Фосфонатные аналоги пептидо-нуклеиновых кислот тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Чуб, Михаил Викторович АВТОР
кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ
1999 ГОД ЗАЩИТЫ
   
02.00.10 КОД ВАК РФ
Диссертация по химии на тему «Фосфонатные аналоги пептидо-нуклеиновых кислот»
 
 
Текст научной работы диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Чуб, Михаил Викторович, Москва

российская академия наук институт биоорганической химии им. м.м. шемякина и

ю.а. овчинникова

на правах рукописи ЧУБ МИХАИЛ ВИКТОРОВИЧ

ФОСФОНАТНЫЕ АНАЛОГИ ПЕПТИДО-НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ: СИНТЕЗ И ГИБРИДИЗАЦИОННЫЕ СВОЙСТВА.

02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

В. А. ЕФИМОВ.

Москва 1999

содержание

Страницы

Список сокращений. ............................................................................................................2

Введение. ..........................................................................................................4

I. Аналоги олигонуклеотидов : типы и их гибридизационные свойства.

(обзор литературы). ..........................................................................5

1.Модифицированные олигонуклеотиды .. 7

2. ПНК. Аналоги и гомологи....................................16

3. ПНК-содержащие конъюгаты................41

ii. Обсуждение результатов.............................................................................................46

III. Экспериментальная часть (материалы и методы)....................................71

Выводы. ..........................................................................................................92

Список литературы. ............................................................................................................93

Список сокращений.

Все обозначения функциональных групп, реагентов и методов даются в латинской транскрипции, за исключением тех, для которых

русскоязычное сокращение общеупотребительно. Обозначения

аминокислот, нуклеозидов приводятся в соответствии с правилами IUPAC.

Ас - ацетил

An - анизоил ( 4-метоксибензоил )

Вое - трет-бутоксикарбонил

Вп - бензил

ВОР -гексафторфосфат бензотриазолил-1-окси-

трис-диметиламинофосфония

¡Bu - изобутирил (2-метилпропаноил )

Bz - бензоил

CPG - шарики из пористого стекла

DBU - 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундек-7-ен

DCA - дихлоруксусная кислота

DCC - М.М'-дициклогексилкарбодиимид

DCM - дихлорметан

DEAD - диэтилазодикарбоксилат

DhbtOH - 2,3-дигидро-3-гидрокси-4-оксо-1,2,3-бензотриазин

DIPC - МД-диизопропилкарбодиимид

DIEA - диизопропилэтиламин

DMAP - 4-диметиламинопиридин

DMF - 1М,1М-диметилформамид

DMSO - диметилсульфоксид

Dmt - 4,4'-диметокситрифенилметил

EDA - этилендиамин

EDTA - этилендиаминотетрауксусная кислота

Fmoc - 9-флуоренилметоксикарбонил

FPLC - быстрая жидкостная хроматография

НATU - гексафторфосфат 7-азабензотриазолил-1 - окси- .

N, N, N', N'-тетраметилурония

HBTU - гексафторфосфат 1-бензотриазолилокси-

N,N,N', N'-тетраметилурония

НОВТ -1 -гидроксибензотриазол

lm - N-имидазолил

MEA - моноэтаноламин

MeCN - ацетонитрил

Melm -1-метилимидазол

Mmt - 4-метокситрифенилметил

Moz - 4-метоксибензилоксикарбонил

NEM - N-этилморфолин

NMM - N-метилморфолин

Np - 4-нитрофенил

PFP - пентафторфенил

PicrH - 2,4,6-тринитрофенол

Py - пиридин

PyBroP - гексафторфосфат 6poM-N,N',N"-TpHC-

пирролидинофосфония.

TCA - трихлоруксусная кислота

TDBTU - тетрафторборат 1 -( 3,4-дигидро-4-оксо-1,2,3-

бензотриазинил )okch-N,N,N',N'-тетраметилурония

TEA - триэтиламин

TEAA - триэтиламмоний ацетат

TEAB - триэтиламмоний бикарбонат

TFA - трифторуксусная кислота

TFMSA - трифторметансульфокислота

THF - тетрагидрофуран

TosCI - п-толуолсульфонилхлорид

TOTU - тетрафторборат ( карбоэтоксицианметилен-

имино )okch-N,N,N',N'-тетраметилурония

TPSCI - 2,4,6-триизопропилбензолсульфонилхлорид

TPSNT - 2,4,6-триизопропилбензолсульфонил-З-нитро-

1,2,4-триазол

Z - бензилоксикарбонил

введение.

За последнее время синтетические олигонуклеотиды вошли в практику как уникальные инструменты для исследований в области молекулярной биологии и биотехнологии. Они широко применяются в качестве зондов и праймеров, как специфические мутагены в белковой и генетической инженерии, а также при получении искусственных генов и регуляторных фрагментов нуклеиновых кислот.

Одной из сфер применения синтетических олигонуклеотидов и в особенности их аналогов является использование в качестве специфических ингибиторов экспрессии генов и репликации вирусов, что создало предпосылки для разработки на их основе лекарственных средств нового поколения, применение которых осуществляется в рамках сформулированных концепций антисенс- и антиген-терапии. С этой целью было предложено большое количество аналогов нуклеиновых кислот, в том числе новый класс соединений - пептидные (полиамидные) нуклеиновые кислоты (ПНК).

Ввиду высокой аффинности к ДНК и РНК, а также устойчивости к деградации внутриклеточными ферментами, эти соединения привлекли внимание исследователей, как перспективные кандидаты для терапевтического использования. Однако биологическое применение ПНК ограничивается их плохой растворимостью в воде, склонностью к самоагрегации, неспособностью активировать РНКазуН и плохим проникновением сквозь клеточные мембраны. В связи с этим представляется актуальным поиск альтернативных соединений, которые, наряду с сохранением хороших гибридизационных характеристик, были бы лишены этих недостатков.

Настоящая работа посвящена разработке схемы синтеза новых ДНК-миметиков - фосфонатных аналогов ПНК (фПНК), и ряда гибридных олигомеров на их основе, а также оценке их физико-химических свойств.

Диссертационная работа выполнена в лаборатории биоинженерии генов Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

i. аналоги олигонуклеотидов : типы и их гибридизационные свойства.

( ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ )

За последнее десятилетие было синтезировано и описано огромное количество разнообразных производных природных олигонукпеотидов и их искусственных аналогов [1-5]. Этот интерес объясняется потенциальной возможностью использования подобного рода соединений в качестве терапевтических средств для лечения генетических повреждений, вирусных инфекций, злокачественных опухрлей и т. п. Их применение мыслится прежде всего в рамках концепций антисенс-[2-5] и антиген-терапии [6].

Идея использования антисенс-механизма подразумевает внутриклеточное комплексообразование мРНК с функциональными аналогами олигонукпеотидов (ФАО) с образованием гибридных дуплексов, которые, в идеальном варианте, должны являться субстратом для клеточной РНКазы Н, катализирующей гидролиз РНКового компонента [2,4,5]. Гибридные дуплексы могут также напрямую препятствовать транскрипции за счет блокирования связывания с рибосомой [2] либо задействовать иной механизм (например, рибозимы [1]). Антиген-механизм нацелен на связывание ФАО непосредственно с геномной ДНК с образованием на комплементарной последовательности триплекса [6] или расплетание двойной спирали с образованием гетеродуплекса [7] , что должно привести к ингибированию транскрипции соответствующих генов, сделать участок связывания мишенью для нукпеаз [8] или химически модифицировать целевую ДНК (окисление [9], алкилирование [10-12] гидролиз [13,14]).

Однако, для применения ФАО в качестве лекарственных средств необходимо выполнение еще целого ряда условий, помимо способности давать дуплекс (триплекс), что резко сужает список претендентов для практического использования, а именно:

а) следует добиться достаточной стабильности препарата по отношению к внутренней среде организма и системам инактивации (в основном к эндогенным нуклеазам, которые делают практически невозможным использование природных олигонуклеотидов ) [2-5];

б) необходимо обеспечить эффективную доставку препарата в клетку - в ядро (для антиген-терапии ) или только в цитоплазму (для антисенс- терапии), что может быть достигнуто конъюгацией с мембраноактивными компонентами для увеличения проницаемости через клеточную мембрану [15,16] или использованием клеточных систем транспорта (эндоцитоз [17]);

в) необходимо добиться высокой специфичности действия реагента на строго определенную комплементарную последовательность, так как с повышением общего сродства может возрастать неспецифическое взаимодействие и снижаться, например, дискриминация единичной комплементарной пары [18];

г) следует максимально уменьшить побочное воздействие ФАО на другие системы организма за счет связывания с тканевыми белками, активации иммунной системы, комплексообразования с ионами металлов [3] и т.п.

Кроме того, очень важной является проблема снижения стоимости получаемых ФАО.

Несмотря на большой прогресс, достигнутый в этой области за последние годы, соединений, полностью отвечающих данным требованиям до сих пор не найдено. Поиск этих соединений продолжается в основном в трех направлениях : введение новых модификаций в природные олигонуклеотиды, конструирование и синтез искусственных аналогов олигонуклеотидов, получение конъюгатов олигонуклеотидов обоих типов с молекулами, способными осуществить адресную доставку антисенс- или антиген-олигонуклеотидов к соответствующим мишеням. Рассмотрению работ в этих направлениях и посвящен настоящий литературный обзор.

1.1. Модифицированные олигонуклеотиды.

Одним из основных подходов является модификация природной фосфодиэфирной связи (рис.1) в частности, замещение кислорода гетероатомами: азотом (фосфамиды (1) [19-21] ); серой ( тиофосфаты (2) [3,22]; дитиофосфаты (3) [23-25]); бором ( боранофосфаты (4) [26,27]); водородом (Н-фосфонаты (5) [28]); алкильной группой (6) [29] ( в частности, метилфосфонаты [30-32]); алкоксигруппой (фосфотриэфиры (7) [33];

№ X V Т

1 -0- -Р(0)1ЧНР- -0-

2 -0- -Р(0)в-- -0-

3 -0- -Р(8)8"- -0-

4 -0- -Р(0)ВНз"- -0-

5 -0- -Р(0)Н- -0-

6 -0- -Р(0)А1к- -0-

7 -0- -Р(0)0А1к- -0-

8 -0- -СН2- -0-

9 -в- -сн2- -0-

10 -СН2- -ММе- -0-

11 -СН2- -С(= 0)- -мн-

12 -Р(0)0" -0-

13 -МН- -С(= Ш2)+- -ын-

Р - Н, ОН, ОА1к, Р, Вг К1. - продолжение цепи.

х" "к

Рисунок 1.

Все эти соединения (за исключением дитиофосфатов) являются оптически активными. Показано, что Рр и Бр изомеры обладают неодинаковым сродством к комплементарной матрице [34,35], при этом оптически чистые (Чр- изомеры ( фосфамиды [20] и метилфосфонаты [35,36]) и Эр- изомеры (тиофосфаты [34,37]), имеющие одинаковое

пространственное расположение заместителей, как правило связываются с большей аффинностью, чем соответствующие стереоизомеры. Помимо различия в сродстве, наличие Р-хиральных звеньев влияет на взаимодействие с ферментами, которые также могут различать стереоизомеры [27,38].

Замена кислорода серой оказалась одной из наиболее удачных. В общем случае, температура плавления ( Тт ) дуплексов тиофосфатных аналогов олигонуклеотидов с ДНК(РНК) несколько ниже природных, что можно скомпенсировать увеличением длины либо содержания гуанина и цитозина [5]. Одно из главных . достоинств тиофосфатных олигонуклеотидов- активация РНКазыН при образовании дуплекса с РНК, что предполагает высокую степень блокирования трансляции при низких концентрациях; кроме того, они устойчивы к действию нуклеаз [3,5].

Чтобы исключить проблемы, связанные с получением стереоизомеров, Карузерс и сотр. [5] получили дитиофосфатные олигонуклеотиды. Эти соединения являются изоэлекгронными аналогами ДНК и не разрушаются нуклеазами. Однако, гибридный комплекс с РНК, по сравнению с комплексом ДНК/РНК, имеет пониженную температуру плавления ( 1-2°С/мод.), а из-за высокого содержания серы дитиофосфаты активно взаимодействуют с белками, как следствие, они более токсичны.РНКазаН активируется слабо [5].

Модификация фосфата увеличивает стабильность олигонуклеотида по отношению к действию нуклеаз, вместе с тем тиофосфатный и дитиофосфатный дуплексы с комплементарной РНК остаются субстратами для РНКазыН [3,5]. Описаны соединения, содержащие более одного гетероатома у фосфора (алкилтиофосфонаты [29]), а также тионотриэфиры [15,16].

Ряд работ посвящен теме замещения анионного кислорода катионогенной группировкой (аминоалкилфосфотриэфиры [39], аминоалкилфосфонаты [40]). Соответствующие олигомеры получают на основе динуклеозидных синтонов, содержащих чистый диастереомер. В некоторых случаях это приводит к возрастанию стабильности дуплексов [40], видимо за счет компенсации электростатического отталкивания цепей

[40,41], в ряде случев при связывании наблюдалась выраженная рН-зависимость [42]. .Летзингер и сотр. [5] показали, что олигомер, содержащий анионные и стереоспецифичные катионные звенья дает дуплекс с РНК с температурой плавления +2,3°С/мод..

Совсем недавно японскими исследователями были получены Н-фосфонатные олигонуклеотиды (5). Описан синтез пурин-пиримидинового тетрамера и тиминсодержащего декамера. Данных по гибридизации не приведено [28].

К неионным аналогам относятся метилфосфонаты. Олигонуклеотиды (6) на их основе полностью устойчивы к действию экзо-и эндонуклеаз. Гибридные комплексы с РНК не являются субстратом для РНКазыН, но "химерные олигомеры", содержащие шесть природных нуклеотидов и два метилфосфонатных (по одному с 3' и 5' концов), вступив во взаимодействие с РНК, способны активировать РНКазуН и проявляют определенную активность in vivo [5] ( в основном это относится к Rp-изомерам).

Следующая ступень модификаций - замена фосфата неким связующим звеном с соответствующим количеством связей. Были предложены формацетальные (8) [43-45] и тиоформацетальные (9) [46-49] производные. Причем, 3-OCH2S-5' оказался неудачным вариантом, видимо, из-за того, что связь C-S имеет большую длину, чем С-0 и в 5'-тиопроизводном дестабилизирована оптимальная гош-конформация двух гетероатомов ( кислорода рибозы и серы ). Олигонуклеотиды, имеющие в своем составе изостеры (9) дают стабильный комплекс с РНК-мишенью (+0,8°С/мод.) [5,49]. Олигомеры такого типа (на основе динуклеозидных синтонов) проявляют антисенсную активность in vitro и имеют повышенную устойчивость к действию нуклеаз.

Описаны метилен(метилимино) "двойки" (MMI) (10) [5,50-52], содержащие вместо фосфата фрагмент М,0-диалкилгидроксиламина. Олигомеры на их основе дают стабильный комплекс с РНК, являющийся вместе с тем субстратом для РНКазыН. ЯМР исследования показали, что З'-метиленовая группа сдвигает равновесие конформаций рибозы в область З'-эндо, таким образом преорганизуя молекулу для образрования

дуплекса А-формы. Особенно перспективными считаются производные рибо- ряда, с метокси- группой при 2' углеродном атоме [5]. Предложен карбоксамидный вариант межнуклеозидной связи (11) [5]. Определенная преорганизация здесь, как и в случае с ММ! аналогами, приводит к увеличению аффинности к комплементарной РНК (+0,1°С/мод.). Олигомер устойчив к экзо- и эндонуклеазам, но РНКазаН активна только в случае блокирования этими производными 3' и 5' концов природного олигонукпеотида.

Максимальная Тщ дуплекса с поли гА ( >30°С при низкой ионной силе раствора, причем речь идет о пентамере Т ) описана для олигомера, у которого фосфатная анионная группировка замещена на катионную гуанидиновую ( "дезоксирибонуклеиновые гуанидины" , ( РМв )), (13) [5356]. Наблюдается именно специфичное связывание, так как с поли г(_1, поли гв, поли гС взаимодействия не наблюдалось [5].

Довольно удачным вариантом оказалась замена мостикового 3' кислородного атома на азот и получение соответствующего олигомерного фосфамида (12) [57-60]. Проведенные исследования показали, что рибозное кольцо при замене 3' кислорода на азот переходит из преимущественно С2' -эндо в СЗ1 -эндо, что приводит к стабильному дуплексу А-типа с комплементарной РНК. Были предложены различные варианты смешанных олигонуклеотидов, содержащих наряду с природными фосфодиэфирными связями фосфамидные М3'-»Р5', включая цвиттерионную последовательность, где анионный кислород через один замещен на остаток 1,1-диметилтриметилендиамина [61]. Замена -ОН при С2' на -Р или -ОМе увеличивает стабильность гетеродуплекса. К сожалению, РНКазаН не активируется [5].

В работе [62] предложен карбоксамидо-фосфонатный вариант олигонукпеотида (14). Полученный декамер давал устойчивый дуплекс с комплементарной ДНК (РНК). Тщ практически совпадала с соответствующими для ДНК/ДНК и ДНК/РНК.

11 /ч

■о—P/XNH

1

OR,

Thy

R

r20

r2o

r1, r2 - продолжение цепи.

(14)

(15)

Суть следующего подхода заключается в том, что при введении заместителей в рибофуранозное кольцо достигается в какой-то степени фиксация СЗ'-эндо конформации, характерной для А-формы ДНК и РНК в отличие от С2'-эндо, характерной для В-формы ДНК. Поскольку ДНК/РНК гетеродуплекс более стабилен, чем ДНК/ДНК, то можно предположить более высокую аффинность олигомеров из таким образом модифицированных нуклеозидов. Получен целый ряд 2'-0-алкилнукпеозидов (метильные [63], этильные [64], аллильные [65] и т. п. ) и 2'-галогенпроизводных (2'-фтор [66,67] и 2'-бромпроизводных [68]). Показано, что соединения, относящиеся к рибо- ряду имеют аффинность выше, чем члены арабино- ряда и определяется полярностью и размером заместителя. Известны также 2',2'- дифторнуклеозиды [69].

В еще большей степени фиксируется СЗ'-эндо конформация у так называемых LNA ( Locked Nucleic Acid ) олигомеров, содержащих 2'-0,4'-С-метиленбициклонуклеозиды. Введение этих производных в олигонуклеотиды приводило к беспрецедентному увеличению Тт комплекса с ДНК(РНК) ( ДТщ = 3-8°С на модификацию) при сохранении специфичности связывания [70,71]. Были также получены 2'-S,4'-C-метиленбициклонуклеозиды [72], 3'-0,4'-С-метиленбициклонуклеозиды [73] и 2',3'-бицикло-производные [74].

Недавн�