Спонтанная и промотированная ассоциация олигоглициновых пептидов и гликопептидов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

На правах, рукописи

,<*>./ V

Цыганкова Светлана Владимировна

Спонтанная и промотированная ассоциация олигоглициновых пептидов и гликопептидов

02.00.10 - Биоорганическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

005059102

мда 2013

Москва 2013

005059102

Работа выполнена в лаборатории углеводов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН)

Научный руководитель:

Бовин Николай Владимирович, доктор химических наук, профессор, заведующий лабораторией углеводов ИБХ РАН

Официальные оппоненты:

Водовозова Елена Львовна, доктор химических наук, заведующая лабораторией химии липидов ИБХ РАН

Ефимов Александр Васильевич, доктор химических наук, заведующий лабораторией моделирования белковых структур Института белка РАН

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт физической химии и электрохимии имени А.Н. Фрумкина Российской академии наук

Защита диссертации состоится 23 мая 2013 года в 10-00 часов на заседании диссертационного совета Д.002.019.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении на)ки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117997 ГСП-7, г. Москва, В-437. ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

Автореферат разослан апрель 2013 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор физико-математических наук

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Конструирование супрамолекулярных наноматериалов, нанолекарств и наноустройств путем самосборки небольших органических молекул привлекает, в первую • очередь, своей «технологичностью». В качестве исходных органических молекул наиболее удобны пептиды и небольшие белки, поскольку они хорошо изучены, структурно разнообразны и способны к межмолекулярному узнаванию, а синтезировать их можно биотехнологическим путем. Однако пептидные молекулы пока не нашли широкого применения в нанотехнологии из-за низкой термической, химической и биологической стабильности. Материалы, построенные из несклонных к рацемизации аминокислот, в частности, из глицина, не имеют этих недостатков. Олигомеры глицина в виде неканонической спиральной структуры полиглицин-П (ПГ-Н) образуют сеть водородных связей с шестью соседними цепями. Организация линейного олигоглицина в разветвленные, так называемые трех- и четырехантенные пептиды, позволила получить новый класс простых молекул, обладающих способностью формировать в водной среде уникальные супрамеры в виде плоских листов мономолекулярной толщины. Для нанотехнологии такие двумерные кристаллы привлекательны благодаря атомной степени гладкости формируемых ими поверхностей, а для медицины -, возможностью их гликозилированных производных эффективно и специфично блокировать вирусы. Понимание закономерностей, связывающих структуру олигоглицинов со способностью образовывать супрамеры, открывает возможность получения материалов с новыми, необычными свойствами - и заданными характеристиками.

Цели работы: синтез молекул общей формулы И-С1уп-Х-01уп-Я с разным числом глициновых звеньев п, отличающихся структурой соединяющего пептидные цепи фрагмента X (кора); изучение ассоциации этих двухантенных олигоглицинов в водной среде и сравнение способности к ассоциации двух-,

трех- и четырехантенных олигоглицинов; поиск воспроизводимых условий получения протяженных атомно-гладких слоев на поверхности слюды, а также условий формирования нанопаттернов; оценка противовирусных . свойств сиапопроизводных двухантенных олигоглицинов.

Научная новизна и практическая значимость. Впервые синтезированы двухантенные олигоглицины с олигоэтиленгликольным, этиленовым и декаметиленовым корами. Проведено систематическое изучение широкого класса самоассоциирующих олигоглицинов, который включает двух-, трех- и четырехантенные молекулы, в результате чего открылась возможность прогнозировать свойства пока еще не синтезированных аналогов.

Изучено влияние поверхности материала-матрицы на процесс образования тектомерного слоя, выявлены механизм ассоциации и закономерности формирования одно-, двух- и многослойных супрамеров на поверхности. Показана возможность получения атомно-гладких слоев на слюде, в том числе функционализированных и способных самовосстановливаться, что востребовано в наноэлектронике и нанооптике.

Показана возможность конструирования блокаторов вируса гриппа на основе синтезированных двухантенных сиалоолигоглицинов.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано три статьи и одна глава в книге. Основные материалы диссертации были представлены на пяти международных научных конференциях.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из

введения, обзора литературы, посвященного самоассоциирующим пептидам,

обсуждения результатов, заключения, выводов, экспериментальной части и

¡10

списка цитированной литературы. Общий объем диссертации | }истраниц,

библиография содержит_ сылок.

Основное содержание работы

В лаборатории углеводов ИБХ РАН синтезированы и охарактеризованы четырехантенные пептиды, способные собираться в водной среде в атомно-гладкие плоские слои*. Совокупность данных атомно-силовой микроскопии (АСМ) и спектральных характеристик позволила предложить модель молекулярной организации супрамеров, которые получили название тектомеры. В мономолекулярном слое молекулы находятся в конформации "2 + 2" (рис. 1а), то есть две антенны направлены к поверхности, а две другие -в противоположную сторону; олигоглициновые цепи формируют структуру полиглицин-ll (Згспирали стабилизированы высококооперативной системой межцепочечных водородных связей, направленных перпендикулярно оси цепей). Позднее было показано, что аналогичные трехантенные**

раствор

І а.мшюгрушіа ш олшоїлиииновая • метальная

антенна группа слюда

Рисунок 1. АСМ-изображение и ЗО-моделъ четырехантенного тектомера, образованного пептидом [H-Gly7-NHCH2]4C (слева). Структурная организация полиглицина-П (справа). Модель сборки четырехантенного (а) и трехантенного (б) тектомера (внизу).

"А.В. Tuzikov, et al, ChemBioChem, 2003, V. 4, 147-154. "Н.В. Бовин, Российские нанотехнол., 2008. Т. 3, 48-61

олигоглицины также способны формировать супрамеры со структурой ПГ-П, в которой мономеры принимают конформацию "3+0" (рис. 16). Противовирусная активность сиапопроизводных . таких олигоглицинов оказалась на 2 - 3 порядка выше, чем у неспособных к ассоциации структурных аналогов. В данной диссертационной работе синтезированы двухантенные олигоглицины, изучена их способность к ассоциации и противовирусная активность сиалированных производных.

1. Синтез двухантенных олигоглицинов и их гликопроизводных

Были синтезированы двухантенные олигоглицины общей формулы, представленной на рисунке 2, отличающиеся природой кора X, длиной

о о

,Н , г II Н1

п=1-7

Л I ^^ N

н н

X: -(СН2)2- С2

-<сн2)10- сю

-(СН,СН,0),СН,СН2- оэг

II =Н, вир

но соон

о

№еи5Аса-8р1-

НО.

ОН

СООН

он

ОН 1?и о

О^СНз

НО /0Н <?оон °н

--------ип у"

"" ОН он

З'БЬ^рЗ-

о

Рисунок 2. Двухантенные олигоглицины и их гликопроизводные.

олигоглициновых антенн, а также наличием или отсутствием терминальных углеводных фрагментов (5иц), содержащих остаток а-Л'-ацетилнейраминовой кислоты (К'еи5Аса).

^МН2 2. СР3СООН 3. НСІ (2М)

1. ВосЄІуОМЗи

аА ^ АА

I ^^ N N ^^ 1

N N Н Н

1. ВосС1утОЯЗи/Е1эМ

2. СР3СООН

3. НСІ (2М)

О

о

о

о

1. Эид-ОМр/Еу

Л-

н

н

н

н

п= 1- 7 т- 1 -2

N9 =

Рисунок 3. Схема синтеза двухантенных олигоглицинов и их гликопроизводных.

Синтез проводили с использованием метода активированных эфиров (рис. 3). Пошаговое наращивание глициновых цепей осуществляли по //-концу с помощью Лг-оксисукцинимидных эфиров (ВосСІуі^ОМБи). Дос-группы количественно удаляли трифторуксусной кислотой, после чего соли переводили в основание действием небольшого избытка триэтиламина и вводили в реакцию с сукцинимидным эфиром. Соли диамино-производных выделяли в виде гидрохлоридов, которые хорошо кристаллизуются. Получение олигоглицинов с длиной цепи более пяти для производных с кором СЮ, и более шести - для кора С2, осуществить не удалось из-за их низкой растворимости.

Сиалогликоконъюгаты двухантенных олигоглицинов получали из соответствующих диаминов и производных а-Л'-ацетилнейраминовой кислоты (Біщ-СЖр), в которых карбоксильная группа спейсера активирована 4-нитрофенолом ^р). Такую модификацию проводили только для тех двухантенных олигоглицинов, которые предположительно могут образовывать тектомеры.

Способность синтезированных в данной работе двухантенных олигоглицинов к ассоциации в растворе и на поверхностях изучалась вместе с трех- и четырехантенными аналогами, синтезированными в лаборатории углеводов ИБХ РАН ранее. Структурную организацию ассоциатов изучали с помощью Раман-спектроскопии, атомно-силовой микроскопии, динамического светорассеяния и расчетных методов.

2. Изучение ассоциации двухантенных олигоглицинов в растворе методом динамического светорассеяния

С помощью динамического светорассеяния (ДС) измерены величины среднего диаметра частиц, формирующихся в растворах двухантенных олигоглицинов, и показано, что способность к ассоциации зависит от числа глициновых звеньев в антенне, природы кора, рН раствора и концентрации пептида.

Известно, что заряд на концевых аминогруппах протонированных форм глициновых пептидов мешает ассоциации, поэтому для ее инициирования к водным растворам солей олигоглицинов добавляли эквивалентное количество основания в виде 0.1 М раствора NaHC03 или Na2C03. В отсутствие основания значения рН растворенной соли олигоглицина варьируют от 3.5 до 4.5 (далее обозначено, как рН<5). При добавлении одного эквивалента основания в расчете на одну аминогруппу раствор становится нейтральным (рН 6.5), а двух эквивалентов Na2C03 - щелочным (рН > 8.5).

Пептиды с олигоэтиленгликольным кором и с корами С2 и СЮ при п < 4 не образуют ассоциатов в водной среде во всех трех изученных интервалах рН (< 5,6.5, > 8.5) и концентрациях (0.1 - 1.0 мг/мл).

Двухантенные олигоглицины с корами С2 и СЮ при п>4 способны образовывать ассоциаты (700-900 нм) в кислых растворах (рН<5) во всем изученном диапазоне концентраций, за исключением

H-Gly4NH(CH2)ioNHGIy4-H х 2НС1, который ассоциирует при концентрациях

> 0.5 мг/мл. Четырех- и трехантенные олигоглицины в этих условиях образуют ассоциаты при наличии 8 и более остатков глицина.'

В нейтральной (рН 6.5) и щелочной (рН > 8.5) среде у молекул с кором С2 (и = 4-6)иС10(и = 5) ассоциация протекает настолько быстро, что приводит к образованию осадка. Ассоциаты (800- 1200 нм), длительное время остающиеся неизменными в водной фазе, способен образовывать только пептид Н-С1у4МН(СН2)ю1^НС1у4-Н при концентрации <0.1 мг/мл (рис. 4). Четырех- и трехантенные олигоглицины в этих условиях ассоциируют при п > 7.

-«— С=0.1 мг/мл, рН 6.5 С=0.1 мг/мл. рН 8.5 -д—С-0 05 мг/мл, рН 6.5 ■X— СЮ.05 мг/мл, рН 8.5

Рисунок 4. Кинетика формирования ассоциатов, образованных пептидом H-Gly4-NH(CH2) 1 oNH-Gly4-H в водной среде.

3. Изучение ассоциации антенных олигоглицинов методом атомно-силовой микроскопии

Метод атомно-силовой микроскопии (АСМ) дает информацию не только о процессе ассоциации (как в растворе, так и на поверхности), но и о мельчайших деталях архитектуры формирующихся тектомеров - их форме, слойности и др. Особый интерес представляют случаи активного участия поверхности в значительном ускорении формирования супрамеров. Чтобы дискриминировать процессы, происходящие на поверхности, от похожих процессов, происходящих в объеме жидкости, измерения проводили сразу после депротонирования солевой формы олигоглицинов при временах

0 10 20 30 40 50 60 время, мин. (t)

инкубирования, недостаточных для самопроизвольной ассоциации в растворе (< 1 мин). Раствор депротонированного олигоглицина помещали на свежесколотую поверхность слюды или графита, выдерживали фиксированные промежутки времени (texp), после чего жидкость с поверхности удаляли и сканировали поверхность образца в режиме прерывистого контакта на воздухе (в дальнейшем, если не указано особо, АСМ-сканирование проводили именно так). При проведении эксперимента в жидкостной ячейке использовали контактный режим сканирования. Такие эксперименты позволяют изучать кинетику сборки пептидных ассоциатов, избегая искажения их архитектуры при высушивании образца.

3.1. Двухантенные олигоглицины

В спектрах комбинационного рассеяния способных к ассоциации двухантенных олигоглицинов, также как и в спектрах описанных ранее трех- и четырехантенных пептидов, содержатся полосы 884, 1261, 1382, 1424 и 1654 см"1, характерные и специфические для кристаллического ПГ-Н. Наличие этих полос позволяет сделать вывод о структурной организации сформированных в жидкости ассоциатов по типу ПГ-П. Чувствительность рутинного метода Раман-спектроскопии недостаточна для работы с монослоями олигоглицинов, поэтому для отнесения ассоциатов к ПГ-И использовались непрямые подходы: геометрические параметры слоев определялись с помощью АСМ и сравнивались 1) с таковыми для сформированных в растворе тектомеров и 2) с полученными расчетными методами. Как будет показано ниже на конкретных примерах в большинстве случаев самопроизвольная и поверхность-промотированная сборка приводят к ассоциатам идентичной структуры -тектомерам.

Формирование структуры ПГ-П для олигоглицинов с коротким жестким С2 кором возможно только тогда, когда молекула вытянута, т.е. антенны направлены в противоположные стороны (конформация "1 +1", рис. 5а). Наличие гибкого кора (СЮ, ОЭГ) позволяет молекуле складываться пополам,

принимая конформацию "2 + 0", в которой олигоглициновые антенны направлены в одну сторону. В водных растворах гидрофобная сторона тектомера, сформированного из множества таких мономеров, для минимизации термодинамически невыгодного контакта с водой должна инициировать формирование второго такого же слоя, но с обратной ориентацией мономера (рис. 56).

а)

/У

¿¡ь

4.0 им

V

раствор

11 -— б) "2+0"

аминогруппа -(СН,)„-олигоглициновая антенна слюда

4.0 им

Рисунок 5. Модель формирования тектомерных слоев двухантенными олигоглицинами на поверхности слюды. Высоты приведены для Н-О1у4МН(СН2)10МНО1у4-Н.

Для двухантенных олигоглицинов было показано, что оптимальной для изучения динамики роста тектомеров на слюде является концентрация 0.1 мг/мл, что на порядок ниже, чем у трех- и четырехантенных аналогов. При более высоких концентрациях рост как в растворе, так и на поверхности идет настолько быстро, что изучение динамики не представляется возможным. В кислых растворах (рН<5) тектомерных структур ни для одной из молекул зафиксировано не было, тогда как в нейтральных и щелочных ассоциация протекала одинаково - как в отношении скорости, так и морфологии.

Неассоциирующие в водных растворах олигоэтиленгликольные производные Н-С1уп-ЫН(СН2СН20)3СН2СН2ЫН-С1у„-Н (я = 2-7), а также олигоглицины с корами С2 и СЮ при величинах п < 4 на поверхности слюды не образуют ассоциатов во всем изученном диапазоне рН растворов (от 4.5 до 8.5).

По данным динамического светорассеяния (см. выше), из всех изученных двухантенных олигоглицинов, только пептид Н-01у4ЫН(СН2)юЫНС1у4-Н в

нейтральных и щелочных растворах способен образовывать супрамеры, длительное время остающиеся неизменными в водной фазе. На рисунке 6 представлена динамика роста слоя на слюде с характерным образованием островковых структур (texp = 0.5 мин, рис. 6а), которые увеличиваются в планарных размерах (texp=l мин, рис. 66) и полностью покрывают всю поверхность ровным слоем (texp = 2 мин, рис. бе). Для больших времен (texp > 2 мин) характерно появление многослойных супрамеров (по-видимому, результат сорбции сформировавшихся в растворе ассоциатов), которые легко удаляются при промывке образца буферным раствором (рН 6.5 или 9.0), при этом морфология первого слоя не изменяется, а имеющиеся дефекты ("дырки") сохраняются. Высота слоя равна 3.7-4.0 нм, что может соответствовать как moho-, так и бислою (конформации "1 + 1" и "2 + 0", соответственно, рис. 5).

а)

б)

: I ^

Т

„

і - ф

■нрща

Рисунок 6. Динамика роста тектомера, образованного пептидом H-GIy4-NH(CH2)i0-NHGly4-H (концентрация 0.1 мг/мл) на поверхности слюды при рН 6.5, прерывистый режим АСМ на воздухе, texp: (а) 0.5 мин, (б) 1 мин, (в) 2 мин. Т - тектомерный слой, С - непокрытые участки слюды.

Более детально динамика ассоциации H-Gly4NH(CH2)ioNHGly4-H изучалась в жидкостной ячейке (рис. 7). Через 3 минуты поверхность практически полностью покрывалась ровным бездефектным слоем. Следует отметить, что характерного для бислойной структуры ступенчатого профиля поверхности образующегося тектомера в жидкостной ячейке также не наблюдалось, а морфология слоя ничем не отличалась от наблюдаемой в экспериментах на воздухе (рис. 6).

а) б) в)

Рисунок 7. Динамика роста тектомера, образованного пептидом Н-01у4-МН(СН2)юМН-01у4-Н (концентрация 0.1 мг/мл) на поверхности слюды при рН 6.5 в жидкостной ячейке. Фазовые АСМ-изображения тектомеров через (а) = 1 мин, (б) 1ехр = 2 мин, (в) 1ехр=3 мин после начала эксперимента. Т - тектомерный слой, С - непокрытые участки слюды.

По данным динамического светорассеяния, в нейтральных водных растворах ассоциация соединений Н-01у5-ЫН-Х-ЫН-01у5-Н (коры С2 и СЮ) приводит к формированию крупных структур, выпадающих в осадок. Методом атомно-силовой микроскопии показано, что пептид с кором С2 на поверхности слюды (1ехр= 10 мин) образует редкие островковые тектомеры высотой 3.3 нм, их планарные размеры не превышают 500 - 700 нм (рис. 8а). Аналог с кором СЮ ассоциирует быстрее (рис. 86), но полного покрытия поверхности не наблюдается (1ехр =10 мин), в отличие от структурного аналога с четырьмя глициновыми звеньями в антенне, которому для этого требуется около двух минут. Измеренные высоты свидетельствуют в пользу модели "1 + 1".

Полученные данные говорят о том, что слюда промотирует формирование тектомеров в нейтральных и щелочных растворах двухантенных олигоглицинов. Рост слоя происходит именно благодаря соучастию поверхности. В случае молекулы Н-С1у4-МН(СН2)10МН-С1у4-Н рост продолжается до полного покрытия поверхности, в то время как по данным динамического светорассеяния в растворе размеры супрамеров не меняются во времени.

¡¡ЗР 1

¡¡Ы,Ш«Р< рій ; ** Щ-if-

■ wmm

ШиР ТдиШ йІІіР5

wLtim^ ¿ій

flllllll!! lllfilllf І

3.3 HM

4.6 им

Рисунок 8. АСМ-изображения ассоциатов, образованных пептидами H-Gly5-NH(CH2)2NH-Gly5-H (а) и H-Gly5-NH(CH2)ioNH-Gly5-H (б) (концентрация 0.1 мг/мл) на поверхности слюды при рН 6.5, texp= 10 мин, прерывистый режим АСМ на воздухе, время инкубирования в растворе 1 мин. Справа приведены профили поверхности, схематические модели слоев и их расчетные высоты.

Прямых данных о том, в какой конформации («1 + 1» или «2 + 0», рис. 5) находится мономер двухантенного пептида в составе слоя, полученные экспериментальные данные не несут, сам по себе параметр высоты слоя не дает возможности сделать однозначный выбор в пользу одной из двух предложенных моделей. Тем не менее, все косвенные данные одназначно свидетельствуют в пользу модели "1 + 1", а именно: 1) отсутствие ступенек, характерных для профиля бислоя (как это будет показано далее для трехантенных пептидов), 2) неизменность высоты при интенсивной отмывке буферным раствором, 3) способность пептидов с кором С2 образовывать островковые тектомеры и 4) отсутствие ассоциации на поверхности графита (см. ниже).

В отличие от слюды, содержащей анионы на поверхности, графит не участвует в ассоциации двухантенных олигоглицинов: на подложке виден

только результат сорбции сформировавшихся в растворе неупорядоченных ассоциатов. Это оказалось неожиданным, поскольку согласно молекулярно-динамическим расчетам, формирование монослоя с конформацией мономера "2+0" является выгодным. Такой результат можно объяснить тем, что межмолекулярные взаимодействия энергетически более выгодны, чем контактирование с поверхностью графита.

Таким образом: 1) слюда (но не графит) промотирует формирование тектомеров из двухантенных олигоглицинов; 2) пространственная организация молекулы соответствует вытянутой конформации ПГ-Н; 3) для сборки тектомерных слоев на поверхности слюды или образования устойчивых ассоциатов в нейтральных и щелочных растворах необходимо не менее четырех глициновых звеньев в цепи двухантенного пептида; 4) олигоэтиленгликольный кор «ингибирует» способность к ассоциации.

3.2. Трехантенный пептид [Н-С1у7->!НСН2ЬССНз

Известно, что ассоциация трехантенного олигоглицина [Н-С1у7-МНСН2]зССНз в растворе приводит к образованию супрамеров, обладающих структурой ПГ-П (рис. 16). В настоящей работе изучена поверхность-промотированная сборка тектомеров, образованных этим пептидом на слюде, при различных значениях рН растворов. В кислых

Рисунок 9. Морфология ассоциатов, образованных пептидом [H-Gly7-NHCH,]3CCH3 (концентрация 1.0 мг/мл) на поверхности слюды при рН 6.5, время инкубирования в растворе 1 мин; прерывистый режим АСМ на воздухе, texp = 10 сек.

растворах (рН < 5) тектомерные слои не образуются. В нейтральных растворах (рН 6.5) сначала образуется рыхлый гранулярный слой с множеством "дырок" (рис. 9), поверх которого формируется второй ровный слой с той же высотой 2.2 нм, по-видимому, за счет гидрофобного взаимодействия между слоями, обладающими конформацией "3 + О".

а)

ЗООпт

б)

ШШоойй

Я£Ш С

"щк.......

86-

- 2

Г ^"Д

1 \ V L-S—¿и

50 100 150 200 250 300 350 Х[пш|

100 200 300 400

Рисунок 10. Динамика роста тектомера, образованного пептидом [H-Gly7-NHCH2]3CCH3 (концентрация 1.0 мг/мл) на поверхности слюды при рН > 8.5, время инкубирования в растворе 1 мин, прерывистый режим АСМ на воздухе, texp: (а) 1 сек, (б) 10 сек. Внизу приведены профили поверхности. Т^ - монослойный и Т2 - бислойный тектомер, С - непокрытые участки слюды.

В щелочных растворах при texp = 1 сек на слюде образуются моно- и бислойные островковые тектомеры (высоты 2.2 и 4.5 нм, соответственно, рис. 10а), которые через 10-20 секунд полностью покрывают поверхность (рис. 106). В связи с тем, что единичное сканирование длится 2 минуты, динамику роста тектомера на слюде в жидкостной ячейке зарегистрировать не удалось.

В ходе сканирования была обнаружена интересная особенность, а именно, в зависимости от интенсивности воздействия АСМ-зонда (чем меньше кадр, тем меньше скорость сканирования и сильнее действие зонда на объект) слои частично или полностью разрушаются. Тектомерный бислой образуется в местах "мягкого" воздействия и, в то же время, не образуется на участках более сильного воздействии зонда (выделенный квадрат на рис. 11а). При более медленном сканировании избирательно удаляется верхний слой бислойного тектомера (рис. 116), который способен восстанавливаться (рис. Не), в то время как "голый" участок слюды в данных условиях не "зарастает". Сильное воздействие зонда на уже сформированный бислой приводит к его полному удалению (рис. 11г). Разрушение олигоглицинового слоя иногда происходит как одновременное слущивание большого участка, благодаря чему появляется возможность наблюдать кристаллическую структуру тектомера с углами скола 120° (рис. 12).

а) б) в)

m » / ■ * л

■■■ 'i \ -■ у . '

i ■ шшшДЯЯ^к

I к ; шНН •

M Щ ■ к* :

-щ\Шктзш&я i й-\ ттШШЁШМ! шш,

•'V \ v v> ■ pi / : А'К ш ШШшж w/

%

llfffl ^rVÏ'-r шШШШй! ИаНр». g Щ

{щ Ц 1 ■■В к 1

1№|1

Рисунок 11. АСМ-изображения тектомеров, 'V'

образованных пептидом [Н-01у7-ЫНСН2]3ССН3 (концентрация 1.0 мг/мл) на поверхности слюды при рН > 8.5 в жидкостной ячейке, (а) бислойный тектомер; (б) частичное разрушение бислоя до '

монослоя; (в) восстановление бислойной структуры (

тектомера; (г) уже сформированный слой может быть полностью удален. Выделен участок полного разрушения тектомера

Î

Рисунок 12. Кристалличность тектомера, образованного пептидом [H-Gly7-NHCH2]3CCH3 (концентрация 1.0 мг/мл) на поверхности слюды при рН > 8.5 в жидкостной ячейке, наблюдающаяся при его сколе АСМ-зондом.

Ассоциации трехантенного олигоглицина на поверхности графита, также как и в случае с двухантенными олигоглицинами, не происходит.

Таким образом: 1) слюда (но не графит) оказывает промотирующее влияние на ассоциацию трехантенного олигоглицина [H-Gly7-NHCH2]3CCH3, 2) в отличие от двухантенных, трехантенный олигоглицин формирует бислойный тектомер, 3) тектомер представляет собой двумерный кристалл; 4) с помощью АСМ-зонда можно локально разрушать участки тектомера на поверхности слюды.

3.3. Четырехантенный пептид [H-Gly7-NHCH214C

Согласно данным АСМ, в кислых растворах (рН < 5) при концентрации 1 мг/мл ассоциации пептида [H-Gly7-NHCH2]4C на слюде не происходит. В нейтральных растворах на поверхности формируются moho-, би- и мультислойные тектомеры (рис. 13а). Следует отметить, что при рН>8.5, формируется исключительно монослой высотой 4.5 нм (рис. ¡26).

Динамику процесса роста тектомера на слюде (рН 6.5) изучали в жидкостной ячейке. Установлено, что сначала образуются небольшие тектомеры островкового типа, которые с течением времени увеличиваются и через 5 минут покрывают всю поверхность ровным слоем (высота 4.5 нм), что соответствует модели "2 + 2" (рис. 1а).

Рисунок 13. Морфология островковых тектомеров, образованных пептидом [Ы-01у7-ЫНСН2]4С (концентрация 1.0 мг/мл) на поверхности слюды при различных значениях рН раствора: а) рН 6.5, б) рН>8.5. АСМ-измерения на воздухе, время инкубирования в растворе 1 мин, 1ехр = 10 сек. Справа приведены профили поверхности, схематические модели слоев и их расчетные высоты. Т - монослойный тектомер; С - непокрытые участки слюды.

При сканировании небольших площадей (1><1 мкм) в условиях усиленного воздействия АСМ-зонда в жидкостной ячейке происходит полное разрушение и удаление тектомерного слоя, подвергнутого воздействию. При сканировании большего "кадра" (10 х 10 мкм) можно визуализировать полученный дефект, размеры и форма которого совпадают с участком предварительного сканирования (выделенный участок на рис. 14а), через 5 минут слой восстанавливается (рис. 146-е) за счет вовлечения мономерных пептидов, находящихся в растворе (в отличие от трехантенного тектомера, см. стр. 14-15).

Таким образом, слюда оказывает промотирующее влияние на ассоциацию четырехантенного олигоглицина [Н-О^-МНСНг^С, в щелочных растворах образуются только монослойные тектомеры.

а) б) в)

щ шттш ШШтШ Ш9Ш0Щ ШШв V

« - - >Щ щ ■•** 1

Л\ ШщШй III Ирв ¡§|| ¡1 «

- #.1' I л

ГЯН % ЯР щ

ШШ :шж тшш-^к Л шйт*

Рисунок 14. Динамика восстановления разрушенного АСМ-зондом тектомерного слоя, образованного пептидом [Н-01у7->ШСН2]4С (концентрация 1.0 мг/мл) на поверхности слюды при рН > 8.5 в жидкостной ячейке. Фазовые АСМ-изображения: (а) - частично разрушенный действием кантилевера слой, выделен участок сканирования 1 * 1 мкм; (б) - частичное восстановление слоя (через 3 мин); (в) - полное восстановление слоя (через 5 мин). Т - монослойный тектомер, С - непокрытые участки слюды.

4. Противовирусная активность

В основе идеи антиадгезионной терапии гриппа лежит ингибирование или блокирование связывания вируса гриппа с клеткой. Моновалентные олигосахариды не способны достаточно эффективно конкурировать с аналогичными гликанами на поверхности клетки из-за их низкой константы связывания с гемагглютинином вируса. Очевидным путем увеличения аффинности блокатора (ингибитора) может служить конструирование рецепторных аналогов, которые в присутствии вируса (или под действием вируса) приобретают способность к ассоциации в тектомер, обеспечивая мультивалентное связывание. В данном случае речь может идти не только о самосборке, но и о поверхность-промотируемой ассоциации, аналогичной той, которую мы наблюдаем для олигоглициновых пептидов на слюде. Поэтому изучение ассоциации олигоглицинов на поверхности слюды приобретает дополнительный смысл - как моделирование вирус-промотируемого механизма сборки гликопептидных терапевтиков. Первый успех в этом направлении достигнут в ингибировании вируса гриппа сиалопрозводными ассоциирующих

четырехантенных пептидов, противовирусная активность которых на три порядка выше, чем у неассоциирующих структурных аналогов и сиалированных гликанов (мономеров).

В связи с этим было интересно изучить противовирусную активность сиалопроизводных двухантенных олигоглицинов. Ее определяли методом ингибирования связывания вируса с фетуин-пероксидазным конъюгатом (гликопротеин фетуин содержит несколько сиалированных углеводных цепей). Изучаемые двухантенные сиалоолигоглицины ингибируют это взаимодействие за счет конкурентного связывания с вирусом. Активность двухантенных гликопептидов как ингибиторов вируса гриппа относительно соответствующего мономера представлена в таблице 1.

Активность сиалоолигоглицинов с кором С2 была в 3-6 раз выше активности мономера. Среди изученных двухантенных гликопептидов максимальной активностью (в 50 раз выше активности мономера) обладает соединение с кором СЮ и и = 4, что хорошо коррелирует с данными по его ассоциации в растворе и на поверхности. Несколько менее активно соединение с кором СЮ и п = 5.

Активность двухвалентных производных с кором ОЭГ и п = 5 не превышает таковую моновалентного сиалозида, а при п = 6 - резко увеличивается (до 50 раз), хотя и не становится сопоставимой с активностью полимерных ингибиторов*. Поскольку олигоглицины ОЭГ-ряда не ассоциировали ни в растворе, ни на поверхности слюды (см. выше), предполагается, что в данном случае увеличение активности по сравнению с моновалентным сиалозидом связано с достижением определенного критического расстояния, позволяющего реализовать двухвалентное связывание с вирусной частицей. Действительно, простой расчет показывает, что в максимально вытянутой молекуле с п = 6 оно составляет величину порядка 50А, что соответствует расстоянию между углевод-связывающими

'A.S.Gambaryan, et al., Virology, 1997,232(2), pp. 345-350.

сайтами в тримере гемагглютинина и немного превышает дистанцию между близко расположенными на вирусе соседними тримерами гемагглютинина.

Таблица 1. Активность двухантенных гликопептидов как ингибиторов вируса

гриппа относительно соответствующего сиалозида.

Соединение Кор, X (и, число глициновых звеньев в антенне) Вирус Относительная активность ■

К'еи5АсаВп (А/НЗЫ2/29/90 1

Иеи5 Аса-зр 1-01у5-Х-01у5-зр і -№и5Аса С2 (5) (А/НЗЫ2/29/90) 3

Ыеи5Аса-5р1-01у6-Х-С1уб-5р1-Ыеи5Аса С2 (6) (А/НЗ№/29/90) 6

№и5 Аса-ер 1 -С1у4-Х-01у4-5р 1 -Ыеи5 Аса СЮ (4) (А/НЗЫ2/29/90) 50

Кеи5Аса-5р1-С1у5-Х-С1у5-5р1-Ыеи5Аса СЮ (5) (А/НЗК2/29/90) 25

6'SLN (А/НШ1/23М) 1

6' 5ЬЫ-5р2-С1у5-Х-С1у5-5р2-6' Э ЬЫ ОЭГ (5) (А/Н1Ш/23М) 1

6' 8ЬЫ-5р2-01у6-Х-01уб-5р2-б' Э 1ЛЧ ОЭГ (6) (А/НШ1/23М) 20-30

(А/Н1КТШ1В23) 40

(Н5Ы2) 1

3'5Ы>рЗ-С1у5-Х-01у5-5рЗ-3'5Ь ОЭГ (5) (Н5Ы2) 1

3' Б Ь-5рЗ-01уб-Х-С1уб-5рЗ -3' БЬ ОЭГ (б) (Н5К2) 50

вр1 =-ОСН2(р-СбН4)КНСОСН2Ш-СО(СН2)4СО; Вп-бензил;

Бр2 = -0(СН2)3ЫНС0(СН2)4С0; бЫМ = Л'еиЗАса2-6Саірі-401сИАср:

5рЗ = -КНСОСН2ЫНСО(СН2)4СО; 3 = Ыеи5Аса2-ЮаЩ-4Ыф.

Таким образом, гликопроизводные двухантенных олигоглицинов способны (в зависимости от природы кора и длины олигоглициновой антенны) как мультивалентно, так и бивалентно связываться с гемагглютинином вируса гриппа.

Заключение

Результатом данного исследования стало сравнение ассоциирующих свойств двухантенных олигоглицинов и их аналогов, отличающихся «антенностью». Скорость формирования тектомеров на поверхности слюды у двухантенных молекул выше, чем у трех- и четырехантенных и зависит от рН раствора. Важную роль играет природа корового фрагмента: гидрофильный олигоэтиленгликольный полностью отменяет ассоциацию, в то время как гидрофобный СЮ - способствует образованию тектомеров в большей степени, чем жесткий короткий кор С2. Особое значение имеет число глициновых звеньев в антенне: трех- и четырехантенные олигоглицины ассоциируют при п > 7, в то время как при формировании тектомера из двухантенных молекул в вытянутой конформации "1 + 1" необходимо фактически 8 глициновых звеньев.

Образование тектомеров из двух-, трех- и четырехантенных олигоглицинов на слюде происходит значительно быстрее, чем ассоциация в растворе (за то время, когда сборка на поверхности уже завершена, формирование ассоциатов в растворе только начинается), то есть поверхность, безусловно, играет активную роль. Рост тектомеров начинается с образования островковых структур, увеличивающихся латерально, и покрывающих всю поверхность ровным слоем. Качество слоя (сплошность и отсутствие вторичных структур поверх него) можно регулировать, подбирая оптимальную величину рН. Механическое разрушение зондом тектомерной структуры может проходить как обратимо, так и необратимо, давая принципиальную возможность формирования нанопаттернов.

Совокупность полученных данных свидетельствует о реальной возможности направленного конструирования плоских атомно-гладких поверхностей с заданными свойствами, что востребовано при разработке новых наноматериалов и наноустройств, и, таким образом, свидетельствует о большом потенциале применения олигоглициновых пептидов.

Еще одно направление возможного использования олигоглицинов -конструирование на их основе супрамолекулярных блокаторов вируса гриппа.

При планировании данной работы не предполагалось, что двухантенные сиалопептиды покажут высокую противовирусную активность, так как объемный сиалогликан препятствует эффективному формированию структуры полиглицин-11, а без мультивалентности взаимодействия не может быть мощного противовирусного действия. Однако для конструирования блокаторов вируса гриппа интересны двухантенные несиагтированные пептиды, которые могут стать идеальными «со-мономерами» с сиалированными олигоглицинами при формировании тектомеров, расширяя, таким образом, возможности дизайна нового поколения супрамолекулярных блокаторов.

Выводы

1. Синтезирована группа двухантенных олигоглицинов общей формулы H-Gly„-X-Gly„-H, где X представляет собой 1,2-диаминоэтан, 1,10-диаминодекан и 1,11-диаминотетраэтиленгликоль, а п - число глициновых звеньев в антенне.

2. Методами динамического светорассеяния и атомно-силовой микроскопии показано, что синтезированные двухантенные олигоглицины H-Glyn-X-Glyn-H, где X представляет собой 1,2-диаминоэтан и 1,10-диаминодекан, способны ассоциировать в водном растворе, если в антенне содержится четыре или более остатков глицина. Олигоэтиленгликольный фрагмент в составе олигоглициновых молекул отменяет образование ассоциатов.

3. Методом АСМ показано, что двух-, трех- и четырехантенные олигоглицины формируют на слюде атомно-гладкие моно- или бислои, в которых пептидные цепи в конформации полиглицин-П расположены перпендикулярно к поверхности. Процесс ассоциации пептидов промотируется поверхностью слюды и идет значительно быстрее, чем самоассоциация в растворе.

4. Показано, что воздействие АСМ-зонда позволяет целенаправленно разрушать нанометровые участки тектомерного слоя на слюде обратимо или необратимо. В последнем случае открывается возможность формирования нанопаттернов.

5. Синтезированы сиалопроизводные двухантенных олигоглицинов.

6. Сиалопроизводные двухантенных олигоглицинов ингибируют адгезию вируса гриппа в 3 - 50 раз эффективнее, чем моносиалозиды.

Список публикаций по теме диссертации

1. И.В. Горохова, A.A. Чинарев, А.Б. Тузиков, С.В. Цыганкова, Н.В. Бовин, Спонтанная и промотированная ассоциация линейных олигоглицинов // Биоорганическая химия, 2006, Т. 32, № 5, С. 467-476.

2. O.A. Гуськова, П.Г. Халатур, А.Р. Хохлов, A.A. Чинарев, С.В. Цыганкова, Н.В. Бовин, Поверхностные структуры олигоглицинов: молекулярно-динамическое моделирование // Биоорганическая химия, 2010, Т. 36, № .5, С. 622629.

3. S.V. Tsygankova, А.А Chinarev, A.B. Tuzikov, I.S. Zaitsev, N. Severin, A.A Kalachev, J.P. Rabe, N.V. Bovin, Assembly of oligoglycine layers on mica surface // Journal of Biomaterials and Nanobiotechnology, 2011, Vol. 2, P. 91-97.

4. A.A. Чинарев, C.B. Цыганкова, И.В. Кубракова, H.B. Бовин // Обособление и концентрирование аденозинтрифосфата в пребиотических условиях: гипотеза и экспериментальные данные // Галимов Э.М. (2008) Проблемы зарождения и эволюции биосферы. М.: URSS. 119 с.

5. S.V. Tsygankova, A.A. Chinarev, A.B. Tuzikov, N.A. Severin, A. Kalachev, J.P. Rabe, N.V. Bovin, Assembling of supramolecular peptides on the surface // Тезисы докладов Summer Course Glycosciences (8th edition), Wageningen, 2004.

6. C.B. Цыганкова, A.A. Чинарев, А.Б. Тузиков, H. Северин, А. Калачев, Д. Рабе, Н.В. Бовин, Сборка супрамолекулярных пептидов на поверхности // Тезисы докладов Физико-химические основы новейших технологий XXI века, Москва, 2005, С-44, С-105.

7. S.V. Tsygankova, A.A. Chinarev, A.B. Tuzikov, N.A. Severin, A. Kalachev, J.P. Rabe, N.V. Bovin, Assembling of supramolecular peptides on the surface // Тезисы докладов European Polymer Congress, Moscow, 2005, P. 166.

8. S. Tsygankova, A. Chinarev, A. Tuzikov, N. Severin, J. Rabe, A. Kalachev, N. Bovin, Supramolecular peptides and glycopeptides // Тезисы докладов 13' European Carbohydrate Symposium, Bratislava, Slovakia, 2005, P. 130.

9. A. Chinarev, A. Gambaryan, I. Demin, I. Zaitsev, S. Tsygankova, V. Oleinikov, D. Klinov, V. Kadykov, N. Bovin, A. Tuzikov. Antennary oligoglycines and sialooligoglycines: self-assembly and antiviral properties // Тезисы докладов SIALOGLYCO-2008, Moscow-St. Petersburg, 2008, P. 68.

Автор выражает свою признательность Дж. Рабе и Н. Северину (Университет имени Гумбольдта, Берлин), а также A.A. Калачеву (Plasmachem GmbH, Берлин) и Д.В. Клинову (ИБХ РАН) за помощь в работе с атомно-силовым микроскопом, A.C. Гамбарян (Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН) - за изучение противовирусной активности, O.A. Гуськовой, П.Г. Халатур, А.Р. Хохлову (ИНЭОС РАН) -за проведение расчетов по молекулярно-динамическому моделированию, Е.А. Образцовой (ИБХ РАН) - за снятие спектров комбинационного рассеяния, Генераловой А.Н. (ИБХ РАН) - за помощь в работе с анализатором субмикронных частиц.

Подписано в печать: 17.04.2013 Объем: 1,5 усл.п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 863 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, ул. Рождественка, д. 5/7, стр. 1 (495) 623-93-06; wwvv.reglet.ru

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии Наук

04201356457

На правах рукописи

Цыганкова Светлана Владимировна

СПОНТАННАЯ И ПРОМОТИРОВАННАЯ АССОЦИАЦИЯ ОЛИГОГЛИЦИНОВЫХ ПЕПТИДОВ И ГЛИКОПЕПТИДОВ

Специальность: 02.00.10 - Биоорганическая химия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: профессор, д.х.н. Бовин Н. В.

Москва 2013

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУМЫХ СОКРАЩЕНИЙ 4

ВВЕДЕНИЕ 6

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ТЕРМИНОВ 8

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9

1.1. Самоассоциация: понятие и силы, ее вызывающие 9

1.2. Самоассоциация пептидов 14

1.2.1. Ассоциация самокомплементарных пептидов 14

1.2.2. Ассоциация амфифильных пептидов 17

1.2.3. Ассоциация, приводящая к Р-амилоидным наноструктурам 18

1.2.4. Ассоциация пептидов на поверхности 21

1.3. Полиглицин и полиглициновые структуры 22

1.3.1. Полиглицин-1 и полиглицин-П 22

1.3.2. Самоассоциация олигоглициновых производных 26

1.3.3. Тектомеры 32

1.4. Природные глицин-насыщенные белки 35

1.5. Методы исследования супрамолекулярных структур 37

1.5.1. Атомно-силовая микроскопия 38

1.5.2. Основные режимы АСМ 39

1.5.3. Поверхности 40

1.5.3.1. Физическая сорбция 41

1.5.3.2. Ковалентная привязка молекул к поверхности 42 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 45

1. Синтез двухантенных олигоглицинов и их гликопроизводных 46

2. Изучение ассоциации двухантенных олигоглицинов в растворе методом динамического светорассеяния 49

2.1. Двухантенные ол иго глицины с декаметиленовым кором 50

2.2. Двухантенные олигоглицины с этиленовым кором 52

2.3. Двухантенные олигоглицины с олигоэтиленгликолевым кором 54

3. Изучение ассоциации антенных олигоглицинов методом атомно-силовой микроскопии 55

3.1. Четырехантенный пептид [Н-01у7ТЧНСН2]4С 5 5

3.2. Трехантенный пептид [Н-01у7-МНСН2]зССН3 60

3.3. Двухантенные олигоглицины 65

4. Противовирусная активность 74 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 77 ВЫВОДЫ 81

5. Экспериментальная часть 82

5.1. Синтез активированных эфиров 83

5.2. Синтез двухантенных олигоглицинов 85

5.2.1. Синтез олигоглициновых производных с ОЭГ кором 85

5.2.2. Синтез олиго глициновых производных с С2-кором 88

5.2.3. Синтез олигоглициновых производных с С10-кором 91

5.3. Синтез двухантенных гликопептидов 94

5.4. Изучение ассоциации в растовре и на поверхности 98

5.4.1. Динамическое светорассеяние 98

5.4.2. Атомно-силовая микроскопия 99

5.5. Изучение противовирусной активности гликопептидов 99 БЛАГОДАРНОСТИ 101 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 102

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АР Р-амилоидный пептид

Ас ацетил

А1а аланин

APTES аминопропилтриэтоксисилан

Аг арил

Arg аргинин

Asp аспарагиновая кислота

Bn бензил

Boc трет-бутилоксикарбонил

br. s уширенный синглет

BSA бычий сывороточный альбумин

d(d) дублет(дублетов)

Et этил

Et3N триэтиламин

Gly глицин

Glu глутаминовая кислота

HOPG высокоориентированный пирографит

Н-связь водородная связь

Ile изолейцин

Leu лейцин

Lys лизин

m мультиплет

Me метил

NSu М-оксисукцинимид

ОЭГ олигоэтиленгликоль

PEG полиэтиленгликоль

Phe фенилаланин

6'SLN Иеи5 Ас<х2-60а1р 1-401сЫАсР

3'SL Иеи5 Аса2-30а1р 1-401сР

spl ОСН2(р-С6Н4)ЫНСОСН2КНСО(СН2)4СО

sp2 0(СН2)3ННС0(СН2)4С0

sp3 ШСОСН2ШСО(СН2)4СО

t триплет

4

Tos тозил

Туг тирозин

ACM атомно-силовая микроскопия

ДС динамическое светорассеяние

ДМСО диметилсульф оксид

ДМФА диметилформамид

ИК инфракрасная (спектроскопия)

КР комбинационное рассеяние

ПГ 1(11) полиглицин 1(11)

РНК (ДНК) (дезокси) рибонуклеиновая кислота

САМ самоассоциирующие монослои

СЗМ (СЭМ) сканирующая зондовая (электронная) микроскопия

ТЕМ туннельная электронная микроскопия

ТСХ тонкослойная хроматография

ЯМР ядерный магнитный резонанс

ВВЕДЕНИЕ

Конструирование супрамолекулярных наноматериалов, нанолекарств и наноустройств путем самосборки небольших органических молекул привлекает, в первую очередь, своей «технологичностью». В качестве исходных органических молекул наиболее удобны пептиды и небольшие белки, поскольку они хорошо изучены, структурно разнообразны и способны к межмолекулярному узнаванию, а синтезировать их можно биотехнологическим путем. Однако пептидные молекулы пока не нашли широкого применения в нанотехнологии из-за низкой термической, химической и биологической стабильности. Материалы, построенные из несклонных к рацемизации аминокислот, в частности, из глицина, не имеют этих недостатков. Олигомеры глицина в виде неканонической спиральной структуры полиглицин-П (ПГ-П) образуют сеть водородных связей с шестью соседними цепями. Организация линейного олигоглицина в разветвленные, так называемые трех- и четырехантенные пептиды, позволила получить новый класс простых молекул, обладающих способностью формировать в водной среде уникальные супрамеры в виде плоских листов мономолекулярной толщины. Для нанотехнологии такие двумерные кристаллы привлекательны благодаря атомной степени гладкости формируемых ими поверхностей, а для медицины -способностью их гликозилированных производных эффективно и специфично блокировать вирусы. Понимание закономерностей, связывающих структуру олигоглицинов со способностью образовывать супрамеры, открывает возможность получения материалов с новыми, необычными свойствами и заданными характеристиками.

Таким образом, целями данной работы являются:

- синтез молекул общей формулы 11-01уп-Х-01уп-К. с разным числом глициновых звеньев п, и отличающихся структурой соединяющего пептидные цепи фрагмента X (кора);

- изучение ассоциации этих двухантенных олигоглицинов в водной среде, а также сравнение способности к ассоциации двух-, трех- и четырехантенных олигоглицинов;

- поиск воспроизводимых условий получения протяженных атомно-гладких слоев на поверхности слюды, а также условий формирования нанопаттернов;

- оценка противовирусных свойств сиалопроизводных двухантенных олигоглицинов.

Список используемых терминов

Прежде всего, необходимо определить несколько основных понятий, так как терминология супрамолекулярной химии сравнительно нова и еще не устоялась.

Антенность - разветвленность молекул. Повторяющиеся пептидные цепи (антенны) соединены в одном центре (коре). Терминами двух-, трех- и четырехантенный в данной диссертационной работе называются симметричные (star-like) конструкции пептидной, а также гликопептидной природы.

Ассоциат и супрамер - надмолекулярные структуры (нековалентные полимеры), возникающие в результате спонтанной ассоциации неопределенно большого числа компонентов в специфическую фазу, характеризуемую более или менее определенной организацией на микроскопическом уровне, а также макроскопическими свойствами, зависящими от природы фазы (пленка, слой, мембрана, кристалл, мицелла и т.д.).

Тектомер - супрамер, в котором олигоглициновые цепи обладают структурой полиглицина-П.

Тектон - "мономер", участвующий в самоассоциации.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Самоассоциация: понятие, движущие силы Супрамолекулярная химия изучает надмолекулярные структуры, являющиеся результатом ассоциации (самосборки) двух и более молекул, которые в результате оказываются связанными вместе межмолекулярными силами. Одним из основателей этого направления был лауреат Нобелевской премии французский ученый Жан-Мари Лен [1]. Два главных условия самосборки - это взаимодополняемость формы молекул компонентов (принцип "ключ-замок") и наличие нековалентных взаимодействий между ними (электростатических, п-п, гидрофобных и Ван-дер-ваальсовых, а также координационного связывания металл-лиганд и водородных связей). Несмотря на слабость нековалентных взаимодействий, их коллективное действие может приводить к формированию очень прочных структур. В целом, межмолекулярные взаимодействия слабее, чем ковалентные связи, поэтому супрамолекулярные ассоциаты менее стабильны термодинамически, более лабильны кинетически, чем отдельные молекулы [2]. В таблице 1 приведены сравнительные характеристики для ковалентных и нековалентных структур [3].

Таблица 1. Характеристики ковалентных и нековалентных структур.

Ковалентное соединение Нековалентное соединение

строительный блок атомы молекулы, ионы

конечная структура молекула ассоциат

молекулярный вес 1 - 1000 Да 1 - 100 кДа

типы связей ковалентная связь ионные, гидрофобные, водородные связи, координационное связывание и другие взаимодействия

энергия связи 140 - 680 кДж моль"1 1-100 кДж моль"1

кинетическая стабильность Высокая Низкая

Различают несколько типов нековалентных связей. Электростатические взаимодействия (притяжение и отталкивание) являются самыми сильными из них, они характерны для молекул, обладающих электрическим зарядом. К ним относятся ион-ионные (в кристалле №С1, до 100 кДж/моль), ион-диполъные (в краун-эфирах, 50 - 80 кДж/моль) и диполъ-диполъные (в карбонильных соединениях, 5-50 кДж/моль) взаимодействия. Ван-дер-ваальсовые силы включают три составляющие: ориентационное, индукционное и дисперсионное взаимодействия [4]. Ориентационное взаимодействие (диполь-дипольное) возникает при сближении полярных молекул, ориентированных друг к другу противоположно заряженными полюсами (рис. 1 а). Индукционное взаимодействие возникает между диполями и неполярными молекулами, причем полярная молекула индуцирует (поляризует) неполярную молекулу (рис. 1 б). Дисперсионное взаимодействие возникает между неполярными молекулами (рис. 1 в). Флуктуации электрической плотности в молекуле приводят к появлению мгновенных диполей, которые в свою очередь индуцируют мгновенные диполи у соседних молекул. Движение мгновенных диполей становится согласованным, их появление и распад происходит синхронно. Энергия дисперсионного взаимодействия очень слабая, однако для неполярных молекул этот вид взаимодействия является единственной составляющей Ван-дер-ваальсовых сил.

Рисунок 1. Ван-дер-ваальсовые взаимодействия молекул: а) — ориентационное, б) - индукционное; в) - дисперсионное.

Гидрофобные силы - особый тип взаимодействий, обусловленный не индивидуальными взаимодействиями молекул друг с другом, а их коллективными взаимодействиями с молекулами окружающей среды (растворителя). Энтропийная природа гидрофобных эффектов состоит в том, что при внедрении неполярной

б)

молекулы совершается работа по разрушению пространственной сетки прочных водородных связей воды, т.е. повышается свободная энергия системы. В результате неполярные молекулы в воде начинают притягиваться, поскольку при их сближении термодинамически невыгодный контакт с водой минимизируется, и свободная энергия системы понижается. Взаимодействия между неполярными частями молекул могут иметь место не только в воде, но и в других жидкостях, например, в формамиде и глицерине.

Водородная связь (Н-связь) играет исключительную роль в стабилизации как

простых молекулярных систем (например, воды), так и биополимеров

(нуклеиновых кислот и белков). Водородные связи позволяют полимерным цепям

соединяться в специфические трехмерные структуры, приобретающие при этом

функциональную биологическую активность - структуры, с одной стороны

достаточно прочные (за счет образования большого числа Н-связей), а с другой -

чутко реагирующие на изменение внешних условий (например, приближение той

или иной молекулы) именно из-за того, что эти взаимодействия являются слабыми.

Разрыв таких связей лишает белки или нуклеиновые кислоты их биологических

функций. Отсюда, в частности, видна исключительно важная роль водородных

связей, которую они играют в биологических процессах на молекулярном уровне

[5]. Н-связь возникает в том случае, когда атом водорода в молекуле соединен с

элементом, имеющим высокую электроотрицательность, как правило, с элементом

второго периода (кислородом, азотом, фтором). Водород, при этом, приобретает

частичный положительный заряд (акцептор электронов), благодаря чему

притягивает молекулу, содержащую электроотрицательный элемент (донор

электронов), следовательно, связь имеет донорно-акцепторную природу [6].

Водородная связь в отличие от большинства нековалентных взаимодействий

обладает специфичностью. В природе существует множество примеров этому,

например, Н-связь между комплиментарными нуклеотидами. От природы и

расположение донорных (В)/акцепторных (А) атомов зависят как устойчивость

ассоциатов, так и селективность их образования. Изменяя пространственное

расположение А и Б центров можно программировать супрамолекулярную

архитектуру. В димере гуанозин-цитидин (рис. 2) стабильность возрастает при

электростатическом притяжении между положительно и отрицательно

11

н

/

г О

о------Н-^

но

>

НО

в

С

в

С

Рисунок 2. Притяжение и отталкивание в гуанозин-цитидин (ОС) димере (сплошная черта - притяжение, пунктирная - отталкивание).

поляризованными атомами и уменьшается при электростатическом отталкивании между двумя положительно или двумя отрицательно поляризованными атомами в соседних Н-связях [7-8]. Направленность водородной связи определяет геометрию молекулярных комплексов. В связи с этим различают несколько типов Н-связи: одномерные, двумерные и трехмерные. Хорошим примером соединения с одномерной структурой является фтористый водород, в котором имеются бесконечные зигзагообразные цепи с углом Н-Б-Н 120°. Большое количество органических молекул, способных к димиризации, образуют одномерные Н-связей. Однако относительно низкая стабильность таких ассоциатов сильно ограничивает использование этого взаимодействия для направленного нековалентного синтеза. Существует несколько способов, которые применяются для увеличения стабильности супрамолекулярных структур, одним из них является создание структур, при ассоциации которых образуется множество Н-связей, укрепляющих

Рисунок 3. Водородные связи в олигоамидном димере [9].

структуру. Например, в работах [9-10] показано, как кооперативность водородных связей положительно влияет на термодинамическую стабильность

мультидентантных комплексов (рис. 3), увеличивая ее (АОп.

ассоциата

> пДв

мономера

Двумерную слоистую структуру имеет ортоборная кислота (Н3В03). Трехмерной структурой обладает фторид аммония, который кристаллизуется в структуре вюрцита, и кислый дифторид аммония, в котором имеются четыре четырехэдрических расположенные Н-связи вокруг каждого атома азота.

Все эти относительно слабые по энергии нековалентные взаимодействия в совокупности способны формировать хорошо упорядоченные супрамолекулярные структуры: бислои, молекулярные везикулы, трубки, фибриллы и многие другие ансамбли. Например, хорошо изученные к настоящему времени нанотрубки могут быть получены разными способами и, в зависимости от строительного блока (рис. 4), участвующего в ассоциации, природы нековалентного взаимодействия и внешних условий, можно получить нанотрубки разной длины, диаметра, толщины и физико-химических свойств [11].

О)

б)

О)

г)

ч

4 4 4 а 4

Рисунок 4. Различные молекулярные строительные блоки, ассоциация которых приводит к трубчатым наноструктурам: а) спиральная и б) циклические структуры, в) дендриты, г) блок сополимеры, д) амфифильные молекулы [11].

Необходимо отметить, что самосборка является многостадийным процессом, проходящим с формированием промежуточных структур, выявление свойств которых требуется для изучения свойств конечного продукта ассоциации. Для

понимания процессов самосборки в живых системах и управления ими необходимо, во-первых, представлять супрамолекулярную природу этих явлений, во-вторых, уметь конструировать различные надмолекулярные образования в водных растворах, для использования их в качестве инструмента воздействия на биохимические процессы.

В данном обзоре внимание сфокусировано на коротких пептидах, их способности самоорганизовываться в устойчивые супрамолекулярные структуры. Короткие пептиды разнообразны, просты в получении, что делает их привлекательными моделями для изучения природных процессов ассоциации [12]. Тем не менее, определение способности конкретного пептида к самосборке и выбора супрамолекулярной структуры для результирующих агрегатов оказывается трудной задачей. Поэтому изучение самоассоциации пептидов и молекул другой природы проходит методом "проб и ошибок".

1.2. Самоассоциация пептидов

В настоящее время в литературе детально описана самоассоциация пептидных молекул нескольких типов, некоторые из которых мы рассмотрим в настоящем обзоре: 1) ассоциация самокомплементарных пептидов, 2) амфифильных пептидов, 3) ассоциация, приводящая к Р-амилоидным фибриллам и 4) ассоциация пептидов на поверхности.

1.2.1. Ассоциация самокомплементарных пептидов

"Lego-nenmuды", также называемые ионными самокомплементарными

пептидами, формируют в водных растворах (3-складчатые структуры, содержащие

две поверхности: гидрофобную и гидрофильную. Подобно 1^о-блокам, с

помощ