Синтез ацильных производных 20-гидроксиэкдизона и липосомы на их основе тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

ВВЕДЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Структура и биологическая активность экдистероидов.

1.1.1. Общие представления об экдистероидах.

1.1.2. Биологическая активность экдистероидов.

1.2. Методы химической модификации экдистероидов.

1.2.1. Синтез ацетатов.

1.2.2. Синтез производных экдистероидов и высших жирных кислот.

1.2.3. Синтез производных экдистероидов и неорганических кислот.

1.2.4. Синтез гликозидов.

1.3. Методы анализа и идентификации экдистероидов и их производных.

1.3.1. Хроматографические методы анализа экдистероидов и их производных.

1.3.2. УФ-, ИК-спектроскопия экдистероидов и их производных.

1.3.3. ЯМР-спектроскопия экдистероидов и их производных.

1.3.4. Масс-спектрометрия экдистероидов и их производных.

1.4. Липосомы.

1.4.1. Методы получения липосом.

1.4.2. Определение размеров везикул.

1.4.3. Стабильность липосомальных дисперсий.

1.4.4. Определение эффективности включения веществ в липосомы.

1.5. Липосомальные формы лекарственных препаратов.

1.5.1. Транспорт лекарств с помощью липосом.

1.5.2. Экдистероидсодержащие липосомальные препараты.

2. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

2.1. Получение ацильных производных 20-гидроксиэкдизона.

2.1.1. Синтез производных 20-гидроксиэкдизона.

2.1.2. Идентификация продуктов и промежуточных соединений синтеза ацильных производных 20-гидроксиэкдизона.

2.2. Получение и характеристика липосомальных форм ацильных производных 20-гидроксиэкдизона.

2.2.1. Определение размеров липосом.

2.2.2. Сравнительное исследование включения ацильных производных 20-гидроксиэкдизона в липосомы.

2.2.3. Определение оптимального соотношения липид/субстрат.

2.3. Гидролиз ацильных производных 20-гидроксиэкдизона под действием ферментов.

2.3.1. Гидролиз 2,3,22,25-тетраацетата 20-гидроксиэкдизона.

2.3.2. Гидролиз 2,3,22-трипальмитата 20-гидроксиэкдизона.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.1. Реактивы и оборудование.

3.2. Методы анализа и идентификации ацильных производных 20-гидроксиэкдизона.

3.3. Химические синтезы.

3.4. Получение липосомальных дисперсий.

3.4.1. Очистка фосфатидилхолина.

3.4.2. Методика получения липосом.

3.4.3. Методика получения мицелл.

3.5. Подготовка препаратов для микроскопии.

3.6. Сравнительное исследование включения методом гель-хроматографии.

3.6.1. Подготовка колонки.

3.6.2. Методика гель-хроматографии и определения включения.

3.7. Определение эффективности включения субстрата в липосомах в зависимости от его исходной концентрации.

3.7.1. Количественное определение липида.

3.7.2. Методика определения оптимального соотношения липид/ субстрат.

3.8. Определение устойчивости ацильных производных 20-гидроксиэкдизона по отношению к гидролитическим ферментам in vitro.Ill

3.8.1. Гидролиз 2,3,22,25-тетраацетата 20-гидроксиэкдизона.

3.8.2. Гидролиз 2,3,22-трипальмитата 20-гидроксиэкдизона.

Актуальность темы. Экдистероиды, представляющие собой полигидроксилированные стероиды, привлекают интерес исследователей благодаря своей высокой биологической активности. Как известно, у членистоногих они регулируют процессы линьки и метаморфоза [1]. Физиологическое действие экдистероидов на млекопитающих обусловлено их свойством стимулировать биосинтез белка при отсутствии побочного гормонального эффекта. Эти соединения перспективны для использования в составе тонизирующих пищевых добавок и адаптогенных лекарственных препаратов; также для них показано антиоксидантное, противовоспалительное и ранозаживляющее действие [2,3]. Установлено, что эффективность ранозаживляющего действия повышается при применении экдистероидов в липосомальной форме [4,5]. Кроме свободных экдистероидов из различных природных источников выделены их производные, в том числе сложные эфиры с высшими жирными кислотами. Они являются неактивными резервными формами гормона линьки насекомых и запасаются в органеллах яйцеклеток взрослых самок. Показано, что образование ацильных производных обратимо, и в процессе эмбриогенеза под действием внутриклеточных эстераз происходит высвобождение активной формы гормона [1,6]. Использование принципа обратимого конъюгирования экдистероидов, реализуемого в организме насекомых, представляется нам перспективным направлением для создания экдистероидсодержащих ранозаживляющих препаратов в липосомальной форме. Так как содержание ацильных производных экдистероидов в природных объектах как растительного, так и животного происхождения мало, целесообразно их получение методом химической модификации доступных экдистероидов. Наиболее распространенным среди них является 20-гидроксиэкдизон, содержание которого, например, в листьях растений БеггашШ согопМа Ь. достигает 2% мае.

Работа выполнена в лаборатории биохимии и биотехнологии растений Института биологии Коми НЦ УрО РАН в соответствии с планом научно-исследовательских работ по теме "Структурно-функциональные исследования продуктов специализированного обмена растений и клеточных культур -продуцентов экдистероидов" (номер гос. регистрации 01.9.80.004936) при частичной финансовой поддержке РГНТП "Новейшие методы биоинженерии" (грант №2-118).

Цель работы - синтез ацильных производных 20-гидроксиэкдизона, обладающих сродством к липидным бислоям, и получение на их основе липосом с высоким содержанием экдистероидов. Задачи исследования:

- синтез ацильных производных 20-гидроксиэкдизона, отличающихся природой, числом и положением замещающих групп: 2-ацетата, 22-ацетата, 25-ацетата, 2,3,22-триацетата, 2,3,22,25-тетраацетата, 2,3,22-трипальмитата;

- сравнительная оценка включения в липосомы 20-гидроксиэкдизона и его ацильных производных;

- оптимизация соотношения липид/субстрат при формировании липосомальных дисперсий;

- характеристика липосом по параметру среднего размера и исследование динамики его изменения с течением времени;

- определение устойчивости ацильных производных 20-гидроксиэкдизона по отношению к гидролитическим ферментам в экспериментах in vitro.

Научная новизна. Разработана схема получения производных 20-гидроксиэкдизона с карбоновыми кислотами по 22-му или 25-му положениям боковой цепи с защитой диола в положении С2/С3 в виде изопропилиденового производного и диольного фрагмента при С2о/С2г - в виде фенилборатного производного. На основе схемы впервые синтезирован 22-ацетат 20-гидроксиэкдизона. Методом прямого ацилирования 20-гидроксиэкдизона впервые получен его 2,3,22-трипальмитат.

Впервые исследовано сравнительное включение ацильных производных 20-гидроксиэкдизона в состав липосом и показана зависимость включения экдистероидов от числа, положения и природы замещающих групп. Для 2,3,22-трипальмитата 20-гидроксиэкдизона, обладающего наибольшим включением в липосомы, проведена оптимизация соотношения липид/субстрат при формировании липосомальных дисперсий. Впервые определен средний размер экдистероидсодержащих липосом и прослежена динамика его изменения с течением времени.

Показана лабильность ацильных производных экдистероидов в свободной и липосомальной форме по отношению к гидролитическим ферментам в экспериментах in vitro, позволяющая прогнозировать контролируемое высвобождение биологически активного вещества из липосом.

Практическая ценность. Разработаны методики синтеза ацильных производных 20-гидроксиэкдизона, в результате чего получен ряд производных, отличающихся числом, положением и природой заместителей. Среди них 22-ацетат и 2,3,22-трипальмитат получены впервые, а также существенно увеличен выход 25-ацетата 20-гидроксиэкдизона по сравнению с известными данными. Полученные производные, являющиеся синтетическими аналогами запасных форм гормонов линьки насекомых, могут быть использованы в биохимических исследованиях для оценки влияния производных экдистероидов на рост и развитие членистоногих. Получены липосомальные формы ацильных производных 20-гидроксиэкдизона с высоким содержанием экдистероидов, перспективные для применения в качестве лекарственных препаратов ранозаживляющего действия.

Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на Международном совещании по фитоэкдистероидам (Сыктывкар, 1996), XXXIV Международной студенческой научной конференции (Новосибирск, 1996), 5th European Symposium on Controlled Drug Delivery (Нордвайк ан Зие, Голландия, 1998), Международном совещании

Физиолого-биохимические аспекты изучения лекарственных растений" (Новосибирск, 1998), 2nd World Meeting on Pharmaceutics, Biopharmaceutics and Pharmaceutic Technology (Париж, Франция, 1998), 13th and 14th Ecdysone Workshops (Йена, Германия, 1998, Рапперсвиль, Швейцария, 2000), III Всероссийском совещании "Лесохимия и органический синтез" (Сыктывкар, 1998), Международной конференции "Природные и физиологически активные соединения" (Новосибирск, 1998), IV, VI и VII Молодежных научных конференциях "Актуальные проблемы биологии" (Сыктывкар, 1996, 1999, 2000).

Публикации. По теме диссертации опубликована 1 статья, 2 сообщения в сериях «Научные доклады Коми НЦ УрО РАН» и «Новые научные методики Коми НЦ УрО РАН» и тезисы 12-ти докладов на конференциях.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 140 страницах машинописного текста и включает введение, литературный обзор, обсуждение результатов, экспериментальную часть, заключение, приложение, содержит 14 таблиц и 28 рисунков. Список цитируемой литературы состоит из 150 работ, в том числе 66 иностранных источников.

выводы

1. Разработаны методы синтеза ацильных производных 20-гидроксиэкдизона, различающихся числом, положением и природой заместителей, в результате чего получены:

2-ацетат, 2,3,22-триацетат, 2,3,22,25-тетраацетат, 2,3,22-трипальмитат 20-гидроксиэкдизона путем прямого ацилирования ангидридами или хлорангидридами карбоновых кислот;

22- и 25-ацетаты при использовании двойной защиты диольных групп 20-гидроксиэкдизона.

Структуры синтезированных продуктов и промежуточных соединений доказаны методом ®Н ЯМР-спектроскопии.

2. Исследовано включение 20-гидроксиэкдизона и его ацильных производных в липосомы. Установлено, что:

- степень включения экдистероидов в липидный бислой увеличивается при использовании производных 20-гидроксиэкдизона и высших жирных кислот;

- степень включения 2,3,22-трипальмитата 20Е в липосомы оптимальна при исходном соотношении липид/субстрат 4:1 моль/моль; средний размер экдистероидсодержащих липосом составляет 70-90 нм и остается постоянным в течение длительного времени (не менее 30-ти дней).

3. Показана лабильность ацильных производных 20-гидроксиэкдизона по отношению к гидролитическим ферментам in vitro. Из исследованных 2,3,22,25-тетраацетата и 2,3,22-трипальмитата более медленное высвобождение 20-гидроксиэкдизона наблюдается в случае липосомальной формы 2,3,22-трипальмитата 20-гидроксиэкдизона, что открывает перспективы для создания экдистероидсодержащих лекарственных препаратов пролонгированного действия.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных исследований разработана методика селективного ацилирования 20-гидроксиэкдизона по 22-му или 25-му положениям боковой цепи с защитой диола в положении С2/С3 в виде изопропилиденового производного, а диольного фрагмента при С20/С22 - в виде фенилбората. Использование разработанной методики селективной химической трансформации 20Е для получения производных с различными замещающими фрагментами (высшими жирными кислотами, гликозидами, диглицеридами, амфифильными полимерами) открывает широкие возможности для синтеза, идентификации и исследования свойств природных соединений и их синтетических аналогов.

Получены производные 20-гидроксиэкдизона, отличающиеся числом, положением и природой заместителей: 2-ацетат, 2,3,22-три- и 2,3,22,25-тетраацетаты, 2,3,22-трипальмитат, 22- и 25-ацетаты, представляющие научный интерес с точки зрения фундаментальных исследований структурно-функциональных отношений в ряду производных экдистероидов природного происхождения и их синтетических аналогов, полученных методами химической модификации, а также практическую значимость в качестве перспективных лекарственных препаратов с высокой физиологической активностью, на основе которых возможна разработка липосомальных форм для направленного транспорта лекарств в организме.

Эксперименты по сравнительной оценке включения в липосомы 20-гидроксиэкдизона и его ацильных производных показали, что эффективность включения зависит от природы замещающего фрагмента в молекуле экдистероида. Включение 2,3,22-трипальмитата 20-гидроксиэкдизона, которое составило 27,5%, свидетельствует о том, что ацильные производные 20-гидроксиэкдизона и жирных кислот, по-видимому, встраиваются в липидный бислой липосом. Таким образом, на основе стратегии моделирования процесса резервирования гормона линьки насекомых, нами был сформулирован принцип получения экдистероидсодержащих липосом, согласно которому успешное встраивание экдистероидов в липосомы достигается путем модификации их молекул мембранотропными фрагментами жирных кислот.

На примере 2,3,22-трипальмитата 20-гидроксиэкдизона исследована зависимость эффективности включения субстрата от его исходной концентрации в липосомальной дисперсии. Определено максимальное насыщение экдистероидами липидного бислоя из яичного фосфатидилхолина с концентрацией липосом 3,6%, которое составляет 2,0% мол. от всего диспергированного фосфолипида. С уменьшением содержания субстрата наблюдается повышение эффективности его встраивания в липосомальную мембрану, однако в целом содержание экдистероида в препарате остается низким. С ростом концентрации субстрата эффективность нагрузки липосом снижается в связи с невозможностью солюбилизации липосомами его избытка. Установленная зависимость может оказаться полезной для разработки медицинских препаратов ранозаживляющего действия на основе экдистероидов.

Электронно-микроскопические исследования дисперсий экдистероидсодержащих липосом показали, что получаемые препараты по параметрам размера везикул (70-90 нм) вполне удовлетворяют требованиям, предъявляемым к липосомальным препаратам в фармакологии и медицине.

Модельные исследования устойчивости ацильных производных 20-гидроксиэкдизона по отношению к гидролитическим ферментам in vitro показали их лабильность, что указывает на реализацию механизма обратимого конъюгирования экдистероидов в липосомальных формах и открывает перспективу создания пролонгированных форм ранозаживляющих препаратов с контролируемым высвобождением лекарственного начала.

1. Koolman J. Ecdysteroids // Zool.Science. - 1990. - V.7. - P.563-580.

2. Сыров В.H., Курмуков А.Г. О тонизирующих свойствах экдистерона, выделенного из левзеи сафлоровидной // Докл. Акад. наук УзССР. -1977. №12. - С.27-30.

3. Slama К., Lafont R. Insect hormones ecdysteroids: their presence and actions in vertebrates // Eur. J. Entomol. - 1995. - V.92. - P.355-377.

4. Patent EP 0436650 МКИ A 61 К №7/00. Meybeck A., Bonté F. Phases lamellaires lipidiques hydratees on liposomes a base d'ecdysteroides. №8812909; Заявл. 03.10.88; Опубл. 17.07.91. Bull. №91/29.

5. Connat J.-L., Diehl P.A., Morici M. Metabolism of ecdysteroids during the vitellogenesis of the tick Omithodoros moubata (Ixodoidea, Argasidae): accumulation of apolar metabolites in the eggs // Gen. Сотр. Endocrinol. -1984. V.56. - P.100-110.

6. Ахрем A.A., Ковганко H.B. Экдистероиды: химия и биологическая активность. Минск: Наука и техника, 1989. - 325 с.

7. Lafont R., Bouthier A., Wilson I.D. Phytoecdysteroids: structures, occurrence, biosynthesis and possible ecological significance // Proc. Conf. Insect Chem. Ecol. Tabor, 1990. - P. 197-214.

8. Regioselective synthesis of 20-hydroxyecdysone glycosides / J.Pis, J.Hykli, M.Budesinsky, J.Harmatha // J. Chromatogr. 1992. - V.596. - P. 180-197.

9. Зацны И.А., Горовиц М.Б., Абубакиров H.K. Фитоэкдизоны Serratula. Витикостерон Е из Serratula sogdiana и его частичный синтез // Хим. природн. соедин. 1973. -№2. - С.175-178.

10. Усманов Б.З., Горовиц М.Б., Абубакиров Н.К. Фитоэкдизоны Aiuga turkestanica. III. Строение туркестерона // Хим. природн. соедин. -1986. -№3.-С.466-470.

11. Acetylated ecdysteroids from Ajuga reptans var. atrropurpurea (Lamiales: Lamiaceae) //Eur. J. Entomol. 1995. - V.92. -№1. -P.287-294.

12. Саатов 3., Горовиц М.Б., Абубакиров H.K. Фитоэкдистероиды растений рода Silene // Хим. природн. соедин. 1993. - №5. - С.627-635.

13. Фитоэкдистероиды растений рода Silene. XVIII. 2-дезоксиэкдистерон-20,22-моноацетонид из Silene brahuica / М.Х.Джухарова, 3.Саатов, М.Б.Горовиц, Н.К.Абубакиров // Хим. природн. соедин. 1986. - №3. - С.241-244.

14. Фитоэкдистероиды растений рода Silene. IX. Экдистерон-22-О-бензоат из Silene scabrifolia / З.Саатов, М.Б.Горовиц, С.Мелибаев, Н.К.Абубакиров // Хим. природн. соедин. 1986. - №3. - С.77-80.

15. Фитоэкдистероиды растений рода Silene. VI. 22-сульфат-а-экдизон -новый экдистероид из Silene brahuica / З.Саатов, Н.Д.Абдуллаев, М.Б.Горовиц, Н.К.Абубакиров // Хим. природн. соедин. 1984. - №4.- С.467-470.

16. Фитоэкдистероиды растений рода Silene. X. Силенеозид Е 2-дезокси-а-экдизон-З-О-Р-О-глюкопиранозид из Silene brahuica / З.Саатов, Н.Д.Абдуллаев, М.Б.Горовиц, Н.К.Абубакиров // Хим. природн. соедин. - 1986. -№3. - С.323-326.

17. Фитоэкдистероиды растений рода Melandrium. I. Полиподин В 22-ацетат из Melandrium turkestanicum / З.Саатов, Р.У.Умарова, М.Б.Горовиц, Н.К.Абубакиров // Хим. природн. соедин. 1990. - №4.- С.480-483.

18. Apolar ecdysteroid esters in adult female crickets, Gryllus bimaculatus / K.H.Hoffmann, D.Bulenda, E.Thiry, E.Schmid // Life Sciences. 1985. -V.37. - P.85-192.

19. Dinan L.N., Rees H.H. The identification and titres of conjugated and free ecdysteroids in developing ovaries and newly-laid eggs of Schistocerca gregaria I I J. Insect Physiol. 1981. - V.27. - P.51-58.

20. Slinger A.J., Isaac R.E. Synthesis of apolar ecdysone esters by ovaries of the cockroach Periplaneta americana // Gen. Сотр. Endocrinol. 1988. -V.70. - P.74-82.

21. A new class of apolar ecdysteroid conjugates: esters of 20E with long-chain fatty acids in ticks / P.A.Diehl, J.-L.Connat, J.-P.Girault, R.Lafont // Int. J. Invertebrate Reprod. Develop. 1985. - V.8. - P. 1-13.

22. Identification of ecdysone 22-long chain fatty acyl esters in newly laid eggs of the cattle tick Boophilus microplus / T.Crosby, R.P.Evershed, D.Lewis, K.P.Wigglesworth, H.H.Rees // Biochem. J. 1986. - V.240. -P.131-138.

23. Pis J., Harmatha J., Slama K. Action of some new synthetic derivatives of phytoecdysones on insects // Proc. Conf. Insect Chem. Ecol. Tabor, 1990. -P.227-234.

24. Burdette W.J. Invertebrate hormones and tumors // Invertebrate Endocrynology and Hormonal Heterophylly / Ed. W.J.Burdette. Berlin: Springier-Verlag, 1974. -P.351-367.

25. Сыров B.H. Сравнительное изучение анаболической активности фитоэкдистероидов и стеранаболов в эксперименте // Хим.-фарм. ж. -2000. Т.34. -№4. - С.31-34.

26. Фитоэкдистероиды растений рода Ajuga и их биологическая активность / З.Саатов, В.Н.Сыров, А.У.Маматханов, Н.К.Абубакиров // Хим. природн. соедин. 1994. - №2. - С.152-159.

27. Effects of ecdysterone on the differentiation of normal human keratinocytes in vitro / M.Detmar, M.Dumas, F.Bonte, A.Meybeck, C.E.Orfanos // Eur. J. Dermatol. 1994. - V.4. -P.558-562.

28. Курмуков А.Г., Сыров B.H. Противовоспалительные свойства экдистерона // Мед. ж. Узбекистана. 1988. - №10. - С.68-70.

29. Курмуков А.Г., Ермишина О.А. Влияние экдистерона на экспериментальную аритмию, изменения в гемодинамике и контрактильности миокарда, вызванные окклюзией коронарной артерии // Фармакол. токсикол. 1991. - Т.54. - №1. - С.27-29.

30. Осинска Л.Ф., Саад Л.М., Холодова Ю.Д. Антирадикальные свойства и антиокислительная активность экдистерона // Укр. биохим. ж. -1992. Т.64. - С.114-117.

31. Сыров В.Н., Айзиков М.И., Курмуков А.Г. Влияние экдистерона на содержание белка, гликогена и жиров в печени, сердце и мышечных тканях белых мышей // Докл. Акад. наук УзССР. 1975. - Т.32. - №8.- С.37-38.

32. Сыров В.Н., Курмуков А.Г., Усманов Б.З. Анаболический эффект туркестерона и тетраацетата туркестерона // Докл. Акад. наук УзССР.- 1975. Т.32. - №2. - С.32-34.

33. Сыров В.Н., Курмуков А.Г., Сахибов А.Д. Влияние туркестерона и неробола на активность белок-синтезирующей системы в печени мышей // Вопр. мед. хим. 1978. - Т.24. - №4. - С.456-460.

34. Dinan L. The chemical synthesis of ecdysone 22-long chain fatty acyl esters in high yield // J. Steroid Biochem. 1988. - V.31. - №2. - P.237-245.

35. Galbraith M.N., Horn D.H.S. Insect molting hormones: crustecdysone from Podocarpus elatus // Austr. J. Chem. 1969. - V.22. - P.1045-1057.

36. Lafont R., Morgan E.D., Wilson I.D. Chromatographic procedures for phytoecdysteroids // J. Chromatogr. A. 1994. - V.658. - P.31-53.

37. Guedin-Vuong D., Nakatani Y., Ourisson G. Ecdysteroids. Selective protections and synthesis of potential tools for biochemistry studies // Croatica Chem. Acta. 1983. - V.38. - №4. - P.547-557.

38. Soumoff C., Horn D.H.S., O'Connor I.D. Production of a new antiserum to arthropod molting hormone and comparison with two other antisera // J. Steroid. Biochem. 1981. - V.14. - P.429-435.

39. Antibodies to the insect molting hormone p-ecdysone / R.C.Lauer, P.H.Solomon, K.Nakanishi, B.F.Erlanger // Experientia. 1974. - V.30. -№5. -P.560-562.

40. A high affinity antiserum specific for the ecdysone nucleus / D.H.S.Horn, J.S.Wilkie, B.A.Sage, I.D.O'Connor // J. Insect Physiol. 1976. - V.22. -P.901-905.

41. Pis J., Harmatha J. Phenylboronic acid as a versatile derivatization agent for chromatography of ecdysteroids // J. Chromatogr. 1992. - V.596. -P.271-275.

42. Cyclic phenylboronates of ecdysteroids as products of regiospecific reaction with phenylboronic acid / J.Pis, J.Hykl, M.Budesinsky, J.Harmatha // Collect Czech. Chem. Commun. 1993. - V.58. - P.612-618.

43. Wilson I.D. Thin-layer chromatography of ecdysteroids // J. Chromatogr. -1985. V.318. - P.373-377.

44. Новосельская И.Л., Горовиц М.Б., Абубакиров H.K. Фитоэкдистероиды Serratula coronata II Хим. природы, соедин. 1981. - №5. - С.668-669.

45. Read Н., Wilson I.D., Lafont R. A note on overpressure thin-layer chromatography of ecdysteroids // Chromatography and isolation of insect hormones and pheromones / Ed. by A.R.McCaffery and I.D.Wilson. -New-York: Plenum Press, 1990. -P.127-130.

46. Wilson I.D. The use of boronic acids for the normal and reversed phase TLC of ecdysteroids // J. Planar Chromatogr. 1993. - V.5. - P.316-318.

47. Efficient determination of phytoecdysteroids from Ajuga species and Polipodium vulgare by high-performance liquid chromatography / F.Camps, J.Coll, M.P.Marco, J.Tomas // J. Chromatogr. 1990. - V.514. -P. 199-207.

48. Efficient isolation of phytoecdysones from Ajuga plants by highperformance liquid chromatography and droplet counter-currentchromatography / I.Kubo, J.A.Klocke, I.Ganjian, N.Ichikawa, T.Matsumoto // J. Chromatogr. 1983. - V.257. - P.157-161.

49. Lafont R., Wilson I.D. Advances in ecdysteroid high-performance liquid chromatography // Chromatography and Isolation of Insect Hormones and Pheromones / Ed. by A.R.McCaffery and I.D.Wilson. New-York: Plenum Press, 1990,-P.79-93.

50. Selectivity in the high-performance liquid chromatography of ecdysteroids / R.Lafont, N.Kaouadji, E.D.Morgan, I.D.Wilson // J. Chromatogr. A. -1994. V.658. - P.55-67.

51. Lafont R.D., Wilson I.D. The Ecdysone Handbook. Nottingham, 1992. -392p.

52. Новосельская И.Л., Горовиц М.Б., Абубакиров H.K. Экдистерон и полиподин В из Paris quadrifolia II Хим. природн. соедин. 1986. -№3. - С.402-403.

53. Rapid determination of 20-hydroxyecdysteroids in complex mixtures by solid-phase extraction and mass spectrometry / J.Pis, J.Hykl, T.Vaisar, J.Harmatha // J. Chromatogr. A. 1994. - V.658. - P.77-82.

54. Vaisar Т., Pis J. Cyclic boronates in the mass spectrometry of ecdysteroids // Rapid Comm. Mass Spectrometry. 1993. - V.7. - P.46-52.

55. Грегориадис Г. Липосомы как носители лекарств. Развитие и будущее концепции // Липосомы в биологических системах. М.: Медицина, 1983. - С.36-93.

56. Gregoriadis G. Liposomes in therapeutic and preventive medicine: the development of the drug-carrier conception // Ann. N. Y. Acad. Sci. -1978. V.308. - P.343-370.

57. Торчилин В.П., Клибанов А.Л. Липосомы как средства направленного транспорта // Ж. Всесоюз. хим. общ. 1987. - Т.32. - №5. - С.502-514.

58. Lasic D. Liposomes an industrial view // Chem. Industry. - 1996. - V.6. -P.210-213.

59. Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия. M.: Просвещение, 1987. -815 с.

60. Фосфолипиды. Методы их выделения, обнаружения и изучения физико-химических свойств липидных дисперсий в воде. Г.М.Сорокоумова, А.А.Селищева, А.П.Каплун, В.И.Швец. М.: Изд-во МИТХТ, 2000. - 68 с.

61. Марголис Л.Б., Бергельсон Л.Д. Липосомы и их взаимодействие с клетками. М.: Наука, 1986. - 240 с.

62. Woodle М.С., Papahdjopoulos D. Liposome preparation // Methods in enzymology. Acad. Press, Inc., 1989. - V.171. - P. 193.

63. Влияние охлаждения, факторов среды инкубации и криопротекторов на стабильность липосом / А.М.Белоус, Т.П.Бондаренко, Л.А.Тонконог, В.Г.Пащенко // Липосомы и их взаимодействие с клетками и тканями. М.: Наука, 1981. - С.80-86.

64. Трофимов В.И., Нисневич М.М. Вопросы получения и контроля свойств стерильных липосом с лекарственными препаратами // Вестн. АМН СССР. 1990. - №6. - С.28-32.

65. Pica U. Liposomes with a large trapping capability prepared by freezing // Arch. Biochem. Biophys. 1981. - V.212. -P.186-194.

66. Влияние замораживания и оттаивания на монобислойные липосомы / В.И.Закревский, Н.Г.Плеханова, К.А.Ротов, Е.Ф.Ступина, В.А.Мельников // Липосомы: применение в биологии и медицине. -М.: Наука, 1985,- С.20-24.

67. Small-volume extrusion apparatus for preparation of large, unilamellar vesicles / R.C.MacDonald, R.I.MacDonald, B.Ph.M.Menco, K.Takeshita, N.K.Subbarao, L.Hu // Biochim Biophys. Acta. 1991. - V.1061. - P.297-303.

68. Биополимеры / Под ред. Ю.Иманиси. М.: Мир, 1988. - 544 с. Пер. с япон.

69. Brunner J., Skrabal P., Hauser H. Single bilayer vesicles prepared without sonication. // Biochim. Biophys. acta. 1976. - V. 455. - P.322 - 331.

70. Detergent removal during membrane reconstruction / T.M.Allen, A.Y.Romans, H.Kercret et al // Biochim. Biophys. Acta. 1980. - V.601. -P.328-342.

71. Patent USA 5230899, МКИ5 A61 К 9/127, B01 J 13/02. Methods and compositions for making liposomes / J.Y.Park, S.A.Thompson, K.Smith. Beecham Corp. №714984; Заявл. 14.06.91; Опубл. 27.07.93. НКИ №424/450.

72. Абрамзон А. А. Поверхностно-активные вещества. Свойства и применение. Л.: Химия, 1975. - 248 с.

73. Ромейс Б. Микроскопическая техника М.: Изд-во иностр. лит-ры, 1954.-712с. Пер. с нем.

74. Wei S.J., Smith N.B. Improvements in the preparation of liposomes for electron microscopy and electronspectroscopic imaging // Microscop. Res. Tech. 1994. - V.27. - P.557-558.

75. Alder K., Schiemann J. Characterization of liposomes by scanning electron microscopy and the freeze-fracture technique // Micr. Microsc. Acta. -1985. V.16. -P.109-113.

76. Huang С. Studies on phosphatidylcholine vesicles. Formation and physical characteristics // Biochem. 1969. - V.8. - №1. - P.344-352.

77. Mason J., Huang C. Chain length dependent termodynamics of saturated symmetric chain phosphatidylcholine bilayers // Lipids. 1981. - V.16. -P.604-608.

78. Watts A., Marsh D., Knowles P.E. Characterization of dymiristoylphosphatidylcholine vesicles and their dimensional changes through the phase transition: molecular control of membrane morphology // Biochem. 1978. - V.17. -P.1792-1801.

79. Larrabee A.L. Time-dependent changes in the size distribution of distearoilphosphatidylcholine vesicles // Biochem. 1979. - V.18. -P.3321-3326.

80. Долгинова E.A. Биологическая активность и агрегационная устойчивость липосом с инсулином: Автореф. дис. канд. биол. наук. -Москва, 1989.- 18 с.

81. Структурная и агрегационная устойчивость лецитиновых липосом по данным светорассеяния / Ю.П.Благой, В.Н.Васильченко, Б.Н.Зимогляд, И.С.Гусева // Биофизика. 1980. - T.XXV. - Вып.6. -С.1017-1022.

82. Chong C.S., Colbow К. Light scattering and turbidity measurements on lipid vesicles // Biochim. Biophys. Acta. 1976. - V.436. - P.260-282.

83. Синтез бетулиновой кислоты из бетулина и исследование ее солюбилизации с помощью липосом / Ле Банг Шон, А.П.Каплун,

84. A.А.Шпилевский, Ю.Э.Андия-Правдивый, С.Г.Алексеева,

85. B.Б.Григорьев, В.И.Швец // Биоорг. хим. 1998. - Т.24. - №10.1. C.787-793.

86. Физико-химические свойства боратных производных DOPA, дофамина и их липосомных форм / Н.В.Борисова, В.И.Крюков,

87. А.П.Каплун, В.И.Швец // Биоорг. хим. 1998. - Т.24. - №11. - С.848-855.

88. Клибанов A.JL, Бурханов С.А., Трубецкой B.C. Химическая модификация липосом и создание новых форм физиологически активных препаратов // Итоги науки и техники. Сер. "Биотехнология". 1988. - Т.8. - С.79-142.

89. Стабильные полимерные липосомы на основе 1,2-ди-9-(2Е, 4Е)-гексади-енилоксикарбонилнонаноил.-8П-гилцеро-3-фосфохолина / Т.Л.Рунова, А.В.Аникин, М.В.Аникин, Ю.Л.Себякин // Биоорг. хим. -1996. Т.22. - №10-11. - С.809-813.

90. Степанов А.Е., Краснопольский Ю.М., Швец В.И. Физиологически активные липиды. М.: Наука, 1991. - 136 с.

91. Пасешниченко В.А. Терпеноиды и стероиды в жизни растений // Успехи биол. науки. 1991. - Т.32. - №2. - С. 197-205.

92. Холодова Ю.Д. Структурно-функциональные особенности мембран с различным содержанием холестерина // Укр. биохим. ж. 1981. -Т.53. - №5. - С.114-130.

93. Влияние стеринов на встраивание мелиттина в липосомальные мембраны / С.Я.Адамян, Ю.А.Каулин, И.М.Кузнецова, К.К.Туроверов, Л.В.Щагина // Цитология. 1998. - Т.40. - №8/9. -С.801-805.

94. Feigin A.M., Teeter J.H., Brand J.G. The influence of sterols on the sensitivity of lipid bilayers to melittin // Biochem. Biophys. Res. Comm. -1995. V.211. -№1. -P.312-317.

95. Tuganova A.V., Kotsyuruba A.V. The in vitro interaction of C27-sterols with the erythrocyte membranes depends on the sterol structure and concentration// Cell. Mol. Biol. Lett. 1996. - V.l. -P.129-135.

96. Needham D., Sarpal R.S. Binding of paclitaxel to lipid interfaces: correlation with interface compliance // J. Liposome Res. 1998. - V.8. -N2. -P.147-163.

97. Изучение взаимодействия а-токоферола с фосфолипидами, жирными кислотами и их оксигенированными производными методом 31Р-ЯМР-спектроскопии / В.В.Чудинова, Е.И.Захарова, С.М.Алексеев,

98. B.В.Чупин, Р.П.Евстигнеева // Биоорг. хим. 1993. - Т.19. - №2.1. C.243-249.

99. Interaction of tryptophan with lecitine liposomes: NMR and turbidity studies / V.Viti, S.Agostini, M.Ceccarini, M.Minetti // Physiol. Chem. Physics Med. NMR. 1985. - V.17. - P.413-420.

100. Башфорд К.JI. Оптическая спектроскопия биологических мембран // Биологические мембраны. Методы. / Под ред. Дж.Финдлея, У.Эванза. М.: Мир, 1990. - С.308-338.

101. Омельяненко В.Г. ЭПР-спектроскопическое изучение встраивания нативных и модифицированных белков в липосомы // Липосомы и их взаимодействие с клетками и тканями. М.: Наука, 1981. - С.139-143.

102. Физико-химические свойства липосомных форм L-3,4-дигидроксифенилаланина (DOPA) и дофамина / Н.В.Борисова, А.П.Каплун, О.В.Богомолов, В.Б.Григорьев, В.В.Юрасов,

103. Е.В.Никушкин, Г.Н.Крыжановский, В.И.Швец // Биоорг. хим. 1996. -Т.22.-№10-11.-С.846-851.

104. Барсуков Л.И. Липосомы // Соросовский образовательный ж. 1998. -№10. - С.2-9.

105. Липидные производные сарколизина, метотрексата и рубомицина / Е.Л.Водовозова, П.Ю.Никольский, И.И.Михалев, Юл.Г.Молотковский // Биоорг. хим. 1996. - Т.22. - №7. - С.548-556.

106. Окисление в липосомах из яичного фофатидилхолина, нагруженных L-3,4-дигидроксифенилаланином (DOPA) и допамином: взаимное влияние компонентов / Н.В.Борисова, И.В.Жигальцев, О.В.Богомолов,

107. A.П.Каплун, В.В.Юрасов, В.Г.Кучеряну, Е.В.Никушкин, Г.Н.Крыжановский, В.И.Швец // Биоорг. хим. 1997. - Т.23. - №4. -С.284-289.

108. Противовоспалительные эффекты липосом / В.М.Крейнес,

109. B.М.Мельникова, Я.М.Марголин, Л.П.Мельянцева, А.И.Гладштейн, Б.А.Андриасян // Вестн. АМН СССР. 1990. - №6. - С.44-47.

110. Взаимодействие липосом различного состава с компонентами сыворотки крови / Н.А.Голубчикова, В.Н.Сидрров, В.М.Крейнес, Т.И.Шраер // Вестн. АМН СССР. 1990. - №6. - С.36-38.

111. Чебанов С.М., Бердичевский В.Р., Торчилин В.П. Динамика морфо-функциональных изменений в печени мышей под влиянием липосом. Материалы электронно-гистохимического исследования // Липосомы: применение в биологии и медицине. М.: Наука, 1985. - С.35-39.

112. Перспективы использования липосом в медицине / В.Ф.Антонов, Ю.А.Князев, Ю.Ш.Мошковский, Л.А.Пирузян, А.И.Тенцова // Липосомы и их взаимодействие с клетками и тканями. М.: Наука, 1981.-С.З-9.

113. Экспериментальное изучение липосомального препарата стрептомицина при туберкулезе / М.А.Владимирский, Г.А.Ладыгина,

114. Р.М.Петюшенко, Н.С.Грязнова, Ю.О.Садыкин // Липосомы: применение в биологии и медицине. М.: Наука, 1985. - С.77-82.

115. Антонов В.Ф., Шевченко Е.В. Термоуправляемые липосомы // Фармация. 1993. - Т.42. - №4. - С.32-34.

116. Любешкин A.B., Себякин Ю.Л. Проблемы структурного моделирования плазматических мембран на основе липосом. Стабильность и направленный транспорт in vivo // Успехи биол. хим. -1994. Т.34. - С.131-187.

117. Розенберг O.A. Перспективы создания органотропных липосом // Ж. Всесоюз. Хим. Общ. им. Д.И.Менделеева. 1987. - Т.32. - №5. -С.514-521.

118. Саатов Т.С., Исаев Э.И., Бурханов С.А. Транспорт аутологичных липосом в организме // Ж. Всесоюз. Хим. Общ. им. Д.И.Менделеева. -1987. Т.32. - №5. - С.522-527.

119. Дворкин В.М., Видершайн Г.Я. Повышение тропности липосом к гепатоцитам включением в липосомную мембрану галактозосодержащих гликоконъюгатов // Липосомы: применение в биологии и медицине. -М.: Наука, 1985. С.48-57.

120. Торчилин В.П. Иммобилизованные ферменты в медицине. М.: Знание, 1986.-32 с.

121. Торчилин В.П., Клибанов A.JL, Смирнов В.Н. Проблемы и перспективы использования липосом в качестве средств обычного или направленного транспорта лекарств в организме // Липосомы и их взаимодействие с клетками и тканями. М.: Наука, 1981. - С.10-17.

122. Райхман Л.М., Иванов В.Е. Каскадные системы слияния и проблема адресования липосом // Липосомы и их взаимодействие с клетками и тканями. М.: Наука, 1981. - С.17-24.

123. Рингедорф Г., Шмидт Б. Системы полимерных носителей лекарств // Ж. Всесоюз. Хим. Общ. им. Д.И.Менделеева. 1987. - Т.32. - №5. -С.487-500.

124. Рууге Э.К., Русецкий А.Н. Направленный транспорт лекарств с помощью магнитного поля // Ж. Всесоюз. Хим. Общ. им. Д.И.Менделеева. 1987. - Т.32. - №5. - С.556-561.

125. Марголис Л.Б. Липосомы и клетка: модель межклеточных взаимодействий // Липосомы и их взаимодействие с клетками и тканями. М.: Наука, 1981. - С.24-31.

126. Meybeck A. Past, present and future of liposome cosmetics // Liposome dermatics / Ed. by O.Braun-Falco, H.C.Korting, H.I.Maibach. Berlin Heidelberg: Springer-Verlag, 1996. -P.341-345.

127. Application of vesicles to rat skin in vivo: a confocal laser microscopy study / M.E.M.J. van Kuijk-Meuwissen, L.Mougin, H.E.Junginger, J.A.Bouwstra// J. Control. Release. 1998. - V.56. -P.l89-196.

128. Van Kuijk-Meuwissen M.E.M.J., Junginger H.E., Bouwstra J.A. Interactions between liposomes and human skin in vitro, a confocal laser scanning microscopy study // Biochim. Biophys. Acta. 1998. - V.1371. -P.31-39.

129. Биотехнологические направления в создании лекарственных и диагностических препаратов липидной природы / В.И.Швец, Ю.М.Краснопольский, А.П.Каплун, А.Е.Степанов // Вопр. мед. хим. -1997. Т.43. - Вып.5. - С.416-423.

130. Хрестовая Н.Л., Апуховская Л.И., Турина Н.М. Изучение биологической активности витамина D3 в липосомах // Хим.-фарм. ж. 1990.-Т.24.-№11.-С.52-55.

131. О некоторых свойствах фосфатидилхолиновых липосом, нагруженных инсулином / М.В.Штейнгарт, Я.И.Хаджай, Н.А.Бугрим, Н.В.Ершова, Н.И Гончаров, В.В.Павлова, А.В.Николаева // Липосомы и их взаимодействие с клетками и тканями. М.: Наука, 1981. - С.95-102.

132. Тенденции в развитии исследований в области липосом (обзор патентной литературы) / Н.Ю.Несытова, Н.С.Палева, Е.В.Ильина, П.Шенк, Ф.Бендас, П.Нун // Вестн. АМН СССР. 1990. - №6. - С.8-19.

133. Биологическая активность 20-гидроксиэкдизона и его ацетатов /

134. B.В.Володин, Т.И.Ширшова, С.А.Бурцева, М.В.Мельник // Раст. ресурсы. 1999. -Вып.2. - С.76-81.

135. Патент (19) RU (11) 2119331 (13) С1 Россия, (51) А 61 К 9/06, 35/78. Средство для лечения ожоговых ран "Витадерм" / В.Н.Дармограй,

136. C.М.Потехинский, Ю.И.Ухов, В.К.Петров, С.С.Потехинский, С.В.Дармограй; № 96104062/14; Заявл. 29.02.96; Опубл. 27.09.98. Бюл. №27.

137. Колегова H.A., Володин В.В. Обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография экдистероидов в системах, содержащих электронодонорные добавки // Ж. аналит. хим. 1999. - Т.54. - №12. -С.1285-1288.

138. Steroidal fatty acid esters / R.B .Hochberg, S.L.Pahuja, J.E.Zielinski, J.M.Larner // J. Steroid Biochem. Mol. Boil. 1991. - V.40. - №3. -P.577-585.

139. Северин E.C. Избирательная регуляция клеточного метаболизма // Акад. наук СССР. Всесоюз. биохим. общ-во. 45-е Баховское чтение / Под ред. В.Л.Кретовича. М., 1989. - 116 с.

140. Patent ЕР 0 180 980 Lipid membrane structures / M.Tomikawa, S.Hirota, H.Kikuchi, N.Yamauchi. № JP 233742/84; Заявл. 06.11.84; Опубл. 14.05.86. Bulletin №86/20.

141. Диксон M., Уэбб Э. Ферменты. M.: Мир, 1982. - T.l. - С.359-360.

142. Гордон А., Форд Р. Спутник химика. М.: Мир, 1976. - 541 с.

143. Губен И. Методы органической химии. М.-Л.: Госхимтехиздат, 1934. - Т.2. - С.235, 248.

144. Агрономов А.Е., Шабаров Ю.С. Лабораторные работы в органическом практикуме. М.: Высшая школа, 1971.- С.139.

145. Свойства органических соединений. Справочник под ред. С.Н.Потехина. Л.: Химия, 1984. - С.518.

146. Кейтс М. Техника липидологии. М.: Мир, 1975. - 322 с.

147. Прохорова М.И., Туликова З.Н. Большой практикум по углеводному и липидному обмену. Л.: Изд-во ЛГУ, 1965. - 219 с.

148. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука, 1985. - 536 с.