Фоторецепторный белок Р26 тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ НАУК СССР

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ЯШИ ИМ. М.М.ШЕМЯКИНА

На пробах рукописи

Нгуен Тхыонг Зунг ФОТОРЕЦЕПТОРНШ БЕЛОК Р26

02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА-1991

Работа выполнена в Институте Оиоорганической химии им. М.М. Шемякина АН СССР

Научный руководитель: доктор химических наук Н.Г. АБДУЛАЕВ

Официальные оппоненты: доктор химических наук H.H. МОДЯНОВ доктор химических наук С.А.УСАНОВ

Ведущая организация- Институт биохимии им.А.Н.Баха АН СССР

Защита состоится " 3 " ¿¿- ''v.t--1991 в //■ час на заседании специализированного совета Д 002 35 01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте биоорганической химии км. М.М. Шемякина АН СССР по адресу II787I ГСП Москва-437, ул.Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им.М.М. Шемякина АН СССР Автореферат разослан " ' " /¿"Xv' 1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат химических наук

Актуальвость проблемы. Надежность и высокий коэффициент усиления фэторецелторных систем зрения животных давно увлекают многих исследователей. Несмотря на то, что за последнее время многие ванные успехи достигнут в изучении процесса фототрансдукции, для всесторонего знания молекулярного механизма этого процесса необходимо изучать структуры, функции ряда важных белков, присутствующих в фоторецепторншс клетках.

Родопсин, как известно, является светочувствительдам пигментом фоторецепторных клеток сетчатки глаза позвоночных и беспозвоночных. Процесс фототрансдукции начинается с поглощения кванта света молекулой родопсина. В свою очередь, фото-возбуждбнная молекула родопсина активирует ряд ферментов и приводит к биохимическим превращениям, в результате которых световой сигнал преобразуется в нервный сигнал с высоким коэффициентом усиления.

Было известно, что фотовозбуаденная молекула родопсина способна взаимодействовать с трансдуцином, родопсинкиназой и аре станом. Каждое взаимодействие играет свою важную роль в процессе фототрансдукции.

Кроме известных белков наружных сегментов палочки сетчатки глаза, со временем обнаруживаются новые белки, структуры и функции которых еще не установлены. Белок Р26 был таким белком. Он способен связываться с делипидированным родопсином, иммобилизованным на Кон А-сефарозе. Актуальность проблемы заключается в определении его функции в фоторецепторной системе.

Необходимой предпосылкой к изучению функции белков является расшифровка их первичной структуры.

Цель работы: Настоящая работа посвящена изучению первичной структуры белка Р26 методами химии белка.

Научная новизна и практическая ценность работы; Проведено расщепление белка Р26 клострипаином и бромцианом. Предложена схема разделения пептидов белка Р26 методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Первичная структура полученных клострипаиновых и бром-циановых пептидов определена на автоматическом газофазном секвенаторе.

На основании результатов сравнения первичной структуры полученных пептидов со структурой известных белков высказаны предположения о функции изучаемого белка.

Публикации. По материалам диссертации опубликована одна статья. Результаты исследований докладывались на Всесоюзном сипозиуме по химии белка (Тбилиси, 1990).

Объем работы. Диссертация изложена на 'страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части и выводов. Список цитируемой литературы включает наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

ВВЕДЕНИЕ. Недавно было обнаружено, что родопсин, будучи солюбклизован в неконном детергенте октилглхкозиде и иммобилизован на Кон А-сефарозе, при обесцвечивании способен связывать избирательно, кроме трансдуцина и белка. 90 кДа, ещё один белок с молекулярной массой приблизительно 26 кДа, обозначенный ках Р26.

Белок Р26 достаточно легко переходит в раствор при про-

мывании мембран наружных сегментов палочки различными буферами. Иммуноцитохимические опыты показали, что белок локализован в наружном сегменте палочки. Однако функциональная роль белка Р26 до настоящего времени не известна.

В настоящей работе представлены данные по анализу первичных структур ряда пептидов, полученкх при расщеплении белка Р26 клострипаяном и бромцианом. С целью выяснения функциональной роли этого белка проведено сравнение его первичной структуры со структурами известных белков.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ I. Аминокислотный состав Р26. Белок Р26 был выделен из супер-натанта, полученного при отмывании изотоническим раствором наружных сегментов палочек сетчатки глаза быка. Выделение было проведено в Мегфакультетской лаборатории молекулярной биологии и биоорганической химии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета. Белок Р26 был очищен с помощью ряда последовательных хроматографий на DEAE-цел-люлозе, Кон-А-сефарозе, колонках Superóse HR 12 и Mono-Q. Чистоту выделенного белка проверяли электрофорезом в полиак-ркламидном геле. Полученный белок Р26 после последней стадии (хроматографии на Mono-Q) имеет чистоту не менее 95%. При электрофорезе в полиакриламидном геле он ведет себя как белок с молекулярной массой 26 кДа (рис.1).

Был проведен анализ аминокислотного состава белка Р26 (табл.1). В его состав входит достаточно большое количество аминокислотных остатков с ионными и неионными полярными боковыми цепями. Это показывает, что белок Р26 относится к типичным гидрофильным белкам.

СГ I 2

ЁЯЬ-- —

Рис.1. Электрофорез в полиакриламидном геле белка Р26 СТ-стандарты 1- препарат после хроматографии на Мопо-О. 2- препарат до хроматографии на Мопо-О. Гель окрашивали Кумасси Н-250.

Таблица 1. Аминокислотный состав белка Р26.

Аминокислота число остатков Аминокислота число остатков

Asx 18 Met 5

Thr 12 .Ile 9

Ser 16 Leu 15-16

Glx 32 Туг 0

Pro О Phe 21

Gly 29 His 3-4

Ala 10-11 lys 21

Val 3 Agr 6

Бредварительные результаты по определению аминокислотной последовательности деградацией по методу Эдмана показали, что N-концевая аминокислота бедка блокирована.

2.Расщепление белка Р26 клострипаином. Нлострипаин представляет собой аргининспэцифическу» цротеазу. Он расщепляет пептидную связь после остатка аргинина. Расщепление 15 нмоль белка Р26 клострипаинои проводили в течение ночи при комнатной температуре в буфере 100 M NH4HC03, рН Т.7, 1 мМ дитиот-реит, при соотношении фермента и белка 1:20 (по весу). Полноту расщепления белка проверяли с помощью электрофореза.

Пептида, полученные расщеплением белка P2S клострипак-ном, разделяли с помощь» высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке Zorbax С8 с обращенной фазой в градиенте концентрации ацетонитрила от 0% до 70% в 0,1% трифгоруксусной

Рис.2. Хроматограф« клострипаинсвого гидролизата белка Р2в на колонке Zorbax С8 4,6 мм х 25 см

кислоты (ТФУ). Скорость элшрования составляла 1 мл/мин. При этой хроматографии получили 13 фракций (рис.2).

б/

Рис.З. рехроматография фракций, полученных при разделении . клострипаинового гидролизата Оелка Р26 на колонке Ultrasphere OIS 4,6 мм х 15 см . а/ Фракция 8. О/ Фракция 9.

Из каждой фракции, полученной при разделении клострипаи-нового гидролизата отбирали аликвоты по одной пятидесятой части для N-концевого анализа по методу Грея. Результаты анализа показали, что в 13-ой фракции содержится пептид, N-концевым аминокислотным остатком которого является треонин. Попытки определения N-концевой аминокислоты в 10-ой фракции не увенчались успехом. Возможно, что в этой фракции находится N-концевой пептид белка Р26, так как К-концевая аминокислота у этого белка блокирована. В остальных фракциях оказывались смеси пептидов.

Фракции, в которых были смеси пептидов, рехроматографи ровали на колонке Ultrasptiere ODS (Alter,США.) в тех же условиях, что и при первичном разделении пептидов. На рис.3 показаны результаты рехроматографии 8-ой и 9-ой фракции.

Фракции пептидов упаривали под струей аргона до .объема 50 мкл. Анализ .аминокислотных последовательностей проводили на газофазном секвенаторе 470 A (Applied Blosystems, США).

Посла рехроматографии на колонке Ultrasphere ODS удалось

Таблица 2. Клостршаиновые пептиды Р26

KI- A-E-K-I-KII- A-Y-A-Q-H-V-F-R

Kill- Q-E-F-Q-T-I-Y-S-K-F-F-P-E-A-D-P-S-R KIV- W-F-D-A-N-S-D-G-T-b-H-F-K-V-Y-R KV- T-P-D-A-N-S-D-G-T-L-D-P-K-E-Y-V-I-A-L-K-X-X-R KVI- Q-E-F-Q-T-I-Y-R

определить частичные или полные аминокислотные последовательности 6 пептидов (табл.2).

Из приведенных данных видно, что между первичными структурами некоторых пептидов имеется сходство. Аминокислотная последовательность четвертого пептида со второго (Тгр) по шестнадцатый остаток (Val) совпадает с последовательностью пятого пептида, кроме His11 и Val14. Шестой пептид также совпадает с первыми семью остатками третьего пептида. Различие заключается лишь в тем, что Arg в пептиде KVI заменен на Ser в пептиде Kill.

3.Расщепление белка Р26 бромцианом.

Расщепление 15 нмоль белка Р26 бромцианом проводили в течение ночи при комнатной температуре в 50% ТФУ при постоянном перемешивании. Использовали 300-кратный мольный избыток бромциана по отношению к метионину. Гидролизат наносили на колонку TSK-SW 2000 (1KB, Швеция), уравновешенную 30% ацетонитрилом, 0,1% ТФУ и элкировали тем же раствором со скоростью 0,5 мл/мин. В качестве стандартов молекулярной массы использовали полипептида с известным числом аминокислотных остатков.

С помощью гель-фильтрации бромцианового гидролизата белка P2S был получен ряд фракций пептидов (рис.4). Так же, как и для фракций клостршаинового расщепления, для каждой фракции, полученной при расщеплении бромцианом, был проведен N-концевой анализ и определение аминокислотной последовательности.

2.0?6

1.8-'.б: ии-1.00.80.6-о:с 0.2-

фрсиаил-

01 3 5 7 9 Л Я

5 ТО 15 20 25 30 35 Ю "т.

Рис.4. Гель - фильтрация бромцианового гидролизата белка Р26 на колонке ТЗК 51(7-2000 7,5 мм х 600 мм.

По данным И-концевого анализа, 1-ая, 3-я и 4-ая фракции содержат пептиды с блокированным И-концевым остатком. 2-ая, 5-ая, 6-ая и 7-ая фракции содержат смеси пептидов с К-конце-выми остатками Тйг и Не, а 8-ая, 9-ая и 10-ая фракции -смеси нескольких пептидов.

Фракции 1, 2, 3 и 4 содержат крупные пептида ( более 30 аминокислотных остатков). Эти фракции рехроматографировали на колонке с фенильной фазой. Фракции, содержавшие более мелкие пептиды рехроматографировали на колонке гогЪах С8. Рехрома-тографию проводили в градиенте концентрации ацетонитрила от 0% до 90% в 0,1% ТФУ со скоростью элюции 1 мл/мин.

а/

АЮ6 «

U'

u w

0A

ад ai аг

2 6 10 и 15 22 26. 30 3i 39 ¿2 мин.

б/

А206

%MeCN Я70

2 б Ю H 1В 22 2Б 30 3Д 38 мин

РИС 5. Рехроматография фракций,'полученных при гель-фильтрации бромцианового гкдролизата.

а/ Фракция 2 на колонке с финальной фазой 4.6 км х 25 см. б/ Фракция 7 на колонке Zorbax С8 4.6 мм х 25 см.

На рис.5.показаны разделение фракции 2-ой и 7-ой бром-цианового гидролизата на колонке гогЬах СЗ и колонке с фе-нильной фазой.

Таблица 3. Бромциановые пептиды Р26.

Б1 1-Б-Р-Б-

Б11 Т-5-А-С-К-Т-Н-0-К-Ь-Е-Р.-А-1,-3-Ь-Т-Б-7-Б-0-К-Н-?? (Т) -Т-И-БШ Т-1г-В-Р-К-Е-У-У-1-А-Ь-С-Р-А-А-^т(V?)-Б (й )-Б-С-Т-Ь-Б-Б1У 1-5-Р-Е-В-Т-К-Н-М-Е-Б-Е-К-Т-Р-Е-К-К-А-Е-К-1-У/-С-БУ Т(I,С >-Р-Е-Н-А-Е-К-1(Ы) -Т (И)-О-Р-Р-С-К-К-

После рехроматографии удалось определить частичные последовательности 5 различных пептидов. Из результатов, приведенных в табл.3, мокно заметить, что существует некоторое сходство в первичных структурах ряда пептидов. 10 начальных аминокислотных остатков бромцианового пептида БШ совпадают с 10 остатками клострипаинового пептида КУ, начиная с 9-го остатка. Поскольку при расщеплении бромцианом не разрывается пептидная связь типа 01у-Х, эти две последовательности должны находиться в различных местах молекулы белка. Сравнивая последовательности этих двух пептидов, мокно также заметить, что последовательность -Р-А-А-Н-З-Б-С-Т-Ь-Б- бромцианового пептида БШ почти совпадает с последовательностью -Р-Б-А-Н-З-Б-С-Т-Ь-Б- клострипаинового пептида К"У. Между бромциановыми пептидами БЗТ и БУ также существует сходство. Последовательность с 15-го по 23-й аминокислотный остаток пептида Б1У совпадает с И-концевой последовательностью пептида БУ.

i.Анализ гомологии белка Р26 с известными белками.

До настоящего времени функциональная роль белка Р26 ещё не определена. Нами была предпринята попытка изучения гомологии структур полученных пептидов этого белка со структурами других известных белков. Сходство первичных структур белков, может говорить об их общей функциональной роли. Было найдено,

что последовательность -Pîie^-...-Glu14- клострипаинового пеп-

1

тида HV белка Р26 сходна с последовательностью -Phe -... 1 fiô

-Glu - одного из кальций-связывающих•белков семейства каль-модулйна витамин D-зависимого кальций-связывающего белка, обнаруженного в кишечнике цыпленка и имеющего молекулярную массу 27,5 кДа:

белок Р26- -TFDANSDGIIDFKE-

совпадение FDAN DG Ь Е

кальций-связывавдий белок—MFDA1QOGKLE1TE-Из литературных источников известно, что участок, который отвечает за связывание кальция представляет собой последовательность 12 аминокислотных остатков. В витамин D-зави-симом кальций-связывахадем белке местом связывания кальция является данный участок: -M-P-D-A-N-N-D-G-K-L-E-L-T-E-. В этом белке существует 4 таких сходных участка. В белке Р26 подобные участки также встречаются в пептидах KIV, KV и БШ.

На рис. 6 показана гомология первичных, структур пептидов белка Р26 с первичной структурой белка визинина. Растворимый белок визинин был обнаружен недавно в колбочках сетчатки куриного эмбриона. Он имеет молекулярную массу-24 кДа. Полная первичная структура белка впервые была расшифрована с помощью анализа кДНК. С помощью метода авторадиографии было

установлено, что визинин, иммобилизованный на нитроцеллюлозе,

способен связываться с ионами . При изучении гомологии

первичных структур визинина со структурами тропонина С и

кальмодулина заметили, что существуют три учаска с высокой

степенью сходства. Эти участки отвечают за связывание ионов 2+

Са . Установлено, что антитела против визинина реагируют также с кальбиндином. На основании этих данных было высказано предположение, что визинин является новым кальций-связывающим белком. Однако роль визинина в фоторецепторных клетках окончательно не установлена.

При исследовании гомологии со структурой визинина заметили, что клострипаиновые пептиды KII, Kill, KV и бром-циановые пептида БП, БШ имеют большую степень гомологии со структурой визинина. На основании анализа структуры визинина мы смогли соединить клострипаиновые пептида KII, Kill, KV и бромциановый пептид БП в одну последовательность, состоящую из 71 аминокислотного остатка, из которых 44 остатка совпадают со остатками визинина в последовательности с 47-го остатка по 117-ый остаток. Четвёртый бромциановый пептид также имеет большую степень .сходства с последовательностью аминокислотных остатков визинина 132-157 : из 26 остатков 15 со-падают с остатками визинина. Нам была предоставлена структура триптического пептида белка F26: (H)-S-G-A-L-S-K-E-I-L-E-E-I-Q-Ir-T-K-F-T-E-E-E-L-S-G ( Дижур А. М., личное сообщение). Структура этого пептида сходна с высокой степенью идентичности последовательности визинина с 5-го по 30-й аминокислотный остаток. Остальные полученные нами пептиды имеют меньшую степень сходства со структурой визинина.

1 20

MGNSRSSALSREVLQELRAS * » * * * * * *

(R)SGALSKEILEELQLN

21 • 40 TRYTEEELSRWYEGF QRQCS

TKFTEEELSG

41

DGRIRCDEFER * *

(R) Q E F Q T

60

IYGHFFPNS * * * * *

IYSKFFPEA

61 80

EPQG-YARHVFRSFDTNDDGT

* * * * « * * * * * * * *

DPSR(A)YAQHVFRTFDANSDGT

81 100 LDFREYIIALHLTSSGKTHL

* ♦ * :jt J¡» ¥ $ £ $ $

bDFKEYVIALK(M)TSAGKTNQ

101 120

KLEWAFSLFDVDRNGEVSKS * * * * * * * * * * *

KIERAFSLYDVDGNNWT

121 140 EVIEIITA I-FKMIPEEERbQ

. ♦ * (M) I S P E D T К H.

141 ' 160

Ь P EDENSP QKRA.DKL-W A Y F N .»****» * * * * * *

"LPEDENTPEK, RAEK IV7G

161 180 KGENDKIAEGEF.IDGVBÍ KND

181 192

AIMRL IQYEPKK

Ионн кальция играют важную роль как активатор или ингибитор во многих внутриклеточных процессах. В некоторых процессах кальций является универсальным медиатором. В фоторе-цепторных клетках в течение многих.лет иону кальция приписывали роль возможного медиатора. Предполагалось, что при поглощении квантов света ионы кальция выходят из дисков в междисковое пространство и блокируют ионные каналы, в результате этого происходит гипэрполяризация мембраны. Несмотря на то, что существует много данных, которые доказывают несостоятельность кальциевой гипотезы фототрансдукции, к иону кальция привлечено внимание многих исследователей. Ионы кальция могут играть важную роль в процессе адаптации системы фототрансдукции. Как известно, концентрация гуанилиновых нуклеотидов наружных сегментах палочек контролируется четырьмя процессами:

а) гидролизом цГМФ фосфодиэстеразой;

б) фосфорилированием фотовозбуадбнного родопсина родопсин-киназой;

в) спонтанным гидролизом ГТФ до ГДФ активированной субъединицей Та-ГТФ трансдуцина;

д) синтезом цГМФ гуанилатциклазой. Было обнаружено, что ионы кальция влияют на скорости фосфсря-лирования родопсина, гидролиза ГТФ Та-субъединицей трансдуцина и на активность гуанилатциклазы.

Рис.6. Сравнение первичных структур визинина и Р26. верхняя строка-структура визинина, нижняя-структура белка Р26. *- обозначает сопадение

Из полученных данных можно сделать вывод о том, что белок Т>26 имеет первичую структуру, подобную структуре визинина, и, возможно,' является кальций-связываюшим белком, играшим важную роль в ферментативных процессах НСП.

вывода

1. Белок Р26, выделенный из наружных сегментов палочек сечат-ки глаза быка по аминокислотному составу является типичным гидрофильным белком.

2. Проведено расщепление белка Р26 клострипаином и бромциа-ном. Предложена схема получения клострипаиновых и Сромциано-вых пептидов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.

3. Частично или полностью определены первичные структура 6 клострипаиновых и 5 бромциановых пептидов Р26. Обнаружено сходство аминокислотных последовательностей ряда полученных пептидов.

4. При сравнении первичной структур! белка Р26 с витамин I)-зависимым кальций-связывавдим белком, обнаруженным в кишечнике цыпленка, обнаружен .участок, подобный участкам связывания кальция, причем такой участок встречается в трёх пептидах Р26.

5. Белок Р26 высоко гомогичен кальций-связывапцему белку

визинину, обнаруженному в колбочках сетчатки куриного.

■ %

эмприона. Вероятно, белок Р26 является кальций-связывавдим белком.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях.

1. Нгуен Т.З., Клезович О.Н., .Кутузов М.А., Левина Н.Б., Дижур A.M., Филиппов П.П., Абдулаев Н.Г. Фоторецепторный белок Р26.-' Тезисы докладов Всесоюзного симпозиума " Химия белка Тбилиси.1990. с. 104.

2. Нгуен Т.З., Клезович О.Н., Кутузов М.А., Левина Н.Б., Абдулаев Н.Г. Фоторецепторный белок P2S.- Сенсорные системы, 1991, Т.5, JK2, с. -

Подписано к печати Щфе&ръл! 195/ г.

Отпечатано на ротапринте в Формат бумаги 30x42/4

Производственном комбинате Объем 3 п.л.

Литературного фонда СССР Зак.^Х'"' Тир. 1°0 тел. ¿52.