Разработка метода определения эйкозаноидов в биологических объектах. Исследование влияния ганглиозидов на липоксигеназное окисление в лимфоцитах человека тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОИ ХИМИИ имени М.М.ШЕМЯКИНА

На правах рукописи

ГРЕЦКАЯ Наталья Михайловна

РАЗРАБОТКА МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭИКОЗАНОИДОВ Б БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ГАНГЛИОЗИДОВ НА ЛИПОКСИГЕНАЗНОЕ ОКИСЛЕНИЕ В ЛИМФОЦИТАХ ЧЕЛОВЕКА.

02.00.10 Биооргавическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Автореферат диссертации на соискание ученоа степени кандидата химических наук

Москва-1991

Работа выполнена в Ордена Трудового Красного Знахеня .Институте

«

Сиоорганической химии им. X.К.Шемякина АН СССР.

Научный руховодитиель: член-корреспондент АН СССР, профессор, доктор химических наук Л.Д.Бергельсон

Официальные оппоненты: член-корреспондент АН СССР, профессор И.В.Торгов, кандидат химических наук К.В.Проказова.

Ведущее предприятие - Институт Физиологически активных веществ АН СССР.

. ро

тчс, г. „

специализированного совета I 0023501 по защите диссертаций на

Защита состоится " Мт&РР/1'Н?г.Л991г. в -Г. .4. на заседании

соискание ученой степени доктора наук при Институте биоорганической хшшн им. И.и.Шемякина АН СССР, г.Москва, ул Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института Сиоорганической хшшн им. и.и.Шемякина АН СССР.

Автореферат разослан щ0.ш1г.

Учений секретарь специализированного совета Д 0023501 /

кандидат химических наук '

АКТУАЛЬНОСТЬ РАБОТЫ*. Эйкозаноиды являются локальными гормонами, высвобождаемыми клетками в ответ на различные стимулы, и обладающими высокой биологической активностью. Чтобы оценить роль этих метаболитов арахидоновой кислоты в физиологической регуляции или патологических процессах, необходимо знать их количественный и качественный состав в различных биологических образцах. Поэтому одной из главных задач современных исследований в области эйкозаноидов является определение их профиля в биологических объектах. Решение этой задачи затрудняется низким содержанием метаболитов арахидоновой кислоты в тканях, сходством структур различных типов эйкозаноидов, имеющих разную биологическую активность, а также их быстрым метаболизмом. Существующие варианты анализа обладают рядом недостатков, ограничивающих их применение, что Делает необходимым разработку новых методов анализа профиля эйкозаноидов.

В настоящее время появляется все больше доказательств, того, что эйкозаноиды играют важную роль в регуляции иммунного ответа. Поэтому значительный интерес представляет выяснение связи между функциональными особенностями иммунокомпетентных клеток и продукцией эйкозаноидов в различных условиях. Многие иммунокомпетентные клетки сами способны синтезировать те или иные продукты каскада архидоновой кислоты. В настоящее время профиль эйкозаноидов в лейкоцитах и макрофагах изучен достаточно подробно, однако лимфоциты в этом отношении остаются еще мало изученными. Поэтому одной из задач настоящей работы было исследование профиля продуктов превращения экзогенной и эндогенной

* В руководстве работой принимал участие к.х.н. В.В.Беэуглов

арахидоновой кислоты в лииФоцитах человека.

Другим классом липидных веществ-иимунорегуляторов являются ганглиоэиды, влияющие на пролиферацию и дифференцировку лимфоцитов, цитотоксическую активность естественных киллеров (НН-клеток**) и макрофагов. В связи с этим важно было выяснить, опосредовано ли иимуномодулирующее действие гангли-озидов их влиянием на каскад арахидоновой кислоты в лимфоцитах человека.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ. Разработать новый высокочувствительный метод определения профиля эйкозаноидов в биологических объектах на основе синтеза и последующего анализа их Флуоресцентных производных с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭХХ).

Исследовать профиль эйкоэаноидов , выделяемых лимфоцитами человека в ответ иа стимуляцию различными эффекторами, и изучить влияние ганглиоэидов на окисление арахидоновой кислоты в лимфоцитах человека.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. В ходе работы впервые синтезированы дан-силгидразиды практически всех типов природных простаглан-динов, тромбоксана Вг и некоторых гидроксиэйкоэатетраеновнх

** Сокращения: ВЭКХ - высокоэффективная жидкостная

хроматография, бщб ■ - масс-спектрометрия ' с ионизацией вторичными ионами, С1 - масс-спектрометрия с химической ионизацией аммиаком, идв - масс-спектрометрия с ионизацией быстрыми атомами, НК-клеткя - натуральные киллеры, РвЕ^ (Е*, Ра < , А1, В», Ог, р1 ее , Р»¿} , б-кёто-р1 ) - простагландин Е! (Еа , Г* , А1 , Вг , Бг , р1 г*. « б-КеТО-Г|»С ), ТхВг -

тромбоксан Ъг, 15-НЕТЕ - 15-(Б)-окси-5,8, и, 13-(г,г,г,Е)-эйкозатетраеновая кислота, 12-НЕТЕ - 12-гидрокси-5,8,ю,14(2,2,Е,г1-эйкозатетраеновая кислота, АА арахидоновая кислота, 0пз-№Ь - 5-диметиламинонафталин-1 сульфонилгидразин (данейлгидразин), и^, см» и сб3 ганглиозиды вМ1 , вМз■ СБ» (по номенклатуре Свеннерхольма).

кислот, ряд других гидраэидов и амидов, содержащих хромофорные группы, а также оксимы дансилгидразидов кето-простаглан-динов и трмбоксана В2 . Синтезированные соединения были использованы при создании нового способа анализа эйкозаноидов в биологических объектах с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Чувствительность разработанного нами метода, составила 10*13 моль, что не уступает, а в ряде случаев превосходит чувствительность существующих методов и позволяет определять баэальный уровень эйкозаноидов в тканях и биологических жидкостях.

В работе показано, что арахидоновая кислота в лимфоцитах' человека окисляется преимущественно с помощью липоксигеназ с образованием 12-НЕТЕ в качестве основного продукта. Экзогенная арахидоновая кислота не изменяет спектр продуктов окисления, но увеличивает абсолютное количество гидроксикислоты. Установлено, что некоторые ганглиозиды оказывают стимулирующее действие на синтез 12-НЕТЕ в лимфоцитах, что является указанием на то, что ганглиозиды могут Функционировать в качестве регуляторов эйкозаноидного каскада. На основании полученных экспериментальных данных высказано предположение, что иыыуномодулирувдее действие ганглиозидов может Сыть обусловлено их влиянием на каскад арахидоновой кислоты в иммунокомпетентннх клетках. Необходимо отметить, что в экспериментах мы изучали влияние ганглиозидов на количество липоксигенаэных продуктов, выделяв«« лимфоцитами в среду инкубации. Но так как эйкозаноиды в клетках не накапливаются, то увеличение количества 12-НЕТЕ в инкубационной среде свидетельствует об увеличении уровня липоксигенааногр окисления- в клетках.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. В результате проделанной работы разработан синтез Флуоресцентных производных нового типа - дансилгидраэидов эйкозаноидов. Разработан новый комплексный метод определения профиля эйкозаноидов, включающий процедуры экстракции из биологического образца,■ деривати-зации и последующего ВЭЖХ-анализа. Разработанный метод может быть применен в биологии и экспериментальной медицине для изучения метаболизма арахидоновой кислоты в биологических объектах.

:АПРОБАЦИЯ ДИССЕРТАЦИИ* Результаты работы были представлены на конкурсе молодых специалистов ИБХ им.М.М Шемякина, на IV Всесоюзной конференции "Синтез и исследование проста-гландинов", на "IV Всесоюзном симпозиуме "Липиды биологических мембран".

ПУБЛИКАЦИИ По материалам диссертации имеется 7 публикаций.

ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация изложена на /^страницах машинописного текста, включает $ таблиц, /(7 рисунков, и состоит из литературного обзора, результатов и их обсуждения, экспериментальной части и выводов. Список литературы содержит 116 ссылок. .

I. РАЗРАБОТКА НОВОГО МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОФИЛЯ ЭЙКОЗАНОИДОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ.

Для изучения каскада арахидоновой кислоты в биологических объектах, используют несколько подходов: 1) изучение радиоактивности метаболитов арахидоновой кислоты после включения в клетки радиоактивномеченной арахидоновой кислоты; 2)

анализ продуктов каскада арахидоновоя кислоты инструментальными методами (хроматомассспектрометрия, ВЭЖХ). От первого способа мы отказались, т.к. добавленная извне к клеткам арахидоновая кислота, являясь сама по себе эффектором, изменяет состояние клеток, что может приводить к искажению действительной картины. Второй метод предполагает превращение эйкозаноидов в производные, обнаруживаемые оптическими методами и их разделение с помощью ВЭЖХ. Применение Флуоресцентных производных эйкозаноидов значительно повышает чувствительность анализа, а использование ВЭЖХ позволяет вы-.делять и накапливать анализируемые вещества для последующего исследования с помощью масс-спектрометрии.

1.1 Синтез данснльных производных эйкозаноидов.

Ключевым моментом в синтезе флуоресцентных производных простагландинов, тромбоксана и гидроксиэйкозатетраеновых кислот для последующего ВЭЖХ-анализа является выбор Флуо-рофора. Мы остановились на соединениях с дансильным флуоро-фором, т.к. такие производные эйкозаноидов близки по хроматографической подвижности их метиловым эфирам, что позволяет осуществлять разделение в обращенно-фазном режиме. Кроме того дансильнна флуорофор дает достаточно высокий квантовый выход Флуоресценции. Для дериватизации метаболитов арахидоковой кислот* использовали я-{2-аминоэтил)-5-} диметнламнно«а#тал*н-1-су«»фонамид, 5-диметил-аминонафталин-1-сульФоиклгндразкн (хансклгидразин, Опз-мн*), N-1(5-| аммнопентил]]-1-дим*тиламияон«Фталин-5-сулыК>намид (дансил-кадаоеркм). Флуоресцентные эякозаноиды получали по методу смеаанннх ангмдридо». Вначале эякоэаноиды обрабатывали из-

бытком иэобутилхлорформиата в присутствии основания (три-этиламина) (молярные соотношения 1:1,8:1,4 соответственно). Образовавшийся смешанный ангидрид через 30 минут вводили в реакцию с полуторакратным избытком флуоресцентного реагента и инкубировали в течение ночи. В результате реакций, проведенных по этой схеме, были синтезированы флуоресцентные производные простагландинов, тронбоксана Вг , арахидоновой кислоты и некоторых гидроксиэйкоэатетраеновых. кислот. В этих же условиях нам удалось осуществить синтез некоторых арилгидразидов простагландинов (бензоилгидразидов,

динитроФенилгидразидов), которые также можно использовать для хроматографического анализа эйкозаноидов с детектированием в видимой или УФ-области спектра.

Таким образом, синтезированные нами соединения «окно разделить на два типа: гидразиды и амиды эйкозаноидов. Все полученные производные были выделены в индивидуальном состоянии с помощью ВЭЖХ или колоночной хроматографии к их структура была подтверждена методом масс-спектрометрии с химической ионизацией аммиаком, ионизацией вторичными ионами (табл.1 и 2) и ионизацией быстрыми атомами (рис.2).

Все синтезированные производные пригодны для анализа эйкозаноидов в биологических объектах. В дальнейшей работе мы использовали дансигидразиды. Ланейлгидразиды всех типов простагландинов обладают флуоресценцией с. максимумом эмиссии 530 нм при Еозбуадении на длине волны 350 нм,., спектры поглощения большинства дансилгидразидов простагландинов и тромбоксана имеют три максимума при 214, 254 и 330 нм, за исключением дансилгидраэкда рвВг^ в спектре которого второй максимум находится при 267 нм. Дансилгидразиды эйкозаноидов

Таблица 1

Характерные ионы в масс спектрах производных эйкоэаноидов Формулы ех-со-кн-я при химической ионизации аммиаком (сп и вторично-ионной масс-спектрометрии (г1М8).

EI R Способ Значения m/z , отвечающие ионам

ионизации [M+H][M-H]» [М+Н-НгО] [М+Н-2НгО]

(-ЗНгО)

PGAi NH-Dns sims 600 - 566 _

PGBi NH-Dns - sims 582 580 564 -

PGD2 NH-Dns sims - 598 582 564

PGE2 NH-Dns sims 600 598 582 564

ci 600 - 582 564

PGEz NH-DNF sims - 533 - -

PGEi NH-BZ sims - 471 455 437

PGFj<* NH-Dns ci 602 584 566

PGFiw; NH-Dns ci - - 586 568

PGF./j PGEi NH-Dns ci' - - 586 568

NH-Dns ci 602 - 584 566

pge2 Cj Hi о -NH-Dns ci — - 652 634

ТхВг NH-Dns sims - - 600 582(564)

6-ке- NH-Dns ci - - 600 582(564)

TO-PGFiaCNH-Dns ci - - 600 582(564)

ei R [M] [M+H- НгО] [М- (СНз ) 2 ]

15-НЕТЕ NH-Dns ci 567' 550 —

12-НЕТЕ NH-Dns ci - 550

*- для масс-спектров эгмя в режиме регистрации отрицательных

ионов

Таблица 2.

Характерные ионы в масс-спектрах оксимов дансилгидраэидов РСЕ1, ТхВ! и б-кеторсг*<* при ионизации вторичными ионами.

Соединения Значения [M-H]* m/z, отвечающее ионам: tM+H-ШО] [М+Н-2НгО]

PGEi -ox-Dns-Hdz 615 599 581

6-KeTO-PGFt«<.- 631 615

ox-Dns-Hdz

TxBi-ox-Dns-Hdz 631 615

«- для масс-спектров SIMS в режиме регистрации отрицательных ионов (ох-оксим, Dns-Hdz - дансилгидраэин)

устойчивы при +4° не менее 30 часов, а после выделения из реакционной смеси сохраняются при +4° более года. Описанный метод синтеза дает высокий (до 70%) выход дансилгидразидов, все реакции проводятся в одном реакционном сосуде, что позволяет свести к минимуму потери. Реакции, как правило, не сопровождаются образованием побочных продуктов, что " значительно упрощает выделение и очистку целевых соединений. Однако при проведении ВЭЖХ следует учитывать тушение Флуоресценции в полярных системах: при увеличении содержания воды в системе от 15 до 75%, интенсивность Флуоресценции падает почти в 2 раза, а максимум смещается с 530 нм до 490 нм. Поэтому дансилгидразиды рекомендуется хроматографировать \ в изократическом режиме.

Известно, что определение ТхВа и 6-кето-рор1 «С, основных продуктов неферментативного превращения высокоактивных ТхАг и простациклина в биологических объектах, с помощью ВЭЮС является серьезной проблемой, т.к. при хроматографическом анализе этих эйкозаноидов и их производных появляются широкие пики, которые связаны с существованием таутомерных ( т.н. "открытых" и "закрытых") Форм. Кроме того, дополнительные трудности возникают из-за перекрывания пиков ТХВа и РвГг »<. , что искажает хроматографическую картину и может привести к ошибкам при интерпретации результатов разделения. Полностью перевести ТхВ» и б-кето-РСЕ1 ее. в открытую форму можно с помощью оксимирования или ыетоксимирования. Синтез оксимов дансилгидразидов простагландинов был осуществлен только оксимированием дансилгидраэида простагландина, т.к. при обработке оксимов кето-простагландинов дансилгидразином не образуется искомых продуктов. Нами были синтезированы

Таблица 3.

Влияние растворителей на образование смешанного ангидрида [3н]-рсе1 с изобутилхлорформиатом. (Реакцию проводили при~+4°С зо минут)

растворители Выход реакции В %

Тетрагидрофуран 17 + 1, 3

Диоксан 57±3

Ацетонитрил 88±2, 4

Таблица 4.

Влияние температуры на образование дансилгидраэида [3Н]-РСЕ1 . (Реакционную смесь выдеряивали 15 мин. при указанной температуре и 18 ч. при +4°С)

Температура реак- Выход реакции в Ч

ции, "С

+4 ■ 70±2,8

+ 25 30+9,7

+ 38 25±5,4

+ 60 13±12,1

30 70 60 50 40 30 20 10 0

выход реакции, У.

' Смеш. ангидрид

5 18

~ Продукт реакции

26

т

1

____А

<111

28

3

4

Рис.1 Зависимость образования дансилгидраэида РСЕг от продолжительности реакции (по данным радио-ТСХ).

оксимы дансилгидразидов РСЕ1, 'ГхВг к б-кето-РСГи*. .Структуру этих соединений подтвердили методой масс-спектрометрии с ионизацией вторичными ионами (табл.2). •

1.2 Оптимизация условий синтеза флуоресцентных производных для микроанализа эйкозаноидов.

В основу^микроанализа профиля эйкозаноидов в биологических объектах была положена описанная выше реакция получения дансилгидразидов эйкозаноидов и последующее их определение с помощью ЕЭЖХ.

Однако, учитывая незначительные концентрации эйкозаноидов в Физиологических условиях, нам было необходимо оптимизировать условия синтеза флуоресцентных производных.

Для оптимизации условий микросинтеза мы исследовали влияние ряда параметров (температура, время, растворители, концентрация реагентов) на протекание реакций образования смешанного ангидрида и дансилгидразида смеси [н3]-Р0Е1 и "холодного" простагландина Е1 , контролируя образование продуктов реакция с помощью радио-ТСХ. Выход смешанного ангидрида на первой стадии достигает 90% при 15-20 кратном избытке иэобутилхлорформиата и триэтиламина, если в качестве растворителя использовать ацетонитрил (табл. 3). Проведение второй стадии реакции в течение 15 минут при температуре выше +4 °с с последующей инкубацией в течение 18 часов при +4°с отрицательно сказывается на выходе дансилгидразидов (табл.4). Оптимальными оказались следующие условия: инкубация с 5-кратным избытком дансилгидразина в течение 18 часов при +4-о Ос (рис.1).

Увеличение времени реакции свыше 30 часов приводит к накоплению в реакционной смеси продуктов деградации. Следует отметить, что существенное влияние на выход продуктов реакции оказывает полнота удаления остатков триэтиламина из реакционной смеси после первой стадии, что позволяет поднять выход дансилгидраэидов до 70%.

1.3 Анализ дансидгпдразидов эйкозаноидов с помощью высокоэффективной зшдкостной хроматографии.

Наличие флуоресценции и интенсивного поглощения в ультра-Фиолетовой области спектра позволило нам использовать для анализа дансидгидразидов два типа детектирования. Кроме того, в данной работе использовали два разных вида обра-щенно-Фазной хроматографии: аналитическую и микроколоночную.

Аналитическую ВЭЖХ проводили на колонке гогЬах С8 (4,6 * 250 мм) с детектором с переменной длиной волны, установленном на 254 нм. Для микроколоночной хроматографии использовали микроколонку (0,5 * 250 мм), упакованную сорбентом' БИазогЬ БРН-Св и флуориметрический детектор (возбуждения 255 нм, область детектирования 500-700 нм). Для разделения производных эйкозаноидов использовали как изократическое, так и градиентное (в случае микроколоночной хроматографии) элюирование.

Результаты разделения ряда дансилгидраэидов эйкозаноидов на аналитической колонке представлены в таблице 5. В примененных нами условиях элюирования не происходит разделения РСЕ1 и рсЕа, которое достигается в других условиях

элюирования (система метанол вода, 67,5:32,5, время удерживания 14,31 и 14,90 для производных РйЕг и РСЕ* соответ-

Таблица 5

Разделение дансилгидразидов простагландинов на колонке гогЬах С8 (5,6*250 мм) в системе метанол - вода, 65:35 Детектирование при 254 нн.

Дансилгидразиды Время удерживания (мин.) простагландинов (коэффициент емкости, к')

Е1 14,93 (5,8)

Ег . 14,53 (5,6)

ГгоС 16,33 (6,4)

Р1,С 15,62 (6,1)

12,51 (4,7)

Аг 26,66 (10,3)

Вг 29,54 (11,4)

ственно). Как уяе упоминалось ранее дансилгидразиды ТХВ2. и б-кето-рвГ!дают на хроматограмые широкие пики, которые перекрываются с пиком дансилгидразида РОР2 << , После оксими-рования с переводом ТХВг и б-кето-РвКкл в "открытую" Форму, увеличивается их время удерживания, а хроматографические характеристики самого РОЕк^С , который не содержит кето-группу, остаются прежними. Б результате достигается удовлетворительное разделение этих эйкозаноидов (времена удерживания б-кето-рстчл, ТхВ2 и РСРгс< в системе метанол -вода - уксусная кислота, 75:25:0,02 равняются 7,07, 8,78 и 5,58 мин. соответственно). использование для анализа производных .эйкозаноидов микроколоночной БЭЖХ с флуориметрическим детектором дает ряд преимуществ по сравнению с обычной аналитической хроматографией. Во-первых, значительно увеличивается чувствительность анализа, которая на кикроколоночном хроматографе ХЖ-1311 составляет ю-13 моль, а при использовании лазерного флуориметрического

детектора "Шафран" (длина волни возбуждения 325 нм) увеличивается до Ю-15 моль. Кроме того, использование

микроколоночноя хроматографии позволяет без каких-либо дополнительных модификаций устранить широкие пики ТхВг и 6-кето-PGFi еС .Результаты разделения модельной смеси дансилгидразидов ряда простагландинов, ТхВг и 15-НЕТЕ в градиенте аиетонитрил-вода от 30:70 до 85:15 представлены на рис. 2 (работа проведена совместно с Е.М.Королевой и Б.Г.Беленьким, ИБС АН СССР, г. Ленинград). Что касается разделения PGEi и PGE2, то и при этих условиях их определение представляет проблему, которую однако мошо решить при сочетании хроматографического и масс-спектрометрического анализа.

1.4 Твердофазная экстракция эйкозаноидов из биологических

объектов. ,

Для успеха анализа эйкозаноидов существенное значение имеет процедура их предварительного выделения иэ биологических объектов. В настоящей работе мк использовали собственный вариант твердофазной экстракции на шши-колонках, содержащих носители на основе снликагеля silasorb, модифицированного силиловыми эфирами с различной длиной углеводородной цепи (С2*, С8', С8 и Cía) и разной степенью зернения (от 7,5 до 30 мнн). Носители помещали в колонку либо использовали непосредственно для экстракции в объеме. Условия экстракции отрабатывали с применение« меченых тритием PGEi , АА и 12-HETE, англизируя распределение радиоактивной метки в разных Фракциях системы растворителей. Первоначально элюцию проводили системами ацетонктрил - вода на колонке, содержащей Silasorb С8 (7,5 ики). В результате экспериментов оказалось, что до 60% [3h]-pgei и [>н]-12-НЕТЕ

«-предоставлены Королевой Е.М.(ИВС АН СССР,г.Ленинград)

Si'ilmn-щ

(00[MfH] +

ol'

S60 sso боо Ej,A/H-Dos

Рис.2 Разделение смеси дансилгидраэидов эйкоэаноидов с помощью микроколоночной обрацэнно-фазной ВЭХХ в градиенте ацеюнитрил - вода, от 30:70* к 85:153!, и характерные ионы в масс-спектрах (FAB) этих соединений.

элюируется 70% ацетонитрилом и до 80% [3Н]-АА - чистым ацетонитрилом, часть метки распределяется по другим фракциям растворителя. Однако при этих условиях экстракции на колонке задерживалось до 40% наносимой радиоактивной .метки. Таким образом эффективность и воспроизводимость этой процедуры была довольно низкой.

Попытки заменить экстракцию на ' колонке экстракцией в объеме не увенчались успехом из-за Флотации сорбента в воде и, как следствие, больиих потерь эйкозаноидов из-за размывания по Фракциям.

Хорошие результаты были получены при экстракции эйкозаноидов, наносимых на мини-колонку,системами, содержащими метанол и воду. Путем перебора различных соотношений этих растворителей установили, что до 90% метаболитов арахидоновой кислоты элюируется системой метанол - вода, 9:1. При этом сама арахядоновая кислота удерживается на колонке, что значительно сокращает время последующего анализа с помощью ВЭЖХ. При изучении влияния на качество экстракции длины углеводородной цепи, конъюгированной с Б11азогЬ, использовали ЗНазогЪ С2* и С8* (30 мкм) , БИазогЬ С8 (7,5 и 15 мкн) и эзЛазогЬ С18 (7,5 и 15 мкм)'. . . Наилучшие результаты были получены яри применении Зд1азогЬ С8 и С18 (15 мкм). Эти сорбенты обеспечивают максимальную полноту экстракции эйкозаноидов из образца (до 80%) 90%-ным воднкм метанолом. Вся процедура, позволяющая концентрирозать малке количества эйкозаноидов из больших объемов, очень проста в исполнении и занимает немного времен:! (10-15 минут от нанесения вещества на колонку до завершения экстракция).

После экстракции возыокна полная регенерация сорбента, что позволяет использовать колонку не менее 10 раз.

Следует отметить, что эйкозаноиды, являясь слабо кислыми липидами, переходят в органический растворитель в протони-рованной Форме, поэтому до экстракции образец следует подкислять до рН 3,0-3,5. Однако в этих условиях РвЕ! н РвЕг могут претерпевать дегидратацию и превращаться в РОА1 и роаг соответственно, а 6-кето-РСГ1Х и ТхВг давать внутренние лактоны (литературные данные). Поэтому в специальном эксперименте мы проследили путь этих простаг'ландинов и тромбоксана В2 от экстракции до ВЭЖХ анализа их дансил-гидразидов. Результаты показали, что хроматографическое поведение эйкозаноидов, экстрагированных предложенным нами способом, и модифицированных далее дансилгидразином, не отличается от хроматографического поведения стандартов.

II. ИЗУЧЕНИЕ МЕТАБОЛИЗМА АРАХИДОНОВОИ КИСЛОТЫ В ЛИМФОЦИТАХ

ЧЕЛОВЕКА.

и.1 Анализ профиля эйкозаноидов в спленоцитах мышей и лимфоцитах человека с помощь» высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Ранее было показано, что после стимуляции спленоцитов мышей арахидоновой кислотой в инкубационной среде можно обнаружить продукты липоксигеназного окисления: 12-гидроксиэй-козатетраеновую кислоту и 12,20-дигидроксиэйкозатетраеновую кислоту (В.В. Безуглов и соавт.,1989). Кроме того некоторые авторы указывают на возможность образования в спленоцитах продуктов циклооксигеназного окисления и наиболее вероятным

из них считают РСЕ*. Мы поставили задачу показать наличие или отсутствие синтеза простагландинов в указанных условиях, используя разработанный нами метод определения циклооксигеназных метаболитов аа. Анализ экстракта из инкубационной среды спленоцитов, стимулированных добавлением арахидоновой кислоты, обработанного дансилгидразином, проводили с помощью микроколоночной ВЭЖХ. При этом не было обнаружено веществ, совпадающих по времени удерживания со стандартами простагландинов.

. После апробации метода на примере спленоцитов мы приступили к изучению каскада арахидоновой кислоты в лимфоцитах человека.

В первой серии экспериментов был изучен состав продуктов каскада эндогенной арахидоновой кислоты, выделяемых лимфоцитами в среду инкубации без добавления каких-либо стимуляторов. Так ке как и в случае спленоцитов, первоначально анализ экстракта инкубационной среды лимфоцитов, обработанного дансилгидразином, проводили с помощью микроколоночной хроматографии. Веществ, совпадающих со стандартами простагландинов, обнаружено не было. Для анализа продуктов липоксигеназного окисления использовали ВЭЖХ с детектированием при 234 нм (моно-гидроксиэйкозатетраеновые кислоты) и 278 нм (лей-котриены и дигндроксиэйкозатетраеновые кислоты). При этом был обнаружен единственный продукт, детектируемый при 234 нм. Содержание этого продукта в образце увеличивалось в 5-7 раз при инкубюации лимфоцитов в присутствии экзогенной арахидоновой кислоты, что позволяет отнести его к эйкозаноидам (рис. 3). Время удераивания этого вещества при ВЭЖХ на обращенной фазе полностью совпадало со временем удерживания

9

КАНЕТЕ

Рис.3 Синтез 12-НЕТЕ иэ эндогенной арахидоновой кислоты (а) и при добавлении 1,5 мкг/4 х 107 клеток экзогенной арахидоновой кислоты (б). (DuPont 6800, UV 234 нм, колонка Separon С18 (4 х 250 мм), скор. 1 мл/мин., метанол- вода -укс. кисл., 75:25;0,02).

стандартного образца 12-НЕТЕ. Не было отмечено образования в детектируемых количествах ни веществ, содержащих триеновый хромофор (леякотриенов и дигидроксиэйкоэатетраеновых кислот) , ни липоксинов, содержащих тэтраеновый хромофор. Отсутствие простагландинов и тромбоксана в среде инкубации подтверждается также отсутствием на хроматограимах пика 12-гид-роксигептадекатриеновой кислоты, образующейся при распаде промежуточной эндоперекиси простагландинов, и служащей индикатором циклооксигеказного окисления АА.

Таким образом, единственным продуктом окисления как эндогенной, так и экзогенной арахидоновой кислоты, выделяемым лимфоцитами человека в окружающую среду, является вещество, которому на основании приведенных данных была приписана структура 12-гидроксиэйкозатетраеновой кислоты. Отсутствие в исследуемом объекте циклооксигеназных продуктов позволило упростить анализ, осуществляя ВЭЖХ с детектированием немодифицированных эйкозаноидов по поглощению в УФ-области спектра.

Известно, что 12-НЕТЕ образуется в тромбоцитах, поэтому при выделении лимфоцитов нами была использована специальная процедура, позволяющая снизить содержание тромбоцитов в клеточной суспензии. По данным микроскопии используемая нами для экспериментов суспензия лнмфоцнтоз человека не содеряала свободных тромбоцитов, а число прикрепившихся к лимфоцитам кровяных пластинок не превышало 1-3 пластинки нз 1 лимфоцит. Отсутствие продуктов циклооксигеназкого окисления в среде инкубации свидетельствовало о Функциональной неактивности

прикрепизшихся к лимфоцитам кровяных пластинок, кроме того, не было отмечено корреляции между,холичестзом 12-НЕТЕ, обра-

оставшейся в суспензии лимфоцитов человека при добавлении арахидоновой кислоты, и количеством тромбоцитов в этой суспензии (данные не приведены). Поэтому мы полагаем, что 12-НЕТЕ, обнаруживаемая в среде инкубации лимфоцитов человека, является продуктом действия липоксигеназы лимфоцитов, а не тромбоцитов. Следует отметить, что присутствие в инкубационной среде конканавалина 'А. активирующего лимфоциты, приводило к увеличению уровня 12-НЕТЕ в среде инкубации в 3 раза.

11.2 Изучение влияния ганглиозидов на липоксигеназиое

окисление арахидоновой кислоты в лимфоцитах человека.

Ранее в лаборатории химии липидов ИЕХ АН СССР было показано, что ганглиозиды модулируют активность НК-клеток в смешанной популяции лимфоцитов человека (Э.В. Дятловицкая и соавт., 1987). Для выяснения возможной связи этого эффекта ганглиозидов с влиянием на каскад арахидоновой кислоты мы изучили действие ганглиозидов в»!, аь и С0з на липоксигеназиое окисление зрахидоновой кислоты в лимфоцитах " человека. Было установлено, что все три ганглиозида при добавлении в инкубационную среду стимулировали секрецию 12-НЕТЕ, как в отсутствие, так и в присутствии экзогенной арахидоновой кислоты (рис. 4). Наименьшей стикулируюцей активностью обладал основной ганглиоэид сыворотки хроаи СМа. Наиболее активным стимулятором повниэния уровня 12-НЕТЕ оказался ганглиоэид бОэ, который, в среднем, 1мл в 2 раза более активен, чем ганглиозид смз и в 1,5 раза - чем ганглиоэид СМ1.

стимуляция, X от контроля

500

400

300

200

100

донор 1 донор 2 донор 3 донор 4 донор 5

ЕИсш в сиз ЕЗсоз

стиму/шиия, % от контроля

донор 1 донор 2 донор 3 донор 4 донор 5

ЕЗси, ЕЯомз 111003 •

Рис.4 Влияние ганглиоэидов на синтез 12-НЕТЕ в лимфоцитах человека. Лиифоциты иккубировали с ганглиоэидами (50 ни/мл) в течение 30 мин при 37*С (а) или с ганглиоэидами и затем в течение 10 мин с арахидоновоя кислотой (1 ыкг/«л) (б). В экспериментах использовали лимфомассу индивидуальных доноров (контроль - 100 %).

Таким образом, исследованные ганглиозиды можно расположить в порядке возрастания стимулирующей активности в следующий ряд: вОэ>0М1>сМэ.

Ограниченное количество лимфомассы не позволило проводить параллельные опыты с одним и тем же образцом клеток, однако каждый эксперимент по изучению влияния того или иного ганглиозида на образование 12-НЕТЕ в лимфоцитах человека проводили не менее 5 раз, используя каждый раз лимфоциты, выделенные из крови индивидуальных доноров. При этом отмечены значительные вариации абсолютных значений стимулирующей активности ганглиозидов от опыта к опыту, что связано, по-видимому, с различиями в состоянии лимфоцитов, полученных от индивидуальных доноров. Однако общая тенденция ганглиозидов стимулировать образование 12-НЕТЕ обнаруживалась в подавляющем большинстве опытов (27 из 30). .

Ранее в ИБХ АН СССР было показано, что ганглиозиды ои , вМа и СОа модулируют липоксигеназное окисление в лимфоцитах селезенки мыши, причем указанные ганглиозиды также увеличивали количество образующейся 12-НЕТЕ (В.В.Безуглов и соавт., 1989). Поэтому изменение количества этой гидроксикислоты в популяции линфоядных клеток может иметь важное Физиологическое значение.

На основании приведенных данных можно высказать, предположение, что механизм иммунномодулмрующего действия ганглио-- зидов, может включать их влияние на каскад арахидоновой кислоты в нммуннокомпетентных клетках.

ВЫВОДЫ

1 Синтезированы новые Флуоресцентные производные эйкоза-ноидов - дансилгидразиды простагландинов, тромбоксана Вг и

некоторых гидроксиэякозатетраеновых кислот, а такие оксимы дансилгидразидов РбЕ! , б-кето-рсГ1 «I и ТхВг, бензоилгидраэид РСЕ1 , динитрофенилгидразид РСЁ1, амиды дансилкадаверина и РвЕ* , к-(2-аминоэтил>-5-динетиламинонаФталин-1-сульфокамида и РСЕг .

2.Разработан эффективный способ твердофазной экстрации эйкозаноидов на мини-колонках, содержащих ЗоЛаэогЬ С8.

3.Разработан новый метод определения профиля эйкозаноидов в биологических образцах с помощью микроколоиочной ВЭЖХ их дансилгидразидов и аналитической ВЭЖХ.

4. Установлено, что основным метаболитом арахидоновой кислоты в лимфоцитах человека является 12-гидроксиэйкозатетраеновая кислота.

5. Показано, что ганглиозиды СИ1,сМз и ее» стимулируют образование 12-гидроксиэйкозатетраеновой кислоты в лимфоцитах человека, причем наиболее активный стимулирующий эффект оказывает ганглиозид БСз.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. В.В.Безуглов, Н.М.Грецкая, Г.С.Когтева, Е.М.Маневич, Е.В.Королева, Б.Г.Беленький, Ю.Э.Лилле, Л.Д.Бергельсон Анализ простагландинов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии их дансилгидразидов. - Докл. Акад. Наук СССР, 1989, т.308, X*1, стр.231-234.

2. В.В.Безуглов, Е.В.Фомина-Агеева, Н.М.Грецкая, Е.В. Крюкова, ЭЛ. Дятловицкая, Л.Д. Бергельсон Ганглиозиды модулируют липоксигеназное окисление в лимфоцитах человека. - биохимия, 1991, т.56, вып. 2, стр. 267-272.

3. H.M.Грецкая, В.В.Беэуглов, Е.М.Маневич, Jl.Д.Бергельсон Синтез флуоресцентных производных эйкозаноидов, содержащих дансильный флуорофор. - IV Всесоюзная конференция "Синтез и исслед. простагландинов". Тезисы докл, 1989, Минск, с.125.

4. Е.В.Фомина-Агеева, Н.М.Грецкая, Е.Н.Королева, В.В.Беэуглов, Д.Д.Бергельсон Твердофазная экстракция продуктов окисления арахидоновой кислоты из биологических объектов. -XV Всесоюзная конференция "Синтез и исслед. простагландинов". Тезисы докл, 1989, Минск, с.124.

5. Б.В.Розынов, О.С.Решетова, Н.М.Грецкая, Д.В.Куклев, И.В.Серков, В.В.Беэуглов Современные " методы ионизации в масс-спектрометрии эйкозаноидов и их производных. - IV Всесоюзная конференция "Синтез и исслед. простагландинов". Тезисы докл, 1989, Кинск, с.126.

6. Н.М.Грецкая, Е.М.Королева, В.В.Беэуглов, Б.Г.Беленький, Д.Д.Бергельсон Иикроколоночная ВЭЖХ дансилгидразидов эйкозаноидов. - новый высокочувствительный метод анализа профиля продуктов каскада арахидоновой кислоты. - XV Всесоюзная конференция "Синтез и исслед. простагландинов". Тезисы докл, 1989, Кинск, с.131.

7. V.P.Shevchenko, V.V.Bezuglov, N.M.Gretskaya, G.S.Kog-teva, E.M.Manevich, N.F.Myasoedov Synthesis of fluorescent derivatives of tritium labelled prostaglandins. - Proceedings of the third intern, symposium. Insbruck', Austria, 1988, July, pp. 17-21.

/

Соискатель

Тир.100 экз., МП "Зевс"