Синтез первых представителей амидов бетулоновой кислоты с тройными связями, их модификация и изучение биологической активности тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

На правах рукописи

005013019

Говди Анастасия Иосифовна

СИНТЕЗ ПЕРВЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕН АМИДОВ БЕТУЛОНОВОЙ КИСЛОТЫ С ТРОЙНЫМИ СВЯЗЯМИ, ИХ МОДИФИКАЦИЯ И ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ

02.00.03 - органическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

2 9 мдр ¿012

Новосибирск - 2012

005013019

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте химической кинетики и горения СО РАН

Научный руководитель: доктор химических наук,

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор, заведующий кафедрой химии КГПУ им. В.П. Астафьева (г. Красноярск) Горностаев Леонид Михайлович

кандидат химических наук, старший научный сотрудник лаборатории медицинской химии НИОХ им. H.H. Ворожцова СО РАН (г. Новосибирск)

Харитонов Юрий Викторович

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова (г. Москва)

Защита состоится 13.04.2012 г. в 9— на заседании диссертационного совета Д 003.049.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Новосибирском институте органической химии им. H.H. Ворожцова СО РАН (НИОХ СО РАН) по адресу: 630090, г. Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева, 9.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИОХ СО

профессор

Сергей Францевич

РАН.

Автореферат разослан « марта 2012 года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор химических наук

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Одним из важнейших направлений современной медицинской химии является модификация метаболитов растительного происхождения. В связи с этим особого внимания заслуживают растительные пентациклические тритерпеноиды лупанового типа и их синтетические производные.

Существенным преимуществом тритерпеноидов является их доступность (кора березы) и низкая токсичность. Удобные методы выделения и наличие в их структуре реакционноспособных функциональных групп определяют перспективность использования соединений этого класса в качестве исходных веществ для различных химических трансформаций.

Кроме того, бетулин, бетулиновая и бетулоновая кислоты, относящиеся к классу лупановых тритерпеноидов, обладают разнообразной биологической активностью, включая противовоспалительное, противоопухолевое, и анти-ВИЧ действия. Среди биологически активных тритерпеноидов особое место занимают азотсодержащие производные. Например, длинноцепочечные амиды бетулиновой и бетулоновой кислот обладают противовирусной и противоопухолевой активностью.

С другой стороны, известно, что ацетиленовые соединения являются достаточно представительной группой природных метаболитов, продуцируемых высшими растениями, а также грибами и микроорганизмами. Известно, что многие природные ацетиленовые метаболиты используются в медицинской практике как противораковые агенты.

Можно ожидать, что введение тройной связи в структуру бету-лоновой кислоты приведет к увеличению синтетического и прикладного потенциала этих соединений.

С учетом того, что п литературе отсутствуют данные об ацетиленовых производных амидов бетулоновой кислоты, а практически важные результаты в поиске противоопухолевых и противовирусных агентов были достигнуты при трансформации заместителей при атоме углерода С28 бетулоновой кислоты, нами предпринята попытка ввести ацетиленовые фрагменты именно в положение-28 молекулы с последующей модификацией по тройной связи.

Таким образом, задачи исследования представляют как фундаментальный, так и практический интерес для органической химии.

Работа выполнена в Группе спин-меченых и ацетиленовых соединений Института химической кинетики и горения СО РАН при поддержке грантов РФФИ № 07-03-00048а (2007-2009), 10-03-00257а (20102012), Междисциплинарного гранта СО РАН №53 (2007-2009), №93 (2009-2011), Междисциплинарного гранта РАН 5.9.3. (2009-2011), Интеграционного гранта СО РАН №32 (2006-2008), а также Химического сервисного центра СО РАН.

Цель работы. Основной целью настоящей работы являлась разработка метода синтеза ацетиленовых производных бетулоновой кислоты и дальнейшая модификация на их основе; изучение фармакологической активности полученных соединений.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Впервые синтезированы первые представители ацетиленовых производных бетулоновой кислоты.

Для синтеза этинильных производных амида бетулоновой кислоты нами выбран способ, заключающийся во взаимодействии хлорангид-рида бетулоновой кислоты с заранее приготовленными алифатическими или ароматическими аминами, уже содержащими терминальную ацетиленовую группу.

Синтетическая ценность соединений с ацетиленовой группой определяется высокой реакционной способностью тройной связи (С=С), в особенности монозамещенных ацетиленов, обладающих повышенной СН-кислотностью. Эти соединения позволяют легко осуществлять как функционализацию молекулы, так и формирование новых С-С- или С-гетероатом-связей.

Были исследованы реакции, характерные для ацетиленов: Ходке-вича-Кадио, аминометилирование по Манниху, кросс-сочетание с арил-галогенидами (реакция Соногаширы), 1,3-диполярное циклоприсоеди-нение.

Показано, что получение ацетиленовых производных бетулоновой кислоты и их модификация открывает новые пути к направленному синтезу биологически активных соединений.

Апробация работы. Результаты настоящей работы были представлены на международных и российских конференциях: Научная молодёжная школа-конференция «Химия под знаком Сигма» (Омск, 2008), 7th International Symposium for Chinese Medicinal Chemists (Kaohsiung Taiwan,

2010), 4th Int. Conference. Modern Aspects of Chemistry of heterocycles, CBC-2010 (S-Petersburg, 2010), II International Symposium on Drug Discovery (Araraquara, San Paulo, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 статей в отечественных и зарубежных изданиях и тезисы шести докладов.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 121 машинописной странице и состоит из введения, четырех глав, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 100 наименований. Первая глава (литературный обзор) посвящена синтезу и биологическим свойствам производных бетулиновой и бетулоновой кислот; вторая -изложению и обсуждению результатов собственных исследований; в третьей главе представлены данные о биологической активности полученных соединений; экспериментальная часть приведена в четвертой главе. Работа содержит 12 таблиц и 4 рисунка.

Основное содержание работы

В качестве исходного соединения использовали бетулоновоую кислоту, получаемую в одну стадию из легко доступного бетулина. Синтез ацетиленовых производных амида бетулоновой кислоты заключается во взаимодействии хлорангидрида бетулоновой кислоты с аминоаце-тиленами. Для этой цели заранее был синтезирован ароматический амин, содержащий этинильную группу - я-аминофенилацетилен (84%).

1. Синтез терминальных ацетиленов бетулоновой

кислоты

Конденсацию хлорангидрида бетулоновой кислоты 1 с п-аминофенилацетиленом или пропаргиламином проводили в атмосфере

аргона в безводном бензоле при 75°С или комнатной температуре в присутствии триэтиламина. Выходы целевых соединений 2 и 3 составили 55

2 3

Таким образом, на основе реакции хлорангидрида с терминальными аминоалкил- и аминоарилалкинами получены первые представители ацетиленовых производных бетулоновой кислоты - ключевые продукты для последующей модификации.

2. Модификация ацетиленовых производных амидов бетулоновой кислоты 2.1 Аминоалкилирование (реакция Манниха)

В классическом варианте реакция Манниха включает взаимодействие трех компонентов - терминального апкина, формальдегида (генерируемого in situ из параформа) и вторичного амина. Применение в этой реакции солей меди значительно ускоряет реакцию Манниха. Известно 3 варианта аминоалкилирования ацетиленов: смесь параформа и вторичных аминов в диоксане с использованием CuCl (метод 1); смесь параформа и вторичных аминов в присутствии Cu(OAc)2 и 30% H2S04 (метод 2); бисаминометаны в присутствии CuCl (метод 3).

Для получения оснований Манниха на основе 7У-(3-оксо-20(29)-лупен-28-оил)-4-этиниланилина 2 были применены все три подхода. В качестве вторичных аминов были использованы диэтиламин, пирроли-

Мс н

ЧЕ1 О он

а Ь с й н е

Реагенты и условия: /. Метод 1: (СН20)\, СиС1;

и. Метод 2: (СН20)х, Си(ОАс)2,30%-ная Н2304; т. Метод 3: н2С{Я)2, СиС1.

Для сравнительного изучения и выявления оптимальных условий аминометилирования амидоацетилена 2 были получены пропарги-ламины 4а-с с использованием трех методов. Взаимодействие ацетилена 2 с аминами (диэтиламин, пирролидин и морфолин) и параформом в ди-оксане в присутствии полухлористой меди в атмосфере аргона привело к соответствующим основаниям Манниха 4а-с (3-10 ч, 50-68%). Переход к кислотно-катализируемому варианту проведения реакции Манниха также позволяет получить соединения 4а-с, при этом выходы продуктов были несколько ниже и составили 46-55%.

Аминоалкилирование >1-(3-оксо-20(29)-лупен-28-оил)-4-

этиниланилина 2 бисаминометанами 5а-е проведено в присутствии СиС1

при 80°С (1-4 ч) с образованием соответствующих алкиламиноэтиниль-ных производных 4а-е с выходами 62-83%.

Таблица 1. А миноалкилирование N-(3 -оксо-20(29)-лу пен-2 8_оил)-4-этиниланилина 2 __

Соедине Время

Метод Т.пл, °С Выход, %

ние реакции, ч

/-3 68%,

4а /', /7, /77 131-133 г/ - 6 46%

/77 - 4 62%

10 50%

4Ь /, /7, ш 135-137 /7-8 51%

/77 -1 74%

¡-7.5 55%

4с /, /7, ш 151-152.5 /7-7 55%

»7 - 2 72%

и-8 69%

4А и, гп 137-139

/77 - 2.5 83%

4е ш 110-112 3.5 82%

/. Метод 1: (СН20)х, СиС1; /7. Метод 2: (СН20)х, Си(ОАс)2, 30%-ная Н2504; /77. Метод 3: бисаминометаны, СиС1.

Как видно из таблицы 1, наиболее оптимальным из всех методов оказалось использование заранее приготовленных бисаминометанов.

Для получения систематических рядов модифицированных природных соединений алифатический ацетилен 3 также был введен в реакцию Манниха. Учитывая наш предыдущий опыт, для получения амино-пропаргильных производных 6а-(1 был применен метод 3. Так, нагреванием алифатического алкина - Лг-(3-оксо-20(29)-лупен-28-оил)-пропаргиламина 3 с бисаминометанами 5а-(1 в диоксане в присутствии СиС1 при 80°С в инертной атмосфере (1-1.5 ч) были получены продукты

abed

Сравнение этих трех методов позволяет сделать вывод, что все три могут быть применены в синтезе аминопропаргильных производных бетулоновой кислоты. Но при использовании метода 3 время реакции значительно сокращается, а выходы продуктов увеличиваются.

2.2 Синтез дизамещенных ацетиленовых производных бетулоновой кислоты: реакции Соногаширы и Ходкевича-Кадио

Применение наиболее распространенного в настоящее время метода получения алкинов (реакция Соногаширы) в системе Си1-Рс1С12(РРЬз)2 нетривиально при введении ацетиленовых фрагментов в

молекулу бетулоновой кислоты, так как наличие в исходной бетулоно-вой кислоте концевой винильной группы может привести к образованию дизамещенного олефина в условиях медно-палладиевого катализа - реакция Хека.

С учетом полифункциональности молекулы бетулоновой кислоты, принципиальное значение имела проверка возможности осуществления палладий катализируемой селективной реакции кросс-сочетания ацетиленов 2 и 3 с галоидаренами. В случае успеха это открывало бы путь к синтезу самых разнообразных производных бетулоновой кислоты с эти-ниларильными и этинилгетарильными заместителями.

В качестве галогеновой компоненты нами были выбраны а-бромпиридин, 5-метил-2-амино-3-иодпиридин и и-иоднитробензол. На основе фенилэтинильного производного бетулоновой кислоты 2 была осуществлена реакция кросс-сочетания с 2-бромпиридином и 5-метил-2-амино-3-иодпиридином в системе PdCl2(PPh3)2, Cul, Et3N. Время реакции для 7 составило 18 ч, для 8 - 15 ч, выходы продуктов этинилирования составили 62% и 67% соответственно. Образования продуктов сочетания по Хеку 9 и 10 не наблюдалось.

Кросс-сочетание

ЛГ-(3 -оксо-20(29)-лупен-28-оил)-

пропаргиламина 3 с и-иоднитробензолом в аналогичных условиях протекало при комнатной температуре в течение 7 ч. Выход дизамещенного ацетилена 11 составил 73%.

Многие диацетиленовые спирты природного происхождения показывают высокую противоопухолевую активность. Поэтому они представляют большой интерес для медицины.

Традиционно важным методом синтеза диацетиленовых производных является кросс-сочетание по Ходкевичу-Кадио. Этим методом синтезированы многие природные сопряженные бутадиинилкарбинолы.

В условиях реакции Ходкевича-Кадио этинилпроизводного 2 с диметил-3-бромпропинолом получен несимметричный бутадиин 12. Кросс-сочетание проводили в метиловом спирте в присутствии СиС1, Е1:2МН, ЫН2ОН- НС1 при температуре 30-35°С. Выход целевого N-(3-Оксо-20(29)-лупен-28-оил)-4-(5-гидрокси-5-метилгексадиинил-1,3-ил)анилина 12 составил 73%.

о

-4

А

о

_ >н> Ш,ОН1

+ вг с=с-9-он -■—

СН3 СиС1

Щ;ОННС1

О

-ОН

Нами изучен способ получения диацетиленового спирта 12 реакцией Соногаширы в «обратном» варианте, т.е. когда бетулоновый субстрат выступал в качестве галоидной компоненты. Для этой цели был синтезирован иодамид 13 взаимодействием 4-иоданилина с хлорангид-ридом 1 в присутствии триэтиламина с выходом 50%.

Взаимодействие А^-(3-оксо-20(29)-лупен-28-оил)-4-иоданилина 13 с 2-гидрокси-2-метилгекса-3,5-диином в стандартных условиях реакции Соногаширы (PdCl2(PPh3)2, Cul, Et3N, 55°С) приводило к целевому бутадиину-1,3 12 с выходом 56%. Следует особо подчеркнуть, что непосредственное (прямое) введение терминального диацетиленового остатка в ароматическое кольцо - это неочевидная задача. Прежде всего, это связано с лабильностью соединений с концевой диацетиленовой группой.

Важно отметить, что и в этом случае также наблюдалось селективное образование продукта алкинилирования, а продукт алкенилиро-вания (реакция Хека) отсутствует.

Сравнение этих двух альтернативных способов позволяет сделать вывод, что ни один из них не имеет явных преимуществ, и оба они могут быть использованы в синтезе бутадииниллупановых производных.

3. Реакция 1,3-диполярного циклоприсоединения: взаимодействие ацетиленов с алкил(арил)азидами (Click Chemistry)

Ставшие доступными алкины бетулонового ряда позволили нам

изучить возможность синтеза на их основе новой серии биогибридов, используя реакцию Click Chemistry.

Для реакции 1,3-диполярного циклоприсоединения предварительно были синтезированы алкил- и арилазиды. Азиды получали двумя способами. Алкилазиды 14а,b были получены реакцией нуклеофильного замещения атома галогена в алифатических галогенпроизводных на ази-догруппу, а арилазиды 14с,d - диазотированием ароматических аминов нитритом натрия с последующей заменой диазогруппы на азидогруппу.

R-x—1R-Nt 14a-d

Х = —Вг,—С1,—ЫН2

R = -с6н)3, -сн2с6н3, * _О"0СНз

a b СН3 d^

Реагенты и условия: i. NaN3, Ме0Н/Н20 или ДМСО ii. 1 .NaN02, HCl, Н20; 2.NaN3

Реакция терминального ацетилена 2 с алкилазидами 14а,b приводит к 4-замещенным 1,2,3-триазолам. Синтез проводили в толуоле в присутствии CuCl при комнатной температуре в инертной атмосфере. В результате получены продукты 15а,Ь, выходы которых составили 70 и 67% соответственно.

Следует заметить, что для получения 1,2,3-триазолов с ароматическим остатком потребовалось сменить растворитель и повысить температуру реакции. Нагреванием алкина 2 с эквимолярным количеством арилазидов 14с,d в н-бутаноле при 100°С в присутствии хлорида меди (I) выделены соответствующие триазолилпроизводные бетулоновой кислоты 15с (7 ч, 77%) и 15d (4 ч, 88%).

Также, нами осуществлен синтез 1,2,3-триазолов 16a-d взаимодействием алифатического пропаргиламида бетулоновой кислоты 3 с алкил- и арилазидами 14a-d в н-бутаноле с использованием каталитических количеств CuCl при нагревании при П0°С. Реакция протекала без осложнений, выходы продуктов 16a-d достигали 73-82%.

о

а

N

/

в.

ь

с

(1

Успех синтеза простых 1,2,3-триазолов позволил перейти к получению триазолилпроизводных бетулоновой кислоты с более сложной структурой. Как отмечалось в литературном обзоре, актуальным является получение биоконьюгатов. Поэтому нами предпринята попытка получить соединения, включающие остатки бетулоновой кислоты и пептида.

На основе реакции 1,3-диполярного циклоприсоединения осуществлен синтез новой серии тритерпеновых производных, включающих в молекулы фрагменты 1,2,3-триазолопептидов. В рамках совместной работы проф. Ненайденко В.Г. с сотрудниками (МГУ, Москва) были получены пептиды 17а-Г, содержащие азидогруппу. Реакцию проводили в бутаноле-1 при нагревании (110-115°С) 4-9 ч. Выходы продуктов 18а-Г составили 45-57%.

ОМе

Г*

9 101 о>/о. I о у г о

о^Ог"^-1-*.

" о н,-Ч"ноЛнь н I А н

ОМе

Особенностью синтезированных конъюгатов 18анГ является способность образовывать прочные гидраты, что подтверждено элементным анализом. Так, соединение 18(1 представляет собой моногидрат. После высушивания образца в вакууме (2 мм рт. ст.) при 80°С над КОН, аналитические данные подтверждали потерю молекулы воды.

Таким образом, нами разработан эффективный метод синтеза новой группы биогибридов - бетулоновая кислота-1,2,3-триазолилпептиды.

4. Фармакологическая активность новых производных бетулоновой кислоты

В Лаборатории фармакологичеких исследований НИОХ СО РАН

(зав. лаб., д.б.н. Толстикова Т.Г.) получены данные по гепатопротектор-

ной, антиоксидантной и противовоспалительной активностям полученных ацетиленовых производных бетулоновой кислоты.

Биохимический анализ сыворотки крови (табл.2) показал, что в ряду протестированных соединений имеется два 4а и 4е, обладающих значимым гепатопротекторным эффектом. Оба соединения не уступают дигидрокверцетину по выраженности гепатопротекторного эффекта, а основание Манниха 4е, содержащее остаток (+)-псевдоэфедрина превосходит последний, так как достоверно снижает апанинаминотрансфе-разу, которая является маркером цитолиза гепатоцитов. Это же производное 4е проявляет антиоксидантное действие.

Наибольший антиоксидантный эффект в ряду производных бетулоновой кислоты отмечен у соединений 7,15с и 15с1. Триазолилпроиз-водные бетулоновой кислоты 15с и 15(1 превосходят в 1,4 раза рефе-ренсный антиоксидант дигидрокверцетин.

Таблица 2. Влияние производных бетулоновой кислоты на биохимические показатели сыворотки крови мышей _с СС14 гепатитом

Соединение Доза, мг/кг ЩФ, Е/л АЛТ, Е/л АСТ, Е/л ТВАКЗ, мкмоль/л

Контроль - 897.44 144 142.13 2.59

1 50 1208.29 139.89 141.78 1.58

л 4е 50 920 103.13 101.5 2.34

4а 50 856.44 141.89 104.63 1.79

Дигидрокверцетин 100 892.11 139.11 98.25 1.81

При исследовании противовоспалительной активности установлено, что максимальная выраженность эффекта отмечена в группе мышей, получавших Аг-(3-оксо-20(29)-лупен-28-оил)-4-{тУ-метил-Л-[(18,28)-2-(метиламино)-1 -фенил-1 -гидроксипро пил]пропаргин-1 -ил)} анилин 4е, что привело к более заметному снижению отека. Также значительную активность проявило производное 4а. Противовоспалительный эффект этих оснований Манниха превышал таковой у рефе-ренсного соединения - индометацина. Показано, что агент 12 по противовоспалительной активности не уступал индометацину.

Таблица 3. Влияние дизамещенных ацетиленовых производных бетуло-

новой кислоты на индексы отека лапы мышей

Соединение Доза, мг/кг Индекс воспаления, % Величина отека от-но контроля, %

Контроль - 22.1 100

Л 4а 20 13.7 62.0

А ✓чФ^ГСХ »* 'к"1 ГТД- и 4е 20 11.8 53.4

4 rtoSKox НО Mo 12 20 15.9 71.9

Индометацин 20 16.8 76.0

Выводы

1. Получены первые представители ацетиленовых производных амидов бетулоновой кислоты, в том числе, ключевые терминальные ал-кины - ЛГ-(3-оксо-20(29)-лупен-28-оил)-4-этиниланилин и Аг-(3-оксо-20(29)-лупен-28-оил)-пропаргиламин.

2. Осуществлена модификация амидов бетулоновой кислоты на основе терминальных ацетиленов с участием как метанового фрагмента НС=, так и собственно тройной связи С=С:

а) Осуществлена реакция селективного кросс-сочетания терминальных алкинов амидов бетулоновой кислоты с арилгалогенидами в условиях реакции Соногаширы (PdCl2(PPh3)2, Cul, Et3N), приводящая к

дизамещенным алкинам - арил(гетарил)ацетиленил-Л^-(3-оксо-20(29)-лупен-28-оил).

Установлено, что, несмотря на наличие в исходных молекулах лупен-28-оил-4-этиниланилина и лупен-28-оил-пропаргиламина олефи-нового фрагмента, имеет место избирательное алкинилирование соответствующих арил- и гетарилгалогенидов, продуктов алкенилирования (реакция Хека) не обнаружено.

б) Показано, что конденсация Лг-(3-оксо-20(29)-лупен-28-оил)-4-иоданилина с 2-гидрокси-2-метилгекса-3,5-диином, также проходит селективно и приводит к Л'-(3-оксо-20(29)-лупен-28-оил)-4-(5-гидрокси-5-метилгексадиинил-1,3-ил)анилину. И в этом случае продукта самоконденсации по Хеку - сочетания двух исходных молекул не наблюдалось.

в) Это же бутадиинильное производное - Лг-(3-0ксо-20(29)-лупен-28-оил)-4-(5-гидрокси-5-метилгексадиинил-1,3-ил)анилин был получен встречным синтезом, по реакции Ходкевича-Кадио.

3. Проведено сравнительное изучение реакции Манниха в трех её модификациях (1. параформ и вторичные амины, СиС1; 2. параформ, вторичные амины, Си(ОАс)2 и 30% ЬЬБОд; 3. бисаминометаны в присутствии СиС1). Обнаружено, что наиболее оптимальным вариантом является использование бисаминометанов и СиС1.

4. Впервые реализована реакция 1,3-диполярного циклоприсое-динения алкил- и арилазидов в ряду АЦЗ-оксо-20(29)-лупен-28-оил)-4-этинильных производных, протекающая региоселективно с образованием соответствующих только 4-замещенных 1,2,3-триазолов.

5. Выявлена взаимосвязь «структура-активность» при изучении антиоксидантной, гепатопротекторной, противовоспалительной активности синтезированных соединений.

Обнаружено, что три агента обладают комплексным действием. 7У-(3-Оксо-20(29)-лупен-28-оил)-4-{Лг-метил-А^-[(15',25)-2-(метиламино)-1-фенил-1-гидроксипропил] пропаргил-1)}анилин показывает выраженное гепатопротекторное и противовоспалительное действие. М-(3-Оксо-20(29)-лупен-28-оил)-4-(Д iV-диэтштминопропаргил-1 )анилин проявил значительный антиоксидантный, гепатопротекторный и противовоспалительный эффекты, а 7У-(3-Оксо-20(29)-лупен-28-оил)-4-(А'-пиперидинопропаргил-1)анилин обладает выраженным гепатопротек-торным, противовоспалительным действием и потенциальным антиок-сидантным эффектом. Данные соединения по выраженности фармакологических эффектов превосходят или не уступают референсным соединениям (дигидрокверцетин и индометацин).

Основное содержание диссертации опубликовано в работах:

1. Василевский С.Ф., Говди А.И., Шульц Е.Е., Шакиров М.М., Алабугин И.В., Толстиков Г.А. Синтез первых представителей ацетиленовых производных бетулоновой кислоты. // ДАН. -2009. - Т.424. - №5. - С.631-634.

2. Vasilevsky S.F., Govdi A.I., Shults Е.Е., Shakirov M.M., Sorokina I.V., Tolstikova T.G., Baev D.S., Tolstikov G.A., Alabugin I.V. Efficient synthesis of the first betulonic acid-acetylene hybrids and their hepatoprotective and anti-inflammatory activity // Bioorganic Medicinal Chemistry. - 2009. - V. 17. - P.5164-5169.

3. Говди А.И., Сорокина И.В., Толстикова Т.Г., Василевский С.Ф., Толстиков Г.А. Синтез и биологическая активность новых ацетиленовых производных бетулоновой кислоты. // Химия в интересах устойчивого развития. - 2010. - Т. 18. - С.477-482.

4. Vasilevsky S.F., Govdi A.I., Sorokina I.V., Tolstikova T.G., Baev D.S., Tolstikov G.A., Mamatuyk V.l., Alabugin I.V. Rapid access to new bioconjugates of betulonic acid via click chemistry. // Bioor-gatiic Medicinal Chemistry Letters. - 2011. - V.21. - P.62-65.

5. Говди А.И., Василевский С.Ф., Ненайденко В.Г., Соколова Н.В., Толстиков Г.А. Синтез 1,2,3-триазольных конъюгатов бетулоновой кислоты с пептидами на основе 1,3-циклоприсоединения. // Изв. АН. Сер. хим. - 2011. - №11. ~ С.2354-2358.

Основные результаты диссертации докладывались на следующих конференциях:

1. Говди А.И. Алкинилпроизводные пентациклических тритерпе-

ноидов. // Материалы Всероссийской научной молодёжной школы-конференции «Химия под знаком СИГМА: исследования, инновации, технологии» - Омск, 2008. - С.75.

2. Говди А.И. Алкинилпроизводные бетулоновой кислоты. // Химическая наука и образование Красноярья: материалы III научно-практической конференции, посвященной 175-летию со дня рождения Д. И. Менделеева и 140-летию со дня открытия Периодического закона химических элементов Д. И. Менделеева. / Горностаев JI. М. (отв. ред.); КГПУ им. В. П. Астафьева. - Красноярск, 2009.-С. 10.

Vasilevsky S.F., Govdi A.I., Tolstikova T.G., Tolstikov G.A. Efficient synthesis of the first representatives of betulonic acid with triple bonds and their hepatoprotective and anti-inflammatory activity. // 7th International Symposium for Chinese Mcdicinal Chemists (ISCMC-2010) - Kaohsiung Taiwan, 2010. - P.l 19.

Govdi A.I., Vasilevsky S.F. The First Representatives of Acetylenic Derivatives of Betulonic Acid. // 4th Int. Conference. Modern Aspects of Chemistry of heterocycles (CBC-2010) - S-Petersburg, 2010. -P.399.

Vasilevsky S.F., Govdi A.I., Tolstikov G.A. Click Chemistry is Convenient Tool for Preparing of Biological Active New Bioconjugates -Betulonic acid - Heterocycles. // BITs 2nd Annual International Conference of medichem (ICM- 2011). - Beijing China, 2011. - P.147. Vasilevsky S.F., Govdi A.I., Tolstikova T.G., Tolstikov G.A. Synthesis and Pharmacological Properties of New Family of the Betulonic acid - Acetylene Bioconjugates. // II International Symposium on Drug Discovery. - Araraquara, San Paulo, 2011. - P.45.

Формат бумаги 60x84 1/16. Объем 1 печ.л. Тираж 110 экз.

Отпечатано на ротапринте Новосибирского института органической химии СО РАН им. Н. Н. Ворожцова. 630090, Новосибирск, 90, пр.акад. Лаврентьева, 9.

61 12-2/370

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ

УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ХИМИЧЕСКОЙ КИНЕТИКИ И ГОРЕНИЯ СИБИРСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

ГОВДИ АНАСТАСИЯ ИОСИФОВНА

СИНТЕЗ ПЕРВЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ АМИДОВ БЕТУЛОНОВОЙ КИСЛОТЫ С ТРОЙНЫМИ СВЯЗЯМИ, ИХ МОДИФИКАЦИЯ и ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ

02.00.03 - Органическая химия

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: д.х.н., профессор Василевский Сергей Францевич

Новосибирск, 2012

СОДЕРЖАНИЕ

стр

ВВЕДЕНИЕ.................................................................................5

ГЛАВА 1. Синтез и биологические свойства производных амидов бетулиновой и бетулоновой кислот (литературный обзор).........................9

1.1 Синтез амидов бетулиновой кислоты..........................................10

1.1.1 Алифатические амиды......................... ...................................11

1.1.2 Циклические амиды...............................................................19

1.2 Синтез амидов бетулоновой кислоты...........................................20

1.2.1 Алифатические амиды............................................................20

1.2.2 Циклические амиды...............................................................26

1.3 Биологическая активность амидов бетулиновой и бетулоновой кислот.........................................................................................28

1.3.1 Противовирусная активность................................................... .28

1.3.2 Противоопухолевая активность.................................................31

1.3.3 Другие виды активности..........................................................33

ГЛАВА 2. Синтез и свойства ацетиленовых производных бетулоновой кислоты......................................................................................34

2.1 Синтез терминальных ацетиленов бетулоновой кислоты..................35

2.2 Синтез дизамещенных ацетиленовых производных амида бетулоновой кислоты.......................................................................................39

2.2.1 Аминоалкилирование (реакция Манниха)....................................39

2.2.2 Реакции Соногаширы и Ходкевича-Кадио....................................44

2.3 Реакция 1,3-диполярного циклоприсоединения (Click Chemistry)......50

ГЛАВА 3. Фармакологические исследования соединений ряда

бетулоновой кислоты....................................................................59

ГЛАВА 4. Экспериментальная часть...............................................76

4.1 Получение исходных соединений..............................................76

4.1.1 Синтез иодидов и терминальных ацетиленов................................76

4.1.2 Получение бисаминометанов...................................................77

4.1.3 Синтез алкил- и арилазидов......................................................78

4.2 Синтез иод- и ацетиленилпроизводных бетулоновой кислоты...........79

4.3 Свойства ацетиленовых производных амидов бетулоновой кислоты......................................................................................82

4.3.1 Реакция Манниха..................................................................82

4.3.2 Реакции Соногаширы и Ходкевича-Кадио....................................90

4.3.3 Реакция 1,3-диполярного циклоприсоединения (Click Chemistry)......95

4.3.3.1 Взаимодействие амидоацетиленов с алкил- и арилазидами......95

4.3.3.2 Синтез пептидных конъюгатов бетулоновой кислоты............102

ВЫВОДЫ.................................................................................108

ЛИТЕРАТУРА...........................................................................110

Список сокращений:

EDC - этилендихлорид DCC - 1,3-Дициклогексилкарбодиимид HOBt- 1-гидроксибензотриазол гидрат DMAP - 4-диметиламинопиридин

EDCI - 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид гидрохлорид

CDI- 1,Г-карбонилдиимидазол

Вое - mpew-бутилоксикарбонил

DIC - 1,3-диизопропилкарбодиимид

DIPEA - jVyV-диизопропилэтиламин

Met - метионин

Phe - фенилаланин

Ala - аланин

Ser - серии

Glu - глутаминовая кислота ДКВ - дигидрокверцетин МДА - малоновый диальдегид ЩФ - щелочная фосфатаза

TBARS - уровень продуктов пероксидного окисления ACT - аспартатаминотрансфераза AJIT - аланинамитрансфераза

COSY - Correlation Spectroscopy (корреляционная спектроскопия)

NOESY - Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy (спектроскопия с

использованием ядерного эффекта Оверхаузера)

TMSA - триметилсилилацетилен

ДМСО - диметилсульфоксид

ТГФ - тетрагидрофуран

ВВЕДЕНИЕ

Одним из важнейших направлений современной медицинской химии является модификация метаболитов растительного происхождения. В связи с этим особого внимания заслуживают пентациклические тритерпеноиды лупанового ряда и их синтетические производные.

Существенным преимуществом тритерпеноидов является их доступность и низкая токсичность. Удобные методы выделения и наличие в их структуре реакционно-способных функциональных групп определяют перспективность использования соединений этого класса в качестве исходных веществ для различных химических трансформаций [1, 2]. Бетулин, бетулиновая и бетулоновая кислоты, относящиеся к классу лупановых тритерпеноидов, обладают разнообразной биологической активностью, включая противовоспалительное, противоопухолевое, и анти-ВИЧ действия.

Исследования последних двух десятилетий показали, что ацетиленовые соединения являются достаточно представительной группой природных метаболитов, продуцируемых высшими растениями, а также грибами и микроорганизмами. Известно, что многие природные ацетиленовые метаболиты проявляют высокую антираковую активность [3,4].

Кроме того, введение тройной связи в структуру бетулоновой кислоты увеличивает синтетический и прикладной потенциал этих соединений. Среди биологически активных тритерпеноидов особое место занимают азотсодержащие производные. Например, длинноцепочечные амиды бетулиновой и бетулоновой кислот обладают противовирусной и противоопухолевой активностью [1]. Вместе с тем, в литературе отсутствуют данные об ацетиленовых производных амидов бетулоновой кислоты.

В связи с этим, а также с учетом того, что практически важные результаты в поиске противоопухолевых и противовирусных агентов [5] были достигнуты при трансформации заместителей при атоме углерода С28 бетулоновой кислоты, нами предпринята попытка разработать методы

синтеза ацетиленовых производных бетулоновой кислоты. Был намечен синтез производных, содержащих алкиновые фрагменты именно в положение-28 молекулы с последующей модификацией по тройной связи.

Цели работы: разработка методов синтеза ацетиленовых производных амидов бетулоновой кислоты; трансформация алкинилбетулоновых кислот и изучение фармакологической активности полученных соединений.

В данной работе впервые представлены результаты по введению ацетиленовых фрагментов в молекулу бетулоновой кислоты.

Для синтеза ацетиленовых производных амидов бетулоновой кислоты нами выбран способ, заключающийся во взаимодействии хлорангидрида бетулоновой кислоты с заранее приготовленными алифатическими или ароматическими аминами, уже содержащими терминальную этинильную группу.

Синтетическая ценность соединений с этинильной группой определяется как высокой реакционной способностью собственно тройной связи (С=С), так и повышенной СН-кислотностью НС=С-фрагмента, позволяющих легко осуществлять как функционализацию молекулы, так и формирование новых С-С-связей.

Были исследованы реакции, характерные для ацетиленов: Ходкевича-Кадио, аминометилирование по Манниху, кросс-сочетание с арилгалогенидами (реакция Соногаширы), 1,3-диполярное

циклоприсое динение.

1 1

Методами ИК, ЯМР Ни С спектроскопии (в том числе 2D COSY, COLOC, NOESY), масс-спектрометрии надежно охарактеризовано строение всех впервые полученных соединений, состав продуктов реакции подтвержден элементным анализом.

Совместно с сотрудниками Лаборатории фармакологических исследований НИОХ СО РАН (зав. лаб., д.б.н. Толстикова Т.Г.) изучены фармакологические свойства новых производных бетулоновой кислоты.

Данная работа является частью плановых исследований Группы спин-меченых и ацетиленовых соединений Института химической кинетики и горения СО РАН, в рамках темы института: «Химические проблемы создания фармакологически активных веществ нового поколения» номер госрегистрации 01201054123. Также работа выполнена в рамках программы фундаментальных исследований отделения химии и наук о материалах РАН проект 5.9.3. «Химическая модификация природных биологически активных соединений, анализ взаимосвязи структура-активность и отбор потенциально значимых для медицины агентов».

Исследования проводились при поддержке грантов РФФИ № 07-03-00048а (2007-2009), 10-03-00257а (2010-2012); Междисциплинарного гранта СО РАН №53 (2007-2009), №93 (2009-2011); Междисциплинарного гранта РАН 5.9.3. (2009-2011); Интеграционного гранта СО РАН №32 (2006-2008), а также Химического сервисного центра СО РАН.

Работа изложена на 121 страницах печатного текста. Первая глава (литературный обзор) посвящена синтезу и биологическим свойствам амидов бетулиновой и бетулоновой кислот; вторая - изложению и обсуждению результатов собственных исследований; в третьей главе представлены данные о биологической активности полученных соединений; экспериментальные данные приведены в четвертой главе. Завершается рукопись выводами и списком литературы (100 ссылок).

По теме диссертации опубликовано 5 статей (Доклады АН (2009), Bioorg. Med. Chem. (2009), Химия в интересах устойчивого развития (2010), Bioorg. Med. Chem. Let. (2011), Известия АН. Серия химическая (2011)) и тезисы семи докладов, представленных на российских и международных конференциях.

Автор выражает глубокую благодарность академику Толстикову Генриху Александровичу за ценные советы и помощь в процессе проведения работы.

Глубокую признательность автор выражает зав. Лабораторией фармакологических исследований д.б.н. Толстиковой Т.Г. и д.б.н. Сорокиной И.В. за исследование фармакологических свойств полученных соединений.

Автор выражает благодарность зав. лабораторией физических методов исследований к.х.н. Маматюку В.И. и сотрудникам лаборатории за регистрацию спектров ЯМР, масс- и ИК-спектров; зав. лабораторией медицинской химии д.х.н. Шульц Э.Э. за полезные советы и помощь в работе.

Автор благодарит д.х.н., профессора Ненайденко В.Г. (МГУ, Москва) за плодотворное сотрудничество.

Самую глубокую благодарность автор выражает своему научному руководителю, доктору химических наук, профессору Василевскому Сергею Францевичу за предложенную интересную и актуальную тему исследования, за чуткое руководство на всех этапах выполнения настоящей работы. Также автор выражает искреннюю признательность дружному коллективу Группы спин-меченых и ацетиленовых соединений за помощь и поддержку во время проведения исследований.

Глава 1. Синтез и биологические свойства производных бетулиновой и бетулоновой кислот (литературный обзор)

Одним из важнейших направлений современной медицинской химии является модификация метаболитов растительного происхождения [6], молекулы которых содержат два или более структурных фрагмента различного типа [7]. Неудивительно поэтому, что возрастающее внимание уделяется синтетическим трансформациям метаболитов для получения биоконьюгатов, содержащих различные структурные блоки [8, 9].

В связи с этим особого внимания заслуживают растительные тритерпеноиды и их синтетические производные. По литературным данным производные лупана, бетулина, бетулиновой и бетулоновой кислот обладают широким спектром биологической активности, в том числе антиоксидантной, противовоспалительной, гепатопротекторной, среди них обнаружены активные противовирусные и противоопухолевые агенты [1, 2]. Существенным преимуществом тритерпеноидов является низкая токсичность, а наличие в их структуре функциональных групп позволяет использовать соединений этого класса в качестве исходных веществ для различных химических модификаций. Бетулиновую и бетулоновую кислоты получают из бетулина, основным источником которого является внешняя часть коры берёзы, называемой берестой. В экстрактах бересты кроме бетулина также присутствуют его окисленные производные: бетулиновая кислота, бетулиновый альдегид, бетулоновая кислота и др.

Целенаправленная химическая модификация биологически активных лупановых тритерпеноидов приводит в ряде случаев к получению веществ, которые обладают высокой активностью и низкой токсичностью, чем исходные соединения. Большинство работ посвящено синтетическим трансформациям, преимущественно затрагивающим СЗ-, С28- и С30-углеродные атомы кислот лупанового ряда.

з

но

5он 28

3

о

,он 28

Бетулиновая кислота

Бетулоновая кислота

Важным производным бетулиновой кислоты является бетулоновая кислота, которая обнаружила высокую антираковую, антиоксидантную и др. виды активности [8]. Было показано, что простые химические трансформации соединений лупанового ряда, а именно получение амидов и пептидов, приводят к более активным ингибиторам ВИЧ [10]. Поэтому особое внимание уделено синтезу амидов и пептидов бетулиновой кислоты и ее полусинтетического аналога - бетулоновой кислоты.

В связи с этим, в настоящем литературном обзоре, учитывая цель и задачи данной работы, рассматриваются методы получения амидов бетулиновой и бетулоновой кислот, а также приводится краткое описание их биологической активности.

Синтез пептидных соединений, содержащих в своей молекуле бетулиновый фрагмент, является актуальным для получения нового класса биологически активных веществ.

Наиболее часто для синтеза амидов используют ацилирование аминов галогенангидридами, ангидридами и сложными эфирами. В качестве аминной компоненты при получении амидов в основном применяют алифатические и циклические амины.

1.1 Синтез амидов бетулиновой кислоты

1.1.1 Алифатические амиды

Для введения аминокислотных фрагментов в молекулу бетулиновой кислоты используют либо хлорангидрид 3 -О-Ас-бетулиновой кислоты, либо непосредственно бетулиновую кислоту. В качестве растворителей, как правило, применяют хлористый метилен, а в некоторых случаях ДМФА. Наиболее простым способом получения амидов является конденсация хлорангидрида с аминами в присутствии органического основания, например, триэтиламина.

При проведении целенаправленного контролируемого синтеза пептидов необходима предварительная временная защита всех (или некоторых) функциональных групп, которые не участвуют в образовании пептидной связи, а также предварительная активация одной из компонент пептидного синтеза. После окончания синтеза защитные группы, чаще всего, удаляют.

В середине 90-х годов появились сообщения, посвященные получению амидов бетулиновой кислоты, которые проявили значительную противовирусную активность. В патенте, опубликованном в 1993 году [11], описан обширный ряд моно- и дипептидов бетулиновой кислоты, из которого стоит выделить соединение 3 (RPR 103611), полученное в пять стадий из бетулиновой кислоты, обладающее высокой анти-ВИЧ активностью [12].

Ряд работ [10-12] посвящен описанию синтеза амидов бетулиновой кислоты, где в качестве исходного соединения использовали 3-(3-ацетокси-20(29)-лупен-28-оил хлорид 4 в присутствии небольшого избытка Е13М. В результате были получены соединения 5-15 с различными заместителями при 28 атоме углерода [13].

Схема 1

Введением соединения 4 в реакцию с метиловыми эфирами 2-амино-4-метилпентановой (лейцин) и 8-аминооктановой кислот в присутствии Е13Ы (1.2 эквивалента, комнатная температура) были выделены амиды 6, 7 (80, 98%) [14]. В аналогичных условиях были получены соединения 8 а-1 и 9-15 с выходами 39-91% [15].

При получении биологически активных пептидов необходимое условие - предотвращение рацемизации аминокислот на всех этапах пептидного синтеза. Для этих целей используют 1-гидроксибензотриазол гидрат (НОВ1;). Так, авторами [16] осуществлен синтез производного бетулиновой кислоты с фрагментом метилового эфира Ь-лейцина 16 в присутствии 1.5-кратного избытка НОВ! и ЕЭС (этилендихлорид), выход которого составил 75%.

13

Схема 2

Л

АсО

п = 2, 7, 10

Характерно, что при введении аминокислот, содержащих 2, 7 и 10 метиленовых групп, эти же авторы использовали другие условия для проведения синтеза (без добавления НОВ1;). Так, к смеси аминоэфира, 1.5-кратного избытка 4-диметиламинопиридина (БМАР) и К2С03, безводных триэтиламина и пиридина в сухом хлористом метилене добавляли хлорангидрид 4 (0.8 экв.). Выходы продуктов 17-19 составили 65-76% [16].

В отличие от выше сказанного, для введения аминокислотных остатков, содержащих 7 и 10 метиленовых звеньев, в молекулу бетулиновой кислоты в работе [17] используют другие органические основания.

Схема 3

Л

Л

АсО

COCI

АсО

R

i H2N-R-COOMe/HOBt/Et3N (или Et2NH)/CH2Cl2, или H2N-R-COOMe/HOBt/CH2Cl2, комнат.темп.

R= а—NH(CH2)l0COOMe b—NH(CH2)7COOMe

с -NH

Взаимодействие хлорангидрида 3-ОАс-бетулиновой кислоты с метиловыми эфирами 2-амино-4-метилпентановой (Б-лейцин), 11-аминодекаиовой и 7-аминогептановой кислот происходит в присутствии НОВ! и триэтиламина. Выходы аминоконъюгатов 20 а-с, содержащих сложноэфирную группу, составили 16-70% [17].

Наиболее важные способы образования пептидной связи и осуществления реакции в растворе - методы с применением активированных эфиров, смешанных ангидридов, карбодиимидный и азидный метод. Карбодиимидный метод образования пептидной связи предусматривает использование в качестве конденсирующих реагентов - различные замещенные карбодиими