Фосфонатные аналоги пептидо-нуклеиновых кислот тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ
Чуб, Михаил Викторович
АВТОР
|
||||
кандидата химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
Москва
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
1999
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
02.00.10
КОД ВАК РФ
|
||
|
российская академия наук институт биоорганической химии им. м.м. шемякина и
ю.а. овчинникова
на правах рукописи ЧУБ МИХАИЛ ВИКТОРОВИЧ
ФОСФОНАТНЫЕ АНАЛОГИ ПЕПТИДО-НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ: СИНТЕЗ И ГИБРИДИЗАЦИОННЫЕ СВОЙСТВА.
02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ
Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук
Научный руководитель: доктор химических наук, профессор
В. А. ЕФИМОВ.
Москва 1999
содержание
Страницы
Список сокращений. ............................................................................................................2
Введение. ..........................................................................................................4
I. Аналоги олигонуклеотидов : типы и их гибридизационные свойства.
(обзор литературы). ..........................................................................5
1.Модифицированные олигонуклеотиды .. 7
2. ПНК. Аналоги и гомологи....................................16
3. ПНК-содержащие конъюгаты................41
ii. Обсуждение результатов.............................................................................................46
III. Экспериментальная часть (материалы и методы)....................................71
Выводы. ..........................................................................................................92
Список литературы. ............................................................................................................93
Список сокращений.
Все обозначения функциональных групп, реагентов и методов даются в латинской транскрипции, за исключением тех, для которых
русскоязычное сокращение общеупотребительно. Обозначения
аминокислот, нуклеозидов приводятся в соответствии с правилами IUPAC.
Ас - ацетил
An - анизоил ( 4-метоксибензоил )
Вое - трет-бутоксикарбонил
Вп - бензил
ВОР -гексафторфосфат бензотриазолил-1-окси-
трис-диметиламинофосфония
¡Bu - изобутирил (2-метилпропаноил )
Bz - бензоил
CPG - шарики из пористого стекла
DBU - 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундек-7-ен
DCA - дихлоруксусная кислота
DCC - М.М'-дициклогексилкарбодиимид
DCM - дихлорметан
DEAD - диэтилазодикарбоксилат
DhbtOH - 2,3-дигидро-3-гидрокси-4-оксо-1,2,3-бензотриазин
DIPC - МД-диизопропилкарбодиимид
DIEA - диизопропилэтиламин
DMAP - 4-диметиламинопиридин
DMF - 1М,1М-диметилформамид
DMSO - диметилсульфоксид
Dmt - 4,4'-диметокситрифенилметил
EDA - этилендиамин
EDTA - этилендиаминотетрауксусная кислота
Fmoc - 9-флуоренилметоксикарбонил
FPLC - быстрая жидкостная хроматография
НATU - гексафторфосфат 7-азабензотриазолил-1 - окси- .
N, N, N', N'-тетраметилурония
HBTU - гексафторфосфат 1-бензотриазолилокси-
N,N,N', N'-тетраметилурония
НОВТ -1 -гидроксибензотриазол
lm - N-имидазолил
MEA - моноэтаноламин
MeCN - ацетонитрил
Melm -1-метилимидазол
Mmt - 4-метокситрифенилметил
Moz - 4-метоксибензилоксикарбонил
NEM - N-этилморфолин
NMM - N-метилморфолин
Np - 4-нитрофенил
PFP - пентафторфенил
PicrH - 2,4,6-тринитрофенол
Py - пиридин
PyBroP - гексафторфосфат 6poM-N,N',N"-TpHC-
пирролидинофосфония.
TCA - трихлоруксусная кислота
TDBTU - тетрафторборат 1 -( 3,4-дигидро-4-оксо-1,2,3-
бензотриазинил )okch-N,N,N',N'-тетраметилурония
TEA - триэтиламин
TEAA - триэтиламмоний ацетат
TEAB - триэтиламмоний бикарбонат
TFA - трифторуксусная кислота
TFMSA - трифторметансульфокислота
THF - тетрагидрофуран
TosCI - п-толуолсульфонилхлорид
TOTU - тетрафторборат ( карбоэтоксицианметилен-
имино )okch-N,N,N',N'-тетраметилурония
TPSCI - 2,4,6-триизопропилбензолсульфонилхлорид
TPSNT - 2,4,6-триизопропилбензолсульфонил-З-нитро-
1,2,4-триазол
Z - бензилоксикарбонил
введение.
За последнее время синтетические олигонуклеотиды вошли в практику как уникальные инструменты для исследований в области молекулярной биологии и биотехнологии. Они широко применяются в качестве зондов и праймеров, как специфические мутагены в белковой и генетической инженерии, а также при получении искусственных генов и регуляторных фрагментов нуклеиновых кислот.
Одной из сфер применения синтетических олигонуклеотидов и в особенности их аналогов является использование в качестве специфических ингибиторов экспрессии генов и репликации вирусов, что создало предпосылки для разработки на их основе лекарственных средств нового поколения, применение которых осуществляется в рамках сформулированных концепций антисенс- и антиген-терапии. С этой целью было предложено большое количество аналогов нуклеиновых кислот, в том числе новый класс соединений - пептидные (полиамидные) нуклеиновые кислоты (ПНК).
Ввиду высокой аффинности к ДНК и РНК, а также устойчивости к деградации внутриклеточными ферментами, эти соединения привлекли внимание исследователей, как перспективные кандидаты для терапевтического использования. Однако биологическое применение ПНК ограничивается их плохой растворимостью в воде, склонностью к самоагрегации, неспособностью активировать РНКазуН и плохим проникновением сквозь клеточные мембраны. В связи с этим представляется актуальным поиск альтернативных соединений, которые, наряду с сохранением хороших гибридизационных характеристик, были бы лишены этих недостатков.
Настоящая работа посвящена разработке схемы синтеза новых ДНК-миметиков - фосфонатных аналогов ПНК (фПНК), и ряда гибридных олигомеров на их основе, а также оценке их физико-химических свойств.
Диссертационная работа выполнена в лаборатории биоинженерии генов Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.
i. аналоги олигонуклеотидов : типы и их гибридизационные свойства.
( ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ )
За последнее десятилетие было синтезировано и описано огромное количество разнообразных производных природных олигонукпеотидов и их искусственных аналогов [1-5]. Этот интерес объясняется потенциальной возможностью использования подобного рода соединений в качестве терапевтических средств для лечения генетических повреждений, вирусных инфекций, злокачественных опухрлей и т. п. Их применение мыслится прежде всего в рамках концепций антисенс-[2-5] и антиген-терапии [6].
Идея использования антисенс-механизма подразумевает внутриклеточное комплексообразование мРНК с функциональными аналогами олигонукпеотидов (ФАО) с образованием гибридных дуплексов, которые, в идеальном варианте, должны являться субстратом для клеточной РНКазы Н, катализирующей гидролиз РНКового компонента [2,4,5]. Гибридные дуплексы могут также напрямую препятствовать транскрипции за счет блокирования связывания с рибосомой [2] либо задействовать иной механизм (например, рибозимы [1]). Антиген-механизм нацелен на связывание ФАО непосредственно с геномной ДНК с образованием на комплементарной последовательности триплекса [6] или расплетание двойной спирали с образованием гетеродуплекса [7] , что должно привести к ингибированию транскрипции соответствующих генов, сделать участок связывания мишенью для нукпеаз [8] или химически модифицировать целевую ДНК (окисление [9], алкилирование [10-12] гидролиз [13,14]).
Однако, для применения ФАО в качестве лекарственных средств необходимо выполнение еще целого ряда условий, помимо способности давать дуплекс (триплекс), что резко сужает список претендентов для практического использования, а именно:
а) следует добиться достаточной стабильности препарата по отношению к внутренней среде организма и системам инактивации (в основном к эндогенным нуклеазам, которые делают практически невозможным использование природных олигонуклеотидов ) [2-5];
б) необходимо обеспечить эффективную доставку препарата в клетку - в ядро (для антиген-терапии ) или только в цитоплазму (для антисенс- терапии), что может быть достигнуто конъюгацией с мембраноактивными компонентами для увеличения проницаемости через клеточную мембрану [15,16] или использованием клеточных систем транспорта (эндоцитоз [17]);
в) необходимо добиться высокой специфичности действия реагента на строго определенную комплементарную последовательность, так как с повышением общего сродства может возрастать неспецифическое взаимодействие и снижаться, например, дискриминация единичной комплементарной пары [18];
г) следует максимально уменьшить побочное воздействие ФАО на другие системы организма за счет связывания с тканевыми белками, активации иммунной системы, комплексообразования с ионами металлов [3] и т.п.
Кроме того, очень важной является проблема снижения стоимости получаемых ФАО.
Несмотря на большой прогресс, достигнутый в этой области за последние годы, соединений, полностью отвечающих данным требованиям до сих пор не найдено. Поиск этих соединений продолжается в основном в трех направлениях : введение новых модификаций в природные олигонуклеотиды, конструирование и синтез искусственных аналогов олигонуклеотидов, получение конъюгатов олигонуклеотидов обоих типов с молекулами, способными осуществить адресную доставку антисенс- или антиген-олигонуклеотидов к соответствующим мишеням. Рассмотрению работ в этих направлениях и посвящен настоящий литературный обзор.
1.1. Модифицированные олигонуклеотиды.
Одним из основных подходов является модификация природной фосфодиэфирной связи (рис.1) в частности, замещение кислорода гетероатомами: азотом (фосфамиды (1) [19-21] ); серой ( тиофосфаты (2) [3,22]; дитиофосфаты (3) [23-25]); бором ( боранофосфаты (4) [26,27]); водородом (Н-фосфонаты (5) [28]); алкильной группой (6) [29] ( в частности, метилфосфонаты [30-32]); алкоксигруппой (фосфотриэфиры (7) [33];
№ X V Т
1 -0- -Р(0)1ЧНР- -0-
2 -0- -Р(0)в-- -0-
3 -0- -Р(8)8"- -0-
4 -0- -Р(0)ВНз"- -0-
5 -0- -Р(0)Н- -0-
6 -0- -Р(0)А1к- -0-
7 -0- -Р(0)0А1к- -0-
8 -0- -СН2- -0-
9 -в- -сн2- -0-
10 -СН2- -ММе- -0-
11 -СН2- -С(= 0)- -мн-
12 -Р(0)0" -0-
13 -МН- -С(= Ш2)+- -ын-
Р - Н, ОН, ОА1к, Р, Вг К1. - продолжение цепи.
х" "к
Рисунок 1.
Все эти соединения (за исключением дитиофосфатов) являются оптически активными. Показано, что Рр и Бр изомеры обладают неодинаковым сродством к комплементарной матрице [34,35], при этом оптически чистые (Чр- изомеры ( фосфамиды [20] и метилфосфонаты [35,36]) и Эр- изомеры (тиофосфаты [34,37]), имеющие одинаковое
пространственное расположение заместителей, как правило связываются с большей аффинностью, чем соответствующие стереоизомеры. Помимо различия в сродстве, наличие Р-хиральных звеньев влияет на взаимодействие с ферментами, которые также могут различать стереоизомеры [27,38].
Замена кислорода серой оказалась одной из наиболее удачных. В общем случае, температура плавления ( Тт ) дуплексов тиофосфатных аналогов олигонуклеотидов с ДНК(РНК) несколько ниже природных, что можно скомпенсировать увеличением длины либо содержания гуанина и цитозина [5]. Одно из главных . достоинств тиофосфатных олигонуклеотидов- активация РНКазыН при образовании дуплекса с РНК, что предполагает высокую степень блокирования трансляции при низких концентрациях; кроме того, они устойчивы к действию нуклеаз [3,5].
Чтобы исключить проблемы, связанные с получением стереоизомеров, Карузерс и сотр. [5] получили дитиофосфатные олигонуклеотиды. Эти соединения являются изоэлекгронными аналогами ДНК и не разрушаются нуклеазами. Однако, гибридный комплекс с РНК, по сравнению с комплексом ДНК/РНК, имеет пониженную температуру плавления ( 1-2°С/мод.), а из-за высокого содержания серы дитиофосфаты активно взаимодействуют с белками, как следствие, они более токсичны.РНКазаН активируется слабо [5].
Модификация фосфата увеличивает стабильность олигонуклеотида по отношению к действию нуклеаз, вместе с тем тиофосфатный и дитиофосфатный дуплексы с комплементарной РНК остаются субстратами для РНКазыН [3,5]. Описаны соединения, содержащие более одного гетероатома у фосфора (алкилтиофосфонаты [29]), а также тионотриэфиры [15,16].
Ряд работ посвящен теме замещения анионного кислорода катионогенной группировкой (аминоалкилфосфотриэфиры [39], аминоалкилфосфонаты [40]). Соответствующие олигомеры получают на основе динуклеозидных синтонов, содержащих чистый диастереомер. В некоторых случаях это приводит к возрастанию стабильности дуплексов [40], видимо за счет компенсации электростатического отталкивания цепей
[40,41], в ряде случев при связывании наблюдалась выраженная рН-зависимость [42]. .Летзингер и сотр. [5] показали, что олигомер, содержащий анионные и стереоспецифичные катионные звенья дает дуплекс с РНК с температурой плавления +2,3°С/мод..
Совсем недавно японскими исследователями были получены Н-фосфонатные олигонуклеотиды (5). Описан синтез пурин-пиримидинового тетрамера и тиминсодержащего декамера. Данных по гибридизации не приведено [28].
К неионным аналогам относятся метилфосфонаты. Олигонуклеотиды (6) на их основе полностью устойчивы к действию экзо-и эндонуклеаз. Гибридные комплексы с РНК не являются субстратом для РНКазыН, но "химерные олигомеры", содержащие шесть природных нуклеотидов и два метилфосфонатных (по одному с 3' и 5' концов), вступив во взаимодействие с РНК, способны активировать РНКазуН и проявляют определенную активность in vivo [5] ( в основном это относится к Rp-изомерам).
Следующая ступень модификаций - замена фосфата неким связующим звеном с соответствующим количеством связей. Были предложены формацетальные (8) [43-45] и тиоформацетальные (9) [46-49] производные. Причем, 3-OCH2S-5' оказался неудачным вариантом, видимо, из-за того, что связь C-S имеет большую длину, чем С-0 и в 5'-тиопроизводном дестабилизирована оптимальная гош-конформация двух гетероатомов ( кислорода рибозы и серы ). Олигонуклеотиды, имеющие в своем составе изостеры (9) дают стабильный комплекс с РНК-мишенью (+0,8°С/мод.) [5,49]. Олигомеры такого типа (на основе динуклеозидных синтонов) проявляют антисенсную активность in vitro и имеют повышенную устойчивость к действию нуклеаз.
Описаны метилен(метилимино) "двойки" (MMI) (10) [5,50-52], содержащие вместо фосфата фрагмент М,0-диалкилгидроксиламина. Олигомеры на их основе дают стабильный комплекс с РНК, являющийся вместе с тем субстратом для РНКазыН. ЯМР исследования показали, что З'-метиленовая группа сдвигает равновесие конформаций рибозы в область З'-эндо, таким образом преорганизуя молекулу для образрования
дуплекса А-формы. Особенно перспективными считаются производные рибо- ряда, с метокси- группой при 2' углеродном атоме [5]. Предложен карбоксамидный вариант межнуклеозидной связи (11) [5]. Определенная преорганизация здесь, как и в случае с ММ! аналогами, приводит к увеличению аффинности к комплементарной РНК (+0,1°С/мод.). Олигомер устойчив к экзо- и эндонуклеазам, но РНКазаН активна только в случае блокирования этими производными 3' и 5' концов природного олигонукпеотида.
Максимальная Тщ дуплекса с поли гА ( >30°С при низкой ионной силе раствора, причем речь идет о пентамере Т ) описана для олигомера, у которого фосфатная анионная группировка замещена на катионную гуанидиновую ( "дезоксирибонуклеиновые гуанидины" , ( РМв )), (13) [5356]. Наблюдается именно специфичное связывание, так как с поли г(_1, поли гв, поли гС взаимодействия не наблюдалось [5].
Довольно удачным вариантом оказалась замена мостикового 3' кислородного атома на азот и получение соответствующего олигомерного фосфамида (12) [57-60]. Проведенные исследования показали, что рибозное кольцо при замене 3' кислорода на азот переходит из преимущественно С2' -эндо в СЗ1 -эндо, что приводит к стабильному дуплексу А-типа с комплементарной РНК. Были предложены различные варианты смешанных олигонуклеотидов, содержащих наряду с природными фосфодиэфирными связями фосфамидные М3'-»Р5', включая цвиттерионную последовательность, где анионный кислород через один замещен на остаток 1,1-диметилтриметилендиамина [61]. Замена -ОН при С2' на -Р или -ОМе увеличивает стабильность гетеродуплекса. К сожалению, РНКазаН не активируется [5].
В работе [62] предложен карбоксамидо-фосфонатный вариант олигонукпеотида (14). Полученный декамер давал устойчивый дуплекс с комплементарной ДНК (РНК). Тщ практически совпадала с соответствующими для ДНК/ДНК и ДНК/РНК.
11 /ч
■о—P/XNH
1
OR,
Thy
R
r20
r2o
r1, r2 - продолжение цепи.
(14)
(15)
Суть следующего подхода заключается в том, что при введении заместителей в рибофуранозное кольцо достигается в какой-то степени фиксация СЗ'-эндо конформации, характерной для А-формы ДНК и РНК в отличие от С2'-эндо, характерной для В-формы ДНК. Поскольку ДНК/РНК гетеродуплекс более стабилен, чем ДНК/ДНК, то можно предположить более высокую аффинность олигомеров из таким образом модифицированных нуклеозидов. Получен целый ряд 2'-0-алкилнукпеозидов (метильные [63], этильные [64], аллильные [65] и т. п. ) и 2'-галогенпроизводных (2'-фтор [66,67] и 2'-бромпроизводных [68]). Показано, что соединения, относящиеся к рибо- ряду имеют аффинность выше, чем члены арабино- ряда и определяется полярностью и размером заместителя. Известны также 2',2'- дифторнуклеозиды [69].
В еще большей степени фиксируется СЗ'-эндо конформация у так называемых LNA ( Locked Nucleic Acid ) олигомеров, содержащих 2'-0,4'-С-метиленбициклонуклеозиды. Введение этих производных в олигонуклеотиды приводило к беспрецедентному увеличению Тт комплекса с ДНК(РНК) ( ДТщ = 3-8°С на модификацию) при сохранении специфичности связывания [70,71]. Были также получены 2'-S,4'-C-метиленбициклонуклеозиды [72], 3'-0,4'-С-метиленбициклонуклеозиды [73] и 2',3'-бицикло-производные [74].
Недавн�