Синтез и изучение связи структура - активность новых производных генно-инженерных полиеновых антибиотиков, родственных амфотерицину B тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

4843790

На правах рукописи СОЛОВЬЕВА СВЕТЛАНА ЕВГЕНЬЕВНА

СИНТЕЗ И ИЗУЧЕНИЕ СВЯЗИ СТРУКТУРА - АКТИВНОСТЬ НОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫХ ПОЛИЕНОВЫХ АНТИБИОТИКОВ, РОДСТВЕННЫХ АМФОТЕРИЦИНУ В

02.00.10 - Биоорганичсская химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА, 2011

1 4 АГТР 2077

4843790

Работа выполнена в Учреждении Российской Академии Медицинских Наук Научно-Исследовательском Институте по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф.Гаузе

Научный руководитель:

доктор химических наук Олсуфьева Евгения Николаевна

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Ходонов Андрей Александрович кандидат химических наук Сумбатян Наталия Владимировна

Ведущая организация: Институт органической химии

им. Н Д. Зелинского РАН

Защита состоится « 04 » апреля 2011 г. в 15 часов на заседании Диссертационного Совета Д 212.120.01 при Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, пр. Вернадского, д. 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте http://www.mitht.ru

Автореферат разослан « марта 2011г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат химических наук,

старший научный сотрудник Лютик А.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ"

Актуальность проблемы. В последнее десятилетие все более остро стоит проблема лечения инфекционных заболеваний, вызванных грибковыми инфекциями, что обусловлено возрастанием числа пациентов с иммуносупрсссисй различного происхождения, а также развитием резистентности к применяемым препаратам. Полисновые антибиотики-макролиды находят широкое применение в медицинской практике для лечения как поверхностных, так и глубоких микозов благодаря своей высокой активности и широкому спектру действия. Нистатин Ai, партрицин А, пимарицин и другие противогрибковые антибиотики действуют местно, а амфотерицин В (АшВ), единственный из полиенов, используется для лечения глубоких системных микозов. Высокая гемато- и нефротоксичность, плохая растворимость в воде, низкая всасываемость из желудочно-кишечного тракта и целый ряд других побочных реакций стимулируют интенсивные поиски новых менее токсичных и более эффективных препаратов. Однако до последнего времени ни один из новых природных, полусинтстичсских или биосинтетических аналогов из группы полисновых макролидов, показавших преимущество перед «золотым стандартом» АшВ в эксперименте, не был внедрен в клинику. С развитием генной инженерии за последние годы появилась возможность получать новые активные полиеновые макролиды, которые могут быть использованы как сами по себе, так и в качестве стартовых соединений в химическом синтезе для создания новых противогрибковых препаратов с улучшенными фармакологическими характеристиками. Исследования в области получения и изучения связи структура-активность новых полиеновых структур расширяют фундаментальные знания о сайтах молекулы, ответственных за биологическую активность, и направленны на создание противогрибковых средств нового поколения.

Цель работы. Получение и изучение связи структура - противогрибковая активность новых аналогов генно-инженерных полиеновых антибиотиков, обладающих преимуществами перед родительскими антибиотиками.

Задачи: 1) Разработать методы препаративной очистки исходных сырцов генно-инженерных полиеновых антибиотиков BSG005, BSG003, BSG018, BSG019, BSG022 (представляющих собой аналоги АшВ и нистатина A¡); 2) разработать методы избирательной модификации функциональных групп (С(16)-карбоксильной группы или/и З'-аминогруппы) с сохранением основного скелета молекулы антибиотика, ответственного за противогрибковую активность; 3) получить новые моно- и дважды модифицированных производные на основе генно-инженерных полиенов S44HP, BSG005, BSG003, BSG022; 4) получить стабильные водорастворимые солевые формы новых полиенов; 5) изучить связь структура - активность в опытах in vitro и in vivo полученных соединений, отобрать наиболее перспективные для дальнейших исследований.

'Научный консультант Д.Х.Н., проф. Преображенская М. Н.

Научная новизна и практическая ценность работы. Разработан и осуществлен принципиально новый подход в создании препаратов группы полисновых макролидов следующего поколения, основанный на сочетании методов химического синтеза и генной инженерии. Получено 48 новых полусинтетических производных. Разработаны методы препаративной очистки исходных сырцов новых генно-инженерных антибиотиков-полиенов и методы их модификации по амино- и/или карбоксильной функциям. Осуществлен синтез moho-, и дважды модифицированных производных, замещенных одновременно по С(16)-карбоксильной группе и З'-аминогруппе остатка микозамина с использованием двух альтернативных методов: исходя из амидов или из З'-М-ацильных производных. Изучена противогрибковая активность производных антибиотиков-полиенов, различающихся между собой положением гидроксильных групп в полиольной области С(7) - С(10) агликонового фрагмента, заместителем при атоме С(16) внутреннего циклического гемиксталя и/или заместителем при З'-аминогруппе микозамина. Для углубленного изучения биологической активности наиболее активные соединений превращены в стабильные водорастворимые соли. Благодаря сочетанию синтетических и генно-инженерных методов получения полиенов впервые подробно изучено влияние расположения гидроксильных групп в области С(7) - С(10) на проявление биологической активности. В результате скрининга отобраны и изучены в опытах на животных 6 соединений, из которых 2-(Ы,К-димстиламино)этиламид S44HP, как наилучший, предложен для дальнейших исследований.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликованы 4 печатные работы в периодических изданиях, из них 2 статьи в журналах рекомендованных ВАК, 2 статьи в зарубежных журналах. Отдельные разделы диссертационной работы представлены на IX Научной школе-конференции по органической химии ИОХ РАН (Звенигород, 2006); 5-ой Объединенной конференции по медицинской химии (Порторож, Словения, 2007); IV Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009); Всероссийской конференции по органической химии (Москва, 2009); Международном симпозиуме ASOC "Успехи науки в области органической химии" (Мисхор, Крым, 2010).

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на^/стр. и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы. Содержит-^^ библиографических ссылок, Í9- рисунков, M схем, и таблиц и приложений.

Диссертационная работа выполнена в рамках сотрудничества с Норвежским Университетом Науки и Технологии (г. Трондхейм, Норвегия), а также поддержана грантом НИ! 5290-2010 и грантом РФФИ 10-03-00210а.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объектом настоящего исследования являются новые генно-инженерные полисновые макролиды: S44HP, BSG003, BSG005, BSG018, BSG019 и BSG022, созданные в Университете Науки и Технологии (г. Трондхсйм, Норвегия). Новые полнены были созданы в результате манипуляций генного материала на основе штамма продуцента нистатина А>, который содержит 4+2 сопряженных двойных связей и относится к группе тетраенов. Новые генно-инженерные полнены можно рассматривать также аналогами амфотсрицина В, поскольку они так же, как и АтВ, входят в группу гептаснов. Антибиотики различаются между собой присутствием в положении С(16) карбоксильной или метальной групп, а также числом и взаимным расположением гидроксильных групп в области С(7) - С(10) агликонового фрагмента (Рис 1, 2).

Необходимо было разработать методы препаративного получения высокоочищенных (до 95 -97% по данным ВЭЖХ) соединений, исходя из сырцов антибиотиков, т.к. препараты необходимы для первичного изучения биологической активности, а также в качестве стартовых соединений для последующей химической модификации. Работа по очистке и химической трансформации полисновых макролидов является нстривихтьной задачей, поскольку осложнена их ограниченной растворимостью в водных растворах и во многих органических растворителях, лабильностью в кислых и щелочных растворах, агрегацией, легкостью окисления кислородом воздуха и склонностью к изомеризации транс-диеновых фрагментов в цис-диеновые под действием света.

С целью получения серии новых полусинтетических производных необходимо было разработать методы химической модификации З'-аминогруппы микозамина и/или С(16)карбоксильной группы агликонового фрагмента полиеновых антибиотиков. Для выявления структурных особенностей каждого из полиенов, влияющих на активность, важно было изучить их в условиях in vitro и in vivo. Особый интерес представляло рассмотрение замены С(16)-карбоксильной группы на С(16)-метильную, С(16)-амидную, а также изучение влияния числа и расположения гидроксильных групп в области С(7) - С(10). Влияние этого полиольного фрагмента агликоновой части молекулы антибиотиков на противогрибковую активность ранее не изучалось. Важным аспектом исследований являлся отбор наиболее активных соединений, создание их водорастворимых форм и изучение в опытах на животных. Характеристика исходных генно-инженерных полисное.

В мировой практике антибиотики амфотсрицин В (1) и нистатин Ai (2) (Рас 1) производят в промышленных масштабах путем биосинтеза На основе штамма продуцента нистатина Ai (2) бактерии Slreptomyces noursei АТСС 11455 методами генной инженерии норвежскими учеными был создан мутантный штамм S. noursei GG5073SP с генетически измененной поликстидсинтетазой (ПКС) NysC. В результате, из-за отсутствия в домене сноилредуктазы

рекомбинантный штамм продуцировал гептаеновый аналог нистатина А1 - 28,29-дидегидронистатин А[ (544НР (3)) (Рис 2). Действие этого фермента в случае биосинтеза 2 приводила к образованию одинарной связи между атомами С(28)-С(29). Рис 1. Структуры применяемых е клинике амфотерицина В (1) и нистатина А¡(2) .

Иэ<4

(1) Амфогерицин В (АшВ)

(2) Нистатин Л1

Соединение 3 превосходило исходный 2 по противогрибковой активности в 2-10 раз в большинстве тестов in vitro, и имело более широкий интервал между максимально переносимой дозой (МПД) и средней летальной дозой (LD50) в опытах на животных по сравнению с 1 [И.Д. Трсщалин и др., 2005]. Появление дополнительной двойной связи С(28)-С(29) в полисновой части молекулы 2, по-видимому, усиливает взаимодействие антибиотика с мишенью микроорганизмов.

Рис 2. Структуры гепно-инженерных аналогов нистатина A¡.

он

(3) S44HP, R-COOII R (4) BSG005, RCH,

(5) BSG022, R=COOH

(6)BSG0Í!>, R=CII3

R (7) BSG003, R=COOH (8) BSG018, R-CII,

"fe

Инаетивация гена, ответственного за работу метилоксидазы Р/уяЫ, окисляющей С(16)-метильную группу в С(16)-карбоксильную, в рекомбинантном штамме-продуценте 844НР (3) -Л', помгас/, привела к образованию высокоактивного аналога 16-декарбокси-16-мстил-28,29-

дидегидронистатина А] - ВЯвООз (4) (Рис 2). Соединение 4 проявило меньшую токсичность по сравнению с 3 и 1 при равной противогрибковой активности [Т.ВпиЛкй й а1., 2008]. С(16)-Карбоксилсодсржащие генно-модифицированные полиены 5, 7 (Рис 2) были созданы на основе мутантного штамма-продуцента 3 (Рис 2). Инактивация работы цитохром Р450-зависимой монооксигеназы ЫухЬ на завершающей стадии биосинтеза 3 привела к блокированию реакции гидроксилирования С(10) в молекуле полисна и к образованию 10-дезокси-28,29-дидегидронистатина А] - В5С022 (5) (Рис 2). Инактивация дегидратазного домена в модуле 15 (ОН15) в ИКС NysJ путем сайт специфического мутагенеза позволило ввести дополнительную гидроксильную группу в положение С(9). В связи с изменением в данной области, участок С(9)-С(11) перестал распознаваться монооксигеназой и в

следствии этого положение С(10) не гидроксилировалось. Такая генная манипуляция привела к образованию 9-гидрокси-10-дезокси-28,29-дидегидронистатина А[ - ВЗОООЗ (7) (Рис 2). Их соответствующие С(16)-дскарбокси-С(16)-мстильныс аналоги - В5С019 (6) и В80018 (8) (Рис 2) получены так же, как и 4 путем блокирования работы С(16)-метилоксидазы ЫуаЫ. Таким образом, в нашем распоряжении были 3 пары новых генно-инженерных полисновых антибиотиков: 544НР (3) и В5С005 (4), В50022 (5) и В50019 (6), ВЗвООЗ (7) и В5С018 (8) (Рис 2). Внутри каждой пары заместитель при С(16) представлен карбоксильной или метальной группой, а каждая пара отличается от других пар и от АшВ (1) расположением гидроксильных групп в области С(7)-С(10) полиольной части агликона антибиотика. Это является уникальным матсри&том для изучения роли фрагментов структур данных генно-инженерных полисновых антибиотиков в проявлении биологической активности.

1. Разработка методов очистки генно-инженерных полисновых антибиотиков.

Образцы, предоставленных генно-инженерных полиенов (3-8) (Рис 2), представляли собой сырцы, выделенные после ферментации и содержащие различные примеси соединений как полиеновой, так и нсполиеновой природы. Суммарное содержание полиенов в сырцах определяли на основании спектроскопии их растворов в ОМБО (0.01 мг/мл) в УФ диапазоне и в видимой области (ВО) при длине волны 415 им. Для удаления примесей полиеновой природы применяли два подхода в зависимости от содержания целевого антибиотика и характера примесей. Первый подход заключался в прямой очистке смеси полиенов на хроматографической колонке с силикагелем. Метод был применим при содержании ключевого компонен та 80-85%. Нанесение сырца на колонку осуществлялось в смеси ОМР с СНСЬ (1:2 по объему), затем последовательно проводилась элюция СНСЬ и системой растворителей СНС13-МеОН-НгО-МШОН конц. (13:6:0.8:0.05). Второй подход использовался для очистки сырцов с меньшим содержанием целевого вещества (68-80%) или/и при наличии примесей близких по хроматографической подвижности к основному компоненту. Суть метода состояла в превращении исходного сырца в гидрофобное 1^-9-флуоренилметоксикарбонил (Ы-Ртос)

производное действием М-Ртос-1Ч-оксисукцинимидным эфиром (РтосОЭи) в присутствии EtзN или Ру в ВМБО и последующей очистки его на колонке с силикагелем. Дальнейшее удаление Ршос-группы действием пиперидина происходило с количественным выходом. На схеме 1 дан пример для антибиотика В50005 (4). В результате были получены образцы полиенов 4,6,8 95 -98% чистоты (ВЭЖХ, УФ/ВО). Схема 1. Схема очистки сьща 4.

1) Бшос-Ови, 01УВ0

(в8С005т-СНз-

ЫН2

2)Колоночная хроматография на силикагеле

(вЗОЮ!Н-СНз N

Пиперидин

БМЯО

НРтос

ВЗвООб- -сн3 ын2

4 (сырец) 9 4 (чистота 95-98%)

2. Модификация С(16)-карбоксильной группы полиеновых антибиотиков.

Для синтеза амидов в качестве конденсирующего агента был использован гексафторфосфат бснзотриазол-1-ил-окси-трис(пирролидино)фосфония (РуВОР). Синтезирована серия С(16)-карбоксамидов антибиотика (3) (Метод А, Схема 2). Все амины вводили в реакцию в виде гидрохлоридов с добавлением триэтиламина. Выход 10-22 - 70-90%, чистота 85-90% по данным ВЭЖХ.

Схема 2. Синтез (Метод А) и структуры карбоксамидов 844НР (3).

К№12*НС1, 84-ШР РуВОР,

(3)

ОМЯО

-N4, (10), ЯШИ -МНСН3 (11),

-ШСН2СН2ОН, (12),

-ШСНГСН,ОН)СООСН3 ■сн, -ЖСН(СН,ОН)СООСН,

-мн;сн3>.сиг

но|°н »«) -он -он

СН2ОН

—мн

«1)

(10-22)

В ряде случаев, для гидрофильных производных, из-за сложности процесса очистки ключевых соединений использовали другой синтетический подход (Метод Б, Схема 3). Схема 3. Схема синтеза некоторых гидрофильных карбоксамидов 344НР (Метод Б).

(з44НРх|-со гчн2

ртос-ОСи, пиридин ОМР-МеОН (5:1)

( 344НР^-С(

ООН МНРтос

23

1. ^[ГИН-НС! РуВОР,Е1зМ, ЬМЭО

2. Колоночная хроматография на силикагеле

[344Н^-О

ШЯ'!*" МНРтос

Пиперидин, ОМЭО

24 -МН(СН2)3ОН;

25 -МН(СН2)2М(СН3)2;

26 .Л-

( 344НР^-СО^'Р"

N42

27 N1^"= -МН(СН2)3ОН;

28 N1^"= -МН(СН2)2Ы(СН3)2;

29 -н

Первоначально 3'-аминогруппу остатка микозамина в 3 блокировали Ршос-защитой, используя для этого Ртос08и/Ру. Полученный К-Ршос-844НР (23) очищали на колонке с силикагелем, а

затем подвергали амидированию под действием гидрохлорида амина в присутствии Е^Ы и РуВОР-реагснта. После хроматографической очистки на силикагелс и удаления Ртос-группы получали соответствующие целевые карбоксамиды (27-29) с чистотой >95% (ВЭЖХ) и выходом 20-25% (в расчете на 3).

Для сравнения получены аналогичные карбоксамиды АтВ (30 - 33,) методом А (выход 7580%), а также 2-^,Ы-диметиламино)этиламиды 34 и 37 {Рис. 3), исходя из 5 (методом А) и 7 (методом Б через Ртос-производные 35 и 36), с выходом 10% (в расчете на 5 и 7 соответственно).

Рис.3. Структуры карбоксамидов АтВ (30-33), В5С,022 (34) и ВЯСООЗ (37).

-ЖС(СН3)(СН2ОН)2 (32), но^А. 6 он он он он он

-ЖСН(СН2ОН)СООСН3 (0,1.) (33) | СНз Т >;0Н1

Р1=ОН, Р2=Ртос (35), у2ггсн3

Р1=ЫН(СН^Ме2 Р2=Ртос(36), ¿Н \°Н ^МИрН^Ме;,'Р2=Н(37) ¡МЯ2

3. Получение производных антибиотиков по З'-аминогруппе остатка микозамнна.

Новые производные антибиотиков 3 и 4, содержащие заместители в остатке микозамина, были получены с использованием реакций Ы-ацилирования, восстановительного "Ы-алкилирования, а также перегруппировки Амадори.

Синтез 3'-М-Ь-лизид-544НР (42) и 3'-Гч'-Ь-лизил-В5С005 (43) проводили исходя из 3 или 4 и №'^Е-ди-Рщос-Ь-Ьу5-08и (Схема 4) с последующим удалением Ртос-групп в промежуточных 40 и 41 действием пиперидина. Выход составил 20% и 19% (в расчете на 3 и 4 соответственно). Аналогично реакцией 3 с 4-(Ы-Ршос-аминометил)бензойной кислотой (44) в присутствии РуВОР и последующим удалением Ртос-группы получен Ы-ацильный аналог 46 с выходом 32% в расчете на 3 (Схема 4).

Исходя из 3 или 4 реакцией с "Ы-Ртос-З-аминопропаналем (49) в присутствии КаВН)СМ с последующим удалением Ршос-группы получены К-аминоалкильные моно- (53) и бис- (54, 55) производные с выходом 12%, 20% и 17% соответственно (Схема 5). Разделение моно- и бис-лроизводных осуществляли флеш хроматографией на силикагсле.

Аналогично синтезу производных (53-55) реакцией восстановительного алкилирования 3 или 4 с 4-(Л',Ы-диметиламино)бсн:!альдсгидом или 2-сульфобензальдегидом в присутствии ЫаВНзСК получены соответствующие (56,57) (выходом 45% и 25%) или (58) (выход 43%) (Схема 5).

При взаимодействии полиенов 3 или 4 с сахаридами (Б-глюкозой, Б-галактозой или лактозой) в БМР при 37°С в результате перегруппировки Амадори были синтезированы 14-углеводеодержащие производные (59-62) с выходом 37-45% (Схема б). Схема 4. Синтез И-аминоацильных производных И44НР (42, 46) и В$С005 (43).

Н2Ы

ГтгосНИ РтосЧМ

чон РтосОЗи 93%

ртосНМ РтосНМ О

I мн2

(3) Б44НР, Х=СООН

(4) ВБС005, Х=СН3

(40) Х=СООН

(41) Х=СН3

(42) Х=СООН

(43) Х=СН3

ОМЭО, \Л 11

хроматография \ мнРтос: — 4

:оон

Аминогруппы Ь-лизина предварительно защищали с помощью Ртос-группы, карбоксильную группу активировали реакцией с ОСС в присутствии К-гидроксисукцинимида

Способом, аналогичным синтезу 62, был получен продукт перегруппировки Амадори с лактозой для амфотерицина В (63) (Рис 4). Выход 43%.

Для подтверждения структуры 59 реакцией 3 с 1-пС-0-глюкозои был получен соответствующий меченый 13С продукт (1-13С-59). Взаимодействие 1-вС-0 -глюкозы с аминогруппой микозамина полисна 3 может приводить к образованию структур пяти типов: основания Шиффа (а), 1Ч-гликозида (Ь), К-углеводсодержащего производного в линейной кето-форме (с) и его изомеров - циклической а,р-пиранозной формы (<1) или а,р-фуранозной формы (е) (Рис. 5).

Схема 5. Синтез N-anKWibubix производных S44HP (53, 54, 56, 58) и BSG0U5 (55, 57).

но ^ NH*CH3CN/H2O (47) 62%

FmocOSu, Et3N, DMP,CH2CI2 л л

нет ^-^^NHFmoc -- 0*^~^NHFmoc

(49)

(48)

NaBCNH3 1 I

Хроматография на X

силикагеле . J

Альдегид 49 был получен исходя из 3-и.иинопропаиола 47, который был превращен в Утос-проюводное 48 с последующим окислением реагентом Десс-Мартина (¡)\ИУ).

Схема 6. Синтез М-угдеводсодержтцих производных Я44НР (59, 60, 62) и ВЯОООЗ (61).

Х=СООН. Y=OH, Z=H,(59); Х=СООН, Y=H, Z=OH, (60); v Х=СН3, Y=OH,2=H, (61)

;=СООН, (62)

(3) S44HP, Х=СООН

(4) BSG005, Х=СН3

На рис. 6 представлен «тест на присоединенные протоны» (13С ЯМР-спектр в режиме APT) искусственной смеси 1-13С-59 и 1-13С-0-глюкозы. Поскольку в спектре присутствуют сигналы, относящиеся к вторичному или четвертичному углеродному атому (направленные «вверх» 51.61 и 50.47 ррш), можно сделать вывод об образовании равновесной смеси структур «с», «d» или/и «е» (Рис 5). Если бы произошло образование структур «а» и/или «Ь», то в спектре

наблюдались бы только сигналы характерные третичным или первичным углеродам, (направленные «вниз»), В данном случае сигналы при 96.63 и 91.96 ррт принадлежат 1-3С-В-глюкозе.

Рис 4. Структура №углевод-содержащего производного АтВ (63).

Рис 5. Возможные структуры N-углеводсодержащего производного 59.

si

он n

4и

-Г

¿н nh

НО—сн

нА—он

»гн2

с=о

I

но—сн НС—он

УС

он nh

0112с»

a "f

Hj:—ОН сн2он

нс—он

¿н5он С

сн,он

■г

он .nh 11;с»

Рис б. ,3С ЯМР-спектр искусственной смеси 1-,3С-Ы-(1-дезокси-0-фруктоз-1-ил)-$44НР (59) и 1 -,3С-0-глюкозы в DMSO-de при 35 °С в режиме APT (тест на присоединенные протоны).

220 200

120 100 I

Chemical Shift (ppm)

40 20

4. Двойная модификация полненового антибиотика S44HP.

Были получены производные s44hp (3), замещенные одновременно по С(16)-карбоксильной группе и 3'-аминогруппе остатка микозамина. Для модификации использовали два различных подхода. Выбор метода синтеза был продиктовал удобством процесса очистки промежуточных или целевых соединений. Оптимальным вариантом для хроматографической очистки производных было использование их в виде гидрофобных Fmoc-защищенных соединений. Большинство соединений было получено исходя из С(16) карбоксамидов, которые потом были превращены в соответствующие 3'-1Ч-ацильные или ЗЧЧ-алкильные соединения (Схема 7). Карбоксамиды 13, 27 и 28 получали в три стадии по разработанному ранее методу Б (Схема 3). Затем 3'-аминогруппу остатка микозамина в 13, 27 и 28 ацилировали К^-диметилглицином (64-66) или Na,Nf-,iH-Fmoc-L-Lys (38) в присутствии РуВОР (68). Карбоксамиды 13, 27 и 28 замещали D-глюкозой или D-галактозой (перегруппировка Амадори) (69-73) или п-диметиламинобензальдегидом в присутствии NaBfbCN (74-76). Выход 64-66 30-40% (в расчете на 3), 68-73 - 15-25% (в расчете на 3), 74-76 - 25-35% (в расчете на 3). Схема 7. Синтез дважды модифицированных аналогов S44HP (64-66, 68-76) исходя из С(16)-карбоксамидов.

S44HP^~CONHR NH

I

COCH2NMe2

R= -(CH2)2NMe2 (64) R=-(CH2)3NMe2(65) R= -(CH2)3OH (66)

Me2nch2co DMSO, Et3N, PyBOP, pH-' 1 h.

1) FmocOSu, пиридин, DMF/MeOH,

S44HR—COOH

—V nh2

2) R-NH2xHCI, PyBOP, DMSO, Et3N, pH~7, r.t., 1 h.,

колоночная хроматография на сипикагеле

3) пиперидин/DMSO

D-глюкоаа или D-галактоэа, DMF, колоночная хроматография (сефадекс G 25)

S44HR- -CONH(CH2)3N(CH3)2

-X

NH

NHX

пиперидин, Г*=£™С<67); DMSO >— X=H (68)

Na,Ne-AH-Fmoc-L-Lys (38),

PyBOP, DMSO, Et3N, pH-7.5, r.t., 1 h.

R= -(CH2)2NMe2 (28) R=-(CH2)3NMe2 (13) R= -(CH2)3OH (27)

/>Me2NC6H4CHO, NaBH3CN, DMF; колоночная хроматография на ч силикагеле

S44HPV- -CONHR

-Ч

HNV он

R = -(CH2)2NMe2 ; X=H; Y=OH (69) R = -(CH2)2NMe2 ; X=OH; Y=H (70) R = -(CH2)3NMe2 ; X=H; Y=OH (71) R = -(CH2)3NMe2; X=OH; Y=H (72) R = -(CH2)3OH ; X=H; Y=OH (73)

S44HR--CONHR

——Л

NH

I

CH2C6H4NMe2-p

R= -(CH2)2NMe2 (74) R= -(CH2)3NMe2 (75) R= -(CH2)3OH (76)

Ряд дважды модифицированных производных 844НР был получен, исходя из З'-Ы-ацильных производных (Схема 5).

Схема 8. Синтез дважды модифицированных аналогов И44НР (78, 80, 82, 84, 86) исходя ¿V-амипоацильных производных.

Fmx-NH-CH^H.-COOH (44), РуВОР, EtjN, рН-7, хроматография на силикагепеj

R-NH2xHCI, РуВОР, DMSO, EtjN, рН-7 5. ■ООН rt'7h-_►

[ S44HP^-CON NH

r^yk

in

FmocHN \>

(77-s2)

N",N*/Jn-Fmoc-L-Lys (38), DCC, HOBt, (i-Pr)3E:.'l pH~8 5, DMF, хроматография на силикэгепе

R-NH,xHCI, РуВОР, DMSO, EtjN, pH-7.5, rt, 1 h

(40)

. r- X=Fmoc; R= -(CH2)2NMe2 (77) 'L-X=H; R=-(CH2)2NMe2(78)

. r-X=Fmoc; R= -(CH2)3NMe2 (79) L—X=H; R= -(CH2)3NMe2 (80)

X=Fmoc; R=-(CH2)3OH (81) 'L»X=H; R=-(CH2)3OH (82)

, |— X=Fmoc; R= -(CH2)2NMe2 (83) L—X=H; R=-(CH2)2NMe2(84)

r- X=Fmoc; R= -(CH2)3OH (85) 1 Ux=H; R= -(CH2)3OH (86)

З'-Аминогруппу 3 первоначально ацилировали №,ЫЕ-ди-Ршос-Ь-Ьу5 (38) или М-Ртос-п-аминомотилбензойной кислотой (44). Затем С(16)-карбоксильную группу в полученных защищенных З'-аминоацильных производных (40 и 45 соответственно) амидировали соответствующими гидрохлоридами аминов в присутствии РуВОР и Е^Ы. Выход 78, 80, 82 -около 30% (в расчете на 3), 84 и 86 - около 10% (в расчете на 3).

Чистота соединений, предназначенных для расширенного изучения активности в опытах на животных составляла 95 - 98%% (ВЭЖХ, УФ/ВО). Строение всех полученных новых производных полиеновых антибиотиков (10-22, 27-34,37,42,43,46, 53-66, 68-76, 78, 80,82,84, 86) подтверждено методами УФ/ВО-спектрофотометрии и масс-спектрометрии. Для наиболее активных соединений получены спектры 'Н ЯМР, подтверждающие их структуру. 5. Получение водорастворимых солей полиеновых антибиотиков и их производных. С целью улучшения растворимости полиенов были получены водорастворимые солевые формы антибиотиков по аминогруппе с неорганическими кислотам (соляной, метансульфокислотой), органическими кислотами (дихлоруксусной, уксусной, сорбиновой, фумаровой, пимелиновой, гликолевой, Ь-молочной, глюкуроновой, Ь-аскорбиновой, яблочной, лимонной), а также с двуосновными аминокислотами (Ь-аспарагиновой, Ь-глутаминовой, О-глутаминовой). Обнаружено, что соли полиенов с дихлоруксусной и аскорбиновой кислотами, а также с аминокислотами обладали оптимальными свойствами: хорошей растворимостью в воде и стабильностью. Соли с неорганическими кислотами оказались нестабильны. Полученные водорастворимые соли обладали такой же противогрибковой активностью как исходные антибиотики.

6. Изучение закономерности структура - противогрибковая активность в ряду полученных производных полиеновых антибиотиков в экспериментах in vitro.

Противогрибковая активность всех полученных производных была изучена в экспериментах in vitro в отношении ряда тест-культур дрожжей: Candida albicans (ATСС 14053), Cryptococcus humicolus (АТСС 9949) и несовершенных грибов: Aspergillus niger (АТСС 16404), Fusarium oxysporum (VKM F-140), с использованием метода микро разведений.*

6.1. Изучение связи структура - противогрибковая активность моно-модифицироваштх производных S44HP.

Данные о противогрибковой активности изученных моно-модифицированных производных S44HP (Табл. 1) свидетельствуют, что превращение С(16)-карбоксильной группы в амидную не всегда приводит к уменьшению или потери активности производного, что согласуется с данными, полученными ранее другими исследователями для карбоксамидов АшВ. Было установлено, что наличие полярных групп (ОН, NH2 или СООН) в составе амндного фрагмента является важным для проявления производным высокой противогрибковой активности.

Таблица 1. Противогрибковая активность моно-модифицированных производных S44HP.

Соединение Тест-организм (МПК#, мкг/мл) Соединение Тест-организм (МПК#, мкг/мл)

Candida albicans АТСС 14053 Crvptococcus humicolus АТСС 9949 Aspergillus i niger АТСС 16404 Fusarium oxysporum VKM F-140 Candida albicans АТСС 14053 Cryptococcus humicolus АТСС 9949 Aspergillus niger ATCC 16404 Fusarium oxysporum VKM F-140

АшВ (АшВ*) 1 (2) 1 (2) 1 (2) 4 (4) 22 4 4 4 8

S44HP (S44HP*) 1 (2) 1 (2) 1 (2) 4 (4) 27 1 1 2 2

10 2 1 2 8 28 0.5 0.5 1 1

11 2 2 4 4 29 1 2 2 4

12 2 4 4 4 42 8 8 16 >16

13 1 1 2 2 46 2 2 4 h 16

14 1 1 2 4 53* (2) (4) (4) (4)

15* (2) (2) (2) (4) 54 1 1 1 1

16* (2) (2) (4) (4) 56 2 2 4 >16

17 2 2 4 8 58 4 4 4 >16 8 ~~ 8

18 2 2 4 8 59 1 1 1 2

19 4 4 4 16 60 1 2

20 4 4 4 >16 62 2 2 2 8

21 2 2 2 8

*Соединения 15, 16, 53 были изучены е сравнении с АтВ и S44HP в отдельном эксперименте (данные приведены в с койках)."Значения АШК определены как минимальные концентрации, при которых прекращается любой видимый рост культуры.

Однако, введение заместителей с несколькими гидроксильными группами (19, 20, 21), а также гидрофобного заместителя (22) приводит к некоторому снижению противогрибковой

' Эксперименты проводились сотрудниками отдела микробиологии НИШ1А им. Г.Ф. Гаузе РАМН (к.б.н. Третш A.C., к.б.н. Галатеико O.A.)

активности, в то время как активность карбоксамидов, содержащих одну гидроксильную/или аминогруппу (27, 29,13, 28) близка к активности исходного антибиотика. Размер вводимого гидрофильного заместителя так же имеет значение для проявления активности. Так например, гидроксиэтиламид S44HP (12) менее активен, чем гидроксипропиламид S44HP (27). В то время как 2-(Ы,М-диметиламино)этиламид S44HP (28) наоборот обладет большей активностью в сравнении с 3-(>),М-диметиламино)пропиламидом S44HP (13). В ряду производных с аминокислотами наблюдаются следующие закономерности: карбоксамиды с метиловыми эфирами L-аланина (17) и L-валина (18) были менее активны по сравнению с карбоксамидом этилового эфира глицина (14). Наличие гидроксильной группы в остатке метилового эфира L- или D,L-cepnHa в соответствующих карбоксамидах (15 и 16) приводит к сохранению противогрибковой активности в сравнении с AmB (1) и исходным S44HP (3) {Табл.1).

Среди производных 3 по З'-аминогруппе остатка микозамина N-алкильные производные, содержащие ароматический заместитель (56, 58), а также N-ацильное производное (42), обладают сниженной активностью. Размер заместителя, введенного по З'-аминогруппе остатка микозамина, так же, как и в случае с карбоксамидами, важен для проявления активности: продукт перегруппировки Амадори с дисахаридом (лактозой) (62) оказался менее активен, чем таковой с моносахаридами (D-глюкозой или D-галактозой) (59, 60). Также следует отметить, что моно-замещенное N-алкильное производное (53) уступает в активности аналогичному бис-замещенному производному (54) (Табл. 1).

Таким образом, наличие полярных групп, а также размер вводимого заместителя по С(16)-карбоксильной/или З'-аминогруппе остатка микозамина имеют важное значение для проявления производными противогрибковой активности.

6.2. Изучение влияния заместителя при атоме С(16) па активность антибиотиков. Структуры генно-инженерных полиеновых антибиотиков S44HP (3) и BSG005 (4) отличаются друг от друга только заместителем в положении С(16): 3 содержит карбоксильную группу, а 4 метальную группу в указанном положении (Рис 2). Следовательно, изучение закономерности структура-активность для их производных, имеющих одинаковые заместители по З'-аминогруппе остатка микозамина, позволяет определить влияние заместителя при атоме С(16). Среди синтезированных N-алкильных производных продукты перегруппировки Амадори с D-глюкозой (59 и 61) обнаруживают приблизительно одинаковую по активность в отношении всех 4-х изученных тест-организмов, уступая при этом в активности соответствующим исходным 3, 4 и 1. N-Алкильное производное S44HP (56), содержащее ароматический заместитель по З'-аминогруппе остатка микозамина, значительно превосходило по активности аналогичное производное BSG005 (57), которое в свою очередь было лишено противогрибковой активности. М,М-Бис-аминоалкильное производное S44HP (54) превосходит

по активности (в отношении штамма Fusarium oxysporum VKM F-140) исходный 3, а также 1, в то время как аналогичное производное BSG005 (55) проявляет довольно низкую активность (Табл. 2).

Интересно отмстить, что в случае N-аминоацильных аналогов ситуация наблюдалась обратная: М-Ь-лизил-844НР (42) был значительно менее активен в сравнении с аналогичным производным BSG005 (43), который по активности но уступал 1 и исходному 4. (Табл. 2). Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что активность антибиотика зависит не только от структуры заместителей при З'-аминогруппе остатка микозамина, но и от характера заместителя в положении С(16). Таким образом, влияние одинаковых модификаций на активность исходных антибиотиков с очень близкими значениями противогрибковой активности может быть разнонаправленным.

Таблица 2. Противогрибковая активность производных по 3'-аминогруппе остатка микозамина в S44HP (3) и BSG005 (4), содержащих одинаковые заместители.

Производные S44HP Производные BSG005

Соединения Тест C.albicans Л'ГСС 14053 -организм C.humicoli(S ЛТСС 9949 .... МГ1К, м Artiger лтсс 16404 2 кг/мл) ï'\oxysporum VKM F-140 ___ Соединения jiT 57 Тест C.albicans ЛТСС 14053 2 -организм 1 C.humicolus ЛТСС 9949 Milk", м A.mger ЛТСС 16404 кг/мл) F.oxysporum VKM F-140

59 56 1 2 2 8

2 2 4 >16 16 >16 >16 >16

54 1 1 1 1 55 4 8 8 8

42 8 8 16 >16 43 1 1 1 2

S44HP (3) 1 1 1 4 BSGO 05 (4) 1 1 2 2

АшВ (1) 1 1 1 4

59, 61 -- (1-дезокси-0-фруктоз-1-ил)-аналоги, 56,57-N-4-(N, N-диметилам ипо)бензил-апалоги, 54, 55 - N,N-6uc(3-aMunonpomm)-aHCUiocu, 42, 43 - N-L-лизип-апалоги,

6,3. Изучение влияния области С(7) - С(10) на противогрибковую активность производных. Проведение одинаковых модификаций по функциональным группам (С(16)-карбоксильной группе или З'-аминогруппе остатка микозамина) на различных полиеновых антибиотиках, отличающихся расположением гидроксильных групп в области С(7)-С(10), позволило выявить роль полиольного фрагмента в проявлении противогрибковой активности. Были изучены противогрибковые активности производных АшВ и S44HP, содержащих одни и тс же заместители. Антибиотики отличаются между собой расположением гидроксильных групп: в молекуле AmB (1) две гидроксильные группы расположены в положениях С(8) и С(9) (Рис 1), в то время как в S44HP (3) - в положениях С(7) и С(10) (Рис 2). В таблице 3 представлена противогрибковая активность четырех пар синтезированных карбоксамидов (3033 и 12,11,19,16) и одной пары углевод-содержащих N-алкильных производных (63 и 62).

Было установлено, что изученные карбоксамиды 844НР (12,11,19,16) по активности в опытах очень близки карбоксамидам АшВ, содержащим аналогичные радикалы (30-33). Полученные перегруппировкой Амадори Ы-алкильные соединения (63 и 62) также близки между собой по активности, но уступают исходным антибиотикам (Табл. 3). Эти результаты позволяют сделать вывод о том, что в случае АшВ (1) и 844НР (3) указанные различия в полиольном регионе С(7)-С(10) существенно не влияют на противогрибковую активность.

Таблица 3. Противогрибковая активность производных АтВ (1) и $44НР (3), содержащих одинаковые заместители.

Производные АтВ Производные 844НР

№№ Тест -организм (МПК, мкг/мл) №№ Тест-организм (МПК, мкг/мл)

C.albicans АТСС 14053 С kumicohis ЛТСС 9949 A niger АТСС 16404 F.oxysporum VK.M F-140 С. albicans АТСС 14053 С humicolus ЛТСС 9949 A. niger АТСС 16404 F.oxysporum VKM F-140

30 2 2 2 4 12 2 4 4 4

31 1 2 2 4 11 2 2 4 4

32 2 4 4 8 19 4 4 4 16

33 1 1 2 4 16 2 2 4 4

63 2 4 4 8 62 2 2 2 8

АтВ (1) 1 1 1 4 S44HP (3) 1 1 1 4

30,12 - 2-гидроксиэтил карбоксамиды,

31, 11- метил карбоксамиды,

32,19 -1-(1,1-дигидроксиметил)этил карбоксамиды,

33, 16 - метиловый эфир В,Ь-серил карбоксамиды,

63, 62 - продукты перегруппировки Амадори с лактозой.

Структуры генно-инженерных полиеновых антибиотиков (3, 5, 7) и (4, 6, 8) различаются в

более узком интервале - в области атомов С(9) и С(10) (Рис 2). Антибиотик 6, в котором

отсутствует гидроксильная группа в положении С(10), уступает в активности 4, положение

С(10) которого гидроксилировано (Табл. 4).

Таблица 4. Противогрибковая активность 2-(М,К-диметиламиио)этилаыидов (28, 34, 37) и соответствующих им природных генно-инженерных полиеновых антибиотиков (4, б, 8).

Тест- МПК, мкг/мл

организм 4 (BSG005) 6 (BSG019) 8 (BSG018) АтВ 28 (S44HP) 34 (BSG022) 37 (BSG003)

С. albicans АТСС 14053 1 1 1 0.5 0.5 1 4

С. humicolus АТСС 9949 0.5 1 16 0.5 0.5 1 >16

A. niger ЛТСС 16404 1 1 4 0.5 0.5 2 4

F.oxysporum VKM F-140 2 4 >16 2 2 4 8

Соединение 8, в котором гидроксилировано положение С(9) вместо С(10) обнаруживает еще более низкую активность в сравнении с 4 и 6. Таким образом, противогрибковая активность в отношении четырех тест-организмов уменьшается в ряду соединений 4 > 6 > 8. Данная закономерность убывания активности прослеживается и для их С(16)-карбоксамидов, содержащих аналогичные функциональные группы в области С(9)-С(10): 28 > 34 > 37. В результате было установлено, что расположение гидроксильных групп в полиольном регионе при атомах С(7) и С(10) (3 и 4) является наиболее благоприятным для проявления противогрибковой активности

6.3 Изучение активности дважды модифицированных производных S44HP.

Результаты изучения противогрибковой активности полученных дважды модифицированных производных S44HP (64-66,68-76, 78, 80, 82, 84, 86) представлены в таблицах 5 и 6. Таблица 5. Противогрибковая активность дважды модифицированных производных S44HP (64-66, 69-76) в сравнении с соответствующими моно-модифицированньши С(16)-карбоксахшдакш (2Н, 13, 27).

(s44HF^-CQR' nhR"

Соединение _ R' R" МПК, мкг/мл

С. albicans ATCC14053 С humicolus ATCC 9949 A. niger ATCC 16404 F.oxysporum VKMF-140

28 —HN. I H 0.5 0.5 1 1

69 0.5 1 J 2

70 0.5 1 1 2

74 ClbWMJMert) 1 1 1 4

64 COCI]2NMe2 1 2 1 4

13 I H 1 1 2 2

71 ipe 1 1 1 4

72 1 2 2 4

75 ClbÇftNMej-p 2 2 2 8

65 COCH2NMc2 1 2 1 4

27 —HN'^^^OH H 1 1 2 2

73 4 4 4 16

76 CHiC^NMcj-p 2 1 2 4

66 COCIT2NMe2 1 1 2 16

3 ОН H 1 1 1 4

Am В (1) 1 1 1 4

Наибольшей противогрибковой активностью обладают продукты перегруппировки Амадори с D-глюкозой и D-галакттоой 2-(М,М-диметиламино)этиламидов S44HP (69 и 70 соответственно). Для них значения противогрибковой активности в опытах in vitro на всех четырех изученных тест-организмах превосходит таковые для родительского 3, а также для 1 (Табл. 5). З'-N-L-Lys-содсржащий 3-(М,М-димстиламино)пропиламид S44HP (68), а также продукт перегруппировки Амадори с D-глюкозой того же амида (71) не уступают в активности 3 и 1 в опытах на всех тест-организмах (МПК ~ 1-4 мкг/мл) (Табл. 5, б). Активность 4-(N,N-диметиламино)бензиламидов 74-76 и Т^,М-диметилглициламидов 64-65 близка к активности 3 и 1 в отношении трех изученных культур С. albicans, С. humicolus, A. niger (МПК ~ 1-2 мкг/мл), но достаточно низкая в отношении F. oxysporum (МПК ~ 4-16 мкг/мл).

Таблица б. Противогрибковая активность дважды модифицированных производных S44HP (68, 78, 80, 82, 84) в сравнении с соответствующими моно-модифицированными N-аминоацилъными производными (46, 42).

is44HFH—COR' nhR"

Milk. mix mi

ft в - - ВС О я R" R' C. albicans АГСС14053 C, kumicolus ATCC 9949 A niger ATCC 16404 F. oxysporum. VKMF-140

1 46 OH 2 1 A 16

"8 T 2 i Л 4

80 fn 1 2 2 4 4

е NH? —HN-^^XIH .2 i 4 IS

42 H>N CO" OH 8 S 16 >16

84 ) —HN. >-1 1 -> -> 4

68 ; 1 1 1 1 2

86 \ m 1 1 i 4

3 H OH 1 1 1 4

Am В (1) 1 1 1 4

Основываясь на полученных данных по противогрибковой активности дважды модифицированных производных в сравнении с соответствующими моно-модифицированными аналогами можно проследить влияние вторичной модификации на противогрибковую активность. Обнаружено, что введение в карбоксамиды 28 и 13 дополнительных алкильных или ацильных заместителей по 3'-аминогруппе остатка микозамина в целом заметно не изменяет их активности, в то время как аналогичные модификации карбоксамида 27 приводят к видимому снижению активности (Табл. 5). Так, например, для карбоксамидов 28 и 13 (МПК ~ 0.5-2 мкг/мл) продукты их перегруппировки Амадори с О-глюкозой (69 и 71 соответственно)

обладают противогрибковой активностью на уровне исходных карбоксамидов (МПК ~ 0.5-4 мкг/мл), в то время как для карбоксамида 27 (МПК ~ 1-2 мкг/мл) аналогичное дважды модифицированное производное (72) значительно уступает в активности (МПК -4-16 мкг/мл) исходному (27) (Табл. 5). Интересно также отмстить, что в случае N-аминоацильного производного (46) (Ы-аминометилбснзоил-844НР, МПК ~ 2-16 мкг/мл) трансформация С(16)-карбоксильной группы в С( 16)-амидную практически не изменяет его противогрибковой активности в отношении трех тест-организмов (МГ1К ~ 2-16 мкг/мл), за исключением данных для 78 и 80 (МПК ~ 2-4 мкг/мл). Однако, в случае с другим N-аминоацильным производным (42) (N-L-Tii3iw-S44HP, МПК ~ 8-16 мкг/мл) такая же модификация С(16)-карбоксильной группы, как и для (46) улучшает его активность в отношении всех тестируемых культур (МПК ~ 1-4 мкг/мл) (Табл. б).

Таким образом, изучение противогрибковой активности в опытах in vitro для дважды модифицированных соединений показало, что большинство полученных производных сохраняют противогрибковую активность. Более того было установлено, что в ряде случаев двойная модификация может привести к улучшению противогрибковых свойств.

На основании проведенных экспериментов были отобраны для дальнейшего более детального изучения в опытах in vivo 2 моно-модифицированных производных S44HP - С(16)-карбоксамиды 13 и 28, N-аминоацильное производное BSG005 (43), дважды модифицированное производное S44HP (69) как наиболее активные в опытах in vitro, а также С(16)-карбоксамиды BSG022 (34) и BSG003 (37).

7. Изучение противогрибковой активности и острой токсичности полученных производных в экспериментах in vivo.

Новые генно-инженерные полисновые макролиды 4, 6 и 8, а также полусинтетичсскис производные 13, 28, 43, 69, 34 и 37 были наработаны в препаративных количествах (с чистотой > 95% по данным ВЭЖХ) и изучены в опытах на животных. Эксперименты проводились на мышах гибридах C57BIXDBA2 (самцы и самки). Животных инфицировали внутривенно культурой Candida albicans (штамм АТСС14053) в дозе 1.0 миллион КОЕ/мышь в объеме 0.1 мл, антибиотик вводили ежедневно в течении 4-х дней. Определение токсичности изучаемых соединений осуществляли на мышах при однократном внутривенном введении с использованием метода пробит-анализа по Литчфилду-Уилкоксону. Эффективность противогрибкового действия оценивали по количеству КОЕ на 1 г ткани почек. Исследование токсичности и противогрибкового действия испытуемых соединений проводили в сравнении с АшВ (1).

Подавляющее большинство испытанных соединений превосходило по лечебным и токсическим характеристикам АшВ (1). При лечении 1 даже в дозе близкой к максимально переносимой

Эксперименты проводились сотрудниками лаборатории фармакологии и химиотерапии ! 1ИИ1! А им. Г.Ф.Гаузе РАМН (к.м.н. Трещалин И.Д., дб.н. Переверчена Э.Р., д.м.н. Мирчинк Е.Г1., Исакова Е.Б.)

(МПД 2.01 мг/кг) число КОЕ/г ткани почек снижается всего на 2 порядка, то есть полного излечения животных не наступает. (Рис 7). Дальнейшее повышение дозы приводит к лекарственной гибели животных.

В то же время для BSG005 (4) и 3-(М,М-диметиламино)пропиламида S44HP (13) повышение дозы до 5.0 мг/кг/сутки при лечении кандидоза (что составляет ~ Уг МПД) не только не вызывает гибели животных, но приводит к практически полному излечению животных: значение КОЕ/г снижается практически до нуля (Рис 7).

N-L-Лизил BSG005 (43) также проявляет высокую эффективность в дозе 2.5 мг/кг/сутки (~ У% МПД, падение КОЕ/г до единичных значений) (Рис 8), однако соединение оказалось достаточно токсичным (МПД=4.48 мг/кг). Наиболее широкий интервал между лечебным и токсическим действием показали 2-(1Ч,М-диметиламино)этиламид S44HP (28) и N-( 1 -D-дсзокси-фруктоз-1 -ил)-2-(М,М-диметиламино) этиламид S44HP (69). Для них эффективная доза составила всего 2% и 6% от МПД соответственно, в то время как АшВ (1) эффективен лишь в дозе 62% от МПД. Была изучена эффективность шести полученных полистовых антибиотиков (4,6,8, 28,34 и 37) на животных с искусственно ослабленным иммунитетом. Изучение возможности лечения полиснами искусственно зараженных животных с заранее ослабленным иммунитетом представляет особый интерес, поскольку в этих опытах моделируется лечение иммунодефицитных больных. Для индукции экспериментальной нейтропении у мышей циклофосфамид вводили подкожно в дозе 100 мг/кг за 3 дня и через 1 день после внутривенного заражения Candida albicans (штамм АТСС14053) в дозе ЗхЮ5 КОЕ/мышь в объеме 0.1 мл. Полученные результаты представлены на рисунке 9. Установлено, что AmB (1), в условиях нейтропении, индуцированной циклофосфамидом, показывает низкую специфическую активность (падение КОЕ/г на два порядка) даже в МПД (2.50 мг/кг/сутки). Генно-инженерные полиены 6 и 8 проявляют выраженную активность только в высоких дозах. 2-(М,М-диметиламино)этиламид BSG022 (34) и 2-(М,М-димстиламино)этиламид BSG003 (37) не обладают противогрибковой активностью даже в высоких дозах. Низкая противогрибковая активность in vitro соединений 8 и 37 подтверждается в опытах in vivo. Соединения 4 и 28 заметно превосходят по эффективности AmB (1) и все остальные производные. 2-(N,N-Диметиламино)этиламид S44HP (28) демонстрирует высокую специфическую активность в диапазоне доз от 1.25 до 2.5 мг/кг/сутки (5-10% от МПД) несмотря на нейтропению (Рис 9).

Таким образом, 2-(Ы,М-диметиламино)этиламид S44HP (28) является наиболее перспективным полусинтетическим аналогом генно-инженерного полиенового антибиотика S44HP (3). Соединение 28 отобрано для дальнейшего углубленного доклинического изучения.

Рис 7. Эффективность соединений 4 и 13 в сравнении с АтВ (1) при лечении кандидозного сепсиса мышей.

0,08 0,8 2,50

Доза, мг/кг/сутки

5,00

II 14 13

Рис 8. Эффективность соединений 43, 28 и 69 в сравнении с АтВ (1) при лечении кандидозного сепсиса мышей.

100000

10000

зе й

о 1000

100

10

шпини

0,08

1 43 ■ 28 ¡5 69

0,31

0,62

1,25

2,5

10

Доза, мг/кг/сутки

Рис 9. Эффективность полученных полиеновых антибиотиков в сравнении с АтВ (1) на модели кандидозного сепсиса мышей, предварительно обработанных циклофосфамидом.

IV.-V

11111IIII

ххх

1111 I I II

0 0,16 0,31 0,62 1,25 2,5 5 11.4В28 «6«8 34 37 Доза, мг/кг/сутки

10

20

30

выводы

1. Разработаны методы химической модификации генно-инженерных гсптаенов по 3'-аминогруппс остатка микозамина или С(16)-карбоксильной группе агликона. Получение карбоксамидов антибиотиков проводилось в присутствии РуВОР без предварительной защиты аминогруппы микозамина. Для модификации 3'-аминогруппы использованы методы восстановительного аминирования, N-аминоацилирования и реакция Амадори.

2. Строение продукта перегруппировки Амадори, образующегося при взаимодействии антибиотика S44HP с 1-иС-0-глюкозой, подтверждено методом ПС ЯМР спектроскопии.

3. Разработаны методы двойной химической трансформации полиеновых антибиотиков с использованием двух подходов - N-замещение карбоксамидов или амидирование N-аминоацилированных полиеновых антибиотиков.

4. Получено 48 новых соединений (монозамещенные производные N-алкильного или N-аминоацильного типа, или С(16)-карбоксамиды, а также дважды модифицированные аналоги). Изучена их противогрибковая активность в опытах in vitro. Среди них 25 соединений показали близкую или превосходящую активность амфотерицину В.

5. Показано, что влияние на противогрибковую активность введения одного и того же заместителя в молекулу полиеновых антибиотиков, отличающихся заместителями при С(16) может быть разнонаправленным.

6. Установлено, что расположение гидроксильных групп в полиольном регионе агликона является определяющим для проявления противогрибковой активности и наиболее благоприятно в положениях С(7) и С(10), что соответствует антибиотику S44HP, его С(16)-мстильному аналогу BSG005 и их производным.

7. Шесть новых производных полиеновых макролидов наработаны в препаративных количествах (чистота >95% по данным ВЭЖХ) для изучения в опытах in vivo; показано, что четыре из них (производные S44HP и BSG005) обладают преимуществом перед амфотерицином В; 2-(>),М-диметиламино)этиламид S44HP (28) отобран для углубленного доклинического изучения.

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

1. Соловьева С.Е., Олсуфьева Е.Н.. Преображенская М.Н. Химическое модифицирование противогрибковых макролидных полисновых антибиотиков (обзор).// Успехи химии-2011.-Т. ВО,-№2,-С. 115-138.

2. Тренин А.С., Зотчев С.Б., Олсуфьева Е.Н., Соловьева С.Е., Тевяшова А.Н., Принцсвская С.С., Галатенко О.А., Преображенская М.Н. Создание новых противогрибковых препаратов на основе химической трансформации антибиотиков-макролидов, полученных генно-инженерной модификацией нистатина.// Иммунопатология, аллергология, инфсктология.-2009.-№2.-С. 155-156.

3. Preobrazhenskaya M.N., Olsufyeva E.N., Solovieva S.E., Tevyashova A.N., Reznikova M.I., Luzikov Y.N., Tcrckhova L.P., Trenin A.S., Galatcnko O.A., Treshalin I.D., Mirchink E.P., Bukhmari V.M., Slctta H., Zotchev S.B. Chemical modification and biological evaluation of new semisynthetic derivatives of 28,29-didehydronystatin A1 (S44HP). A genetically engineered antifungal polyene macrolide antibiotic.// J. Med. Chem.- 2009.-V. 52,- P. 189-196.

4. Preobrazhenskaya M.N„ Olsufyeva E.N., Tevyashova A.N., Printsevskaya S.S., Solovieva S.E., Reznikova M.I., Trenin A.S., Galatcnko O.A., Treshalin I.D., Percverzcva E.R., Mirchink E.P., Zotchev S.B. Synthesis and study of the antifungal activity of new mono- and ¿¡substituted derivatives of a genetically engineered polyene antibiotic 28,29-didehydronystatin A1 (S44HP).// J. Antibiotics.- 2010,- V.63.- P. 55-64.

5. Тевяшова A.H., Соловьева C.E., Преображенская М.Н. Новые производные полиенового противогрибкового антибиотика Амфотерицина В: синтез и изучение биологической активности.// IX Научная школа-конференция по органической химии ИОХ РАН-Звенигород. - 2006,- С. 355.

6. Tevyashova A.N., Solovyeva S.E., Olsufyeva E.N., Preobrazhenskaya M.N. New amphotericin В derivatives: Synthesis, antifungal and haemolitic toxicity.// 5th Joint Meeeting on Medicinal Chemistry.- Protoroz, Slovenia.- 2007,- Famiacevtski vestnik.- V. 58,- P. 189.

7. Тевяшова A.H., Соловьева C.E., Олсуфьева E.H., Тренин А.С., Зотчев С.Б., Преображенская М.Н. Химическая модификация генно-инженерных полиеновых антибиотиков - новый путь получения более эффективных противогрибковых препаратов.// IV Московский Международный Конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития»,- Москва,-2009,-Материалы.- Ч. 1,- С. 211-212.

8. Принцсвская С.С., Соловьева С.Е., Тевяшова А.Н., Тренин А.С., Олсуфьева Е.Н., Зотчев С.Б., Преображенская М.Н. Двойная химическая модификация генно-инженерного полиенового макролида - попытка улучшения свойств противогрибкового препарата.// IV Московский Международный Конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития»,-Москва.-2009,-Материалы,-Ч. 1.-С. 192-193.

9. Тренин A.C., Зотчев С.Б., Олсуфьева Е.Е., Тевяшова А Н., Соловьева С.Е., Принцевская С.С., Галатенко O.A., Преображенская М.Н. Новые противогрибковые антибиотики, полученные на основе химической модификации полиеновых макролидов -амфотерицина В и его генно-инженерных аналогов: отбор и изучение взаимосвязи структура - активность.// IV Московский Международный Конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития»,- Москва,- 2009,-Материалы,- Ч. 1,- С. 86-87.

10. Принцевская С.С., Олсуфьева E.H., Тевяшова А.Н., Соловьева С.Е., Зотчев С.Б., Преображенская М.Н. Химическая модификация новых полиеновых макролидов, полученных методом генной инженерии.// Всероссийская конференция по органической химии,- Москва,- 2009,- Сборник тезисов докладов,- С. 349.

11. Принцевская С.С., Тевяшова АН., Соловьева С.Е., Олсуфьева E.H., Зотчев С.Б., Преображенская М.Н. Химическая модификация противогрибковых полиеновых антибиотиков-макролидов.// Международный Симпозиум ASOC "Успехи науки в области органической химии",- Мисхор, Крым,- 2010,- Материалы,- С. 174.

Подписано в печать 02.03.2011 г. Формат А5 (148,5x210 мм). Бумага офсетная. Гарнитура "Тайме". Печать трафаретная (ризограф). Заказ 84. Тираж 100 экз. Отпечатано в типографии "Геликон" 105203, Москва, 12-я Парковая ул., д.7 (495) 925-34-34 www.helicongroup.ru

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

МОДИФИКАЦИЯ ПРОТИВОГРИБКОВЫХ МАКРОЛИДНЫХ ПОЛИЕНОВЫХ АНТИБИОТИКОВ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

Введение.

1. Природные и генно-инженерные полиеновые макролидные антибиотики

1.1. Природные противогрибковые полиеновые антибиотики.

1.2. Аналоги полиеновых антибиотиков, полученные генно-инженерными методами.

2. Механизм действия полиеновых антибиотиков.

3. Полусинтетические производные полиеновых макролидных антибиотиков: получение и свойства.

3.1. Производные амфотерицина В по готическому гемикеталю агликонового фрагмента.

3.2. Производные полиеновых антибиотиков по карбоксильной группе.

3.3. Производные полиеновых антибиотиков по 3'-аминогруппе остатка микозамина.

3.4. Дважды модифицированные производные полиеновых антибиотиков.

3.5. Фторсодержащие аналоги амфотерицина В.

3.6. Циклические производные амфотерицина В.

3.7. Дгшеры амфотерицина В.

4. Конъюгаты амфотерицина В с макромолекулами: получение и свойства

4.1. Конъюгаты амфотергщина В с полисахаридами.

4.2. Конъюгаты амфотерицина В с полиэтиленгликолем.

В последнее десятилетие все более остро стоит проблема лечения инфекционных заболеваний, вызванных грибковыми^ инфекциями, что обусловлено возрастанием числа пациентов с иммуносупрессией различного происхождения, а также развитием устойчивости патогенов к применяемым препаратам.

Углеводсодержащие полиеновые антибиотики-макролиды находят широкое применение в медицинской практике для лечения как поверхностных, так и глубоких микозов благодаря своей высокой активности и широкому спектру действия. Нистатин Аь партрицин А, пимарицин и другие противогрибковые антибиотики применяются местно, а амфотерицин В, единственный из полиенов, используется преимущественно для лечения глубоких системных микозов. Их высокая гемато- и нефротоксичность, плохая растворимость в воде, низкая всасываемость из желудочно-кишечного тракта и целый ряд других побочных реакций стимулировали интенсивные поиски новых менее токсичных и более эффективных препаратов. Однако до последнего времени ни одно из новых природных, полусинтетических или биосинтетических производных из группы полиеновых макролидов, показавшее некоторые преимущества перед «золотым стандартом» амфотерицином В в эксперименте, не было внедрено в клинику.

С развитием генной инженерии за последние годы появилась возможность получать новые активные аналоги полиенов, которые могут быть использованы как сами по себе, так и в качестве стартовых соединений в химическом синтезе для создания новых противогрибковых препаратов с улучшенными фармакологическими характеристиками. Исследования в области получения и изучения связи структура-активность новых полиеновых структур расширяют фундаментальные знания о сайтах молекулы, ответственных за биологическую активность и направлены на создание противогрибковых средств нового поколения.

Целью настоящей работы является разработка методов химической модификации, получение и изучение биологических свойств новых производных генно-инженерных полиеновых антибиотиков, обладающих преимуществами перед родительскими антибиотиками.

Были поставлены следующие задачи: 1) разработать методы препаративной очистки исходных сырцов генно-инженерных полиеновых антибиотиков S44HP, BSG005, BSG18, BSG019; 2) разработать методы избирательной модификации функциональных групп (С(16)-карбоксильной группы или/и 3-аминогруппы) с сохранением основного скелета молекулы антибиотика, ответственного за противогрибковую активность; 3) получить серии новых моно- и дважды модифицированных производных на основе генно-инженерных полиенов S44HP, BSG005, BSG003, BSG022; 4) получить водорастворимые солевые формы синтезированных полусинтетических производных; 5) наработать наиболее активные соединения в количествах, необходимых для изучения в опытах in vivo; 6) для полученных соединений изучить связь структура - противогрибковая активность в опытах in vitro и in vivo.

Модификация противогрибковых макролидных полиеновых антибиотиков (Обзор литературы) Введение

Возрастание числа больных с грибковыми инфекциями (микозами) как поверхностными, так и инвазивными (системными) связано прежде всего со значительным увеличением числа пациентов с иммунодефицитом [1, 2]. Особенную опасность представляют собой инвазивные микозы. Так, например, инвазивный кандидоз характеризуется тяжестью клинических проявлений и высокой (30-70%) смертностью, а смертность при инвазивном аспергиллезе превышает 50% [1]. Частота инвазивного микоза в онкогематологических стационарах достигает 50%, и даже в условиях интенсивной противогрибковой терапии смертность от микозов детей, больных лейкозом, составляет 29% - 39% [3].

Арсенал средств для лечения системных грибковых инфекций ограничен. Уже более 50 лет для лечения применяются полиеновые макролидные антибиотики, среди которых наиболее важен амфотерицин В (АшВ) вследствие его высокой эффективности и широкого спектра действия. Успешное применение противогрибковых препаратов из класса азолов на какое-то время отодвинуло полиеновые макролиды на второй план, однако быстрое привыкание микроорганизмов к азолам [1,2] побудило усилить поиск новых препаратов [2,4].

Важным преимуществом полиенов перед другими типами противогрибковых препаратов является сравнительно низкая частота развития устойчивости к ним. В настоящее время АтВ - единственный полиеновый макролид, разрешенный к применению при системных грибковых инфекциях. Однако применение АтВ существенно ограничено вследствие выраженной нефротоксичности, гематотоксичности, очень низкой растворимости в воде и субоптимальной фармакокинетики (т.е. лечебные дозы препарата близки к максимально переносимым дозам) [1,2].

Необходимость поиска новых противогрибковых средств среди полиенов связаны с потребностью в создании препаратов, более эффективных для лечения инвазивных микозов, и в то же время, лишенных тяжелых побочных эффектов.

В мировой практике создание новых перспективных препаратов осуществляется, главным образом, химической модификацией природных антибиотиков. За последние 15 лет разработаны и предложены новые реагенты и методы, которые позволили получить серии новых полусинтетических производных на основе природных полиенов. Было изучено влияние отдельных элементов структуры антибиотиков на противогрибковую активность в модельных опытах in vitro и in vivo. В ряде случаев удалось получить препараты нового поколения, перспективные для внедрения в клинику.

Механизм действия полиенов, который мог бы помочь в целенаправленном поиске новых структур, еще недостаточно изучен. За эти годы появилась серия публикаций, посвященных углубленному изучению механизма действия полиеновых антибиотиков, и с этой целью специально были синтезированы их новые аналоги.

С развитием генной инженерии за последние годы появилась также возможность создавать новые биосинтетические аналоги [4]. Они могут быть использованы сами по себе или в качестве стартовых соединений в химическом синтезе для получения новых противогрибковых препаратов с улучшенными фармакологическими характеристиками.

В последнее десятилетие опубликовано несколько обзоров, посвященных полиеновым антибиотикам. Однако они либо несут общий ознакомительный характер [5], либо в них сконцентрировано внимание на полном синтезе антибиотика АшВ [6].

Настоящий обзор посвящен основным достижениям за последние ~15 лет в области создания новых аналогов АтВ и других родственных полиенов методами современного химического дизайна.

выводы

1. Разработаны методы химической модификации генно-инженерных,гептаенов по 3-аминогруппе остатка микозамина или С(16)-карбоксильной группе агликона. Получение карбоксамидов антибиотиков проводилось в присутствии РуВОР без1 предварительной, защиты аминогруппы микозамина. Для модификации 3'-аминогруппы использованы методы восстановительного аминирования, N-аминоацилирования и реакция Амадори.

2. Строение продукта перегруппировки Амадори, образующегося при взаимодействии антибиотика S44HP с 1-13C-D -глюкозой, подтверждено методом С ЯМР спектроскопии.

3. Разработаны методы двойной химической трансформации полиеновых антибиотиков с использованием двух подходов - N-замещение карбоксамидов или амидирование N-аминоацилированных полиеновых антибиотиков.

4. Получено 48 новых соединений (монозамещенные производные N-алкильного или N-аминоацильного типа, или С(16)-карбоксамиды, а также дважды модифицированные аналоги). Изучена их противогрибковая активность в опытах in vitro. Среди них 25 соединений показали близкую или превосходящую активность амфотерицину В.

5. Показано, что влияние на противогрибковую активность введения одного и того же заместителя в молекулу полиеновых антибиотиков, отличающихся заместителями при С(16) может быть разнонаправленным.

6. Установлено, что расположение гидроксильных групп в полиольном регионе агликона является определяющим для проявления противогрибковой активности и наиболее благоприятно в положениях С(7) и С(10), что соответствует антибиотику S44HP, его С(16)-метильному аналогу BSG005 и их производным.

7. Шесть новых производных полиеновых макролидов наработаны в препаративных количествах (чистота >95% по данным ВЭЖХ) для изучения в опытах in vivo; показано, что четыре из них (производные S44HP и BSG005) обладают преимуществом перед амфотерицином В; 2-(Ы,>Т-диметиламино)этиламид S44HP (28) отобран для углубленного доклинического изучения.

Диссертационная работа выполнена в сотрудничестве с Норвежским Университетом Науки и Технологии (г. Трондхейм), а также поддержана грантом Президента РФ НШ 5290-2010 и грантом РФФИ 10-03-00210а.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает глубокую признательность д.х.н. проф. Преображенской Марии Николаевне за научные консультации и плодотворное обсуждение диссертации.

Автор выражает благодарность за помощь в работе по синтезу и очистке производных к.х.н. А.Н. Тевяшовой, к.х.н. С.С. Принцевской и Т.А. Лойм, за получение и интерпретацию ЯМР-спектров к.х.н. Ю.Н. Лузикову, за получение данных ВЭЖХ -к.б.н. М.И. Резниковой и Н.М. Малютиной, за проведение биологических испытаний сотрудникам отдела микробиологии и лаборатории фармакологии и химиотерапии Учреждения Российской Академии Медицинских Наук НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе.

5. Заключение

Подводя итог, можно отметить, что за последние 30 лет получено4 множество производных полиеновых антибиотиков и накоплен практический опыт по синтезу и изучению их биологической активности. На основе изучения связи структура -активность определены главные сайты молекулы, ответственные за проявление противогрибковой активности. Предложена молекулярная модель комплекса антибиотика с мишенью. Однако многие вопросы остаются невыясненными. И главное - как нужно изменить, «подправить» молекулу антибиотика, чтобы сохранить высокую противогрибковую активность и снизить токсичность. Имеются объективные сложности в изучении механизма действия полиенов, решение которых могло бы помочь в целенаправленном поиске перспективных структур. В частности, применяющаяся для исследований модель взаимодействия антибиотика с мишенью -мембраной дает недостаточную информацию. Недостаточно изучено влияние заряда в положении С(16) (карбоксильной группы) молекулы амфотерицина В на биологические свойства; не ясно влияние числа и расположения гидроксильных групп в полиольном фрагменте и ряда других факторов на проявление нежелательных токсических эффектов. Все эти проблемы отчасти объясняют, почему до настоящего времени для лечения инвазивных микозов не удалось внедрить в клиническую практику ни одного нового препарата полиеновой группы, заменяющих амфотерицин В, хотя попытки делались неоднократно и делаются сейчас. Проблема снижения токсичности и одновременного увеличения противогрибковой активности не может быть решена только биохимическими исследованиями или в опытах на культурах клеток in vitro.

В то же время синтез и изучение новых рядов полиеновых структур, отличающихся одной или двумя модификациями, и изучение связи структура-активность открывают новые возможности создания и последующего отбора перспективных соединений для углубленного изучения. На достаточно раннем этапе требуется проведение серии биологических испытаний in vivo, поскольку опыты на животных остаются наиболее достоверным способом выявления эффективных лекарственных противогрибковых средств с улучшенными фармакологическими характеристиками. Особую ценность представляют модельные опыты на иммунодефицитных животных, так как они наиболее приближены к условиям будущего клинического применения полиеновых антибиотиков при системных грибковых заболеваниях.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ *

Полиеновые макролидные антибиотики, такие как амфотерицин В (1) и нистатин А1 (2)' (рис 1). используются в клинической практике на протяжении последних 50 лет вследствии их эффективности и широкого спектра действия. Однако и они имеют ряд недостатков, вызванных прежде всего их высокой токсичностью и низкой растворимостью в воде. В промышленных масштабах -1 и 2 производят путем биосинтеза. Одним из перспективных направлений поиска новых полиеновых макролидных антибиотиков являются методы генной инженерии (см. обзор литературы, раздел 1.2).

Рис 1. Структуры некоторых полиеновых антибиотиков применяемых в клинике.

Характеристика исходных генно-инженерных полиеновых антибиотиков.

Объектом настоящего исследования являются новые генно-инженерные полиеновые макролиды: 844НР, ВБОООЗ, В80005, В80018, В8в019 и В8С022 (Рис 2), созданные в Норвежском Университете Науки и Технологии (г. Трондхейм, Норвегия) и представляющие собой аналоги нистатина А1 (2). Новые полиены были получены в результате манипуляций с генным материалом на основе штамма продуцента 2, который содержит 4+2 сопряженных двойных связей и относится к группе тетраенов. В то же время все новые генно-инженерные полиены правомерно рассматривать также близкими аналогами амфотерицина В (1), поскольку они так же, как и амфотерицин В входят в группу гептаенов. нумерация соединений, рисунков, схем и таблиц отлична от использованной в обзоре литературы.

На основе штамма продуцента нистатина А1 (2) бактерии БП-ерЮтусея поиг$е1 АТСС 11455 методами генной инженерии норвежскими учеными (Зотчев С.Б. и сотр.) был создан мутантный штамм 5. поиг$& С050738Р с генетически измененной ПКС КуБС. Из-за отсутствия в домене еноилредуктазы рекомбинантный штамм продуцировал гептаеновый аналог нистатина 28,29-дидегидронистатин А1 - Б44НР (3) (Рис 2) [10].

Рис 2. Структуры генно-инженерных аналогов нистатина А]. он он

16 (3) 844НР, Я=СООН

Л (4) В8С005, Я^СНз

5) BSG022, R=COOH

6) BSG019, R=CH3

R (7) BSG003, R=COOH (8) BSG018, R=CH3

Работа этого фермента в случае биосинтеза 2 приводила к образованию одинарной связи между атомами С(28)-С(29), в то время как в процессе биосинтеза 1 двойная связь в том же положении не восстанавливалась. Соединение 3 превосходило исходный 2 по противогрибковой активности в 2-10 раз в большинстве тестов in vitro, и проявляло более широкий интервал между максимально переносимой дозой (МПД) и средней летальной дозой (1ЛЭ50) в опытах на животных по сравнению с 1 [14]. Появление дополнительной двойной связи С(28)-С(29) в полиеновой части молекулы 2 повышало его противогрибковую активность в отношении большинства изученных штаммов, что может быть объяснено повышением эффективности взаимодействия антибиотика с мишенью микроорганизмов (см. литературный обзор, раздел 2. механизм действия).

Инактивация гена, ответственного за работу метилоксидазы А^уА^, окисляющей С(16)-метильную группу в С(16)-карбоксильную, в рекомбинантном штамме-продуценте 844НР (3) - & поикег, привела к образованию высокоактивного аналога 16-декарбокси-16-метил-28,29-дидегидронистатина А] - ВБ0005 (4) (.Рис 2) (Приложение 1). При сохранении высокой противогрибковой активности на уровне 3, 4 проявил существенно меньшую токсичность по сравнению с 3 и АтВ (1) [15].

Структуры двух других С(16)-карбоксилсодержащих генно-модифицированных полиенов, используемых в работе, были созданы на основе мутантного штамма-продуцента 3 и отличались от него расположением гидроксильных групп в полиольной части молекулы при атомах С(9) и С(10) (Рис 2). Инактивация работы цитохром Р450-зависимой монооксигеназы ЫуяЬ на завершающей стадии биосинтеза 3 привела к блокированию реакции гидроксилирования положения С(10) в молекуле полиена. Таким образом был получен новый полиеновый антибиотик 10-дезокси-28,29-дидегидронистатин А1 - ВБС022 (5) (Рис 2) (Приложение 2). Инактивация дегидратазного домена в модуле 15 (БН15) в ПКС NysJ путем сайт специфического мутагенеза позволило ввести дополнительную гидроксильную группу в положение С(9). В связи с изменением в данной области, участок С(9)-С(11) перестал распознаваться монооксигеназой ЫуяЬ и вследствие этого положение С(10) не гидроксилировалось. Такая генная манипуляция привела к образованию нового поливного антибиотика 9-гидрокси-10-дезокси-28,29-дидегидронистатина А1 - ВБОООЗ (7) (Рис 2) (Приложение 3, 4). Их соответствующие С(16)-декарбокси-С(16)-метильные аналоги - BSG019 (6) и BSG018 (8) (Рис 2) получены так же, как и 4 путем блокирования работы С(16)-метилоксидазы NysN (Приложение 4, 5, 6).

Таким образом, в нашем' распоряжении были 3 пары новых- генно-инженерных^ полиеновых антибиотиков: S44HP (3) и BSG005 (4), BSG022 (5) h<BSG019 (6), BSG003 (7) и BSG018 (8) (Рис 2). Внутри каждой пары заместитель.при,С(16) представлен карбоксильной или метальной группой, а каждая пара отличается от других пар и от AmB (l) расположением гидроксильных групп в области С(7)-С(10) полиольной части, агликона антибиотика. Это является уникальным материалом для изучения роли фрагментов структур данных генно-инженерных полиеновых антибиотиков в проявлении биологической активности.

1. Разработка методов очистки полиеновых антибиотиков.

Генно-инженерные полиеновые антибиотики, являются перспективными для дальнейшего изучения с целью продвижения их в медицинскую практику, а также для использования в качестве стартовых соединений при получении новых полусинтетических производных. В связи с этим, необходимо было наработать исходные генно-инженерные полиеновые антибиотики в препаративных количествах с высокой степенью чистоты (>95% содержания основного вещества по данным ВЭЖХ).

Работа по очистке и химической модификации полиеновых макролидов является нетривиальной- задачей, поскольку осложнена их ограниченной растворимостью в водных растворах и во многих органических растворителях, а также лабильностью в кислых и щелочных растворах, агрегацией, легкостью окисления кислородом воздуха и склонностью к изомеризации транс-диеновых фрагментов в цис-диеновые под действием света.

Образцы генно-инженерных полиенов (3-8) (Рис 2), предоставленные фирмой SINTEF (Норвегия), представляли собой сырцы, выделенные после ферментации и содержащие различные примеси соединений как полиеновой, так и- неполиеновой природы. Антибиотик S44HP (3) единственный из всех имел приемлемую чистоту (9255

94% псь данным ВЭЖХ) и использовался для дальнейшей модификации без предварительной очистки. Суммарное содержание полиенов в сырцах определяли на основании спектрофотометрии их растворов в БМБО (0.01 мг/мл) в УФ диапазоне и в 1 видимой области (ВО) при длине волны 415 нм. В качестве стандарта использовался 3. Полиеновый состав анализировали с помощью ВЭЖХ и масс-спектрометрии. В таблице 1 приведены некоторые характеристики исходных полиенов. В качестве основных примесей полиеновой природы были идентифицированы соответствующие агликоны и вещества, содержащие дополнительный углеводный остаток в составе молекулы.

1. Практическое руководство по антиинфекционной химиотерапии.// Страчунский Л.С., Белоусов Ю.Б., Козлов С.Н.-М: Боргес.- 2002.

2. Demain A.L., Sanchez S. Microbial drug discovery: 80 years of progress.// J.Antibiotics.-2009.-V. 62.-P. 5-16.

3. Caffery P., Aparicio J.F., Malpartida F., Zotchev S.B. Biosynthetic engineering of polyene macrolides towards generation of improved antifungal and antiparasitic agents.// Curr. Top. Med. Chem.-2008.-V. 8.-P. 639-653.

4. Espinel-Ingroff A. Antifungal agents.// Encyclopedia of microbiology, third edition. Elsevier Inc. USA.-2009.

5. Cereghetti D.M., Carreira E.M. Amphotericin B: 50 years of chemistry and biochemistry.// Synthesis.-2006.-V. 6.-P. 914-942.

6. Czerwinski A., Konig W.A., Sowinski P., Borowski E. Amides of polyene macrolide aureofacin. Synthesis and biological properties.// J.Antibiotics.-1987.-V. 40.-P. 10231027.

7. Yoshioka S., Stella V.J. Stability of drugs and dosage forms.// Kluver Academic/Plenum Publishers NY.-2000.

8. Borgos S.E.F., Tsan P., Sletta H., Ellingsen T.E.,.Lancelim J.-M, Zotchev S.B. Probing the structure-function relationship of polyene macrolides: engineered biosynthesis of soluble nystatin analogues.// J. Med. Chem.-2006.-V. 49.-P. 2431-2439.

9. Bruheim P., Borgos S.E.F., Tsan P., Sletta H., Ellingsen Т.Е., Lancelin J-M., Zotchev S.B. Chemical diversity of polyene macrolides produced by Streptomyces noursei

10. АТСС11455 and recombinant strain ERD44 with genetically altered polyketide synthase NysC.//Antimicrob. agents and chemother.-2004.-V. 48.-P. 4120-4129.

11. Byrne В., Carmody M., Gibson E., Rawlings В., Caffrey P. Biosynthesis of deoxyamphotericins and deoxyaphteronolides by engineered strains of Streptomyces nodosus.//Chemistry and Biology.-2003.-V. 10.-P. 1215-1224.

12. Carmody M., Murphy В., Byrne В., Power P., Rai D., Rawlings В., Caffrey P. Biosynthesis of amphotericin derivatives lacking exocyclic carboxyl groups.// J. Biol. Chem.-2005.-V. 280.-P. 34420-34426.

13. Palacios D., Anderson Т., Burke M. A post-PKS oxidation of the amphotericin В skeleton predicted to be critical for channel formation is not required for potent antifungal activity.//J. Am. Chem. Soc.-2007.-V.0129.-P. 13804-13805.

14. Matsumori N., Tahara K., Yamamoto H., Morooka A., Doi M., Oishi Т., Murata M. Direct interaction between amphotericin В and ergosterol in lipid bilayers as revealed by 2HNMR spectroscopy.//J. Am. Chem. Soc.-2009.-V. 131.-P. 11855-11860.

15. Структура и мембранная функция полиеновых макролидных антибиотиков.// Касумов Х.М.-М.: Наука, Баку: ЭЛМ.-2009.

16. Andreoli Т.Е. The structure and function of amphotericin В cholesterol pores in lipid bilayer membranes.// Ann. N.Y.Acad. Sci.-1974.-V. 235.-P. 448-468.

17. Matsumori N., Sawada Y., Murata M: Large molecular assembly of Amphotericin В formed in ergosterol-containing membrane evidenced by solid-state NMR of intramolecular bridged derivative.// J. Am. Chem. Soc.-2006.-V. 128.-P. 11977-11984.

18. Шенин Ю.Д., Белахов В.В. Амфотерицин В: свойства, химическое строение, поиск производных.//Антибиотики и химиотерапия.-1997.-Т. 42.-С. 34-46.

19. Шенин Ю.Д., Белахов В.В., Аравийский Р.А. Нистатин: методы получения, поиск производных и перспективы медицинского применения.// Хим.-фарм. журн.-1993,-Т. 27.-С. 14-21.

20. Driver M.J., Greenlees A.R., MacPherson D.T. A versatile strategy for the derivatisation of the carboxy group of amphotericin B: the preparation of C-16 ketone analogues.// J. Chem. Soc. Perkin Trans.-1992.-V. 23.-P. 3155-3157.

21. Driver M.J., Greenlees A.R., MacLachlan W.S., MacPherson D.T., Taylor A.W. Synthesis of 16-decarboxy-16 hydroxymethyl amphotericin В a novel antifungal agent.// Tetr. Lett.-1992.-V. 33.-P. 4357-4360.

22. Corbett D.F., Dean D.K., Greenlees A.R., Macpherson D.T. Synthesis and antifungal activity of C-16 oximino and vinyl amphotericin В derivatives.// J. Antibiotics.-1995.-V. 48.-P. 509-515.

23. Taylor A.W., Costello B.J., Hunter P.A., MacLachlan.W.S., Shanks C.T. Synthesis and antifungal selectivity of new derivatives of amphotericin B' modified at the C-13 position.//J. Antibiotics.-1993.-V. 46.-P. 486-493.

24. Taylor A.W., MacPherson D.T. Preparation of a novel C-13 thioacetal derivatives ofamphotericin B.// Tetrahedron Lett.-1994.-V. 35.-P. 5289-5292.

25. MacLachlan W.S., Readshaw S.A. Stereoselective synthesis of 13-dehydroxy-(14S)-hydroxyamphotericin В methyl ester.// Tetrahedron Lett.-1995.-V. 36.-P. 1735-1738.

26. Bonner D.P., Mechlinski W., Schaffher C.P. Ill Biological properties of polyene macrolide esters salts.// J. Antibiotics.-1972.-V. 25.-P. 261-262.

27. Jarzebski A., Falkowski L., Borowski E. Synthesis and structure-activity relationship of amides of Amphotericin B.// J. Antibiotics.-1982.-V. 35.-P. 220-229.

28. Slisz M., Cybulska В., Grzybowska J., J.Czub, Prasad R., Borowski E. The mechanism of overcoming multidrug resistance (MDR) of fungi by amphotericin В and its derivatives.// J. Antibiotics.-2007.-V. 60.-P. 436-446.

29. Bruzzese Т., Rimaroli C., Bonabello A., Ferrari E., Signorini M. Amide derivatives of partricin A with potent antifungal activity.// Eur. J. Med. Chem.-1996.-V. 31.-P. 965-972.

30. Белахов B.B., Шенин Ю.Д. Синтез и противогрибковая активность N-бензильных производных амфотерицина В.// Хим.-Фарм. Жур.-2007.-Т. 41.-С. 20-24.

31. Paquet V., Carreira Е.М. Significant improvement of antifungal activity of polyene macrolides by bisalkylation of the mycosamine.// Org. Lett.-2006.-V. 8.-P. 1807-1809.

32. Белахов B.B., Шенин Ю.Д., Аравийский P.A., Штильбанс Е.Б. Синтез и биологическая активность гидрофосфорильных производных амфотерицина В.// Антибиотики и химиотерапия.-1996.-Т. 41.-С. 4-8.

33. Mechlinski W., Schaffher C.P. Polyene macrolide derivatives. I N-acylation and esterification reactions with amphotericin В.// J. Antibiotics.-1972.-V. 25.-P. 256-258.

34. Slisz M., Cybulska В., Mazerski J., Grzybowska J., Borowski E. Studies of the effects of antifungal cationic derivatives of amphotericin В on human erythrocytes.// J. Antibiotics.-2004.-V. 57.-P. 669-678.

35. Grzybowska J., Sowinski P., Gumieniak J., Zieniawa T., Borowski E. N-methyl-N-D-fhictopyranosylamphotericin B methyl ester, new amphotericin B derivative of low toxicity.//J. Antibiotics.-1997.-V. 50.-P. 709-711.

36. K.Wright J.J., Albarella J.A., Krepski L.R., Loebenberg D. N-aminoacyl derivatives of polyene macrolide antibiotics and their esters.// J. Antibiotics.-1982.-V. 35.-P. 911-914.

37. Rimaroli C., Bruzzese T. In vitro activity of new polyene, SPA-S-843, against yeasts.// Antimicrob. Agents Chemother.-1998.-V. 42.-P. 3012-3013.

38. KazanahN., Hamann M.T. SPK-843 (Aparts/Kaken).// Current opinion in investigational drugs.-2005.-V. 6.-P. 845-853.

39. Matsumori N., Umegawa Y., Oishi T., Murata M. Bioactive fluorinated derivative of amphotericin B.// Bioorg. Med. Chem. Lett.-2005.-V. 15.-P. 3565-3567.

40. Tsuchikawa H., Matsushita N., Matsumori N., Murata M., Oishi T. Synthesis of 28-19F-amphotericin B methyl ester.// Tetrahedron Lett.-2006.-V. 47.-P. 6187-6191.

41. Matsumori N., Sawada Y., Murata M. Derivatives with an amino-carbonyl bridge.// J. Am. Chem. Soc.-2005.-V. 127.-P. 10667-.10675

42. Matsumori N., Yamaji N., Matsuoka S., Oishi T., Murata M. Amphotericin B covalent dimers forming sterol-dependent ion-permeable membrane channels.// J. Am. Chem. Soc.-2002.-V. 124.-P. 4180-4181.

43. Umegawa Y., Matsumori N., Oishi T., Murata M. Amphotericin B covalent dimers with carbonyl-amino linkage: a new probe for investigation ion channel assemblies.// Tetrahedron Lett.-2007.-V. 48.-P. 3393-3396.

44. Silverman R. Organic chemistry of drug design and drug action.// San Diego: Elsevier Academic Press.-2004.

45. Falk R., Domb A.J., Polacheck I. A novel: injectable water-soluble amphotericin B-arabinogalactan conjugate.// Antimicrobial agents and chemotherapy.-1999.-V: 43.-P. 1975-1981.

46. Ehrenfreund-Kleinman T., Azzam T., Falk R., Polacheck L Synthesis and characterization of novel' water soluble amphotericin B-arabinogalactan conjugates.// Biomaterials.-2002.-V. 23.-P. 1327-1335.

47. Sokolsky-Papkov M., Domb A.J., Golenser J. Impact of aldehyde content on amphotericin B-dextran imine conjugate toxicity.// Biomacromolecules.-2006.-V. 7.-P. 1529-1535.

48. Ehrenfreund-Kleinman T., Golenser J., Domb A.J. Conjugation of amino-containing drugs to polysaccharides by tosilation: amphotericin B-arabinogalactan conjugates.// Biomaterials.-2004.-V. 25.-P. 3049-3057.

49. Sedlak M., Pravda M., Staud F., Kubicova L., Tycova K., Ventura K. Synthesis of pH-sensitive amphotericin B-poly(ethylene glycol) conjugates and study of their controlled • release in vitro.// Bioorg. Med. Chem.-2007.-V. 15.-P. 4069-4076.

50. Sedlak M.} Pravda M., Kubicova L., Mikulcikova Pi, Ventura K. Synthesis and characterization of a new pH-sensitive amphotericin B-poly(ethylene glycol)-b-poly(L-lysine) conjugate.// Bioorg. Med. Chem. Lett.-2007.-V. 17.-P. 2554-2557.

51. Sedlak M., Drabina P., Bilkova E., Simunek P., Buchta V. New targeting system for antimycotic drugs: p-glucosidase sensitive amphotericin B-star poly(ethylene glycol) conjugate.// Bioorg. Med. Chem. Lett.-2008.-V. 18.-P. 2952-2956.

52. Miroshnikova O.V., Printsevskaya S.S., Olsufyeva E.N., Pavlov A.Y., Nilius A., Hensey-Rudloff D., Preobrazhenskaya M.N. Structure activity relationships in the series of eremomycin carboxamides.// J. Antibiotics.-2000.-V. 48.-P. 3885-3890.