Разработка промышленного способа выделения ганглиозидов и их использование для очистки столбнячного токсина тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

V Ч 'п о'"'}

ЯОСКОВСКИИ ОРДЕНА ТРУЛОВОГО. КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ТОНКОЙ ХИМИЧЕСКОЕ ТЕХНОЛОГИИ им. М.В.ЛОМОНОСОВА

Специализированный совет Д 063.41.01 УДК 577.25:612.06 На правах рукописи

МЕЗИН Игорь Александрович

РАЗРАБОТКА ПРОМЫШЛЕННОГО СПОСОБА ВЫДЕЛЕНИЯ ГАНГЛИ03ИД0В И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ ОЧИСТКИ СТОЛБНЯЧНОГО ТОКСИНА

02.00.10 - Биоорганическая химия, хииия природных и ■ физиологически активных вепеств

Автореферат диссертации на соискание ученоя степени кандидата химических наук

МОСКВА- 1992

Работа выполнена на Харьковском предприятии "Биолек" и кафедре биотехнологии Московского института тонкой химической технологии

I

им. М. В. Ломоносова.

Научные руководители: д.фарн.н. Ю.М. Краснопольския д.х.н.. профессор E.H. Звонкова

Официальные оппоненты: д.х.н. Б.А. Кляшиикия;

к.х.н. В.П. Варламов

Ведущая организация: Институт биоорганическоя химии им. Шемякина. РАН.

У ■

Зашита диссертации состоится "J?" Н.О&З}-) У\ 1992 г.

_ на заседании Специализированного совета д 063.41.01 при Московском институте тонкой химической технологии им. М.В.Ломоносова (117571 г.Москва, пр. Вернадского д.вб).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке КИТХТ им. И.В.Ломоносова (119831 г.Москва, ул. М. Пироговская, д.П

Автореферат разослан

г.

Учения секретарь специализированного совета Кандидат химических наук л /> А.И.Лютик

' t,

i'OC !t*

iiiibJ'^O ГЕКА

!.. Исследование процессов клеточной диф-ферениировки, рецепции клетками биологически активных молекул и макроструктур показалочто важную роль в этих процессах играют ганглиозиды-кислые гликосфинголипиды, входящие в состав мембран различных тканея (рис .1 )• Фиэико-химическио свойства ГГ* обусловлены наличием гидрофобной части и гидрофильных углеводных остатков. имеющих отрицательный заряд.

СМ1: Gal(ß,l-*3 >Ga 1 МАс• /3,1 -И )Gal(/J,l-*1)Glc( )Сег

(3-»2.ct)NANA

Gni : Gal(ß,l-»3 )GalNAc(ß,l-»4 JGallß, l-»4)Glct 1-»1 )Cer

via ( ,

(3-£,ci)NANA (3-2,<x)NANA

GD,b: Cal<p,l-3 IGalNAcip,I-*4 )Gal(ß,l-4 )Glc( l-M )Cer

t3-*2,a)NANA(a,e-2)NANA GTlb: Gal(ß, l-*3 IGalNAcI ß. 1-Ч )Cal( ß, l-*4 IGlcl 1-*1 )Cer t3-*2,a »NANA . (3-*2 ,a)NANA(a,6-2 INANA

Рис.1 Ганглиозияы мозга крупного рогатого скота.

ГГ кироко применяются в молекулярной биологии при исследовании Функционирования клеточных и искусственных мембран. Кроме того, в настоящее время ведутся интенсивные исследования по созданию лекарственных композиция с ГГ, предназначенных для лечения травматических повреждений нервной ткани, диабета, различных интоксикация . Установлено, что ГГ обладают рецепторными свойствами по от— ,

'здесь и далее: ГГ-ганглиозиды; КРС-крупныИ рогатый скот; АХ -1финная хроматография; NANA- N-ацетилнейраминовая кислота; ВЭЖХ-ысокоэффективная лмдкостная хроматография; ГФ - гель-фильтрация СХ - тонкослойная хроматография; ОФС -обрашенно-фаэовые сорбен-ы; CT - столбнячный, токсин.

ношение к вируса« (бешенства, гриппа», а также х ряду гормонов (тиротропин, серотонин) и белков: фибронектину, холерному и столбнячному токсинам, токсину типа Е, продуцируемому бактериями С1оБгг1(11и» ЪогиНпиш.

Дальнейшие исследования роли ГГ в процессах клеточной жизнедеятельности, создание лекарственных средств на основе ГГ в определенной степени сдерживается отсутствием производства в нашея стране биопрепаратов, представляющих собой высокоочишенные суммарные и индивидуальные ГГ.

'£'связи с вышеизложенным, исследования, направленные на разработку промышленной технологии получения стандартного препарата высокоочипзннцх суммарных ГГ, являются актуальной задачей.

Учитывая интерес к вопросам создания новых лекарственных средств, мы изучили возможность использования аффинности ГГ к СТ

в процессе очистки.

!

Цель работы. Диссертационная работа посвящена разработке промышленного метода выделения высокоочишенного препарата суммарных ГГ из мозга КРС и создание иа их основе аффинного сорбента для очистки столбнячного токсина.

Научная новизна работы. Изучена экстракция ГГ смесями органических растворителей при различных температурных и объемных параметрах. В ходе разработки методов препаративной анионообменпой и обрашенно-фазовой хроматография, позволявших получать препарат ' высокоочищенных суммарных ГГ, исследована динамическая емкость ряда анионообменных сорбентов (аминосилохром, АСД-6-вп. ЗегУйсеХ-СЕАЕ, ЗерЬагове-ОАБ, Диасорб-ТА/500, АпЬег1узг А-27) и ОФС: сили-кагели ИР-2, ЙР-б, ЮМв; Ос1у1-ЗерЬагове С1-4В; Диасорбы С-в и С-16 по отношению к ГГ. Изучены процессы десорбции примесей, и ГГ' с анионообменных сорбентов и ОФС. Впервые показана возможность использования водных элюентов при проведении ионообменной хрома-

тографии ГГ.

С целью разработки метода очистки СТ с помощью АХ предложен способ получения аффинного сорбента с помощью сорбции ГГ на ОФС. Исследованы условия проведения АХ СТ на предложенных сорбентах. Определен оптимальный тип матрицы сорбента и тип адсорбированного ганглиозида.

Практическая ценность. Разработан промышленный способ получения высокоочииенных ГГ из мозга КРС. полученный препарат стандартен по составу и стабилен при хранении. Предложенная технология является малоотходной, позволяет проводить комплексную переработку сырья для последующего выделения ряда других глико- и фосфолипидов. Данный способ получения ГГ внедрен на Харьковском предприятии "Биолек", составлен технологический регламент производства и ТУ.

Изучены медико-биологические свойства полученного препарата ганглиозидов с целью его использования в лекарственных средствах.

Предложен способ аффинной очистки СТ на ОФС с адсорбированным ганглиозидом СТ1Ь. Начато производство счищенного СТ, используемого в качес.тве стандарта при производстве противостолбнячных препаратов.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

- Промышленный метод выделения высокоочииенных суммарных и индивидуальных ганглиозидов из мозга крупного рогатого скота.

- Метод получения.аффинного сорбента для очистки столбнячного токсина.

- Метод очистки столбнячного токсина с помощью аффинной хроматографии. . "

Апробация работы. Результаты работы доложены на Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы иммунологии инфекционных болезней" (г. Харьков. 1987) ' ^

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 2 статьи, те-

эиси 1 доклада, получено 1 авторское свидетельство.

Объем и структура работы, Диссертация состоит из введения; обзора литературы по методам выделения ГГ. разделении ГГ на индивидуальные типы хроматографическиыи методами, аффинному вэаииодействию СТ с ГГ; обсуждения результатов; экспериментальной части; выводов; списка литературы; прилокониа. Работа изложена на страницах машинописного текста, включая 2 схемы. таблиц, рисунков. Список литературы состоит из ссылок.

ОСНОВНЫ2 РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Бидсленио к очистка ганглкозигоз из иоэга крупного рогатого скота. £ качестве сырья для получения ГГ был выбран мозг КРС как источник, содержащий максимальное количество гакглиозидос.. Он доступен в больших количествах и, как нами было установлено, может аяягельно храниться (до трех месяцев) при температурах -20-»- -40°С ©ез достоверно значимого снижения содержания ганглиозидов,* что важно в реальных условиях производства. Препарат суммарных ГГ был получен экстрактивными методами и очисзн с помоеъо препаративной

■ «I

ионнообменноя и обрацонно-фазовоя хроматографией.

На первом этапе была изучена возможность удаления нейтральных

I • .

липидов. пигментных весзств, соды и ряда других примесей с помощью обработки иозговой ткани ацетоном. Мотодои ТСХ был проанализирован липидныя состав полученных ацетоновых экстрактов. Уста-' новлено, что ГГ практически но экстрагируется при температурах от -20°С до +20 -25°С и длительности экстракции 20 - 30 мин. Потери фосфолипидов, по данным анализа на фосфор, не превышали 5 - 10%. Повторная обработка ацетоном нецелесообразна, так как позволяет дополнительно^удалить только 10-155 балласта по отношонио"

*3десь и далее содержание ГГ определяли резорциновым методом

к первой экстракции. Это количество примесей но затрудняло дальнейшее выделение и очистку ГГ..

Для экстракции ГГ использовали ряд известных смесей органических растворителей. Полученные данные по результатам" экстракции приведены в табл. 1. Для создания эффективной схемы проведения экстракции, обеспечивавшей максимальный выход ГГ без необходимости использования взрывоопасных растворителей (N2) или ультразвуковой обработки (N6), было решено изучить комбинированную экст-эакцио последовательно системами N 4,5 и 6 (си. Табл.1). На рис.2 показана зависимость изменения концентрации NANA от времени ретракции. Необходимо отметить, что изменение Пор'йдка применения кстрагентов приводило к снижение выхода ГГ на 20-25* и образовано вязких, труднофильтруеыых смесей. В результате проведенных сследований быЛ определены племенные параметры и обьемные со-

NANA кг/мл

33

22

Где: 1-смесь СНС13/МеОН»2/1

2-смесь CHClj/MeOH-1/2

3- 1-Рг0Н/С6Нн/Н20 . 55/20/25

Время, ч.

с.2 Изменение содержания NAHA в экстракте в зависимости от ительности экстракции.

ношения, обеспечивавшие максимальный выход ГГ при экстракции абл'2). При сравнении данных таблиц 1 и 2 видно, что предлага-способ экстракции ГГ по своей эффективности не уступает избным методам.

На следусщем этапе необходимо было провести фракционирование

суммарного липидного экстракта на глико- и фосфолипиды, так как его хроматографическое разделение затруднено. В известных методах фракционирование липидов проводят в двухфазных системах, прямое перенесение которых в промышленное производство невозможно иэ-за ряда причин. Поэтому били проведены исследования по оптимизации фракционирования суммарного липидного экстрахта и уста-

Табл.1

Количество экстрагируемой NANA различными смесями.

N | Состав, |Темп.экс- | Время (Колич экстрагируемой |

1 (V/V); |трак.°С (экст.,ч (NANA. иг/кг мозга. |

1 | ацетон -20+25 0.5 0 1

2 1' ТГФ:Фосфатный -25 1-3 190-210 |

6yo>eD 6/2 t

3| CHCLjiMeOHiHgO +25 1-3 ¥ 150-170 |

5/5/1

CHCLjiMeOH 2/1 ♦25 0.5-3 90-100 |

СНСЦ:Ме0Н 1/2 50-60

6| 1-Рг0Н:С6Н14:Н20 +25 1-3 100-200* . |

55/20/25 130-150 !

новлены объемные соотношения, обеспечивающие эффективное расслаивание в течении 4-6 часов при высокой степени извлечений ГГ. Полнота извлечения ГГ подтверждалась методом ТСХ и отсутствием NANA в нижней фазе после окончания процесса фракционирования.

Экстракцию проводили при ультразвуковой обработке

Методой ТСХ с использованием в качество стандартов индивидуальных

. Табл.2

Выход NANA на стадиях комбинированной экстракции.

Н экстра- 1 4 5 6

гента

Состав.ч/ч ацетон CHCLj/MGOH СНСЦ/МзОН 1-Ргон/свн14/н2о

1/2 55/20/25

Время экстр. 20 40 40 60

мин

Обьеи экстра- 4 2.7 1.3 2.3

гекта.л/кг ноэга

Извлечение * 0 100-115 43-35 33-45

ММ.КГ/КГ МЭГ.Й_______

ганглиозидоз било показано, что э обьединеннол водно-ыетанольноп фазе в основном присутстзуот ганглиозиды GM1, GDja, GDib' GTib'

Препаратиркаа хроматография гапглнозкдов Выделение суммарных ГГ.из получаемого водно-органического раствора и их дальнелсая очистка проводилась хроматографическими методами. Для разработки препаративных хроцатографических методов, пригодных при пропыленной производстве, была исследована возможность сорбиии ГГ из вояно-нзтанольнол фазы на анионообыенных сорбентах. Для этого определяли динаммческуо емкость различных сор-, бенгор относительно ГГ по наличию NANA в элюате водно-мстаноль-нол фазы после сорбции на ионообменной колонке. На основании полученных данных о динамичэскол емкости сорбентов (в ацетатноп

форме) по отношению к ГГ видно, что наибольшей емкостью обладают полисахаридные сорбенты (Табл.3). При использовании этих сорбентов было найдено, что их низкие гидромеханические свойства не

I

позволяют создавать высокие скорости элюирования, что приводит к

увеличению времени хроматографирования. Кроме того, происходит

изменение объема геля при смене состава элоентов, приводящее к

разрушению сорбентов. В результате они выдерживают не более 3-5 циклов. Поэтому для дальнейшей работы бали выбраны сорбенты Диасорб ТА и Амберлист А-27 (Табл. 3».

В последующих экспериментах были исследованы различные варианты проведения десорбции примесей и ГГ. Для этой цели на стадии

Табл.3

Характеристики исследованных аннионообменных сорбентов.

Матрица Анионообм. Емкость сорбента

сорбента сорбента группа. по С1~ мэкв.мл по НАИА мкг/мл.

АСЛ-б-вп полимео В-ННИНН. 1000 160

Аминосило- силохррм Н-ЫН2 130 360

хоом

Сервацил декстран Н-ЖЕ1)2 2000 2000

РЕАЕ

Сефадекс декстран Тетраалкил- 3000 2300

ОАЕ' аммониевые

Диасорб силахроы к-н""< Ег )2м® 220 350- 650

ТА/300 силикагель 120 500-600 • : ,

Амберлист полимер ,Тетраалкил- 500 730-650

А-27 аммониевые

злюирования приыесея использовались: метанол, хлороформ, их смеси и водные растворы солея с различной ионноя силоя. Процесс десорбции контролировали путем измерения оптической плотности при N-213 нм. При изучении десорбции примесей органическими растворителями и водно-солевыми растворами, было обнаружено, что наиболее эффективны а случае сорбента Лиасорб ТА смеси метанол:вода 1:1 и раствор 0,1-0,2 М NaCl в воде (Табл.4). При увеличении концентрации NaCl до 0,4-0,3 М обнаруживается частичная десорбция ГГ, в первуо очередь СМ1. ГГ можно десорбировать практически полностьо, используя растворы солея в метаноле, в водной метаноле или в воле (Табл.3). На рис.3 приведена хроматограмма препаративного анион-нообиенного разделения ГГ. При использовании колонок с сорбентом

Табл.4

Десорбция примесей с сорбента Лиасорб ТА различными элиеятзии.

Состав CHCL j: НеОН МеОН 0.03 И НаС1._ 0,1-0,2 М NaCl_-aq

Десорбируемые. Липиды Липиды Пептиды и Пептиды и

поимесн N IS. И BD. пигменты пигменты

к" 7-9 • 3-7 10-14 З-б •

Амберлист А-27 получены аналогичные результаты хроматографии.

Учитывая амфифи'льность ГГ, лалгьнеяиее обессоливаяиэ гг дополнительную очистку получаемого эляата сы проводили при помоют обраг иенно-фазовоя хроматографии. Лля этого была исследована сорбготя ГГ на различных ОФС: октил-сефарозе СИ-4В,. силикате-лях ДР-9

ЙР-16, Лиасорбах С-б и С-16 (Табл.6). Дттаютческую емкость сорбентов определяли, анализируя наличие ГГ в элюате после сорбции

"К. - Отношение обьема элвента к обьему сорбента.

: ' . Табл.5 .

Характеристика элоентоо для десорбции ганглиозидов.

Состав элвента. 0.05М №{4НС03 в 05« МеОН. 0.2М НаСЬ в МоОН 1М N¿10. в воде 2М ИаС1 с вода

К' 6-6 4-6 5-7 4-6

Выход, % 05 9в 36 96 ~

и

Табл.6

Еикость ОФС по отношению к ГГ (величина пористости использованных сорбентов била сопоставима).

1_:_;_

Сорбент Диасорб С- ИсЫобогЪ 0с1у1-ЗерЪагозе

_-16/200 ■ -16/400 .-а/200 , ЙР-6_Д-4В

Содеря.алкилън. 350 160 350 450 „ 15-20

ГРУПП-1ЛШ/ЦД1-' '..:■ ■....

Еикость по 25-27. 20-22 12-14 12-14 ГГ мг/ил

3.1-3,5 (2.4- 2,9 • по Спь )

:а колонке с ОСС. Для дальнелсзл работы был выбран сорбент Диа-орб С-16 с еикость«? по отношение к ГГ 20-22 иг/ил. В последус-их экспериментах была изучена возмогиостъ разделения адсорбиро-

, ВррКЯ;,

I1 2' !3 4>

:. 4 Хроматография ГГ на колонке с, серией,три* Д!1,9.с,С~ 1 ^

чанноя смеси при градиенте коцентрации метанола (Рис 41. Установлено что примеси элюируются смесью метанол: вода при соотношении 4:6 - 6:4. ГГ элюируются чистым метанолом. Проведение хроматографии при других формах градиента не улучшало разделения.

Полученный с оСрашенно-фаэовой колонки ыетанольный раствор ГГ упаривали, растворяли в воде и проводили лиофильное высушивание. Контроль качественного состава препарата ГГ проводили с помощью ТСХ. После проведения ряда экспериментов были определены следующие параметры проведения лмофильного высушивания: начальная температура препарат»: -70°С: остаточное давление: 2 мм. рт.ст.. конечная .температура препарата +20°С; время сушки 72 ч. При увеличении начальной темвер&турм происходило вскипание препарата в процессе лиофилизаиим^ а. уменьшение длительности лмофилиэаиии приводило к неполному высушиванию препарата. При увеличении ко-

Табл.7

Фракционный состав разлймшк препаратов ГГ по данным ВЭЖХ

Образец Содержание ГГ, X' .

СТ1Ь со фугие

31ета

ьуре 2 е-10 34-37 13-16 20-35 2-Э

Зоп1по" 13.5 Зв 9-.4 16 15-20

Харьков 7-9' 38-46 10-12 15-20 15-20

'Литературные данные

hew о я температуры препарата свыез 23 С начиналась деструкция ГГ. Указание параметры проведения лиофильного высушивания позволяет получать ГГ в виде лиофильно высушенного порошка, фракционный состав которого, по данным ВЭХХ, не отличается от состава препарата в растворе (Табл. 7J.

Таким образом, по разработанному способу выход ГГ составляет 0.6-0.9 г/кг мозга КРС., содержание NANA не менее 26-29*, примеси фосфолипидов не обнаруживаются. Остаточная влажность не более 3,3*. Содержание пептидных примесей не Солее О.ЗХ.

На схеме 1 приведена технологическая схема выделения ГГ из мозга КРС.

Схема 1.

Технологическая схема выделения ГГ из мозга КРС.

Водио-яц*тон. не тракт_

«- ||"оиог>иаа»дц» , »цл> шро»*ни«"| |Ац»то»Ч

|Ос»до«"]

|Ос»до|Г^" * 1 fjucmptiuu» , 4.u/i»r.po»»Huf j-y

Кл»рфорн/н»т*мол

t/l и 1/2

ТЗкстрчтм minUto»-] ' | 33^10^29

|Хлорофорииа» фаз*"}- 4—фч (--1 МЮН/Н^О" ¿7~1~\

X

[врдн

jrtpuMTCul-

о-игттнольн&м

I

I

-L-

Г А.Н 100 Т

14

CopCuua г&нглио зидо» на аниог100См?них»

^ 0 . 1 И ЫосГ] NdCL \

[Принес и

сет-

ТГнягдцоэиды » 1М НоСЬ

1 Сорбция ГГ на обр*«»н»о-фьзовок сорО#нше —«-|Ыг0Н/Н„0- 1/1 |

—--1 М»ОН I

|Раст.ор ГГ . Ц»0Н]

Ул>ри>ми>, раст»ор»ии» * И^О Лиофильиы> сума

л

2, Получение индивидуальных ганглиозидов и создание на их основе

аедишжх сорбентов для очистки столбнячного токсина, н

При производстве вакцино-сывороточных препаратов на основе сточбнячного токсина необходимо использовать высокоочивзнып СТ в качестве тест-стандарта. Известные методы его получения дают нестандартный препарат с ничкоя степенью чистоты. ••

Лругои подход для очистки СТ основан на применении АХ. Раннее была описана АХ столбнячного токсина в аналитических целях на сорбентах с ковалентно иммобилизов'аными ГГ.

Учитывая аыфифильность ГГ, было решено создать аффинный сорбент с помокъю их адсорбции на ОФС. Получение такого аффинного сорбента значительно менее трудоемко. Для достижения постазленноп цели ресались следующие задачи:

-выбор хроматографического метода для выделения бысокоочиизнных индивидуальных ганглиозидов из суинарных ГГ: - изучение адсорбции ГГ на ОФС с целью создания аффинного сорбента;

- изучение условия проведения аффинной хроматографии СТ на полученных сорбентах, выбор оптимального типа матрицы сорбента и состава адсорбированных ГГ.

Выделение индивидуальных ганглиоэидов и изучение их адсорбции на обракенно-фаэових сорбентах.

После воспроизведения ряда способов получения индивидуальных ГГ было установлено, что метод Хирабаяши (Н1гаЬаузЬ1) и сотр. позволяет получа.ть требуемые количества индивидуальных ганглиоэидов с высокой степенью'чистоты при большой длительности хроматографии-20 - 24 часа. С цель» сокращения времени хроматографии была изучена возможность интенсификации процесса хроматографического разделения. Для этого исследовали хроматографию ГГ при возрастании удельной нагрузки и скорости злюирования. Было установлено, что при увеличении нагрузки ГГ на сорбент О-Сефароза в 1,5 раза

о

и повышении скорости элюирбвания с 24 до 36 млЛсм'ч) выход индивидуальных ГГ составлял 80 - 63« для Сща и СС1Ь и более 90* для Сщ и Дальнейшая интенсификация хроматографии приводила к

существенному снижению эффективности разделительной системы.

По результатам анализов индивидуальных ГГ методом ВЭЖХ и резорциновым методой степень частоты полученных ГГ была более.931.

Далее была исследована сорбция ГГ на ОФС. Было установлено, что для данного типа сорбентов емкость.по отношению к ГГ была практически постоянной и не зависела от концентрации ГГ в пределах от 0.1 до 10 мг/мл. ГГ не десорбировались с носителя в детектируемых количествах в условиях проведения АХ. Как видно из данных табл.7, наибольшей емкостью обладают силикагели, модифицированные алкильными группами.

3. Аффинная хроматография столбнячного токсина на ганглиозид-содержашях сорбентах.

В работе использоалея препарат СТ, выпускаемый на Харьковском

предприятии "Би'олек". При анализе препарата методом высокоэффективной ГФ было обнаружено, что в нем содержится значительное количество компонентов со значением коэффициента удерживания Кау>2. Для уменьшения времени анализа после выхода пика СТ было исполь,-зовано элоирование при градиенте расхода от 2 до 3 мл/мин. По данным ВЭЖХ (Рис.3) в исходном препарате содержание СТ не превышало 0,1-0.13*. Пик СТ на хроматограмме был определен по наличие специфической активности и по совпадению найденной молекулярной массы (147 кЛа) с литературными данными.

«I -

и -

• А

Время, мин.

к . - ** ».

и «• ;

)« . ;» . . и -

ТГ"

I>it.it .' ■ '' ■ ■»!.,,

Время, мин.

Рис.5 Высокоэффективная ГФ препарата СТ (А). Пик СТ при

увеличении масштаба (В).

.1

В

При исследовании связывания СТ с аффинными сорбентами на основа силикагельных матриц и ГГ было обнаружено, что СТ не элюирует-ся с колонки описанными системами, включая денатурируоиие растворы: 2М ИаС1 в 0,1- 0,5 * №0Н, в М мочевина. Необратимая сорбция наблюдалась при использовании как суммарных, так и индивидуальных ГГ. Попытки блокирования центров нзспецифическол сорбции преинку-бациел аффинного сорбента с 5« растворои БСА не уменьшили степень неспецифического взаимодействия. Сорбированный белок удалось эло-ировать только метанолом, однако при этом происходила таклэ десорбция ГГ. Вероятно, неспецифическая сорбция обусловлена взаимодействием между гидрофобным фрагментом СТ и сорбентами, полученными на основе гидрофобизированных силикагелей, которые обладает высокой плотностью алкильиых цепей на поверхности сорбента. Поэтому в дальнейшей работе использовалась октил-сефароза. На рис.6 показано изменение содержания токсина (в I от исходного) в элсате

Несорб. СТ в злюате, S

es

еа 77" ее-55

.33 2211

Используемый сорбент:

1- октил-сефароза без лиганда

2- ганглиозид на октял-' сефарозе

3- суммарные'IT мозга KFC на октил-сефарозо

А- ганглиозид С-1;> на октил-сс^арозо

С.00 1.60 3.20 4.00 6.40 0.00

Обьем злюата/Обьем сорбента Рис.б Изменение содер.-лния СТ (в % от исходного) з элоате после аффинных колонок. •

препарата СТ после нанесения на колонку с октил-сефарозой. содержащей различные ГГ.

Как видно, наиболее эффективным лигандом при создании аффинного сорбента оказался ганглиоэид GTil). Так как количество адсорбированных ГГ в этих опытах было практически одинаковым И,5 - 2 мкМ/мл геля I, то различие в эффективной емкости сорбентов скорее всего обусловлено более высокой константой связывания токсина с ганглиозидом G-¡.jb с по сравнение с моно- и дисиалоганглиоэидами. Согласно литературным данным, связывание СТ с ГГ зависит также от рН и ионной силу, и оптимальное значение рН составляет 9,0-5,6 при минимальной концентрации соли. В исходном препарате СТ величина рН была 7,0-7,2, концентрация NaCL составляла 0,15 М. Для получения оптимальных значений рН и иснноя силы, а также для предварительной концентрации токсина перед проведением аффинной хроматографии мы провели ультрафильтрацию препарата СТ с последующим диализом. В результате был получен раствор, содержащий около 0,а* токсина no отношению к содержанию других компонентов. При аффинной хроматографии концентрированного СТ. (Рис.7) было обнаруженно, что емкость сорбента по токсину увеличилась более чем в 20 раз. СТ был элюирован калия- фосфатным буфером, элюат

Рис.7 Аффинная хроматография концентрированного пргпарата СТ.

,{Ю 20 t 30 L 40 .60

У -2 3

- ацетатный буфер рН 5,61 3 - Десорбция СТ (1М К-фосфатныя

1 - Концентрированный препарат С'Г

2 - Десорбция примесей ( 0,25ыМ Na

буфер рН 9,0)

далее разделили с-помощью высокоэффективной гель-хроматографии при постоянном расходе <Рис.8). В полученных фракциях определяли специфическую активность СТ. Установленно. что основная часть биологической активности соответствует пику с молекулярной массой около 150 кДа (время удерживания 13,77 мин). Полученный результат совпадает с литературными данными о молекулярной массе токсина -|47 кДа. Другие фракции при введении мыпам приводят к неврологическим нарушениям, сходными с симптомами тетании. Вероятно,они

соответствуют продуктам фрагментации СТ. Следует заметить, что

низкомолекулярные фрагменты с такой же активностью присутствуют как в исходном, так и в концентрированом препарате СТ. Содержание СТ после АХ составляет 14-18*, при этом его концентрация увеличилась в 100- 130 раз. Количество белка снизилось с 0,3-10 мг/мл до 40- 46 мкг/мл (в 160 - 220 раз).

Таким образом, в результате работы разработан промышленный способ получения высокоочииениых ГГ из мозга КРС, полученный препарат стандартен по составу и стабилен при хранении. Данный способ получения ГГ внедрен на Харьковском предприятии "Биолек", на него составлен технологический регламент производства и ТУ.

Показана возможность проведения аффинной хроматографии СТ на ОФС с адсорбированными ГГ. На предприятии "Биолек" начато производство очищенного препарата СТ, используемого при контроле противостолбнячных препаратов.

ВЫВОДЫ

1. Изучена экстракция ганглиозидоа из мозга КРС рядом смесей органических растворителей, установлены оптимальные температурные и объемные соотношения. Наследована сорбция ГГ на ряде аннионн.о-обменных (аминосилахром, АСД-6-бп, Servacel-DEAE. Sepharose-QAE. Диасорб-ТА/500, 'Amberlyst А-27) и обрашенно-фазовых (силикагели НР-2, RP-9, RP-10: Octyl- Sepharose С1-4В; Диасорбы С-б и С-16) сорбентах. Установлено, что наиболее эффективно применение сорбентов Диасорб ТА и Диасорб С-16. Впервые показана возможность проведения при ионнообменной хроматографии десорбции примесей и ГГ водными элюентами. На основании полученных данных разработан промышленный способ получения высокоочищенного препарата суммарных ГГ из мозга КРС.

ц

2. Разработан метод получения аффиного сорбента для очистки СТ адсорбцией ГГ на обрашенно-фазовых сорбентах. .

3. Изучено влияние типа матрицы, плотности привитых алкильных

групп сорбента и типа адсорбированного ганглиозида на аффинную хроматографию столбнячного токсина. На основании„полученных данных предложен способ очистки CT методом АХ на октил-сефароэе с адсорбированным ганглиозидом Gjj^. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ:

1. Моэин H.A.. Мэнзелеев Р.Ф., Сенников Г.А., Краснопольский D.M., Езец В.И. // Способ получения ганглиозидов из мозга крупного рогатого скота - A.c. N 1647960 - 1991

2. Мэзин И.А., Мензелеев Р.Ф., Мензелеева Г.К., Пинчук А.Н.,Краснопольский Ю.И., Пзец В.И./ Комплексная препаративная технология выделения липидов из мозговой ткани.// Биол. мембраны. - 1992- Т. 9 - N 3 - с. 301 - 307

3.'Мезин И.А., Мензелеев Р.Ф., Звонкова E.H., А.Н..Краснопольский Ю.М., Швец В.И. / Очистка столбнячного токсина аффинной хроматографией на обращенно-фазовых сорбентах с адсорбироваными гангли-озидами. // Биотехнология - 1992 - Н 4 - с. 22-25

Зак.52Д тдр.ЮО экз.Ротапрант 1ШТХТ пи.Ломоносова