Синтез бетулиновой кислоты и разработка ее липосомальной формы тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

Ле Баш Шоп

РГБ ОД

2 1 М

Синтез бетулннопой кислоты и ряфаботка её лппосомальлой

формы

02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически акшнных веществ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва -

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова.

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Каплун. А П.

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Серебренникова Г.А.

доктор биологических наук, профессор

Суханов В.А.

Ведущая организация: Институт биоорганической химии им.

М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита диссертации состоится 21 июня 1499 г. в 15 часов на заседании Диссертационного Совета Д 063.41.01 при Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова по адресу: 117571, Москва, пр-т Вернадского,86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова по адресу: 119831, Москва, ул. М. Пироговская, 1.

Автореферат разослан ь 1999 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук,

старший научный сотрудник Л И. Лютик

А£68.? ~ А _0

российская

судлрстг.иННАЯ ____'

^ щ -£> У Общая характеристика работы:

Актуальность проблемы: За последние десятилетия число больных, страдающих от меланомы, увеличивается со скоростью, большей, чем для любого другого ракового заболевания. В России на конец 1995 года находилось под наблюдением 33200 больных меланомой. Летальность на первом году с момента установления диагноза составляет 16.4%. На 100 вновь выявленных больных приходятся 50.3 умерших.

В случае метастатической меланомы самыми эффективными препаратами являются дакарбазин, цисплатин, апьфа-2 интерферон, интерлейкин-2 (положительный ответ при применении этих препаратов в отдельности составляет 20-30%). Комбинированная терапия эффективнее (30-50% в некоторых клинических испытаниях), но, как правило, полного излечения не достигается. У большинства препаратов наблюдается высокая токсичность. В последнее время сообщается о попытках использования генно-иммунологической терапии (использование вакцин), но пока малочисленные данные не позволяют оценить эффективность этого подхода.

Недавно установлено,, что бетулиновая кислота (3|3-гидрокси-

*

луп-20(29)-ен-28-овая кислота, ВА (ШЬ) ) обладает уникальным свойством селективно ингибировать рост меланомы человека и ряда других опухолей нейроэктодермального происхождения путем включения механизма апоптоза (программированной смерти клеток). ВА не оказывает токсический эффект в дозе до 500мг/кг. Одна из больших проблем при лечении опухолевых заболевании является преодоление резистентности опухолевых клеток к химиотерапевтическим агентам. ВА действует на устойчивые к доксорубицину раковые клетки, что открывает новую возможность решения этой проблемы. Некоторые производные ВА обладают высокой анти-ВИЧ активностью.

Сокращения: ВА - бетулиновая кислота; Chol - холестерин; CholS - холестерин сульфат; еРС - яичный фосфатидилхолин; NaBA - . натриевая соль бетулиновой кислоты; PC - фосфатидилхолин; PVP -поливинилпирролидон; SA - стеариламин;8НО - пространственно затрудненный катализатор; SM - сфингомиелин; MSB - моносульфат бетулина; DSB - дисульфат бетулина.

Выделение ЕА из растительного сырья малорентабельно из-за низкого содержания (около 0.1% от сухого веса), в то время как кора березы содержит до 25% бетулина (I) - биосинтетического предшестсенника бетулиновой кислоты. Таким образом, является весьма ахтуальной разработка схемы получения ВА на основе бетулина.

Важным фактором, во многом определяющим эффективность действия гидрофобных лекарственных веществ, является возможность получения их водо-растворимых форм. Одним из подходов может служить включение таких соединений в состав липосом. Липосомы имеют тенденцию накапливаться е опухолях, что приводит к желательному повышению локальной концентрации лекарственных веществ, включенных в их состав. Поэтому разработка липосомальной формы для ВА представляет практический интерес.

ВА можно рассматривать как новое родоначальное соединение (lead compound) с антимеланомной активностью. Весь опыт химии лекарственных соединений говорит о том, что первое родоначальное соединение чрезвычайно редко проявляет оптимальный комплекс терапевтических свойств. В частности, для ВА характерна довольно большая терапевтическая доза (~250 мг/кг). Таким образом, актуальной проблемой является получение производных ВА и выявление соотношения структура-функция для поиска более эффективных произьодных.

Целью работы являлось:

1 .■ Разработка методов синтеза ВА и её производных из природного бетулина.

2. Разработка и исследование физико-хгмических свойств липосомальной формы ВА.

3. Исследование биологической активности В А и её производных.

Научная новизна: Предложены и осуществлены малостадийные схемы синтеза ВА, бетулоновой кислоты, бетулинальдегида, сульфатов бетулина из бетулина

Найдена система дата селективного окисления первичной гидроксильной группы бетулина в присутсивии вторичного гидроксила.

Получена и охарактеризована липосомальная форма ВА.

Изучена зависимость агрегационной стабильности липосом с ВА от природы липидов и амфифнльных полимеров, входящих в состав.

Изучена цитотоксичность ВА, её производных и включенной в шпосомы ВА in vitro для разных опухолевых клеток человека. Обнаружено, что одно из синтезированных соединений - бетулоновая сислота в 18 раз активнее, чем В А по отношению к клеткам меланомы VIS.

Включение ВА в липосомы может как снижать ее дитотоксичность , так и значительно повышать (в 19 раз для клеток лиеломы Im9) в зависимости от природы раковых клеток.

Трактнческап значимость: Отработан малостадийный метод юлучения ВА из легко доступного биологического предшественника бегулина.

Исследованы некоторые аспекты взаимосвязи между симнческим строением и биологической активностью производных ЗА, что позволяет планировать направленный поиск новых более [ктивных соединений в ряду производных ВА. Установлено, что одно 13 синтезируемых соединений - бетулоновая кислота обладает щтотокснчностыо по отношению к клеткам меланомы MS, n ÎS раз февышаюшей цитотоксичность ВА, что указывает на герспективность изучения ряда производных ВА как основы для »азработки новых высокоэффективных протнвомелакомных [екарственных препаратов.

Получена стабильная липосомальная форма ВА, которая может ibiTb использована после углубленных доклинических и клинических [сследований для лечения меланомы.

1оложення, выносимые ига защит)': . Синтез ВА и её производных из природного бетулина.

Получение липосомалыюй формы ВА и исследование основных :арактгристик (размеры, степень включения, агрегационная стойчкзость).

Данные о соотношении структура-активность для ряда [роизводных ВА, модифицированных по Сз и Сц положениям.

апробация работы: Результаты работы доложены на: The 25th nternaticnal Symposium on Controlled Release of Bioactive Materials Las Vegas, USA, June 1998), The 6<h Liposome Research Days 'onference (Les Embiez, Marselle, France, May 1998), и на V Международной конференции "Наукоемкие технологии" (19-21 мая 998. Ярославль).

Публикации По результатам проведенных исследований опубликовано 2 статьи, 3 тезисов докладов на научных конференциях.

Объем и структура работы

Настоящая диссертация состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы, содержащего ссылок. Работа изложена на

страницах и включает / схем, таблиц, // рисунков.

Результаты работы и их обсу/кдсние.

Для достижения поставленных целей работа проводилась в несколько этапов:

1. Отработка метода выделения бетулина из коры березы.

2. Разработка метода синтеза ВА из бетулина. Наработка ВА в препаративных количествах.

3. Синтез сульфатов бетулина.

4. Получение и исследование физико-химических свойств липосомальной формы ВА.

5. Исследование биологической активности ВА и её производных.

1. Отработка метода выделения бетулина из коры березы.

Так как бетулин служит исходным сырьем для предложенных схем синтеза ВА и её производных, потребовалась разработка препаративного метода выделения этого вещества из коры берёзы. В литературе достаточно полно описаны способы выделения малых количеств бетулина с последующей счисткой колоночной хроматографии. Для препаративного Быделения бетулина, экономически более целесообразно проводить его очистку без использования хроматографии.

Выделение бетулина проводили по модифицированной нами литературной методике (рис. 1). Суммарные тритерпены экстрагировали из измельченной коры берёзы 95% ацетона в аппарате Сокслета (для полного извлечения бетулина требуется не менее 5 циклов). Основными примесями были лу.чеол (до 20-30% от суммы экстрактивных веществ), олеановая кислота и другие тритерпенсвые соединения, а также бета-ситостерин.

Сырой бетулин выпадал в виде желтоватого осадка при удалении части растворителя из экстракта.

Ш^1 , 1 ' * » - 1 —^

Березовая кора

Рис. 1,Технологическая схема выделения бегулина из коры березы,

Важным этапом при выделении бетулина являлось удаление пигментов и полярных соединений. Для этого осадок сырого ; бетулина растворяли в ацетоне и пропускали через слой основного i оксида алюминия. Нами показано, что основной оксид алюминия ! наиболее подходит для этой цели, тогда как силикагель, кислый и нейтральный оксиды алюминия не полностью сорбируют примеси. Таким образом, экстракт обесцвечивался, полярные примеси удалялись.

Хроматографически чистый бетулин удалось получить только после . трехкратной перекристаллизации из метанола. Выход очищенного бетулина составлял 7-8 % от массы исходного сырья - коры березы (примерно 28-30% от суммарного бетулина в сырье).

2. Разработка метода синтеза бетулшювой кислоты из бстулнна. Препаративная наработка ВА.

2.1 Биологическое окисление.

Нами проведены исследования по поиску микроорганизмов и грибов, которые могли бы избирательно окислять бетулин. Были исследованы культуры, используемые для окисления стероидов: Corynebacterium simplex, Coryncbacierium mediolanum, Rhodococcus sp, Curvularia lunata, A'csidia orckidis, Tieghemella hyalospora, Rhizopus nigricans, Circirielta sp.. Бетулин растворяли в диметилсульфоксиде в присутствии эмульгатора (Твин 80) и вносили в питательную среду. После термостатирования при 37°С в течение 72 ч культуральную жидкость экстрагировали этилацетатом и анализировали с помощью ТСХ. К сожалению, ни в одной культуре бетулинсвую кислоту идентифицировать не удалось. 2.2. Химическое превращение.

До недавнего времени было известно четырехстадийное превращение бетулина в бетуликовую кислоту, заключающееся в блокировании обеих гидроксильиых групп ' ацетилированием., избирательном гидролизе олежноэфирной группы первичного спирта, окислении деблокированной гидрокекметиленовой группы до карбоксильной и удалении ацетильной защитной группы с гидроксила в Сз положении. Суммарный выход составлял 30%. В то

Работа проводилась в Центре "Еиоинженерия" РАН (Москва) б сотрудничестве с к.х.н. Андрютикой В. А.

же время очевидно, что подобное превращение можно осуществить в две стадии: 1) окислением бетулина в бетулоновуга кислоте (II), и 2) восстановлением кетогруппы до вторичного гидроксила. Целью данного этапа работы была разработка именно такой схемы синтеза (схема I). Также была поставлена задача найти подходящий реагент, способный избирательно окислять первичную гидроксильную группу в бетулине, не затрагивая вторичный гидроксил.

В качестве окислителей было опробовано несколько реагентов: перманганат калия б присутствии катализатора фазового переноса -дибензо-18-краун-6, азотная кислота и хромовый ангидрид. Предположение о возможности избирательного окисления первичной спиртовой группы первыми двумя реагентами не подтвердилось. И в том и в другом случае конверсия исходного бетулина (I) была крайне низкой. Частично эта проблема была решена (раздел 2.2.а.)

Схема !. Синтез (>етулнновой кислоты из бетулина

В то же время использование хромового ангидрида (в 2.2-кратном мольном избытке) в уксусной кислоте приводило к полной конверсии бетулина.

На ТСХ обнаруживалось пятно с большей, чем у исходного бетулина, хромг.тографической подвижностью, и окрашивающееся не только реагентом на терпеноиды (анисовый альдегид в серной кислоте), но и 2,4-динитрофенилгидразином (реагент на карбонильную группу). Полученное вещество (бетулонозая кислота (II)) выделялось из эфирного экстракта в виде натриевой соли осаждением раствором щелочи. Выход натриевой соли бетулоновой кислоты (II) составлял 40%.

Кроме основного продукта на ТСХ обнаруживалось много полярных веществ, которые, очевидно, являлись продуктами более глубокого окисления бетулина. Было выдвинуто предположение, что этого можно избежать путем уменьшения времени реакции. Для достижения полной конверсии был увеличен избыток окислителя. Действительно, при 4.4 кратном мольном избытке оксида хрома и добавлении его одной порцией выход соединения (И) повышался до 50%.

Тем не менее продукты глубокого окисления образовывались в значительном количестве. Так как известно, что активность хромового ангидрида как окислителя уменьшается при увеличении концентрации воды, уксусную кислоту разбавляли. В нашем случае оптимальным оказалось использование 85? „ уксусной кислоты, при этом выход (II) повысился до 59%.

Для использования в качестве реакционной среды нами были опробованы различные растворители и их смеси (диэтиловый эфир, бензол, ацетон, пиридин), однако результаты оказались неудовлетворительными. Выход реакции, проводимой в ацетоне, бензоле и пиридине был значительно меньше, чем выход реакции в уксусной кислоте, а при использовании эфира образовывались только побочные продукты. Применение стандартного реактива Джонса (раствор хромового ангидрида и серной кислоты в воде) в ацетоне также не привело к успеху: при комнатной температуре бетулин полностью расходовался за 20 мин, причем образовывались в основном побочные соединения. Результаты экспериментов по оптимизации условий проведения реакции окисления бетулина приведены в табл. 1.

Второй этап синтеза ВА (ШЬ) состоял в восстановлении бетулоновой кислоты (II) боргидридом натрия в метаноле. Судя по ТСХ, реакция проходит практически с количественным выходом.

Бетулиновую кислоту (ШЬ) выделяли осаждением из раствора метанол-этанол (2:1) горячей водой с последующей кристаллизацией из метанола.

Таблица 1.

Оптимизация окисления бетулина (I) в бетулоновую кислоту (II)

Окислитель Растворитель Соотношение бетулич/ окислитель (моль/моль) Выход Бетулоновой кислоты (II) %

КМп04/дибензо-13-краун-6 Ацетон 1/10 <5

НМОз Ацетон 1/10 <5

Сг03 Эфир 1/4.4 5

СЮз Бензол 1/4.4 18

Сг03 Пиридин 1/4.4 10

сю3 АсОН 1/2.2 40

Сг03 АсОН 1/4.4 • 50

СЮз АсОН 85% 1/4.4 59*

СЮ3 АсОН 70% 1/4.4 48

СЮ3 АсОН 85% 1/3.3 53

СЮ3 АсОН 85% 1/2.2 50

HCr04/H2S04 Ацетон 1/4.4 30

* Прибавление окислителя одной порцией.

Строение бетулоновой (И) и бетулиновой (ШЬ) кислот подтверждалось на основании данных ПК- и 'н-ЯМР-спехтроп, и при сравнении их с соответствующими спектрами исходного бетулина (табл. 2). Для целевого соединения (ШЬ) также был получен масс-спектр.

Полоса поглощения спиртового гидроксила (3500 см ') прчсутствовала в ПК-спектрах бетулина и кислоты (III) (менее интенсивная), но не наблюдалась в спектре бетулоно;юй кислоты (II i Спектр последней содержал плохо разрешенные полосы с чолиопыми числами 1687 и 1703 см"', которые соответствовали поглощении'

карбонильной группы в карбоксиле и кетоне. В спектре же кислоты (Ш) наблюдалась только полоса (1690 см"1), характерная для карбоксильной группы. Очень широкая полоса, соответствующая колебаниям ОН карбоксильной группы (3200-2800 см *), присутствовала в спектрах кислот (II) и (IIIЬ). Во всех спектрах наблюдалась полоса поглощения для С=С связи (1640 см *)

Таблица 2.

Данные ИК-, и 'н-ЯМР спектров, температуры плавления бетулина (I), бетулоновой (II) и бетулиновой кислот (Illb).

Соединения ИК-спектр (v, см ) ]Н-ЯМР спектр (5, м.д.) Т. пл. °С

Бетулин (I) 3470 (ОН), 1640 (С=С). 4.67, (1Н, м, =СН2), 4.57 (1Н, м, =СН2), 3.78 (1Н, м, 28-СШОК), 3.31 (1Н, м, 28-CH2OII), 3.17 (1Н, м, 3-СНОН), 2.36 (1Н, м, 19-СН), 1.66 (ЗН, с, СНз), 1.23 (ЗН, с, СН3), 0.96 (ЗН, с, СН3), 0.94 (ЗН, с, СНз), 0.80 (ЗН, с, СНз), 0.74 (ЗН, с, СНз). 254-257 (лит.: 256257)

Бетулоновая кислоты (И) 3200-2800 (ОН в СООН), 1703 (С=0 в RCOR), 1687 (С=0 в СООН), 1640 (ОС). 4.71, (1Н, м, =СН2), 4.59 (1Н, м, =СН2), 2.99 (1Н, м, 19-СН), 1.67 (ЗН, с, СН3), 1.04 (ЗН, с, СНз), 0.89 (ЗН, с, СН3), 0.88 (ЗН, с, СНз), 0.85 (ЗН, с, СН3), 0.80 (ЗН, с, СН3). 245-248 (лит.: 246247)

Бетулинопая кислота (Illb) 3500 (ОН в СНОН), 33002800 (ОН в СООН), 1690 (С=0 в СООН), 1640 (ОС). 4.71 (1Н, м, =СН2), 4.59 (1Н, м, =СН2), 3.37 (0.15Н, м, З-Нр), 3.17 (0.85Н, м, З-На)', 3.00 (1Н, м, 19-СН), 1.67 (ЗН, с, СН3), 1.23 (ЗН, с, СН3), 0.95 (ЗН, с, СН3), 0.91 (ЗН, с, СН3), 0.80 (ЗН, с, СНз), 0.73 ^ЗН, с, СН3). 291-293 (лит.: 290293)

При анализе данных 1 Н-ЯМР-спектрси обсуждаемых веществ (I)-(III) хорошо прослеживаются изменения, произошедшие в их структуре в ходе превращений. Основная часть протонов тритерпенового скелета резонирует в интервале 2.0-0.73 м.д. В этой же области для всех трех вещестЕ наблюдаются шесть синглетов, соответствующих метильным протонам. Сигналы с 6 > 2.0 м.д. дают надежную информацию о различиях в строении соединен.¡й (I) - (III). В этой области спектра хорошо различимы несколько групп сигналов. Сигналы двух протонов концевой двойгой связи (4.71 и 4.59 м.д.) характерны для всех трех веществ, что свидетельствует об устойчивости этой связи к окислению в использованных условиях. Сигналы протонов С28-гидроксиметиленовой группы (3.31, 3.78 м.д.) присутствуют только в спектре бетулина (I), в то время как сигналы протонов при Сз наблюдаются в спектрах бетулина (I) и кислоты (Ш). В последнем случае кроме мультипчета при 3.17 м.д., совпадающего по химическому сдвигу и форме с аналогичным сигналом с спектре бетулина (I), присутствовал мультиплет при 3.37 м.д., который мы отнесли к экваториальному протону а-эпимера (Ша). Соотношение интегральных интенсивностей указанных мультиплетов составило 85:15. Неполная стереоселективность восстановления кето-группы -основной недостаток разработанного метода превращения бетулина (I) в бетулиновую кислоту (Illb). С помощью перекристаллизации можно полностью удалить неприродный а-эпимер (Illa): в 1 II-ЯМ Р-спектре перекристаллизованных образцов ВА присутствовал только сигнал 3.17 м.д.

Масс-спектр для бетулиновой кислоты (III), полученной на

252

масс-спектрометре с ионизацией осколками деления ~ Cf при использовании времяпролетного анализатора ионов покачал единственный пик, соответствующий молекулярному иону бетулиновой кислоты (m/z 455.4).

Во время завершения разработки схемы синтеза появилось сообщение об аналогичном синтезе бетулиновой кислоты (Illb) in бетулина (I), осуществленном в лаборатории J. М. Pezzuto (USA, 1998), в которой впервые была обнаружена противомеланомная активность бетулиновой кислоты. Отличия заключаются в несколько других условиях окисления (авторы использовали стандартный реактив Джонса в качестве окислителя) и в проведении восстановления бетулоновой кислоты (II) в тетрагидрофуране. Как указывалось выше, наша попытка использования реактива Джонса не

привела к требуемому результату. По данным авторов, в тетрагидрофуране стереоселективность восстановления оказалась выше (соотношение р- и а-эпимеров составило 95:5), чем в нашем случае при использовании метанола в качестве реакционной среды.

Нами было проведено дополнительное исследование влияния условий реакции на стереоселективность. Результаты приведены в табл. 3. Восстановление в тетрагидрофуране при 20°С не улучшило стереоселективности. Только при пониженной температуре (0°С) соотноношение (3:а-эпкмеров увеличивалось и составляло 93/7, что совпадало с результатами выше упомянутой публикации.

Таблица 3

Влияние условий проведения реакции восстановления бетулоновой кислоты на стереоселективность

Растворитель Восстановитель Температура Соотн. ¡}:а эпимеров

Метапол №ВН4 20°С ' 85/15

Метанол КаВН4 0°С 87/13

Тетрагидрофуран 1ЧаВН4 20°С 85/15

Тетрагидрофуран №ВН4 0°С 93/7

2.2.а. Региоселективное окисление бетулина. Получение бетулнц альдегида (IV).

Известно, что скорости окисления первичной и вторичной гидроксильных групп различны , но различия обычно недостаточны, чтобы можно бь ло избирательно окислить только первичный гидроксил. Избирательность окисления существенно повышается, если используется стерически затрудненный катализатор, например, при г етерогенном катализе на окиси платины или при использовании гомогенных катализаторов на осноче тяжелых металлов (2гО(ОАс)2, П.иС12(РРЬз)). Литературный поиск позволил найти более дешевый реагент (БНО), который вследствие экранирования окисляющего центра объемными заместителями, окисляет первичные спирты быстрее вторичных на 2 порядка. Причем, в присутствии более сильного окислителя, например хлората, происходит регенерация БПО/н д)7м (схема 2).

Первичным < кислнгель

Продукты

Субстрат шбнр?тсльного

окисления

Схема 2. Избирательное окисление первичного гидроксила региоселективным вторичным окислитепем (SHO) с регенерацией последнего in situ.

Преимущество системы регенерации in situ в том, что она позволяет использовать региоселективный окислитель в каталитических количествах. Для огсисления бетулина, в качестве первичного окислителя использован перманганат калия с катализатором фазового перехода дибензо-18-краун-6. Соотношение вторичного окислителя SHO к бетулину (I) составляло 5 мольных %. Обнаружено, что основным продуктом окисления является бетулинальдегид (IV) (схема 3).

Схема 3. Региоселективное окисление бетулина в бетулинальдегид.

ВА (III) образовалась в следовых количествах. Исследована . зависимость выхода бетулинальдегида (IV) от растворителя (табл. 4)

Таблица 4

Влияние растворителя на выход бетулинальдегида.

Растворитель Выход бетулинальдегида, %

Ацетон 10

Диэтиловый эфир 65

Хлороформ 71

Дихлорметан 85

Таким образом, наилучший выход достигается, когда реакция проводится в дихлорметане.

Строение полученного бетулинальдегида (IV) подтверждалось

данными 'н-ЯМР-спектра. По сравнению с спектром бетулина в спектре альдегцда (IV) отсутствуют сигналы протонов при С23 гидроксиметиленовог группы (3.77 и 3.31 м.д), кроме того появился сигнал, характерный для протона альдегидной группы (9.66 м.д). Остальные сигналы у альдегида (IV) и у бетулина практически совпадали, в том числе сигнал для протона при С'з положении (3.17 м.д.). Это свидетельствует о том, что гидроксильная группа при этом положении не была затронутой в ходе окисления.

3. Синтез сульфатов бетулина.

С целью изучения закономерности структура противоопухолевая активность были синтезированы моно- и дисульфаты бетулина (MSB и DSB). У MSB присутствует кислотная группа, ка:< у ВА, что позволяет предположить о возможной противомелЕкомной активности у этого вещества.

Для синтеза сульфатов бетулина мы использовали в качестве сульфирующего реагента комплекс триоксида серы с пиридином (Ру*ВОз), наиболее часто применяемый для сульфирования спиртов, фенолов, стероидов и др. (схема 4).

Мы попытались подобрать условия как селективного сульфатирования одной ОН - группы так и исчерпывающего сульфирования обеих гидроксилов.

В качестве растворителей пыли опробованы пиридин, бензол, толуол и ДМФА. Для получения MSB (V) реакцию проводили при 1.3-кратном избытке SC>3*Py, при 50-60°С. При этом уже через 30 минут были обнаружены как MSB, так и DSB (VI), с преобладанием первого. После полутора часов в реакционной смеси, судя по ТСХ, существенных изменений не наблюдглось.

DSB (VI) получали при использовании 4-кратного избытка БОз*Ру. Реакцию проводили при 80°С в течение 4 ч. В реакционной смеси кроме целевого дисульфата (VI) наблюдалось присутствие не прореагировавшего бетулина и моносульфата (V).

Увеличение времени реакции не приводило к изменению соотношения компонентов реакционной смеси.

Чистые сульфаты (V и VI) получили после колоночной хроматографии на силикагеле с выходом 45% и 30% соответственно.

Строение этих веществ подтверждали данными элементного анализа и ^-ЯМР-спектроскопии. В их спектрах присутствовали сигналы метальных (2.5-0.5 м.д.) и метиленовых протонов (4.65, 4.56 м.д.), как у бетулина. Сигналы протонов при Сгя У обоих сульфатов сдвигались в сторону слабого поля на 0.48 м.д. У MSB (V) сигнал протона при Сз не изменялся (3.17 м.д.), а в молекуле DSB сдвигался в сторону слабого поля на 0.46 м.д.

4. Получение и исследование физико-химических свойств липосомалыюн формы ВА.

Важным фактором, во многом определяющим эффективность действия гидрофобных лекарственных веществ, является возможность получения их водо-растворимых форм. На наш взгляд, наиболее приемлемым методом для ВА является включение в липосомы, поскольку при этом используются естественные для организма человека компоненты.

4.1. Определение возможности включения ВА в"липосомы.

0.20-

0.15-

0.10-

0.05

1- До центрифугирования

2- После центрифугирования

ООО

10 20 Содержание №-ВАвлипосомах, мол % Рис. 2 Зависимость оптического поглощения ВА-содержащей еРС-днсперсии от соотношения ЬтаВА/(НаВА+еРС)*100% (моль/моль).

Суммарная концентрация ингредиентов 0.5 мг/мл.

На первом этапе было определено максимальное содержание ВА, которое может встроиться в мембрану липосом из яичного фрсфатидилхолина (еРС). Водные дисперсии смесей еРС и ВА с различным мольным соотношением готовились впрыскиванием спиртового раствора еРС и ВА в физиологический раствор при 60°С.

ВА и ее натриевая соль при впрыскивании спиртового раствора в .воду образуют очень нестабильные дисперсии. Агрегаты микрокристаллов осаждались из дисперсии в течение часа. Поэтому

1Ы предполагали, что при достижении концентрации "насыщения" JaBA в бислое она будет выделяться в виде подобных шкрокристаллов, что должно проявляться в резком увеличении веторассеивания и выпадении осадка при центрифугировании. На 1ис. 2 представлено изменение поглощения дисперсий до и после (ентр¡{фугирования в зависимости от содержания NaBA в липосомах □ еРС. Оптическое поглощение дисперсии до центрифугирования кривая 1), начиная с препаратов, содержащих более 10% NaBA, юзрастало скачкообразно. Кривая 2 представляет результаты малогичных измерений тех же дисперсий после центрифугирования. Сравнение этих кривых показывает, что при мольной доле NaBA юлее 10% образуются частицы, осаждающиеся при ;ентрифугировании (4300 g), т.е. значительно более крупные, чем шпосомы.

i.2. Оптимизация состава липосом.

На следующем этапе исследовалась агрегационная устойчивость липосомальных дисперсий в смеси с различными толярными липидами. Липосомы в данном случае готовились по :ледующей методике. Водный раствор глюкозы упаривали в <руглодонной колбе до получения аморфной стекловидной плгнки. В <олбу прибавляли спиртовой раствор липкдов и NaBA и снова /париьали. Затем добавляли воду и взбалтывали. Суспензию подвергали обработке ультразвуком. Преимущество этого метода включается в быстроте и полноте диспергирования липидной пленки. При использовании традиционной методики возникали сложности, связанные с тем, что кристаллы ВА с большим трудом отделялись от стенок колбы даже при получасовом встряхивании. Для создания изотоничности была использована глюкоза, так как было обнаружено, что в 0.9% солевом (физиологическом) растворе при хранении наблюдается быстрая агрегация липосом, содержащих NaBA.

Агрегационную устойчивость NaBA содержащих липидных дисперсий оценивали по соотношению значений их оптического поглощения дисперсий до и после центрифугирования (рис. 3). Чем выше и ближе к единице это соотношение, тем устойчивее дисперсия.

Для смесей NaBA с еРС, с гидрированным соевым PC, с CholS, а также для тройных смесей с ePC/Choi (5:2) и с SM/Chol (5:2) это соотношение было 0.65 и меньше, тогда как тля дисперсий, составленных из NaBA и SM или SM/CholS/Na3A (5:2:3), ePC/CholS/NaBA (5:2:3) эта величина варьировала ог 0.85 до 0.9.

SM:CholS:NaBA:5:2:3 SM:NaBA 7:3 ePC:SM:NaBA 7:3 ePC:CholS:NaBA 5:2:3 ePC:NaBA 7:3 Hydr.soybeanPC:NaBA 7:3 ePC:SA:NaBA 5:2:3 NaBA

3M:Chol:NaBA 5:2:3 Chol:NaSA7:3 ePC:Chol:NaBA 5:2:3

33

—1

[ZZZD,

1—T—1-,-.-1-r

• 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8

Соотношение оптического поглощения при 450 нм после и до центрифугирования.

Рис. 3. Агрегациоккая устойчивость липидных дисперсий с NaBA. (соотношение липидов выражено в мольных долях).

Из приведенных данных видно, что стабильность дисперсий, включающих ВА, зависит от тонких различий в строении образующих бислой липидов. Например, гидрированный соевый PC имеет б гидрофобной части цепи, мало отличающиеся по структуре от таковых в SM из мозга крупного рогатого скота, однако SM показывает лучшие результаты. В то же время, оба исследуемых PC, различающиеся от длине и по ненасыщенности жирнокнелотных остатков, одинаково плохо солюбилизируют NaBA. Это положение еще более напкущо выявляется при сравнении Chol и ChoIS. Chol снижает агрегационную устойчивость липосом на основе еРС, а ChoIS повышает ее. Последнее хорошо иллюстрируется данными, представленными на рнс. 4. Аналогичным образом Chol и ChoIS влияют на устойчивость липосом на основе SM.

(

J

i г

о

0.

0.

0.

Рис. 4. Оптическое поглощение липидных дисперсии еРС и ePC:Cho!S, содержащие ВА (без центрифугирования). Суммарная концентрация компонентов 5мг/мл. Соотношение NaBA/CholS=)./l

(моль/моль).

На электронных микрофотографиях" липосомальных препаратов на основе сыеги ePC/CholS, выполненных через неделю после их получения наблюдаются конгломераты, состоящие из 10-20 липосом, а также пучки игольчатых кристаллов длиной 0.5-2 мкм (по всей видимости, это кристаллы NaBA). Чтобы избежать этого нежелательного явления, были испытаны амфифильные полимеры для стабилизации липосом. Мы предполагали, что в нашем случае полимеры будут покрывать липосомы, защищая их от агрегации. Обнаружено, чго наилучший результат достигается при использовании смеси полимеров PVP/проксанол 263 (1:1). Электронная микрофотография показала отсутствие агрегации а течение месяца и сохранение размеров липосом в диапазона 20-100 нм. Не наблюдалось в этих дисперсиях и образования кристаллов NaBA.

—И— ePC:NaBA | а

- • ePC:CholS:NaBA ! Т 'Т

Ш'

6" /г !

П

7?

у

/

Т/ -г- Т/

i у........

О 5 10 15 20 25 Ыа-ЗА/(№-8А+липиды) (моль/.голь)*100%

* Электронные фотографии сделаны в НИИ Вирусологии им. Д.Й.Ивановсксго РАМН ст. н. сотр. Грнгорьевом В.Б.

РУР и некоторые другие полимеры используются дл) солюбилизаиии гидрофобных соединений. Поэтому мы исследовал» эффективность- подобной солюбилизации в случае №ВА дш сравнения с эффективностью солюбилизации липосомами. Смесз полимеров, показавшая наилучшие результаты для стабилизации липосом, максимально солюбилизировала НаВА в количестве 6.7% о: суммарной массы полимеров (рис. 5). Это практически не отличаете« от эффективности солюбилизации с помощью липосом (6.6%).

NaBA/(NaBA+PVP+ProKainsoi)(r/r)*lOO%

Рис. 5. Оптическое поглощение дисперсии полимеров с NaBA. Суммарная концентрация компонентов = Змг/мл.

5. Исследование биологической активности ВА и её производных*

. Цитотоксическую ахтивность ВА и производных определяли по ингибироианию пролифератквной активности опухолевых клеток человека следующих линий: MS (меланома), СЕМ (лимфома), SKOV3 (карцинома яичника), Bro В19 (меланома), 1ш9 (миелома). Количество выживших клеток определяли с использованием бромида Э-[4,5-

* Биологические испытания проводились в Московском Научно-исследовательском Институте Медицинской Экологии в лаборатории клеточной биохимии вед. и. сотр., к.х.н. Посыпановой Г, А. и к.б.н. Колибабой Л.Г.

диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия (МТТ). Были исследованы растворы в ДМСО: бетулина, бетулиновой и бетулоновой кислоты, моно- и дисульфатов бетулина, а также липосомальная форма ВА (табл. 5).

Таблица. 5.

Цитотоксичность производных ВА и липсссмальной формы опухолевых клеток человека.

Препарат i MS ICso МКГ/МЛ Bro В19 СЕМ Im9 SKOV3

Бетулин (I) >1000 - - -

Бетулсновая кислота (II) 2 7.6 (13)*' <6 2 10

ВА (III) 36 6.5(27)* 13-6 38 29

MSB (V) 313 - - -

DSB (VI) 330 - - -

ВА (II) в липосомах 66 - 2 13

*1Сзо

Приведенные результаты позволяют сделать некоторые выводы относительно соотношения структура-активность з исследованном ряду веществ.

Карбоксильная группа в положении критически важна для проделения противоопухолевой активности. У бетулина Еместо этой группы находится неспособная к ионизации гидрскскметильная, и он практически не ахтивен. У мско- (V) и дисульфатов (VI) бетулина, у которых в этом положении имеется кислотная группг, наблюдается некоторая активность. Меньшая, чем у ВА активность нсжет быть связана как с большей константой диссоциации сульфокислсты, так и с большей удаленностью ее от скелета молекулы. Таким образом, возможными модификациями в этой области могут быть замены карбоксильной группы на кислотные группы с размером меньшим,

чем -СН2050зК (например, -СК2Е03Н, -С^ЫШО-Д, -0503Н, -

ОЗОгШз, -ЯОзК, -БОгИНг, или -МНЕО^}. Расстояние от скелета до ионизируемого атома для харбоксЕ^льной группы составляет 0.223 им, для -Сл^СЗОгН это расстояние в два раза больше. Наиболее близким по этому параметру является группа -СКгИНЗОзИ (0.251 Ока же, счеЕ.чдно, проще других может быть введена а бзтулин. ''

Модификации в положении Сз более перспективны. Одно из таких производных - бетулоновая кислота (II), имеет цитотоксичность выше, чем у бетулиновой кислоты, например, для клеток меланомы MS цитотоксичность больше в 18 раз. Обращает на себя внимание факт, что у монс- и дисульфатов бетулина активность близка, хотя у последнего гидроксил при Сз сульфатирсван.

Включение ВА в липосомы существенно изменяет цитотоксичность ВА, и это изменение (величина и направление) зависит от природы клеточных линий. Липосомальная форма ВА, по сравнению с раствором ВА, в 2 раза менее активна для клеток меланомы MS, в то время как для клеток SKOV3 (карцинома яичника) и 1ш9 (миелома) эффективнее в 2 и 19 раз соответственно. По последним данным ВА индуцирует апоптоз, действуя ка митохондрии. Таким образом, эффективность ее прямо зависит от того, насколько хорошо она проникает в клетку. И не исключено, что найденные различия в ингибировйнии пролиферации раковых клеток липосомальными препаратами ВА определяются различиями в способности этих клеток к эндоцитозу.

In vivo ситуация может существенно измениться как вследствие разницы в распределении ВА в виде раствора и в липосомах, так и возможной пролонгации действия в случае липосомальной формы.

Выводы

1. Отработана схема препаративного выделения хроматографически чистого бетулина из коры березы с выходом 30% от суммарного содержания в сырье.

2. Разрабсртаны малостадииная схема синтеза бетулиновой кислоты окислением бетулина хромовым ангидридом с последующим восстановлением кето-группы в бетулоновой кислоте. Выявлены факторы, влияющие на выход окисления бетулина, а также условия повышения стсреоселективности восстановления кето-группы.

3. Разработан способ регаоселективного окисления первичной гидроксильной группы бетулина до альдегидной при сохранении вторичного гидроксила.

4. Исследованы возможности солюбилизации бетулиновой кислоты включением ее в липосомы и образованием комплексов с амфифильными полимерами (поливинилпирролидон и проксанол). Подобран состав (яичный фосфатидилхолин/холестерин сульфат), который позволяет включать до 6.6 % массовой доли бетулиновой

кислоты; приблизительно такая же эффективность (6.7% массовая доля) наблюдается для некоторых композиций с полимерами.

5. Изучена агрегационная стабильность липосом различного состава. ' Показано, что холестерин уменьшазт, а холестерин сульфат i повышает стабильность липосом, содержащих бетулиновую ! кислоту. Обнаружено, что липосомы, приготовленные с

добавлением поливинилпирролидона и проксанола, обладают большей агрегационной устойчивостью и поэтому более стабильны при хранении.

6. Исследована цитотоксичность бетулиновой кислоты и её I производных in vitro для разных клеточных линий опухолей

! человека. Обнаружено, что одно из производных по Сз -бетулоновая кислота проявляет цитотоксичность в концентрациях ' 18 раз меньших, чем бетулиновая кислота по отношению к клеткам меланомы MS.

7. Включение ВА в липосомы может как снижать ее цитотоксичность (например, в два раза для клеток меланомы MS), так и повышать (в 2 и 19 раз для клеток карциномы яичников SKOV3 и миеломы Im9 соотзетстзенно).

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих

работах:

l.Le Bang Son, А. P. Kaplun, A. V. Symon, A. A. Shpilevsky, V. B.Grigoriev, V. I. Shvets. Solubilization of betulinic acid, a new antimelancma compound. // The Proceeding of "The 25th International Symposium on Controlled Release of Bioactive Materials" (Las Vegas, USA, June 1998). -P. 419-420. 1. Le Bang Son, A. P. Kaplun, A. V. Symon, A. A. Shpilevsky, V. B. Grigoriev, V.I.Shvets. Liposomal form of betulinic acid, a selective apoptosis inducing in melanoma cells substance. // J. Liposome Res. -«993. -V.8., N.l. -P.78. The Proceeding of "The 6th Liposome Research Days Conference" (Les Embiez, Marselle, France, May 1998).

3.Ле Бгнг Шон, А. П. Каплун, А. А. Шпилевский, Ю. Э. Андия-Правдивый, С. Г. Алексеева, В. Б. Григорьев, В. И. Швец. Синтез бетулиновой кислоты' из бетулина и исследование ее солюбилизации с помощью липосом // Биоорган. Химия. -1998. -Т. 24., № 10. -С. 787-793.

4. А. П. Каплун, Ле Банг Шон, Ю. М. Краснопольский, В.И.Швец. Липосомы и другие наночастицы как средство доставки лекарственных веществ. Успехи в технологии получения

технологии применения. V Международная конференция "Наукоемкие технологии. Тезисы докладов. Ярославль. 19-21 мая 1998. -С. 159-Д60.

5. А. П. Каплун, Ле Банг Шон, Ю. М. Краснопольский, В. И. Швец. Липосомы и другие наночастицы как средство доставки лекарственных веществ // Вопросы Мед. Химии. -1999. -Т. 45., № 1. -С. 3-12,

Подписано в печать Формат 60*90/16.

Бумага офсетная. Печать офсетная. Уч. изд. л. Тираж 80 экз. Заказ Л«_

ИПЦ МИТХТ им. М. В. Ломоносова, пр. Вернадского В6

МОСКОВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ ТОНКОЙ ХИМИЧЕСКОЙ ТЕХНОЛОГИИ им. М. В. ЛОМОНОСОВА

На правах рукописи

Ле Банг Шон

УДК 547.597.057:148+615.014.23

Синтез бетулиновой кислоты и разработка её липосомальной формы

02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель -доктор химических наук, профессор А. П. Каплун

Москва -

1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

Список сокращений 6

1. Введение 7

2. Обзор литературы. Биологическая активность бетулиновой кислоты 12 и структурно-близких соединений

2.1. Противоопухолевая активность 12

2.1.1. Взаимосвязь структура-активность бетулиновой кислоты и 12 родственных соединений

2.1.1.1. Активность бетулиновой кислоты и близких соединений на 2-х 13 стадийных моделях опухолей

Ряд урсолевой кислоты 14

о

Олеановыйряд s . 15

Ряд тараксастана. 16

Ряд мултифлорайа. 17

Ряд бетулиновой кислоты. 18

2.1.1.2. Цитотоксичность ВА и близких соединений in vitro 21 Цитотоксичность бетулиновой кислоты и винбластина in vitro для разных 21 опухолевых линии

Цитотоксичность В А и близких соединений на клеточной линии L1210 в 23 фазах роста и покоя

Цитотоксичность пулсатилловой кислоты 24

Цитотоксичность ВА и производных цеантиновой кислоты 25

Цитотоксичность различных терпеноидов, структурно близких к 27 бетулиновой кислоте.

Цитотоксичность некоторых лимоноидов сенданинового типа на линии

Р388 (мышиный лифоцитарный лейкоз) in vitro 47

Цитотоксичность циютоартаноидов 47

Цитотоксичность кукурбитацина Е и кумижианозидов 49

Цитотоксичность виргауреасапонина и продуктов гидролиза 51

Цитотоксичность юлиброзидов и продуктов их гидролиза 52

Цитотоксичность производных бетулиновой кислоты 53

Противоопухолевая активность соединений, выделенных из Маргоипеа africana 54

Цитотоксичность производных урсолевой кислоты на клеточной линии 54

гепатомы PLC/PRF/5

2.1.1.3. Анализ соотношения «структура - противоопухолевая активность» 55

ВА и близких соединений

Цитотоксичность соединений, различающихся строением в кольцах С, Э

или Е 56

Цитотоксичность соединений с 3-кето функцией, различающихся

строением в кольцах С, Б или Е 57

Заместители в Сз положении 58

Зависимость цитотоксичности от природы заместителя в Сз-положении

для соединений не бетулинового ряда 59

Зависимость цитотоксичности от природы заместителя в Сз-положении в

рядубетулина 61

Положение Сгз, С24. 61

Зависимость противоопухолевой активности от заместителей в С23 и С24 62

Изменение в Сп положении. 64

Цитотоксичность производных бетулиновой кислоты в зависимости от

природы заместителя С17 положении 64

Цитотоксичность терпеноидов в зависимости от природы заместителя в

С17 положении 65

Другие положения нижней части структуры 67

Цитотоксичность терпеноидов в зависимости от природы заместителя в

нижней части структуры 67

Цитотоксичность терпеноидов в зависимости от природы заместителя в Сг

положении 68

Цитотоксичность терпеноидов в зависимости от природы заместителя в

С12 положении 69

Цитотоксичность терпеноидов в зависимости от природы заместителя в С19 положении

Цитотоксичность производных бетулиновой кислоты в зависимости от

заместителя в С19 положении 72

Цитотоксичность производных охрацеолидов 73

2.1.2. Возможные механизмы противоопухолевого действия бетулиновой 75 кислоты

2.2. Противовирусная активность тритерпеноидов 79

2.3. Противовоспалительная активность 82

2.4. Противомикробная активность 84

2.5. Другие активности 85

3. Результаты работы и их обсуждение 87

3.1. Отработка метода выделения бетулина (I) из коры березы. 88

3.2. Разработка метода синтеза бетулиновой кислоты из бетулина (I). Препаративная наработка В А 91

3.2.1 Биологическое окисление. 91

3.2.2 Химическое превращение 91 3.2.2.а Региоселективное окисление бетулина. Получение бетулинальдегида (IV). 1С

3.3. Синтез сульфатов бетулина 103

3.4. Получение и исследование физико-химических свойств липосомальной формы ВА. 105

3.4.1. Определение максимальной степени включения В А в липосомы из еРС. 1С о

3.4.2. Оптимизация состава липосом 10?

3.5. Исследование биологической активности ВА, её производных, и 112. липосомальной формы

Соотношение "структура-активность" 1124. Экспериментальная часть 115

4.1. Выделение бетулина из коры березы 11

4.2. Биологическое окисление бетулина 117

4.3. Химическое окисление бетулина 118" Получение бетулоновой кислоты 11$ Получение бетулиновой кислоты 11? А.. Восстановление бетулоновой кислоты в метаноле 113

Б. Восстановление бетулоновой кислоты в тетрагидрофуране 120

Получение бетулинальдегида 12.0

4.4. Синтез сульфатов бетулина 124 А. Получение MSB ГУ) 124 Б. Получение DSB ГУЛ 124

4.5. Получение липосомальной формы ВА и исследование ее физико-химических свойств 122. Приготовление липосом. 12£

Исследование эффективности включения NaBA в липосомы из еРС 122.

Исследование влияния состава липосом на их агрегационную 123.

устойчивость

Исследование способности солюбилизации NaBA полимерами 123

4.6. / Определение цитотоксичности ВА, её производных, и липосомальной

формы 123

5. Выводы 125

6. Литература 12<?

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

н.а. - не активно.

AIF - (Apoptosis-inducing factor) апоптоз-индуцирующий фактор.

ВА -бетулиновая кислота

Casp-З - каспаза-3

Casp-8 - каспаза-8

Choi - холестерин

CholS - холестерин сульфат

Cyt С - цитохром С

DMBA - 7, 12-диметилбенз [а]антрацен DSB - дисульфат бетулина

DTIC - 5-(3, 3-dimethyl-l-triazeno)-imidazole-4-carboxamide, дакарбазин EBV - вирус Эпштейна-Барра еРС - яичный фосфатидилхолин

ICE (interleukin-converting enzyme) - интерлейкин-конвертирующий фермент.

MSB - моносульфат бетулина

NaBA - натриевая соль бетулиновой кислоты

PARP (polyadenosine diphosphate ribose polymerase) - полиаденозин-дифосфат-рибозо-

полимераза.

PC - фосфатидилхолин

PVP - поливинилпирролидон

SA - стеариламин

SHO - (sterically hindered oxidant) пространственно затрудненный окислитель SM - сфингомиелин

TP A - 12-О-тетрадеканоилфорбол-13-ацетат Z.VAD.fmk (Z-Val-Ala-Asp-fluoromethylketone)

I

1. Введение

В настоящее время меланома становится серьезной проблемой для здравоохранения. Ожидается, что в США к концу этого десятилетия в среднем 1 из 75 человека подвергается риску развития меланомы. В России в 1995 году находились под наблюдением на конец года 33200 больных меланомой [1]. Летальность на первом году с момента установления диагноза составляет 16.4 %.[1]. На 100 вновь выявленных больных приходятся 50.3 умерших [1]. Если в 1985 году абсолютное число вновь выявленных заболеваний составляло 3.4 тыс. человека то на 1995 - уже 5.0 тысяч [1]. Хотя хирургическое удаление с применением интерферона в качестве адъюванта или без него может быть эффективным на I, II и III, стадиях, у многих пациентов с глубокой первичной опухолью или в случае вовлечения лимфатических узлов развиваются дистальные метастазы.

Прогноз развития метастатической меланомы у пациентов неутешителен. Средний срок выживаемости - от 6 до 10 месяцев. Пятилетняя выживаемость наблюдается не более чем у 4% больных [2].

Для лечения меланомы самым эффективным химиотерапевтическим агентом является дакарбазин (БТЮ); он вызывает улучшение состояния у 24% пациентов. Комбинированная терапия с другими синтетическими и иммунологическими агентами, такие как кармустин, цисплатин, тамоксифен, интерферон-альфа, интерлейкин-2 дает улучшение у 30-50% больных в некоторых клинических протоколах, но полного излечения не достигается, а токсичность комбинаций увеличивается.

Основанная на революционных достижениях в биотехнологии в течение последних 25 лет, генетическая инженерия проявляется как новая дисциплина с многообещающим потенциалом для клинического применения. В частности, большой интерес представляет

использование генной терапии для лечения злокачественной меланомы. Эти усилия преследуют две цели. В первых, как адъювантное лечение у пациентов на стадии полной клинической ремиссии для уничтожения микрометастазов. Во вторых, как альтернативная терапия для поздних стадий неудаляемых метастазов, когда обычные схемы лечения, включая химиотерапию, радиотерапию, а также системное применение цитокина (интерлейкина-2) не очень эффективны и не предотвращают фатальный исход. Исследования по генно-иммунологической терапии проводятся и в России, в НИИ Онкологии им. Петрова (Санкт-Петербург). Результаты достаточно обещающие, но пока малочисленные. Подробный обзор по генно-иммунологической терапии меланомы можно найти в обзоре [3].

Разные вещества природного происхождения, такие как доксорубицин, блеомицин, этопозид, винкристин и их производные были опробованы для лечения меланомы в виде монотерапии, а также в комбинации. Эти вещества также как и перечисленные выше, показывают низкую эффективность, неустойчивую полную ремиссию и высокую токсичность. В связи с этим поиск новых более эффективных противомеланомных соединений остается актуальной проблемой. У некоторых исследователей появлялись сомнения о целесообразности проведения тотального скрининга выделенных из природных источников соединений из-за низкой вероятности нахождения эффективных соединений и дороговизны этой процедуры. Взамен тотального скрининга в настоящее время предлагают новые подходы, в частности метод комбинаторной химии, а также компьютерное конструирование (QSAR подход), которые уже дали определенные успехи.

Однако, в последнее время интерес к природным соединениям вновь возрастает в связи с обнаружением новых эффективных лекарственных веществ среди этих соединений. Два таких активных соединений - паклитаксел (Taxol) и камптотецин. Паклитаксел, выделенный из коры тисса Тихого океана Taxus brevifolia Nutt. (Тахасеае) одобрен для применения в декабре 1992 г. в

США и сейчас используется для лечения рака яичников устойчивого к другим противоопухолевым препаратам. Недавно были проведены клинические испытания для выяснения возможности использования паклитаксела в лечении метастатической меланомы. Паклитаксел показывал активность, сравнимую с цисплатином и интерлейкином-2. Механизм его действия связан с влиянием на полимеризацию тубулина, что приводит к остановке деления клеток в фазе митоза. Второе лекарственное вещество, камптотецин, было выделено из коры Китайского растения Camptotheca acuminata Decaisne (Nyssaceae). Механизм действия камптотецина иной, чем у паклитаксела - он ингибирует топоизомеразу 1.

Бетулиновая кислота (1, В А) известна еще с начала нашего века. Родственное соединение - бетулин содержится в коре березы в количестве до 25% по массе и обусловливает её белый цвет. Первое упоминание о противоопухолевой активности В А относится к 1972 г. [4]. После этого появилось несколько работ, посвященных фитохимии растений, где также зафиксировано это свойство В А. Однако авторы ограничились только первичными исследованиями. Конкретный механизм действия ВА не был установлен.

* Здесь и дальше приводятся русские названия соединений вместе с английскими в связи с не устоявшимися переводами английских названий на русский язык. Многие названия переводятся автором впервые.

"У—21 / \ 12 18

•ОН

(1) Бетулиновая кислота (луп-20(29)-ен-3-ол-28-овая кислота), betulinic acid

В 1995 году, ученые из Иллинойского университета (США), при проведении скрининга среди 2500 экстрактов растений, установили, что ВА обладает уникальным свойством селективно ингибировать рост меланомы путем включения механизма апоптоза [5]. В опыте на бестимусных мышах, несущих человеческую меланому, ВА в 3 раза эффективнее уменьшала рост опухоли по сравнению с дакарбазином. Современные противоопухолевые препараты, такие как камптотецин, таксол, винбластин и др. высоко токсичны для организма. В отличие от этих веществ ВА не оказывает токсического действия в терапевтических дозах.

Недавно (ноябрь 1997 г.) установлено, что В А эффективна не только в отношении меланомы, но также и других опухолей нейроэктодермального происхождения (нейробластома, меддулобластома и др.) [6].

Одна из больших проблем в лечении опухолевых заболеваний является способность опухолевых клеток быстро приобретать устойчивость к действиям противоопухолевых агентов. Поэтому тот факт, что ВА действует даже на опухолевые клетки, резистентные к доксорубицину или к анти-Рав-антителам [6], представляет повышенный интерес.

Выделение ВА из растительного сырья малорентабельно из-за низкого содержания (около 0.1% от сухого веса), в то время как кора березы содержит до 25% бетулина (26), биосинтетического предшественника бетулиновой кислоты. Таким образом, является весьма актуальной разработка схемы синтеза ВА из бетулина.

Важным фактором, во многом определяющим эффективность действия гидрофобных лекарственных веществ, является возможность получения их водо-растворимых форм. Одним из подходов может служить включение таких соединений в состав липосом (бислойных липидных везикул). Липосомы имеют тенденцию накапливаться в опухолях [7], что приводит к желательному повышению локальной концентрации лекарственных веществ, включенных в их состав.

ВА можно рассматривать как новое родоначальное соединение (lead compound) с противомеланомной активностью. Весь опыт химии лекарственных соединений говорит о том, что первое родоначальное соединение чрезвычайно редко проявляет оптимальный комплекс терапевтических свойств. В частности, для ВА характерна довольно большая терапевтическая доза (-250 мг/кг). Таким образом, актуальной проблемой является получение производных ВА и выявление соотношения структура-функция для поиска более эффективных производных.

Настоящая работа посвящена разработке методов синтеза ВА, ее производных и исследованию закономерностей «структура-активность» в ряду этих производных ВА, и разработке липосомальной формы ВА, как возможной лекарственной формы.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Биологическая активность бетулиновой кислоты и структурно-близких соединений 2.1. Противоопухолевая активность 2.1.1. Взаимосвязь структура-активность

Много внимания было уделено исследованию биологической активности сапонинов -гликозидов тритерпенов и стеринов [8]. Однако, публикации, посвященные цитотоксичности тритерпенов природного происхождения крайне малочисленны [9-12].

До недавнего времени сведения о противоопухолевой активности пентациклического тритерпена бетулиновой кислоты и ее аналогов скудны и противоречивы. Эту активность впервые описали Sheth К. и сотрудники (университет Аризоны, США) в 1972 в работе, посвященной исследованию фитохимии Hyptis emoryi (Labiatae) [4]. Тест проводился в системе 5WA16 (Walker256) in vivo. Теми же авторами сообщено об активности лупеола (32)* и бетулина (26) в этой же тестовой системе в 1973 году [13]. Также зафиксирована активность бетулина (26) против эпидермоидного рака носоглотки in vitro[14]. В 1976 году появилось сообщение о противоопухолевой активности бетулиновой кислоты и родственных соединений на клетках Р388 лимфоцитарного лейкоза (3PS) in vivo [15]. Активность оценивалась как увеличение продолжительности жизни подопытных животных по сравнению с контролем. В этой системе бетулиновая кислота демонстрировала 140% увеличение продолжительности жизни в диапазоне доз 50-100 мг/кг. Уваол (3) показал эффективность 125% при дозах 100 и 200 мг/кг, а урсолевая кислота (4) 125% активность при 50 мг/кг. Но активность бетулиновой и урсолевой кислот (4) не обнаружена на клеточной культуре 9КВ рака носоглотки [16]. Также не наблюдалось активности бетулиновой кислоты и лупеола (32) на клеточной линии КВ [17]. Многие растительные экстракты, основными компонентами которых являются бетулин (26),

* Нумерацию соединений см. в нижеследующих таблицах.

бетулиновая кислота, лупеол (32) обладают противоопухолевыми свойствами [18, 19]. Противоопухолевая активность наблюдалась для лупеола (32) [20], бетулинового альдегида [21]. Choi YH и др. показали, что З-О-ацетат бетулиновой кислоты, метиловый эфир бетулиновой кислоты (218) обладают 1С ¡о 10.5 и 6.8 мкг/мл, соответственно, против мышиного лейкоза Р388 in vitro [22]. Тем не менее бетулиновая кислота по критериям Национального Института Рака (США) признана в 1989 г. не эффективной субстанцш [23,24].

2.1.1.1. Активность бетулиновой кислоты и близких соединений на 2-х стадийных моделях опухолей

В 1991 г. К. Yasukawa и сотр. установили, что бетулиновая кислота, многие тритерпены и стерины ингибируют эффект активатора роста опухолей 12-О-тетрадеканоилфорбол-13-ацетата (TPА) [25].

Процесс химического канцерогенеза состоит из двух стадии, инициации и активации. Инициация вызывается инициатором, например 7,12-диметилбенз [а]антраценом (DMBA), который индуцирует необратимые повреждения ДНК. Большинство инициаторов - мутагены. Активация - это более медленный процесс, ассоциированный с обратимыми и необратимыми изменениями после инициации. Соединения, активизирующие рост опухолей в инициированных клетках называют активаторами роста опухолей (опухолевый промотор). Одно из таких соединений - TP А. Некоторые тритерпены и стерины показали себя как ингибиторы активации опухолевого роста: глицирретиновая кислот