Выделение, структура и свойства новых регуляторных пептидов из мозга крупного рогатого скота тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

б од

6 АПР 1993

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. М.М.ШЕМЯКИНА И Ю.А.ОВЧИННИКОВА

На правах рукописи УДК 577.171.55

Карелин Андрей Авенирович

ВЫДЕЛЕНИЕ, СТРУКТУРА И СВОЙСТВА НОВЫХ РЕГУЛЯТОРНЫХ ПЕПТИДОВ ИЗ МОЗГА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

Специальность: 02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА - 19ЭЗ

Работа выполнена в Институте биоорганической химии им. 1.1.М. Шемякина и О.А. Овчинникова РАН

Научный руководитель: доктор химических наук В.И.Цетлин

Официальные оппоненты:

Академик РАМН, доктор биологических наук,

профессор И.П. Ашмарин

Кандидат химических наук А.Л.Жузе

Ведущая организашя: Институт нормальной физиологии им. П.К.Анохина РАМН

Защита состоится 12 мая 1993 года в 10 часов на заседании специализированного совета Д 002.35.01 при Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН по адресу: 117871, ГСП-7, Москва, В-437, ул. миклухо-Маклая 16/10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии юл. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова

Автореферат разослан "/с?" апреля 1993 года

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

В.А.Несмеянов

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТИ

Актуальность проблемы. Класс веществ пептидной природы, объединяемых общим названием нейропептидов, включает в себя большое количество соединений, значительно отличающихся по аминокислотному составу, механизму действия и локализации в организме. Общим для этих веществ является их влияние на деятельность центральной нервной системы. Под этим подразумевается действие на передачу нервного импульса, нейрозндокринную регуляцию, нейроыо-дуляторные эффекты. Систематизация накопленного материала дала возможность выделить несколько классов нейропептидов, объединяющих- вещества, сходные по структуре или функциональным эффектам. В качестве примеров можно привести опиоиды, тахшшнины. тензины и т. д.. К настоящему времени выделено несколько сотен нейропептидов, но не найдено двух разных по структуре веществ, обладающих идентичной биологической активностью. Этим объясняется тот интерес, который вызывает каждый новый нейропептид.

Цель работы. Целью настоящей работы является выделение и установление первичной структуры новых пептидов из мозга крупного рогатого скота и изучение их биологической активности.

Научная новизна. В результате работы выделены и идентифицированы три новых эндогенных соединения пептидной природы, установлена их структура п спектр биологических активностей.

Практическая ценность работы. Установлено, что идентифицированные пептиды способны к коррекции поведенческих проявлений, что служит основанием для исследования перспектив фармакологического применения этих вешеств в качестве прототипов новых лекарственных препаратов или моделирования нервных процессов .

Апробация работы и публикации. Результаты исследования доложены на II Всесоюзных п международных симпозиумах и конференциях. По материалом исследований подготовлено и опубликовано свыше 25 печатных работ.

Структура дисертацаи. Диссертационная работа изложена на 105 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения резульгатаов, экспериментальной части выводов п списка цитируемой литературы (125 ссылок).

- г -

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Выделение и установление структуры новых пептидов

1. Первичная хролютографическая очистка.

Исходным материалом для выделения нейроактивных веществ являлась основная фракция кислотного экстракта гомогената мозга крупного рогатого скота (к.р.с.). Эта фракция была получена после экстракции 10 % уксусной кислотой предварительно автоклавиро-ванного и гомогенизированного мозга крупного рогатого скота и двух последовательных стадий ионообменной хроматографии: на ка-тионообменнике КУ-2, а затеи на СМ-МОлселекте А-25 (схема I).

При таком способе первичной очистки биологического материала основную массу полученных вешеств составляли сильно основные соединения с молекулярной массой до 10 кД, что было показано с помощью ультрафильтрации на мембранах РМ-10 и 177-0.5, а также гель-хроматографией на колонках с Bio-Gel Р2 и TSK 2000 SW.

Тестирование биологической активности фракций проводили путем инъецирования их крысам в латеральные желудочки ыозгэ. Фракция обладала ярко выраженной агрессотропной активностью.При вну-трижелудочковом введении она индуцировала спонтанные агрессивные схватки у крыс через 18-20 часов после инъекции, регистрировавшиеся на протяжении 48 часов, а также вызывала значительное повышении электроболевой агрессивности животных и снижение хищнической п межсамцовой агрессивности в эти же сроки.

Для дальнейшего анализа активной фракции использовали градиент рН от 7 до 4 в 0.1 M аммоний-ацетатном буфере при хроматографии на колонке Silasorb 600. При этом удалось добиться сорбции и значительной очистки активной фракции, однако форма гради ента, определяющаяся природой буфера, не позволила получить до статочное разрешение веществ в области злюшш активного вещества. В процессе дальнейшей работы эта хроматографпческая операция была Использована в качестве одной из предварительных стадий очистки (схема I). Б результате удалось добиться примерно восьмикратной очистки активной фракции (фракция I) по сравнению с вешествоп, полученном после хроматографии на СИ-Ыолселекте.

iîocju. гель-хроматографии фракции I на колонке с Сефадек

ема I. Выделение агрессотропной фракции из мозга крупного рогатого скота.

сунок I. Гель-хроматография агрессотропной фракшш на колонке с Сефадексон 0-25 эГ, уравновешенной 0.1 II уксусной кислотой. Отмечены места элюцип активных фрэкиий.

сом с-25 з! в 0.1 М уксусной кислоте фракция (I), элюирующаяся в области полного объема колонки (рис. I), при внутрижелудочко-вой инъекции подопытным животным воспроизводила основной комплекс защитно-оборонительных реакций, вызываемый исходной фракцией I. При совместном введении подопытным животным фракции I и фракции, содержащей вещества с большей молекулярной массой Ш), была показана способность фракции М значительно уменьшать эффективные дозы фракции 1 при индукции спонтанной агрессивности, а также изменять первичноразвившийся симптомокомплекс. ГЬКонпевой и аминокислотный анализ фракции !.1 показал наличие в ней пептидного материала. В результате дальнейшего анализа пептидной фракции с помощью обращеннофазной хроматографгш на колонке тл 1га-зр'пеге-ОШ в присутствии 0.1 % трифторуксусной кислоты в градиенте ацетонитрида от О до 50 % было показано, что она состоит из сравнительно небольшого количества веществ пептидной природы з количествах от 50 ш.галь до 4 нмоль в пересчете на 100 кг мозговой ткани. По данным Ы-концевого анализа в этой фракции содержится 15-20 различных пептидов.

Таким образом, на этом этапе выделения было показано присутствие в исследуемой фракции кроме собственно агрессотропного вещества, некоторых других веществ, вероятно, пептидной природы, обладающих биологической активностью. Выделение, установление первичной структуры и подбор условий для определения спектра биологической активности этих соединений составило задачу, отличную от изучения собственно агрессотропного вещества.

В результате дальнейшего исследования агрессотропное начало исходной фракции было определено как комплексное соединение цинка с некоторыми алифатическими третичными аминами.

■ 2. Выделение петийод и анализ ш первичной структуры.

Как было показано в первой части работы, в исходной агрессо-тропной фракции присутствуют пептиды, способные модулировать поведенческие реакции при инъекции подопытным животным. В то же время, отсутствовали условия биологического тестирования непосредственно этих веществ, а малые количества пептидов (0,5-4 нмоль) не позволяли провести подбор тестов, могущих служить ориентиром в процессе выделения. Все вышесказанное обусловило еле-

дувший подход: выделение максимально возможного количества пептидов; установление их первичной структуры; анализ этой структуры, т. е. сравнение ее с последовательностями, содержащимися в бежово-пептидных банках с целью определения возможного происхождения пептидов и наличия гомологии с известными веществами, синтез аналогов и затем исследование биологической активности синтетических препаратов в широком круге тестов.

Дальнейшее разделение фракции I проводили с помощью гель-хроматографии на колонке с Сефадексом й-ю в 0.1 М трифторуксус-ной кислоте (рис. 2).

Рисунок 2. Гель-хроматография агрессогенной фракции из мозга крупного рогатого скота на колонке с Сефадексом G-I0, уравновешенной 0.1 М уксусной кислотой.

Для выделения в гомогенном состоянии исследуемых пейтидов применяли обрашеннофазную хроматографию на колонке Ultrasphere ODS в градиенте ацетонитрила в присутствии 0.1 % трифторуксус-ной кислоты. При делении фракции Z (рас. 2) был выделен ряд веществ, соответствующих пикам, обозначенным на хроматограмме (р пс. ЗА).

Для веществ, соответствующих пикам 1-8, были проведены аминокислотный и 'Ьконцевон анализ. Аминокислотная последовательность пептидов, соответствующих ликам I и 3 была определена с

fi210

сш m

L W ЫЦ-

20 .«Q № „„

Рисунок 3. Обращеннофззнзя хроматография фракций, полученных после гель-хрсштогрэфик агрессогенной фракхпш

(Рпс, г) „ на колонке tn.irsspr.er« OLG в присутствии О,. I к ттктфторуксуснопкпслогы е гсдоигзд ьие-Т0»ШТР1-ЛЗ. а - фракция 2; Б - Cwain.? _*.

помощью автоматического газофазного секвенатора:-

Tyr-bys-bys-Arg-Pro-Tyr-Ser-bys-Arg-Thr-Ala И Туг-А1а-Туг-Туг-Туг

Методом масс-спектроскопии с ионизацией быстрши атомами (УАВ-масс-спектроскопии) был получен молекулярный ион с массой 1398 Д, согласующейся с аминокислотной последовательностью приведенного выше ундекапептида, что подтвердило правильность установленной структуры.

При разделении в аналогичных условиях фракции 4 (рис. ЗБ), юлученной после гель-хроматографии, было выделено значительно Зольшее число пиков, но только немногие из них соответствовали веществам пептидной природы, что было показано с помощью аминокислотного анализа. Было установлено, что вещества, соответству-ощие пикам 1-3, являются, соответственно, изолейпином, фенилзла-¡hihom и тирозином. n-Концевой анализ пептида, соответствующего тику 18, показал наличие остатков Туг-, Gly, Ser. Секвенирование пептида по методу Эдмана с определением дансилированного и-кон-цевого аминокислотного остатка после каждого шага позволило установить пять аминокислот. Повторное секвенирование с использованием автоматического газофазного секвенатора показало наличие гетырех аминокислотных остатков. В обоих случаях не удалось однозначно установить IT-концевой аминокислотный остаток. Полученные варианта структуры выделенного пептида можно представить: [Ser, Гут. Gly ]-Arg-Asp-Lys-Arg-?

Количество пептида, полученного при выделении (0.5 нмоль) эе позволили точнее определить исследуемую аминокислотную после-тователыгость непосредственно секвенированиеы. Поэтому, для уточнения структуры выделенного пептида был использован иммуно-эеактивный материал, идентифицированный с помощью антител, Полуниных на конъюгат синтетического пептидного аналога с гемоианн-юм (см. ниже).

Поиск установленных структур в банках пептидно-белковых последовательностей показал, что пептиды с такой последовательностью аминокислотных остатков неизвестны.

Сравнение новых пептидов с ранее известными нейропептилами юказало, что наибольшее сходство последовательность ундекапеп-

тада имеет с последсзэтельностяш; нейротензина, каялздшз, леаи-тидз, а Техасе с Н-кспцевым фрагментом нейрсвхтивного пептида, ваяелеаного из ксЗрсвз улпкз-з Ар1уз1а ca.lifom.lca (рис. 4). Обращает на себя вшшгниз заметная гомология меаду нейротензирзм я взделешаш ундекапспжюм, затрагивающая тот участок молокулл пзйротензана, которому приписывается основная роль в проявлении &ЮЯ0Г2ЧЗСКСЙ йкт'!2иост:' ¿того пептадэ, что позволяет предположить наличие у выделенного уодекапептидо нейротензин-гадобвсй живности,

«■» --SJ*-01;—Тлг-Ь« !-,rnr-',5fT-i.Y«-i???Ilr--L.VJ-Cl!'-

TyrjLyi-Ly»-frr

pSl-I>«u-:Ua-V*l-A*a-Ly«-Ali-

»Gl-Cly-

*

Arg-Ar з-Pro-Tyr-II e-Leu •i.*e-iur«-»r$-Tf p-:i -iM'ti

Ils-.Ua

er

Asp-Val-Ser-Aep-Olj'-Sas'-Alä-Gld

Lya-Are-Prolpro-CIy-fha-Ser-pro-Pne-Ärg Lye-j

II« ASll

tro-Tyr-Ile-Leu Prc-Tyr-Ils-Leu

Lys

fcrg-Are-fro-Tyr Thr-Arj-Met-Gli— Ser-Gly-

1

Рисунок 4. Анализ последовательностей, содержащих гомологичные участки с выделенным ундекапептидом шр-11. i - леви-тид (Кепориз sp.), 2 - МВР-11 (к.р.с.), 3 - нейротен-зин (к.р.с.), 4 - нейротензин (курипа), 5 - ксеноп-син (Кепо-раз sp.), 6 - кинетензин (к.р.с.), 7 - кал-лидин (к.р.с.), 8 - нейромедин Л (к.р.с.), 9 - bA}JT-6 (курица, 10 - Ri5ai (Jplysta californica, М-концевой фрагмент аминокислотной последовательности)

Для выделенного певтапептидз X-Arg-Asp-Lys-Arg-? среди из-бзстных нейропеятидов не удалось обнаружить ни одного вещества, структура которого моглаа хотя бы приблизительно, подсказать

возможные проявления активности выделенного пептида. Среди белковых последовательностей гомологичные участки присутствуют в структурах гонадотропина, лютропинэ и проопиомеланокортина (рис. 5).

X -Arg-Asp-Lys-Arg Пептид FS

Asn-Tyr-Arg-AGp-Val-Arg-Phe Гонадотропин 61-67

Ibr-Tyr-Arg-Asp-Val-Arg-Phe Лютропин 60-65

Pro-Pro-Iys-Asp-IyB-Arg-Tyr Проопиомеланокортин 209-215

Рисунок 5. Анализ последовательностей, содержащих участки, гомологичные выделенному пептиду Р6

Что касается пентапелтида Tyr-Ala-Tyr-Tyr-Tyr, то подобные, богатые остатками тирозина участки, встречаются достаточно часто в самых различных белках, например, в предшественнике нейро-тензина. Последовательность, полностью соответствующая структуре выделенного пептида, была идентифицирована в составе белка множественной устойчивости к лекарственным препаратам multidrug resistence protein (113-11?) - специфического белка, экспресси-руемого группой генов в трансформированных клетках в ответ на хемиотерапевтическое воздействие. В то же время, нельзя однозначно утверждать, что источником выделенного пептида является именно этот белок.

Синтез пептидов и их аналогов.

С целью изучения биологической активности выделенных пептидов были синтезированы как сами пептиды, так и некоторые их аналоги (рис. 6).Синтез проводили твердофазным методом.Выбор синтетического фрагмента (Р7) ундекапептида (ИВР-11) обусловливался известными данными о иосттрансляиионном процессинге нейропепти-дов. Ранее было показано, что вышепление большинства нейропепти-дов из последовательности белка-предшественника происходит в результате специфического протеолиза по участку основных аминокислотных остатков. Синтез ряда аналогов пентапелтида (Р6) - РбТуг, P6Ser, P6Gly и Р4) был осуществлен с учетом данных о механизме образования амилировэнных С-концевых аминокислотных остатков.

ykkrpyskrta

y к к r p y s ykkrpyakrta

y a y y y

NHP-11 P7

NRP-11A P5

y r d к r g s rbkrnhj g r d к r nh2 d к r g

РбТуг P6Ser P6Gly P4

Рисунок 6. Структуры синтезированных пептидов.

Имыуноскрининг в гоыогенате ыозга купного рогатого скота.

Для проведения имыуноскриннинга в различных системах были получены антитела на конъюгаты пептидов Р5, РбТуг, Р7 и NRP-11. Получение антител имело целью показать присутствие пептидов непосредственно в мозге, то есть доказать их эндогенность и провести иммуногистохпмическую локализацию, а также идентификацию имыунореактивного материала.

Полученные после трехкратной иммунизации кроликов конъюга-тами синтетических пептидов с гемопианином (KIH) антпсыворотки показали в EUSa тптр < 1:1000000 для Р5, 1:1000000 для ÎJRP-11, 1 :480000 для РбТуг И 1:40000 ДЛЯ Р?.

Антитела на пептиды ШР.-11, Р5 и Р6 выделяли аффинной хроматографией на пептидил-сефарозе, полученой модификацией соответствующим пептидом СН-активированной сефарозы 4В. Титр выделенных антител в ELISA составил 1:30000, 1:20000 и 1:40000 соответственно .

Очпшенные таким образом антитела были использованы для поиска пммунореактпвного материала в пептидной фракции экстракта гоыогената мозга крупного рогатого скота. После гомогенизирования, экстракции 10 % уксусной кислотой и центрифугирования, су-пернатант, содержащий пептидную фракцию лиофилизовали. а затеи проводили гель-хроматогрэфию на колонке с Сефадексом G-25 si (рис.?). Для определения наличия'пммунореактпвного материала полученные фракшш переносили на нитроцеллюлозу с помошью аппарата для шжрофпльтрашш Bio-Dot и проводили иммуноферпентный анализ. Было показано наличие в экстракте гомогената мозга иммуно-

реактивного материала для антител, полученных на все три пептида. Дальнейшее разделение пептидного материала с использованием обращеннофазной нрьс с последующим иммуноферментным анализом иммобилизованных на нитроцеллюлозе фракций показало наличие нескольких иммунореактивных веществ для антител, полученных на каждый пептид.

А „

НМ

1

I

/ /

I

\

I N лГ

I V/

\ I 1 Л

1Д1 ^

' V \ I \

V к

-с-Н—Н-Н-4

А В

200

и

Рисунок 7. Гель-хроматография кислотного экстракта гомогашта

мозга крупного рогатого скота на колонке с Сс.фаяек-

сом о-25 эГ, уравновешенной о.Г 1,1 уксусной кислотой.

Отмечены зоны элюиии иммунореактивного материала

ЖР-11 -подобная иымунореактивность Р5-подобнэл ишунорезктишссть +++++++ рб-подобная иммунореактивность

¡Гзоэлекторофскусирование фракций, полученных после обращен -но-фэзноп хроматографии, на стандартных пластинках геля в интервале рН 3.5-Э.5 позволило получить результаты, необходимые для соотнесения иммунореактпвн&стн с конкретными веществами. Б част-

со

СО

Рисунок 8. Анализ шлмунореактнвных веществ, содержащихся во фракции В (рис. 7). Обрашеннофазная хроматорафия на колонке Мио1еозИ 7цс8 в присутствии 0.1 Ч трифтор-

уксусной кислоты. Отмечены области элюиии ишуноре-активных веществ и охарактеризованные пептиды

ности, было показано, что вещество, обладающее иммунореактивнос-тью к антителам, полученным на пептид РбТуг во фракции В (рис. 8), и идентичное по хроматографичесшш характеристикам эндогенному пептиду, соответствует веществу с pl > 9.3, что свидетельствует об амидировании С-концевого остатка аргинина. Расчет изо-электрической точки, проведенный с учетом значений рК аминокислотных остатков, входящих в состав пептида, показал, что значение pl для амидированного пептида должно составлять 9.4-9.6. в то время, как для пептида со свободной С-концевой карбоксильной группой значение pl находится в области 8.6-8.8. Секвенирование выделенного в гомогенном состоянии иммунореактивного материала с использованием дансильного варианта метода Эдмана. показало содержание в нем пептида с Последовательностью (SRDX-?), а аминокислотный анализ показал идентичность состава пептида Р6 (SRDXR) и исследуемого иммунореактивного вещества. Сравнение параметров элюшш при обрашенно-фазной хроматографии (колонка U1-trasphere ODS) для всех синтетических аналогов пептида Р6 и иммунореактивного материала показало, что для пептидов РбТуг, РбБег и P6Gly область элюшш соответствует 18-24 \ ацетонитрила, в то время, как для иммунореактивного вещества с той же аминокислотной последовательностью область элюшш соответствует 5055 % аиетонитрила. Такое различие в хроыатографических характеристиках может служить основанием для предположения об ацилиро-вании эндогенного пептида F6 по гидроксильной группе серина жирной кислотой.

Удалось показать также, что имеется два вещества, обладающих иммунореактивностью к антителам, полученным на пептид F6 и отличающихся от него как по молекулярной массе, так и по значению изоэлектрических точек, pl 7.7 и pl 5.5, соответственно. При этом необходимо отметить, что добиться разделения этих нмму-нореактивных вешеств удалось только комбинацией хрсматографнчес-ких методов и изоэлектрсфокуспрованил. так как при высокоэффективной хроматографии на обращенной фазе не удается добиться достоверного разрешения иммунореактивных веществ.

:TRP-11-подобная иимунореактивность была детектирована в области элюшш более высокомолекулярных пептидов (рис. 7). НеоСхо-

димо отметить, что при попытке идентификации самого пептида по хроматографичесюш характеристикам его синтетического аналога не удалось обнаружить иммуноферментной реакции в области элюшга стандартного пептида. Это может быть связано с низким содержанием ШР-11 в мозговой ткани.

Хроматография в стандартных услових синтетического пептида F5 позволила точно определить время его элюшш с колонки Mucleo-sll 7|i Cg. Последующее деление фракции, содержащей Р5-подобный иммунореактивный материал и иммуноферментный анализ позволили установить идентичность хроматографических характеристик иымуно-реактивного вещества и стандартного синтетического пептида (рис. 8), что позволило сделать вывод о присутствии в исследуемом материале выделенного пептида и о специфичности используемых антител.

Для пептида Р5, кроме иымунореактивного материала, идентифицированного как сам пептид, было отмечено наличие еще одного вещества, дающего реакцию в иммуноферментнсм анализе и обладающего большей молекулярной массой. Низкое содержание пептида не позволили установить его полную последовательность. Идентификация четырех первых аминокислотных остатков показала полную идентичность со структурой пептида Р5 (YAYY-?) (рис. 8). Таким образом, секвенированное Р5~подоСное вещество может являться предшественником исходного пептида.

Иммуногистохимическая локализация пептид-подобного имыуно-реактивного материала на срезах мозга крысы, полученных в Институте нормальной физиологии им.П.К.Анохина, показала наличие специфического имыуноферментного окрашивания клеток эпендимы в случае антител на пептид Р5 и рассеянной по всему мозгу иыунореак-■гивности с максимальным содержанием в кортексе и гипоталамусе в случае антител на пептид РбТуг.

Исследование биологической активности выделенных пептидов и некоторых их синтетических аналогов.

Лля всех известных на сегодняшний день нейропептидов наиболее характерной особенностью является мультифункциональность, то есть способность пептида регулировать самые разные процессы в различных тканях организма. Одной из задач, стоящих перед ис-

Таблица 1. Биологическая активность пептидов, выделенных аз аг-рессотропной фракции мозга крупного рогатого скота.

ПЕПТИДЫ

ТЕСТ-СНСТЕИН

HRP-11«

Р6<

F5

I. открытое поле II. Условворефлекторное поведение

A. форсирование йодное преграды

B. Челночная камера

¡тест пассивного избегания)

C. Хамера Вогедя III. Агрессивное поведение

A. Эпектроболевая агрессия

B. Межвидовая агрессия

C. Нехсамдовая агрессия Р. Групповое поведение

IV. Пищевое поведение

A.Потребление аипн .

B.ПотреОленне воды V. Анальгезия

VI. Вертикальная активность

О О

HI

HI

нт

tzar

ВТ

I. Няотропная активность О НТ О

II. Кардиотропяая активность О ЯТ ИТ

III. Вазоврессорная активность О НТ ВТ

IV. Периферическая гормональная активность »0 НТ

V. Изменение уровня нейромеднаторо» НТ ! ВТ

VI. Цитотоксичность ' + ( НТ НТ

I. ■Antl-¥rltblng" активность ВТ j ЯТ о

II. Амфетамин-ивдуцированная гипотермия ЕТ НТ О

Ш. феваиин-инхуцированная стереотипия ЕТ ВТ О

IV. "Head-twitch" феномен НТ НТ ♦

I. Влияние на связывавне лигандов нейромедиаторных рецепторов

A. Глутанатиые О

B. Нускариновые ацетилхолиновые о

C. ji-Адреноэргические О

D. Серотониновые О

E. Дофаминовые +

F. dl-Адренозргяческие НТ

G. ог-Адревозргические НТ II. Взаимодействие с пептидными рецепторами

A.ji -Опиатными О

B. Рецепторами вещества Р О D. Нейротевзиновыни о/*

III. Специфическое связывание с синап-

тическими нехбрананя НТ

о о

НТ

о

НТ ЕТ

О о

НТ

о о

о +

о о

о/«

о о

нт

I. Локализация пептидов в мозге' " -<г..... ♦'

П. Наличие пептидных предшественников + | - ♦ +

I. фосфорилировавне + 0 НТ

II. Регуляция фосфоинозитольного обмена + НТ НТ

III. Влияние ва активность адевилатциклазы + НТ НТ

1. Активность на изолированном нейроне 0/* t +

II. Активность на срезах гиппокампа ♦ НТ НТ

* - положительный эффект - - отрицательный эффект

о - отсутствие эффекта НТ - тестирование яе проводилось

« - для пептида получены синтетические аналоги

следователями новых нейропептидов, является максимально возможно полное изучение всего спектра биологической активности вещества. Основываясь на этих соображениях, биологическая активность синтетических препаратов выделенных пептидов и их аналогов была исследована в тест-системах, представленных в таблице I.

Воздействие пептидов на поведение животных и электрофизиологические реакции идентифицированных нейронов виноградной улитки Helix aspersa были исследованы в Институте нормальной физиологии им. П.К.Анохини РАМН; исследование периферической активности пептидов Р? и ШР-11 осуществлено в Институте органического синтеза АН Латвии (Рига, Латвия); воздействие пептида N№-11 на переживающие срезы гиппокаыпа крысы было исследовано в Институте физиологии высшей нервной деятельности РАН; воздействие пептидов на связывание лигандов различных рецепторных систем изучалось в лаборатории нейромедиаторов и нейрореиепторов и лаборатории рецепшш нейропептидов Института биоорганической химии им.II. Ы.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН, Институте физиологии им. И.С. Бериташвили АН Грузии (Тбилиси, Грузия), Центре молекулярной диагностики РАМН, Кардиологическом центре РАМН; участие пептидов во внутриклеточных биохимических процессах исследовалось в Центре молекулярной диагностики РАМН; активность пептида Р5 в некоторых фармакологических тестах изучали в Институте эпидемиолигп, микробиологии и гпгпены (Ростов-на-Дону. Россия).

I. Биологическая ативностъ пептида N№-11 и eso аналогов.

При внутрижелудочковых инъекциях пептидов р7 и жр-и крысам наблюдаются заметные изменения поведения и двигательной активности. При введении пептидов в дозах 70-200 рг/кг для пептида Р7 и 100-300 цг/кг для пептида N№-11 были отмечены эпилеп-тоидные судороги, характерные ротации, учашение реакций грумин-га и исследовательской активности продолжительностью до 2 часов. Ллл NRP-11 через 24 часа после инъекции наблюдалось заметное увеличение двигательной активности. После введения пептида Р7 через 3-4 часа развивается состояние гипокинезии, снижение социальных контактов л исследовательской активности, продолжающееся до 20-24 часов. Инъекции пептида Р? в дозах около 400 рг/кг вызывают у крыс коматозное состояние продолжительностью до 2 часов.

Енутрибрюшпнное введение обоих пептидов в дозах до 2 не приводит к видимым изменениям в поведении.

Внутрижелудочковые инъекции пептидов вызывают у подопытных животных различные нарушения пищевого поведения, в зависимости от дозы и времен;!, прошедшего с момента введения. Так при дезе 50 рг/кг для обоих пептидов наблюдается некоторое увеличение потребления пиши, а для F7 п воды, ко сравнению с контролем з течение 2 часов после инъекнж.

Исследование действия пептидов на моделях элсктробо..пе^пп мьасальсвсй и хшшческой агрессивности крге локозалк отсутп-вяе статистически значтадс эффектов.

Инъекции пептидов Р7 и NRP-11 ухудшают у подопытных утес.;-них способность к обучению, но в зависимости от дозы, окааге-т? различнее влияние на воспроизведение полученных навыков.

В целом, поведенческие реакции, наблюдаемые у подопытных животных при внутрижелудочковых инъекциях :ikp-ii и Р7 сходны с

1 SivoBbn^.i, IlCílpC iCii JiitiJU tlp.i t^ü'ipJ-ILtíOU ^

Е опытах in vitro изучена миотропная активность пептидов :,"КР-11 и Р7 в сравнении с нейротензином, влияние этих пептидов на секрецию гистамина, а в опытах in vivo - влияние на артериальное давление. Было показано, что пептиды не обладают вазо-прессорной и ыиотропной активностями, характерными для нейротен-зина. Индукция выброса гистамина перитонеальными тучными клетками выражена сильнее для :jrp-ii и р7, чем для нейротензина, но отсутствие кардиотропного эффекта, характерного для нейротензина. который опосредуется секретируемым гистамином, ставит под сомнение реализацию этого процесса in vivo.

Пептиды апплипировали в физиологическом растворе, омывавшем ганглии улиток в концентрациях I нМ-10 цМ, в течение 10-20 мин. Результаты показывают отсутствие значимого эффекта пептидов на нейроны оборонительного и пищевого поведения. На переживающих срезах гиппокампа крысы аппликация :шр-11 в концентрациях 0.01 - I цМ также не оказывает видимого влияния на величину фокального суммарного ответа нейронов поля CAI. вызванного стимуляцией афферентных волокон. Б то же время, при совместной аппликации с апеморфияом (I p¡.l) :IRP-11 в концентрации 10-100 нМ

подавляет, а при концентрации I рМ - усиливает облегчающее влияние апоморфина на амплитуду вызванного ответа.

При анализе влияния NBP-11 и Р? на связывание лигандов ряда рецепторных систем (табл. 1) была показана способность этих пептидов избирательно модулировать связывание лигандов дофаминовых D2-рецепторов. При этом на мембранах стриатума NRP-II оказывал сходное с нейротензином влияние на связывание %-спиропери-дола, а на мембранах nucleus ассшпЪепз он подавлял специфическое связывание %-галоперидола. Обратная картина наблюдалась для пептида Р7; подавление связывания антагониста на мембранах стриатума и сходное с нейротензином потенциирование связывания %-галоперидола на мембранах nucleus асситЪепз. Зависимость способности мембранных препаратов п. accumbens связывать радиоактивный агонист 02-рецепторов %-ADTlí (5нМ) от концентрации NHP-11. Р7 и нейротензина при совместной инкубации описывалась пери-одическиыи чередованиями ингибирования и потенциирования связывания лиганда в интервалах концентраций пептидов 0.1 нМ - I цМ, причем общая форма этой зависимости подобна для всех трех пептидов. Влияние нейротензина на связывание различных дофаминерги-ческих лигандов с препаратами мембран из различных мозговых структур известно из литературных источников.

Одной из характерных особенностей нейропептидов является влияние на механизм нейропередачи. Предполагается, что реализация такой активности пептидов может происходить как через собственно пептидные рецепторы, так и через воздействие на связывание классических нейромедиаторов, т.е. иоду....;.,::'., оиго процесса. Результаты, полученные на переживающих срезах гиппокампа и мембранных препаратах мозга указывают на большую вероятность реализации такого рода эффектов для пептида NRP-11 in vivo.

Связывание нейромедиаторов со своими рецепторами запускает ряд внутриклеточных процессов. В частности, для D2-дофаминовых рецепторов показана возможность регуляции обмена фосфатидилино-зитов. Известно, что нейротензин, наряду с модуляцией связывания дофаминергических лигандов, активирует обмен фосфатидилино-зитов. Дофамин, в свою очередь, способен ингпбировать этот процесс. Показано, что важную роль, как в фосфоинозитольном обмене,

так и в регуляции функционирования дофслгаергктаа-гсЗ спстеет, играет протеяшспнззз С. Поскольку ШР-11 по ряду пргсз£"сз является нейротензин-подсбным пептидом п. кач бкзо яокззйзо рзявг. способен селективно изменять параметры связывания лигандов D2-ренепторов, можно было ожидать от него дс'<г.твтля на фосфовнозн-тольный обмен.

В концентрации I ¡iM пептид вызывает ув<?ичензе (до 200 %) накопления инозитфосфатсв в присутствии ы в клетках иейроблас-тоуы х глиомы n0106-15. Накопление вкозят-I, 41б-тряфосфата регистрировалось через 15 сеч после нетато йнк?Сгцки, достагзгр «гчсанума (350%) че^ез 1.5 гипуп и всзврззалссь на базолыглй уровень через 5 минут. Нгксплепие кнозат-I, 4-л»4'осфз?г н инозит-I-фосфзта наблюдалось -:ерез I и 5 минут соотгогствонно. TFcrc-5-ный эффект показан для нейротензкна.

В то же время аминокислотная последовательность r¿R?-n ныо-чкнает последовательность характерную для известпкх субстратов лротешшзнзз (т. е. предполагаемой участок, фоо5оряяароз£уяя ои-рууев кластерами оспоеннх аинокисдотаых остетеоз) и, сладсвч-тельво, мскет являться эндогенным субстратом какой-либо протекн-киназы. Удалось показать, что прстеинкиназэ С способна фосфори-Лфовэть. TJRP-11 í Y 300 nmol/tr,in*rng, Г^ 5 рм), в С82+,каль-иодулш-ззвисиыея протеинкиназа II и сАМР-зависикал протегашша-за оказались не эффективны. Фрагмент Р7 не фосфорилировался нп одной из испктэних протеинкиназ, пептид крр-иа являлся лнгяба-"С;г>< этого процесса. С помошью фосфоамгогокислотного знзлиза Cují;: по" 534110» что протеинкиназа с модифицирует остаток ser7.

•.-.•.,..ло сделать вывод, что ккр-и способен служить субстратом протепккиназы С in vitro. Возможность реализации такого процесса in vivo требует дополнительного исследования.

Полученные для NKP-11 и Р7 данные в челом согласуются с представления!,® о тем, что проявление периферических активностей нейрот-ензина связано с Фрагментом 8-13. Проявление центральных эффектов пептиден обусловлено пдакп с-.-рукт/рио-фушаасасл;.-ными взаимоотношениями, о чем свидетельствуют совпадения сост-встсгвувзсй активности нейротензина с р7 или iirjm1. слсзиой к> луляния пептидом лойм-шнергаческой слстали, воспроиз^огг-гл

на препаратах мозговых мембран, так и на срезах гиппокампа , активация им фосфоинозитольного обмена и сходство поведенческих реакций при центральном введении нейротензина и иер-11 дают основания считать, что выделенный нами ундекапептид является представителем группы нейротензин-подобных пептидов. На основании представленных результатов можно сделать вывод, что ЖР-11, не проявляя наиболее характерных периферических эффектов нейротензина, достаточно полно воспроизводит все основные виды его центральной активности. Это может быть связано со значительно более узкой локализацией щр-11 - с его нейроспецифичностью.

2. Исследование биологической актиЗноат пептида Р5.

Влияние Р5 на двигательную активность крыс изучалось при •внутрибрюшинном введении пептида. Было обнаружено, что в дозе 50 рг/кг инъецирование Р5 сопровождается увеличением двигательной активности крыс по сравнению с контрольными животными при тестировании через 24 часа после инъекции.

Пептид Р5 при внутрибрюшинном введении в дозе 10 рг/кг оказывает стимулирующее влияние на агрессивное поведение во всех испытанных моделях этой формы поведения крыс. Эффект пептида более всего выражен при групповом ссаживании крыс-изолянтов в открытом поле через 24 часа после введения. В дозах 0.5-5 рг/кг Р5 в условиях внутрибрюшинного введения стимулирует зоосоциаль-ную активность и межсамцовую агрессивность крыс.

Результаты экспериментов в камере Вогеля показывают наличие анксиолитического действия Р5 в дозе 50 рг/кг через 24 часа после внутрибрюшинного введения пептидов животным.

Пептид в дозе 10 рг/кг умеренно увеличивал потребление корма через 2 часа после введения, но в те асе сроки угнетал потребление воды у крыс при внутрибрюшинном введении. При тестировании через 3 часа после инъекции Р5 обнаружено полное угнетение приема воды и значительное торможение приема корма.

На основании полученных результатов можно сделать обший вывод о широком спектре биологической активности пептида Р5. Анализ отдельных проявлений поведенческой активности животных позволил предположить, что реализация наблюдаемых эффектов связана с воздействием пептида на серотонинергическую систему. Это

предположение подтверждается результатами исследования активности пептида в тесте "head twitch", индуцированным введением аго-ниста Бг-серотониновых рецепторов - 2,5-диметокси-4-метилфенил-изопропиламина. Было показано, что F5 при внутрибршинном введении в дозах 25-100 рг/кг на 30-50 % уменьшает исходный эффект тест-вешества.

При аппликации (0.1-1 рМ) пептид избирательно подавлял реакции нейронов оборонительного поведения на тактильные раздражения и на аппликацию серотонина, тогда как электрические свойства мембраны (возбудимость, входное сопротивление и уровень мембранного потенциала) не изменял. Действие F5. по-видимому, не опосредуется его взаимодействием с дофамином, т.к. пептид не изменял эффектов медиатора при их совместном подведении к нейрону. Полученные данные свидетельствуют, что F5, по-видимому, избирательно вовлечен в регуляцию активности нейронов функциональной системы оборонительного поведения, не оказывая действия на нейроны- пищевого поведения. Одним из конкретных локусов действия Р5 могут сыть серотонинергическце сннапгическпе входы нейронов.

Для пептида F5 в концентрации 10 рМ была показана способность ингибировать связывание радиоактивного лиганда серотонино-вых рецепторов - 3Н-кетансерпна (концентрация 0.5 нМ; Ю-0 3.02 рШ и радиоактивного лиганда 32-адренорепепторов - 3Н-клонилина (концентрация 4 нН; IC-Q 2.65 pli) с препаратами суммарных мембран мозга крысы.

Комплекс проведения исследований позволяет утверждать, что пептид F5 обладает всеми свойствами нейропептида, причем он не может быть отнесен ни к одной из известных на сегодняшний день групп. Ложно предположить, что реализация основных наблюдаемых эффектов связана с антагонистической активностью пептида в отношении серотонинергаческоп системы.

3. Биологическая атибностъ пешмЗов РбТуг, P6S«r, PoGly u Р4.

Исследования поведенческой активности пептидов РбТуг. рьг^г, PoGly и Р4 показали, что эти пептиды при внутрнбрюшннном введении обладают седативным и антиагрессивным действием, причем антиагрессивные эффективные дозы при внутрнбрюшннном введении примерно в 5 раз ниже пшодннамических доз (10-50 цг/кг и 200-100

рг/кг соответственно). Эффект регистрировался через I час после инъекции на протяжении 2-3 часов. При внутрижелудочковых инъекциях пептидов антиагрессогенные дозы составляли 2-3 цг/кг. При использовании внутримозгового пути введения Р6, по сравнению с внутрибрюшинным, значительно увеличивается продолжительность антиагрессивного действия вещества (до 3 суток, то есть в 60 раз).

Результаты испытаний показали, что Р6 снижает у животных уровень трех основных форм агрессивности: ыежсаыцовой (внутривидовой), хищнической (межвидовой) и защитно-оборонительной.

Инъекции пептидов на фоне введения налоксона не оказывают существенного влияния на агрессивное поведение животных. Это свидетельствует о том, что агрессотропный эффект не опосредуется опиатныма рецепторами.

При изучении действия пептидов РбТуг, P6Ser и p6Gly на нейроны Helix aspersa была показана способность пептида в концентрациях 0.1-1 цМ вызывать гиперполяризацию мембран продолжительностью до 120 минут. При этом активность пептида проявлялась на нейронах оборонительного поведения, но не на нейронах пищевого поведения. Таким образом, можно сказать, что пептид Р6 обладает специфической агрессотропной активностью.

Для пептидов РбТуг, РбБег и P6Gly была показана способность модулировать связывание 3Н-глутамата с препаратами мембран коры мозга крупного рогатого скота.Этот процесс включает нн-гибирование связывания радиоактивного глутамата (10 рАП при концентрации пептида 10-100 нМ, потеншшрование связывания лиганда при концентрации пептида I (U1.

Исследованные проявления активности пептида позволяют утверждать об открытии нового, не имеющего аналогов, нейропептида. Необходимо отметить, что во всех проведенных экспериментах, синтетические аналоги пептида Р6, то есть РбТуг, РбБег и P6Gly, проявляли одинаковую активность в различных тестах, причем эффективные дозы были весьма близки. Сходную активность проявлял и синтетический фрагмент Р4, однако, в этом случае эффективные дозы были выше на два порядка. Таким образом, можно считать, что и-концевой аминокислотный остаток пентапептида не является определяющим для проявления его активности.

ВЫЕОДЫ

1. Проведено выделение и установлены аминокислотные последовательности трех новых нейропептидов из мозга крупного рогатого скота.

2. Осуществлен синтез выделенных пептидов и некоторых их аналогов и конъюгатов пептидов с гемоиианинон, получены эффинно-очишенные антитела на выделенные пептиды!

3. Проведен пммуноскрининг в гбиогенате мозга крупного рогатого скота и иммуногистохимическая локализация на срезах мозга крысы; показано наличие в пептидной фракции мозгового материала крупного рогатого скота иммунореактивных веществ; установлен фрагмент последовательности одного из этих'веществ.

4. Организовано широкое исследование биологической активности выделенных нейропептидов, по результатам которого установлено, что выделенные пептиды проявляют все свойства, характерные для регуллторных пептидов. Ундекапептид (1ЖР-11) может быть отнесен к группе нейротензина; два других пептида (Р5 и Р6) не имеют аналогий среди известных нейропептидов. Выдвинуты предположения о возможных механизмах действия исследованных пептидов.

Основные результаты работы изложены в публикациях:

1. Шерстнев Б.В.. Рылов А.Л., Долгов О.Н., Карелин A.A., Михалева И.П., Цетлин В.И., Иванов В.Т.. Мальцев К.В.. Беляев С.В., Судаков К.В. Способ получения агрессивного состояния крыс. Авторское свидетельство СССР ,1989 U 4626972/30-14/180227

2. Рылов А.Л., Пак Е.С., Карелин A.A., Ульяшин В.В.. Беляев С.В., Козловская М.М., Шерстнев В.В. Использование новой модели устойчивого состояния агрессивности животных для тестирования нейротропных средств депрныируюшего действия. Журнал высшей нервной деятельности, 1990, т.40, вып.4, стр.783-785

3. Ivanov V.T., Karelin A.A., Dolgov O.N., Xarelina E.V., Ul *ya-shin V.V.Tsetlin, 7.1., Sudakov K.V., Sherstnev V.T., Severin S.E. jr., Mikeladze D.G., Klusha V.E.. NRP-11.A novel neuroten-sin-resembling peptide from bovine brain. Peptides. Chemistry, Structure and Biology,(in Rivier E. and Marshall G. Eds.). Es-oom. Leiden, 1990. pr>.462-463.

x. E.V., Karelin A.A., Severin S.E.jr., Popov V.A. 'Jl'ya-

shiri V.V.. Novel neuropeptide from bovine brain. 7th International Conference of Young Scientists on Organic and Biological Chemistry, Varna, 1990, pp. 94-96

5. V.T.Ivanov, A.A. Karelin, E.V.Xarelina, V.V. 'Jl'yashin, V.l. Tsetlin. T.N.Alyonycheva, E.V.Gi'ishin, A.P.Alexandrov, T.U.Vol-kova, ll.V.Pletnikov, O.N.Dolgov, N.v.Nikitin, N.N.Galeva, V.v. Sherstnev, V.i.spiglazov, M.A.Dimtriadi. Two novel neuropeptides from bovine brain. Peptides. Chemistry and Biology. (Smith J.A. and Rivier J.I. Eds). Proceedings of the Twelfth American Peptide Symposium. June 16-21, 1991, Cambridge, Massachusetts, 'JSA, Escom, leiden, 1932,- p. 157-158

'£. К.В.Пышляковз, М.П.Раткевич, Г.М.Стразда. В.E.Клуша, E.B.Карелина, А.А.Карелин. Исследование кпниноподобных свойств нового пептпда, выделенного из мозга крупного рогатого скота. Еюллю-тень экспериментальной биологии и медицины. 1992. т.4, с. 38В

7. Иванов В.Т., Карелин A.A., Михалева И.П., Васьковскпп Б.В., Свирлев В:11.. Назимов И.Б. Выделение, структура и свойства новых эндогенных пептидов. Биоорганическая химия, 1992, т.18.