

рСН3 ОН

но

12:11,= СН3; 1*2= 1*4= Н; Я3= 13- Я,= И3= Й4=Н; й2=

1

АсО СН3

НзеоЛЙ^

ЭН ОЯ, О снэ но Н3с

НС СНзО^о^ но

14:Н;Я2= И,- но!^'

Рис. 14. Новые производные оливомицина 1.

Производные оливомицина 1, представленные на рисунке 14, были получены по 2'-

карбонильной группе боковой цепи агликона и по ароматической части агликона.

2.2. Изучение цитотоксической активности производных ауреоловой кислоты и полусинтетических производных оливомицина 1

Для оценки цитотоксических свойств соединений этого класса использовали культуры опухолевых клеток лейкоза мыши линии 1Л210/0 и Т-лимфоцитов человека линий МоМ/СБ, СЕМ/О, а также клетки лейкоза человека линии К562 (табл. 4).

Таблица 4. Антипролиферативная активность (¡С50) оливомицина 1, оливомицина 2 и полусинтетических производных, полученных в результате химической моОификации оливомицина 1. _

Соединение ГСзд.мкМ

К562 Ы210/0 Мо114/С8 СЕМ/0

Оливомицин 1 0,025±0,002 0,034±0,002 0,0040±0,0004 0,0025±0,0000

Оливомицин 2 ни 4,5±0,6 0,45±0,03 0,23±0,05

5 0,10 ±0,02 0,21 ±0,00 0,12 ± 0,05 0,14 ±0,01

6 >3,2 6,5 ± 2,8 1,8 ±1,4 2,3 ± 1,6

7 >3,2 3,6 ±3,1 1,0 ±0,1 0,82 ±0,19

8 ни 0,19±0,01 0,026 ± 0.007 0,018 ±0,002

9 >3,2 18,0 ±5,0 3,7 ±0,8 6,4 ±0,0

10 0,025±0,002 0,20 ±0,01 0,033 ± 0,003 0,032 ±0,001

11 2,47 ± 1.80 20,0 ± 11,0 3,1 ±2,3 4,5 ± 1,2

12 ни 1,00±0,10 0,80±0,19 0,84±0,09

13 1,55±0,30 6,1±1,3 1,6±0,0 1,8±0,0

14 2,97±0,80 1,3±0,2 0,71±0,07 1,00±0,30

Анализируя данные скриниша цолусшпечических производных, полученных в

результате химической модификации оливомицина 1, было установлено, что все они

обладали цитотоксическим действием на опухолевые клетки, используемые в

эксперименте. Наиболее цитотоксически активные из анализируемых производных 5, 8 и

10, приближающиеся по своему эффекту к действию оливомицина 1, были получены его

модификацией по 2'-карбонильной группе боковой цепи агликона. Производные 12-14,

полученные путем модификации оливомицина 1 по хромофору, были менее активны, чем

5, 10 и 8, на всех линиях клеток в эксперименте. Хотя действия производных 11 и 14 на

клетки лейкоза человека линии К562 были сопоставимы, в отношении клеток лейкоза

мыши линии 1Л210/0 последнее производное проявило большую активность.

2.3. Изучение топо 1-активности антибиотиков группы ауреоловой кислоты и полусинтетических производных оливомицина 1

Известно, что в отличие от антибиотиков антрациклинового ряда, механизм действия производных ауреоловой кислоты (рис.14) является неинтеркаляционным. Он основан на их взаимодействии с ОС-парами в узкой бороздке ДНК в комплексе с ионами двухвалентных металлов (Мц2+, Мп2+ и Ре2+), что вызывает нарушения структуры и

функций нуклеиновых кислот, в том числе генной транскрипции. Хотя влияние ОС-специфических антибиотиков группы ауреоловой кислоты на ДНК-зависимый фермент топо I ранее исследовалось, сравнительного анализа их топо 1-ингибирующего действия не проводилось. Поэтому мы поставили задачу сопоставить действие на топо I оливомицина 1, хромомшшна Аз (далее хромомицин) и митрамицина, а также установить, как влияет химическая модификация молекулы оливомицина 1 на его топо I-ингибирующую активность.

А. Изучение влияние природных антибиотиков оливомицина 1, митрамицина и хромомицина на активность топоизомеразы I

Было изучено действие на топо I природных противоопухолевых антибиотиков группы производных ауреоловой кислоты - оливомицина 1, хромомицина, митрамицина. Все они обладали сопоставимым ингибирующим действием на топо I в диапазоне концентраций от 0,025 мкМ до 0,40 мкМ, что коррелировало с их цитотоксической активностью при субмикромолярных концентрациях.

Б. Изучение влияние полусинтетических производных оливомицина 1 и оливина на активность топоизомеразы I

Было изучено влияние на топо I десяти цитотоксичных полусинтетических производных оливомицина 1, представленных на рисунке 14. Кроме того, было исследовано действие на топо I агликона оливомицина 1 - оливина (рис.15), не обладающего цитотоксическим действием.

На рисунке 16 приведена электрофореграмма разделения продуктов релаксации супсрскручснной плазмидной ДНК под действием топо I в присутствии оливина. В диапазоне концентраций (0,05 мкМ - 2,5 мкМ), который намного превышал диапазон в эксперименте с оливомицином 1, хромомицином и митрамицином, не цитотоксичный оливин не ингибировал изучаемый фермент (дорожки «Tono I без оливина» и «Tono I с 0,05; 0,10; 0,5; 2,5 мкМ оливина» совпадали). Возможное влияние на СС самого оливина контролировалось одновременным проведением реакции с такими же концентрациями вещества в отсутствии топо I. Использование в той же реакции 20 мкМ камптотецина показало эффект ингибирования активности топо I (дорожка КАМП)

оливин

Tonal

ОК-И СС-Л

Ш ам» ¡Mi mi ■ 4М 1

Tonol КАМП 0,05 0,05 20мкМ

0,1

0,5

j^-CC

Концентрация, мкМ

Рис.16. Электрофореграмма продуктов реакции релаксации в присутствии оливина (гель без БЭ) (СС - суперскрученная ДНК без топо I и без оливина; Tono I - действие топо I без оливина; КАМП - действие 20 мкМ камптотецина;

Tono I «+» - действие 0,05; 0,10; 0,5 и 2,5 мкМ оливина с топо I; Tono 1 «-» - действие 0,05; 0,10; 0,5 и 2,5 мкМ оливина без топо I)

Проведение реакции релаксации в присутствии оливомицина 1 и его производных 511, полученных модификацией по 2-карбонильной группе боковой цепи агликоиа, показало, что все они проявляют дозозависимую топо 1-ингибирующую активность, сопоставимую с активностью оливомицина 1, Одна из наиболее характерных электрофореграмм продуктов реакции релаксации в присутствии оливомицина 1 и его производных 5-7 представлена на рисунке 17.

ОЛИВОМИЦИН15 6 7

; ■ ц тшшшщжщшш' а пщщ^Ш тмт р

0К*|

СС«

Топо! 0.10 0,50 2.5 10 0.10 0,50 2,5 10 0,10 0.50 2.5 10 0,10 0.50 2.5 10 СС КАМП КОНЦЕНТРАЦИЯ, мкМ ДОмкМ

Рис.17. Электрофореграмма продуктов реакции релаксации в присутствии оливомицина 1 и его производных 5-7 (гель без БЭ).

Если присутствие 10 мкМ оливомицина 1 практически полностью прекращало релаксацию СС, то при действии 10 мкМ 2'-метоксима оливомицина 1 (5) ингибированяе релаксации было частичным. Это коррелирует с их цитотоксическим действием на клетки лейкоза человека линии К562 (1С5о=0,025 и 0,10 мкМ соответственно). Однако менее цитотоксичный 2'-карбоксиметоксим оливомицина 1 (6) (1С5о>3,5 мкМ) показал большую способность к ингибированию работы фермента, чем более токсичное соединение 5 (эффект ингибирования в присутствии последнего наступал при более высоких концентрациях). Вероятно, это связано с тем, что в бесклеточной системе фермент более доступен для взаимодействия с ингибитором, чем в клетках. Действие камптотецина (КАМП, 40 мкМ)

было сопоставимо с действием амида 2'-карбоксиметоксима оливомицина 1 (7) уже при 0, 50 мкМ, хотя цитотоксическая активность производного 7 на клетках линии К562 была невысокой (1С5о>3,5 мкМ).

Таблица 5. Связь структура-активность в ряду ингибиторов mono I группы ауреоловой кислоты и полусинтетических производных оливомицина 1.

Название/Xs Диапазон изучаемых концентраций, мкМ Толо 1-активность

Оливомицин 1 0,025-0,40 +

Хромомицин -и- +

Митрамицин -//- +

Оливин 0,050-2,5 Не активен

Оливомицин 1 0,10-10 +

5 -II- +

6 +

7 -II- ++

8 -II- +

9 -II- +++

10 -II- +++

11 -II- +-Н-

' 12 -II- +++

13 -II- +++

14 -II- +++

При изучении мишень-специфического действия оливомицина (1 и 2), хромомицина, и митрамицина было установлено, что эти (ЗС-спсцифичсскис противоопухолевые антибиотики способны дозозависимо ингибировать каталитическую активность топоизомеразы I (возможно, специфически) уже в субмикромолярном диапазоне концентраций (это согласуется с их цитотоксической активностью), причем действия их сопоставимы. Активными ингибиторами изучаемого фермента оказались соединения 511, полученные модификацией по 2'- карбонильной группе боковой цепи агликона оливомицина 1. Цитотоксичность некоторых из них (6,7,9,11) была значительно ниже, чем у исходного оливомицина 1 на всех линиях опухолевых клеток, использованных в эксперименте. Введение различных заместителей в ароматическую часть агликона оливомицина 1 также позволило получить соединения, замедляющие действие топо I, но менее токсичные, чем исходный антибиотик Полученные результаты представлены в таблице 5.

4. Связь структура-активность изученных противоопухолевых соединений, их полусинтетических производных и синтетических аналогов

А. Изучение топо 1-ингибирующей активности антрациклиновых антибиотиков

доксорубицина, даунорубицина, карминомицина, а также четырех полусинтетических производных доксорубицина и карминомицина выявило следующие закономерности: 1) замена метальной группы в боковой цепи даунорубицина на гидроксиметильную в доксорубицине не влияет на способность соединения ингибировать фермент, замена метоксигруппы при 4 атоме углерода даунорубицина на гидроксильную в карминомицине приводит к увеличению топо 1-ингибирующей активности, что коррелирует с его большей цитотоксической активностью (схема 1);

СХЕМА 1 О ОН

•* ОМе': О ОН

НзС^оУ НО мн2

Доксорубицин

Н.С^оУ НО ИНг

Даунорубицин

НО N42

Карминомицин

" № Т6 >-..„

ОМе О ОН о НОЩ

Доксорубицин

2) присоединение гидроксилсодержащих алкильных заместителей к КН2-группе остатка даунозамина увеличивает способность ингибировать топо I в сравнении с исходными антибиотиками, однако цитотоксическая активность снижается с увеличением объема введенного заместителя, что возможно связано с большей доступностью фермента для взаимодействия с ингибитором в бесклеточной системе, чем в клетках (схема 2);

3) топо 1-ингибирующая активность производного карминомицина с заместителем по КНг-груште остатка даунозамина, несущим две гидроксиалкильные цепи, была выше, чем у такого же производного доксорубицина; топо 1-ингибирующая активность производных карминомицина с различными заместителями по 3'-аминогруппе (схема 3) была

сопоставима;

Б. Изучение топо 1-ингибирующей активности в ряду двадцати двух синтетических

гетероарилантрахинонов выявило следующие закономерности:

1) все изученные соединения ингибируют каталитическую активность фермента дозозависимым способом.

О ОН о

(ОН/ о он

^н^ноГсн2о"й

ЧСНгСНОН-СН2ОН |

Tono 1-активность не изменяется

(OMt(0 он ¿

I чсн?;?:нон-сп?он j О ОН О .......

(он) О ОН '"'О 3

_________________________________

HOjNH

i ЧСН2-(СНОН>з-СН2ОН

СХЕМА 4

•К 20 ° НМ'К *=/\Л N

2) в гетероарилантрахинонах топо 1-ингибирующая активность и цитотоксичность соединений увеличиваются в зависимости от структуры гетероцикла в следующей последовательности: пиррол - тиофеи - фуран (схема 4);

3) в З-аминометильных производных нафтоиндолдионов химическая структура присоединенного амина существенно влияет на цитотоксическую активность и способность ингибировать активность топо I;

4) в ряду оптических изомеров нафтоиндолдиона с (Я) или (в)- 3-аминопирролидиновым заместителем при присоединении нафтоиндолдиона к азоту пирролидина топо I -ингибирующая активность изомеров различается, а оптические изомеры, полученные при присоединении нафтоиндолдиона к первичной аминогруппе аминопирролидияа, близки по своей активности (схема 5);

В. Изучение топо 1-ингибирующей активности в ряду производных ауреоловой кислоты (оливомицина 1, хромомицина и митрамицина), а также десяти полусинтетических производных оливомицина 1 выявило следующие закономерности: 1) природные противоопухолевые антибиотики оливомицин 1, хромомицин и митрамицин активны в отношении топо I, что коррелирирует с их цитотоксической активностью, причем митрамицин ингибирует фермент при более низких концентрациях, чем оливомицин 1 и хромомицин и является наиболее цитотоксичным.

NH.

О ОН

И-изомер

2) оливин (агликон оливомицина 1) не ингибирует активность топо I и не проявляет цитотоксических свойств; отсутствие способности ингибировать активность фермента у нецитотоксичного оливина показывает, что наличие углеводных остатков является фактором, влияющим и на цитотоксическую, и на топо I- ингибирующую активность (схема 6);

Н,С ДгП ПН.

ОМе ОН

Н3СО

Н3С АсОС^з

ОН 12,14

Направления химической ^^ модификация

¡-РгС02—^т7

^ Оливомицим 1 К- О

5 К- К-ОСЩ,

6 »«х-о-сщ-соон.

7 И-К-О-СНуСО?™,,

Топо 1-активность для оливомицина и 5, б, 7

9 К«К-О-СНгС0\П-СПгС11!0Р1,

10 Н-К-О-СНгСОРШ-С^НзЬ;

11 й-М-О-СПг-ССИН-асНгОНЬСИ,

Топо 1-активность для 9,10,11

3) производные по 2'-карбонильной группе боковой цепи оливомицина 1 сохраняют или даже превосходят активность исходного антибиотика в отношении топо I, по обладают меньшей цитотоксичностью в сравнении с ним (схема 6); несколько производных этого

ряда проявили противоопухолевую активность в опытах на лабораторных животных с перевиваемыми опухолями;

4) модификация по ароматической части агликона оливомицина 1 увеличивает топо I-ингибирующую активность производных, при этом их цитотохсичность в сравнении с исходным антибиотиком снижается (схема 6).

ВЫВОДЫ

1. Проведен анализ цитотоксических свойств антрациклиновых антибиотиков, гетероарилантрахинонов, антибиотиков группы ауреоловой кислоты и их новых производных в отношении клеток опухолей человека и мыши.

2. Оптимизирован метод изучения воздействия соединений на важную мишень опухолевого роста - топоизомеразу I в реакции релаксации суперскрученной ДНК: подобраны диапазоны концентраций для каждого анализируемого соединения, определены соотношения исходных продуктов реакции, составы буферных растворов для релаксации и разделения продуктов реакции методом электрофореза. Исследована релаксация суперскрученной ДНК под действием ядерных экстрактов из клеток аденокарциномы толстой кишки человека линии НСТ116, содержащих топоизомеразу I. Показана возможность скрининга топо 1-ингибирующсй активности серий препаратов, как с очищенным ферментом, так и с экстрактами клеток.

3. Изучено воздействие на активность топоизомеразы I антрациклиновых антибиотиков доксорубицина, даунорубицина, карминомицина, а также четырех их полусинтетических производных. Все три природных антибиотика ингибируют топоизомеразу I, производные карминомицина, как и карминомицин. являются наиболее активными в отношении топоизомеразы I и проявляют наибольшую цитотоксическую активность, введение гидроксиалкильных заместителей по З'-аминогруппе доксорубицина и карминомицина увеличивает их топо 1-ингибируклцую активность.

4. Изучено воздействие на активность топоизомеразы I двадцати двух гетероарилантрахинонов, содержащих пиррольный, фурановый или тиофеновый цикл, и установлена зависимость способности к ингибированию фермента от структуры аннелированного гетероцикла. Исследовано влияние геометрии и места присоединения фармакофорной группы, структуры введенного заместителя и расположения его в хромофоре на топо 1-ингибирукицую и цитотоксическую активность соединения.

5. Впервые изучено влияние на активность топоизомеразы I антибиотиков группы ауреоловой кислоты: оливомицина 1, хромомицина А3 и митрамицина, а также десяти полусинтетических производных оливомицина 1. Природные антибиотики, а также производные по 2'-карбонильной группе боковой цепи оливомицина 1 дозозависимо

ингибируют фермент в субмикромолярном диапазоне концентраций. Производные по ароматической части агликона оливомицина 1 активны в отношении топоизомеразы I, но менее цитотоксичны. На примере агликона оливомицина 1 - оливина показано, что присутствие углеводных цепей необходимо для ингибирования активности топоизомеразы I, а также цитотоксической активности антибиотиков этого ряда. Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

1. Шевцова Е.К., Щекотихин А.Е., Деженкова Л.Г., Штиль A.A., Травень В.Ф. Поиск цитотоксичных производных в ряду антра[2,3-й]фуран-5,10-диона.// Успехи в химии и химической технологии.- Сборник научных трудов МКХТ,- 2007.- Т.21.-№6,- С.90-92.

2. Деженкова Л.Г., Сусова О.Ю., Щекотихин А.Е., Преображенская М.Н., Штиль A.A. Аминоалкильпые производные нафто[2,3-/]индол-5,10-дионов - новый класс ингибиторов топоизомеразы I.// Бюлл.эксп.биол.мед.- 2008.- Т.145.- №3.- С.304-308.

3. Деженкова Л.Г., Тевяшова А.Н., Олсуфьева E.H., Трещалин И.Д., Штиль A.A., Преображенская М.Н. Антрациклиновые антибиотики и их производные - новые ингибиторы топоизомеразы I.// Биоорг.химия.- 2008.- Т.34,- №3.-С.1-3.

4. Shchekotikhin А.Е., Dezhenkova L.G., Susova O.Y., Glazunova V.A., Luzikov Y.N., Sinkevich Y.B., Buyanov V.N., Shtil A.A., Preobrazhenskaya M.N. Naphthoindole-based analogues of tryptophan and tryptamine; synthesis and cytotoxic properties.// Bioorg.Med.Chem.- 2007,- V.15.- P.2651-2659.

5. Деженкова Л.Г., Сусова О.Ю., Глазунова B.A., Щекотихин А.Е., Штиль A.A., Преображенская М.Н. Нафтоиндолдионы - новый класс ингибиторов топоизомеразы I.// Росс, биотер. ж,- 2007.- Т.6.- №1.- С.44.

6. Щекотихин А.Е., Глазунова В.А., Деженкова Л.Г., Штиль A.A., Преображенская М.Н. Новые нафтоиндолдионы, вызывающие гибель клеток с множественной лекарственпой устойчивостью.// Росс, биотер. ж,- 2008.- Т.7.- №1.- С.55.

7. Штиль A.A., Тевяшова А.Н., Деженкова Л.Г., Самусенко A.B., Олсуфьева E.H., Преображенская М.Н. Оливомицин А - мощный противоопухолевый антибиотик: механизмы цитотоксичности и оптимизация структуры.// Росс, биотер. ж.- 2008,-Т.7.- №2,- С.23.

8. Щекотихин А.Е., Деженкова Л.Г., Штиль A.A., Преображенская М.Н., Хуанг Х.-Ш. Поиск ДНК-специфических лигандов в ряду гетероциклических аналогов 5,12-нафтаценхинона.// Научная конференция «Органическая химия для медицины», Черноголовка,- 2008.-С.309.

9. Shtil A.A., Dezhenkova L.G., Samusenko A.V., Filippova N.A., Tevyashova A.N., Olsufyeva E.N., Preobrazhenskaya M.N. Olivomycin A induces multiple mechanisms of tumor cell death.// Cancer Therapeutics: the Road Ahead.Capri Science Conference.-Nature Conference.- Capri, Italy.- 2007.- P.70.

10. Shchekotikhin A.E., Dezhenkova L.G., Susova O.Y., Glazunova V.A., Shtil A.A, Preobrazhenskaya M.N. Naphtho[2,3-_/]indole-5,10-dione derived analogues of tryptamine. A new type of cytotoxic topo I inhibitors.// Annal. Oncology.- 2007,- V.18.-P.35.

11. Shchekotikhin A.E., Dezhenkova L.G., Susova O.Y., Glazunova V.A., Shtil A.A, Preobrazhenskaya M.N., Huang H.-S. Novel naphthoindoledione derived topoisomerase I inhibitors potent for multidrug resistant tumor cells.// Annal. Oncology.- 2008.- V. 19,-P.28.

12. Тевяшова A.H., Олсуфьева E.H., Бухман B.M., Деженкова Л.Г., Штиль А.А., Преображенская М.Н. Производные антибиотика группы ауреоловой кислоты оливомицина 1, обладающие противоопухолевой активностью, и способ их получения.// Положительное решение о выдаче патента РФ № 2007139442/04

'(043182) от 10.10.2008 г.

Подписано в печать 22.10.2008 г.

Печать трафаретная

Заказ № 1027 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 хуи^.аШогеГега! ги

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ТОПОИЗОМЕРАЗАI - СПЕЦИФИЧЕСКАЯ МИШЕНЬ ДЕЙСТВИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ АГЕНТОВ (Обзор литературы).

1. Топоизомеразы - ферменты, изменяющие конформацию ДНК. Механизм их действия и функции в клетке. Определение понятий: «отрицательная и положительная суперспирализация», «формы ДНК», «ДНК-топоизомеры».

1.1. Топоизомеразы: определение, функции в клетке.

1.2. Общие принципы механизма действия ДНК-топоизомераз.

1.3. Формы ДНК.

2. Основные классы ДНК-топоизомераз.

2.1. Топоизомеразы 1.

2.2. Топоизомеразы II.

3. Механизмы ингибирования ДНК-топоизомераз низкомолекулярными химическими соединениями.

4. Ингибиторы топоизомеразы 1.

4.1. Камптотецин - специфический ингибитор топоизомеразы 1.

4.2. Некамптотециновые ингибиторы топоизомеразы 1.

5. Ингибиторы топоизомеразы II.

6. «Двойные» ингибиторы топоизомераз I и II.

Являясь важными компонентами современной химиотерапии опухолей, противоопухолевые антибиотики, такие как доксорубицин, даунорубицин, блеомицин и другие, включены в важнейшие схемы химиотерапевтического лечения. Однако, наряду с эффективным действием, они имеют ряд существенных недостатков, основные из которых -высокая токсичность, низкая избирательность действия в отношении злокачественных новообразований и развитие множественной лекарственной устойчивости (МЛУ). Пути преодоления этих недостатков - создание противоопухолевых препаратов с улучшенными свойствами и изучение механизма их действия в клетке. Понимание механизма действия поможет подобрать режимы применения лекарственных средств, укажет на возможность комбинирования с другими препаратами, позволяя повысить избирательность и эффективность проводимого лечения. Таким образом, в настоящее время, наряду с активно развивающимся поиском новых препаратов, воздействующих на механизмы регулирования жизнедеятельности опухолевой клетки (ингибиторы протеинкиназ, различных факторов роста и другие), крайне актуальным и высоко востребованным остается детальное изучение механизмов действия противоопухолевых антибиотиков. Современный уровень поиска новых лекарственных препаратов, включающий известные классические подходы, такие как изучение цитотоксической активности и противоопухолевой активности на животных, предполагает также изучение воздействия химиотерапевтических агентов на различные биологические мишени в клетке. Идентификация молекулярных мишеней и исследование их взаимодействия с изучаемыми препаратами является важным этапом направленного создания и модификации высоко активных антибиотиков с целью разработки новых противоопухолевых средств.

Воздействуя на биологическую мишень, главным образом, на ДНК и ДНК-зависимые ферменты опухолевой клетки, противоопухолевые антибиотики нарушают структуру дуплекса и/или ее функции, индуцируя гибель клетки [1]. Поэтому в последние годы большое внимание уделяется поиску новых ингибиторов ферментов, синтезирующих или модифицирующих нуклеиновые кислоты. Одним из основных в этом ряду является ДНК-зависимый фермент топоизомераза, катализирующий топологические перестройки ДНК и играющий ключевую роль во всех аспектах функционирования генома [2]. Внесение топоизомеразами одно- (топоизомераза I или топо I) и двухцепочечных (топоизомераза II или топо II) разрывов, с последующей их сшивкой и восстановлением целостности молекулы ДНК, обуславливает мобильность, необходимую для конформационных изменений ДНК в процессах матричного синтеза и подвижности хромосом в митозе [3]. Топоизомеразы рассматриваются в качестве внутриклеточных мишеней действия химиотерапевтических препаратов [4,5], так как, препятствуя репарации разрывов, такие вещества способны вызывать накопление повреждённых молекул ДНК, форсируя, таким образом, гибель клетки [6].

В настоящее время ведётся интенсивный поиск и отбор природных ингибиторов топоизомеразы I, а также создание новых синтетических аналогов и полусинтетических производных известных противоопухолевых соединений, способных изменять каталитическую активность фермента, стабилизируя ковалентные ДНК-белковые комплексы [7]. Существует два основных подхода к такому отбору. Первый — это система направленного поиска лекарственных соединений, исходя из их структурных особенностей и молекулярного механизма действия. Именно к такому типу относится поиск мишень-специфических противоопухолевых агентов. Вторым подходом является, так называемый, «случайный скрининг», когда для выявления противоопухолевой активности изучаются все доступные соединения, как синтетические, так и выделенные из природных источников. При этом оба указанных подхода взаимно дополняют друг друга. Особенно перспективным представляется направленное изучение новых производных антибиотиков - известных ингибиторов топоизомераз. Это позволяет с большей долей вероятности найти среди них высоко активные ингибиторы фермента, имеющие улучшенные химические и фармакологические характеристики в сравнении с исходными антибиотиками.

Основной целью нашей работы было изучение влияния противоопухолевых антибиотиков, их производных и аналогов различной химической структуры на каталитическую активность ДНК-зависимого фермента топоизомеразы I. Были сформулированы следующие задачи:

• отработка и оптимизация метода, позволяющего in vitro изучать влияние соединений на каталитическую активность фермента топо I в реакции релаксации суперскрученной ДНК;

• отбор наиболее активных ингибиторов топо I в ряду следующих классов соединений: антрациклины, производные ауреоловой кислоты и гетероарилантрахиноны;

• выявление закономерностей влияния химической структуры исследуемых соединений на каталитическую активность топо I, позволяющих путем дальнейшей химической модификации получать более активные ингибиторы фермента.

На первом этапе работы была исследована топо I-ингибирующая активность антрациклиновых антибиотиков и их полусинтетических производных. Одной из основных мишеней действия соединений этого класса является топоизомераза II, их действие на топоизомеразу I изучалось меньше. Выявление в ряду природных антибиотиков и их новых производных структурных закономерностей, характерных для проявления наибольшего ингибирующего эффекта, дает возможность наметить основные пути химической модификации антрациклинов, позволяющие получить активные ингибиторы топо I с улучшенными свойствами.

Синтетические гетероарилантрахиноны - новый класс структурных аналогов агликонов антрациклиновых антибиотиков. Механизм их действия в клетке только изучается. В свете этого представляется важным идентифицировать молекулярные мишени их направленного воздействия, в частности в отношении топо I Установление зависимости структура-активность в ряду этих потенциальных противоопухолевых препаратов позволит выделить наиболее приоритетные направления химической модификации гетероарилантрахинонов.

В отличие от антрациклиновых антибиотиков, которые активно интеркалируют в ДНК, GC- специфические производные ауреоловой кислоты, образуя комплекс с катионами двухвалентных металлов, располагаются в узкой бороздке ДНК. Известно, что некоторые АТ-специфические узкобороздочные лиганды могут увеличивать время жизни ковалентного комплекса топо I -ДНК, препятствуя восстановлению целостности дуплекса [5], действие же GC-специфических производных ауреоловой кислоты на этот фермент практически не изучалось. Нами впервые было исследовано ингибирующее действие на топоизомеразу I природных противоопухолевых антибиотиков этого класса, а также новых полусинтетических производных оливомицина 1, и изучена связь между их структурой и их топо I-ингибирующей активностью.

Оптимизация и отработка метода, позволяющего сравнительно быстро оценивать способность соединений воздействовать на изучаемый фермент, помогает вести направленный поиск ингибиторов топо I - потенциальных противоопухолевых агентов среди представителей исследуемых классов антибиотиков.

Выполненная работа являлась частью научных исследований, проводимых в ГУ НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф.Гаузе РАМН, и была определена планом НИР в соответствии с государственной программой «Приоритетное направление развития науки, технологии и техники в РФ - Живые системы», утвержденной Президентом РФ. Работа была поддержена следующими грантами РФФИ:

06-03-32233-а «Синтез и изучение полициклических индольных производных нового типа, направленные на поиск индукторов апоптоза опухолевых клеток»;

07-03-92000-ННСа «Получение новых противоопухолевых веществ, направленных на мишени противоопухолевой терапии - топоизомеразы I и II, теломеразу и р53»;

06-04-08127-офи «Создание мишень-специфического противоопухолевого антибиотика нового поколения на основе исследования молекулярных механизмов гибели опухолевых клеток».

ТОПОИЗОМЕРАЗА I - СПЕЦИФИЧЕСКАЯ МИШЕНЬ ДЕЙСТВИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ АГЕНТОВ (Обзор литературы).

выводы.

1.Проведен анализ цитотокеичееких свойств антрациклиновых антибиотиков, гетероарилантрахинонов, антибиотиков группы ауреоловой кислоты и их новых производных в отношении клеток опухолей человека и мыши.

2. Оптимизирован метод изучения воздействия соединений на важную мишень опухолевого роста - топоизомеразу I в реакции релаксации суперскрученной ДНК: подобраны диапазоны концентраций для каждого анализируемого соединения, определены соотношения исходных продуктов реакции, составы буферных растворов для релаксации и разделения продуктов реакции методом электрофореза. Исследована релаксация суперскрученной ДНК под действием ядерных экстрактов из клеток аденокарциномы толстой кишки человека линии НСТ116, содержащих топоизомеразу I. Показана возможность скрининга топо I-ингибирующей активности серий препаратов, как с очищенным ферментом, так и с экстрактами клеток.

3. Изучено воздействие на активность топоизомеразы I антрациклиновых антибиотиков доксорубицина, даунорубицина, карминомицина, а также четырех их полусинтетических производных. Все три природных антибиотика ингибируют топоизомеразу I, производные карминомицина, как и карминомицин, являются наиболее активными в отношении топоизомеразы I и проявляют наибольшую цитотоксическую активность, введение гидроксиалкильных заместителей по 3'-аминогруппе доксорубицина и карминомицина увеличивает их топо I-ингибирующую активность.

4. Изучено воздействие на активность топоизомеразы I двадцати двух гетероарилантрахинонов, содержащих пиррольный, фурановый или тиофеновый цикл, и установлена зависимость способности к ингибированию фермента от структуры аннелированного гетероцикла. Исследовано влияние геометрии и места присоединения фармакофорной группы, структуры введенного заместителя и расположения его в хромофоре на топо I-ингибирующую и цитотоксическую активность соединения.

5. Впервые изучено влияние на активность топоизомеразы I антибиотиков группы ауреоловой кислоты: оливомицина 1, хромомицина Аз и митрамицина, а также десяти полусинтетических производных оливомицина 1. Природные антибиотики, а также производные по 2'-карбонильной группе боковой цепи оливомицина 1 дозозависимо ингибируют фермент в субмикромолярном диапазоне концентраций. Производные по ароматической части агликона оливомицина 1 активны в отношении топоизомеразы I, но менее цитотоксичны. На примере агликона оливомицина 1 - оливина показано, что присутствие углеводных цепей необходимо для ингибирования активности топоизомеразы I, а также цитотоксической активности антибиотиков этого ряда.

7. Заключение.

Для выявления наиболее перспективных природных и синтетических агентов, проявляющих противоопухолевую активность, важно уже на ранних стадиях их доклинического изучения сузить круг испытуемых соединений. Изучение мишень-специфического воздействия на ДНК-зависимый фермент топоизомеразу I позволяет не только решить данную задачу, но и создает основу для целенаправленного получения новых противоопухолевых соединений с заранее прогнозируемыми свойствами. Выявление закономерностей в ряду структура-активность для подобных соединений ведет к созданию лекарственных препаратов, аналогичных по своей противоопухолевой активности известным ингибиторам топо I, но менее токсичных и имеющих более выгодные физико-химические характеристики. Так на смену высоко токсичному и плохо растворимому камптотецину пришли его растворимые аналоги — топотекан и иринотекан, которые в настоящее время широко применяются в клинике для лечения онкологических заболеваний.

Оптимизация методов, позволяющих сравнительно быстро оценить способность вещества действовать на молекулярную мишень в клетке (например, топоизомеразу), проявляя цитотоксические свойства, делает возможным проведение подобных экспериментов in vitro. Изучение молекулярных механизмов действия противоопухолевых соединений является важным этапом на пути создания лекарственных препаратов нового поколения. Несмотря на значительные достижения в изучении и накоплении знаний по действию исследуемых соединений в отношении топоизомеразы I, остается ещё много неясного.

Недостаточно изучено действие двойных ингибиторов топоизмераз типа I и типа И, существуют трудности в интерпретации получаемых результатов, недостаточно ясны механизмы связывания веществ с ДНК, изменяющие структуру дуплекса, а также влияния разных концентраций на ингибирующую способность соединения. Так, в случае акларубицина увеличение концентрации вносимого вещества кардинально меняет механизм ингибирования топоизомеразы I. В целом изучение направленного действия противоопухолевых агентов на специфические молекулярные мишени является одной из наиболее актуальных проблем, стоящих перед современной химиотерапией.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ *

В работе иееледованнно действие на топоизомеразу I высоко активных противоопухолевых препаратов доксорубицина, даунорубицина, карминомицина, оливомицинов 1 и 2, хромомицина Аз, митрамицина, а также полусинтетических производных доксорубицина, карминомицина и оливомицина 1. Помимо этого, было изучено действие ряда веществ, относящихся к новому классу синтетических аналогов противоопухолевых соединений - гетероарилантрахинонам. Гидрохлориды даунорубицина, доксорубицина, карминомицина и оливомицин были получены на опытной установке НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф.Гаузе РАМН, а также на заводе г. Омутнинска (Россия). Хромомицин А3 и митрамицин А - коммерческие препараты (Sigma Chemical Co., США). Остальные анализируемые соединения были получены синтетически в лаборатории химической трансформации антибиотиков ГУ НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф.Гаузе РАМН и переданы нам для дальнейшего изучения их биологической активности. Чистота изучаемых соединений контролировалась методами ТСХ, ВЭЖХ и ЯМР.

Выбор веществ для изучения мишень-специфического влияния на топоизомеразу I базировался на результатах исследований антипролиферативного действия этих препаратов на разные линии опухолевых клеток: лейкоз человека К562 и аденокарциному толстой кишки НСТ116, а также их сублинии с лекарственной устойчивостью, обусловленной гиперэкспрессией Pgp (K562i/S9; фенотип МЛУ) или делецией р53 (НСТ116р53КО), проведенных в лаборатории механизмов гибели опухолевых клеток НИИ канцерогенеза ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН под руководством д.м.н. А.А.Штиля. Результаты эксперимента дополнены данными, полученными в Институте медицинских исследований Рега Католического университета г. Лейвен (Бельгия) под руководством проф. Я.Бальзарини на клетках лейкоза мышей линии L1210/0 и линиях Molt4/C8 и СЕМ/О (трансформированные нумерация рисунков, схем и таблиц отлична от использованной в Обзоре литературы

Т-лимфоциты человека). Всего было изучено цитотоксическое действие тридцати девяти соединений.

1. Цитотоксическая активность исследованных классов соединений

Практически любые воздействия, повреждающие различные клеточные структуры, способны вызывать апоптоз - вид гибели клетки, характеризующийся функциональными, морфологическими, биохимическими и генетическими изменениями [80]. Например, ингибиторы белкового синтеза вызывают апоптоз клеток одного тканевого происхождения (лимфоидных), блокируют апоптоз других (тромбоцитов) и не действуют на третьи (карцинома), таким образом, можно говорить об определенной специфике их действия.

Применение в процессе интенсивной химиотерапии комбинаций лекарственных препаратов, отличных по структуре и механизму действия, оказывает значительное токсическое воздействие на организм в целом, приводя к развитию множественной лекарственной устойчивости (МЛУ, MDR-multidrug resistance). Механизмы биохимических процессов, лежащих в основе МЛУ, весьма разнообразны: от снижения накопления лекарственного препарата внутри клетки до ингибирования программы её гибели [81].

Одним из основных факторов в системе противоопухолевого надзора организма является продукт гена р53, участвующий в устранении клеток с повреждениями в ДНК. Это подтверждается обнаружением мутантных форм р53 в значительном числе новообразований многих локализаций. Лица с наследственным дефектом одного из аллелей гена р53 составляют группу риска в отношении развития опухолей, а клетки таких индивидуумов более резистентны к действию излучений и химических агентов. В связи с этим перспективно проведение исследований цитотоксических свойств возможных противоопухолевых агентов параллельно на культурах клеток с интактным геном р53 и изогенных клетках с не функционирующим р53 [82]. Мутации, приводящие к инактивации р53, часто встречаются в опухолях больных и в трансформированных клетках в культуре.

Эти мутации могут обусловливать устойчивость к ДНК-связывающим химиотераиевтическим агентам, (например, доксорубицину, ДР), уменьшая их противоопухолевый эффект. Наряду с этим одной из наиболее распространенных причин возникновения МЛУ в клетках является экспрессия АВС-транспотера Р-гликопротеина (Pgp) [83]. Активность в отношении клеток с множественной лекарственной устойчивостью, обусловленной дисфункцией р53 и экспрессией Р-гликопротеина (Pgp), может дать дополнительные преимущества новым химиотерапевтическим препаратам.

Для оценки цитотоксичности в клинико-лабораторных и экспериментальных исследованиях широкое распространение получил МТТ-тест, основанный на способности митохондриальных дегидрогеназ метаболически активных клеток восстанавливать водорастворимый 3-(4,5~диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолий бромид (МТТ) в формазан, который кристаллизуется внутри клетки с образованием темно-синих кристаллов [84, 85, 86]. Перевод формазана в раствор с помощью органических растворителей диметилсульфоксида (ДМСО) или изопропанола с последующей спектрофотометрией позволяет сопоставить изменение оптической плотности раствора по отношению к контролю с изменением количества жизнеспособных клеток. Контролем служат клетки, не обработанные испытуемым препаратом. Для каждого исследуемого препарата определяют ингибирующую концентрацию (IC50), замедляющую рост 50% анализируемых клеток. Дальнейшее сравнение таких концентраций позволяет оценить эффективность воздействия различных препаратов на данную клеточную линию.

Необходимо заметить, что в дальнейшем, используя термин «антипролиферативная активность», мы подразумеваем цитотоксическую активность изучаемого соединения, так как в течение эксперимента прекращалась не только пролиферация клеток, но и происходила их гибель, что подтверждалось, в частности, изучением морфологии клеток. На основании результатов МТТ-теста (таблицы 1-6) были отобраны наиболее перспективные соединения для изучения мишень-специфического действия в отношении топоизомеразы I.

1.1. Антрациклиновые антибиотики и их полусинтетические производные

На рисунке 1 представлен ряд антрациклиновых антибиотиков и их полусинтетических производных (1-4), полученных в лаборатории химической трансформации антибиотиков ГУ НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф.Гаузе РАМН по методу, описанному ранее [87, 88]. 3'-7\г-(1-Дезокси-/,-арабит-1-ил)-14-гидроксикарминомицин (3) был получен,

CH2R2

ОН R3

СН2-СНОН-СН2ОН N *

СН2-СНОН-СН2ОН X

Название/№ Структура заместителя

Rt R2 R3

Доксорубицин СН3 он nh2

Даунорубицин СНз н nh2

Карминомицин Н н nh2

1 Н он X

2 СНз он X

3 Н он Y

4 Н он z

HN-I сн2 н-но-но

-он

-н

-н

-NH-CH2-(CHOH)4-CH? он 0но сн2он Y он о но

Рис. 1. Антрациклиновые антибиотики и их полусинтетические производные 1-4 исходя из карминомицина и Z-арабинозы, методом восстановительного jV-алкилирования промежуточного интермедиата (13-диметилкеталя-14-бромкарминомицина) в присутствии NaBH3CN; по аналогичной схеме был синтезирован 3'-ЛЦа-£)-галакто1шранозил-(1—-^-O-l-flesoKCH-ZJ-raronHT-l-miJ-M-rHflpOKCH-KapMHHOMHnHH (4), исходя из карминомицина и мелибиозы. 3|-Лг-£'«с(2,3-дигидроксипропил)-14-гидроксикарминомицин (1) и 3'-АЧ)ис(2,3-дигидроксипропил)доксорубицин (2) в виде смеси трёх оптических изомеров были получены аналогичным методом, исходя из 13-диметилкеталь-14-бром-карминомицина и даунорубицина соответственно и DL-глицеринового альдегида.

Цитотоксическая активность четырех производных доксорубицина и 14-гидроксикарминомицина была исследована в сравнении с даунорубицином (ДНР), карминомицином (КР) и доксорубицином (ДР) на клетках лейкоза человека линии К562 и его Pgp-положительной сублинии K562i/S9. Полученные данные показаны в таблице 1. Все исследованные соединения были цитотоксичными в отношении опухолевых клеток, использованных в эксперименте. Анализ результатов проведенного скрининга аминозамещенных производных доксорубицина и 14-гидроксикарминомицина показывает, что наибольшую активность в отношении клеток лейкоза человека линии К562 проявили карминомицин и его производные 1 и 3 (1С5о= 0,060; 0,3 и 0,4 мкМ соответственно). Цитотоксическая активность производных 1, 3 оказалась почти на порядок ниже, чем КР, однако она была близка к действию ДР на клетки этой линии (1С5о=0,14 мкМ). Менее цитотоксичным оказалось производное доксорубицина 2, отличающееся от 1 заменой гидроксильной группы в 4 положении агликона на метоксигруппу (ICso^ 12,8 мкМ и 0,3 мкМ соответственно). Введение дигликозидного остатка (4) приводило к понижению цитотоксических свойств по сравнению с производным 3 (1С50= 5,85 мкМ и 0,40 мкМ соответственно).

Проведенное исследование показало, что производные доксорубицина и карминомицина, содержащие по З'-аминогруппе даунозамина гидрофильный гидроксилсодержащий алкильный фрагмент, обладали меньшей цитотоксической активностью в отношении клеток лейкоза человека линии К562, чем исходные антибиотики, причём производные карминомицина 1 и 3 оказались более активными, чем производные доксорубицина 2 и 4. Дальнейшей задачей в отношении исследованных антибиотиков класса антрациклинов и их полусинтетических производных было изучение ингибирующей активности при действии на фермент ДНК-топоизомеразу I и выявление закономерностей влияния структуры этих соединений на их способность к ингибированию фермента. Таблица 1. Лнтипролиферативная активность (1С5о) антрациклинов и их производных 1-4.

Название/№ 1С50а( >ikM) RI6

К562 K562i/S9

Доксорубицин 0,14 1,99 14,2

Даунорубицин 0,20 нив

Карминомицин 0,060 0,060 1

1 0,30 ни

2 12,8 ни

3 0,40 ни

4 5,85 ни а ICso ~ концентрация ингибирования роста 50% клеток; 6 индекс резистентности = IC5o(K562i/S9)/IC5o(K562); в ни — соединение не исследовалось.

1.2. Производные группы ауреоловой кислоты и полусинтетические производные оливомицина 1

Оливомицин 1: Ri = Н; R2 = СН(СН3)2; R= СОСН3; Митрамицин

Оливомицин 2: R, = Н; R2 = СН(СН3)2; R = Н; Хромомицин А2: Ri= СН3; R2= СН(СН3)2; R = СОСН3; Хромомицин А3: Ri = R2 = СН3; R = СОСН3

Рис. 2. Производные группы ауреоловой кислоты Антибиотики группы ауреоловой кислоты являются высокоэффективными природными противоопухолевыми препаратами, некоторые из которых разрешены к применению в качестве антинеопластических агентов для лечения ряда опухолевых заболеваний. Важнейшие представители этого класса антибиотиков представлены на рисунке 2.

Наряду с ценными свойствами, у представителей этой группы соединений имеется ряд недостатков, основными из которых являются высокая токсичность, а также мутагенность, канцерогенность, миело- и иммунодепрессивное действие. Поэтому, важно получить новые, менее токсичные производные антибиотиков группы ауреоловой кислоты, обладающие противоопухолевой активностью.

Оливомицин 1: R= О

5: R= N-OCH3; 6: R=N-0-CHrC00H; НзСО^^О/^^А 7: R=N-0-CH2-C0NH2; ch3

ОСНз он

8: R= 00 H

9: R=N-0-CH2-C0NH-CH2-CH20H; 10: R=N-0-CH2-C0NH-C(CH3)3; 11: R=N-0-CH2-C0NH-C(CH20H)2CH3

9CH3 он i-PrCO

CH3

СНз HO .

HO

AcO CH3

НзСО^/ЬбВ HO —

H,C- CH" i-PrC02

HO

OH ORi о сн3 ноле

12: Rr= CH3;R2=R4=H;R3= 13: Ri= R3= R4-H; R2=-N=N'0> ACQ СНз 14: R,= H; R2= R4= ^ ^ ; R3= Hoi^ZcT

Рис. 3. Новые производные оливомицина 1

Влияние химической модификации на цитотоксическую активность соединений изучалось на примере десяти полусинтетических производных оливомицина 1, полученных модификацией 2'-карбонильной группы боковой цепи агликона или модификацией по хромофору (см. рис. 3). В эксперименте были использованы культуры опухолевых клеток лейкоза мышей линии L1210/0 и Т-лимфоцитов человека линий Molt4/C8, СЕМ/0. Также было исследовано воздействие изучаемых веществ на клетки лейкоза человека линии К562. Полученные данные приведены в таблице 2.

1. Химиотерапия злокачественных опухолей.// Блохин Н.Н.-М.: Медицина.-1977.

2. Liu L.F. DNA topoisomerase poisons as antitumor drugs.// Ann.Rev.Biochem.-1989.-V.58.-P.351-375.

3. Якубовская E.A., Габибов А.Г. Топоизомеразы. Механизмы изменения топологии ДНК.// Мол.биология,-1999.-Т. ЗЗ.-С. 368-384.

4. Garcia-Carbonero R., Supko J.G. Current perspectives on the clinical experience, pharmacology, and continued development of the camptothecins.// Clinical Cancer Research.- 2002,- V. 8.-P. 641-661.

5. Meng L-h., Liao Z-y„ Pommier Y. Non-camptothecin DNA topoisomerase I inhibitors in cancer therapy.// Current Topics in Medicinal Chem.-2003.-V. 3.- P. 305-320.

6. Denny W. A. Emerging DNA topoisomerase inhibitors as anticancer drugs.// Expert Opin.Emerg.Drugs.-2004.-V. 9.-P. 105-133.

7. Staker B.L., Freese M.D., Cushman M., Pommier Y., Zembower D., Stewart L., Burgin A.B. Structures of three classes of anticancer agents bound to the human topoisomerase I-DNA covalent complex.// J.Med.Chem.-2005.-V. 48.-P. 2336-2345.

8. Биоорганическая химия: химические подходы к механизму действия ферментов.// Дюга Г., Пенни К.-М.: Мир.-1983.

9. Гены.//ЛьюинБ.-М.: Мир.-1987.

10. Portugal J., Rodrigez-Campos А. Т7 RNA polymerase cannot transcribe through a highly knotted DNA template.// Nucl.Acids Res.-1996.-V. 24.- P. 4890-4894.

11. Uemura Т., Ohkura H., Adachi Y., Morino K., Shiozaki K., Yanagida M. DNA topoisomerase II is required for condensation and separation of mitotic chromosomesin S.pombe.// Cell.-1987.-V. 50.-P. 917-925.

12. Основы молекулярного действия антибиотиков.// Гэйл Э.-М.: Мир.-1975.

13. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование.// Остерман JI.А.-М.: Наука.-1981.

14. Bailly С. DNA relaxation and cleavage assays to study topoisomerase I inhibitors.// Methods in Enzymology.-2001.-V. 340.-P. 610-623.

15. Facompre M., Carrasco C., Colson P., Houssier C., Chisholm J.D., Van Vranken D.L., Bailly C. DNA bilding and topoisomerase I poisoning activities of novel disaccharide indolocarbazoles.// Mol.Pharmacol.-2002.-V. 62.-P. 1215-1227.

16. Roca J. The mechanism of DNA topoisomerases.// TIBS.-1995.-V. 20.-P. 156-160.

17. Gupta M., Fujimori A., Pommier Y. Eukaryotic DNA topoisomerases I.// Biochem.Biophys.Acta.-1995.-V. 1262.-P. 1-14.

18. Stewart L., Champoux J.J. Assaying DNA topoisomerase I relaxation activity.// In: Methods in molecular biology.DNA Topoisomerase Protocols. Part II: Enzymology and Drugs.- 2001.-V. 95.-P.1-11.

19. Kim R.A., Wang J.C. Identification of the yeast TOP3 gene product as a single strand-specific DNA topoisomerase.// J.Biol.Chem.-1992.-V.267.-P.17178-17185.

20. Champoux J.J. Mechanism of catalysis by eukaryotic DNA topoisomerase I.// Adv.Pharmacology.-1994.-V. 29A.-P. 71-82.

21. Fortune J.M., Osheroff N. Topoisomerase II-catalyzed relaxation and catenation of plasmid DNA.// In: Methods in molecular biology.DNA Topoisomerase Protocols. Part II: Enzymology and Drugs.-2001.-V. 95.-P. 275-281.

22. Kingma P.S., Fortune J.M., Osheroff N. Topoisomerase II-catalyzed ATP hydrolysis as monitored by thin-layer chromatography.// In: Methods in molecular biology. DNA Topoisomerase Protocols. Part II: Enzymology and Drugs.-2001.- V.95.-P. 5156.

23. Beretta G.L., Zunino F. Relevance of extracellular and intracellular interactions of camptothecins as determinants of antitumor activity.// Biochem.Pharmacol.-2007.-V.74.-Р. 1437-1444.

24. Staker B.L., Hjerrild К., Freese M.D., Behnke C.A., Burgin A.B., Steward Jr.and L. The mechanism of topoisomerase I poisoning by a camptothecin analog.// PNAS.-2002.-V. 99.-P. 15387-15392.

25. Madden K.R., Champoux J.J. Overexpression of human topoisomerase I in baby hamster kidney cells: hypersensitivity of clonal isolates to camptothecin.// Cancer Res.-1992.-V. 52.-P. 525-532.

26. Pommier Y., Gupta M., Valenti M., Nieves-Niera W. Cellular resistance to camptothecins.// Ann.NY Acad.Sci.-1996.-V. 803.-P.-60-73.

27. Wang J.C. Interaction between DNA and an Escherichia coli protein omega.// J.Mol.Biol.-1971.-V. 55.-P. 523-533.

28. Horowitz M.S., Horowitz S.B. Intracellura degradation of HeLa adenovirus type 2 DNA induced by camptothecin.// Biochem.Biophys.Res.Commun.-1971.-V. 45.-P. 723-727.

29. Ryan A. J., Squires S., Strutt H.L., Johnson R.T. Camptothecin cytotoxicity in mammalian cells is associated with the induction of persisted double strand breaksin replicating DNA.//Nucleic Acids Res.-1991.-V. 19.-P. 3295-3300.

30. Thomas С J., RahierN.J., Hecht S.M. Camptothecin: current perspectives.// Bioorg.Med.Chem.-2004.-V. 12.-P. 15 85-1604.

31. Pommier Y., Jaxel C., Heise C., Kerrigan D., Kohn K.W. In: DNA topoisomerase in cancer.// New York.: Oxford University Press.-1991.- P. 121-132.

32. Abelson H.T., Penmann S. Selective interruption of high molecular weight RNA synthesis in HeLa cells by camptothecin.//Nat.New Biol.-1972.-V.237.- P. 144-146.

33. Li Т.К., Liu L.F. Tumor cell death induced by topoisomerase-targeting drugs.// Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.-2001.-V. 41.-P. 53-77.

34. Goldwasser F., Bae I., Valenti M., Torres K., Pommier Y. Topoisomerase I- related parameters and camptothecin activity in the colon carcinoma cell lines from the National Cancer Institute anticancer screen.// Cancer Res.-1995.-V. 55.-P. 21162121.

35. Shin C.-G., Snapka R.M. Exposure to camptothecin breaks leading and lagging strand simian virus 40 DNA replication fork.// Biochem.Biophys.Res.Commun.-1990.-V.168.-P. 135-140.

36. Yang L., Wold M.S., Li J. J., Kelly T.J., Liu L.F.Roles of DNA topoisomerases in sirrian virus 40 DNA replication in vitro.// Proc.Natl.Acad.Sci.USA.-1987.-V. 84.-P. 950-954.

37. Bendixen C., Thomsen В., Alsner J,, Westergaard O. Camptothecin- stabilized topoisomerase I DNA adducts cause premature termination of transcription.// Biochemictry.- 1990.-V. 29.-P. 5613-5619.

38. Kaufmann S. DNA topoisomerases in chemotherapy.// Cancer Cells.-1991 .-V. 3.-P. 24-27.

39. Ren J., Bailly С., Chaires J.B. N-506, an indolocarbazole topoisomerase I inhibitor binds preferentially to triplex DNA.// FEBS Letters.- 2000.-V. 470.-P. 355-359.

40. Zembower D.E., Zhang H., Lineswala J.P., Kuffel M.J., Aytes S.A., Ames M.M. Indolocarbazole poisons of human topoisomerase I: regioisomeric analogues of ED-110.// Bioorg.Med.Chem.Lett.-1999.-V. 9.-P. 145-150.

41. Yamashita Y., Fujii N., Murakata C., Ashizawa Т., Okabe M., Nakano H. Induction of mammalian DNA topoisomerase I mediated DNA cleavage by antitumor indolocarbazole derivatives.//Biochemistry.- 1992.-V. 31.-P. 12069-12075.

42. Long B.H., Rose W.C., Vyas D.M., Matson J.A., Forenza S. Discovery of antitumor indolocarbazoles: rebeccamycin, NSC655649, and fluoroindolocarbazoles.// Curr.Med.Chem.: Anticancer Agents.-2002.-V. 2.-P. 255-266.

43. Prudhomme M. Recent developments of rebeccamycin analogues as topoisomerase I inhibitors and antitumor agents.// Curr.Med.Chem.-2000.-V. 7.-P. 1189-1212.

44. Bailly C., Riou J.F., Colson P., Houssier C., Rodrigues-Pereira E., Prudhomme M., DNA cleavage by topoisomerase I in the presence of indolocarbazole derivatives of rebeccamycin.// Biochemistry.-1997.-V.36.-P. 3917-3929.

45. Cushman M., Cheng L. Stereoselective oxidation by thionyl chlorid leading to the indenol ,2-c.isoquinoline system.//J.Org.Chem.-1978-V. 43.-P. 3781-3783.

46. Kohlhagen G., Paull K.D., Cushman M., Nagafuji P., Pommier Y. Protein-linked strand breaks induced by NSC 314622, a novel noncamptothecin topoisomerase I poison.// Mol.Pharmacol.-;1998.-V. 54.-P. 50-58.

47. Strumberg D., Pommier Y., Paull K., Jayaraman M., Nagafuji P., Cushman M. Synthesis of cytotoxic indenoisoquinoline topoisomerase I poison.// J.Med.Chem.-1999.-V. 42.-P. 446-457.

48. Fujii N., Yamashita Y., Mizukami Т., Nakano H. Correlation between the formation of cleavable complex with topoisomerase I and growth-inhibitory activity for Saintopin type antibiotics.// Mol.Pharmocol.-1997.-V. 51.-P. 269-276.

49. Yamashita Y., Kawada S.-Z., Fujii N., Nakano H. Induction of mammalian topoisomerase I and II mediated DNA cleavage by saintopin, a new antitumor agent from fungus.//Biochemistry.-1991.-V. 30.-P. 5838-5845.

50. Wang L.K., Johnson R.K., Hecht S.M. Inhibition of topoisomerase I function by nitidine and fagaronine.// Chem.Res.Toxicol.-1993.-V. 6.-P. 813-818.

51. Larsen A.K., Grondard L., Couprie J., Desoize В., Сотое L., Jardillier J.-C., Rion J.-F. The antileukemic alkaloid fagaronine is an inhibitor of DNA topoisomerases I and II.// Biochem.Pharmacol.- 1993.-V. 46.-P.1403-1412.

52. Wang L.K., Rogers B.D., Hecht S.M. Inhibition of topoisomerase I function by coralyne and 5,6-dihydrocoralyne.// Chem.Res.Toxicol.- 1996.-V. 9.-P. 75-83.

53. ДНК-специфичные низкомолекулярные соединения.// Колесникова Д.В., Жузе А.Л., Заседателев А.С.-М.: МФТИ.-1998.

54. Larsen Т.А., Goodsell D.S., Cascio D.C., Grzeskowiak К., Dickerson R.E. The structure of DAPI bound to DNA.11 J.Biomol.Struct.Dyn.-1989.-V. 7.-P. 477-491.

55. Brown D.G., Sandersen M.R., Skelly J.V., Jenkins T.C., Brown Т., Garman E., Stuart D.I., Neidle S. Crystal structureof a berenil-dodecanucleotide complex:thc role of water in sequence-specific ligand binding.// EMBO J.- 1990.-V. 9.-P. 1329-1334.

56. Михайлов M.B., Заседателев A.C., Крылов A.C., Гурский Г.В. Механизм «узнавания» AT пар ДНК молекулами красителя «Хехст 33258».// Мол.биология.-1981.-Т. 15.-С. 690-704.

57. Beerman Т.А., McHugh М.М., Sigmund R., Lown J.W., Rao K.E., Bathini Y.

58. Effects of analogs of the DNA minor groove binder Hoechst 33258 ontopoisomerase II and I mediated activities.// Biochem.Biophys.Acta.-1992.-V. 1131.-P. 53-61.

59. Sun Q., Gatto В., Yu Ch., Liu L.F., LaVoie E.J. Synthesis and evaluation of terbenzimidazoles as topoisomerase I inhibitors.// J.Med.Chem.-1995.-V. 38.-P: 3638-3644.

60. Chen A. Y., Yu C., Gatto В., Liu L.F. DNA minor groove-binding ligands: a different class of mammalian DNA topoisomerase I inhibitors.// Proc.Natl.Acad.Sci. USA.-1993.-V. 90.-P. 8131-8135.

61. Foglesong P.D., Reckord C., Swink S. Doxorubicin inhibits human DNA topoisomerase I.// Cancer Chemother Pharmacol.-1992.-V. 30.-P. 123-125.

62. Trask D.K., Muller M.T. Stabilization of type I topoisomerase-DNA covalent complexes by actinomycin D.// Proc.Natl.Acad.Sci.USA.-1998.-V. 85.- P. 14171421.

63. Hajji N., Mateos S., Pastor N., Dominguez I., Cortes F. Induction of genotoxic and cytotoxic damage by aclarubicin, a dual topoisomerase inhibitor.// Mutation Research.-2005.-V. 583.-P. 26-35.

64. Larsen A.K., Escargueil A.E., Skladanowski A. From DNA damage to G2 arrest: the many roles of topoisomerase II.// Progress in Cell Cycle Research.-2003.-V. 5,- P. 295-300.

65. Larsen A.K., Escargueil A.E., Skladanowski A. Catalytic topoisomerase II inhibitors in cancer therapy.// Pharmacology and Therapeutics.-2003.-V. 99,-P. 167-181.

66. Nitiss J.L., Pourquier P., Pommier Y. Aclacinomycin A stabilizes topoisomerase I covalent complexes.// Cancer Res.-1997.-V. 57.-P. 4564-4569.

67. Bridewell D.J., Finlay G.J., Baguley B.C. Differential actions of aclarubicinand doxorubicin: the role of topoisomerase I.// Oncol.Res.-1997.-V. 9.-P. 535-542.

68. Гибель клетки (апоптоз).// Душников Е.Ф., Абросимов А.Ю.-М.: Медицина. 2001.

69. Ставровская А. А. Механизмы лекарственной устойчивости опухолевых клеток.// Биохимия.-2000.-Т.65.-С.111-126.

70. Bourdon J.-C. р53 and its isoforms in cancer.// British Journal of Cancer.-2007.-V. 97.-P. 277-282.

71. Veerman A.J.P., Pieters R. Drug sensitivity assay in leukemia and lymphoma.// J.Br.Haematol.-l990.-V. 74.-P. 381-384.

72. Леонтьева О.В., Тренин А.С., Бухман В.М., Дудник Ю.В. Цитотоксичность мевалоната, ловастатина и карминомицина в отношении человеческих злокачественных Т-лимфобластов MOLT-4 in vitro.// Антибиотики и химиотерапия.-1999.-Т.44.-№ 2.-С. 13-18.

73. Тевяшова А.Н. Модификация углеводной части противоопухолевых антибиотиков антрациклиновой группы.// Диссертация на соискание учёной степени кандидата химических наук.- М.-2005.

74. Tevyashova A.N. Novel derivatives of antibiotic olivomycin 1.// Annals of Oncology.-2008.-V. 19.-P. 28-29.

75. Turner P.R., Denny W.A., The genome as a drug target: sequence specific minor groove binding ligands.// Curr.Drug Targets.-2000.-V. l.-P. 1-14.

76. Adjei A.A., Charron M., Rowinsky E.K., Svingen P.A., Miller J., Reid J.M., Sebolt-Leopold J., Ames M.M., Kaufmann S.H., Effect of pyrazoloacridine (NSC 366140) on topoisomerase I and topoisomerase II.// Clin. Cancer Res.-1998.-V. 4.-P. 683691.

77. Moreau P., Gaillard N., Marminon C. et al. Semi-synthesis, topoisomerase I and kinases inhibitory properties, and antiproliferative activities of new rebeccamycin derivaties.// Bioorg. Med. Chem.-2003.-V. ll.-P. 4871-4879.

78. Gewirtz D. A. A critical evaluation of the mechanisms of action proposed for the antitumor effects of the anthracycline antibiotics adriamycin and daunorubicin.// Biochem.Pharmacol.-1999.-V. 57.-P. 727-741.

79. Dal Ben D., Palumbo M., Zagotto G., Capranico G., Moro S. DNA-topoisomerase II structures and anthracycline activity: insights into ternary complex formation.// Curr. Pharm.Des.-2007.-V. 13.-P. 2766-2780.

80. Bates S.E., Mickley L.A., Chen Y.N., Richert N., Rudick J., Biedler J.L., Fojo A.T. Expression of a drug resistance gene in human neuroblastoma cell lines: modulation by retinoic acid-induced differentiation.// Mol.Cell Biol.-1989.-V. 9.-P. 4337-4344.

81. Chaires J.B., Priebe W., Graves D.E., Burke T.G. Dissection of the free energy of antracycline antibiotic binding to DNA: electrostatic contributions.//

82. J.Am.Chem.Soc.-1993.- V. 115.- P. 5360-5364.

83. Olsufyeva E.N, Tevyashova A.N., Treshalin I.D., Preobrazhenskaya M.N., Piatt D., Klyosov A. Synthesis and antitumor activity of new D-galactose-containing derivatives of doxorubicin//Carbohydrate Res.-2003.-V. 338.-P. 1359-1367.

84. Shen L., L. DNA-unwinding test using eukaryotic DNA topoisomerase I // In: Methods in Molecular Biology: DNA topoisomerase protocols.Part II: Enzymology and Drugs.-2001 .-V.95.-P. 149-160.

85. Lombo F., Menendez N., Salas J.A., Mendez C. The aureolic acid family of antitumor compounds: structure, mode of action, biosynthesis, and novel derivatives.//Appl.Microbiol.Biotechnol.-2006.-V. 73 .-P. 1-14.

86. Hou M.-H., Lu W.-J., Lin H.-Y., Yuann J.-M. P. Studies of sequence-specific DNA binding, DNA cleavage, and topoisomerase I inhibition by the dimeric chromomycin A3 complexed with FeI1+.// Biochemistry.-2008.-V. 47.-P. 5493-5502.

87. Behr W., Honikel К., Hartmann G. Interaction of the RNA polymerase inhibitor chromomycin with DNA.// Eur.J.Biochem.-1969.-V. 9.-P. 82-92.

88. Hayasaka Т., Inoue Y. Chromomycin A3 studies in aqueous solutions. Spectrophotometric evidence for agregation and interaction with herring sperm deoxyribonucleic acid.//Biochemistry.-1969.-Vol. 8.-P. 2342-2347

89. Kim J.S., Sun G.,Gatto B.,Yu C., Liu A., Liu L.F., LaVoie E.J. Structure-activity relationships of benzimidazoles and related heterocycle as topoisomerase I poisons.// Bioorg.Med.Chem.-1996.-V. 4.-P. 621-630.