Модификация природных полиеновых кислот и синтез на их основе ациклических эйкозаноидов и родственных соединений тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. Л1.'М. Шемякина

На правах рукописи КУКЛЕВ Дмитрий Владимирович

МОДИФИКАЦИЯ ПРИРОДНЫХ ПОЛИЕНОВЫХ кислот И СИНТЕЗ НА ИХ ОСНОВЕ АЦИКЛИЧЕСКИХ ЭЙКОЗАНОНДОВ и РОДСТВЕННЫХ СОЕДИНЕНИЙ

02.00.10 — Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

I

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 1992

Работа выполнена в ордена Трудового Красного Знамени институте биоорганической химии им. М. 'М. Шемякина Российской академии наук.

канд. хим. наук, ст. 'науч. сотр. ИБХ РАН В. В. Безуглов.

и. о. зав. группой химии .липидов ИБХ им. М. М. Шемякина

канд. хим. наук В. Л. Христофоров, зав. лабораторией, В'НИВИ — НПО «Витамины».

Ведущее предприятие: Институт физиологически активных веществ РАН.

Защита состоится 14 октября 1992 г. в 10 часолз на'заседании специализированного совета Д 002.35.01 при институте биоорганической химии им.' М. М. Шемякина РАН, 11787'!, ГСП-7, В-437, Москва, ул. Миклухо-Маклая 16/.10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института биоорганической химии им. М. М. Шемякина РАН.

Автореферат разослан « » Ученый секретарь специализированного совета Д 002.35.01

Научный руководитель

Официальные оппоненты: докт. хим. наук 10. Г. Молотковский,

РАН,

канд. хим. наук В. А. Несмеянов.

и-

Актуальность работы ' .

В последнее время активно идет поиск альтернативных пищевых источников, в том числе- и за счет использования нетрадиционного пищевого сырья. Большое внимание исследователей призлек Факт неожиданно сильного влияния (п-з)-ПНЖК, характерных для морепродуктов, на состояние здоровья человека. Это вызвано тем, что ПНЖК такого строения способны вовлекаться в каскад арахидоновой кислоты, образуя соединения, отличающиеся по своему биологическому действию от продуктов окислительного метаболизма арахидоновой кислоты. Однако эти соединения, в своем большинстве, недоступны в настоящее время для проведения широких биологических исследования. Таким образом, одной из актуальных задач современной биоорганической химии является синтез модифицированных ("необычных") ПНЖК и продуктов их окислительного метаболизма для изучения возможного участия этих соединений в окислительной биотрансформации в организме млекопитающих и регуляции физиологических процессов. Цель работы.

Разработка способов получения и синтез полиеновых жирных кислот и их ациклических окисленных производных в препаративных количествах для проведения биологических испытании.

*/ В руководстве работой принимал участие к.б.н. Н.А.Латышев.

Список основных сокращений: ВЭЯХ - высокоэффективная жидкостная хроматография; ЖК - жирные кислоты; СЖК - смесь жирных кислот; ПНЖК - полиненасыщенные жирные кислоты; АК- полностью цис-5,8,11,14,-эйкоэатетраеновая кислота; ЭПК - полностью цис-5,8,11,14,17-зйкозапентаеновая кислота; ДГК - полностью цис-4,7,10,13,16,19-докоэагексаеновая кислота; ОДПК - полностью цис-3,б,9,12,15-октадекапентаеновая кислота; ОДТрК - полностью цис-5,9,12-октадекатриеновая кислота.

Научная новизна

Разработан новый метод выделения ПНЖК комбинацией иодлактониэации и хроматографических процедур. Предложен аналитический вариант иодлактониэации, позволяющий идентифицировать в природных смесях, жирных кислот полиеновые кислоты с ближним к карбоксилу положением двойной связи. В ходе работы впервые синтезированы, путем модификации природных ПНЖК, ряд их моноацетиленовых аналогов. Впервые осуществлен синтез зг,бг,92,127,15г-октадекапентаеновой кислоты и идентифицированы основные продукты ее липоксигеназного окисления. Впервые проведено С»-элонгирование основных природных высоконенасыщенных жирных кислот.

Практическая ценность работы.

В ходе работы разработана модифицированная методика иодлактониэации, позволяющая выделять из природных источников препаративные количества дельта-4 и дельта-5 жирных кислот высокой чистоты. Были синтезированы предшественники для получения высокомеченных тритием и углеродом-14 ПНЖК. а также ранее недоступные моноэпоксиды основных ПНЖК в виде свободных кислот.

Апробация диссертации.

Отдельные части настоящего исследования были представлены на III Международном симпозиуме по органическим соединениям, меченных радиоактивными изотопами, Марианске Лазне (Чехословакия, 1988), на Всесоюзном совещании "Биологически активные вещества при комплексной утилизации гидробионтов" (Владивосток, 1988), на Всесоюзной конфег "*нции "Синтез и исследование простагландинов" (Минск, 1989), на Совётско-

Индийском симпозиуме по химии природных соединения (Рига,1989), на Всесоюзном совещании по проблеме "Физиологически активные соединения меченные радиоактивными и стабильными изотопами" (Звенигород, 1991). Публикации.

По материалам диссертации имеется 13 публикаций и 2 авторских

свидетельства.

Объем работы.

Диссертация изложена на 153 страницах машинописного текста, включает 9 таблиц, М рисунка, и состоит из введения, обзора литературы, результатов исследования и их обсуждения, экспериментальной части и выводов. Список литературы содержит 142 ссылки.

I-Разработка условия проведения реакции иодлактонизации в препаративных масштабах.* *

1.1. Выделение дельта-4 я дельта-5 ПШК методой иодлактонизации. Впервые реакцию иодлактонизации для разделения природной смеси жирных кислот применил Э.Дж.Кори, он описал синтез иодлактонов арахидоновоя (I), эйкозапентаеновой (и) и докозагексаеновой (Ш) кислот (См. Рис. 1). Он же показал, что образующиеся нейтральные иодлактоны природных ПНЖК могут оыть отделены от непрореагировавших ЯК и затем восстановлены в исходные ПНЖК.

**/ Структуры всех соединений, синтезированных в работе, подтверждены данными 1н-ЯМР (отнесения всех сигналов сделаны на основании экспериментов по селективному подавлению протонов)■ масс-спектрометрии производных, УФ- и ИК-спектроскопии. Идентичность стандартам и индивидуальность потдверждаласъ с использованием капиллярной газо-жидкостной и обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии .

\=/\=/\=-У\ (III)

(II)

Рисунок 1. Иодлактоны природных ПНКК.

В то же время, автор указал что выбор оптимальных условий для

выделения индивидуальных ПНЖК из природных смесей ЖК, с

использованием этого подхода, требует значительной

экспериментальной работы. В этой связи мы провели сравнительное

изучение скоростей образования иодлактонов различной структуры

(i, и, iii, iv) и их восстановления а исходные ПНЖК в

зависимости от условий реакции. Процесс выделения из

биологических объектов ПНЖК, образующих иодлактоны (например,

О

ДГК, ЭПК, АК, ОДТрК), состоит из 4 стадий:

1) получение иодлактонов природных полиеновых жирных кислот;

2) отделение полученных иодлактонов от непрореагировавших жирных кислот с помощью хроматографии;

3) хрсматографическое разделение I до-гамма- и иодо-дельта-лактонов; "

1) восстановление индивидуальных иодлактонов в исходные ПНЖК.

г.;'. Синтез иодлактоновПНЖК.

Опираясь на литературные данные относительно механизма реакции иодлактонизации и на ее кинетическое уравнение реакции второго порядка по иоду и собственные ?

экспериментальные данные мы считаем, что реакцию необходимо проводить максимально быстро, не вводя, однако, в реакционную смесь большого избытка иода. С другой стороны представляется затным использобэть для этой реакции высокополярнье среди !еоду, спирт), т.к. применение менее полярных растворителей (тетрагидрошуран, диоксан) неоптимально (См. Рис Я).

% Ж)ДЛ'»КТ<)И.Ч

И|ч'ми реакции, МИ11.

Рисунок я. Кинетические кривые реакции иодлактонизации эйкозапентаенопой кислотн п растворе о) вода этанол (Ж):П, Я зкв кнсоп , Л экв Ь рекомендуемые нами условия; «) иода тетрагидрофуран (1:1), я экв кжмь, 12 экв кь условия Кори; +) вода диоксан (-1:1), я экв кипь , ул экп кь.

Кроме" того, необходим^ быстрое удаление образующегося лабильного иодлактона из агрессивной реакционной среды. Вышеперечисленные соображения привели нас к идее проведения реакции иодлактонизации в двухфазной системе п гьптан эдно спиртовая фаза с малым избытком кнго3 (?. л кв) и постепенным прибавлением насыщенного раствора иода в спирте. При такой процедуре образующийся нейтральный иодлактон переходит в органический слой «гептана, в котором растворимость иопа принебрежигельно мала. Таким образом нам удалось достичь стабильных высоких выходов иодлактонов: до 90% очищенного продукта на дельта-4 кислотах, например, ДГК и до «о* - на дельта-5 кислотах, например, ОДТрК.

Проведение реакции в условиях кинетич ского контроля позволяет дифференцировать дельта-4 и дельта ь ПНЖК за счет значительно большей скорости образования иодо гамма лактона по сравнена с иодо-дельта лактоном. Так, при проведении реакции иодлактониэации смеси ПНЖК при соотношении ДГК-ЭПК 1:1 (моль/мс 1ь> добавление о.8 экв 1« (в расчете на ДГК) приводит к образованию смеси иодлактонов состоящей из иодлактонов ДГК и ЭПК в соотношении 95:5, а при добавлении 1.3 экв ь (в рассчете на ДГК), в смеси непрореагировавших ЯК, содержится только ЭПК. Таким образом', поя1 ляется возможность селективно извлекать из смеси жирных кислот как кислоты с дельта-4 положением авоиной связи, так и кислот с дельта-5 положением пвойной связи, а также получать смеси ПНЖК с заранее эаланным соотнош нием компоне! :ов, что особегчо важ..о при создании искусственных диетических смесе ..

1.л. Отделение иодлактонов от непрореагировавгаин.Щи Ключевым моментом в схеме получения чистых дельта-4 и дельта '> полиеновых кислот является отделение непро^еагировавших ЖК от иодлактонов. Сопутствующие ЖК, доля которых, в зависимости от источника, может состазлять до 75-яп%, в процессе реакции частично пере!; .спределяются в органический слой двухфазной системы (см. 1.2), что существенно затрудняет очистку иодлактонов и вызывает значительный расход сорбента при хроматографии. Мы разработали процедуру удаления сопутствующих ЖК из гептанового слоя реакционен смеси промывкой последнего свежеприготовленным раствором .4.5% N8! г.Оз в 40% водном этаноле, что снижало их содержание до следовых количеств. Такой подход к очистке иодлактонов от непрореагировавших ЖК позволил единовременно вводить в реакцию более зоо г исходных ЖК и выделять более 60 г чистых иодлактонов на обычном лабораторном оборудовании.

1-4 Хроматографическое разделение иодлактонов и восстаноплениэ их в исходные жирные кислоты-Для препаративного хроматографического разделения иодо-гамма- и иодо-дельта-лактонов на силикагеле мы исполь-аовали градиентную смесь эфира (О -> 10%) с сухим бензолом. Предложенная система раствор телеи позволяет получать чистые иодо-гамма- и 1.эдо-дельта-лактоны (чистота по данным ВЗЖХ анализа не менее '(5%). В данной системе иодо-гамма-лактон ДГК (III) --люируется первым, а иодо-дельта-лактон [иодлактоны АК (I) или ЭПК (11)1 вторым.

Восстановление иодлактонов в исходные ЖК при обработке иодотриметилсиланом в сухом ацетонитриле проходит быстро и

«

количественно. Использование в качестве реагента заранее приготовленного иодотриметилсилана, с нашей точки зрения, лучше и удобнее применения образующегося ¡.п мНи реагента. Мы провели сравнительное изучение скоростей восстановления иодо дельта и иодо-гамма-лактонов. Установлено, что различие в скоростях восстановления весьма значительно, причем иодо-гамма-лактоны значительно устойчивее иодо-дельта-лактонов. Это открывает возможность селективного восстановления подо-дельта лактонов в присутствии иодо-гамма лактонов и получения из смеси иодлактонов чистых препаратов ПНЖК.

Так, при селективном восстановлении иодлактона АК (П в смеси с иодлактоном ДГК (111) в соотношении 1:) (моль/моль) обработкой о.73 экв иодотриметилсилана (в рассчете на иодлактон арахидоновой кислоты) была получена смесь АК/ДГК в соотношении 96:4.

I■ Хроматографическое разделение жирных кислот, не вступивших в реакцию иодлактонизации.

Разработанные нами условия "мягкой иодлактонизации" позволяют выделять в препаративном масштабе некоторые важные полиеновье жирные кислоты, не образующие иодлактоны. Наибольший интерес для нас представляли полностью цис~б,9,]2,15-октадекатетраеновая кислота и полностью цис-7 , ю, 13 , .16,19-докозапег-аеновая кислоты. После стандартной обработки (удаление ЖК, образующих иодлактоны) смеси полие >вых ЖК рыбьего жира их содержание в остаточной смеси ЖК достигало 26% и соответственно. Препаративной обращенно-фазной

хроматографией выделили указанные ЖК с чистотой не менее 96% в граммовых количествах.

1.6. Аналитическая иодлактонизация.

Оптимизация условии образования иодлактонов ПНЖК и их регенерации в исходные ЖК дала возможность применить эту реакцию в аналитическом варианте. Аналитическая процедура, предложенная нами, состоит в сопоставлении гаэо-жидкостных хроматограмм исходной СЖК, остаточной смеси ЖК после исчерпывающей иодлактонизации и СЖК, регенирированной из иодлактонов. Для полноты характеристики, регенерированные ЖК исследовали хромато-масс-спектрометрически в виде полученных из них пирролидидов.

IX. Ацетиленовые полиеновые жирные кислоты.

Нами осуществлен синтез 5,6-дегидро-ОДТрК (5,б-ДГ0ДТрК), 5,6-дегидро-АК (5,6-ДГАК), 5,6-дегидро-ЭПК (5,6-ДГЭПК), 4,5-дегидро-ДГК (4,5-дгдгК) - важных инструментов в исследовании процессов окислительного метаболизма жирйых кислот и необходимых стартовых соединениий при получении высокомеченных тритием ПНКК - из природных ОДТрК, АК. ЭПК и ДГК.

Обработка иодом природных смесей ПНЖК из различных источников (СЖК рыбьего жира, СЖК печени крупного рогатого скота, СЖК кедрового масла) приводила с высоким выходом к иодлактонам АК (i), ЭПК (и), ДГК (iii) и ОДТрК (iv). Метиловые эфиры 4,5-эпоксикислот (Уа) из иодо-гамма-лактонов и метиловые эфиры 5,6-эпоксикислот из иодо-дельта-лактонов ключевые продукты в синтезе ацетиленовых ЖК - получали из соответствующих иодлактонов реакцией с н^э N в Меон. Для полного и чистого превращения метиловых эфиров соответствующих эпоксикислот (Уа-11) в сумму изомерных бромгидринов {VIа-гз) нами предложена в качестве реагента концентрированная

бромистоводород. ая кислота в двухфазной системе с гептаном. Хроматографически очищенные бромгидрины окисляли далее до соответствующих бромкетонов (уца-а) реактивом Джонса.

Хроматографически очищенные бромкетоны (УНа-Л) обрабатывали далее тозилгидразином в кислых условиях с образованием целевых соединений. Таким образом получали ацетиленовые ПНЖК (УШа-а) с выходом 17-20% и чистотой ьо-65% по данным ГЖХ; в качестве примесей (до 10%) идентифицированы алленовые соединения (1Ха-а) (См. Рис. -Л . Индивидуальные ацетиленовые эфиры выделяли препаративной обращенно-фазной

вэжх.

Вг ОН

\1lb-d

а) СН,-СН,-С01>Ме Ь.е.<1) К,= (СН^-ГООМ«

1<=

Рисунок 3. Синтез аце-иленовнх ПНЯК.

Таблица 1. Масс-спектрометрическая фрагментация пирролидидов ЭПК, 5,б-ДГЭПК; ДГК, 1,5-ДГДГК.

Структурный Фрагмент Ионы (п/2) в спектрах кислот:

ЕР.\ 5,6-ЭНЕРА ОНА 4,5-ОНРНЛ

[М)' 355 353 381 379

[М- ЕМ' 326 324 352 350

[М- Е): (СН=СНСН2 ) ] * 286 284 312 310

[М- Е»: (СН^СНСНг ) г ]♦ 246 244 27 2 270

[М ЕЬ(СН=ГНСН2)1 !• 206 204 Г 32 230

(М - ЕКСН=СНСН2)» 166 164 192 190

[М- ЕЛ (СН=СНСНг ) •> ] • — - --- 152 149

Таблица 2. Масс-спектрометрическая Фрагментация пирролидидов 5,9,12-октадекатриеновой кислоты(ОДТрК), 5,6-ДГОДТрК.

Структурный фрагмент Ионы (га/г) в спектрах кислот:

ОДТрК 5,6-ДГбДТрК

[М]' 331 329

[М- С3Н1 1 ]♦ 260 258

С5Н1 1 (СН=СН) ]♦ 234 232

[М- С1Н11 <СН=СН)СН» ]4 220 21Я

[М- Сз Их X (СН=СН)СН2 (СН=СН) ]♦ 194 192

[М- СзНх 1 (СН=СН)СН2 (СН=СН)СН2СН2 ]' 166 164

[М- С5 Н1 1 (СН=СН)СН2 (СН=СН)СН2 СНг (СН=СНП* 140 ---

[М- СзНи (СН=СН)СН2 (СН=СН)СН2С.Н2 (СеС) ]♦ --- 140

Рисунок 4. Идентифицированные эфира алленовых ПНЖК, образующиеся при синтезе эфиров ацетиленовых ПНЖК.

Синтезированные нами моноацетиленовые жирные кислоты были

использованы для получения селективно меченных высокопроцентным

тритием ПНЖК. Молярная радиоактивность этих препаратов

составляла 1.5 - 1.8 ПБк/моль.(Опыты с.высокопроцентным тритием

проведены в ИНГ РАН д.х.н. Б.П.Шевченко).

Структуры синтезированных метиловых эфиров ацетиленовых ЖК (VIII а—с! I были подтверждены с помощью масс-спектрометрии полученных из них пирролидидов. что позволило точно определить положение двойных и тройной связи в молекуле (см. табл 1 и табл 2). Алленовым соединениям (по данным ИК, спектроскопии и масс-спектров пирролидидов) можно приписать следующие структуры (тха - для продукта из ДГК, 1\ь - для продукта из АК, 1Хс - для продукта из ЭПК и 1Х<э - для продукта из ОДТрК) (См. Рис. л.

1Т1. Синтез,подиеновых жирных кислот С2-элонгацией.

Потребность в получении препаративных количеств ряда ПНЖК (Хл-е) вызвана необходимостью систематического исследования их превращений в пищевых цепях, а также для выяснения возможности участия этих ПНЖК в кдчг-т,- альтернативных субстратов в каскаде арахидоновой кислоты.

Нами разработана схема и осуществлен синтез целевых ПНЖК (Хае) из природных ПНЖК путем удлинения углеводородной цепи на 2 атома углерода малоновым синтезом. Схема синтеза приведена на Рис 5. Исходный метиловый эфир ЖК восстанавливали алюмогидридом лития до соответствующего полиенового спирта, полученный спирт бромировали трифенилфосфин-дибромидом и вводили в реакцию малонового синтеза.

Я СООМе

V

Я^СН.Вг

к =

Ь)

1з

е)

Рисунок 5. С»-Элонгация природных ПНЖК.

Условия проведения малонового синтеза определялись низкой реакционной способностью полиеновых бромидов, их высокой лабильностью и склонностью к дегидрогалогенированию в присутствии сильных основании. Сущность предложенного нами метода заключается в реакции полиенового бромида с натрий малоновым эфиром (получаемым непосредственно перед опытом взаимодействием натрия со свежеперегнанным сухим диэтилмалонатом) в диглиме при температуре 140°с. Осуществить реакцию в обычных условиях (диэтилмалонат/бутилат натрия в бутиловом спирте, диэтилмалонат/этилат натрия в этиловом спирте при 25°с, диэгилмалонаг/бугиллигий в тетрагидрофуране при -бо°С> не удалось. Декарбоксилирование омыленного продукта реакции проводили действием соляной кислоты в диглиме. На этой стадии синтеза выход составил 92?б (применение серной, хлорной, уксусной и трихлоруксусной кислот приводило к быстрой деградации субстрата).

IV. Синтез эпокси-кислот, гидрокси-кислот и кетодиенов. Моноэпоксипроизводные. ПНЖК удобно синтезировать с использованием реакции Прилежаева. Обычно для этой реакции используют метиловые эфирь ПНЖК. Однако при омылении сложного эфира происходит расщеплением оксиранового цикла, что делает невозможным получение моноэпоксидов свободных ПНЖК. Для синтеза моноэпокси-кислот мы применили, ранее не описанное, прямое неселективное эпоксидирование полиеновой жирной кислоты мета-хлорнадбензойной кислотой с последующим хроматографическим разделением позиционных изомеров (См. Рис 6). Выход смеси моноэпоксидов зависит от условий проведения реакции; так

'.'ООН

I ООН

Н.У-КЬ"ГА

"ООН

11,1~-ЕЕТЛ

11,15-ЕЕТЛ

</оои

Рисунок 6. Синтез моноэпокси эйкозатриеновых кислот из АК прямым окисле ием т-хлорнадбензойноя кислотой (5,6-еета-полностыо цис-5,б-эпокси-8,11,14-эйкоэатриеновая кислота. 8,9-еета- полностью цис-а,9-эпокси-5,11,14-зйкозатриеновая кислота, 11,12-еета- полностью цис-11,12-эпокси-5,8,14-эйкозатриеновая кислота, 14,15-еета- ПОЛНОСТЬЮ ЦИС-14,15-ЗП0КСИ-5,8,11-эйкоэатриеновая кислота).

например, эпоксидирование в спирте протекает гладко, и приводит к целевым продуктам с выходом до 45%.

Для синтеза гидроксикислот и кетокислот мы разработали схему, позволяющую использовать синтезированные моноэпоксиды и состоящую в их расщеплении с образованием соответствующих бромгидринов, окислении полученных бромгидринов до бромкетонов (см. п. II), дегидрогалоидировании последних действием 1,7-циазобицикло[5.4.0]ундек 7 вна приводящем к кетолиеновым гоедннениям, и дальнейшем восстановлении

I г.

„СООМе

< ООМе

'."ООМн

НО Вг

ССЮМе

СОСШе

ш

СООМе

У

Ме 11-КЕТЕ

СООМе

соим-

СООЫе

,00 ОН

12-НЕТЕ

Рисунок 7. Синтез кетокислот и гидрокси кислот с использованием "бромкетонного" подхода на примере синтеза 11-КЕТЕ, 11-НЕТЕ, 12-кете. 12-нете - 11-0КСО И М-ГИДроКСИ-бй,8г,12е,142-эйкозатетраеновые кислоты, 12-оксо и 12-гидрокси-52.8г,юе,147.-эКкозатетраеновые кислоты соответственно.

1 7

полученных кетодиенов в соответствующие гидроксикпслоты действием боргидрида натрия в этаноле (которые далее разделяли хроиатограшически). Такая последовательность стадии синтеза определялась рядом обстоятельств. Дегидрогалоидиропание незащищенных бромпшринов приводит к регенерации исходных эпоксидов. Применение же защитных групп (ацетильной, триметилсилильно!) или диметилтретбутилсилильнои) существенно замедляет скорость основной реакции, а реакционная смесь загрязняется большим количеством неидентианщируемых продуктов. Примечательная особенность разработанной нами схемы состоит в том что при образовании бромкетона увеличивается реакционная способность соединения к дегидрогалоидированию и полностью предотвращается возможность изомерного дегидрогалоидирования (См. Рис 7). Дегидрогалопдирование бромкетонов проходит за ь-10 мин, а выход реакции практически количественный. Кроме того, открывается простой путь к получению препаративных количеств кетодиеновых -пкозаноидов - мало изученных биологически активных продуктов окислительного метаболизма ПНЖК. По разработанной нами схеме удалось синтезировать все изомеры диеновых гидрокси-кислот и кетодиенов из арахидоновой, эйкозапентаеновой и докозагексаеновой кислот.

У.. Синтез .17,, 6Z, 9z, 12Z, i Моктадекапентаеновойкислоты.

Для исследований жирнокислотного состава липидов из морских источников и изучения метаболизма высоконенасыщенных жирных кислот С18 семейства необходимы препаративные количества высокочистой ОДПК (XIX), структура которой до настоящего времени не была подтверждена встречным синтезом-

Нами разработан простоя метод синтеза ОДПК в препаративных количествах из природной ДГК с хорошим выходом, гарантирующий

сохранение цис конфигурации двойных связей и их природное

расположение (См. Рис 8). Иодлактон Д"К (III) превратили в I.'»

эпокси-производное метилового эфира £ГК uva). Последний

расщепили обработкой йодной ki потой и далее окислили образовавшийся альдегид (хт) до ОДПК (ч;п).

Рисунок 8. Синтез ОДПК.

Физико-химические данные поученной нами ОДПК совпадали с характеристиками, полученными ранее для киспоты. выделенной из 'риродных источников-

Разработанный нами синтез был успешно применен для получения ОДПК в количествах, достаточных для проведения широких биологических испытаний.

I о

VI. Изучение продуктов липоксигенаэногр окисления )•/,(./,<)/., )?.7,,),ул октадекапентаеновой кислоты.

Синтезированная нами ОДПК является предельно ненасыщенной жирной кислотой нормального строения С1н семейства. Наличие 1 диалли ьных атомов углерода и аллильного атома углерода в альфа положении к карбоксильной группе делают ">ту стг "ктуру уникальным объектом для изучения окислительного метаболизма. Известно, что ПНЖК С1й семейства являются основными полиеновыми жирными кислотам" высших растений, основным источником окисленных продуктов метаболизма жирных кислот в которых являются различные липоксигеназы. Поэтому было интересно изучить ферментативное окисление ОДПК 15 липо| игеназой соевых

Рмсунок .9. Липокси! -'Наэнор окисление ОДПК.

бобов. Мы провели исследование основных продуктов Ферментативного окисления. Установлено: процесс Ферментативного окисления ОДПК на первой стадии приводит к образованию лабильного гидропероксида (\1Т1). который в обычных условиях достаточно быстро деградирует до 1.3-оксо 37.. 6? , ч/ , 11 г тридекатетраеновои кислоты (XIV) (при восстановлении борогияридом натрия (хт\) легко превращается в 1 л гидрокхи .32, 67. , нг-тридекатетраеновую кислоту (\"\тт) , либо до 32,67,,47,, 1Н-: додекатетраеновои кислоты (XVIII иди

восстанавливается в I з-гидрокси .37 ,62, чу, 1 1 г, 1 Ъ7 октадекапента еновую кислоту (13-ноге) (л) (См. Рис п) . Увеличения выхода 13 -норе в этой реакции (выход яг>"о; конверсия ОДПК - до '>о%) , и полного предотвращения деградации углеродного скелета молекулы, удалось достичь необычным способом реакцию ферментативного окисления проводили в присутствии ю-кратного избытка боргидрида натрия.

Следует отметить, что лабильность структуры СДПК позволяет выявить обычно малозаметные процессы деструкции и трансформации углеродной цепи. Интересно, что подобную же деградацию, при липоксигеназном окислении испытывают и другие (п-з) кислоты -ДГК и ЭПК, но в 'значительно меньшей степени, и, что для арахидоновой кислоты ((п-£>) кислота! подобная деградация становится заметной только при проведении ферментативной реакции в атмосфере кислорода.

Выводы.

1. Разработан комплексный подход к выделению высокочистых ПНЖК комбинацией иодлактонизации и хроматографических процедур из природных смесей ЖК. Оптимизирован процесс селективной иодлактонизации. Разработан аналитический вариант иодлактонизации, позволяющий разделять жирные кислоты по расположению ближней к карбоксильной группе двойной связи.

2. Синтезирован ряд моноацетиленовых жирных кислот октадеканового, эйкозанового и докозанового семейств.

3. Подобраны реагенты и условия реакций для Сг-элонгации высоконенасыщенных жирных кислот малоновым синтезом.

4. Впервые синтезирована 3z,6z,9Z,12z,isz-октадекапентаеновая кислота и изучены основные продукты ее липоксигеназного метаболизма.

5. Разработана общая схема синтеза ряда ациклических эйкоэаноидов: эпоксикислот, кетодиеновых соединений, гидроксикислот и осуществлена их наработка в препаративных количествах.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

Ii В.П.Шевченко, И.Ю.Нагаев, Н.Ф.Мясоедов, Д.В.Куклев, А.Б.Имбс, Н.А.Латышев, В.В.Беэуглов.// Синтез меченных тритием арахидоновой и эйкоэапентаеновой кислот, содержащих метку у определенной двойной связи. Тез. докл. Iii Международного симпозиума по органическим соединениям, меченных радиоактивными изотопами., Марианске Лазне (Чехословакия); ноябрь 1988, с.34

Имбс А.Б., Гайдай Н.В., Куклев Д.В., Латышев H.A.// Химические методы получения чистых ПНЖК и некоторых эйкоэаноидов из жира сардины иваси. Тез. докл. ш Всесоюзн. совещан. "Биологически активные вещества при комплексной утилизации гидробионтов", Владивосток, 1988, с.47

з. Куклев Д.В., Латышев H.A., Фомина-Агеева Е.В., Беэуглов В .В.// Синтез новых эйкозаноидов о докоэакоидов из природных полиненасыщенных жирных кислот. - Тез. докл. iv Всесоюз. конф. "Синтез и исследование простагландинов". Минск. 1989. стр.82, ii Шевченко В.П., Нагаев И.В., Мясоедов Н.Ф., Куклев Д.В., Имбс А.Б., Латышев H.A., Беэуглов В.В.// Синтез меченных тритием эйкоза- и докозаполиеновых кислот. - Тез. докл. IV Всесоюз. конф. "Синтез и исследование простагландинов". Минск. 1989. стр.83.

IL. Б.В.Розьнов, О.С.Решетова, Н-М.Грецкая, Д.В.Куклев, И.В.Серков, В.В.Беэуглов// Современные методы ионизации в масс-спектрометрии эйкозаноидов и их производных. - Тез. докл. ш Всесоюзн. конферен. "Синтез и исследование простагландинов"., - Минск, 1989, , с.12б.

<L. Д.В.Куклев, " H.A.Латьшев, В.В.Беэуглов, В.П.Шевченко, Н.Ф.Мясоедов.// Выделение полиеновых жирных кислот из морских организмов и получение их меченных тритием аналогов. - Тез. докл. ix Советско-Индийского симпозиума по химии природных соединений. Рига 1989, с.106

7. Д.В.Куклев, В.П.Шевченко, Н.А.Латышев, В.В.Беэуглов. Синтез 4,5[!|н]-докоэагексаеновой кислоты// Тез. докл. ш Всесоюзн. совещан. по проблеме "Физиологически активные соединения меченные радиоактивными и стабильными изотопами". -Звенигород, 1991, с.19.

8. А.И.Филатова, Д.В.Куклев, В.П.Шевченко, В.В.Беэуглов. Получение изотопномеченньк гидроксиэйкоэаполиеновых кислот с использованием в качестве Ферментной системы - липоксигеназы соевых бобов. Тез. докл. ш Всесоюзн. совещан. по проблеме "Физиологически активные соединения меченные радиоактивными и стабильными изотопами". - Звенигород, 1991, с.30.

Gaiday N.V., Imbs А.В. , Kuklev D.V., Latyshev N.A. Separation of natural polyunsaturated fatty acids by means of j iodolactonization. - J.Amer.Oil Chem.Soc., 1991, v.68, N4, J p.230-233

j. 10. ImbB А.В., Kuklev D.V., Vereshchagin A.D., Latyshev N.A. Application of an analytical modification of the iodolactonization reaction to selective detection of d-5(d-4) unsaturated fatty acids. - Chemistry and Physics of Lipids, 1991, v.60, N»1, p.71-76

11. Д.В.Куклев, H. А.Латышев, В .В.Беэуглов. Синтез зг,бг,9г,12г,15г-октадекапентаеновой кислоты. - Биоорганическая ХИМИЯ, 1991, Т.17, Nolo, стр.1433-1436

12. Д.В.Куклев, В.П.Шевченко, И.Ю.Нагаев, Н.А.Латышев, В.В.Беэуглов. Синтез 4,5-дегидродокоэагексаеновой, 5,6-дегидроэйкозапентаеновой кислот и их селективно меченных тритием производных. - Биоорганическая химия, 1991, т.17, №11, стр.1574-1581

13. В.П.Шевченко, И.D.Нагаев, И.Ф.Мясоедов, Д.В.Куклев,

A.Б.Имбс, Н.А.Латышев, В.В.Беэуглов. Синтез меченных тритием арахидоновой и тимнодновой кислот, содержащих метку у определенной двойной связи. - Радиохимия, 1989, т.31, № 6., СТр. 119-120.

Hi. АС СССР № 165Ю67. Способ получения докоэагексаеновой, эйкозапентаеновоя и арахидоновой кислот или их смесей// Латышев Н.А., Имбс А.Б., Гайдая Н.В., Куклев Д.В., Касьянов С.П. Приоритет от 01.10.90

15i АС СССР № 1631942. Способ Получения [4,5-Зн]докоэагексаеновой и [5,б->н]тимнодоновой кислот.//Беэуглов

B.В., Куклев Д.В., Латышев Н.А., Шевченко В.П., Мясоедов Н.Ф., Нагаев И.Ю. Приоритет от 09.08.89