Ганглиозид GM3 из эритроцитов лошади и его роль в клеточной пролиферации тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

| I и V/«

'Ч Л МЛ.М 'ППО С ; г.1П<1 ЮчДО

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ТОНКОЙ ХИМИЧЕСКОЙ ТЕХНОЛОГИИ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

Специализированный совет Д 063.41.01

УДК 577.25:612.86 Не правах рукописи

МЕНДЕЛЕЕВ Рамнль Феридовнч

ГАНГЛИОЗИД Г,М3 ИЗ ЭРИТРОЦИТОВ ЛОШАДИ И ЕГО РОЛЬ В КЛЕТОЧНОЙ ПРОЛИФЕРАЦИИ.

Специальность 02.00.10

Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных вещпств.

Автореферат диссертации на соискание ученой стелено кандидата химических наук.

МОСКВА - 199.1

Работа выполнена на Харьковском предприятии "Биолек" и кафедре биотехнологии Московского института тонкой химической техно\оши им. М.В. Ломоносова. '

Научные руководители, д.х.н., проф. E.H. Звонкова

д.фарм.н. Ю.М. Краснопольский

Оффнциалыше оппоненты: д.х.н. Э.В. Дятловнцкая

к.х.и. H.B. Проказова'

Ведущая организация: Научно-производственный центр медицинской биотехнологии МЗ РФ.

Защита диссертации состоится

в на заседание Специализированного совета Д 063.41.01 при

Московском институте тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова ( 117571 Москва, пр. Вернадского, 68).

С диссертацией можно ознакомится а библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова (119831 Москва, ул. М. Пироговская, 1.)

Автореферат разослан ^QT-^iy_1993 г.

Ученый секретарь Специализированного совета

к.х.н. А.И. Лютик

Актуальность проблемы. Ганглнозиды- гликосфинголипиды клеточной поверхности, содержащие остатки сиаловой кислоты, участвуют как во взаимодействиях типа клетка — клетка, клетка — вирус, клетка — молекула, так и в функционировании плазматической мембраны. Примером роли ганглиоэидов в функционировании цитоплазматической мембраны может служить модулирование ганглиозндом GM3 аутофосфорилирования рецепторов некоторых факторов роста, приводящее к ннгибированию пролиферации клеток. Рядом авторов проводятся исследования, направленные иа изучение действия ганглиоэидов, в частности GM3 и его производных, в составе лекарственных средств с целью модулирования функций цитоилазматической мембраны клеток, причем результаты, опубликованные различными авторами, отличаются противоречивостью. В то же прсмя данные, полученные нами ранее, демонстрируют возможность усиления клеточной пролиферации под действием ганглиозида GM3 из эритроцитов лошади. Это может быть связано с использованием различных типов клеток, концентраций ганглиозида и , что самое главное, с тонкой структурой GM3. Поэтому дальнейшие исследования, направленные иа выяснение роли ганглиоэидов в процессах клеточной пролиферации, являются актуальной задачей.

Цель работы. Диссертационная работа »освящена изучению связи структуры ганглиозида GM3 из эритроцитов лошади и его способности усиливать пролиферацию клеток.

Научная, новизна работы. При изучении влияния ганглиозида GM3, выделенного из эритроцитов лошади, на пролиферацию гепатоцитов In vivo и in vitro, также как и фи'оробллстов, впервые показано, что происходит увеличение пролиферативной активности. Методами хроматомасс — спектрометрии, ГЖХ, масс - спектрометрии с ионизацией* осколками деления ядер калифорния —252, ВЭЖХ, ферментативного гидролиза и др. изучена структура этого соединения. Впервые предложено использовать 9 — антрнлметиловые зфиры ганглиоэидов в качестве флуоресцентных производных для характеристики состава длинноцепочечных оснований и анализа молекулярных видов. Установлено, что в составе олнгосахаридной часта ганглиозида GM3 из эритроцитов лошади присутствует остаток N — гл^колилнгнраминоной кислоты, а в состав церамида входят, в основном, эйкозасфпкгецнн и жирные кислоты 24:1 и 24:0. Синтезированы молекулярные . яиды ганглиозида GM3, содержащие остаток N — ацетил-нейраминовой кислоты - и остатки жирных кислот различной длины, с

помощью которых установлено, что тип остатка нейраминовой кислоты (ЫеиАс или №иСс) не влияет на модулирование г&нглионидом СМз пролиферативиой активности клеток. ' В то же время иоказано, что определяющим в способности СМз усиливать рост' клеток является дм!на цепи жирной кислоты, входящей в состав церамида.

Разработан новый метод препаративной ВЭЖХ ганглиозида СМз с использованием проточного детектирования ври коротких длинах волн для получения вещества с чистотой не менее 99%.

Практическая ценность. Показана принципиальная возможность использования ганглнозида СМз из эритроцитов лошади в составе препаратов, применяемых для усиления пролиферации клеток. Разработан промышленный способ получения'ганглнозида СМз из эритроцитов лошади с высокой степенью чистоты и высоким выходом. Данный способ получения ганглнозида СМз внедрен на Харьковском предприятии "Бцолек", составлен технологический регламент производства и ТУ.

Разработанный метод ВЭЖХ ганглнозида " СМз с применением непрерывного детектирования при коротких длинах волн использован в условиях производства для анализа и выделения ганглнозида СМз, а также может быть адаптирован для ВЭЖХ других гликосфинголипидов.

Основные положения, выносимые на защиту.

Промышленный метод получения ганглнозида СМз 113 эритроцитов лошади. .

Изучение структуры ганглиозида СМ3., выделенного из эритроцитов лошади, и синтез его молекулярных видов.

Изучение связи структуры ганглиозида СМз и его способности влиять на пролиферацию клеток.

Апробация работы. Результаты работы доложены на VI съезде фармакологов Украины (г, Харьков, 1990).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 2 статьи, тезисы 1 доклада, получены 1 авторское свидетельство и 1 положительное решение на выдачу патента на изобретение. ,,

' N ^_'__• •_. ' _'_

Список использованных сокращений: СМд —ЫеиАс, И^ЫеиАс —ЬасСег; СМз-МеиСс, И%еиСс-исСег; СМз-ЫеиИН2, П3ЫеиЫН2-исСег; ёе—Ы —ацил—СМз, иЗыеиР4Н2 — ЬасЗрЬ; ЕСР — эпндермяльный фактор роста, ИСИ — фактор роста фибробластов.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы,обсуждению результатов, экспериментальной части, выводов, списка литературы. Работа изложена на __ страницах машинописного

текста, включает_схемы, _таблиц, рисунков. Список литературы

состоит из _ссылок.

Основные результаты работы.

Промышленный метод получения ганглиозида GM3 из эритроцитов лошади. На первом этапе Наших исследований для проведения экспериментов ln vivo с основным ганглиочидом эритроцитов лошади — ганглиоэидом GM3, с целью изучения динамики пролиферативного ответа клеток, дозового эффекта и различных способов введения было необходимо значительное количество вещества. Поэтому в нашу задачу входила разработка препаративного способа получения ганглиозида GM3 из эритроцитов лошади высокой степени очистки и с. максимальным выходом. Известные методы получения ганглиозида GM3 из природных источников отличаются многостадийностью, трудоемкостью и низким выходом.

Предложенный нами метод получения ганглиозида GM3 из эритроцитов лошади представлен на схемо 1.

На первой стадии эритроцитарную массу обрабатывали 1% —ной СН3СООН д/я удалении пигментов, образующихся при гемолизе. Для полного извлечения гаиглиозидов мы использовали эффективную схему экстракции, разработанную на нашем предприятии для получения гаиглиозидов мозга крупного рогатого скота при непосредственном участии автора данной работы. После обезвоживания и экстракции нейтральных лнпидоа ацетоном сырье обрабатывали смесями хлороформа и метанола, 2:1 и 1:2 (экстракты А и В) и смесью 70 % — ного водного 2—пропанола п гсксана, 4:1 (экстракт С). Использозание пос/едней смеси "увеличивало выход GM3 на 40—45 %. Учитывая низкое содержание липидов в сырье, для снижения расхода растворителей мы изучили возможность циклической экстракции эритроцитов указанными смесями и показали, что наиболее эффективным является трехкражее использование экстрагентов. К объединенным экстрактам А и В прибавляли сконцектрированый в вакууме при температуре не выше 40 °С экстракт С и отделяли водно — мегапольную фазу, содержащую ганглиозиды. Для выделения фракции моносиалоганглиозидов ми использовали ионообменную хроматографию на QAE — сефадсксе. Выбор эгсго сорбента был обусловлен возможностью увеличения нагрузки на колонку в 1.5 раза по сравнению с другими

Схема 1. _

Технологическая схема выделения ганглиозида GM3

-<3 Эритроднты лошади {>

сорбентами. Элюирование моносиалоганглиоэидов 0.05 М раствором NH4HCO3 в водном метаноле позволяло легко обессоливать раствор GM3 с помощью катионообменника в Н +* - форме. Полученную моносиало-гангляоэидную фракцию упаривали до 5 % исходного объема и осаждали ацетоном. Это позволило практически полностью удалить пигменты перед хроматографнрованием на колонке с с или нагелем. Элюирование с силикагеля проводили смесью СНОз-МеОН-НгО (70.35.8). Фракции, содержащие ганглиозид GM3 (по данным ТСХ), объединяли, концентрировали в вакууме и осаждали целсюй продукт ацетоном. Выход составлял 80—100 мг нэ 1 л зритроцитарной массы. Чистота получаемого таким способом ганглиозида GM3 была не менее 97 % (по данным аналитической ВЭЖХ). Препарат не содержал примесей пептидов и фосфолипидоа в детектируемых количествах (по данным количественного анализа содержания фосфора и аминокислот). Содержание сиаловой кислоты (25 %) соответствовало расчетному. Ганглиозид GM3 из эритроцитов лошади содержит остаток N —гликолилнейраминовой кислоты, что было подтверждено нами сравнением при ТСХ подвижности отщепленной с помощью нейраминидазы сиаловой кислоты со стандартами N — ацетил и N — гликолилнейрамниовых кислот.

Для интенсификации контроля чистоты GM3 мы провели модификацию известного метода анализа гангляозидов с помощью ВЭЖХ на колонке с модифицированным амннопропнльными группами силикагелем при градиентном элюированнн смесью ацетонитрил—фосфатный буфер и детектированием при 215 "м. Нами предложено использовать колонку длиной 150 мм вместо 250 мм. Предложенная в результате проведенных экспериментов методика позволила без потерн эффективности разделения ганглиозндов сократить в 1.5 раза время анализа и расход растборителей.

Препаративная ВЭЖХ ганглиознда GMj,

Для проведения экспериментов на культурах клеток необходимо 10—20 мг вещества с чистотой не менее 99 %. Наиболее эффектнпнпм методом получения ганглиозндов с такой степенью чистоты является препаративная ВЭЖХ. В настоящее время известен ряд методов для препаративной ВЭЖХ ганглиозндов. однако во всех этих методах для анализа собираемых фракций применяется ТСХ. что связано с невозможностью использования проточного детектирования ганглнезндоп при коротких длинах волн из —за сильного поглощения подвижной фазы. Прямое масштабирование метода, который был, использован нами для аналитической ВЭЖХ ганглиозндов с

• е

непрерывным контролем поглощения при коротких длинах волн, не приводит к успеху в препаративном варианте вследствие плохой растворимости ганглиозида СМз в подвижной фазе (МеСЫ —буфер). Частичная замена ацетоннтрила на метанол, в котором ганглиозиды растворяются значительно лучше, привела к уменьшению коэффициента емкости (к"), В связи с этим в состав подвижной фазы мы ввелн компонент с меньшей элюирующей силой — 2-пропанол. Соотношение компонентов подвижной фазы было оптимизировано для полумения максимального выхода СМз 33 единицу затрачиваемого на разделение времени с требуемой чистотой 99 % . (В данных условиях, на колонке с силикагелем, модифицированным амкнопропильными группами, при элюировании смесью МеОН- 2 - РгОИ - МеСЫ — 30 иМ натрий -фосфатный буфер было с успехом очищено от 1 до 20 мг СМз~ ЫеиСс. Б и ход ганглиознда после упаривания и обессолкваинн составлял не менее 96 % по данным количественного определения содержания ошловой кислоты.

Предложенный метод был использован нами для получения СМз~ МеиСс непосредственно из моиоендлоганглиозндной фракции эритроцитов лошади. Гомогенный по данным аналитической ВЭЖХ ганглиознд^Мз (3.1 мг) был получен за 14 минут при расходе 250 мл иодоижной фазы (рис. I ). .

юо- к

« я.

•0- \ • К\

90 \ н

М- \ 13

| 1

30 1 й

ао 10- V м\. •

' 1' * -г • • 1 1 ' 10 ' 12 ' Й них

Рисунок I. Препаративное разделение методом ВЭЖХ моносиало — ганглиозидов эритроцитов лошади на колонке гогЬах N142 (21.4x250 мм). Подвижная фаза МеОН- 2-РгОН- МеСМ -30 тМ фосфатный буфер, рН 5.6 (168:84:24:35, об.), Расход 20 мл/мин. Детектирование при 215 Поглощение максимального пика принято за 100 %. ■ . ' •

Несколько изменив соотношение компонентов подвижной фазы за счет уменьшения доли воды мы применим! разработанный метод для' очистки ганглиозида СМз, содержащего в своем составе остаток N — ацетил — нейрамияовой кислоты.

Полученные нами с помощью предложенного метода препаративной ВЭЖХ ганглиоэиды имели чистоту не менее 99 % по данным аналитической ВЭЖХ и не содержали детектируемых количеств примесей пептидов и фосфолипидов (рис. 2). Этот метод позволяет существенно сократить время, затрачиваемое иа получение вещества с такои степенью чистоты, и снизить трудоемкость. Предложенная комбинация подвижкой н неподвижной фаз может быть также использована для аналитической хроматографии ганглиозида вМз

Рисунок 2. Аналитическая ВЭЖХ ганглиозида СМз на колонке Диасорб 130 ЫНз- Подвижная фаза МеОН- 2-РгОЙ- МеС1М- 30 мМ фосфатиын буфер, рН 5.6 (198:9623:20, об.|, Расход 1.5 мл/мин. Детектирование при 215 ни. А СМз_КеиА.с, В СМз_№и(>с. Поглощение максимального пика принято за 100%.

Структура ганглиозида СМз-Строение олигосахарндной части.

В продуктах полного кислотного гидролиза СМз И3 эритроцитов лошади нами обнаружены нейтральные моносахариды глюкоза и галактоза. При частичном кислотном гидролиз« отщеплялась сиаловая кислота и

образовывался гликосфннголипид, подвижность которого по результатам ТСХ совпадала с подвижностью стандарта лдктозилцерамида. К аналогичному результату привод ил и гидролиз нейрамннидазой из V. сЬо1егае. Сравнение подвижности при ТСХ сиаловой кислоты со стандартами Ы—ацетил и N—гликолмлнейраминовых кислот показало, что и составе' СМз присутствует остаток только N—гликолил нейрамнновой кислоты. По данным количественного анализа гаиглиозид содержит остатки глюкозы, галактозы и сиаловой кислоты в соотношении 1:1:1.

Положение связей между остатками моносахаридов и последовательность моносахаридов в ганглиозиде определяли с помощью метилирования. При ГЖХ продуктов кислотного метанолиза перметнлнрованного ганглиозида был обнаружен только одни пик производного сиаловой кислоты, соответствующий стандарту метилового эфира метилкетозида 4,7,8,9— тетра—О—метил—N — метил — N—(О—метилгликолил)—иейраминовой кислоты. Следовательно, как и ожидалось, в ганглиозиде остаток N — гликолилиейраминовой кислоты занимает концевое Положение. Хроматомасс — спектрометрический анализ ацетатов частично метилированных полиолов, полученных после пздролиза пермет или ро ванного ганглиозида, восстановления N88144 и последующего ацетилярования, показал присутствие 1,3.5—три—О — ацетил—2.4,6—три — О —метил—дульцита и 1,4,5—три—О—ацетил—2,3,6—1ри—О—метил-сорбита. Следо вательно, в ганглиозиде остаток глюкозы замещен в положении 4, а остаток галактозы в положении ,3. „

При ГЖХ частично.метилированных ацетатов полиолов, образующихся из перметилированного дигексозилцерамида, полученного после гидролиза ганглиозида нейраминидазой, восстановления и ацетилнроваиия, обнаружены пики 1,5—дн —О—Ас— 2,3,4,0—тетра —О — Ме—дульцита и 1,4,5—три — О—Ас - 2,3,6 - три - С — Ме—сорбита. . . '

Из приведенных результатов метилирования следует, что олнгосахаридиая часть ганглиозида линейиа, в начале цепи находится остаток глюкозы, замещенный по 04 остатком галактозы, который1 глнкознлирован по ОЗ остатком N — гликолилиейраминовой кислоты.

Для определения конфигурации гликозндных связей нейтральных Сахаров днгексозилцерамид, полученный прр' частичном кислотном гидролизе, оцетилировали и окисляли хромовым ангидридом. Глюкоза и галактоза по данным ГЖХ окислялись практически полностью, что свидетельствует о присутствии только Ь — гликозидная связь. Сиаловая кислота присоединен^ а — кетозидной связью, что следует из результатов гидролиза

и

нейраминидазой.

Таким образом, структура олигосахаридной части .исходного гаяглиозида полностью соответствует структуре ганглнозида СМз — Мечвс (рис. 3).

Рисунок 3. Структура олигосахаридной части ганглнозида СМз иэ эритроцитов лошади.

Для определения строения липидиой части ганглнозида был проведен его кислотный метанолиз. В продуктах метанолиза с помощью ТСХ были обнаружены метиловые эфиры только неокисленных высших жирных кислот н сфингении. Состав жирных кислот, которые были выделены после полного кислотного гидролиза СМз твердофазной экстракцией на патроне С16, бил проанализирован с помощью ВЭЖХ в виде флуоресцентных произзодних (рис. 4), полученных при взаимодействии с монодапснлка\аверином в ДМФА в присутствии конденсирующего агента — 1 — (3—диметиламнко — пропил) — 3— зталкарбодиимнда (Схема 2).

Схема 2.

КМс

СН (СН )„СООН

ЫМе.

О ЕС

П>5

МНСО(СН,)пС.из

Использование данного реагента пнесто ДЦК, позволило избежать проблем, связанных с плохой растворимостью образующегося производного мочевины п необходимостью дополнительной подготовки проб!.! перед ВЭЖХ. Ках поклздм! наши исследования, ссновцинн кислотами п ганглнозида СМз 113 эритроцитов лошади являются кислоты 24:1 и 24:0 (в сумме 09%).

ганглнозида GM3 из эритроцитов лошади- Колонка— Zorbax ODS, 4.6x230 мм, Подвижная фаза- MeOH-MeCN-2-PrOH ( 63:27:10), расход 1 мл/мин. Флуоресценция максимального пика принята за 100 %.

Характеристика состава сфипгозииовых octiooaunñ и молекулярных тиооа.

Для характеристики состава сфингозниовых оснований мы исследовали возможность использова! <я ВЭЖХ на обращенной фазе производных ганглиозндов, у которых остатки жирных кислот замещены на остаток уксусной. Поведение при ВЭЖХ на обращенной фазе подобных соединений должно определяться длиной цепи и степенью ненасыщышости сфингозиновых оснований. Для увеличения чуствительносги детектирования и снижения влияния па разделение заряда карбоксильной группы нейраминовой кислоты мы предложили использовать 9 —антрнлметиловые эфиры (АМН) ганглиоэндоп, получаемые действием 9 - антрилдназометана на карбоксильную группу нейраминовой кислоты (Схема 3). Этот реагент ранее был с успехом применен для модификации карбоксильной группы жирных кислот, но в химии ганглиозндов прежде не использовался.

9—Антрилдиазометан был синтезирован нами окислением гидразона 9 — антрилкарбальдегида оксидом ртути в эфире (Схема 4). Несмотря на то, что нам не удалось выделить в индивидуальном состоянии; ,

Схема 3.

еоон

11 пм

1. = Н, Я'«» СНз 2. Я= Са1-СаНМАс-1лс-5р1^Ас, И'-СНз

3. исЭрЬЫАс. 1Г = СН3 4. 11= исСег, !Г - СН2ОН

неустойчивый 9 — антрнлдиазометдн, возможность применения этою реагента была убедительно доказана при контрольных экспериментах. Как представлено на рисунке 5В, при взаимодействии 9 — антрилдиазометана со стандартом N — ацетилнейраминовой кислоты (Схема 3) на ТСХ детектируется только одно флуоресциирующее резорвин — положительное пятно. При ВЭЖХ на колонке с снликагелем также детектируется, только один пик (рис. 5А). УФ —спектр выделенного эфира пейраминовой кислоты соответствовал литературным данным.

Использование этого реагента позволило проводить модификацию ганглиозида о олигосахарндной части в мягких условиях (20°С) за короткое время (20 минут) и применить чувствительный метод детектирования по флуоресценции при ТСХ и ВЭЖХ ганглиозидов.

. . Схема 4.

сно сн^

Предварительно нами была исследована, возможность использования подобного подхода на стандартном ганглиозиде СМ| из мозга быка. Было показано, что состав молекулярных видов СМ, полностью соответствует литературным данным. Анализ тем же методом производного ганглиозида СМ[, в котором остатки жирных кислот заменены ацетильной группой ( Н^ЫеиАс—СдОзв43рЬАс ), показал присутствие двух основных пиков-' '9 % и 40 %), соответствующих сфингенину и эйкозасфингенину. и двух

1'исупок 5. 9 —Антрилмзшловый зфкр КеиАс. Л ВЭЖХ, колонка — ЫсЪг0801Ь 5Ю0, граА"=>»>!0;; злкжроэение. СНС13-МгОН-Н2О от 65:10.0.1 до 65.25:1, расход 1 мл/пил. Флуоресценция максимального ирнняи За 100%.

В ТСХ, К1гае1до1 СУ, Система рлствориклей СНС13 - МеОН- ИгО (65.25:3) Обнаружение розорцшюпым реагенто». 1— МоиАс, 2~ ЛМ1; — МсиЛс

минорных (5% ¡1 6 %), соотвстствуЮЩ!и ефштинту и ЭКЖОЭЗСфМНГаШШу

(сь> рис ОА ). Полученные РО'ЗуЛ! ! .. : !; Л'. тоз^о -Л'И;';.. С /Л1!ШМ1;

литературы.

Подобный подход был использован нами для анализа состава сфингознновых оснований в GM3 из эритроцитов лошади. Ках видно из рисунка 66, при анализе AME—II3NeuNAc—LacSphNAc детектируется один главный пик (69%) ■ несколько минорных (максимальный не более 8%). При масс—спектрометрии GM3—NeuGc с ионизацией осколками деления ядер калифорния — 252 были обнаружен ион с массовым числом 130В. Исходя из этих данных Н данных анализа жирных кислот следует, <гто главным сфннпззиновым основанием якляетс* эйкозасфннгенин. Этот вывод подтверждается результатами ВЭЖХ молекулярных видов AME — GM3 (рис.7).

И» Л - м - • «0 -Л - м -» - м> - Б qm . , 1

A k ih' i¿ -fo l'< , in í'c---' V 1W MU ¿V ■ . w - «/V и** КИП.

Рпсунох 6. ВЭЖХ 9—антрнлметкловых эфиров ганглиозидов при разделении на колонке исЬовогЬ ЯР—48, расход 1 мл/мин. А Н-^еиАс — СдОзе.43рЬАс, Колонка 3x150 мм. подвижная фаза МеОН - МеСЫ - Н2О, от (35:15:50) до (70:30:0) Б Н3ЫеиАс — LacSphNAc. Колонка 3x300 мм, подвижная фаза МеОН —МеСЫ — 2 — РгОН (50:24:20). Флуоресценция максимального пика принята за 100%.

Рисунок 7. ВЭЖХ AME - GM3— NeuGc ори разделении на колонке Lichrosorb RPI8, 4x-j0 мм , подвижная фаза: 10 мни 90- 100 %В, 70 мин 100 %В. А МеОН-Me0N-H2O- 2-РгОН (35:15:50:5) В MeOH-MeCN- 2-РгОН (48:40:5), расход 1 мл/мин. Флуоресценция максимального онка принята за 100%.

Таким образом, из результатов установления структуры следует, что церамид ганглиозида GM3 —NeuGc из эритроцитов лошади содержит, в основном, эйкозасфингенин и кислоты 24:1 и 24:0.

Проведенные исследования позволили нам предположить, что способность ганглиозида GM3 из эритроцитов лошади усиливать

пролиферацию гепатоцитов может быть связана с наличием остатка NeuGc в олигосаХаридноб части и/или жирных кислот 24:1, .24:0 и длинноцепочечного основания 20:1 в составе цсрамида. Поэтому мы посчитали необходимым провести сравнительное изучение биологической активности ганглиозида GM3, отличающегося типом остатка нейраминовой кислоты ^JeuGc или NeuAc) и длиной жкрнокислотной цепи (16:0 и 24:0).

Синтез ганглиозида СМз-NeuAc, содержащего природный набор жирные кислот.

Для выяснения возможной роли типа остатка нейраминовой кислоты мы синтезировали ганглиозид GM3 — NeuAc, содержащий природный набор жирных кислот. Д\я этого исходный GM3 —NeuGc обрабатывала .! М раствором гидроксида тетраметиламмонмя в 90 % н — бутаноле при !00 °С в течение 4 часов с последующим выделением GM3— NeuNHj обращение — фазовой хроматографией на колонке с Uchroprep RP'8 при элюировднип

метанолом. Олюированне оСдэующегося в тех же услопиях примесного Je— N-ацил GM3 достигалось смесью метанол—вода (80:20). Селективным pl — ацетнлирован- э остатка нейрамнновой кислоты проводили уксусным днгидридомв смсси метанол-4% NaHC03 (1:1). Полученное соединение рмело время выхода при ВЭЖХ, соответствующее стандарту ганглиоэида (1М3—NeuAc. Наличие в составе полученного ганглиоэида остатка только N - ацетилнейрамнновой кислоты было подтверждено сравнением подвижности на ТСХ отщепленной при действии фермента сиаловой кислоты со стандартами NeuAc и NeuGc. Состав жирных кислот синтезированного ганглиоэида был по данным ВЭЖХ дансилкадавериновых производных идентичен составу исходного GM3. Никаких существенных изменений не наблюдалось и в составе сфннгозиновых оснований, что было продемонстрировано нами при анализе антрнлметилового эфира лнзо — ганглиоэида.

Синтез ганглиоэида GMj-NeuAc, содержащего кислоты 16:0 и 24:0.

Для исследования г-гадулнрования ганглиозидом GM3 пролиферативной активности клеток л зависимости от состава церамнда мы синтезировали соединения, содержащие только короткую (16:0) и только длинную (24:0) (Шслоты, без изменения состава длинноцепочечных оснований приро1дного рМз (схема 5).

Для этого исходный гликосфинголипид (I, R = CH20H) гидролиэовали 1 М гидрокспдом тетраметиламмония в 90 % я — бутаноле при 100 °С. Контроль состава продуктов реакции по ТСХ показал, что оптимальным является рроведение реакции в течение 10 часов. Удаление основания в нашем случае достигалось пропусканием разбавленной метанолом реакционной массы через колонку с Amberlite IR—120 в Н+ — форме. Полученные GM3 — NeuNH2 и ele —N —ацил —GM3 (II) разделяли обращение —фазовой хроматографией на ко\онке с Uchioprep RP18. Менее гидрофобное целевое соединение (И) элюиропали смесью МеОН —Н2О (3:2), а более гидрофобное соединение GM3—NeuNH2_ .чистым метанолом. Селективное ацилнрование свободной аминогруппы сфингозиновйго основания соединения (II) жирной кислотой с необходимой дмшой цепи проводили в воде с использованием конденсирующего . агента— 1 — (3— диметиламинопропил) — 3 —

этилкарбодиимида, В отличие от известного в литературе метода, нами был изменен порядок прибавления реагентов Карбодиимид добавляли к смешанным мицеллам из лизо — ганглиоэида (II) и "жирной кислоты, что позволило избежать проблем нерастворимости

Схема 5,

я=сн он 2

н=сн

3

ТМА-ОН

Т ОН ОН

ом

| ОЕС/СН3(СН^)пСООН

ооон I

а. п«14 о. п-22

111 а-ь | АС20/КаНС03 т

ли

IV

а. п*14 Ь. р."22

последней и , в конечном итоге, увеличить выход (особенно в случае ^ кислотой 24:0). При данном способе мы не наблюдали также сколько нибудь заметного образования продуктов О —ацилирования., что исключи^ необходимость проведения стадии щелочной обработки. Свободную аминогруппу выделенного обращсннофазовой хроматографией соединен!^ (III) избирательно ацетилировалч действием АС2О в смеси МеОН —4 Ц, Ь'аНСОз в Н2О (1:1). Выход ганглиозида СМз (IV а,б), содержащего

<; 1Г|/сдеЛеннуто жирную хисло-*у, составлял 19 %.

Структура полученных соединений была подтверждена методами ВЭЖХ и масс — спектрометрии с ионизацией осколками деления ядер калифорния — 252. Так, при ВЭЖХ на колонке с модифицированным аминопропильными труппами силикагелем синтезированные ганглнозиды (IV а,б) имели времена удерживания, совпадающие со временем удерживания стандарта GMj- Net \с. При анализе состава жирных кислот в виде даисилкадавериновых производных было показано, что синтезированные липиды содержат только одну жирную кислоту (16:0 или 24:0, соответственно). Состав сфингозиновых оснований, проанализированный в виде AME л:13о—ганглиозидов, соответствовал природному. В масс — спектре были зарегистрированы ионы с массовыми числами 1160 (d20:l -4- 16:0) и 1192 'd20:l + 24:0), что полностью отвечает предлагаемой структуре.

Исследования влияния GAt-» на пролиферацию клеток.

Опыты проводились как в экспериментах in vivo- при двух моделях повреждений печени крыс: частичной гепатэктомии и терклческн индуцированного гепатита, так н in vitro— на культурах гепатоцитов и фибробластов.

Ранее было показано, что после хирургического удаления части печени гепатоцнты начинают интенсивно пролиферировать, причем максимум включения радиоактивной метки в ядра клеток наблюдается через 24 часа после операции. Увеличение пролиферативной активности гепатоцитов было продемонстрировано и, d случае с термически индуцированным гепатитом. Введение ганглнозида GM3 из эритроцитов лошади приводило к увеличению включения — тимидина в ядра клеток печени крыс с гепатэктомией через 24 часа (рис. 8В). Увеличение пролиферативной'.активности клеток было обнаружено и для модели с гепатитом, причем динамика включения метки была подобна контрольной, оставаясь все время на более высоком уровне (рис. 8А).

Для подтверждения результатов экспериментов In vivo и для выяснения возможной роли типа остатка нейраминовой кислоты (NeuAc или NeuGc) мы провели исследование влияния ганглиозидов GM3 —NeuGc и GM3 — NeuAc на пролиферацию гепатоцитов в первичной культуре. • Были использованы вещества с чистотой не менее 99 % . Как показано на рисунке 9, пролиферация гепатоцитов стимулировалась при инкубировании клеток с GM3 при различных концентрациях вне зависимости от типа остатка нейраминовой кислоты.

Рисунок в. Влияние-ганглиозида GM3—NeuGc из эритроцитов лошади на пролиферацию гепатоцитов ln vivo. А—Гепатит, В— Гепатэхтомия (через 24 часа); 1-контроль, 2 —общие липнды эритроцитов лошади, 3-GM3 —NeuGc, 4 - суммарные гангллозиды мозга КРС.

Для того, чтобы выяснить, влияет ли тип клеток на характер изменения пролиферации под действием ганглиозида GM3, вместо гепатоцитов, пролиферация которых индуцируется и контролируется ростовым фахтором, отличным от HGF и FGF, мы провели исследования на перевиваемой линии фибробластов мыши. Эксперименты проводили при двух типах инкубирования клеток с ганглиозидом: трехчасовое инкуби) ование клеток однодневной культуры (аналоги'!но опытам с первичной культурой гепатоцитов, вариант А), и культивирование клеток в среде, содержащей ганглиозид (аналогично опытам других авторов, париант Б). Нами было показано, что GM3—NeuGc способен усиливать пролиферацию фибробластов при обоих типах инкубирования (рис. 10).

В следующей группе экспериментов мы изучали влияние на пролиферацию клеток ганглиозида GM3 — N'suAc. содержащего определенную жирную кислогу (16:0 и 24:0). Полученные данные позволяют считать, что СМд, содержащий более длинную жирную кислогу, способен усиливать пролиферацию фибробластов, a GM3, в состав церамида

0.0

париант А

4 5

Премл (дни)

О.в

| -•» - 7.5 нкг/нл - **— Контроль

вариант Б

♦ о

Время (дни)

-а— 7.5 мкг/нл т-*— Контроль |

исунок 10. Влияние ганглиозиДа СМз~ Ыеивс на пролиферацию ибробластов. А Инкубирование клеток с ганглиозкдом в течении 3 часов. Б обавление гантлиозидов в культуральную среду. Результаты представлены ж средние значения двух независимых экспериментов по 8 лунок на )чку. С) Различие с контролем статистически достоверна (р<0.05).

которого входит кислота 16:0 ие обладает таким эффектом.

I | 0\Ш40с Е23 <5ММ1Ас

Рисунок 9. Влияние ганглиознда СМз на пролиферацию гепатоцитов 1п у!ио.

Выводы.

1. Разработан промышленный метод получения ганглиознда СМз из эритроцитов лошади с высокой степенью чистоты и высоким ныходом.

2. Предложен экспресс — метод д\я препаративной ВЭЖХ ганглиознда СМз с применением непрерывного детектирования при коротких длинах волн.

3. Изучена структура ганглиознда вМз-ЫеиСс из эритроцитов лошади и устг ювлено, что в составе церамнда присутствуют, в основном, эйкозасфингенин и жирные кислоты 24:1 и 24:0.

4. Впервые предложено использование Э —атрилметиловых эфиров ганглиозидов в качестве флуоресцентных производных для анализа молекулярных видов и характеристики состава длинноцепочечных оснований методом ВЭЖХ.

Ь. Синтезированы гашлнознды типа вМз — МеиЛс с исходным набором ддинноцепочечных оснований, содержащие ,как первоначальный набор жирных кислот, так и заранее заданны,I (¡6:0 и 24.0).

в; Впервые показано, T¡ гвнглиозид GM3 из эритроцитов лошади способен усиливать пролиферацию клеток как In vitro, так и In vivo: при модельных повре—дениях печени у животных: частичной гепатэктомии и при индуцированном гепатите.

7. В тестах воздействия на пролиферативную активность клеток изучена зависимость между биологической активностью ганглиозида GM3 и его структурой. Показано, что на пролиферацию клеток не влияет тип остатка нейраминовой кислоты (NeuGc или NeuAc). В то же время показано, что длина цепи жирной кислоты определяет способность GM3 усиливать пролиферацию клеток.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ:

Мезин И.А., Мензелеев Р.Ф., Мензелеева Г.К., Пшгчук АН., Краснопольский Ю.М., Швец В.И. / Комплексная препаративная технология выделения лип идо в из мозговой ткани. //Бнол. мембраны. 1992. Т9 N. 3. с. 301 -307.

Божков А И., Краснопольский Ю. М„ Асадова М. К., Могилянская С. М., Длубовская В. Л.. Мензелеев Р. Ф. / Влияние экзогенных липидов на функциональную активность печени при экспериментальном гепатите. // Вопросы мед. химии. 1993. N1. с. 41 — 43.

Мезнн И.Л.. Мензялеев Р.Ф., Сенников Г.А., Краснопольский Ю.М., Швец В.И. / Способ получения ганглиозидов из мозга крупного рогатого скота.// А. с. N1647980

Мензелеев Р.Ф., Сенннкова И.Г., Швец В.И, Краснопольский Ю.М. / Способ получения гангляозида GM3. // Полож. решение на заявку N 4941930; Заявлено 08.06.92

Мензелеев Р.Ф., Смирнова Г.П., Чекарева Н.В., ЗвОнкова E.H., КраснопольскийЮ.М., Швец В.И../ Ганглиозид GM3 из эритроцитов лошади: структура и влияние на пролиферацию клеток.// Бноорг. химия 1993. Т.19 N.8.

Зак.95 тираж 80 экз. Ротапринт МИГ XT им.Ломоносова