Молекулярная модификация бетулиновой кислоты как антимеланомного средства и подходы к ее солюбилизации тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правахрукописи

СЫМОН АНДРЕЙ ВАЛЕНТИНОВИЧ

МОЛЕКУЛЯРНАЯ МОДИФИКАЦИЯ БЕТУЛИНОВО1 КИСЛОТЫ КАК АНТИМЕЛАНОМНОГО СРЕДСТВА И ПОДХОДЫ К ЕЕ СОЛЮБИЛИЗАЦИИ

02.00.10 - Биоорганическая химия

Автореферат Диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2004

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Московской Государственной Академии тонкой химической технологии имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Каплун Александр Петрович

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Звонкова Елена Николаевна кандидат химических наук,

старший научный сотрудник Водовозова Елена Львовна

Ведущая организация:

Тихоокеанский институт

биоорганической химии (ТИБОХ) РАН

Защита диссертации состоится 27 декабря 2004 года в 15 часов на заседании Диссертационного совета Д 212.120.01 при Московской Государственной Академии тонкой химической технологии имени М.В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, пр. Вернадского, 86

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова по адресу 119831, Москва, ул. М. Пироговская, д.1.

Автореферат разослан

2004 года.

Учёный секретарь Диссертационного Совета кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Рост заболеваемости меланомой в России с 1992 по 1999 гг. составил 30%, уступая лишь раку щитовидной и предстательной желез. Следует отметить, что среди всех злокачественных опухолей кожи меланома занимает особое место. Так, составляя структурно не более 10% от всех форм рака кожи, она ответственна за 80% смертей, приходящихся на группу злокачественных опухолей кожи. На ранней стадии заболевания эффективно хирургическое лечение, но прогноз при метастатической меланоме остается очень плохим. Средняя продолжительность жизни пациентов с метастазами составляет один год.

В настоящее время для лечения пациентов с метастатической меланомой широко применяются такие препараты, как дакарбазин, цисплатин, производные нитрозомочевины (кармустин, ломустин, семустин), интерферон-а, интерлейкин-2. При монохимиотерапии активность препаратов не превышает 20%. В случае комбинированной терапии эффективность лечения достигает 30-50%. Следует отметить, что главной причиной неэффективности лечения является высокая токсичность препаратов.

но

СНз

Бетулиновая кислота (ЗР-гидроксилуп-20(29)-еновая кислота, (БК*))

В середине 90 годов прошлого столетия было обнаружено, что БК способна селективно ингибировать рост клеток меланомы человека и ряда других опухолей

* Сокращения: БК - бетулиновая кислота; ДМФХ - димиристоилфосфатидилхолин; лизоФХ - лизофосфатидилхолин; ПАВ - поверхностно-активное вещество; СА -стеариламин; ТЭБА - триэтилбензиламмоний хлорид; Хол - холестерин; яФХ -яичный фосфатидилхолин; 1С50 - концентрация исследуемого препарата, вызывающая 50% гибель клеток в культуре; Ка-ОК - натровая соль олеиновой кислоты; ТМЭК -триметисиланазид. _______

.он

нейроэктодермального происхождения путем включения механизма апоптоза. В отличие от большинства современных препаратов применяемых для лечения метастатической меланомы, БК не токсична для организма (вплоть до 500 мг/кг). Одной из основных проблем при лечении злокачественных образований является развитие резистентности опухолей к применяемым препаратам. Поэтому уникальное свойство БК ингибировать рост опухолевых клеток, устойчивых к таким препаратам как доксорубицин, открывает новые перспективы для преодоления этой проблемы. Помимо противоопухолевых свойств, БК и ее производные обладают довольно широким спектром активностей: анти-ВИЧ, противовоспалительной, антималярийной, антиангиогенной и др.

БК можно рассматривать как новое родоначальное соединение (lead compound) с аптимеланомной активностью. Однако использовать ее в качестве препарата для лечения метастатической меланомы в настоящее время не представляется возможным. Одним из основных факторов, ограничивающим использование БК, является довольно большая терапевтическая доза (~ 250 мг/кг). Весь опыт химии лекарственных веществ говорит о том, что родоначальное соединение очень редко обладает оптимальными терапевтическими характеристиками. Поэтому актуальной задачей является проведение исследований по выявлению взаимосвязи структура-активность (SAR), и на основании полученных данных синтез новых более эффективных производных БК.

Плохая растворимость в воде (по нашим данным ~ 1 мкг/мл) также ограничивает использование БК в качестве антимеланомного препарата. Одним из подходов для преодоления этой проблемы может стать включение БК в состав наночастиц: липосом или нанокристаллов. Такие частицы по сравнению с водорастворимыми формами лекарств обладают рядом преимуществ. Во-первых, липосомы и нанокристаллы не токсичны для организма, они защищают включенные в их состав лабильные вещества от биодеградации. Из-за своих малых размеров они могут быть введены в организм внутривенно и не вызывать эмболию, а, благодаря эффекту пассивного нацеливания, они имеют тенденцию накапливаться в опухолях, и при определенных условиях поглощаться клетками, а это, в свою очередь, приводит к желательному повышению концентрации лекарственного вещества в солидных опухолях и очагах воспаления. Все вышесказанное делает очень привлекательным

использование наночастиц в качестве носителя для конструирования новых лекарственных форм БК.

Работа выполнена кафедре биотехнологии МГАТХТ в рамках госбюджетной темы НИР 1.5.00 «Синтез новых фармакологически активных веществ и изучение их биологических свойств и методов направленного транспорта с целью создания противоопухолевых, противовирусных, антипаркинсонических средств» и при поддержке грантов РФФИ (00-04-48363), РФФИ MAC (02-04-07604), МНТЦ (1781).

Цели работы.

1. Синтез новых аналогов БК.

2. Разработка методов солюбилизации БК и ее аналогов.

3. Исследования биологической активности БК и ее аналогов.

Научная новизна работы. Предложены и осуществлены новые модификации БК. Синтезирована эпи-бетулиновая кислота стереоселективным восстановлением 3-кетогруппы бетулоновой кислоты. Используя метод Макоши, получены новые циклопропановые производные бетулоновой и бетулиновой кислот. Осуществлена схема синтеза новых сульфамидных производных (28-тозиламинолупсола, 28-мезиламинолупеола). В условиях микроволнового облучения получено новое тетразольное производное (28-дезметил-28-(5-тетразолил)лупеол).

Обнаружено, что реакции замещения у атомов, соседствующих с четвертичными атомами углерода (СЗ и С28) в ряду лупанового ряда осложняются побочными процессами: при замещении гидроксила на бензоилоксигруппу и тозилокси- на формилоксигруппу при СЗ образуются продукты -элиминирования; реакции замещения гидроксильной группы при С28 в производных бетулина осложняются перегруппировкой, приводящей к расширению циклопентанового кольца с последующим элиминированием.

Изучена эффективность включения бетулиновой кислоты и ее производных в липосомы. БК из образцов с большим содержанием активного вещества включается в липосомы хуже. Для 95% БК максимум включения в липосомы составляет 16.5 мол.% при использовании композиции для 99% БК, а также ее

производных - менее 2 мол.%.

Изучено образование наносуспензий БК, стабилизированных

Выявлена цитотоксическая активность эпи-бетулиновой кислоты по отношению к линии клеток меланомы Вго, которые не чувствительна: к БК. Из циклопропановых производных БК наиболее активными по отношению к линиям клеток меланомы Вго и карциномы яичника СаОу являются 20,29-дищдро-20,29-дихлорметилен-и 20,29-дигидро-20,29-дибромметиленбетулиновые кислоты. К линии клеток меланомы Со1о38 проявила активность, сравнимую с БК, только 20,29-дигидро-20,29-дихлорметиленбетулиновая кислота

Показана перспективность молекулярных модификаций в области изопропенильной группы и при СЗ.

Практическая значимость работы. Эпи-бетулиновая кислота, а также дихлор- и дибромциклопропановые производные БК проявили цитотоксическую активность по отношению к линии клеток меланомы Вго, которые не чувствительны к БК. Таким образом, полученные соединения могут явиться основой для разработки новых препаратов лупанового ряда против меланомы Вго.

Изучено образование наносуспензий БК, стабилизированных яФХ. Достоинством данной лекарственной формы является то, что, во-первых, нанокристаллы БК имеют размеры меньше 500 им и, следовательно, могут быть введены в кровоток, не вызывая эмболию. Во-вторых, такая форма является эффективной с точки зрения соотношения лекарственное вещество/носитель. И, наконец, при образовании нанокристаллов «растворимость» БК в воде увеличилась в 1500 раз.

Положения выносимые на защиту.

1. Синтез новых аналогов БК: эпи-бетулиновой кислоты; циклопропановых производных бетулиновой и бетулоновой кислот; сульфамидных производных (28-тозиламинолупеола, 28-мсзиламинолупеола); тетразольного производного (28-дезметил-28-(5-тетразолил)лупеола).

2. Элиминирование и перегруппировки при СЗ и С28 в ряду лупановых производных.

3. Солюбилизация БК с помощью липосом и нанодисперсий.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и тезисы 7 докладов на научных конференциях, одна статья принята к печати.

Апробация работы. Результаты работы доложены на: The 25th International Symposium on Controlled Release of Bioactive Materials" (Las Vegas, USA, June 1998), Всероссийской выставке научно-технического творчества молодежи НТТМ-2002 (Москва 4-7 июля 2002), I Международном Конгрессе «Биотехнология-состояние и перспективы развития» (Москва. 14-18 октября 2002), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва. 20-22 Марта 2003). Международной научно-технической конференции «Перспективы развития химии и практического применения алициклических соединений» (Самара. 2004), X Международной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии-2004» (Волгоград. 710 сентября 2004).

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов и списка литературы. Работа изложена на страницах, содержит рисунков и таблиц. Список литературы включает источников.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На основании анализа данных о взаимосвязи «структура-активность» производных, а также родственных соединений БК были предложены структуры, которые по нашему мнению должны обладать большей активностью:

• Эпи-бетулиновая кислота.

• Производные БК с увеличенным объемом в области изопропенильной группы, без значительного уменьшения гидрофобности.

• Аналоги БК с биоизостерической заменой карбоксильной группы.

1. СИНТЕЗ НОВЫХ АНАЛОГОВ БЕТУЛИНОВОЙ КИСЛОТЫ

1.1 ЭПИМЕРИЗАЦИЯ ГИДРОКСИЛьНОЙ ГРУППЫ В ТРИТЕРПЕНАХ ЛУПАНОВОГО РЯДА

Ранее в нашей лаборатории было показано, что бетулоновая кислота (7)

обладает в 18 раз большей цитотоксичностью по отношению к клеткам меланомы MS,

чем бетулиновая кислота (10b).

Проведенный нами анализ литературных данных о взаимосвязи «структура-активность» ряда тритерпенов показал, что биологическая активность, как правило, увеличивается при переходе от ЗР-гидрокси- к 3-кетогруппе, а затем к За-гидроксигруппе.

Рис.1. Предполагаемое увеличение активности в ряду лупановых производных

Мы предположили, что и для антимеланомной активности в ряду бетулиновой кислоты эта закономерность также может соблюдаться, то есть эпи-бетулиновая кислота может проявлять большую активность. Для проверки данной гипотезы необходимо было разработать удобный метод получения эпи-бетулиновой кислоты (10а). К настоящему времени известна только одна работа, в которой авторы выделяли эпибетулиновую кислоту (10а) экстракцией из коры кустарника Picramnia pcntandra SW., произрастающего в США, при этом из 0.9 кг коры было выделено 0.8 г эпи-бетулиновой кислоты (10а).

Были исследованы два пути получения эпи-бетулиновой кислоты (10а): 1) эпимеризация соединений Зр-ряда; 2) стереоспецифическое восстановление бстулоновой кислоты (7). Для эпимеризации исследовали две реакции эффективные в случае холестан- -ола: замещение тозилокси- на формилоксигруппу и замещение НО-группы на бензоилоксигруппу по Мицунобу. В нашем случае оба метода привели почти целиком к продуктам А2,3-элиминирования (схема 1; табл. 1). Из З-О-тозиллупеола (3) образовался 3-дезокси-2,3-дегидролупеол (6); из бетулина (1)3-дезокси-2,3-дегидробетулин (4) и бензоат 3-дезокси-2,3-дегидробетулина (5). В 'Н-ЯМР-спектрах соединений наблюдались сигналы протонов дополнительной двойной связи в районе 8 5.39-5.28 м.д. и отсутствовал сигнал протона CHOR1. В спектре же соединения (5) сигналы метиленовых протонов СН2О сдвинулись в более слабое поле на 0.65 и 0.75 м.д. по сравнению с соответствующими сигналами в исходном бетулине (1), что говорит о замещении первичного гидроксила при С28 на бензоилоксигруппу.

ОН

Увеличение активности

(1) Ы'=Н, ЯЧ)Н (4) я3=он

(2)К1=Н,Я2=Н (5) Я3=ОВ7.

(3) Я^ТБ, Я2=Н (6) Я3=Н

Схема 1. Бимолекулярное замещение 3(5 гвдроксильной группы в тритерпенах лупанового ряда, приводящее к продуктам Л2,3-эдиминирования

Кольцо А у соединений лупанового ряда, в отличие от веществ холестанового ряда, содержит гем-диметильную группировку при С4. Стерические и электронные эффекты, обусловленные этой структурной особенностью, делают более вероятными реакции элиминирования и препятствуют реакции бимолекулярного замещения. В связи с этим, вероятно, любые варианты бимолекулярного замещения в положении 3 лупанового ряда малоперспективны.

Каталитическое гидрирование бетулоновой кислоты (7) над никелем Ренея приводило к восстановлению лишь двойной связи изопропенильной группы с образованием 20,29-дигидробетулоновой кислоты (8). В 'Н-ЯМР-спектре данного соединения наблюдаются два характерных дублета метальных протонов при СЗО (0.88 м.д.) и С29 (0.76 м.д). В тоже время сигнал от протона при СЗ не появился. При использовании более активного катализатора, 5% Ии/С образовывалась смесь а- И эпимеров 20,29-дигидробетулиновой кислоты (9а, 9Ь) в соотношении. 60:40 (по данным 'Н-ЯМР-спектра) (схема 2; табл. 1). О восстановлении кето-группы бетулоновой кислоты говорит появление в ИК-спектре характерного сигнала ОН-группы (3430 см"1). Кроме того, в 'Н-ЯМР-спектре вещества наблюдались сигналы протонов изопропилыюй группы, и протонов при СЗ, соответствующих а- и {5-эпимеру: 3.29 м.д., 3.15 м.д., а сигналы протонов двойной связи исчезали.

Получить эпибетулиновую кислоту (10а) нам удалось при использовании стерически затрудненного гидрида, три-<тор-бутилборгидрида лития (Ь-Селсктрида).

Восстановление бетулоновой кислоты (7) в этом случае приводит к смеси эпимеров (10а, 10Ь) в соотношении 62:38 (по данным 'Н-ЯМР-спектра) (схема 2; табл. 1).

(7) (8)^=0,^=11,01:

(9а) Я'=Н, а-ОН, 11г=Н, СН3 (9Ь) К'=Н, Р-ОН, Я^Н, СН3 (10а)К'=Н, а-ОНД2=СН2

(10Ь) я!=н, р-он,к2=сн2

Схема 2. Продукты реакций восстановления бетулоновой кислоты

Следует отметить, что хроматографическая подвижность эпибетулиновой (10а) и бетулоновой кислоты (7) близки, тогда как разница в подвижности эпимеров бетулиновой кислоты (10а, 10Ь) довольно значительная.

Таблица 1. Эпимеризация гидроксильной группы в тритерпенах лупанового ряда

Исходные вещества Условия реакции Продукты реакции Выход, %

(1) РЬ3Р, РЬС02Н, РДС02К=КС02Е1/ТГФ 20°С/10ч (4) (5) 44 16

(3) ДМФА 78°С/23 ч (6) 17

Н2/№(Ренея)/2-Пропанол 50°С/50атм (8) 95

(7) Н2/5% Яи/С/Метанол 80°С/80атм (9а) (9Ь) 45 29

Ь-Селектрид/ТГФ -80°С/5 ч (10а) (10Ь) 38 19

1.2 СИНТЕЗ ЦИКЛОПРОПАНОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ БЕТУЛИНОВОЙ И БЕТУЛОНОВОЙ КИСЛОТ

Проведенный нами анализ взаимосвязи «структура-активность» ряда

тритерпенов, обладающих противоопухолевым и противовоспалительным действием,

показал, что увеличение объема без значительного уменьшения гидрофобности в

области изопропенильной группы может привести к получению производных бетулиновой кислоты с большей противоопухолевой активностью.

Наиболее простым способом увеличения объема в области изопропенильной группы без значительного уменьшения гидрофобности является присоединение малополярных групп. Для этой цели нами было выбрано циклопропанирование.

Для исключения побочных реакций при присоединении карбенов, которые могут протекать по обоим гидроксилам бетулина (1), исходным соединением нами был выбран диацетат бетулина (11). Синтез проводили с помощью стандартных методик дихлор- и дибромциклопропанирования олефинов по методу Макоши, с использованием в качестве источника карбена трихлорацетата натрия или бромоформа, и катализатора межфазного переноса ТЭБА. Для получения дихлор- и дибромпроизводных бетулина (17) и (13) соответствующие циклопропановые производные диацетата бетулина (16) и (12) без очистки дезацетилировали щелочным гидролизом. В спектрах 'Н-ЯМР обоих циклопропановых производных бетулина (17) и (13) отсутствуют сигналы олефиновых протонов 5 4.67 м.д. и 5 4.57 м.д., присутствующие в исходном диацетате бетулина (11).

Соединение (20) было получено из производного бетулина (17) под действием лития в трет-бутиловом спирте. После перекристаллизации полученного соединения из изопропилового спирта в области сильного поля (б 0.24 м.д.) 'Н-ЯМР спектра появился мультиплет четырех протонов циклопропанового кольца.

Производные бетулина (13, 17, 20) были превращены в соответствующие циклопропановые производные бетулоновой кислоты (14, 18, 21) окислением СгО3 в уксусной кислоте. Для получения циклопропановых производных бетулиновой кислоты 3-кетогруппу восстанавливали МаБН4. Соединения (15, 19, 22) выделялись хроматографией на силикагеле, что позволило очистить целевые продукты от За-эпимеров, получающихся при восстановлении и имеющих большую хроматографическую подвижность, чем ЗР-эпимеры. Гомогенность синтезированных веществ по данным ВЭЖХ составила не менее 98%; их строение было подтверждено данными элементного анализа и масс-спектра.

Так, в масс-спектрах 20,29-дигидро-20,29-метиленбетулоновой кислоты (21)

и 20,29-дигидро-20,29-метиленбетулиновой кислоты (22) присутствуют сигналы

молекулярных ионов (469 [М]+ и 471 [М]+). В спектре 20,29-дигидро-20,29-

11

дихлорметиленбетулоновой кислоты (18) наблюдались сигналы нескольких молекулярных ионов, содержащие изотопы хлора в различном сочетании: 537.5 [М(35С1,35С1)]+, 539.5 [М(35С1,37С1)]+, 541.5 [М(37С1,37С1)]+. В спектре 20,29-дигидро-20,29-дихлорметиленбетулиновой кислоты (19) наблюдались молекулярные ионы, соответствующие продуктам дегидратации: 521.5 [М(35С1,35С1)-Н2О]+, 523.5 [М(35С1,37С1)-Н2О]+, 525.5 [М(37С1,37С1)-Н2О]+. В используемых условиях съемки масс-спектра для 20,29-дигидро-20,29-дибромметиленбетулоновой кислоты (14) был обнаружен слабый сигнал молекулярного иона 626.5 [М(79Вг,81Вг)]+, для 20,29-дигидро-20,29-диброммстиленбетулиновой кислоты (15) молекулярный ион не наблюдался.

13 МОДИФИКАЦИЯ БЕТУЛИНОВОЙ КИСЛОТЫ ПО С28 ПОЛОЖЕНИЮ

Ранее проведенные в нашей лаборатории исследования показали, что для проявления противоопухолевой активности необходимым условием является наличие карбоксильной группы в С28 положении БК (рис. 2.). У бетулина (1) примерно на том же расстоянии от скелета находится гидроксиметильная группа неспособная к ионизации при физиологических рН, и он практически не проявляет активности. В случае моносульфата бетулина (23) в С28 положении присутствует кислотная группа, однако активность соединения на порядок меньше, чем у БК (10Ь). Меньшая цитотоксичность по отношению к клеткам меланомы моносульфата бетулина по сравнению с БК (10Ь) может быть объяснена тем, что, во-первых, атом кислорода способный к ионизации находится на расстоянии в 2 раза большем от скелета, чем у БК (10Ь) и, кроме того, в моносульфате бетулина заряд в большей степени делокализован.

Рис. 2. Цитотоксическая активность бетулина, БК и моносульфата бетулина по отношению к клеткам меланомы линии М8

Перспективными, по нашему мнению, модификациями в этом положении может стать введение тетразольного кольца (24), а также синтез сульфамидных производных (25) (биоизостереомерные группы карбоксильной группе) (рис. 3.). У этих производных подвижный атом водорода (МН) находится примерно на том же расстоянии от скелета молекулы, что и атом кислорода в карбоксильной группе БК

Другой перспективной модификацией по С28 положению может стать синтез гомолога БК (26). Удаленность карбоксильной группы от скелета молекулы гомолога в 1.5 раза больше чем у БК (10Ь). Такая молекулярная модификация позволяет

уточнить расстояние, на котором должен находится отрицательный заряд от скелета молекулы для проявления максимальной активности.

Рис. 3. Гомолог и биоизостереомеры БК

1.3.1 Синтез сульфамидных производных Сульфамидные производные планировалось получать через 28-аминолупеол (29). Для его синтеза был предложен путь, изображенный на схеме 4.

Схема 4. Схема синтеза 28-аминолупеола

Исходный бетулин (1) региоселективно окисляли до бетулинальдегида (27) стерически затрудненным окислителем, оксоаммониевой солью ТЕМПО. В качестве первичного окислителя использовали перманганат калия с катализатором межфазного переноса дибензо-18-краун-6. На второй стадии из бетулинальдегида (27) получали нитрил бетулиновой кислоты (28) кипячением с гидрохлоридом гидроксиламина в этаноле в присутствии конц НС1. Строение нитрила (28) подтверждали данными Н-ЯМР- масс- и ИК-спектроскопии, а также данными элементного анализа. В Н-ЯМР-

спектре отсутствовал сигнал альдегидного протона 9.65 м.д, кроме того, сигнал протона при С19 смещался на 0.2 м д в более сильное поле по сравнению с исходным альдегидом (27). В масс-спектре наблюдался молекулярный ион 437 [М]+, а в ИК-спектре появлялась характерная полоса нитрильной группы (2225 см-1) и не наблюдалась полоса тоглощения карбонильной группы (1700 см-1).

Для получения 28-аминолупеола (29) из нитрила (28) нами было опробовано как каталитическое гидрирование, так и восстановление гидридами. Но ни один из способов, приведенных на схеме, не привел к восстановлению нитрильной группы до соответствующего амина. Подобный результат мы связываем со стерическими затруднениями, обусловленными наличием в а положении к нитрильному углероду (С28) четвертичного атома углерода

Другая схема синтеза сульфамидных производных (схема 5), основанная на восстановлении оксима оказалась эффективной

Схема 5. Синтез сульфамидных производных

Свободная гидроксильная группа бетулинальдегида (27) блокировалась бензоильным остатком. Из полученного 3-О-бензоилбетулинальдегида (30) синтезировали

15

соответствующий 3-О-бензоилбетулинальдегидоксим (31) кипячением с гидрохлоридом гидроксиламина в этаноле. А для восстановления оксима (31) до 28-амино-3-О-бензоиллупеола (32) использовали КаБИ3СК с 10% водным раствором ИС13. Полученный амин (32) был превращен в З-О-бензоил-28-мезиламинолупеол (33) и З-О-бензоил-28-тозиламинолупеол (35) ацилированием соответствующими хлорангидридами. Последующее деблокирование гидроксильных групп позволило получить искомые 28-мезиламинолупеол (34) и 28-тозиламинолупеол (36). Строение полученных производных было подтверждено данными Н-ЯМР спектроскопии, а также элементного анализа. Анализ "Н-ЯМР спектров показывает появление сигналов амидных протонов: с 8 4.39 м.д. для 28-тозиламинолупеола (36) и 8 4.11 м.д. для 28-мезиламинолупеола (34). Кроме того, о появлении сульфамидного заместителя в молекуле свидетельствует расщепление метиленовых протонов при С28 на амидном протоне: для 28-тозиламинолупеола (36) сигналы от этих протонов резонируют при 2.98 мд. и при 2.57 м.д., а для 28-мезиламинолупеола (34) сдвигаются в более слабое поле (3.28 м.д. и 2.78 м.д).

1.3.2 Синтез 28-дезметил-28-(5-тетразолил)лупеола Наиболее распространенный метод получения тетразолов заключается в присоединении азид ионов к нитрилам. Такие реакции, как правило, требуют довольно жестких условий (нагревание свыше 100°С в полярных апротонных растворителях в течение 24 ч). В нашем случае нагревание азида натрия (с добавлением хлорида аммония для увеличения растворимости азида) в ДМФА вплоть до 140°С в течение нескольких дней не привело к образованию каких-либо других продуктов. Механизм данной реакции заключается в нуклеофильной атаке азид ионом положительно заряженного углерода в нитрильной группе с последующим замыканием тетразольного кольца. Очевидно, что величина заряда на углероде в нитрильной группе имеет решающее влияние на скорость реакции. Часто в этой реакции в качестве катализаторов используются кислоты Льюиса или Брэнстеда. Координация кислот Льюиса или протона с нитрильным азотом увеличивает положительный заряд на углероде и облегчает нуклеофильную атаку азид ионом. Однако в этой реакции добавление кислот не привело к получению тетразола (24). Подобный результат, скорее всего, связан (также как и в случае восстановления нитрила (28) до амина (29)) со стерическими затруднениями в данной области молекулы.

16

Поскольку обычные методы построения тетразольного цикла оказались не эффективными, для получения тетразола (24) мы использовали новую методику для стерически затрудненных нитрилов - микроволновое облучение с использованием TMSN, Вu2SnО в диоксане (схема 6). В жестких условиях (нагрев до 165°С) через 8 ч по ТСХ наблюдалась незначительная конверсия исходного нитрила (28) с образованием более гидрофобного продукта, который после выделения был идентифицирован как тетразол (37). Деблокирование гидроксильной группы производного (37) кислотным метанолизом привело к получению 28-дезметил-28-(5-тетразолил)лупеола (24) с выходом 21.8%. Строение производного (24) подтверждали данными масс- и 'Н-ЯМР спектроскопии. В Н-ЯМР спектре наблюдали появление в слабом поле (13.20 м.д.) уширенного сигнала протона тетразольного кольца.

1.3.3 Синтез гомолога бетулиновой кислоты

Для синтеза гомолога БК (26) был наработан по схеме 7 З-О-ацетил-28-О-мезилбетулин (39), из которого реакцией с NaCN в ДМФА планировалось получить нитрил (40). Данные реакции, как правило, не требуют высоких температур и для них характерны высокие выходы. Однако, в обсуждаемом случае в плоть до 90°С новых продуктов не наблюдалось. При достижении 90°С на ТСХ было обнаружено новое более гидрофобное вещество, которое после хроматографического выделения было идентифицировано как продукт перегруппировки с расширением цикла (42). В Н-

* Синтез 28-дезметил-28-(5-тетразолил)лупеола (24) в условиях микроволнового облучения проводился сотр)дником фирмы Хембридж И.В. Близнецом.

17

ЯМР спектре соединения (42) исчезают сигналы метиленовых протонов при С28 и появляется новый сигнал протона при двойной связи 5 34 м д Также наблюдается влияние перегруппировки на сигналы других протонов Так, сигналы от протонов при двойной связи смещаются в более слабое поле на 0 05 мд В масс-спектре был обнаружен молекулярный ион 467 [М]+ соответствующий молекулярной массе вещества (42)

Схема 7 Схема синтеза гомолога БК через З-О-ацетил-28-О-мезилбетулин

Подобную перегруппировку мы также наблюдали при замещении первичного гидроксила при С28 моноацетатабстулина (38) на галоген (схема 8)

Схема 8 Перегруппировка при замещении первичного гидроксила в 3-0-ацетилбетулине на галоген 18

В случае замещения на хлор, судя по 'Н-ЯМР спектру, основного продукта (43) в реакционной смеси было 80%, а продукта перегруппировки (42) 20%. При замещении на бром картина менялась только количественно. Содержание основного продукта (44) в реакции было 25%, а продукта перегруппировки (42) 75%.

Известно, что реакции нуклеофильного замещения могут осложняться другими превращениями. Они происходят при появлении в качестве переходного состояния карбкатиона. В этом случае кроме реакций ¡^1 могут происходить элиминирование и перегруппировки. Причем, вероятность последних возрастает при наличии соседнего четвертичного атома углерода.

Схема 9. Возможные продукты перегруппировки при нуклеофильном замещении при

С28

2. ИССЛЕДОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ БЕТУЛИНОВОЙ КИСЛОТЫ И ЕЕ ПРОИЗВОДНЫХ*

К настоящему времени была изучена цитотоксическая активность эпимера бетулиновой кислоты (10а), а также циклопропановых производных бетулоновой (14, 18, 21) и бетулиновой (15, 19, 22) кислот. Биологические испытания проводились на культурах опухолевых клеток человека различного гистогенеза: меланома (линии MS, Вго, Со1о38) и карцинома яичника (CaOv). Цитотоксическую активность тестируемых соединений оценивали по показателю IC50 с помощью МТТ-теста.

Для сравнения цитотоксичности полученных соединений была исследована выживаемость опухолевых клеток в культуре при концентрации 10 мкМ. Как видно из рис. 4, наиболее активны дихлор- (19) и дибром- (15) циклопропановые производные

Биологические испытания проводились в РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН в лаборатории экспериментальной химиотерапии ст. н. сотр., к.м.н. Н.К. Власенковой и ст. н. сотр., О.С. Жуковой

бетулиновой кислоты. При этом выживаемость клеток линий Вго и СаОу составила около 50%, в то время как для клеток Со1о38 дибромпроизводное (15) было малоэффективно, а дихлорпроизводное (19) подавляло их рост на 50%. При концентрации эпибетулиновой кислоты (10а) 10 мкМ выживаемость клеток составляла 70-75%.

Таким образом, не смотря на то, что мы не выявили у синтезированных соединений ожидаемого увеличения цитотоксичности по сравнению с БК (10Ь), спектр биологической активности производных изменился. Так, обнаружена цитотоксическая активность веществ по отношению к линии клеток меланомы Вго, которые не чувствительны к БК (10Ь).

21 22 18 19 14 15 10а БК Вещества (10 мкМ)

Рис. 4. Выживаемость клеток опухолей человека при действии производных бетулиновой кислоты (10мкМ)

3. СОЛЮБИЛИЗАЦИЯ БЕТУЛИНОВОЙ КИСЛОТЫ И ЕЕ ПРОИЗВОДНЫХ

Существует большая вероятность, что найденная умеренная активность синтезированных соединений - следствие их плохой растворимости. Из-за этого при добавлении раствора тестируемого вещества в ДМСО к дисперсии клеток, происходит образование осадка, что существенным образом уменьшает вероятность проникновения и даже контакта вещества с клетками. Таким образом, в данном случае растворимость могла оказаться одним их ключевых свойств, ограничивающих биологическую активность исследуемых веществ. Традиционными способами определить растворимость БК и ее производных оказалось невозможным, так как предел обнаружения у веществ много выше, чем насыщающие концентрации.

Поэтому для оценки растворимости как самой БК, так и ее производных мы использовали метод, основанный на измерении оптической плотности растворов, приготовленных добавлением различных объемов исходного раствора вещества в ТГФ к определенному объему исследуемого растворителя. Наибольшая концентрация вещества в растворе, при которой еще не обнаруживалось светорассеивание, принималась за растворимость. Следует отметить, что ТГФ не мог влиять на растворимость БК и её производных в исследуемом растворителе, т.к. его концентрация в образцах не превышала 2%. Растворимость синтезированных соединений составила: в воде 0.5 -1 мкг/мл (причем практически не зависела от рН), а в ДМСО 10-15 мкг/мл.

3.1 Липосомные формы бетулиновой кислоты и ее производных

В качестве солюбилизующего агента для производных бетулиновой кислоты мы исследовали липосомы. Липосомные формы лекарств особенно удобны для противоопухолевых препаратов, из-за их способности накапливаться в опухолях благодаря эффекту пассивного нацеливания.

Изучалась эффективность включения бетулиновой кислоты и ее производных в липосомы различного состава (таблица 5). Моноламеллярные липосомы готовили гидратированием липидной пленки, полученной при упаривании липидов и БК из смеси ТГФ/спирт. Полученную дисперсию замораживали-оттаивали (6 раз) и далее фильтровали через ядерные ноликарбонатные фильтры с порами 400, 300 и 200 нм. Концентрацию БК определяли с помощью ВЭЖХ (210 нм). Основой композиции брали яФХ. Второй компонент выбирали из веществ, различающихся зарядом, количеством жирнокислотных цепей и насыщенностью. Было выяснено, что холестерин способствует включению бетулиновой кислоты в бислой; липиды с одной жирнокислотной цепью, наоборот, резко уменьшают растворимость в бислое исследуемых веществ; повышение насыщенности также препятствует инкорпорации бетулиновой кислоты в фосфолипидный бислой. В результате исследований была найдена композиция (яФХ/Хол, 90/10), в которой максимум включения бетулиновой кислоты в липосомы составил 16.5 мол. %. Таким образом, нам удалось увеличить растворимость примерно в 1000 раз.

Таблица 5. Зависимость максимальной степени включения БК (95%) от состава

липосом.

Состав липосом, моль/моль (размер) Максимальная мольная степень включения БК в Лс, % Исходная мольная доля БК, %

яФХ/Ыа-ОК, 90/10 (200 нм) 0 3.3

яФХ/СА, 90/10 (200 нм) 0.6 3.3

ДМФХ (200 им) 56 9.7

яФХ/лизоФХ,90/10 (200 нм) 11.4 15.7

яФХ (200 нм) 14.0 15.7

яФХ/Хол,95/5 (300 нм) 14.9 15.7

яФХ/Хол, 90/10 (300 нм) 16.5 21.4

яФХ/Хол, 80/20 (300 нм) 15.7 15.7

Известный факт: «чем чище вещество, тем хуже его растворимость» -проявился в нашем исследовании несколько неожиданным образом. БК с чистотой 99% включалась в липосомы значительно хуже БК 95% чистоты. Ни в одной из исследованных композиций БК (99%), а также ее производные не включались больше 2 % мол.

Таблица 6. Включение ЬК (99%) и ее производных в липосомы состава я ФХ/Хол

90/10 моль/моль.

Вещество Максимальная мольная степень включения БК в Лс, %

БК (99%) <2

20,29-Дигидро-20,29-дибромметиленбетулиновая кислота (15) <2

20,29-Дигидро-20,29-дихлорметиленбетулиновая кислота (19) 2

Эпи - бетулиновая кислота (10а) 0

3.2 Наносуспензии бетулиновой кислоты

Существуют лекарственные формы более эффективные, чем липосомы, с

точки зрения соотношения активное вещество/носитель - наносуспензии. Они

представляют собой нанокристаллы активного вещества, стабилизированные ПАВ.

Наносуспензии БК получали впрыскиванием к перемешиваемому раствору БК с яФХ

в ТГФ 25-50 кратного избытка воды, с последующим концентрированием на роторном

испарителе. Для оценки их размера использовали турбодиметрию. Оказалось, что

22

нм) достигается при соотношении яФХ/БК (1/1). На электронной микрофотографии данной суспензии обнаружены кристаллы вытянутой формы с длиной меньше 500 нм и с диаметром около 30 нм. Также на фотографии видно небольшое количество липосом.

Рис.5. Электронная микрофотография* нанокристаллов БК, стабилизированных яФХ. Соотношение яФХ/БК 1:1

Таким образом, нами получены наносуспензии БК стабилизированные яФХ, в которых концентрация БК 1.6 мг/мл, что в 1500 раз больше ее растворимости в воде. В настоящее время проводятся биологические испытания наносуспензии БК и ее аналогов

ВЫВОДЫ

1. Синтезированы новые вещества: эпи-бетулиновая кислота стереоселективным восстановлением З-кетаруппы бетулоновой кисло гы с помощью стерически затрудненного три-втор-бутилборгидрида лития (Ь-Селектрида); циклопропановые производные бетулиновой и бетулоновй кислот с использованием метода Макоши; два сульфамидных производных (28-тозиламинолупеол, 28-мезиламинолупеол); тетразольное производное (28-дезметил-28-(5-тетразолил) лупеол) в условия микроволнового облучения.

2. Обнаружено, что реакции замещения при СЗ и С28 в ряду бетулина осложняются побочными процессами: реакции, направленные на замещение гидрокси-, тозилокси- групп в 3 положении приводят к продуктам

реакции замещения гидроксильной группы при С28 сопровождаются перегруппировкой приводящей к расширению циклопентанового кольца с последующим элиминированием.

наименьший средний размер частиц (316

* Электронная микрофотография сделана в ИМБ им. В.А. Энгельгардта РАН вед. н. сотр., д.б.н. В.И. Попенко

3. Изучена эффективность включения бетулиновой кислоты и ее производных в липосомы. БК из образцов с большим содержанием активного вещества включается в липосомы хуже. Для 95% БК максимум включения в липосомы составляет 16.5 мол.% при использовании композиции (яФХ/Хол, 90/10); для 99% БК, а также ее производных - максимум менее 2 мол.%.

4. Получены наносуспензии БК стабилизированные яФХ с концентрацией БК 1.6 мг/мл, что в 1500 раз больше ее растворимости в воде.

5. Изучена цитотоксичность некоторых новых производных БК. Выявлена цитотоксическая активность эпи-бетулиновой кислоты по отношению к линии клеток меланомы Вго, которые не чувствительны к БК. Из циклопропановых производных БК, наиболее активными по отношению к линиям клеток меланомы Вго и карциномы яичника CaOv являются 20,29-дигидро-20,29-дихлорметилен и 20,29-дигидро-20,29-дибромметиленбетулиновые кислоты.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Le Bang Son, A.P.Kaplun, A.V. Symon, A.A Shpilevsky, V.B.Grigoriev, V.I.Shvets. Liposomal form of betulinic acid, a selective apoptosis inducing in melanoma cells substance. // J. Liposome Res.-1998.-V.8.,N.1.-P.78.

2. Le Bang Son, A.P. Kaplun, A.V. Symon, A.A. Shpilevsky, V.B. Grigoriev, V.I.Shvets. Solubilization of betulinic acid, a new antimelanoma compound. // The Proceeding of "The 25th International Symposium on Controlled Release of Bioactive Materials" (Las Vegas, USA, June 1998).-P.419-420.

3. A.B. Сымон. Лекарство для лечения рака кожи из коры березы. // Всероссийская выставка научно-технического творчества молодежи НТТМ-2002. Москва. 4-7 июля 2002.

4. А.В. Сымон, А.П. Каплун, И.В. Сенечкин, Н. К. Власенкова, Г. К. Герасимова, В.И. Швец. Молекулярная модификация бетулиновой кислоты для создания высокоэффективных противомеланомных препаратов. // I Международный Конгресс «Биотехнология - состояние и перспективы развития». Тезисы докладов. Москва. 14-18 октября 2002.-С.61-62.

5. Ле Банг Шон, Г.А. Посыпанова, Л.Г. Колибаба, А.В. Сымон, Ю.Э. Андия-Правдивый, АЛ. Каплун, Е.Л. Суркова, В.И. Швец. Исследование цитотоксической активности бетулиновой кислоты, ее производных и

липосомной формы in vitro. // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии.-2002.-№ 4.-С.31-34.

6. А. В. Сымон, А. П. Каплун, Н. К. Власенкова, Г. К. Герасимова, Ле Банг Шон, Е.

Ф. Литвин, Л. М. Козлова, Е. Л. Суркова, В. И. Швец. Эпимеризация гидроксильной группы в тритерпенах лупанового ряда. // Биоорган. химия.-2003.-Т.29., № 2.-С.202-207.

7. А.В. Сымон, Н.Н. Веселова, А.П. Каплун, Н. К. Власенкова, Г. К. Герасимова, В.И. Швец. Поиск активных соединений с антимеланомными свойствами в ряду синтетических производных бетулиновой кислоты. // Российский биотерапевтический журнал.-2003.-№1 .-С.43. Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты». Москва. 20-22 Марта 2003.

8. АП.Каплун, С.В.Подольская, В.В. Красильникова, АВ.Сымон, В.И.Швец. Солюбилизация с помощью липосом противоопухолевых препаратов на примере бетулиновой кислоты и гелиомицина. // Российский биотерапевтический журнал.-2003.-№1.-С.24. Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты». Москва. 20-22 Марта 2003.

9. И.В.Близнец, А.В. Сымон, А.П. Каплун, А.Е. Степанов, СМ. Лукьянов. Синтез тетразолных аналогов природных алициклических кислот в условиях микроволнового облучения. // Международная научно-техническая конференция «Перспективы развития химии и практического применения алициклических соединений». Тезисы докладов. Самара. 2004.-С.70.

10. Сымон А.В., Бояринова СВ., Красильникова В.В., Подольская СВ. Конструирование липосомных антимеланомных препаратов с производными бетулиновой кислоты. // X Международная научно-техническая конференция «Наукоемкие химические технологии-2004». Тезисы докладов. Волгоград. 7-10 сентября 2004.-Т.1.-С.326-329.

11. А. В. Сымон, Н. П. Веселова, А. П. Каплун, Н. К. Власенкова, Г. А. Федорова, А. И. Лютик, Г. К. Герасимова, В. И. Швец. Синтез циклопропановых производных бетулиновой и бетулоновой кислот и их противоопухолевая активность. // Биоорган. химия.-В печати.

Подписано в печать 2.1, И Формат 60*84/16. Бумага писчая.

Отпечатано на ризографе. Уч. изд. листов_. Тираж 100 экз. Заказ №

Лицензия на издательскую деятельность ИД № 03507 от 15.12.2000

Московская государственная академия тонкой химической технологии им М.В.Ломоносова.

Издательско-полиграфический центр. 119571 Москва, пр. Вернадского, 86.

1. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

2. ВВЕДЕНИЕ

3. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

3.1. Способы получения, биологическая активность и фармакокинентика бетулиновой кислоты

3.1.1. Способы получения бетулиновой кислоты

3.1.2. Биологическая активность бетулиновой кислоты и ее производных

3.1.2.1 Анти-ВИЧ активность

3.1.2.2 Противоопухолевая активность

3.1.2.3 Противовоспалительная активность

3.1.2.4 Другие активности

3.1.3. Фармакокинетика

3.1.3.1 Распределение

3.1.3.2 Метаболизм

3.2. Нанодисперсии с высоким соотношением «активное вещество/носитель»

3.2.1. Наноч астицы из твердых липидов

3.2.1.1 Твердые липидные наночастицы (ТЛН, SLN)

3.2.1.2 Наноструктурированные липидные носители (НЛН)

3.2.1.3 Коньюгат липид-лекарство (КЛЛ)

3.2.1.4 Приготовление твердых липидных наночастиц

3.2.1.4.1 Гомогенизация высокого давления

3.2.1.4.2 Приготовление ТЛН через микроэмульсии

3.2.1.5 Стабильность ТЛН дисперсий

3.2.1.6 Модели высвобождения лекарств из ТЛН

3.2.2. Наносуспензии

3.2.3. Другие структуры

4. РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Синтез новых аналогов бетулиновой кислоты

4.1.1. Эпимеризация гидроксильной группы в тритерпенах лупанового ряда

4.1.2. Синтез циклопропановых производных бетулиновой и бетулоновой кислот

4.1.3. Модификация бетулиновой кислоты по с28 положению

4.1.3.1 Синтез сульфамидных производных

4.1.3.2 Синтез 28-дезметил-28-(5-тетразолил)лупеола

4.1.3.3 Синтез гомолога бетулиновой кислоты 54 4.2. Исследование биологической активности бетулиновой кислоты и ее производных

4.2.1. солюбилизация бетулиновой кислоты и ее производных

4.2.1.1 Липосомные формы бетулиновой кислоты и ее производных

4.2.1.2 Наносуспензии бетулиновой кислоты

5. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

6. ВЫВОДЫ

7. БЛАГОДАРНОСТИ

Рост заболеваемости меланомой в России с 1992 по 1999 гг. составил 30%, уступая лишь раку щитовидной и предстательной желез. Следует отметить, что среди всех злокачественных опухолей кожи меланома занимает особое место. Так, составляя структурно не более 10% от всех форм рака кожи, она ответственна за 80% смертей, приходящихся на группу злокачественных опухолей кожи. На ранней стадии заболевания эффективно хирургическое лечение, но прогноз при метастатической меланоме остается очень плохим. Средняя продолжительность жизни пациентов с метастазами составляет один год [1].БК можно рассматривать как новое родоначальное соединение (lead compound) с антимеланомной активностью. Однако использовать ее в качестве препарата для лечения метастатической меланомы в настоящее время не представляется возможным. Одним из основных факторов, ограничивающим использование БК, является довольно большая терапевтическая доза ( 250 мг/кг) [3]. Весь опыт химии лекарственных веществ говорит о том, что родоначальное соединение очень редко обладает оптимальными терапевтическими характеристиками. Поэтому актуальной задачей является проведение исследований для выявления взаимосвязи структура-активность (SAR), и на основании полученных данных синтез новых более эффективных производных БК. Плохая растворимость в воде (по нашим данным 1 мкг/мл) также ограничивает использование БК в качестве антимеланомного препарата. Одним из подходов для преодоления этой проблемы может стать включение БК в состав наночастиц: липосом, нанокристаллов и др. Нанодисперсии по сравнению с водорастворимыми формами лекарств обладают рядом преимуществ. Во-первых, уменьшается токсичность и биодеградация веществ, инкапсулированных в состав наночастиц. Из-за своих малых размеров они могут вводиться в организм внутривенно и не вызывать эмболию, а благодаря эффекту пассивного нацеливания [5], наночастицы имеют тенденцию накапливаться в опухолях, а это, в свою очередь, приводит к желательному повышению концентрации лекарственного вещества в солидных опухолях и очагах воспаления. Все вышесказанное делает очень привлекательным использование наночастиц в качестве носителя для конструирования новых лекарственных форм БК. Настоящая работа посвящена синтезу новых аналогов БК, разработке методов солюбилизации БК и ее аналогов, а также исследованию их биологической активности.

6. выводы

1. Синтезированы новые вещества: эпи-бетулиновая кислота стереоселективным восстановлением З-кетогруппы бетулоновой кислоты с помощью стерически затрудненного три-<?/иор-бутилборгидрида лития (L-Селектрида); циклопропановые производные бетулиновой и бетулоновй кислот с использованием метода Макоши; два сульфамидных производных (28-тозиламинолупеол, 28-мезиламинолупеол); тетразольное производное (28-дезметил-28-(5-тетразолил) лупеол) в условия микроволнового облучения.

2. Обнаружено, что реакции замещения при СЗ и С28 в ряду бетулина осложняются побочными процессами: реакции, направленные на замещение гидрокси-, тозилокси-групп в 3 положении приводят к продуктам Д2'3-элиминирования; реакции замещения гидроксильной группы при С28 сопровождаются перегруппировкой приводящей к расширению циклопентанового кольца с последующим элиминированием.

3. Изучена эффективность включения бетулиновой кислоты и ее производных в липосомы. БК из образцов с большим содержанием активного вещества включается в липосомы хуже. Для 95% БК максимум включения в липосомы составляет 16.5 мол.% при использовании композиции (яФХ/Хол, 90/10); для 99% БК, а также ее производных - максимум менее 2 мол.%.

4. Получены наносуспензии БК стабилизированные яФХ с концентрацией БК 1.6 мг/мл, что в 1500 раз больше ее растворимости в воде.

5. Изучена цитотоксичность некоторых новых производных БК. Выявлена цитотоксическая активность эпи-бетулиновой кислоты по отношению к линии клеток меланомы Вго, которые не чувствительны к БК. Из циклопропановых производных БК, наиболее активными по отношению к линиям клеток меланомы Вго и карциномы яичника CaOv являются 20,29-дигидро-20,29-дихлорметилен и 20,29-дигидро-20,29-дибромметиленбетулиновые кислоты.

7. БЛАГОДАРНОСТИ

Существенную помощь в работе оказали:

• сотрудники фирмы Хембридж Близнец И.В. и Лапин А.;

• студенты и сотрудники кафедры биотехнологии Бастрич А.Н, Веселова Н., Илларионов В.В., Красильникова В.В., Подольская С.В., к.х.н. Чудинов М.В.; к.х.н. Ле Банг Шон;

• старшие научные сотрудники РОНЦ им. Н.Н. Блохина к.м.н. Н.К. Власенкова и к.м.н. О.С. Жукова;

• ведущий научный сотрудник ИМБ им. В.А. Энгельгардта РАН д.б.н. В.И. Попенко;

• фирмы Биолек и Хембридж.

1.B., Харкевич Г.Ю., Меланома кожи: стадирование, диагностика и лечение //. Русский медицинский журнал. 2003 .Т. 11. № 11.

2. Bajetta Е., Vecchio М. Терапия метастатической меланомы // Современная онкология. 2003. Т. 5. № 1.

3. Huang S.K., Mayhew E., Gilani S., Lasic D.D., Martin F.J., Papahadjopoulos D. Pharmacokinetics and therapeutics of sterically stabilized liposomes in mice bearing C-26 colon carcinoma // Cancer Res. 1992. V. 52. N. 24. P. 6774-6781.

4. Hayek E.W.H., Jordis U., Moche W., Sauter F. A bicentennial of betulin. // Phytochemistry. 1989. V. 28. P. 2229-2242.

5. Jle Банг Шон, Каплун А.П., Шпилевский А.А., Андия-Правдивый Ю.Э., Алексеева С.Г., Григорьев В.Б., Швец В.И. Синтез бетулиновой кислоты из бетулина и исследование ее солюбилизации с помощью липосом. // Биоорганическая химия. 1998. Т. 24. С. 787-793.

6. Ruzicka L., Rey Е. Oxidation of the alcohol groups of betulin // Helv. Chim. Acta 1941. V. 24. P. 529-536.

7. Kim D.S.H.L., Chen Z., Nguyen V.T., Pezzuto J.M., Qui S., Lu Z-Z. A concise semi-synthetic approach to betulinic acid from betulin. // Synth. Commun. 1997. V. 27. P. 1607-1612.

8. Evers M., Poujade C., Soler F., Ribeill Y., James C., Lelievre Y., Gueguen J-C., Reisdorf D., Morize I., Pauwels R., De Clercq E., Henin Y., Bousseau A., Mayaux J-F., Le Pecq J-B., Dereu N.87

9. Betulinic acid derivatives: A new class of human immunodeficiency virus type 1 specific inhibitors with a new mode of action. // J. Med. Chem. 1996. V. 39. P. 1056-1068.

10. Labrosse В., Pleskoff O., Sol N., Jones C., Henin Y., Alizon M. Resistance to a drug blocking human immunodeficiency virus type 1 entry (RPR103611) is conferred by mutations in gp41. // J. Virol. 1997. V. 71 P. 8230-8236.

11. Holz-Smith S.L., Sun I.C., Jin L., Matthews T.J., Lee K.H., Chen C.H. Role of human immunodeficiency virus (HIV) type 1 envelope in the anti-HIV activity of betulinic acid derivative IC9564. // Antimicrob. Agents Chemother. 2001. V. 45. P. 60-66.

12. Sun I.C., Chen C.H., Kashiwada Y., Wu J.H., Wang H.K., Lee K.H. Anti-AIDS agents. 49. Synthesis, anti-HIV, and anti-fusion activities of IC9564 analogs based on betulinic acid. // J. Med. Chem. 2002. V. 45. P. 4271^275.

13. Kashiwada Y., Hashimoto F., Cosentino L.M., Chen C.H., Garrett P.E., Lee K.H. Betulinic acid and dihydrobetulinic acid derivatives as potent anti-HIV agents. // J. Med. Chem. 1996. V. 39. P. 1016-1017.

14. Sun I.C., Wang H.K., Kashiwada Y., Shen J.K., Cosentino L.M., Chen C.H., Yang L.M., Lee K.H. Anti-AIDS agents. 34. Synthesis and structure-activity relationships of betulin derivatives as anti-HIV agents. // J. Med. Chem. 1998. V. 41. P. 4648^657.

15. Kashiwada Y., Chiyo J., Ikeshiro Y., Nagao Т., Okabe H., Cosentino L.M., Fowke K., Lee K.H. 3,28-Di-0-(dimethylsuccinyl)-betuIin isomers as Anti-HIV agents // Bioorg. Med. Chem. Lett.2001. P. 1-3.

16. Hashimoto F., Kashiwada Y., Cosentino L.M., Chen C-H., Garrett P.E., Lee K.H. Anti-AIDS agents. XXVII. Synthesis and anti-HIV activity of betulinic acid derivatives. // Bioorg. Med. Chem. 1997. V. 5. P. 2133-2143.

17. Fulda S., Jeremias I., Steiner H.H., Pietsch Т., Debatin K.M. Betulinic acid: A new cytotoxic agent against malignant brain-tumor cells. // Int. J. Cancer. 1999. V. 82. P. 435-441.

18. Schmidt M.L., Kuzmanoff K.L., Ling-Indeck L., Pezzuto J.M. Betulinic acid induces apoptosis in human neuroblastoma cell lines. // Eur. J. Cancer. 1997. V. 33. P. 2007-2010.

19. Zuco V., Supino R., Righetti S.C., Cleris K., Marchesi E., Gambacorti-Passerini C., Formelli F. Selective cytotoxicity of betulinic acid on tumor cell lines, but not normal cells. // Cancer Lett.2002. V. 175 P. 17-25.

20. Selzer E., Pimentel E., Wacheck V., Schlegel W., Pehamberger H., Jansen В., Kodym R. Effects of betulinic acid alone and in combination with irradiation in human melanoma cells. // J. Invest. Dermatol. 2000. V. 114. P. 935-940.

21. Fulda S., Scaffidi C., Susin S.A., Krammer P.H., Kroemer G„ Peter M.E., Debatin K-M. Activation of mitochondria and release of mitochondrial apoptogenic factors by betulinic acid. // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 33942-33948.

22. Fulda S., Debatin K.M. Betulinic acid induces apoptosis through a direct effect on mitochondria in neuroectodermal tumors. // Med. Pediatr. Oncol. 2000. V. 35. P. 616-618.

23. NodaY., Kaiya Т., Kohda K., Kawazoe Y. Enhanced cytotoxicity of some triterpenes toward leukemia L1210 cells cultured in lowpHmedia: Possibly a newmode of cell killing. // Chem. Pharm. Bull. 1997. V. 45. P. 1665-1670.

24. Wachsbeberger P.R., Burd R., Wahl M.L., Leeper D.B. Betulinic acid sensitization of low pH adapted human melanoma cells to hyperthermia. // Int. J. Hyperthermia. 2002 V. 18. P. 153-164.

25. Melzig M.F., Bormann H. Betulinic acid inhibits aminopeptidase N activity. // Planta Med. 1998. V. 64. P. 655-657.

26. К won H.J., Shim J.S., Kim J.H., Cho H.Y., Yum Y.N., Kim S.H., Yu J. Betulinic acid inhibits growth factor-induced in vitro angiogenesis via the modulation of mitochondrial function in endothelial cells. // Jpn. J. Cancer Res. 2002. V. 93. P. 417^25.

27. Syrovets Т., Buchele В., Gedig E., Slupsky J.R., Simmet T. Acetyl-boswellic acids are novel catalytic inhibitors of human topoisomerase I and Ila. // Mol. Pharm. 2000. V. 58. P. 71-81.

28. Kim D.S.H.L., Pezzuto J.M., Pisha E. Synthesis of betulinic acid derivatives with activity against human melanoma. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1998. V. 8. P. 1707-1712.

29. Jle Банг Шон, Посыпанова Г.А., Колибаба Л.Г., Сымон А.В., Андия-Правдивый Ю.Э., Каплун А.П., Суркова Е.Л., Швец В.И. // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2002. № 4. С. 31-34.

30. Kinoshita К., Yang Y., Koyama К., Takahashi К., Nishino Н. Inhibitory effect of some triterpenes from cacti on 32P-incorporation into phospholipids of HeLa cells promoted by 12-0-tetradecanoylphorbol-13-acetate. //Phytomedicine. 1999. V. 6. P. 73-77.

31. Hata K., Hori K., Takahashi S. Differentiation- and apoptosis-inducing activities by pentacyclic triterpenes on a mouse melanoma cell line. // J. Nat. Prod. 2002. V. 65 P. 645-648.

32. Lee J.S., Min B.S., Bae K.H. Cytotoxic constituents from the Forsythiae fructus against LI210 and HL60 cells. // Yakhak Hoeji. 1996. V. 40. P. 462-467.38 Неопубликованные данные.

33. Kim J.Y., Koo H.M., Kim D.S.H.L. Development of C-20 modified betulinic acid derivatives as antitumor agents. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2001. V. 11. P. 2405-2408.

34. Jeong H.J., Chai H.B., Park S.Y., Kim D.S.H.L. Preparation of amino acid conjugates of betulinic acid with activity against human melanoma. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1999. V. 9. P. 1201-1204.

35. Chatteijee P., Pezzuto J.M., Kouzi S.A. Glucosidation of betulinic acid by Cunninghamella species. // J. Nat. Prod. 1999. V. 62. P. 761-763.

36. You Y.-J., Kim Y., Nam N.-H., Ahn B.-Z. Synthesis and cytotoxic activity of A-ring modified betulinic acid derivatives // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2003. V. 13. P. 3137-3140.

37. Kouzi S.A., Chatteijee P., Pezzuto J.M., Hamann M.T. Microbial transformations of the antimelanoma agent betulinic acid. // J. Nat. Prod. 2000. V. 63. P. 1653-1657.

38. Safayhi H., Sailer E-R. Anti-inflammatory actions of pentacyclic triterpenes. // Planta Med. 1997. V. 63. P. 487-493.

39. Recio M.C., Giner R.M., Manez S., Gueho J., Julien H.R., Hostettmann K., Rios J.L. Investigations on the steroidal anti-inflammatory activity of triterpenoids from Diospyros leucomelas. // Planta Med. 1995. V. 61. P. 9-12.

40. Mukheijee P.K., Saha K., Das J., Pal M., Saha B.P. Studies on the anti-inflammatory activity of rhizomes of Nelumbo nucifera. // Planta Med. 1997. V. 63. P. 367-369.

41. Huang C., Tunon H., Bohlin L. Anti-inflammatory compounds isolated from Menyanthes trifoliata L. // Acta Pharm. Sinica 1995. V. 30. P. 621-626.

42. Dunstan C.A., Liu В., Welch C.J., Perera P., Bohlin L. Alphitol, a phenolic substance from Alphitonia zizyphoides which inhibits prostaglandin biosynthesis in vitro. // Phytochemistry 1998. V. 48. P. 495-497.

43. Mukheijee P.K., Saha K., Das J., Pal M., Saha B.P. Studies on the anti-inflammatory activity of rhizomes of Nelumbo nucifera. // Planta Med. 1997 V. 63. P. 367-369.

44. Manez S., Recio M.C., Giner R.M., Rios J-L. Effect of selected triterpenoids on chronic dermal inflammation. // Eur. J. Pharmacol. 1997. V.334. P. 103-105.

45. Huguet A.-L, Recio M.C., Manez S., Giner R.M., Rios J.-L. Effect of triterpenoids on the inflammation induced by protein kinaseCactivators, neuronally acting irritants and other agents. // Eur. J. Pharmacol. 2000. V.410. P. 69-81.

46. Wachter G.A., Valcic S., Flagg M.L., Franzblau S.G., Montenegro G., Suarez E., Timmermann B.N. Antitubercular activity of pentacyclic triterpenoids from plants of Argentina and Chile. // Phytomedicine. 1999. V. 6. P. 341-345.

47. Jeong T.-S., Hwang E.-I., Lee H.-B., Lee E.-S., KimY.-K., Min B.-S., Bae K.-H., Bok S.-H., Kim S.-U. Chitin synthase II inhibitory activity of ursolic acid, isolated from Crataegus pinnatifida. // Planta Med. 1999. V. 65. P. 261-263.

48. Nick A., Wright A.D., Rali Т., Sticher O. Antibacterial triterpenoids from Dillenia papuana and their structure-activity relationships. //Phytochemistry. 1995. V. 40. P. 1691-1695.

49. Schuhly W., Heilmann J., Calis I., Sticher O. New triterpenoids with antibacterial activity from Zizyphus joazeiro. // Planta Med. 1999. V. 65. P. 740-743.

50. Higa M., Ogihara K., Yogi S. Bioactive naphthoquinone derivatives from Diospyros maritime Blume. // Chem. Pharm. Bull. 1998. V. 46. P. 1189-1193.

51. Steele J.C.P., Warhurst D.C., Kirby G.C., Simmonds M.S.J. In vitro and in vivo evaluation of betulinic acid as an antimalarial. // Phytother. Res. 1999. V. 13. P. 115-119.

52. Udeani G.O., Zhao G.-M., Shin Y.G., Cooke B.P., Graham J., Beecher C.W.W., Kinghorn A.D., Pezzuto J.M. Pharmacokinetics and tissue distribution of betulinic acid in CD-I mice. // Biopharm. Drug Dispos. 1999. V. 20. P. 379-383.

53. Clark A.M., Hufford C.D. Use of microorganisms for the study of drug metabolism: An update. // Med. Res. Rev. 1991. V. 11. P. 437-501.

54. Chatterjee P., Kouzi S.A., Pezzuto J.M., Hamann M.T. Biotransformation of the antimelanoma agent betulinic acid by Bacillus megaterium ATCC 13368. // Appl. Environ. Microbiol. 2000. V. 66. P. 3850-3855.

55. Wertlind A. Development of fat emulsions. // J. Parenter. Enter. Nutr. 1981. V. 5. P. 230-235.

56. Каплун А.П., Jle Банг Шон, Краснопольский Ю.М., Швец В.И. Липосомы и другие наночастицы как средство доставки лекарственных веществ. // Вопросы Мед. Химии 1999. Т. 45. № i.e. 3-12.

57. Smith A., Hunneyball I.M. Evaluation of polilactid as a biodegradable drug delivery system for parenteral administration. // Int. J. Pharm. 1986. V. 30. P. 215-230.

58. Muller R.H., Mader K. Gohla S. Solid lipid nanoparticles (SLN) for controlled drug delivery—a review of the state of the art. // Eur. J. Pharm. Biopharm. 2000. V. 50. P. 161-177.

59. Mehnert W., Mader K. Solid lipid nanoparticles: production, characterization and applications. // Adv. Drug Deliv. Rev. 2001. V. 47. P. 165-196.

60. Kayser O., Kiderlen A.F. Delivery strategies for antiparasitics. // Expert Opin. Investig. Drugs 2003. V. 12. №2. P. 1-11.

61. Muller R.H., Radtke M., Wissing S.A. Solid lipid nanoparticles (SLN) and nanostructured lipid carriers (NLC) in cosmetic and dermatological preparations. // Adv. Drug Deliv. Rev. 2002 V. 1. P. 131-155.

62. Wissing S.A., Kayser O., Muller R.H. Solid lipid nanoparticles for parenteral drug delivery. // Adv. Drug Deliv. Rev. 2004 V. 56. P. 1257-1272.

63. Muller R.H., Radtke M., Wissing S.A. Nanostructured lipid matrices for improved microcapsulation of drugs. // Int. J. Pharm. 2002. V. 242. P. 121-128.

64. Radtke M., Muller R.H. NLC nanostructured lipid carriers: the new generation of lipid drug carriers. // New Drugs. 2001. V. 2. P. 48-52.

65. Jenning V., Thunemann A.F., Gohla S.H. Characterisation of a novel solid lipid nanoparticle carrier system based on binary mixtures of liquid and solid lipids // Int. J. Pharm. 2000. V. 199. P. 167-177.

66. Jenning V., Mader K., Gohla S.H. Solid lipid nanoparticles based on binary mixtures of liquid and solid lipids: a 1H-NMR study. // Int. J. Pharm. 2000. V. 205. P. 15-21.

67. Olbrich C., Gebner A., Kayser O., Muller R.H. // Lipid-drug conjugate nanoparticles as novel carrier system for the hydrophilic antitrypanosomal drug diminazenediaceturate. // J. Drug Target. 2002. V. 10. № 5. P. 387-396.

68. Muller R.H., Lucks J.S. Arzneistofftrager aus festen Lipid- teilchen, Feste Lipidnanospharen (SLN), European Patent No. 0605497 (1996).

69. Gasco M.R. Method for producing solid lipid microspheres having a narrow size distrivution, US Patent 5 250 236 (1993).

70. Westesen К. Bunjes H., Koch M.H.J. Physicochemical characterization of lipid nanoparticles and evaluation of their drug loading capacity and sustained release potential // J. Control. Release 1997. V. 48. P. 223-236.

71. Freitas C. Muller R.H. Effect of light and temperature on zeta potential and physical stability in solid lipid nanoparticle (SLN) dispertions. // Int. J. Pharm. 1998. V.168. P. 221-229.

72. Heiati H., Tawashi R., Phillips N.C. Drug retention and stability of solid lipid nanoparticles containing azidothymidine palmitate after autoclaving, storage and lyophilization. // J. Microencapsul. 1998. V. 15. №2. P. 173-184.

73. Shahgaldian P., Gualbert J., Aissa K., Coleman A.W. A study of the freeze-drying conditions of calixarene based solid lipid nanoparticles. // Eur. J. Pharm. Biopharm. 2003. V. xx. P. 1—4.

74. Radomska A., Dobrucki R., Muller R. H. Chemical stability of lipid matrices of solid lipid nanoparticles (SLN) development of analytical method and determination of long-term stability. // Pharmazie 1999. V. 54. P. 903-909.

75. Larabia M., Gulikb A., Dedieub J.P., Legranda P., Barratta G., Cheronc M. New lipid formulation of amphotericin B: spectral and microscopic analysis. // Biochim. Biophys. Acta 2004. V. 1664. P. 172-181.

76. Kulkarni V.S., Boggs J.M., Brown R.E. Modulation of Nanotube Formation by Structural Modifications of Sphingolipids. // Biophysical Journal 1999. V. 77. P. 319-330.

77. Jaaskelainen P. Betulinol and its utilization. // Paperi ja Puu. 1981. V.63. № 10. P. 599-603.

78. Pradhan B.P., Hassan A., Ray T. Reduction of ketones to epimeric alcohols with potassium hydroxide-diethylene glycol. // Tetrahedron. 1985. V.41. № 12. P. 2513-2516.

79. Pakrashi S.C., Bhattacharyya J., Mookeijee. S., Samanta T.B. Indian medicinal plants. XVIII. The nonalkaloidal constituents from the seeds of Alangium lamarckii // Phytochemystry 1968. V. 7. N. 3. P. 461-466.

80. Krajniak E., Ritchie E., Taylor W.C. Some contituents of Akania lucens // Aust. J. Chem. 1969. V. 22. N. 6. P. 1331-1332.

81. Wahhab A., Ottosen M., Bachelor F.W. The synthesis of nor- and bisnorlupanes. // Can. J. Chem. 1991. V.69. P.570-577.

82. Herz W., Santhanam P.S., Wahlberg I. 3-i^D/-betulinic acid, a new triterpenoid from picramnia pentandra. // Phytochemistry. 1972. V. 11. P. 3061-3063.

83. Otsuka H., Fujioka S., Kimiya Т., Goto M., Hiramatsu Y., Fujimura H. Studies on antiinflammatory agents. B, A new anti-inflammatory constituent of Pyracantha crenulata // Chem. Pharm. Bull. 1981. V. 29. N. 11. P. 3099-3104.

84. Kim D.S.H.L., Chen Z.D., Nguyen V.T., Pezzuto J.M., Qiu S.X., Lu Z.Z. A Concise Semisynthetic Approach to Betulinic Acid from Betulin // Synthetic Communications 1997. V. 27. N. 9. P. 1607-1612.

85. Sun I.C., Wang H.K., Kashiwada Y., Shen J.K., Cosentino L.M., Chen C.H., Yang L.M., Lee K.H. Anti-AIDS agents. 34. Synthesis and structure-activity relationships of betulin derivatives as anti-HIV agents. // J. Med. Chem. 1998. V. 41. P. 4648-4657.