Закономерности антиоксидантного действия природных и синтетических тритерпеноидов ряда лупана и β-амирина тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

На правах рукописи

ЦЫМБАЛ ИРИНА НИКОЛАЕВНА

ЗАКОНОМЕРНОСТИ АНТИОКСИДАНТНОГО ДЕЙСТВИЯ ПРИРОДНЫХИ СИНТЕТИЧЕСКИХТРИТЕРПЕНОИДОВ РЯДА ЛУПАНА И р-АМИРИНА

02.00.04 - Физическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Тюмень, 2004

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Тюменская государственная медицинская академия Минздрава России

Научный руководитель:

доктор химических наук,

профессор Сторожок Надежда Михайловна

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор,

заслуженный деятель науки РФ Разумовский Станислав Дмитриевич

доктор химических наук, профессор Щипаное Владимир Павлович

Ведущая организация:

Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ТюмГНГУ.

Автореферат разослан « 27 » ноября 2004 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, доктор химических наук, профессор

И.Г. Жихарева

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. В последние десятилетия антиоксиданты широко используются для предотвращения окислительной деструкции органических материалов различного назначения: топлива, смазочных масел, пластических масс, лекарственных и косметических препаратов, липидсодержащих пищевых продуктов. Новые высокоэффективные ингибиторы окисления выделяют из природных объектов, синтезируют путем химической модификации структур известных соединений.

В последние годы получены синтетические производные ряда природных тритерпеноидов. К ним относят производные глицирретовой кислоты, выделяемой из корней солодки, бетулоновой кислоты, присутствующей в коре березы (бересте).

Тритсрпеноиды природного происхождения, а также их химически модифицированные аналоги привлекают внимание как перспективные противовирусные средства. Выявлена их потивовоспалительная и противоязвенная активность /Y. Shingo et al., 1989; Н.И. Петренко и яр., 2000; О.Б. Флехтер и др., 2002/, гепатопротекторные и гиполипидемические свойства /А.С. Иванов 1987; Ю.К. Василенко и др., 1994; Banskota Arjun Hari ct al., 2000/ противоопухолевое действие /Takao Konoshima et al., 1987; M.L. Schmidt ct. al., 1997/, противовирусная активность /R. Pompei et al., 1980, Fujioka Toshihiro et al., 1994; Fumio Hashimoto et al., 1997/.

С целью получения активных антивич - агентов в Новосибирском Институте органической химии им. Н.Н. Ворожцова СО РАН синтезированы индивидуальные дипептидные производные бетулоновой и глицирретовой кислот /Н.И. Петренко и др., 2000; А.Г. Покровский и др., 2001/. Показано, что введение аминокислотного фрагмента в структуру тритерпеноидов способствует ингибированию репродукции вируса в клеточных структурах /R. Pompei et al., 1979; М. Ito et al., 1987; J.-F. Mayaux et al., 1994; Fumio Hashimoto et al., 1997/.

Сведения об антиоксидантной активности тритерпеноидов ограничены. Так, показано проявление ингибирующего действия у экстрактов корня солодки /СИ. Гусейнова, 1998; Г.Г. Гарифуллина и др. 2002/. Установлено, что глицирретовая и глицирризиновая кислоты тушат люминесценцию синглентного кислорода /Н.Н. Кабальнова и др. 2002/. На модели острого токсического гепатита in vivo установлено ингибирование окисления липидов печени крыс тритерпеновыми соединениями коры березы /Ф.С. Зарудий и др. 1998/. Показаны антиоксидантные свойства бетулоновой кислоты, ее метилового эфира и атанинамидного производного /И.В. Сорокина и др. 2003/.

Как видно, данные об ингибирующем действии тритерпеноидов преимущественно относятся к сумме действующих веществ, выделяемых из природных объектов. В литературе отсутствуют систематические исследования индивидуальных тритерпеноидов ряда лупана и р-амирина, не выявлена взаимосвязь строения и их ингмиимуюшей акжвности^ не изучена роль

различных характеристических групп. Механизм ингибирующего действия тритерпеноидов не исследован.

В природных объектах тритерпеноиды присутствуют в композициях с биоантиоксидантами (а-токоферолом, флавоноидами, хинонами), однако не известны данные о характере их совместного ингибирующего действия.

В связи с вышеизложенным, изучение кинетики и механизма ингибирующего действия ряда индивидуальных тритерпеноидов и их функциональных производных при окислении классических модельных систем представляет немаловажный теоретический и практический интерес.

Целью работы являлось изучение закономерностей ингибирующего действия индивидуальных производных бетулоновой и глицирретовой кислот, исследование взаимосвязи между строением и антиоксидантной активностью, установление кинетических эффектов совместного действия тритерненоидов и основного природного антиоксиданта а-токоферола.

Задачи исследования:

1. Исследовать кинетику окисления модельного субстрата (метилолеата) в присутствии производных тритерпеноидов ряда (5-амирина (I) и лупана (П-Х) при различных способах инициирования процесса.

2. Изучить характер зависимости брутто-ингибирующего действия от концентрации исследуемых соединений

3. Хсмилюминесцентным методом изучить антирадикальную активность дипептидных производных тритерпеноидов (ЦГ).

4. Оценить роль различных фрагментов молекулы в обеспечении брутто-ингибирующего действия дипептидов глицирретовой (I) и бетулоновой кислот (II).

5. Исследовать кинетику совместного антиоксидантного действия дипептидов глицирретовой и бетулоновой кислот с а-токоферолом.

6. Изучить характер и механизм совместного ингибирующего действия а-токоферола с природными хинонами (убихиноном Q10. филлохиноном, токот риенолхиноном).

Научная новизна. В работе впервые исследованы антиоксидантные свойства индивидуальных тритерпеноидов: метилового эфира №-^-[3-ацетокси-Ц-оксо-12-олеанен-29-оил]-9-аминонаноил}-3-амино-3-фенилпропионовой кислоты (I); метилового эфира №-^-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оил]-9-аминонаноил}-3-амино-3-фенилпропионовой кислоты (II); бетулина (луп-20(29)-ен-3,28-диол) (III); 3-ацетоксибетулина (3-ацетокси-луп-20(29)-ен-28-ол) (IV); 28-ацетоксибетулина (28-ацетокси-луп-20(29)-ен-3-ол) (V); 3,28-диацетоксибетулина (3,28-диацетокси-луп-20(29)-ен) (VI); 3-оксобстулина (3-оксо-луп-20(29)-ен-28-ол) (VII); метилового эфира бетулоновой кислоты (метилового эфира 3-оксо-луп-20(29)-ен-28-оил) (VIII); метилового эфира бетулиновой кислоты (метиловый эфир 3-гидрокси-луп-20(29)-ен-28-оил) (IX); метилового эфира К-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оил]-2-аминоуксусной кислоты (X).

Установлены диапазоны концентраций, соответствующие проявлению максимальной антиоксидантной активности соединений. Методом хемилюминесценции показано, что дипептидные производные глицирретовой и бетулоновой кислот (I и II) не активны в реакции с пероксильными радикалами. Установлена возможность связывания дипептидом бетулоновой кислоты (II) солей железа в ферри-форме (Fe+2). Выявлена роль различных функциональных групп в обеспечении брутто-ингибирующего действия бетулина (III). Показано, что наибольший вклад вносят первичный С-28- гидроксил (53,9±2,0) %, лупановое ядро за счет изопренилыюго заместителя обеспечивает 27% брутто-ингибирующего действия, вторичный спиртовый С-3-гидроксил -16,3±0,8 %.

Впервые установлено и кинетически изучено проявление эффектов антагонизма в совместном ингибирующем действии а-токоферола с дипептидными производными глицирретовой и бетулоновой кислот, природными хинонами (убихиноном Q10, филлохиноном, токотриенолхиноном). Установлен механизм проявлений неаддитивности в действии смеси а-токоферола и коэнзма Q10.

Научно-практическая значимость работы заключается в отборе наиболее эффективных антиоксидантов в ряду производных лупанового ряда. Установлено, что наибольшую антиоксидантную активность проявляют бетулин и дипептид бетулоновой кислоты. Действие дипептидных производных бетулоновой и глицирретовой кислот на 70% превышает эффективность их родоначалыюй структуры (агликона). Установлено, что дипептидные производные тритерпеноидов, природные хиноны (убихинон Q10, филлохинон, токотриенолхинон) способны связывать основной липидный антиоксидант а-токоферол, существенно снижая его ингибируюшее действие в смеси с указанными антагонистами. Обнаруженный нами эффект позволяет рассматривать пептиды тритерпеноидов, равно как и хиноны, в качестве перспективных средств медикаментозного воздействия на состояние антиоксидантной системы опухолевых клеток.

Показаны направления химической модификации структур исследуемых соединений с целью направленного синтеза высокоэффективных антиоксидантов ряда пептидных производных тритерпеноидов.

Материалы и методы исследования. В работе использовали манометрический метод поглощения кислорода, метод хемилюминесценции, метод ИК-спектроскопии, йодометрический метод определения количества гидропероксидов. Статистическую обработку результатов проводили с определением достоверности различий по критерию Стьюдента.

Исследуемые тритерпеноиды были синтезированы в институте органической химии (НИОХ) им. Н.Н. Ворожцова СО РАН; использовали а-токоферол и дибунол фирмы «Serva» (США); метилолеат, синтезированый в НИОХ СО РАН и очищенный перегонкой под вакуумом при остаточном давлении 5 мм рт. ст. В качестве модельных соединений применяли пептиды: карнозин фирмы «Serva» (США) и глутатион фирмы «Reanal» (Венгрия);

хиноны фирмы «Serva» (США): токотриенолхинон, филлохинон и убихинон. Растворителями служили хлорбензол и четыреххлористый углерод, очищенные методом простой перегонки.

Апробация работы. Основные результаты работы представлены на международной конференции «Свободнорадикальные процессы: экологические, фармакологические и клинические аспекты» (г. Санкт-Петербург, 1999 г.); VI Международной конференции «Биоантиоксидант» (г. Москва, 2002 г.); X Российском Национальном конгрессе «Человек и лекарство» (г. Москва, 2003 г.); IV Конгрессе молодых ученых «Науки о человеке» (г. Томск, 2003 г.); международном симпозиуме «Медицина и охрана здоровья» (г. Тюмень, 2000, 2001, 2004 гг.); межвузовской научной конференции "Актуальные проблемы теоретической, экспериментальной и клинической медицины" (г. Тюмень, 2001,2002,2003,2004 гг.).

Публикации. Основной фактический материал и выводы диссертации опубликованы в 15 работах (8 статей и 7 тезисов докладов).

Положения, выносимые на защиту:

1. Особенности зависимости эффективности ингибирующего действия от концентрации тритерпеноидов в модельной системе окисления.

2. Количественная оценка вклада различных фрагментов в брутто-ингибирующее действие структуры бетулина в целом. Оценка роли дипептидного фрагмента.

3. Влияние тритерпеноидов на кинетику накопления гидропероксидов.

4. Эффекты антагонизма в совместном ингибирующем действии а-токоферола с дипептидными производными бетулоновой и глицирретовой кислот. Моделирование действия дипептидного фрагмента тритерпеноидов с использованием карнозина и глутатиона.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 147 страницах текста, содержит 10 таблиц, 22 рисунка. Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, списка литературы, приложения.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Исследование антиоксидантной активности аминокислотных производных бетулоновой и глицирретовой кислот

Характеристика объектов исследования

В качестве объектов исследования использовали группу природных и синтетических тритерпеноидов лупанового ряда (II-Х), дипептидное производное глицирретовой кислоты (I), принадлежащее к ряду р-амирина. Формулы исследуемых веществ представлены на схеме 1.

Схема 1

ФОРМУЛЫ ИССЛЕДУЕМЫХ ТРИТЕРПЕНОИДОВ ГР 6 рн о

АсО

I

дгк

метиловый эфир М'-{М-[3-ацстокси-11-оксо-12-олсапсн-29-оил]-9-аминонаноил'гЗ-амино-З-фснилпропионовой кислоты

^-МН(СН2)8-^-МН-СН-СН2-и-ОМв

о о ри о

II (ДБК)

метиловый эфир N'-{N-[3-0X00-20(29) -лупен-28-оил]-9-амиионаноил}-3-амино-3-фенилпропионовой кислоты

ноСС^

III

бетулин (луп-20(29)-ен-3,28-диол)

^СН^ОАс

ГУТси.он

АсО^-О

IV

3-ацстоксибстулин (3-ацсто1сси-луп-20(29)-сн-28-ол)

л.

АсО

СИ^Ас

VI

3,28-диацстоксибстулин (3,28-диацетокси-луп-20(29)-ен)

28-ацетоксибстулин (28-ацетокси-луп-20(29)-сн-3-ол)

/УУсн.он VII

3-оксобетулин метиловый эфир бетулоновой кислоты

(3-оксо-луп-20(29)-сн-28-ол) (метиловый эфир 3-оксо-луп-20(29)-сн-28-

оил)

оОТ^

VIII

IX

метиловый эфир бетулиновой

кислоты (метиловый эфир 3-гидрокси-луп-20(29)-ен-28-оил)

Отличия в химическом строении изучаемых соединений связаны с природой характеристических групп в положении С-3 и С-28 лупанового ядра. При этом одни вещества содержат свободные гидроксильные (спиртовые) группы в положении С-3 (III, V, IX), а другие - в положении С-28 (III, IV, VII). У некоторых соединений указанные группы ацилированы либо в положении С-3 (IV, VI), либо в положении С-28 (V, VI). В структурах VIII, IX в положении С-17 присутствует сложноэфирная группировка, у веществ I, II, X в этом положении находится амидный (X) или полипептидный фрагмент (I, II). Выделяется также ряд тритерпеноидов, имеющих 3- оксо - группу (II, VII, VIII, X).

Соединения I и II (производные глицирретовой и бетулоновой кислот) принадлежат к разным классам тритерпеноидов, у которых кольцо Е представлено циклогсксаном или циклопентаном (ряд р-амирина и лупана соответственно). Вещества I и II наиболее близки между собой по набору различных характеристических групп, их отличает между собой лишь различное расположение двойной связи: в С-12 и С-20 в положениях, а также оксо-группы - в С-11 и С-3 положениях соответственно. При этом необходимо отметить, что в производном р-амирина (I) двойная связь и оксо-группа сопряжены между собой.

Наличие в коллекции разнообразных структур тритерпеноидов позволяло установить взаимосвязь строения и эффективности их ингибирующего действия, выявить роль различных групп (гидрокси- и оксо-групп, двойной связи), значимость в процессе окисления сложноэфирного и пептидного фрагментов молекулы.

Действие индивидуальных тритерпеноидов сравнивали с ингибирующей активностью известных природных или синтетических антиоксидантов. Реперными ингибиторами окисления служили известные фенолы: дибунол (XI), а-токоферол (XII). В качестве соединений, моделирующих действие оксо-групп, использовали ингибиторы хиноидного строения: токотриенолхинон (XIII), филлохинон (IX), убихинон (XV). Модельные пептиды: карнозин (XVI) и глутатион (XVII) позволяли выявить роль пептидного фрагмента в структурах I и II. Формулы используемых в работе реперных антиоксидантов и модельных веществ приведены на схеме 2.

X

метиловый эфир К'-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оил]-2-аминоуксусной кислоты

Схема 2

ФОРМУЛЫ РЕПЕРНЫХ АНТИОКСИДАПТОВ И МОДЕЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ ОН

Ме

XI

дибунол 2,6-дитрет.бутил-4-мстилфенол

Ме

Ме

Ме

XIII

токотриенолхинон о

МеОуА^Ме

НО.

Ме

Ме^ Ме

Ме

Н

XII

а-токоферол 2,5,7,8 тетраметил 2(4,8,12 триметилтридецил) хроман-6-ол

XIV

филлохинон (витамин К1)

н^-снг-снг-с-ын-сн-сч;-^

о соон м

XV

У'бИХИНОН (КОЭЛЗИМ Ою)

З-декапренил-5,6 диметокси-2-

метилхинон

XVI

карнозин (р-аланилгистидин)

НООС-СН-(СН2)2-С-Ж-СН-С-ЫН-СН2-СООН Й г.я. сЬ

ын0

сн^ Эн

XVII глутатион (у-глутамилцистеинилглицин)

В настоящей главе представлены результаты тестирования ингибирующего действия дипептидных производных глицирретовой (ДГК) и бетулоновой кислот (ДБК) (см. формулы веществ I и II) при различных способах инициирования окисления.

Соединения представляют собой гибридные структуры производных р-амирина и лупана, включающих полициклический углеводородный скелет с п-связью, оксо-группу в положениях 11 или 3, а также идентичный длинноцепочечный дипептидный фрагмент. Исследуемые соединения дифильны, в их структурах выделяется неполярный тритерпеноидный фрагмент и полярная часть, представленная длинноцепочечным дипептидным остатком.

В присутствии тритерпеноидов I и II изучали кинетику инициированного окисления модельного липида метилолеата (МО) в среде неполярного растворителя хлорбензола при их соотношении 1:4. В данных условиях окисление МО инициировали за счет термического разложения азосоединений (схема 3) при 333 К. Образующиеся радикалы г" в последующем вымениваются на радикалы ЯО^субстрата RH.

Схема 3

Ингибирующее действие тритерпеноидов исследовали также в микрогетерогенной среде, образованной добавками поверхностно-активного вещества (ПАВ) додсцилсульфата натрия и воды. Концентрация ПАВ в опытах соответствовала критической концентрации мицеллообразования, установленной экспериментально (1,04х10-3 М). Микрогетерогенность системы с ПАВ была подтверждена методом электронной микроскопии.

Известно, что в водно-органических системах формируются обращенные мицеллы /В.Н. Бакунин и др., 2001/, в структуре которых дифильные молекулы тритерпеноидов ориентированы полярными фрагментами к водной фазе В микрогетерогенной системе процесс инициировали солью железа (по механизму реакции типа Фентона, протекающей по схеме /У. Прайор, 1979/): «ЮН + Ре2* —► Ре* + 1*0'+ ОН"

Было показано, что ДГК (I) и ДБК (II) ингибируют процесс окисления как в гомогенной, так и в мицеллярной системе (рис.1). При этом брутто-ингибирующее действие соединений зависит от условий окисления. Ингибирующий эффект дипептида бетулоновой кислоты (ДБК) в мицеллярной системе в 1,6 раза выше, чем при окислении в среде неполярного растворителя хлорбензола. Значение АОА, оцениваемое отношением периодов индукции окисления МО с исследуемым веществом и без него, составила 3,6 и 2,2 в упомянутых выше системах, соответственно. Обнаруженные различия обусловлены, по всей вероятности, способностью алкилсульфатов разрушать гидропероксиды в растворах органических растворителей без образования свободных радикалов /А.А. Голявин и др. 2003/.

Были изучены особенности зависимости ингибирутощего действия тритерпеноидов от их концентрации в системе окисления. Для каждого из исследуемых веществ получены сходные по характеру концентрационные кривые. Показано, что при окислении в среде хлорбензола на концентрационной кривой действия веществ обнаруживается предел (рис. 2). При окислении МО максимальное ингибирующее действие дипептидов глицирретовой (I) и бетулоновой (II) кислот, определяемое в точке экстремума

кривых рис. 2, соответствовало концентрациям 8,0x10 и 2,5х10 М. Было показано, что дальнейшее увеличение количества веществ не сказывалось на величине эффекта (рис.2). Следует отметить, что аналогичный характер зависимости установлен для холестерина и бетулина (III), включающих в своей структуре неполярный полициклический углеводородный скелет и гидрофильные ОН-группы (рис.3). У ДГК (I) и ДБК (II) к полициклическому скелету примыкает полярный дипептидный фрагмент. Общность формы концентрационных кривых обусловлена дифильными свойствами соединений, которые при определенных концентрациях могут формировать мицеллы с локализацией полярных групп внутри сложной надмолекулярной структуры.

Концентрационная зависимость дипептида бетулоновой кислоты (II) при окислении в водно-органической системе имела колоколообразный характер с диапазоном эффективных концентраций (5,0 - 12,0)* 10-4 М, свыше которых происходит снижение ингибирующего действия (рис.4). Особенности указанной зависимости обусловлены, вероятно, формированием обращенных мицелл, в которых активные пептидные группы «упрятаны» внутрь микрореактора. Предложенная концепция позволяет объяснить закономерное ослабление брутто-ингибирующего действия с ростом концентрации тритерпеноидов.

С учетом общеизвестных представлений о механизме действия антиоксидантов можно было полагать, что наблюдаемые эффекты ингибирования окисления МО в присутствии ДГК и ДБК связаны с гибелью пероксильных, алкильных или алкоксильных радикалов. В связи с этим исследовали антирадикальную активность ДГК (I) и ДБК (II) методом термохемилюминесненции в модельной реакции инициированного окисления кумола. Торможение этой реакции обусловлено непосредственным взаимодействием АО с пероксильными радикалами (реакция 7, согласно общепринятой схемы). Было показано, что введение в систему окисления ДГК или ДБК не вызывало заметного снижения интенсивности хемилюминесценции и появления периодов индукции. На основании этих данных можно заключить, что ДГК и ДБК не активны в реакции с пероксильными радикалами (К02 ').

Представляло интерес сопоставить между собой действие исследуемых соединений и известных природных и синтетических АО. В одних и тех же условиях окисления было протестировано брутто- ингибирующее действие сравнимых концентраций дипептидов глициррстовой, бетулоновой кислот, а-токоферола, астаксантина, Р-каротина, дибупола, убихинона (табл.1).

Таблица 1

Эффективность действия антиоксидантов различного строения

№ п/п Название АО Ть мин Д1=т, -Тмо, мин АОА=т/тмо

1 а-токоферол 164,2±2,5 137,2 6,1

2 дибунол 156,4±3,1 129,4 5,8

3 астаксантин 102,8±2,3 75,8 3.8

4 ДБК 60,2+1,1 33,2 2,2

5 Р-каротин 42,1+0,8 15,1 1,6

6 убихинон 40,0+0,6 13,0 1,5

7 ДГК 37,1+0,6 10,1 1,4

Р<0,02

•условия окисления приведены в подписях к рис.1; С(ЛО)=соп51=2,5хЮ"4М,

Из данных, представленных в табл. 1 видно, что действие изучаемых веществ (ДГК и ДБК) сравнимо с активностью Р-каротина, убихинона, но существенно уступает эффективности а-токоферола, дибунола, астаксантина. Таким образом, исследуемые соединения не могут составить альтернативы известным природным и синтетическим антиоксидантам в качестве стабилизаторов окисления субстратов липидной природы.

Глава 2. Роль различных фрагментов молекулы дипептида бетулоновой кислоты в процессе окисления липидов

В главе представлены результаты сравнительного изучения ингибирующей активности девяти представителей ряда лупана (11-Х). Действие веществ тестировалось при двух концентрациях, расположенных в диапазоне

их максимальной эффективности (табл. 2). Из табл. 2 следует, что наибольшие эффекты торможения процесса окисления МО отмечаются для ДБК, включающего СЗ-оксо- и С-17-дипептидную группы, а также бетулина, сочетающего в своей структуре два спиртовых гидроксила: 3-ОН и 28-ОН. При сравнимых концентрациях эффективность ДБК в 1,7 раза превышает действие бетулина.

Таблица 2

Периоды индукции для различных структур тритерпенодов лупанового ряда

Тмо =26 мин., [АИБН] = 3 * 10'" М, Т = 333 К

.-Л „М. „Ме

Структура заместителей Концентрация тритерпенодов х Ю"4, М

С = 5,0 С= 10,0

Я: Дт= т, - тмо, мин. Дт/тмо х100% Дт= т, - Тмо, мин. Дт/тМо х100%

II =0 -СОКН(СН2)8СОШ СН(Р11)СН2С00Ме 34,0 130,8 33,0 126,9

III -ОН -СН20Н 19,3 74,2 19,4 74,6

IV -ОАс -СН20Н 15,2 58,5 16.0 61,5

V -ОН -СН20Лс 8,5 32,7 9,0 34,6

VI -ОАс -СН20Ас 5,2 20,0 5,5 21,2

VII =0 -СН20Н 17,2 66,2 17.0 65,4

VIII =0 -СООМс 11,0 42,3 11.2 43,1

IX -ОН -СООМе 14,0 53.8 14.5 55,8

X =0 -СОЫНСН2СООМе 10,8 41.5 11.0 42,3

Р < 0,02

Были проанализированы формы полулогарифмических анаморфоз кинетических кривых поглощения кислорода в координатах,Д[0:]/[ЯН] --1п(1-1/т) (рис.5). Показано, что на участке, соответствующем периоду индукции кинетических кривых, обнаруживается два и более излома (рис.5). Для классических фенольных антиоксидантов, например дибунола, включающего в своей структуре лишь один реакционный центр, изломы на анаморфозах кинетических кривых отсутствовали (рис.6).

Приведенные выше данные указывают, что в ингибировании окисления принимают участие несколько реакционных центров, принадлежащих структуре тритерпеноидов. Таковыми могут являться лупановое ядро с изопренильным заместителем в положении С-19 (двойная связь), а также заместители в положениях С-3 (вторичная ОН-группа) и С-28 (первичная 011-

группа). Было показано, что действие этих фрагментов молекулы аддитивно и взаимонезависимо.

В нашем распоряжении имелась достаточно обширная коллекция тритерпеноидов различного строения, среди которых находились соединения, включающие порознь или вместе указанные выше характеристические группы. В связи с этим методом химического моделирования количественно оценивали вклад каждого фрагмента путем сопоставления ингибирующего действия пар соединений с минимальными отличиями в их структуре. Результаты показали, что наиболее значимый вклад в брутто-ингибирующее действие структуры бетулина вносит первичный гидроксил С-28-ОН. Его действием определяется (53,9±2,0) % от эффективности всей структуры бетулина в целом. Вклад изопренильного заместителя лупапового ядра составляет (27%), вторичного спиртового С-3-гидроксила - (16,3±0,8) % (диаграмма 1).

Суммарное действие всех вышеназванных фрагментов близко к 100 % (97,2%), что подтверждает тезис об аддитивности действия (простой сумме эффектов) разных заместителей.

Диаграмма 1

Брутто-ингибирующее действие бетулина связано с вовлечением спиртовых групп в процесс окисления. Из литературы известно (Е.Т. Денисов и др., 1975), что при окислении спиртов в соответствии с представленной ниже схемой образуются оксипероксильные радикалы

Я02' + >СН(ОН) -*1юон + >с'он

>С'ОН + 02 -»>С(0Н)00*

В результате происходит выменивание активных радикалов (ЯОг*) на оксипероксильные радикалы. В структуре последних существует внутримолекулярная водородная связь, что снижает активность оксипероксильных радикалов в реакциях продолжения цепей и лишает подвижности -О-О* группу. Это приводит к дополнительному уменьшению энтропии при образовании активированного комплекса. Кроме того, константа скорости кросс-диспропорционирования пероксильных и оксипероксильных радикалов выше константы скорости гомо-диспропорционирования алкилпероксирадикалов, что приводит к усилению брутто-ингибирующего действия (Е.Т. Денисов и др., 1975):

1Ю2' + >С(0Н)00* - иоон + о2 + >с=о

Известно, что способность к окислению спиртовых гидроксилов зависит от стерических факторов. Образование оксипероксильного радикала из первичного спирта происходит с большей скоростью, чем из вторичного /В.Л. Рубайло и др., 1989/. Этим, по всей вероятности, объясняются установленные нами различия в брутто-ингибирующем действии первичного гидроксила у С-28 и вторичного - у С-3 атомов полициклической структуры бетулина.

Эффективность действия изопрепильного заместителя связывали с возможностью присоединения свободных радикалов по двойной связи, присутствующей в структуре соединений лупанового ряда. Реакции такого типа описаны в монографии /ВЛ. Рубайло и др., 1989/.

Среди изученных тритерпеноидов наибольшее брутто-ингибирующее действие проявлял дипептид бетулоновой кислоты (ДБК) (табл. 2). Установлено, что АОА дипептида бетулоновой кислоты по сравнению с родоначальной структурой бстулина (III) выше на 40%. В сравнении с бетулоновой кислотой (VIII) эффективность дипептидов выше на 70% (табл. 2). В связи с этим считали необходимым изучить особенности и механизм действия дипептидого фрагмента молекулы.

Независимым методом химического моделирования изучали роль полипептидной цепи в процессе окисления с использованием модельных соединений. В качестве таковых применяли дипептид - карнозин (XVI) и трипептид- глутатион (XVII) В сравнении исследовали характер концентрационных зависимостей действия дипептида бетулоновой кислоты и модельных пептидов. Были получены идентичные по форме экстремальные зависимости. Показано, что действие глутатиона и карнозина в области наиболее эффективных концентраций было сравнимо между собой. Положение точки экстремума независимо от строения пептида находилось в интервале (2,5 - 7,5)х10-4М (рис.7). Дипептид бетулоновой кислоты превосходил по своему действию бетулоновую кислоту и модельные пептиды (рис.8). Величина периодов индукции ДБК представляла собой простую сумму эффектов

ингибирования тритерпеноидной части и пептидного фрагмента. Эти данные свидетельствовали о том, что действие указанных фрагментов молекулы ДБК аддитивно и независимо.

и а «и «э ¿и \ ■ ' _ ■ ■ • ■„

4 о 2 4 6 8 10 12 и 16 18

С (пептида), 10, М С(АО)хМ\М

Рис. 7 Зависимость периодов индукции от рис8 3а8ИСИМОС11> дов вди от

концентрации пептидов: 1 - глугатиона, 2- концентрации дак (,); эфира ^лотвой

карнозина;Саибн=Зж10 М кислота (2); глугатиона (3);Саибн=3><10-3М.

Роль пептидного фрагмента обусловлена, по всей вероятности, возможностью образования нитроксильных радикалов по реакциям /В.Л. Рубайло и др., 1989/:

>N11 + ЯО:' >N, + ЯООН >РГ + М)2* — >N0" + ЯО'

Нитроксильные радикалы могут взаимодействовать со свободными радикалами разной природы:

>N0* + ^(ЯОг*, Ж)*) -> >N0-1* (молекулярные продукты) >N0-11 + ЯОг* -» >N0" + 1МХЖ (молекулярные продукты)

Каскад реакций с участием нитроксильных радикалов приводит к многократному обрыву цепей окисления.

Таким образом, можно заключить, что действие дипептида бетулоновой кислоты в части влияния пептидных групп связано с образованием нитроксильных радикалов.

Выше было отмечено, что эффективность ДБК в мицеллярной системе превосходило его действие в среде неполярного растворителя хлорбензола. Инициирование окисления, осуществляли за счет реакции типа Фентона:

ИООН + Рег+ —► Ре5* + ИОЧ ОН" В связи с этим полагали, что данный феномен связан либо с возможностью хелатирования катионов Fe+2, являющихся инициаторами окисления, либо со способностью соединений разрушать гидропероксиды с образованием молекулярных продуктов. Экспериментально подтверждали указанные рабочие гипотезы.

Исследовали возможность хелатирования дипептидом бетулоновой кислоты катионов железа в фсрри-форме. Для этого изучили зависимость изменений максимальной скорости окисления от концентраций соли Мора. Было показано, что максимальная скорость окисления возрастает с увеличением количества инициатора (катионов Ге2+) (кривая 1, рис. 9).

Изучили характер той же зависимости при дополнительном введении ДБК в систему окисления, Дипептид бетулоновой кислоты добавляли в концентрации, соответствующей его максимальному ингибирующему действию (5x10^ М). Было установлено, что присутствие ДБК снижает величину этого кинетического параметра (кривая 2, рис. 9). Сопоставление зависимостей 1 и 2 рис. 9 показывает, что кривые практически параллельны друг другу. Различия между значениями максимальной скорости окисления в отсутствии и в присутствии ДБК (при одной и той же концентрации инициатора) могут быть обусловлены хслатированием катионов инициатора.

Полагали, что связывание катионов железа происходит с участием пептидной группы. Для подтверждения этого тезиса в тех же условиях была изучена зависимость максимальной скорости окисления от концентрации соли Мора в присутствии постоянной концентрации модельного пептида глутатиона. Структура глутатиона, как и дипептида бетулоновой кислоты, включает две пептидные группы. Сравнение представленных на рис. 9 зависимостей, иллюстрирующих действие ДБК и глутатиона, показало практически полное их совпадение. Эти данные доказывают способность дипептидов связывать катионы железа в ферри - форме

Считали, что снижение скорости поглощения кислорода могло быть связано не только с хелатированием катионов железа, по и конкурентным разрушением гидропероксидов на молекулярные продукты. В связи с этим исследовали кинетику накопления гидропероксидов в присутствии ДБК. Было показано, что ДБК в диапазоне (0.05 - 1,0)х10-2М не влияет на скорость их накопления в системе. В сравнении было исследовано действие глутатиона. Было установлено, что глутатион разрушает гидронероксиды лишь при высоких исходных концентрациях, превышающих 0,01 М (рис.10).

2 3 4 5 в о io Ibo 1б0 2Í» 2S0 3t» 3S0 4¡X> 460

С (соли Мора) х ю', М t.Mim.

Рис. 9 Зависимость скорости поглощения Рис.10 Кинетические кривые разрушения

кислорода МО от концентрации соли Мора: гидроперекисей при аутоокислении (М0>-

МО(контроль)(1); МО+ДБК(2); МО+ (1); смеси МО+ЫО'2 М (ДБК) (2), смеси

глутатион (3); Стсгтиа=соп51=5х10'4М. МО+1хЮ'2М глугатиона (3).

Следует отметить, что в присутствии бетулина происходило достоверное увеличение скорости накопления пероксидов. Этот экспериментальный факт подтверждает литературные данные о том, что спиртовые гидроксилы участвуют в побочной реакции, протекающей по схеме:

>СН-ОН+ 02 - >С=0 + Нг0г Н202 НО' + 'ОН

Образующийся пероксид водорода распадается на свободные радикалы, способствующие вторичному инициированию окисления.

Таким образом, механизм ингибирующего действия ДБК сводится к двум независимым процессам, протекающим с участием пептидных групп. Часть молекул ДБК связывает катионы металлов переменной валентности, а другие образуют нитроксильные радикалы, участвующие в реакциях обрыва цепей. Первый из этих процессов снижает скорость инициирования, а второй -обеспечивает гибель свободных радикалов. Таким образом, в системе окисления, инициированой солью Мора, имеют место обе указанные реакции. При инициировании азососдинениями в среде неполярного растворителя хлорбензола ингибирование связано с образованием нитроксилов, многократно обрывающих цепи окисления. Указанные особенности механизма ингибирования объясняют различия в эффективности тритерпеноидов при разных условиях окисления.

На основании приведенных выше результатов может быть предложено осуществление направленного синтеза с целью химической модификации структуры ДБК или ДГК, позволяющей усилить их антиоксидантные свойства. В полипептидном фрагменте структуры ДБК и ДГК имеется бензольное кольцо, на основе которого может быть получен пространственно затрудненный фенол, проявляющий высокую активность в реакции с пероксильными радикалами. В результате может быть синтезирован антиоксидант с высокой эффективностью ингибирования, поскольку в молекуле появится дополнительный реакционный центр, участвующий в гибели пероксильных радикалов.

Глава 3. Изучение совместного антиоксилантного действия а-токоферола с дипептидными производными тритерпеноидов и хинонами

Считали привлекательным усилить ингибируюшее действие дипеитидов бетулоновой и глицирретовой кислот за счет дополнительного введения в систему окисления природного антиоксиданта - а-токоферола ( а-ТФ). В связи с этим исследовали кинетику ингибированного окисления МО в присутствии бинарных смесей, включающих ДБК (или ДГК) и а-токоферол.

Установлено, что ингибирующее действие смеси было значительно ниже, чем простая сумма периодов индукции индивидуальных составляющих

(1т-,). Выполнялось неравенство Т£.< 2д,. Полученные данные свидетельствовали о проявлении эффекта антагонизма в совместном ингибирующем действии композиции тритерпеноидов и фенольного антиоксиданта.

Величину эффектов антагонизма количественно оценивали по разнице периодов индукции (Дт = т^ - 1т,). В наших экспериментах величина Дт всегда принимала отрицательные значения и количественно характеризовала потерю эффективности смеси по сравнению с аддитивным действием компонентов. Величину эффекта антагонизма выражали в относительных единицах Дх/Тт.хЮО, %.

Была изучена зависимость величины антагонизма от количества в системе окисления каждого из составляющих смеси. Исследовали кинетику окисления МО, ингибированного смесями ДБК или ДГК, в которых количество второго компонента (фенольного антиоксиданта (а-ТФ) оставалось постоянным. Было показано, что зависимости величины эффекта антагонизма от количества каждого из исследуемых тритерпеноидов однотипны: в области низких концентраций (до 2х10-4 М) величина антагонизма возрастает прямо пропорционально их количеству, в интервале от 2х104 М до 5х10-4 М кривая плавно выходит на плато. Потеря эффективности при совместном действии исследуемых веществ по сравнению с аддитивным действием достигала (55-60)% (рис 11).

При исследовании действия смесей от концентрации -токоферола была выявлена и-образная зависимость (рис. 13). Показано, что при концентрациях, превышающих 1,5х104 М величина антагонизма уменьшалась прямо пропорционально количеству а-токоферола в смеси.

0 2 4 в В 10 12 14

Рис. 11 Зависимость величины антагонизма от концентрации тритерпеноидов в смеси с а-токоферолом: 1 - ДГК; 2 - ДБК; С„.тф=2,5х1 О'М; САибн=Зх 10'М.

Ряс. 12 Зависимость величины антагонизма от концентрации пептидов в смеси с а-токоферолом: 1 - карнозин; 2 - глутатион; С„.тф=2,5х 1 0"4М;Саиьн=ЗхЮ'3М.

00 05 Ю 15 20 25 30 35 40 45 50

Рис.13 Зависимость величины антагонизма от концентрации а-токоферола в смеси ДБК; Сдвк=5хЮ"4М; САиш=Зх10"3М.

Аналогичным образом было изучено совместное действие смесей а-ТФ с карнозином и глутатионом, моделирующим действие дипептидного фрагмента. Было установлено, что характер изменения величины антагонизма от концентрации модельных пептидов и дипептидов тритерпеноидов одинаков (рис. 11,12). Можно видеть, что эффект антагонизма в присутствии глутатиона, включающего две пептидные группы, существенно выше, чем у карнозина, в структуре которого содержится одна пептидная связь. Эффект исследуемых дипептидов тритерпеноидов сопоставим с действием глутатиона. Таким образом, на основании приведенных данных можно сделать вывод, что именно дипептидный фрагмент молекулы ДБК и ДГК обеспечивает проявление эффектов антагонизма в их совместном действии с -ТФ.

Как было отмечено выше, вторичные амины, к которым можно отнести и пептидные группы, способны в ходе окисления образовывать нитроксильные радикалы. В литературе описано, что нитроксильные радикалы могут генерировать свободные радикалы путем отрыва атома Н от молекулы ингибитора по реакции /В.Л. Рубайло и др., 1989/:

>N0" + 1пН —> >N011 + 1п", где 1пН - а-токоферол

В результате фенольный антиоксидант расходуется не в реакции с пероксильными радикалами (реакция 7),

ЯОг* + 1пН —» ЯООН + 1п*

а при взаимодействии с нитроксильными радикалами. Таким образом, реакция между нитроксилом и фенольным антиоксидантом является причиной антагонизма в совместном действии смеси. Тот факт, что кинетика сочетанного действия дипептидов тритерпеноидов и модельных пептидов идентична, подтверждают гипотезу образования нитроксильных радикалов в процессе окисления полипептидов разной природы. В современной литературе, к сожалению, отсутствуют прямые доказательства образования нитроксилов при окислении полипептидов. Вывод о необходимости проведения таких исследований вытекает из результатов настоящей работы.

Обнаруженный нами впервые эффект антагонизма в совместном

ингибирующем действии пептидных производных с а-токоферолом может иметь важное значение для объяснения механизма противоопухолевого и противовирусного действия тритерпеноидов. Известно, что а-токоферол в преобладающих количествах локализуется в опухолевых клетках, обеспечивая ей более высокую антиоксидантную защиту (эффект онкотропии ТФ) /Е.Л. Псйфах и др., 1970; B.C. Данилов и др., 1973/. Авторы исходили из гипотезы о существовании взаимосвязи между скоростью деления клеток и интенсивностью свободнорадикальных процессов окисления. Согласно этим представлениям антиоксиданты, регулирующие интенсивность окисления, являются важным звеном механизма регуляции пролиферативных процессов /Е.Б. Бурлакова, 1981/. Экспериментально подтверждена взаимосвязь между митотической активностью клеток и антиоксидантной активностью их липидов. Имеет место обратная корреляционная связь между антибластической активностью химиотерапевтических препаратов и уровнем антиоксидантов в опухолевой клетке /Е.Б. Бурлакова и др., 1974/. Следуя этой логике, можно предполагать, что вещества, связывающие ТФ, будут проявлять противоопухолевое действие. На основании приведенных в работе данных можно рекомендовать дипептидные производные тритерпеноидов для исследования их противоопухолевого действия.

В работе исследовали сочетанное действие а-ТФ с природными хиионами: убихиноном (коэнзимом ), филлохиноном (витамином ).

токоферилхиноном. В совместном действии указанных веществ, как и в действии смесей а-ТФ с тритерпеноидами, установлено проявление эффекта антагонизма. Кинетические закономерности действия композиций а-ТФ с хинонами разной природы не отличаются от описанных выше смесей с тритерпеноидами. Следует отметить, что ряд хинонов используется в качестве противоопухолевых средств /Е.Л. Обольникова, 1993/. Анализируя приведенные выше данные можно заключить, что химическое связывание а-ТФ, может приводить к ослаблению антиоксидантной защиты опухолевой клетки и способствовать ее гибели за счет усиления интенсивности свободнорадикальных процессов окисления.

Работа поддержана грантом РФФИ 02-04-49452 и контрактом Федеральной целевой программы "Содействие интеграции высшего образования и фундаментальной науки" ("Интеграция") И 0566/1653.

выводы

1. Установлено ингибирующее действие производных ряда лупана: бетулина, 3-ацетоксибетулина, 28-ацетоксибетулина, 3,28-диацетоксибетулина, 3-оксобетулина, метилового эфира бетулоновой кислоты, метилового эфира бетулиновой кислоты, метилового эфира К'-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оил]-2-аминоуксусной кислоты.

2. Показано, что бетулин среди исследуемых соединений обладает наибольшим ингибирующим действием. Зависимость брутто-эффективности от концентрации носит экстремальный характер, обусловленный дифильными свойствами соединения.

3. Проведена количественная оценка вклада характеристических групп в общее брутто-ингибирующее действие бетулина. Показано, что наибольший вклад вносят первичный С-28- гидроксил (53,9±2,0) %, далее в порядке убывания следует лупановое ядро (27%), вторичный спиртовый С-3-гидроксил (16,3±0,8) %. Установлено, что действие различных фрагментов молекулы аддитивно и взаимонезависимо.

4. Установлено, что при аутоокислении бетулина в системе в 2,2 раза ускоряется накопление пероксидов.

5. Показано, что среди природных и синтетических тритерпеноидов наибольшим ингибирующим действием обладают дипептидные производные бетулоновой и глицирретовой кислот. Дипептидный фрагмент молекулы обеспечивает до 70 % их эффективности. Максимальный ингибирующий эффект проявляется при концентрациях 5х10-4 М и 8х10-4 М дипептида бетулоновой и дипептида глицирретовой кислот, соответственно.

6. Установлено, что дипептидный фрагмент молекулы тритерпеноидов бетулоновой и глицирретовой кислот, глутатион способны связывать катионы железа в ферри-форме.

7. Установлено проявление эффекта антагонизма в совместном ингибирующем действии смесей а-токоферола с дипептидными производными бетулоновой и глицирретовой кислот. Показано, что величина антагонизма возрастает с увеличением концентрации дипептидов и уменьшается с ростом количества а-токоферола. Эффект антагонизма в сочетанном действии веществ может достигать 60%.

8. Показан эффект антагонизма в совместном ингибирующем действии а-токоферола с природными хинонами: убихиноном (коэнзимом р10). филлохиноном (витамином К2), токоферилхиноном. Тормозящее действие смеси снижается пропорционально росту количества хинонов в смеси.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Межмолекулярные взаимодействия дипептидных производных тритерпеноидов и природных хинонов с а-токоферолом /Сторожок Н.М., Цымбал И.Н., Петренко Н.И., Шульц Э.Э., Храпова Н.Г., Толстиков Г.Л., Бурлакова Е.Б. //«Биомедицинская химия». - 2003. - №1(49).- С.96-105.

2. Взаимосвязь стр)ктуры и ингибирующего действия аминокислотных производных бетулоновой кислоты Н.М.Сторожок, Цымбал И.Н., Н.И.Петренко, Э.Э.Шульц //«Научный вестник Тюменской медицинской академии» - спец. выпуск «Биоантиоксиданты». - №1(23). - 2003. - С.62-65.

3. Цымбал И.Н. Роль различных фрагментов химической структуры в обеспечении ингибирующих свойств ряда природных и синтетических тритерпеноидов /Цымбал И.Н., Н.М.Сторожок //Медицинская наука и образование Урала. - 2004. - т.33-34. - №3-4. - С.210-211.

4. Цымбал И.Н. Антиоксидантная активность ли пептидных производных тритерпеноидов /Цымбал И.Н. //В сб. материалов юбилейной научной конференции «Актуальные проблемы теоретической, экспериментальной и клинической медицины». - Тюмень. - 2001. - С.58-60.

5. Цымбал И.Н. Кинетические эффекты сочетанного ингибирующего действия тритерпеноидов, убихинона и а-токоферола /Цымбал И.Н //В сб. материалов юбилейной научной конференции «Актуальные проблемы теоретической, экспериментальной и клинической медицины». - Тюмень. -2001.-С.60-61.

6. Цымбал И.Н. Ингибирующее действие дипептида бетулоновой кислоты /Цымбал И.Н. //В сб. материалов Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы теоретической, экспериментальной и клинической медицины». - Тюмень. - 2002. - С.97-98.

7. Цымбал И.Н. Совместное антиоксидантное действие а-токоферола с карнозином и глутатионом /Цымбал И.Н., Н.М.Сторожок //В сб. статей IV международного конгресса молодых ученых и специалистов «Науки о человеке». - Томск. - 2003. - С. 183-184.

8. Цымбал И.Н. Оценка эффективности ингибирующего действия характеристических групп производных ряда лупана /Цымбал И.Н. //В сб. материалов Всероссийской научной конференции молодых ученых «Актуальные проблемы теоретической, экспериментальной и клинической медицины». - Тюмень. - 2004. - С.88-89.

9. К механизму обеспечения антиоксидантного гомеостаза /Сторожок Н.М., Храпова Н.Г., Бурлакова Е.Б.,Пирогов И.О., Луконькин И.Н., Цымбал И.Н. //Тезисы докладов международной конференции «Свободнорадикальные процессы: экологические, фармакологические и клинические аспекты». -Санкт-Петербург. -1999. - С.828-829.

10. Цымбал И.Н. Кинетика и механизм ингибирующего действия природных тритерпеноидов /Цымбал И.Н., Щеглов СВ., Петренко Н.И. /Тезисы международной конференции «Медицина и охрана здоровья». - Тюмень. - 2000. - №4 - С.47.

11. Цымбал И.Н. Антиоксидантная активность производных бетулина Цымбал И.Н., Сторожок Н.М. //Тезисы международной конференции «Медицина и охрана здоровья». - Тюмень. - 2001. -№4. - С.77.

12. К вопросу о механизме антиоксидантной активности пептидных производных бетулоновой кислоты /Цымбал И.Н., Сторожок Н.М., Петренко Н.И., Толстиков ГА. //Тезисы докладов VI международной конференции

«Биоантиоксидант». - М. - 2002. - С.607-609.

13. Цымбал И.Н. Влияние смесей производных тритерпеноидов и а-токоферола на процесс окисления /Цымбал И.Н., Сторожок Н.М. //Тезисы докладов VI международной конференции «Биоантиоксидант». - М. - 2002. -С.606-607.

14. Цымбал И.Н Влияние дипептида бетулоновой кислоты на скорость инициированного окисления /Цымбал И.Н //В сб. материалов Всероссийской научной конференции молодых ученых «Актуальные проблемы теоретической, экспериментальной и клинической медицины». - Тюмень. - 2003. - С.65.

15. Действие пептидных производных тритерпеноидов лупанового ряда в качестве ингибиторов окисления /Н.М.Сторожок, Цымбал И.Н., Н.И.Петренко, Э.Э.Шульц //Тезисы докладов X Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - М.-2003.-С.666-667.

Отпечатано:

625002, г.Тюмень, ул.Осипенко, 81, каб. 711. Тел.: (3452) 462-954, 467-654 тел/факс: 240-340. E-mail: reklama1@sibtel.ru

ЦЫМБАЛ ИРИНА НИКОЛАЕВНА

ЗАКОНОМЕРНОСТИ АНТИОКСИДАНТНОГО ДЕЙСТВИЯ ПРИРОДНЫХ И СИНТЕТИЧЕСКИХ ТРИТЕРПЕНОИДОВРЯДА ЛУПАНА И в-АМИРИНА

02.00.04 - Физическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Отпечатано:

625002, Тюмень, ул. Осипенко, 21. Подписано в печать 25.11.2004г. Тираж 120 экземпляров. Заказ 257

24669

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

ЧАСТЬ ПЕРВАЯ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1 Химическая структура, природные источники тритерпеновых гликозидов

1.2 Общность структуры тритерпеноидов и гормонов

1.3 Биологическая активность некоторых тритерпеноидов

1.3.1 Биологическое действие глицирретовой кислоты

1.3.2 Биологическое действие бетулина и его производных

1.4 Современные представления о механизме свободнорадикального окисления липидов

1.5 Особенности антиоксидантной активности и биологического действия некоторых природных ингибиторов

1.6 Современные представления об эффектах синергизма и антагонизма в совместном действии антиоксидантов

1.7 Антиоксиданты в онкотераиии

1.8 Антиоксидантная активность тритерпеноидов и стероидных гормонов

1.8.1 Ингибирующие свойства женских половых гормонов (эстрогенов)

1.8.2 Антиоксидантное действие тестостерона и прогестерона

1.8.3 Антиоксидантная активность тритерпеноидов 32 ЧАСТЬ ВТОРАЯ (СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ)

2.1 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1.1 Хемилюминесцентный метод определения ингибирующей активности фенольных антиоксидантов

2.1.2 Метод ИК-спектросконии

2.1.3 Манометрический метод

2.1.4 Определение скорости инициирования процесса окисления

2.1.5 Математическая обработка экспериментальных данных

2.1.6 Метод обратного йодометрического титрования

2.1.7 Определение критической концентрации мицеллообразования

ККМ) методом Ребиндера

2.1.8 Методика приготовления исследуемых растворов

2.1.9 Реактивы и их очистка

2.2 ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИОКСИДАИТНОЙ АКТИВНОСТИ АМИНОКИСЛОТНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ БЕТУЛОНОВОЙ И ГЛИЦИРРЕТОВОЙ КИСЛОТ

2.2.1 Характеристика объектов исследования

2.2.2 Характеристика модельных систем окисления, используемых для изучения ингибирующего действия тритерпеноидов

2.2.3 Антиоксидантная активность пептидных производных бетулоновой и глицирретовой кислот в системе окисления, инициированной АИБН

2.2.4 Антирадикальная активность ДБК и ДГК

2.2.5 Изучение особенностей ингибирующего действия тритерпеноидов и хинонов

2.2.6 Ингибирующее действие пептидных производных бетулоновой кислоты в системе окисления, инициированной солями железа

2.3 РОЛЬ РАЗЛИЧНЫХ ФРАГМЕНТОВ МОЛЕКУЛЫ ДИПЕПТИДА БЕТУЛОНОВОЙ КИСЛОТЫ В ПРОЦЕССЕ ОКИСЛЕНИЯ

2.3.1. Взаимосвязь между антиоксидантной активностью и строением производных ряда лупана в системе окисления, инициированной АИБН

2.3.2. Особенности ингибирующего действия дипептида бетулоновой кислоты

2.3.3. К механизму ингибирующего действия различных фрагментов структуры ДБК

2.4 ИЗУЧЕНИЕ СОВМЕСТНОГО АНТИОКСИДЛНТНОГО ДЕЙСТВИЯ «ТОКОФЕРОЛА С ДИПЕПТИДНЫМИ ПРОИЗВОДНЫМИ

ТРИТЕРПЕНОИДОВ И ХИНОНОВ

2.4.1. Кинетические эффекты ингибирующего действия а-ТФ с дииеитидными производными бетулоновой и глицирретовой кислот

2.4.2. Изучение совместного антиоксидантного действия природных хинонов и а-ТФ

2.4.3. Спектроскопические исследования межмолекулярных взаимодействий в системе а-ТФ - хинон

2.4.4. Изучение роли различных фрагментов структуры дипептида бетулоновой кислоты при его взаимодействии с а-токоферолом 98 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 102 ВЫВОДЫ 115 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 117 ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АИБН - азобисизобутиронитрил АО- антиоксида!it, антиоксидантный

АОА - антиоксидантная активность

АРА - антирадикальная активность а-ТФ - а-токоферол

ДБК - дипептид бетулоиовой кислоты

ДГК - дипептид глицирретовой кислоты

ГЛК - глицирретовая кислота

Тос* - токофероксильный радикал

ЖК - жирные кислоты

ВЖК - высшие жирные кислоты

ПНЖК - полиненасыщенные жирные кислоты

МО - метилолеат

ПОЛ - пероксидное окисление липидов УХ-убихинон

ХЛ - хемилюминесненция, хемилюминесцентный

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Систематических исследований бетулоновой, глицирретовой кислот и их пептидных производных в качестве потенциальных антиоксидантов ранее не проводилось. В литературе имеются единичные сведения об ингибирующем действии природных смесей тритерпеноидов /34,60/, данные об активности индивидуальных соединений еще более ограничены. Показано, что глицирретовая кислота способна тушить люминесценцию синглентного кислорода, причем в сравнении с агликоном эффективность соответствующего гликозида выше /60/. Для ряда производных бетулоновой кислоты на биологической модели острого токсического гепатита установлен эффект ингибирования накопления продуктов окисления липидов печени крыс /28/, показано, что введение аланинамидного фрагмента в молекулу бетулоновой кислоты усиливает антиоксидантные свойства у самой кислоты и ее метилового эфира /56/. В классических модельных системах антиоксидантная активность веществ этого класса не тестировалось. Представления о возможном механизме ингибирующего действия этих соединений отсутствуют, не изучена роль в процессе окисления различных характеристических групп, входящих в структуру тритерпеноидов.

Известно, что в природных объектах тритерпеноиды присутствуют в композициях с природными антиоксидантами (а-токоферолом, флавоноидами, хинонами), однако данные о характере их совместного ингибирующего действия в литературе отсутствуют.

В связи с вышеизложенным изучение кинетики и механизма ингибирующего действия индивидуальных тритерпеноидов и их функциональных производных, в частности, дипептидов, представляет немаловажный теоретический и практический интерес.

Целью работы являлось изучение закономерностей ингибирующего действия индивидуальных пептидных производных бетулоновой и глицирретовой кислот, исследование взаимосвязи между строением и эффективностью соединений, выявление характера совместного действия тритерпеноидов и основного природного антиоксиданта а-токоферола.

Задачи исследования:

1. Исследовать кинетику окисления модельного субстрата (метилолеата) в присутствии производных тритерпеноидов: метилового эфира N'-{N-[3-ацетокси-11-оксо-12-олеанен-29-оил]-9-аминонаноил}-3-амино-3-фенилиронионовой кислоты (I); метилового эфира N'-{N-[3-okco-20(29)-лупен-28-оил]-9-аминонаноил}-3-амино-3-фенилпропионовой кислоты (II); бетулина (III); 3-ацетоксибетулина (IV); 28-ацетоксибетулина (V); 3,28-диацетоксибетулина (VI); 3-оксобетулина (VII); метилового эфира бетулоновой кислоты (VIII); метилового эфира бетулиновой кислоты (IX); метилового эфира ^-[З-оксо^О^^лупен^Б-оил]^-аминоуксусной кислоты (X) при различных способах инициирования процесса.

2. Изучить характер зависимости брутто-ингибирующего действия от концентрации исследуемых соединений.

3. Хемилюминесцентным методом протестировать антирадикальную активность дипептидных производных тритерпеноидов (I, II).

4. Оценить роль различных фрагментов молекулы в обеспечении брутто-ингибирующего действия дипептидов глицирретовой (I) и бетулоновой кислот (II).

5. Исследовать кинетику совместного антиоксидантного действия дипептидов глицирретовой и бетулоновой кислот с а-токоферолом.

6. Изучить характер и механизм совместного ингибирующего действия а-токоферола с природными хинонами (убихиноном Qio, филлохиноном, токотриенолхиноном).

Научная новизна. В диссертационной работе впервые исследованы антиоксидантные свойства индивидуальных тритерпеноидов: метилового эфира N'- {Ы-[3-ацетокси-11 -оксо-12-олеанен-29-оил]-9-аминонаноил} -З-амино-З-фенилпропионовой кислоты (I); метилового эфира М'-{М-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оил]-9-аминонаноил}-3-амино-3-фенилпропионовой кислоты (II); бетулина (луп-20(29)-ен-3,28-диол) (III); 3-ацетоксибетулина (3-ацетокси-луи-20(29)-ен-28-ол) (IV); 28-ацетоксибетулина (28-ацетокси-луп-20(29)-ен-3-ол) (V); 3,28-диацетоксибетулина (3,28-диацетокси-луп-20(29)-ен) (VI); 3-оксобетулина (3-оксо-луи-20(29)-ен-28-ол) (VII); метилового эфира бетулоновой кислоты (метилового эфира 3-оксо-луп-20(29)-ен-28-оил) (VIII); метилового эфира бетулиновой кислоты (метиловый эфир 3-гидрокси-луп-20(29)-ен-28-оил) (IX); метилового эфира >Г-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оил]-2-аминоуксусной кислоты (X).

Установлены диапазоны концентраций, соответствующие проявлению максимальной антиоксидантной активности соединений. Методом хемилюминесценции показано, что тритерпеноиды (I и И) не активны в реакции с пероксильными радикалами. Установлена возможность связывания дипептидом бетулоновой кислоты (II) солей железа в ферри-форме (Fe+2). Выявлена роль различных функциональных групп в обеспечении брутто-ингибирующего действия бетулина (III). Показано, что наибольший вклад вносят первичный С-28гидроксил (53,9±2,0) %, луиановое ядро за счет изоиропенильного заместителя обеспечивает 27% брутто-ингибирующего действия, вторичный спиртовый С-3-гидрокхш1 - 16,3±0,8 %. Суммарное действие всех вышеназванных фрагментов аддитивно.

Впервые установлено и кинетически изучено проявление эффектов антагонизма в совместном ингибирующем действии а-токоферола с дипептидными производными глицирретовой и бетулоновой кислот, природными хиноиами (убихиноном Q)0, филлохиноном, токотриенолхиноном). Установлен механизм проявлений неаддитивности в действии смеси а-токоферола и коэнзима Qio

Научно-практическая значимость работы заключается в отборе наиболее эффективных антиоксидантов в ряду производных лупанового ряда. Установлено, что наибольшую антиоксидантную активность проявляют бетулин и дипептид бетулоновой кислоты. Действие дипептидных производных бетулоновой и глицирретовой кислот на 70% превышает эффективность их родоначальной структуры (агликона). Установлено, что динегтгидные производные тритерпеноидов, природные хинош>1 (убихинон Qjo, филлохинон, токотриенолхинон) способны связывать основной липидный антиоксидант а-токоферол, существенно снижая его ингибирующее действие в смеси с указанными антагонистами. Обнаруженный нами эффект позволяет рассматривать пептиды тритерпеноидов, равно как и хиноны, в качестве средств медикаментозного воздействия на состояние антиоксидантной системы опухолевых клеток.

Показаны направления химической модификации структур исследуемых соединений с целыо направленного синтеза высокоэффективных антиоксидантов ряда пептидных производных тритерпеноидов.

Апробация работы. Основные результаты работы представлены на Международной конференции «Свободнорадикальные процессы: экологические, фармакологические и клинические аспекты» (г. Санкт-Петербург, 1999 г.); VI Международной конференции «Биоантиоксидант» (г. Москва, 2002 г.); X Российском Национальном конгрессе «Человек и лекарство» (г. Москва, 2003 г.);

IV Конгрессе молодых ученых «Пауки о человеке» (г. Томск, 2003 г.); Международном симпозиуме «Медицина и охрана здоровья» (г. Тюмень, 2000,

2001, 2004 гг.); Межвузовской научной конференции "Актуальные проблемы теоретической, экспериментальной и клинической медицины" (г. Тюмень, 2001,

2002, 2003, 2004 гг.).

Публикации. Основной фактический материал и выводы диссертации опубликованы в 15 работах (8 статей и 7 тезисов докладов).

ЧАСТЬ ПЕРВАЯ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

ВЫВОДЫ

1. Установлено ингибируюшее действие производных ряда лупана: бетулина, 3-ацетоксибетулина, 28-ацетоксибетулина, 3,28-диацетоксибетулина, 3-оксобетулина, метилового эфира бетулоновой кислоты, метилового эфира бетулиновой кислоты, метилового эфира Ы'-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оил]-2-аминоуксусной кислоты.

2. Показано, что бетулин среди исследуемых соединений обладает наибольшим ингибирующим действием. Зависимость брутто-эффективности от концентрации носит экстремальный характер, обусловленный дифильными свойствами соединения.

3. Проведена количественная оценка вклада характеристических групп в общее брутто-ингибирующее действие бетулина. Показано, что наибольший вклад вносят первичный С-28- гидроксил (53,9±2,0) %, далее в порядке убывания следует лупановое ядро (27%), вторичный спиртовый С-З-гидроксил (16,3±0,8) %. Установлено, что действие различных фрагментов молекулы аддитивно.

4. Установлено, что при аутоокислении бетулина в системе ускоряется накопление пероксидов в 2,2 раза.

5. Показано, что среди природных и синтетических тритерпеноидов наибольшим ингибирующим действием характеризуются дипептидные производные бетулоновой и глицирретовой кислот. Дипептидный фрагмент молекулы обеспечивает до 70 % их эффективности. Максимальный ингибирующий эффект проявляется при концентрациях 2,5x10-4 М и 8x10"4 М дипептида бетулоновой и дипептида глицирретовой кислот соответственно.

6. Установлено, что дипептидный фрагмент молекулы тритерпеноидов бетулоновой и глицирретовой кислот, карнозин, глутатион способны связывать катионы железа в ферри-форме и образовывать нитроксильные радикалы в процессе окисления.

7. Установлено проявление эффекта антагонизма в совместном ингибирующем действии смесей а-токоферола с дипептидными производными бетулоновой и глицирретовой кислот. Показано, что величина антагонизма возрастает с увеличением концентрации дипептидов и уменьшается с ростом количества а-токоферола. Эффект антагонизма в сочетанном действии веществ может достигать 60%.

8. Показан эффект антагонизма в совместном ингибирующем действии а-токоферола с природными хинонами: убихиноном (коэнзимом Qjo), филлохиноном (витамином Kj), токоферилхиноном. Тормозящее действие смеси снижается до 55% пропорционально росту количества хинонов в смеси.

1. Абрамова Ж.И., Оксенгендлер Г.И. Человек и противоокиелительные вещества. Л.: Наука. - 1985. - 232с.

2. Антиокислительная активность липидов и радиочувствительность. /Шишкина Л.Н., Алесенко А.В., Пальмина Н.П., Бурлакова Е.Б. //Радиобиология. -1976. Т.16. -N 1.-С.39-43.

3. Антиокислительная активность липидов печени мышей при лучевой болезни и перевивном лейкозе и действие ингибиторов свободнорадикальных реакций /Бурлакова Е.Б., Дзюба Н.М., Пальмина Н.П., Эммануэль Н.М. //ДАН СССР. 1965. - Т. 163. - К«5. - С. 1278-1281.

4. Антиокислительная эффективность экстрактов корня солодки голой /Гарифуллина Г.Г., Герчиков А.Я., Денисова С.Б., Хайруллина В.Р. //В сб.: Биоантиоксидант. М. - 2002. - С.100-101.

5. Антиоксидантные свойства некоторых гормонов /Галкина О.В., Путилина Ф.Е., Ещенко Е.Д., Вилкова В.А. //В сб.: Биоантиоксидант. М. - 2002. - С.96-97.

6. Аристархова С.А. К механизму различной биологической активности а- и Р-токоферолов /Аристархова С.А., Бурлакова Е.Б., Кухтина Е.Н. //Вопросы питания. 1974. - Л'^5. - С.34-37.

7. Баглей Е.А. Влияние противоопухолевых препаратов на антиокислительную активность липидов печени /Баглей Е.А. //В кн.: Материалы I Всесоюзной конференции но химиотерапии злокачественных опухолей. Рига. - 1968. - С.204-206.

8. Биленко М.В. Ишемические и реперфузионные повреждения внутренних органов. М. - 1990. - 128с.

9. Бурлакова Е.Б., Алесенко А.В., Молочкина A.M. Биоантиоксиданты в лучевом поражении и злокачественном росте. - М.: Наука. - 1975. - 214 с.

10. Бурлакова Е.Б. Биоантиоксиданты и синтетические ингибиторы радикальных реакций /Бурлакова Е.Б. //Успехи химии. 1975. - Т.44. - № 10. — С.874-886.

11. Бурлакова Е.Б. Изучение антирадикальной активности аналогов и гомологов токоферола методом хемилюминесценции /Бурлакова Е.Б., Кухтина Е.Н., Ольховская И.П. //Биофизика. 1979. -Т.24. - С.975 - 979.

12. Бурлакова Е.Б. Исследование физико-химических свойств липидов при некоторых патологических состояниях /Бурлакова Е.Б.: Дис. док. биол. наук. -М.- 1970.-300с.

13. Бурлакова Е.Б. Кинетические особенности токоферолов как антиоксидантов /Бурлакова Е.Б., Крашаков С.А., Храпова Н.Г.; //Химическая физика. 1995. -Т. 14. - №10. - С.230-280.

14. Бурлакова Е.Б., Папьмина Н.П. Возможность подбора оптимальных условий химиотерапии опухолей на основании изучения изменения антиокислительной активности липидов. Проблемы химиотерапии злокачественных опухолей. — Москва-Киев. - 1974. - 106с.

15. Бурлакова Е.Б. Перекисное окисление липидов мембран и природные антиоксиданты /Бурлакова Е.Б., Храпова Н.Г. //Успехи химии. 1985. - Т.54. - №9. -С.1540-1558.

16. Бурлакова Е.Б. Роль липидов в процессе передачи информации в клетке /Бурлакова Е.Б. //Биохимия липидов и их роль в обмене веществ. М.: Наука. -1981.-С.23-24.

17. Бурлакова Е.Б. Роль токоферолов в пероксидном окислении липидов биомембран /Бурлакова Е.Б. Крашаков С.А., Храпова Н.Г. //Биологические мембраны. 1998. - Т. 15. - №2. - С. 137-167

18. Бурлакова Е.Б. Связь физико-химических характеристик ингибиторов радикальных процессов с их строением /Бурлакова Е.Б., Храпова Н.Г. //В кн.: Теория и практика жидкофазного окисления. М.: Наука. - 1974. - С. 244-248.

19. Буробина С.А. Исследование природного антиоксиданта (система витамина Е) при злокачественном росте /Буробина С.А., Нейфах Е.А. //В кн.: Физико-химические механизмы злокачественного роста. Труды МОИП,32. М.: Наука. -1970. - С.56-61.

20. Василенко АЛО. Экспериментальное обоснование лечебного применения тритерпеновых соединений при заболеваниях гепатобилиарной системы /Василенко АЛО., Фролов А.В., Чомаева С.Х. //Хим. фарм. журнал. 1985. - Т.19. -№11.-С.1335- 1340.

21. Василенко Ю.К. Сравнительное исследование гиполипидемических свойств тритерпеноидов /Василенко Ю.К., Пономарев В.Д., Оганесян Э.Т. //Хим. фарм. журнал. 1981. - Т. 15. - №5. - С.50-53.

22. Витамин А и иерекисное окисление липидов: влияние недостаточности ретинола /Конь И .Я., Горгошидзе Л.Ш., Васильева О.Н., Кулакова С.Н. //Биохимия. 1986. - Т.51. - №1. - С.70 -76.

23. Владимиров В.А. Свободные радикалы и антиоксиданты /Владимиров В.А. //Вестник РАМН. 1998. - №7. - С.43-50.

24. Влияние стероидов на перекисное окисление липидов мембран митохондрий печени /Владимиров Ю.А., Сергеев П.В., Сейфулла Р.Д., Руднев Ю.Н. //Молекулярная биология. 1973. - Т.7. - вып.2. - С.247-253.

25. Влияние фенилаланина и а-токоферола на обмен убихинона и убихроменола в печени Е-авитаминозных крыс in vitro /Чернухина JI.A., Донченко Г.В., Золоташко О.М., Теплицкая ЛЛО. //Укр. биохим. журн. 1976. - Т.48. - №2.-С.206-210.

26. Гепатозащитная и антиоксидантная активность тритерпеноидов. /Зарудий Ф.С., Карачурина Л.Т., Сапожникова Т.А., Флехтер О.Б., Исмагилова А.С., Давыдов М.В. //В сб.: Биоантиоксидант. Москва. - 1998. - С.133-134.

27. Гиполипидемические свойства гликозидов бетулина. /Иванов А.С., Захарова Т.С., Одинокова Л.Э. Уварова Н.И. //Хим. фарм. журнал. 1987. - Т.21. - №9. -С.1091-1094.

28. Гладышев С.П. Тестирование химических соединений как стабилизаторов полимерных материалов /Гладышев С.П., Цепалов В.Ф. //Успехи химии. 1975. -Т.44. - вып. 10. - С.1830-1850.

29. Голявин А.А. Изучение распада гидропероксида кумила в присутствии ПАВ методом ЯМР спектроскопии /Голявин А.А., Карташева З.С., Касаикина О.Т. //В сб.: Современная химическая физика XV Симпозиум. Туапсе. - 2003. - С.98-99.

30. В.П. Гранкина, Т.П. Надеждина. Солодка уральская. Новосибирск: Наука. - 1991.

31. Гринкевич Н.И., Сафронич Л.Н. Химический анализ лекарственных растений. -М.: Высшая школа. 1983. - 175с.

32. Гусейнова С.И. Антиоксидантные эффекты экстракта солодкового корня в соматических органах в условиях воздействия тетрахлорэтилена /Гусейнова С.И. /В сб.: Биоантиоксидант. М. - 1998. - С. 125.

33. Дарюхина Е.Н. Совместное действие тиразола-С и а-токоферола /Дарюхина Е.Н., Гуреева Н.В., Сторожок Н.М. //В сб.: Биоантиоксидант. М. - 1998. - С.35.

34. Деканосидзе Г.Е., Чирва В.Я., Сергиенко Т.В. Биологическая роль, распространение и химическое строение тритерпеновых гликозидов. Тбилиси. -1984.-347 с.

35. Денисов Е.Т., Азатян В.В. Ингибирование цепных реакций. Черноголовка. -1997.-266 с.

36. Денисов Е.Т. Кинетика гомогенных химических реакций. М.: Высшая школа. - 1978.-367 с.

37. Денисов Е.Т. Кинетические критерии эффективности ингибиторов окисления /Денисов Е.Т., Эмануэль Н.М. //Кинетика и катализ. 1973. - Т. 14. - № 4.-С. 823-829.

38. Денисов Е.Т. Константы скорости гомолитических жидкофазных реакций. -М.: Наука. -1971.-711 с.

39. Денисов Е.Т., Мицкевич Н.И., Агабеков В.Е. Механизм жидкофазного окисления кислородсодержащих соединений. Минск: наука и техника. - 1975. -322 с.

40. Денисов Е.Т. Области реализации различных механизмов ингибированного фенолами окисления углеводородов /Денисов Е.Т. //Химическая физика. М.: Наука. - 1983. - №. - С. 229-238.

41. Денисов Е.Т. Расчет предэкспонентов некоторых элементарных реакций окисления /Денисов Е.Т., Косарев В.П. //Жур. физ. хим. 1964. - Т.38. - №12. - С. 2875-2881.

42. Денисов Ю.П. Стероидные гормоны и регуляция функций митохондрий /Денисов Ю.П. //Фармакология и токсикология. 1981. - Т.44. - №4. - С.500-506.

43. Друлле А.Я. Антиоксидантная активность азотсодержащих производных 1,4-нафтохинона /Друлле А.Я., Логин Я.Я., Дрегерис Я.Я. //Изв. АН Латв. ССР. -1989. -№3.-С.358-361.

44. Дулицкая Р.Ф., Фельдман Р.И. Практикум по физической и коллоидной химии. М.: Высшая школа. - 1978. - 296 с.

45. Ерин А.Н. Взаимодействие а-токоферола со свободными жирными кислотами. Механизм стабилизации микровязкости липидного бислоя /Ерин А.Н., Горбунов Н.В., Скрыпин В.И. //Биол. науки.-1987.-N 1. С. 10-16.

46. Ерин А.Н. Образование комплексов а-токоферола с жирными кислотами. Возможный механизм стабилизации мембран витаминов Е /Ерин А.Н., Спирин М.М., Табидзе Л.В. //Биохимия. 1983. - Т.48. - N 11. - С. 1855-1861.

47. Ершов Ю.А., Попков В.А., Берлянд А.С. Общая химия. Биофизическая . химия. Химия биогенных элементов. М.: Высшая школа, - 2002. - 560с.

48. Захарова Н.А. Антирадикальные свойства природных фенолов и их синтетических аналогов /Захарова Н.А. //Дис. кан. хим. наук. М. - 1972. - 180 с.

49. Зенков Н.А., Кандалинцева Н.В., Ланкин В.З., Меньшикова Е.Б., Просенко А.Е. Фенольные биоантиоксиданты. Новосибирск: СО РАМН, 2003. - 328с.

50. Зенков Н.К., Ланкин В.З., Меньшикова Е.Б. Окислительный стресс. Биохимический и патофизиологические аспекты. М.:Наука /Интерпериодика. -2001.-340 с.

51. Иванов И.И. Перераспределение антиоксидантов липидной природы в организме животного при раке /Иванов И.И., Тарусов Б.Н. //В кн.: Физико-химические механизмы злокачественного роста. Труды М0ИП,32. М.: Наука. -1970.-С.112-115.

52. Изменение структуры углеводородной среды в процессе жидкофазного окисления /Бакунин В.Н., Попова З.В., Оганесова Э.Ю., Кузьмина Г.Н., Харитонов В.В., Перенаго О.П. //Нефтехимия. 2001. - Т.41. - № 1. - С.41 -46.

53. Изучение антиоксидантного действия ряда препаратов растительного происхождения при облучении Бабаев Р.А., Кочарли Р.Х Бабаев Х.Ф., Садых-заде Р.А., Гаджиева Б.Х. //В сб.: Биоантиоксидант. М. - 1998. - С. 109-110.

54. Изучение антиоксидантных свойств производных бетулоновой кислоты на модели острого токсического гепатита /Сорокина И.В., Толстикова Т.Г., Бубнова Е.Г., Петренко Н.И., Шульц Э.Э. //Научный вестник Тюм. мед. академии.- 2003. -№1.-С.60-61.

55. Иогансен Т.А. Инфракрасная спектроскопия и спектральное определение энергии водородной связи //В сб.: Водородная связь. М.: Наука. -285с.

56. Кабальнова Н.Н. Тушение синглентного кислорода агликонами и гликозидами /Кабальнова Н.Н., Денисова С.Б., Муринов Ю.И. //В сб.: Биоантиоксидант. М. - 2002. - С.226-227.

57. Карпухина Г.В. Взаимодействие двух ингибиторов в реакциях окисления углеводородов /Карпухина Г.В., Майзус З.К., Эмануэль Н.М. //Доклады АН СССР. 1963. -Т.152.-№1.-С.110-113.

58. Карпухина Г.В. Классификация синергических смесей антиоксидантов и механизма синергизма /Карпухина Г.В., Эмануэль Н.М. //Докл. АН СССР. 1984. -Т.276. - №5. - С.1163-1167.

59. Карпухин О.Н. Хемилюминесценция в реакциях ингибированного окисления и активность ингибиторов /Карпухин О.Н., Шлягшнтох В.Я., Золотова Н.В. //Изв. АН СССР, сер. хим. 1963. - №10. - С. 1718-1793.

60. Касаикина О.Т. Реакционная способность Р-каротина при взаимодействии со свободными радикалами /Касаикина О.Т., Гагарина А.Б., Эмануэль Н.М. //Изв. АН СССР. 1975. - №10. - С.2243-2247.

61. Конь И.Я. Действие ретиноевой кислоты на перекисное окисление липидов в микросомах печени крыс in vitro /Конь И.Я., Горгошидзе Л.Ш. //Бюл. экспер. биол. и мед. 1985. - №4. - С.428 - 429.

62. Кухтина Е.Н. Особенности антиокислительного действия токоферолов как природных антиоксидантов /Кухтина Е.Н., Храпова Н.Г., Бурлакова Е.Б. //Докл. АН СССР. 1983. - Т. 272. - № 3. - С.729-732.

63. Кухтина Е.Н. Особенности действия природных антиокислителей в системах in vivo и in vitro и их роль в регуляции процессов перекисного окисления липидов /Кухтина Е.Н. //Дис. канд. хим. наук. М. - 1982. - 194 с.

64. Ланкин В.З. Концентрационная инверсия антиоксидантного и прооксидантного действия Р-каротина в тканях in vivo /Ланкин В.З., Тихазе А.К., Коновалова Г.Г. //Бюлл. эксп. биологии и медицины. 1999. - Т. 128. - №9. - С. 314-316.

65. Луконькин И.Н. Эффекты синергизма в совместном антиоксидантном действии а-токоферола с производными пантоевой кислоты и L-карнитином /Луконькин И.Н.: Дисс.канд. хим. наук. - Тюмень. - 2000. -139с.

66. Максимова Т.В. Лекарственные средства природного происхождения, обладающие антиоксидантной активностью /Максимова Т.В., Пахомов В.П. //В сб. Биоантиоксидант. Тюмень. - 1997. -С.41-42.

67. Машковский М.Д. Лекарственные средства. М.: Изд-во Новая волна. -2000.-608с.

68. Муравьев И.А. Изолирование глицирретиновой кислоты методом электрофореза на бумаге /Муравьев И.А., Савченко Л.Н. //Хим. фарм. журнал. -1980. Т.14. - Ж7. - С. 104-107.

69. Насыров Х.М. Влияние современных противовоспалительных средств на репаративную стадию воспаления /Насыров Х.М., Лазарева Д.Н. //Фармакология и токсикология. 1984. - Т.47. - №1. - С.84-88.

70. Наумов В.В. Исследование взаимодействия убихинона и убихинола с перекисными радикалами хемилюминесцентным методом /Наумов В.В., Храпова Н.Г. //Биофизика. 1983. - Т.28 - №5. - С.730-735.

71. Наумов В.В. Кинетические характеристики реакций убихинонов и родственных соединений как антиоксидантов в модельных системах возрастающей сложности /Наумов В.В.: Автореф. дисс. канд. хим. наук. -Москва. - 1985.-24с.

72. Наумов В.В. Хемилюминесцентные характеристики убихинонов /Наумов

73. B.В., Храпова Н.Г. //Биофизика. 1985. - Т.30. - № 1. - С.5-9.

74. Нейфах Е.А. К механизму окисления ненасыщенных жирных кислот раковыми и нормальными тканями /Нейфах Е.А. //В сб.: Труды VIII Международного противоракового конгресса. М. - Л.: Медгиз. - Т.2. - 1963.1. C.141-144.

75. Нейфах Е.А. Мобилизация и интесивная утилизация бластомами витамина Е /Нейфах Е.А., Ермачкова Е.В., Стромилова Л.И. //В сб.: Биоантиоксидант. -Черноголовка. 1986. - С. 67-68.

76. Николаев С.М. Биоантиоксиданты в терапии повреждений печени /Николаев С.М., Ажунова Т.А. //В сб.: Биоантиоксидант. Тюмень. - 1997. - С. 184.

77. Оболышкова Е.А. Аналоги коферментов Q и их биологическая активность /Обольникова Е.А., Кожухова А.И. //Хим. фарм. Журнал. 1993. - №12. - С.15-20.

78. Осипов А.Н. Активные формы кислорода и их роль в организме /Осипов А.Н., Азизова О.А., Владимиров Ю.А. //Успехи биологической химии. М.: Наука. - 1990. - Т.31. - С. 181 -209.

79. О скорости и механизме зарождения цепей при окислении метиловых эфиров олеиновой, линолевой, линоленовой кислот /Янишлиева Н., Скибида Н., Майзус 3., Попов А. //Изв. отд. хим. наук Болгарской АН. 1971. - Т.4. - №1. - С. 1-10.

80. Особенности антиокислительного действия слабых ингибиторов /Храпова Н.Г., Бурлакова Е.Б., Кухтина Е.Н., Синкина Е.Б. //Нефтехимия. 1978. - Т. 18. -№5. -С.724-730.

81. Пальмина Н.П. Изменение антиокислительной активности липидов при лечении перевиваемого лейкоза препаратами из класса алкилирующих агентов /Пальмина Н.П., Бурлакова Е.Б. //Биофизика. 1973. - Т. 18. - №1. - С. 166-169.

82. Петрусевич Ю.М. Антиокислительные свойства фенолов растительного и животного происхождения /Петрусевич Ю.М. //Биоантиокислители. М.: Наука, 1975.-С. 247-251.

83. Полонская А.К. Оценка антиоксидантной активности растений Крыма /Полонская А.К., Ежов В.Н., Дорофеев А.Н. //В сб.: Биоантиоксидант. М. - 2002. - С.468-469.

84. Попов А., Янишлиева Н. Автоокисление и стабилност на липидите. -София: Болгарската академия на науките. 1976. - 253с.

85. Прайор У. Свободные радикалы в биологии. М.: Мир. - 1979. - Т.1. - С.279-283.

86. Рогинский В.А. Исследование ингибиторов перекисного окисления липидов акцепторов алкильных радикалов /Рогинский В.А. //В сб. Исследование синтетических и природных антиоксидантов in vivo и vitro. - М.: Наука. - 1992. -С.48-52.

87. Рогинский В.А. Кинетика окисления эфиров полиненасыщенных жирных кислот, ингибированного замещенными фенолами /Рогинский В.А. //Кинетика и катализ. 1990. - Т.31. - вып.З. - С.546-552.

88. Рогинский В.А. Фенольные антиоксиданты: реакционная способность и эффективность. М.: Наука. - 1988.-247 с.

89. Разумовский С.Д., Заиков Г.Е. Озон и его реакции органическими соединениями. М.: Наука. - 1974. - 323 с.

90. Рубайло B.JI., Маслов С.А. Жидкофазное окисление непредельных соединений. М.:Химия, - 1989. - 224с.

91. Семенченко В.Ф. Содержание бетулинола во внешней коре березы /Семенченко В.Ф., Кудрин С.В. //Фармация. 1992. - Т.41. - №4. - С.24-27.

92. Сергеев П.В. Взаимодействие стероидов с фосфолипидными мембранами /Сергеев П.В., Сейфулла Р.Д., Денисов Ю.П. //Биофизика. 1974. - Т. 19. - вып. 1. -С.40-42.

93. Синтез производных растительных тритерпенов и исследование их противовирусной и иммуностимулирующей активности /Покровский А.Г., Плясунова О.А., Ильичева Т.Н., Борисова О.А., Федюк Н.В., Петренко Н.И.,

94. Петухова В.З., Шульц Э.Э., Толстиков Г.А. //Химия в интересах устойчивого развития. 2001. - №9. - С.485-491.

95. Скульте И.В. Влияние глицирама на показатели липидного обмена /Скульте И.В. //Хим. фарм. журнал, 1980.-Т.14. -№9. -С. 13-18.

96. Сравнительное изучение антиоксидантной активности сексвитерпенгидрохинонов из морских губок /Лихацкая Г.Н., Ким НЛО., Уткина Н.К., Шубина Л.К. //В сб.: Биоантиоксидант. М. - 2002. - С.351-352.

97. Сравнительное изучение кардиопротекторной и антирадикальной активности эстрогенов и их нитропроизводных /Матюшин А.И., Балабаньян В.Ю., Ржезников В.М., Мамбетова А.Ж. //Бюл. экспер. биол. и мед. 1999. - Т. 128. -№10. - С.408-410.

98. Сторожок Н.М. Антиоксидантная активность природных и синтетических хинонов /Сторожок Н.М., Друлле А.Я., Логин Я.Я. //Вопросы мед. химии. 1995. - Т.41. - № 1. — С.21-24.

99. Сторожок Н.М. Исследование межмолекулярных взаимодействий компонентов природных липидов в процессе окисления /Сторожок Н.М., Храпова Н.Г., Бурлакова Е.Б. //Химическая кинетика.- 1995.-Т.14. № П.-С.29-46.

100. Сторожок Н.М. Исследование проявлений антагонизма в совместном антиоксидантном действии Р-каротина и витамина А с а-токоферолом /Сторожок Н.М., Кутузова И.В. //Хим. фарм. журнал. 1995. - №12. - С.37-41.

101. Сторожок Н.М. Кинетика и константы скорости реакции феноксильных радикалов а-токоферола и хромана С с ненасыщенными жирными кислотами и фосфолипидами /Сторожок Н.М., Пирогов О.Н., Крашаков Н.Г. //Кинетика и катализ. 1995. - Т.36. - № 6. - С.818-824.

102. Сторожок Н.М. Межмолекулярные взаимодействия компонентов природных липидов в процессе окисления /Сторожок Н.М.: Дис. док. хим. наук. - М. 1996.- 372 с.

103. Терней Л. Современная органическая химия.: Пер. с англ.-М.-Мир.-1981.-312с.

104. Толстиков Г.А. Глицирретовая кислота (обзор) /Толстиков Г.А., Балтина Л.А., Сердюк Н.Г. //Хим. фарм. журнал. 1998. - №8. - с5-14.

105. Толстиков Г.А., Горяев М.И. Глицирретовая кислота. Алма-Ата. - 1966. -95с.

106. Тушение синглентного кислорода лупановыми тритерпеноидами /Ашавина О.Ю., Кабальнова Н.Н., Грабовский С.А., Флехтер О.Б., Галин Ф.З., Толстиков Г.А. //В сб.: Биоантиоксидант. М. - 2002. - С.47-49.

107. Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э. и др. Основы биохимии. Пер. с англ. - М.: Мир 7.- 1981.-535с.

108. Ухина Т.В. Влияние эстрадиола на перекисное окисление липидов в коже /Ухина Т.В., Калмагамбетова Г.Ж. //Бюл. экспер. биол. и мед. 1993. - №4. -С.362-364.

109. Фармакологические свойства тритерпеноидов коры березы /Василенко Ю.К., Семенченко В.Ф., Фролова Л.М., Коноплева Г.Е., Парфентьева Е.П., Скульте И.В. //Экспериментальная и клиническая фармакология. 1993. - Т.56. -№4. - С.53-55.

110. Хемилюменесцентный метод изучения природных антиоксидантов в липидах /Бурлакова Е.Б., Буробина С.А., Храпова Н.Г., Ядыкин Г.И. //Биофизика.- 1971.-Т. 16. -№ 1.-С. 39-43.

111. ХЛ-метод исследования связи структура-активность в ряду Р-гидрокси-производных пиридина и бензимидазола /Русина И.Ф., Кузнецов Ю.В., Гольцова Л.В., Смирнов Л.Д. //В сб.: Биоантиоксидант. М. - 2002. - С.495-497.

112. Храпова Н.Г. Кинетические особенности действия токоферолов как антиоксидантов /Храпова Н.Г. //Биофизика. 1977. - Т. 22. - № 3. - С. 463-442.

113. Храпова Н.Г. Кинетические характеристики токоферолов как регуляторов перекисного окисления липидов /Храпова Н.Г. //Липиды: Структура, биосинтез, превращение и функции. М. -1977. - С.157-170.

114. Храпова Н.Г. Перекисное окисление липидов и системы, регулирующие его интенсивность /Храпова Н.Г. //Биохимия липидов и их роль в обмене веществ. -М.: Наука, 1981.-С.147- 154.

115. Храпова Н.Г. Хемилюминесцентное исследование природных антиоксидантов липидов и синтетических ингибиторов /Храпова Н.Г.: Дис. канд. хим. наук. - М. - 1972. - 130 с.

116. Цепалов В.Ф. Определение констант скорости и коэффициентов ингибирования фенолов-антиоксидантов с помощью модельной цепной реакции /Цепалов В.Ф., Харитонова А.А., Гладышев В.П. //Кинетика и катализ. 1977. -Т. 18. - вып.5. - С. 1261 -1267.

117. Чудинова В.В. Влияние а-токоферола на ферментативное окисление линолевой кислоты /Чудинова В.В., Василенко Е.И., Захарова Е.И. //Биоорганическая химия. 1996.-Т.22. - № 10-11. -С.804-808.

118. Чудинова В.В. Изучение взаимодействия а-токоферола с фосфолипидами, жирными кислотами и их оксигенированными производными методом Р3,-ЯМР-спектроскопии /Чудинова В.В., Захарова Е.И., Алексеев С.М. //Биоорган, химия. -1993. Т. 19. - № 2. - С.243-249.

119. Чудинова В.В. Образование комплекса между а-токоферолом и гидропероксидами жирных кислот в гомогенных растворах /Чудинова В.В., Захарова Е.И., Алексеев С.М. //Докл. АН. 1992. - Т. 322. - №4. - С.773-776.

120. Чудинова В.В. Синтез и изучение биологических свойств производных хроманов и полиеновых жирных кислот /Чудинова В.В.: Автореф. дисс. канд. хим. наук. - Москва. - 1992. - С.24.

121. Чукаев С.А. Влияние половых гормонов на уровень перекисного окисления липидов плазмы крови in vitro /Чукаев С.А., Караченцев А.Н. //Бюл. экспер. биол. и мед. 1997. - Т. 124. - №7. - С.73-76.

122. Шамовский И.JI. Исследование структуры комплекса молекул токоферола и арахидоновой кислоты методом теоретического конформационного анализа /Шамовский И.Л., Яровская И.Ю. //Биологические мембраны. 1990.-Т.7. - № 5. -С.556-560.

123. Шишкина Л.Н. Определение антиокислительной активности индивидуальных веществ и липидов на метилолеатной окислительной модели /Шишкина Л.Н. //В сб. Исследование синтетических и природных антиоксидантов in vivo и vitro. М.: Наука. - 1992. - С.26-30.

124. Шляпинтох В.Я., Капухин О.Н., Постников Л.М., Захаров И.В., Вичутинский А.А., Цеиалов В.Ф. Хемилюминесцентные методы исследования медленных химических процессов. 1966. - М.: Наука. - 299 с.

125. Экспериментальное обоснование новых препаратов из коры березы /Василенко Ю.К., Семенченко В.Ф., Фролова Л.М., Коноплева Г.Е., Парфентьева Е.П., Скульте И.В. //Фармация. 1994. - Т.43 - №6. - С.7-9.

126. Элементарные реакции ингибиторов окисления /Денисов Е.Т. //Успехи химии. 1973. - Т. 42. - № 3. - С. 361-390.

127. Эмануэль Н.М., Гал Д. Окисление этилбензола (модельная реакция). М.: Наука. - 1984.-376 с.

128. Эмануэль Н.М., Денисов Е.Т., Майзус З.К. Цепные реакции окисления углеводородов в жидкой фазе. М.: Наука. - 1965. - 375 с.

129. Эмануэль Н.М., Заиков Г.Е., Майзус З.К. Роль среды в радикально-цепных реакциях окисления органических соединений. М.: Наука. - 1973. -279с.

130. Эмануэль Н.М. Кинетика экспериментальных опухолевых процессов. М.: Наука. - 1977.-416 с.

131. Эмануэль Н.М., Кузьмина М.Г. Экспериментальные методы химической кинетики. М.: Изд-во МГУ. - 1985. - 384 с.

132. Эмануэль Н.М. Физико-химия рака /Эмануэль Н.М. //Природа. 1982. - №1. - С.76-83.

133. Эмануэль Н.М. Химическая и биологическая кинетика /Эмануэль Н.М. //Успехи химии. -1981.- Т.50. № 10. - С. 1721 -1809.

134. Abdullaev A.Kh., Zakirov N.U. Derivatives of glycyrrhetic acid as new group of biological antioxidants //Dokl. Akad. Nauk. Resp. Uzb. 1996. - №1-2. - P.66-68.

135. Ames B.N., Shigenaga M.K., Hagen M.H. Oxidants, antioxidants and the degenerative diseases of aging //Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1993. - Vol. 90. - N 17. -P. 1915-1922.

136. Armanini D., Karbowiak I., and Funder J.W. Affinity of liquorice derivatives for mineralocorticoid and glucocorticoid receptors //Clin. Endocrinol. (Oxford). 1983. -Vol.19. - №5.-P.609-612.

137. Barclay L.R.C., Ingold K.U. Autoxidation of a model membrane: A cjmpfrison of the autoxidation of egg lecithin phosphatidylcholin in water and in chlorbenzene //J. Am. Chem. Soc. 1980. - V. 102. - ЛЬ 26. - P.7792-7794.

138. Barclay L.R., Vingvist M.R. Membrane peroxidation: inhibiting effects of water-soluble antioxidants on phospholipids of different charce tipes //Free Radical Biology et Medicine. 1994. -Vol. 16. - Xs 6. - P.779-788.

139. Biologically competent virus-inactivated albumin prepared with glycyrrhizic triterpenoids for use in blood substitutes //Shanbrom Edward, PCT Int. Appl. WO 90 05,533; Chem. Abstr., 114, 88623m (1991).

140. Bostrom H., Berntsen K., Whitehouse M.W. Biochemical properties of antiinflammatory drugs. II. Effects on sulfate-35s metabolism in vivo //Biochem. Pharmacol. 1964. - Vol.13. - P.413-416.

141. Boveris A., Cadenas E., Stoppani A.O.M. Role of ubiquinonen in the mitochondrial generation of hydroge peroxide //Biochem. J. 1976. - Vol.156. - №2. -P.435-444.

142. Brigelius-Flohe R., Traber M.G. Vitamin E: function and metabolism //FASEB. J. 1999. - Jul. - Vol.13. - № 10. - P.l 145-1155.

143. Burlacova E.B., Krashakov S.A., Khrapova N.G. The role of tocopherols in biomembrane lipid peroxidation //Membr. Cell Biol. 1998. - Vol. 12. - № 2. - P. 173211.

144. Burton G.W., Foster D.O., Perly B. et al. Biological antioxidants //Phil. Trans. Roy. Soc. London. - 1985. - Vol. 311. - № 1152. - P.567-578.

145. Burton G.W., Ingold K.U. Antioxidation of biological membranes. I. The antioxidant activity of vitamin E andrelated chan-breaking phenolic antioxidants in vitro //J. Amer. chem. Soc. 1981.-Vol. 103. - P.6472-6477.

146. Burton G.W., Ingold K.U. P-Carotene: an unusual type of lipid antioxidat //Science. 1984. - Vol.224 (4649). - P.569-573.

147. Burton G.W., Joyce A., Ingold K.U. First proof that vitamin E is major lipid-soluble, chain-breaking antioxidant in human blood plasma //Lancet. 1982. - № 8293. - P.327-329.

148. Burton G.W., Joyce A., Ingold K.U. Is vitamin E the only lipid-soluble, chain-breaking antioxidant in human blood plasma and erythrocyte membranes //Arch. Biochem. and Biophis. 1983. - Vol. 221. - № 1. - P.281-290.

149. Burton G.W., Pade V.L., Gabe E.J. et al. Antioxidant activity of vitamin E and related phenols. Importance of stereoelectronics factors //J. Am. Chem. Soc. 1980. -Vol. 102. - 26. - P.7791-7792.

150. Cadenas E. Mechanisms of oxygen activation and reactive oxygen species detoxification //In: Oxidative Stess and Antioxidant Defenses in Biology (Ahmad S., ed). New York etc. - Chapmen et Hall. - 1995. - P. 1 -61.

151. Cadenas S., Barja G. Resveratrol, melatonin, vitamin E, and PBN protect against renal oxidative DNA damage induced by the kidney carcinogen КВЮ3 //Free Radical Biology et Medicine.-1999 Vol.26. - №№ 11-12. - P. 1531-1537.

152. Castelli Т., Littaru G.P., Bertoli E. et al. Specifity of lipid and coenzime Q in mitochondrial NADH and succinoxidase of beaf heart and sereviasial //Arch. Biochem. Biophys. 1971. - Vol.142. - P.407-416.

153. Crane F.L. Biochemical functions of coenzyme Q!0 //J. AM. Coll. Nutr. 2001. — Vol.20.-N.6.-P.591-598.

154. Dargan D., Subak-Sharpe J. The antiviral activity against herpes simplex virus of the triterpenoid compounds carbenoxolone sodium and cicloxolone sodium //J. Antimicrob. Chemother. 1986. - 18 Suppl. - P. 185-200.

155. D.Howard Miles, Udom Kokpol, Leon H.Zalkovv,Steven J.Steindel and James B.Nabors. Tumor ingibitors I: Preliminary investigation of antitumor activity of Sarracenia flava//J.Pharm.Sci. 1974. - Vol.63. - №4. - P.613-615.

156. Duraccio M.R., Capasso P., Maskolo N. et al. Glycyrrhetinic acid, leucocytes and prostaglandins //J. Pharm. Pharmacol. 1983. - Vol.35. - № 5. - P.332-335.

157. Ekiel I.H., Hughes L., Burton G.W. et al. Structure and Dynamics of a-tocopherol in Model Membranes and in Solution: A Broad-Line and High-Resolution NMR Studi //Biochemistry. 1988. - Vol. 27.-N 5. - P.1432-1440.

158. Esterbauer H., Wag G., Puhl H. Lipid peroxidation and its role in atherosclerosis //Br. Med. Bull. 1993.-Vol 49. - №2. - P.566-576.

159. Fato R., Bertoli E., Costelli C.P. et al. Eluidizing effect of endogenous ubiquinone in bovine heart mitochondrial membranes //FEBS Lett. -1984.- Vol.172. №1. - P.6-10.

160. Fato R., Ragaiani P., Lenaz G. at al. Effect of some lipophilic substances on fluorescence polarization of perylene in lipid vesicles and mitochondrial membranes //Bull. Soc. H. Biol. Sper.- 1980.- Vol.56.- №10.- P.911-995.

161. Fukuzama K., Hayashi K., Suruki A. Effect of a-tocopherol analog on lysosome membranes and fatty acids monolayers //Chem. Phys. Lipids. 1977. - Vol. 18. - N1. -P.39-48

162. Fulda S., Jeremias I., Pietsch Т., Debatin K.M. Betulinic Acid a new chemotherapeutic agent in the treatment of neuroectodermal tumors //Klin.Pediatr.(Germany).- 1999. Vol.211. - №4.- P.319-322.

163. Gotoh N., Niki E. Rates of interactions of superoxide with vitamin E, vitamin С and related compounds as measured by chemiluminescense //Biochem. and Biophys. Acta. 1992.-Vol. 1115. - P.201-207.

164. Hans-Anton, Peter Vajkoczy, Michael D. et al. Do vitamin E supplements in diets for laboratory animals jeopardize findings in animal modeles of disease //Free Radical Biology et Medicine. 1999. -Vol. 26. - № 3-4. - P.472-481

165. Heap R.B., Symons A.M., Watkins J.C. //Biochim. Biophys. Acta. 1970.-Vol.218.- P.482-495.

166. Howard J.A. In.: Free Radicals //Kochi J.K., Willey S., N.Y. 1973. - Vol.2. -P.3-62.

167. Howard J.A., Ingold K.U. Absolute rate constants for hydrocarbon autoxidation //Can. J. Chem. 1966. - V.44. - P. 1119-1130., Can. J. Chem. - 1967.- Vol.45. - P.793-800.

168. Ikeda Takao. The character of glycyrrhizae radix's contents and its application //Nippon Koshohin Kagakkaishi. 1984. - Vol.8. - №1. - P.67-74.

169. Inoue H., Mori Т., Shibata S. et al. Inhibitory effect of glycyrrhetinic acid derivatives on arachidonic acid-induced mouse ear oedema //J. Pharm. Pharmacol. -1988. Vol.40. - №4. - P.272-277.

170. Inoue H., Mori Т., Shibata S., Saito H. Pharmacological activities of glycyrrhetinic acid derivatives: analgesic and antiallergic effects //Chem. Pharm. Bull.-Tokyo 1987. - Vol.35. - №9. - P.3888-3893.

171. Inoue H., Saito S., Koshihara Y. et al. Inhibitory effect of Glycyrrhetinic acid derivatives on lipoxygenase and prostaglandin synthetase //Chem. Pharm. Bull. 1986. -Vol.34.- №2. -P.897-901.

172. Ishida S,. Sakiya Y,. Ichikawa Т., Awazu S. Pharmacokinetics of glycyrrhetic acid, a major metabolite of glycyrrhizin, in rats //Chem. Pharm. Bull. -1989. Vol.37. -№9. - P.2509-2513.

173. Ishikawa S., Saito T. The effect of glycyrrhetinic acid on the action of aldosterone in stimulating sodium transport in frog skin //Endocrinol. Jpn. 1980. - Vol.27. - №6. -P.697-701.

174. Ito M., Nakashima H., Baba M., Shigeta S., Yamamoto N. Glycyrrhizin and its salts for inhibiting growth of virus of acquired immune deficiency syndrome (AIDS) //Chem.Abst. October 3, 1988. - Vol.109. - №14.

175. Jaaskelainen P. Betulinol and its unilisation //Paperi ja Puu Papper och Tra. -1981. - Vol.63. - №10. - P.599-603.

176. Jialal I., Norcus E.P., Cristol L. et al. Beta-carotene inhibits the oxidative modification of low density lipoproteins //Biochem. et Biophys. Acta. 1991. -Vol.1086.-P.134-138.

177. Ju H., Li X., Zhao B. et al. Scavenging effect of sodium ferulate and 18 beta-glycyrrhetic acid on oxygen free radicals //Zhongguo Yao Li Xue Bao. 1990. - Vol.11. - №5. - P.466-470.

178. Kartha V.N.R., Vijayan E., Krishnamurthy S. Tissue catalysis of lipid peroxidation of hypervitaminosis A. //Indian J. Biochem. and Biophis. 1978. - Vol.15. -№2. - P.l 11-114.

179. Kashiwada Yoshiki, Hashimoto Fumio, Cosentino L. Mark, Chen Chin-Ho, Garret Patricia E., Lee Kuo-Hsiung. Betulinic Acid and Dihydrobetulinic Acid as potent anti-HIV agents //J. Med. Chem.(English). 1996. - Vol.39. - ЛЬ5. - P.l016-1017.

180. Kaul N., Devaraj S., Jialal I. Alpha-tocopherol and atherosclerosis //Exp. Biol. Med. 2001. - Vol.226. - №1. - P.5-12.

181. Keaney J.F., Simon D.I., Freedman J.E. Vitamin E and vascular homeostasis: implications for atherosclerosis //FASEB J. 1999. - Vol.13. - №9. - P.965-975.

182. Kiso Yoshinobu, Kato Osamu, Hikino Hiroshi. Assay methods for antihepatotoxic activity using peroxide-induced cytotoxicity in primary cultured hepatocytes //Planta Med. 1985.- №l.-P.50-52.

183. Kitagawa K., Nishino H., Iwashima A. Inhibition of 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate-stimulated 3-O-methyl-glucose transport in mouse Swiss 3T3 fibroblasts by glycyrrhetinic acid //Cancer Lett. 1984. - Vol.24. - P. 157-163.

184. Kitagawa K., Nishino II., Iwashima A. Inhibition of the specific binding of 12-0-tetradecanoylphorbol-13-acetate to epidermal membrane fractions by glycyrrhetinic acid //Oncology. 1986. - Vol.43. - P. 127-130.

185. Koga Т., Мою К., Terao J. Protective effect of a vitamin E analog, phosphatidylchromanol, against oxidative hemolysis of human erythrocytes //Lipids. -1998. Vol.33. -№6. - P. 589-595.

186. Kumagai Akira, Nishino Kazuhiko, Shimomura Atsushi, Kin Takekazu, Yamamura Yuichi. Effect of glycyrrhizin on estrogen action //Endocrinol. Jpn. 1967. -Vol.14.-№l.-P.34-38.

187. Ling Han Chin, King Ming Lu, Chen Chia Fu, Hsu Kuo Pang et al. Anticancer effects of nine triterpenol derivatives on human cancer cell //Chung-Hua Hsuech Tsa Chin. (Taipei). 1982. - Vol.29. - №4. - P.308-315.

188. Livrea M.A., Tesoriere L., Bongiorno A. et al. Contribution of vitamin A to the oxidation resistance of human low density lipoproteins //Free Rad. Biol, et Med. 1995.- Vol. 18. №3. - P.401 -409.

189. Lucy J. A. Control of membrane permeability and stability //Ann. N.Y. Acad. Sci.- 1972. Vol.203. - P.6-11.

190. Maggio В., Diplock A.T., Lucy J.A. Interactions of tocoferols and ubiquinoneswith monolayers of phospholipids //J. Biochem. 1977. - Vol. 161. - N 1. - P.l 11-121.

191. Matthias F. Melzig, Hedda Bormann. Betulinic Acid inhibits aminopeptidase N activity //Planta Med. 1998. - Vol.64. - P.655-657.

192. Mayaux J.-F., Bousseau A., Pauwels R., Huet Т., henin Y., Dereu N., Evers M., Soler F., Poujade C., Clercq E., Pecq J.-B. Triterpene derivatives that block entry ofhuman immunodeficiency virus type I into cells //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994.

193. Vol.91. -№9.-P.3564-3568. -> 208. Mellors A., Tappel A.L. The inhibition of mitochonndrial peroxidation byubiquinone and ubiquinol //J.Biol.Chem. 1966. - Vol.241. - P.4353-4356.

194. Miura Т., Muraoka S., Ogiso T. Inhibition of hydroxy 1 radical induced protein damages by trolox //Biochem. and Mol. Biol. Inst. - 1993. - Vol. 31. - №1. - P. 125-134.

195. Mori Takeo, Kobaoyashi Kazuhiro., Sakamaki Seiji, Sugiya Yukio. Effects of oral administration of glycyrrhizin and its combinations on urine volume and electrolyte metabolism in rats //Oyo Yakuri 1987. - Vol.34. - №3. - P.293-301. (C.A.V. 108:49307t).

196. Nair P.P., Partnalk R.N., Hausurerth J.W. Cellular transport and binding of d-atocopherol //Tocopherol oxygen and biomembranes. London. - 1978. - P. 121-130.

197. Nair P.P. Vitamin E and metabolism regulation //Ann. N.Y. Acad. Sci. 1972. -e Vol.203. -P.53-61.

198. Nerin K., Suzanza Taha. Ulrich moser and angelo azzi effect of vitamine E and Probucol on dietary cholesterol-induced atherosclerosis in rabbits //Free Radical Biology et Medicine. 1998. -Vol. 24. - № 2. - P.226-233.

199. Nerin К., Taha S., Moser U. et al. Effect of vitamine E and probucol on dietary cholesterol-induced atherosclerosis in rabbits //Free Radical Biology et Medicine. -1998. Vol.24. - Xs2. - P.226-233.

200. Nishino Hoyoku, Shibata Shoji, Hirabayashi Kazuhiro, Ivvata Susumu. Antitumor-promoting activity of glycyrrhetinic acid related compounds //Kyoto-Furitsu Ika Ika Daigaki Zasshi.- 1986,-Vol.95. - №2. - P.1563-1566.

201. Nishino H., Yoshioko K., Iwashima A. Antitumor-promoting activity of glycyrrhetinic acid in mouse skin tumor formation induced by 7,12-dimethylbenza.anthracene plus teleocidin //Carcinogenesis. 1984. - Vol.5. - P. 15291530.

202. Nishino Ы., Yoshioko K., Iwashima A. et al. Glycyrrhetinic acid inhibits tumor-promoting activity of teleocidin and 12-0-tetradecanoylphorbol-13-acetate in two-stage mouse skin carcinogenesis //Jpn. J. Cancer Res. 1986. -Vol.77. - №1. - P.33-38.

203. Nohl H., Jordan W., Youngman R.J. Quinone in biology: functions in electron transfer and oxygen activation //Biol. med. 1986. - Vol.2. - JYqI . - P.211-279.

204. O' Brian C.A., Ward N.E., Vogel V.G. Inhibition of protein kinase С by the 12-0-tetradecanoylphorbol-13-acetate antagonist glycyrrhetinic acid //Cancer Lett. 1990. -Vol.49.-P.9-12.

205. Ohtsuki K., Yakida N. Inhibitory effect of glycyrrhizin on polypeptide phosphorylation by polypeptid protein kinase (kinase P) in vitro //Bioshem. Biophys. Res. Commun. 1988. - Vol.l57. - №2. - P.597-604.

206. Okamoto II., Yoshida D. and Mizusaki S. Inhibition of 12-0-tetradecanoylphorbol-13-acetate-induced induction in Epstein-Barr virus early antigen in Raji cells //Cancer Lett. 1983. - Vol.19. - №1. - P.47-53.

207. Onat D., Boscoboinik D., Azzi A. et al. Effect of a-tocopherol and silibin dihemisuccinate on the proliferation of human skin fibroblasts //Biotechnol. Appl. Biochem. 1999. - Vol.29. - P.213-215.

208. Palozza P., Krinsky N.I. Antioxidant effects of carotenoids in vivo and in vitro -an overview //Methods in Enzymology. 1992. - Vol.213.- P.403 - 420.

209. Perly В., Smith J.C.P., Hughes L. Estimation of the location of natural a-tocopherol in lipid bilayers by 13C NMR spectroscopy //Biochem. et biophys acta; Biomembranes. 1985. -Vol. 819. -N 1. - P.131-135.

210. Pincheira J., Navarrete M.H. Effect of vitamin E on chromosomal aberrations in lymphocytes from patients with Down's syndrome //Clin Genet. 1999. - Vol.55. - №3. -P.192-197.

211. Pompei R., Flore O., Marccialis М.Л. et al. Glycyrrhizic acid inhibits virus growth and inactivates virus particles //Nature. 1979. - Vol.281(5733). - P.689-690.

212. Pompei R., Marcialis М.Л., Flore O., Pani A., Marongiu M.E., Manconi P.E. Influence of hydrocortisone on cytopathic effect of Newcastle disease virus an to freezing of vescicular stomatitis virus //Experientia.- 1978. Vol.34. - №11 - P. 15281529.

213. Pompei R., Pani A., Flore O., Marcialis M.A., Loddo B. Antiviral activity of glycyrrhizic acid //Experientia. 1980. - Vol.36. - №3. - P.304-306.

214. Porter G.A., Phodes C.D. and Sacra P. Comparative studies on the mineralocorticoid action of aldosterone and carbenoxolone sodium in the adrenalectomized rat //Pharmacology. 1974. - Vol.12. - №№ 4-5. - P.224-229.

215. Ruiz-Larrea M.B., Martinez R. et al. Antioxidant activities of estrogens against aqueous and lipophilic radicals: Differences between phenol and catechol estrogens //Chem. Phys. Lipids. 2000. - Vol. 105. - P. 179-188.

216. Sakamoto K.and Wakabayashi K. Inhibitory effect of glycyrrhetinic acid on testosterone production in rat gonad //Endocrinol. Jpn. 1988. - Vol.35. - №2. - P.333-342.

217. Sakamoto W., Nishihira J., Fujie K. et al. Inhibition of macrophage migration inhibitory factor secretion from macrophages by vitamin E //Biochimica et Biophysica Acta. 1998. - Vol.1404. - P.427-434.

218. Schmidt M.L., Kuzmanoff K.L., Ling-Indeck L., Pezzuto J.M. Betulinic Acid ' induces apoptosis in human neuroblastoma cell liness //European Journal of Cancer. —1997. Vol.33.-№12.- P.2007-2010.

219. Schvvarz K. Role of vitamin E, selenium and related factors in experimental nutritional liver disease //Federat. Proc. 1965. - Vol.24. - P.58-67.

220. Schvvarz K. The cellular mechanism of vitamin E action; direct and indirect effect of a-tocopherol on mitochondrial respiration //Ann. N.Y. Acad. Sci. 1972. - Vol.203. -P.45-52.

221. Scott G. Atmospheric oxidation and antioxidants //Amsterdam-New York. Elsevier. 1965.-P. 350.

222. Shamovski I.L., Varovskaya I.Y. Computer molecular simulation of tocopherol two phospholipid complexes //J.Chin Phys. 1991. - Vol. 88.- P.2675-2680.

223. Shamovski I.L., Varovskaya I.Y., Khrapova N.G. et al. Influence of fatti acid composition on the structure and stability of fatti acid complexes with vitamin E //J.Molec. Struct. -1992. Vol. 253. - P.149-159.

224. Shingo Y., Masatoshi H., Kazuo W. et al. Antiulcer activities of Glycyrrhetinic acid derivatives in experimental gastric lesion models //Chem. Pharm. Bull. 1989. -Vol.37. - №9. - P.2500-2504.

225. Sugata S., Urano S., Matsushita Y. et al. A comment on the evaluation of equilibrium constants for a-tocopherol interaction with fatty acids by absorbance in the ultraviolet region //Biochem. et Biophys. Acta. 1988. - Vol. 962. - N. 3. - P.385-386.

226. Suzuki Hidehiko, Nakano Naoko, Ito Masami, Yamashita Naohiro et al. The effect of glycyrrhizin and glycyrrhetic acid on production of 02-and hydrogen peroxide by macrophages //Igaku no Ayumi. 1983. - Vol.124. - № 2. - P.l09-111.

227. Takao Konoshima, Midori Takasaki, Mutsuo Kozuka. Studies on inhibitors ofskin-tumor primotion, I: inhibitory effects of triterpenes from Euptelea Polyandra on к Epstein-Barr virus activation //J.of Natural Products. 1987. - Vol.50. - №6. - P.l 167

228. Takeda Ryoyn, Miyamori Isamu, Soma Ryuichiro, Matsubara Takao, Ikeda ' Masatoshi. Glycyrrhizic acid and its hydrolyzate as mineralocorticoid agonist //J. Steroid

229. Biochemistry. 1987. - Vol.27. - №№4-6. - P.845-849.

230. Takizawa Ilaruo, Konishi Sumie, Nishino Hoyoku. Glycyrrhetic acid: a potent inhibitor of tumor promotion in two-stage carcinogenesis of mouse skin //Kyoto-Furitsu Ika Ika Daigaki Zasshi. 1985. - Vol.94. - №10. - P.999-1004.

231. Terao J., Yamaushi R., Marakami H. et al. Inhibitory effects of a-tocopherol and P-carotene on singlet oxygen-initiated photooxidation on methyllinoleate and soybean oil //J. Food Proc. Presery. 1980. - Vol. 4. - P.79-93.

232. Tsuda H., Okamoto H. Elimination of metabolic cooperation by glycyrrhetinic acid, an anti-tumor promoter in cultured Chinese hamster cell //Carcinogenesis. 1986. -Vol.7-№11.-P. 1805-1807.

233. Virucidal glycyrrhetin 3-O-sulfonate and its salts and their prophylactic or therapeutic use for virus infection //Yashiro Jun, Machid Makoto, Jpn. Kokai Tokkyo Koho 01 238,525; Chem. Abstr., 112, 151845m (1990).

234. Wang H.-K. The therapeutic potential of flavonoids //Exp. Opin. Invest. Drugs. -2000.-Vol.9.-P.2103-2119.

235. Wang X., Takahashi H., Hatta I. et al. An X-ray dijraction study of the effect of I a-tocopherol on the structure and phase behaviour of bilayers of У dimyristoylphosphatidylethanolamine //Biochimica et Biophysica Acta. 19991. Vol.1418. P.335-343.

236. Watanabe К., Yano S. and Yamaguchi T. Effects of carbenoxolone and prostaglandin E2 on transmucosal potential difference in the rat stomach //Scand. J. Gastroenterol. Suppl. 1989. - Vol.24. - Л«162. - P.87-90.

237. Whitehouse M.W., Haslam J.M. Ability of some antirheumatic drugs to uncouple oxidative phosphorylation//Nature. 1962. - Vol.196. - P.1323-1324.

238. Yagi K., Komura S. Inhibitory effect of female hormones on lipid peroxidation //Biochem. Int. 1986. - Vol.13. -P.1051-1055.

239. Yoshinoby Kiso, Masahiro Tohkin., Hiroshi Hikino et al. Mechanism of antihepatotoxic activity of glycyrrhizin, I: Effect on free radical generation and lipid peroxidation //Planta Medica. 1984. - Vol. 50. - №4. - P.298-302.

240. Zhou Y.C., Zheng R.L. Phenolic compounds and an analog as superoxide anion scavengers and antioxidants //Biochem. Pharmacol. 1991. - Vol. 42. - P.l 177-1179.143