Синтез неогликоконъюгатов различных типов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ОРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. Н.Д. ЗЕЛИНСКОГО РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

КОНОНОВ Леонид Олегович

СИНТЕЗ НЕОГЛИКОКОНЪЮГАТОВ РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ

02.00.03 — Органическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

19 СЕН 2013

Москва—2013

005533117

005533117

Работа выполнена в лаборатории химии углеводов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института органической химии им. Н.Д. Зелинского Российской академии наук (ИОХ РАН), Химическом центре Лундского университета (Лунд, Швеция) и Институте физических и химических исследований (РИКЕН, Вако, Саитама, Япония).

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: Веселовскнй Владимир Всеволодович

доктор химических наук, профессор ИОХРАН

заведующий лабораторией

Маслов Михаил Александрович

доктор химических наук

МИТХТ им. М.В. Ломоносова, доцент

Ямсков Игорь Александрович

доктор химических наук, профессор ИНЭОС РАН заведующий лабораторией

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита состоится " ^ " ^^ 1 2013 г. в 11 часов 00 мин. на заседании

диссертационного совета Д 002.222.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте органической химии им. Н.Д. Зелинского Российской академии наук по адресу: 119991, Москва, Ленинский проспект, д. 47.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИОХ РАН. Автореферат размещен на официальном сайте Высшей аттестационной комиссии при Министерстве образования и науки Российской Федерации по адресу http://vak2.ed.gov.ru/catalogue.

Автореферат разослан " 12 " сентября 2013 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Д 002.222.01

доктор химических наук Л.А. Родиновская

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ И ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Гликоконъюгаты (ГК) - это соединения, в которых углеводные фрагменты связаны с молекулами других классов (например, белками в гликопротеинах или липидами в гликолипидах). ГК широко распространены в природе и являются важнейшими биомолекулами, определяющими протекание многих иммунологических, нейробиологических, онкологических и других биологических процессов. Эти процессы основаны на молекулярном распознавании углеводных структур, расположенных на поверхности клеток и кодирующих информацию, которая во многом определяет характер межклеточного взаимодействия, адгезии и пролиферации клеток. Важность углеводов определяет необходимость получения индивидуальных структурно охарактеризованных соединений для использования в биологических исследованиях.

Вследствие малой доступности природных ГК, а также внутренне присущих им ограничений, таких как гетерогенность и отсутствие дополнительных функциональных групп для модификации, их применение для изучения взаимосвязей структура-свойство является проблематичным. В связи с этим уже на самых ранних этапах изучения биологической специфичности ГК возникла потребность получения неогликоконъюгатов (НТК) - их синтетических или полусинтетических аналогов, которые тем или иным образом имитируют поведение природных ГК и обладают преимуществами в плане возможности получения индивидуальных и, следовательно, в большей степени структурно-охарактеризованных продуктов по сравнению с природными ГК. В настоящее время НГК востребованы в качестве инструментов исследования практически во всех разделах гликобиологии.

Одной из наиболее актуальных задач современной химии углеводов является разработка эффективных методов синтеза НГК различного типа. Ее решение подразумевает умение присоединять любые сахариды к любому типу носителя,* тем самым преодолевая ограничения природных ГК. Возможность широкого варьирования структуры НГК важна как для детального изучения функционирования родоначальных природных ГК в живых системах, так и для создания на основе НГК новых диагностических и лекарственных препаратов. НГК должны с одной стороны имитировать функции природных ГК, а с другой стороны быть лишенными их свойств, нежелательных с точки зрения практического применения (например, нерастворимости в воде, нестабильности или токсичности).

Целью данной работы являлась разработка новых эффективных подходов к синтезу НГК различных типов. В НГК условно выделяют три части (схема 1): углеводный фрагмент биологически значимого природного ГК (или его аналог), носитель и спейсер (или «мостик»). Из схемы 1 видно, что синтез НГК не сводится только к стадии конъюгации. Для достижения поставленной цели необходимо решить целый комплекс задач, включая (1) получение частично защищенных моно- и олигосахаридных производных, (2) сборку олигосахаридов с помощью реакций гликозилирования, (3) введение в углеводный фрагмент

Для упрощения обсуждения термин «носитель» трактуется здесь в расширительном смысле: под ним понимается не только полимерный носитель (растворимый или нерастворимый, в частности, поверхность), но и фармакофорный фрагмент физиологически-активного вещества (ФАВ, в том числе лекарства) или «метка», которая позволяет отслеживать локализацию НГК в тестовой системе, в том числе /я vivo.

функционализованного спейсера, который будет соединять оба компонента НТК и который подходит для решения конкретной прикладной задачи, и, наконец, (4) собственно конъюгацию сахарида с носителем. Вследствие этого поиск новых решений каждой из этих отдельных задач являлся необходимым и важным элементом данной работы, во многом определившим успешное достижение поставленной цели в целом.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Разработаны новые эффективные подходы к синтезу НТК различных типов: (1) предложен унифицированный подход к синтезу ГК полиэдрических соединений бора - потенциальных агентов для бор-нейтронозахватной терапии рака (БНЗТ); (2) разработан улучшенный метод синтеза лактама сиалоолигосахаридной цепи ганглиозида Смз - негидролизуемого аналога соответствующего лактона, а также неогликопротеина и неогликолипида на основе Смз-лактама; (3) разработан метод стереоселективного синтеза нового НГК гликолипидного типа - сиалил(полипренил)фосфата, (4) осуществлен первый синтез сиалил-донора на полимерном носителе (НТК полимерного типа), (5) разработан синтез НГК сополимерного типа на основе олигосахаридов, включающих остатки уроновых кислот в виде амидов с аминокислотами.

Синтез НГК последнего типа удалось реализовать благодаря использованию развитого в данной работе эффективного способа получения селективно защищенных производных уроновых кислот, основанного на их лактонизации и последующем селективном алкоголизе лактонной группировки.

В зависимости от задачи для синтеза каждого типа НГК использовались различные способы спейсеризации. Спейсер присоединялся как в аномерное положение (олиго)сахарида (агликон-спейсер), так и к боковой цепи одного из моносахаридов; конъюгация углеводного фрагмента с носителем осуществлялась также и без спейсера. Применялся фиксированный агликон-спейсер или синтетический предшественник окончательного спейсера («лреспейсерный» подход), а также способ, основанный на блокировании аномерного положения временной защитной группой. Разработан подход к синтезу НГК, позволяющий модифицировать агликон-спейсер, не повторяя синтез углеводного (олигосахаридного) фрагмента; при этом в качестве удобного преспейсера предложено использовать 2-азидоэтильный агликон.

Обнаружена ранее неизвестная реакция деборирования клозо-о/дао-карборанов, входящих в состав НГК, которая протекает в водных растворах и приводит к образованию соответствующих конъюгатов с нндо-карборанами.

Внесен существенный вклад в химию сиаловых кислот. Впервые для стереоселективного синтеза сиалоолигосахаридов использован сиалил-донор на полимерном носителе. Впервые показана возможность использования сиалилхлоридов для О-гликозилирования при отсутствии промотора, и этот метод применен для стереоселективного синтеза а- и Р-гликозилфосфатов и сиалил(полипренил)фосфата - предполагаемого интермедиата биосинтеза бактериальных полисиаловых кислот, а также метил- и аллилсиалозидов с а-конфигурацией. Предложен новый эффективный подход к синтезу гликалей сиаловых кислот - предшественников ряда противовирусных препаратов.

Предложена оригинальная научная гипотеза, объясняющая химическое поведение реагентов образованием нековалентно-связанных супрамолекулярных агрегатов реагирующих молекул - супрамеров.1, На этой основе предложен нетрадиционный («супрамерный») подход к планированию экспериментов и анализу их результатов, позволивший выявить экспериментальные параметры, которые ранее не рассматривались как определяющие исход гликозилирования, такие как концентрации реагентов, присутствие в реакционной смеси других соединений, включая «нереагирующие» добавки или примеси, и время реакции.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Результаты, полученные в ходе выполнения данной работы, нашли практическое применение. Предложенный нами 2-азидоэтильный агликон широко используется для получения НГК в различных лабораториях.1

Синтезированные в данной работе НГК различных типов были использованы в гликобиологических исследованиях. Так, с помощью НГК сополимерного типа на основе олигосахаридов, включающих остатки уроновых кислот в виде амидов с аминокислотами, были охарактеризованы эпитопы О-специфических полисахаридов (О-антигенов) клинически значимых бактерий рода Proteus.

С практической точки зрения важна обнаруженная в данной работе зависимость скорости деборирования карборан-углеводных конъюгатов в воде от природы агликона-спейсера, соединяющего углеводный фрагмент с карборановым каркасом. Эта находка открывает путь к получению НГК с различными физико-химическими свойствами путем выбора спейсера, который будет либо стабилизировать (по отношению к гидролизу) гидрофобный борный клозо-полиэдр, либо, наоборот, способствовать его легкому превращению в более гидрофильный hwóo-карборан. Соответственно, будет отличаться способность НГК проникать внутрь клетки и, как можно ожидать, эффективность препаратов для БНЗТ на их основе.

Предложенные простые способы синтеза гликаля /V-ацетилнейрамшювой кислоты, а также метил- и аллилсиалозидов с a-конфигурацией позволяют получать эти важные продукты в мультиграммовых количествах, что невозможно с использованием ранее известных подходов, которые плохо масштабируются и/или требуют дорогих и токсичных реагентов.

Использование сиалил(полипренил)фосфата в качестве первичного гликозил-акцептора в сиалилировании, катализируемом сиалилтрансферазами, позволит прояснить детали биосинтеза полисиаловых кислот в менингококках и кишечной палочке и выявить новые потенциальные мишени для терапии заболеваний, вызываемых этими бактериями.

Сиалил-донор на полимерном носителе, впервые предложенный в данной работе, открывает уникальную возможность стереоселективного синтеза сиалоолигосахаридов с

' Расширение области применения термина «супрамер» вызвано необходимостью изменения трактовки старых понятий о природе частиц (кластеров), образуемых молекулами реагирующих веществ в растворах, которые наряду с молекулами растворенных веществ могут также включать и молекулы растворителя.

5 Индекс цитирования (ИЦ) соответствующей публикации - 81 по данным Интернет-ресурса Web of Knowledge (http ://wokinfo.com).

использованием автоматических синтезаторов - направления, интенсивно развивающегося в настоящее время.

Предложенный «супрамерный» подход позволил интерпретировать некоторые необычные факты и предсказать неожиданные результаты реакций. С его помощью разработаны высокоэффективные и стереоселективные синтезы гликозидных связей Neu5Ac-(a2->3)-Gal и Neu5Ac-(a2—>6)-Gal, присутствующих во многих биологически важных сйалоолигосахаридах и гликоконъюгатов.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ И ПУБЛИКАЦИИ

Основные результаты диссертационной работы были представлены на 18 международных и 7 всероссийских конференциях (из них 17 устных докладов, включая 14 на международных конференциях). Лично автором представлено 10 устных докладов (включая 3 приглашенных) и 5 стендовых докладов. Данные, полученные в работе, изложены в 64 публикациях, в том числе в ведущих отечественных и зарубежных рецензируемых научных журналах, включенных в Перечень ВАК (28 статей, в том числе один обзор), сборниках статей (2 публикации) и тезисов докладов на международных и всероссийских конференциях (31 тезис). По теме работы также опубликованы 3 главы в книгах Neoglycoconjugates: Preparation and Application, Carbohydrate Chemistry: Proven Synthetic Methods и Advances in Chemistry Research. Многие публикации имеют высокие индексы цитирования (см. список публикаций автора по теме диссертации).

ЛИЧНЫЙ ВКЛАД АВТОРА

Автор непосредственно участвовал в планировании и проведении научных экспериментов, получении исходных данных, обработке, интерпретации, обсуждении результатов и их обобщении. Все выводы работы базируются на данных, полученных автором лично или при его непосредственном участии (в том числе аспирантами и сотрудниками под его руководством) в результате совместных исследований с соавторами научных работ, перечисленных в списке публикаций автора по теме диссертации. В диссертации частично использованы идеи и/или разработки, принадлежащие АЛ. Черняку, Й. Магнуссону, Т. Огава, В.Н. Шибаеву, В.И. Брегадзе и их сотрудникам, опубликованные в соавторстве с ними. Основные статьи по работе подготовлены лично автором (19 из 33) или при его непосредственном участии. По тематике представленной работы под руководством автора были подготовлены и защищены две диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ

Диссертация изложена на 370 страницах и состоит из введения, результатов и их обсуждения в свете литературных данных, заключения, выводов, экспериментальной части, списка цитируемой литературы (1108 наименований), а также списка публикаций автора по теме диссертации (64 наименования). Номера глав и шифры соединений в автореферате соответствуют тексту диссертации.

Схема 1 Общие подходы к синтезу неогликоконъюгатов различных типов

(структура работы)

Неогликоконъюгаты

(условно выделяют три компонента в молекуле)

ЖЗЯЙВВЙ^ЗЯ?!®

Обсуждение общих принципов синтеза неогликоконъюгатов (Глава 1)

Углеводный фрагмент

(моно- или олигосахаридный лиганд -определяет специфичность взаимодействия НГК с углевод-узнающими белками-рецепторами)

Синтез (олиго)сахаридов

(может быть нетривиален)

т

Синтез моносахаридных блоков (Главы 3.4.5.6)

Сборка олигосахарида (гликозилирование) (Главы 3.4.6.7)

Развитие методов гликозилирования (Главы 5.6.7)

Преспейсер

(особенно удобен при смене спейсера)

Спейсер

(обеспечивает доступность лиганда для взаимодействия с рецептором)

Стратегия спейсеризации

(возможны различные подходы)

Фиксированный спейсер -"(Глава 2) Преспейсерный подход (позволяет варьировать -спейсер, не повторяя синтез олигосахарида) -(Глава 3)

Аномерная защитная группа (позволяет вводить спейсер _после завершения сборки олигосахарида)-(Глава 4)

Конъюгация без спейсера -"(Главы 4. 51

Спейсер не в аномерном „положении сахара -(Глава 6)

«Носитель»

(обеспечивает поливалентность, физиологическую активность или возможность селективной детекции)

Выбор «носителя»

(определяется задачей)

Лекарственный -препарат (Глава 2)

Синтетический -полимер (Главы 3.6)

Белок (Глава 4)

Природный липид (Глава 4)

Неприродный липид (Глава 5)

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ*

Глава 1. Общие принципы химического синтеза неогликоконъюгатов+

В главе 1 диссертации кратко рассмотрены наиболее широко используемые типы НТК, а также возможности, которые открывает их применение в биологии и медицине. Сформулированы современные представления о наиболее целесообразных подходах к химическому синтезу НТК, а также о тех аспектах, которые приходится принимать во внимание при его планировании. Особое внимание уделено выбору стратегии спейсеризации, определяемому задачей синтеза каждого типа НТК.

В последующих разделах приведены примеры получения конкретных НТК различных типов, необходимых для разнообразных медико-биологических исследований, каждый из которых имеет определенные особенности. Это синтезы гликоконъюгатов с препаратами для БНЗТ (глава 2), гликополимеров на основе фрагментов бактериальных полисахаридов, включающих амиды гликуроновых кислот с аминокислотами (глава 3), неогликопротеина и неогликолипида на основе лактама сиалоолигосахаридной цепи ганглиозида Стмз (глава 4), а также НТК гликолипидного типа - сиалил(полипренил)фосфата (глава 5) и гликополимерного типа - полимерного сиалил-донора (глава 6). Проблемы, которые пришлось решать в ходе синтеза этих НТК, стимулировали развитие соответствующих разделов химии углеводов и органической химии в целом.

Глава 2. Синтез конъюгатов полиэдрических соединений бора с углеводами*

2.1. Введение

Бор-нейтронозахватная терапия представляет собой метод лечения онкологических заболеваний, основанный на введении в опухоль стабильного изотопа 10В и ее последующем облучении потоком тепловых нейтронов, что позволяет в идеале избирательно разрушать клетки опухоли а-частицами, образующимися при распаде ядра бора, не затрагивая окружающую здоровую ткань.

Одним из путей повышения селективности накопления в опухоли препаратов для БНЗТ может быть направленная доставка соединений бора в клетки опухоли за счет специфических углевод-белковых взаимодействий (так называемое гликоадресование). Конъюгаты полиэдрических соединений бора (ПСБ) с углеводными лигандами лектинов, экспрессирующихся на поверхности раковых клеток, могут стать перспективными агентами для БНЗТ. К началу данной работы не существовало единого подхода к синтезу конъюгатов олигосахаридов с ПСБ различного типа, что связано как со сложностью синтеза функциональных производных ПСБ, так и с тем, что известные условия функционализации и присоединения углеводного фрагмента к гидрофобным карборанам и гидрофильным

* Строение всех полученных впервые соединений однозначно подтверждено методами спектроскопии ЯМР !Н и 13С, двумерной корреляционной спектроскопии ЯМР 'Н-'Н и 'Н-1ЭС, а также масс-спектрометрией. т Совместно с Й. Магнуссоном и др. [1] (здесь и далее приведены ссылки на публикации автора; фамилии всех соавторов см. в списке публикаций по теме диссертации в конце автореферата). ' Совместно с В.И. Бретадзе и др. [4,6,20,22,24-26,35,38,43^15].

додекаборат-анионам значительно различаются и неприменимы для сложных олигосахаридов.

2.2. Унифицированный подход к синтезу конъюгатов лактозы с полиэдрическими соединениями бора

В данной работе на модели легко доступного дисахарида лактозы предложен подход, который позволяет связывать ПСБ любого типа с производными олигосахаридов (схема 2-1). Для обеспечения узнавания углеводного фрагмента лектинами особенно важны терминальные участки на невосстанавливающем конце олигосахарида. В связи с этим в данном случае был применен фиксированный агликон-спейсер, присоединенный к аномерному положению лактозы.

о .,_,„

углеводное производное ПСБ

производное

» - В или С .-ВН или СН о-ВН

X и Y - спейсеры

Схема 2-1. Общая схема получения незащищенных конъюгатов углеводов с полиэдрическими соединениями бора. Реагенты и условия: a. DMT-MM, Л-мстилморфолин, Ме0Н-Н20. Шестичленный цикл на структурах обозначает моно- или олигосахаридный фрагмент.

Наиболее эффективным вариантом синтеза ГК карбоксилсодержащих ПСБ оказалось использование производных олигосахаридов без О-защитных групп и построение амидной связи в водном МеОН в присутствии ЛГ-метил-Лг-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)морфолгагайхлорида (DMT-MM) в качестве конденсирующего агента (схема 2-1), что привело к НГК 8-11 с выходами 50-74% (рис. 2-1).

н° -он но

8 (50%)

но он но он

10 (74%)

Рис. 2-1. Синтезированные незащищенные конъюгаты лактозы с ПСБ.

Отличительной особенности) предложенного способа конъюгирования ПСБ с углеводами является отсутствие защитных групп на остатке лактозы. Это особенно важно для додекаборат-углеводных конъюгатов, освобождение которых от защитных групп часто превращается в нетривиальную задачу. Предложенный подход эффективен как для О-гликозидов, так и для ТЧ-гликозидов, и может быть применен для конъюгирования и более сложных олигосахаридов, в том числе >1-гликозиламидных производных восстанавливающих олигосахаридов, выделенных из природных источников.

2.3. Деборирование конъюгатов клозо-карборана с лактозой

В ходе данной работы обнаружена ранее не известная реакция деборирования клозо-орто-карборанов в составе НГК, которая приводит к образованию соответствующих ГК с нидо-

-7-

карборанами (схема 2-2). Показано, что стабильность НТК на основе клозо-карборанов в водных растворах существенно зависит от природы спейсера. Почти десятикратное различие в скорости деборирования коньюгатов 8 и 10 нашло объяснение в рамках «супрамерного» подхода, подробно изложенного в главе 7. Вероятно, оно связано со значительно меньшей доступностью для атаки водой карборанового каркаса в супрамолекулярных мицеллоподобных агрегатах (супрамерах) конъюгата 8 вследствие образования большего числа межмолекулярных водородных связей, дополнительно стабилизирующих эти агрегаты.

Схема 2-2. Скорость деборирования коньюгатов лактозы (Lac) с орто-карбораном зависит от строения спейсера. Спектры ЯМР "В{'Н} в D20: (а) конъюгат 1,2-дикарба-клозо-додекаборана с лактозой 10; (6) конъюгат 1,2-дикарба-ныдо-ундекаборана 10а, полученный нагреванием водного (D20) раствора 10 при 60 °С в течение 17 ч; (с) то же, что и (Ь) после удаления Н3В03; (с!) схема реакции; (е) схема, показывающая различия в строении коньюгатов 8 и 10, а также место атаки молекулы воды. Реагенты и условия: /. Н20, 60 °С, время полной конверсии - 165 ч (для 8) и 17 ч (для 10).

Полученные соединения переданы на испытания в ФГУП «ГНЦ Институт биофизики» ФМБА РФ для исследования их примененимости в качестве препаратов для БНЗТ.

Глава 3. Синтез НГК на основе фрагментов бактериальных полисахаридов, включающих амиды уроновых кислот с аминокислотами*

3.1. Введение

Аминокислоты (лизин, аланин, серии, треонин и др.), связанные амидной связью с карбоксильными группами уроновых кислот, являются компонентами ряда капсулярных и О-специфических полисахаридов (О-антигенов) условно-патогенных бактерий, вызывающих главным образом инфекции мочевыводящих путей и ран. В данной работе осуществлен синтез фрагментов олигосахаридов, содержащих амиды уроновых кислот с аминокислотами (рис. 3-1), в форме, пригодной для их превращения в НГК сополимерного типа (на основе полиакриламида), которые востребованы для характеризации эпитопов полисахаридных антигенов.

' Совместно с Л.Я. Черняком и др. [7-15,17].

L-Lys L-Aia " T J

J J NH СОгН Nh C02H

в 6 HS^OHO^^VOR

-»3)-p-D-GlcpNAc-(1->3)-P-D-GlcpA-(1->3)-(i-D-Ga]pA-(1-> o-1-"^

6 4 Me-r-nJ OH AcNH OH

t î

H2N(CH2)20P=0 р-D-GIcpNAc 0H R' I R.

6Н nhVh нгГ С°гН ЛОН

HO1 C=0 '

OH OR OH

Рис. 3-1. (о) Строение О-специфического полисахарида P. mirabilis 027; (b) целевые структуры для синтеза НГК на основе фрагментов некоторых О-специфических полисахаридов P. mirabilis и капсулярного полисахарида К54 Е. coli 06:К54:НЮ; R — агликон с фунциональной группой, R1 — заместитель в ос-положении аминокислотного остатка.

3.2. Выбор способа получения гликополимера

Известно, что основной вклад в иммунохимические свойства О-антигенов вносят терминальные участки на невосстанавливающем конце основной или боковых цепей полисахарида. В связи с этим конъюгация олигосахарида с полимерным носителем целесообразна через агликон-спейсер с функциональной ю-аминогруппой. Так как в структуре лизин-содержащих гаптенов присутствует своя первичная е-аминогруппа лизина, играющая важную роль в иммуноспецифичности, для получения целевых искусственных антигенов был выбран подход, основанный на сополимеризации акриловых мономеров, а не на модификации уже сформированного полимера.

3.3. Синтез мономеров для сополимеризации

Первый этап получения НГК сополимерного типа включал разработку эффективных подходов для синтеза углеводных мономеров, содержащих акриламидную группу в агликоне. Для минимизации возможности нежелательной самопроизвольной гомополимеризации акрилоильный остаток планировалось вводить на последних стадиях ацилированием терминальной аминогруппы в агликоне, генеририруемой из азидного предшественника (см. раздел 3.3.1).

3.3.1. (2 - Аз идоэтил) гликоз иды - гликозиды с удобным агликоном-преспейсером

Для присоединения углеводного фрагмента к носителю часто используют реакции образования амидной связи между аминогруппой, расположейной в терминальном положении агликона-спейсера, и карбоксильной группой носителя. В этом случае необходимо присутствие ортогональной защитной группы в спейсере, которая выдержала бы все манипуляции в ходе олигосахаридного синтеза, или наличие в агликоне латентной группы, которую в нужный момент можно превратить в необходимую функцию. В качестве латентной удобно использовать азидную группу, восстановление которой приводит к соответствующему гликозиду с аминогруппой. Агликоны с азидной группой в терминальном положении известны; как правило, они имеют достаточную длину и могут выполнять функции полноценного спейсера. Однако, по нашему мнению, более перспективно

применение «иреспейсерного подхода», в котором целевой олигосахарид синтезируют в виде гликозида с относительно коротким агликоном-преспейсером (от 2 до 4 атомов углерода), а затем при необходимости (например, для конъюгации с белком) он может быть существенно удлинен. В качестве такого преспейсера с латентной группой в данной работе предложен 2-азидоэтильный агликон.

Ме АсО-

АсО I

3(3) 80%

Ме' АсО АсО

fJ^aJ

АсО I

N3

ОАс 15

Ф-ч 9А° a Í421 АсО~ ОАс ОА= X

АсО-у ОАс АсО АсО

N3

в (26)

АсО~

АсО АсО 3

22 23

Ас? ^ОАс Ас? ^ОАс

UV-0 а (24) ^V-O

АсО-4—(Г^-ОАС дс0Л—■

ACO АсО

16 , ,17

Ь 92% d|90%

I 71% |

ACO ОАС A'*L¿?o:

АсО ы Вг

™ 21

20 21

МеОгС _ МеО,С _

АсОЛ-"ТЛ-ОАс: АсО-*--^0

АсО АсО

" . - 1 "

Схема 3-1. Синтез (2-азидоэтил)гликозидов с 1,2-шране-гликозидной связью. Реагенты и условия: а. HO(CH2)2N3, BF3Et20, СН2С12, -20 °С (в скобках указано время реакции, ч); Ь. НО(СН2}гС1, BF3Et20, СН2С12, -20 °С; с. Bu,NN3, PhH, кипячение; d. HO(CH2)2N3, Hg(CN)2, HgBr2, MeCN, MS 4A, -20 °C; e. HO(CH2)2N3, Hg(CN)2, 105 °C; f. H0(CH2)2C1, Hg(CN)2, 105 °C. Шестичленный цикл на структурах в рамке обозначает моно- или олигосахаридный фрагмент.

Для получения (2-азидоэтил)гликозидов было реализовано несколько подходов, основанных на гликозилировании 2-азидоэтанола в различных условиях. Их выбор определялся как реакционной способностью гликозил-доноров (были использованы гексозы, дезоксигексозы, уроновые кислоты), так и требуемой конфигурацией (1,2-транс или 1,2-уис) образующейся гликозидной связи. Выходы 1,2-т/ганс-(2-азидоэтил)гликозидов составляли 38-90%. Так, для введения 2-азидоэтильного агликона в P-D-глюкуроновую кислоту наилучшие результаты дало гликозидирование ацетобромглюкуроновой кислоты 26 в среде 2-азидоэтанола при повышенной температуре, которое с выходом 69% привело к гликозиду 25 (схема 3-1). В то же время для синтеза а-аномера 2-азидоэтилгликозида D-галактуроновой кислоты 29 оптимальным оказалось гликозидирование галактуроновой кислоты 28 по Фишеру в среде 2-азидоэтанола в присутствии ТГОН. В таких условиях с выходом 18%

образовался целевой пиранозид (схема 3-2), что с учетом одностадийности процесса можно признать удовлетворительным результатом.

гликозиды не образуются

Н0Л—^«-он н

28 29

ОН

с

fcOzlCHjfeNj

Схема 3-2. Синтез (2-азидоэтил)гликозида a-D-галактуроновой кислоты с 1,2-цис-гликозидной связью. Реагенты и условия: a. HO(CH2)2N3, CF3SO3H (0.34 экв.), 70-80 °С, 3 сут (выход 29 - 18%); b. HO(CH2)2N3, CF3SO3H (0.20 зкв.), 85 "С, 52 ч (выходы: 29 - 5%, 30 - 4%, 31 (а:Р = 1:2) - 36%); с. HO(CH2)2N3, DMSO, CF3SO3H (кат.), 85 °С, 3 сут (гликозиды 29-31 не образуются); d. 0.2 М NaOH, Ме0Н-Н20 (выход 32 - 70%).

Следует отметить, что (2-азидоэтил)гликозиды могут быть также получены нуклеофильным замещением атома хлора в соответствующих (2-хлорэтил)гликозидах (схема 3-1). 2-Азидоэтильный агликон может быть легко восстановлен в 2-аминоэтильный агликон и затем при необходимости удлинен, например, с использованием хорошо разработанных приемов пептидного синтеза (схема 3-3).

К преимуществам (2-азидоэтил)гликозидов следует отнести относительную инертность азидной группы в типичных условиях, используемых в олигосахаридном синтезе. Так, гидролиз сложноэфирных групп в основных или кислотных условиях или алкилировгние гидроксильных групп в (2-азидоэтил)гликозидах в присутствии оснований протекает без осложнений, в то время как аналогичные превращения гликозидов с N-ацильными или уретановыми защитными группами часто сопровождаются побочными процессами. Предложенные в данной работе (2-азидоэтил)гликозиды оказались востребованными и в других лабораториях мира, что отчасти связано с бурным развитием так называемой «клик-химии» («click-chemistry»), использующей способность азидной группы легко вступать в реакцию 1,3-диполярного циклоприсоединения с алкинами с образованием соответствующих «химерных» конъюгатов.

Схема 3-3. Удлинение агликона в (2-азидоэтил)гликозидах. Реагенты и условия: а. йошех 1x8 (ОН"), Ме0Н-Н20, -20 °С, 2 ч; Ь. Н2, 10% Рс1/С, МеОН, -20 "С, 2 ч (выход 34 - -100%); с. ТРА-Иу (37), ЕЕБО, ОМР, -20 °С, 24 ч (выход 35 - 82%); ТРА-С1уС1у (38), ЕЕО<2, ОМР, -20 "С, 24 ч (выход 36 - 82%).

3.3.2. Синтез (2-азидоэтил)гликозидов уроновых кислот с незащищенной карбоксильной группой

Поскольку все целевые соединения были либо моносахаридами, либо дисахаридами с остатком уроновой кислоты на восстанавливающем конце (рис. 3-1), необходимо было получить (2-азидоэтил)пиранозиды (З-О-глюкуроновой (45), (З-О-галактуроновой (42) и а-О-галактуроновой (32) кислот в виде производных с незащищенной карбоксильной группой.

Так, (2-азидоэтил)гликозиды пиранозных форм [№-глюкуроновой (45) и а-Э-галактуроновой (32) кислот были гладко получены с выходами 91% и 70% омылением сложных эфиров 25 и 29 (схемы 3-2 и 3-5), которые легко образуются при гликозидировании соответствующих моносахаридов 2-азидоэтанолом (схемы 3-1 и 3-2). В то же время для получения (2-азидоэтил)гликозида р-Э-галактуро но во й кислоты 42 оптимальным оказалось окисление подходящим образом защищенного производного (2-азидоэтил)-|3-В-галактопиранозида 41 (его полностью ацетилированный предшественник 17 был получен гликозилированием 2-азидоэтанола, как показано на схеме 3-1). Омыление продукта 41 привело к уроновой кислоте 42 (суммарный выход пяти стадий 25%) (схема 3-4). Разработанные методы синтеза (2-азидоэтил)гликозидов уроновых кислот позволили перейти к синтезу дисахаридов, включающих эти фрагменты.

/ 17 Я = Ас / 40 Я = Н 42

а139К-Н V 41 Я = Ас

Схема 3-4. Синтез (2-азидоэтил)гликозида р-Р-галактуроновой кислоты. Реагенты и условия: а. 0.036 М МеО^ МеОН, 50 °С; Ь. ТгС1, Ру, 50 °С (выход 40 - 52% на 2 стадии); с. Ас20, Ру, -20 "С (выход 41 - 95%); а. 1. СЮ3, Н2504, Н20, Ме2СО, СН2С12,0 °С -> 20 °С; 2.0.14 М КаОН, Ме0Н-Н20, 0 °С (выход 42 - 57%).

3.3.3. Синтез (2-азидоэтил)гликозидов дисахаридов, содержащих остаток глюкуроновой кислоты

Во всех целевых дисахаридах остаток глюкуроновой кислоты гликозилирован по О-З. Необходимое селективно защищенное производное глюкуроновой кислоты 49 со свободной гидроксильной группой при С-3 было получено с суммарным выходом 55% из кислоты 45 с помощью разработанного нами подхода. Он основан на селективной 6,3-лактонизации гликозидов глюкопирануроновой кислоты и последующем селективном метанолизе образующегося лактона (см. раздел 3.3.3.1 и схему 3-5).

3.3.3.1. Получение селективно защищенных производных уроновых кислот путем лактонизации-алкоголиза

Ранее сотрудниками лаборатории химии углеводов ИОХ АН СССР было показано, что нагревание аллилгликозидов глюкуроновой (44) и целлобиоуроновой кислот в АсгО с выходами 45-80% приводит к селективному образованию 6,3-лактонов, последующий селективный метанолиз которых с выходами 52-60% дает желаемые моногидроксильные производные (схема 3-5).

В данной работе этот подход был оптимизирован и распространен на производные других уроновых кислот: была изучена лактонизация простых гликозидов глюкопирануроновой, галактопирануроновой и маннопирануроновой кислот, а также алкоголиз полученных лактонов рядом спиртов, включая МеОН, ВпОН и А110Н. Лактонизация и алкоголиз гликозидов глюкопирануроновой кислоты протекали однозначно, и в этом случае данный подход имеет препаративное значение. Оказалось, что метанолиз лактонов глюкуроновой кислоты 46 и 47 можно проводить и при отсутствии AcONa, причем выходы моногидроксильных производных 48 и 49 при этом заметно возрастают и достигают 76-81% (50-65% в расчете на исходную кислоту) (схема 3-5).

Ме02С НОЛ „ О r2o2C

_JU OR EH5? ^figE^-ORi

OAc OH j^gJ "U OAc

43 R = All 44 R = All (74%, лит.) f^f 48 R'= All. R2 = Me (81 %),

25R = (CH2)2N3 45R=(CH2)jN3(91%) AcO OAc 49 R' = (CHjfeN,. R2 = Me (76%)

46 R = All (60%, rar.) 50 Я' " - <»%>

47 R » (CH2)jNa (73% или 66% КЗ 25) 51 R = All, R2 = All (52%)

Схема 3-5. Получение селективно защищенных производных глюкуроновой кислоты путем лактонизации-алкоголиза. Реагенты и условия: а. 0.2 М NaOH, Ме0Н-Н20; Ь. 1. Ас20, 70 °С, 15 мин (для 44) или 2 ч (для 45); 2. Ас20, Ру, -20 "С, 18 ч; с. МеОН, -20 °С, 4 сут. (для 48,49); d. ROH (R = Bn, All), AcONa, -20 °С, 2 ч-1 сут. (для 50,51).

3.3.3.2. Гликозилирование селективно защищенных производных глюкуроновой кислоты

Гликозилирование спирта 49 ацетобромрамнозой 69 в CH2CI2 при -40 °С 20 °С в присутствии AgOTf дало целевой дисахарид 70 с выходом 48%, при омылении которого NaOH гладко образовалась свободная кислота 71 с выходом 91% (схема 3-6).

Ме-7—rvJ * МвОгС

Вг МеОгС

2Г/ * „ ---р

AtO-iM

АсО-Дт*-/ AcO' ч ~_о ______Т пдл

AcO I НО-5——ме-т-o-J UAC Me

OAc OAc АсО-АгУ/ НО

69

и-

НО I ОН

п МеОгС „ с АсС. Ме02С „ ° нп НОгС _

ОАс дсМН ОН

72 49 73 Р = (СН2)2М3 74 И = (CH2)2Nэ

Схема 3-6. Синтез (2-азидоэтил)гликозидов дисахаридов, содержащих остаток глюкуроновой кислоты. Реагенты и условия: а. AgOTf, МБ 4А, СН2С12, -40 °С -» 20 °С (выход 70 - 48%); Ъ. 0.2 М N8011, Ме0Н-Н20 (выход 71 - 91%); с. к%ОИ, сиим-коллидин, МБ ЗА, СН2С12, -30 °С -» 20 °С (выход 73 - 68%); <1. 1. 0.2 М КаОН, МеОН-НгО; 2. К2Н4Н20, ЕЮН, кипячение; 3. Ас20, МеОН (выход 74 - 52% из 73).

Гликозилирование спирта 49 глюкозаминилбромидом 72 с фталимидной группой при С-2 в СН2О2 при -30 "С —> 20 °С в присутствии А§ОТГ и сшш-коллидина привело к целевому дисахариду 73 с выходом 68%. Защитные группы были удалены последовательной обработкой №ОН и гидразин-гидратом. Селективное М-ацетилирование (Ас20, МеОН) дало

свободную кислоту 74 с общим выходом 52% в расчете на защищенный дисахарид 73 (схема 3-6).

3.3.4. Амидирование уроновых кислот аминокислотами

Для создания амидиой связи между а-аминогруппой аминокислот и карбоксильной группой 2-азидоэтилгликозидов уроновых кислот оптимальным оказалось использование 2-этокси-1-этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолина (ЕЕИС?) в БМР в качестве конденсирующего агента и защита нереагирующих функциональных групп аминокислот кислотолабильными защитными группами (Г-Ви, Вое). В этих условиях выходы на стадии амидирования были устойчиво высокими и составляли 80-100% (12 примеров) или около 70% (один пример); лишь в случае глюкозаминил-(1->3)-глюкуроновой кислоты выход амида 94 с лизином составил 62% (схема 3-7).

X

Н21Ч С02СМе3

75 I* = Ме (1-А1а)

76 Р = СН2ОСМе3 (Ь-Бег)

77 R = СН(Ме)ОСМе3 (1.-Т|1Г)

78 R - (СН2)4ЖС02СМе3 (Ы.у5)

79Н=Ме(1--А1а)(97%)

80 Н - СН2ОСМе3 (ЬБег) (93%)

81 Я = СН(Ме)ОСМе3 (ИЪг) (99%)

82 Р ■= (СН^МНСОгСМеэ (Ыуэ) (82%)

МН^ОгСМе,

ГСОгН

ЧЁЙЙ

но-^-тА но'

Ме

I

Н^' СОгСМе3 75 (1-А1а)

R

^М^СОгСМез

НЙ=0

тс=о

'Ч-

N3

83 (ЬА1а) (99%)

R

Л,

N4

НО^—т1

но.

75 R - Ме (1--А1а)

76 R = СН2ОСМе3 (иЗег)

77 Я' СН(Ме)ОСМе3(ЬТЪг)

78 Н - (СН2)4МНС02СМе3 (Пуз)

84 К = Ме (0-А1а)

85 R = (СН2)4МНС02СМе3 (0-1*5)

гп-г-м» 86 R * Ме (1_-А1а) (71%) согомез 87 „ . СН2осме3 (^Эег) (100%)

88 Я « СН(Ме)ОСМе3 (ИЬт) (100%)

89 Р = (СН2)4МНС02СМез (Цуг) (92%)

90 И з; ме (0-А1а) (100%)

91 Р = (СН2)4ЫНС02СМе3 (О-Ьуа) (85%)

М3

R ..ОСМеэ

Ме' НО

!

НО I

ОН

МН С02СМез

N3

,.ОСМе3

НгМ^^СОгСМез

76 Н = Н (ивег)

77 R « Ме 0.-Т1«)

(СН2)4МНС02СМе3 Н21Ч^С02СМе3 78 (1_-1.у5)

и

НО I

92 Н • Н «--Бег) (85%) ОН 93 R - Ме (Ь-ТПг) (92%)

(ОЩ^НСОгСМез МН"^С02СМез

N3

94 (Ц-Ьуэ) (62%)

Схема 3-7. Синтез амидов уроновых кислот с аминокислотами. Реагенты и условия: а. ЕЕБСЗ, ОМБ, -20 "С.

При получении амидов a-D-галактуроновой кислоты, наряду с амидами с природными L-аминокислотами (аланин, лизин, серин, треонин), были получены амиды с D-аланином и D-лизином. Это позволило сравнить диастереомеры, полученные из L- и D-аминокислот, и показать, что в ходе амидирования и на последующих стадиях модификации агликона и удаления защитных групп эпимеризации аминокислотных остатков не происходит. 3.3.5. Синтез (2-акриламидоэтил]гликозидов ЛГ-гликуроноиламинокислотных производных

Для введения остатка акриловой кислоты азидная группа во всех полученных (2-азидоэтил)гликозидах была восстановлена каталитическим гидрированием, полученный амин без очистки селективно N-ацилировали акрилоилхлоридом и с выходами 42-99% получали защищенные (2-акриламидоэтил)гликозиды. Защитные группы с аминокислотных остатков были гладко удалены обработкой TFA при ~20 "С с образованием с выходами 60100% мономеров, готовых для полимеризации (схема 3-8).

3.4. Превращение мономеров в НГК сополимерного типа

Полученные (2-акриламидоэтил)гликозиды jV-гликуроноил аминокислот 99-102, 104-110, 113, 114, 116 были превращены в НГК сополимерного типа 117-130 (выходы 80-90%) радикальной сополимеризацией с акриламидом (схема 3-9). Полученные НГК были использованы для характеризации эпитопов О-специфических полисахаридов клинически значимых бактерий рода Proteus'.

Глава 4. Синтез НГК на основе неприродного аналога гликановой цепи ганглиозида Смз - лактама Смз-сиалоолигосахарида^

4.1. Введение

Ганглиозиды - это гликосфинголипиды, олигосахаридные цепи которых содержат остатки сиаловых кислот, в частности, Л^-ацетилнейраминовой кислоты (Neu5Ac). Ганглиозиды являются опухоль-ассоциированными антигенами и важными рецепторами, расположенными на поверхности клеток иглокожих и хордовых, включая человека. Имеется предположение, что 5-лактоны ганглиозидов, легко образующиеся в кислой среде (in vitro), присутствуют на поверхности живых клеток (ш vivo) и являются более иммуногенными, чем родоначальные кислоты. Это позволяет рассматривать лактоны олигосахаридных цепей ганглиозидов и их НГК в качестве перспективных иммуногенов для выработки опухоль-специфических диагностических антител и противоопухолевой вакцинации. Однако, гидролитическая лабильность лактонов не только затрудняет их идентификацию in vivo, но и делает эту форму менее удобной для использования в качестве иммуногена. В то же время лактамы ганглиозидов — неприродные структурно близкие аналоги лактонов — устойчивы к гидролизу. К началу нашей работы был снтезирован лактам олигосахаридной цепи ганглиозида Gm3 и было показано, что антитела, выработанные к его НГК с бычьим

Иммунохимические исследования были проведены в лаборатории профессора А. Рожальски в Институте микробиологии, биотехнологии и иммунологии Лодзинского университета (Лодзь, Польша).

* Совместно с Й. Магнуссоном и др. [16] во время стажировки автора в Лундском университете (Лунд, Швеция).

сывороточным альбумином (BSA), узнают природный вмз-лактон. Они были использованы для демонстрации присутствия ганглиозида Gm3 на поверхности клеток меланомы мышей.

r

МН^С02СМе3

о=с

но-^-Т^ ^ N3--

79 R = Me (L-Ala)

80 R = СН2ОСМез (L-Ser)

81 R = CH(Me)OCMe3 (L-Thr)

82 R ■ (CH2)4NHC02CMe3 (L-Lys)

Me

Мн"^С02СМе3

тс=о &&

он

83 (L-Ala)

N3

R

мн"Ч:о2сме3 Hol

hoi

HO

86 R = Me (L-Ala)

87 R s CH2OCMe3 (L-Ser)

88 R » CH(Me)OCMe3 (L-Thr)

89 R - (CH^NHCOjCMej (L-Lys)

90 R ' Me (D-Ala)

81 R » (CH2)4NHC02CMe3 (D-Lys)

95 R = Me (L-Ala) (76%)

98 R » CH2OCMe3 (L-Ser) (84%/15% (»£))

97 R ■ CH(Me)OCMe3 (L-Thr) (92%)

98 R - (СНг^ЖСОгСМез (L-Lys) (59%)

Me

NH^C02CMe3

н<Й=о

|U=U

о

он

103 (L-Ala) (99%)

R

МН^СОгН

но'

|С=0 но!

о

NH

105 R - Me (L-Ala) (54% (а); 78% (Ь))

106 R = СН2ОСМе3 (L-Ser) (76%)

107 R * CH(Me)OCMe3 (L-Thr) (79%)

108 R - (CH2)4NHC02CMe3 (L-Lys) (72%)

109 R - Me (D-Ala) (65%Я0% (Z/E))

110 R - (СН^НСОгСМез (D-Lys)

(60%/23% (Z/E))

R ,OCMe3 NH C02CMe3

99 R = Me (L-Ala) (99%)

100 R = СН2ОСМез (L-Ser) (91% (Z))

101 R = СН(Ме)ОСМез (L-Thr) (99%)

102 R = (СН^МНСОгСМез (L-Lys) (99%)

Me

NH^COjH H?i=0

I u=u

OH

104 (L-Ala) (99%)

R „ОН NH COjH

О

Me HO

o=c

ISS71 °H

Hdl 113 R* H (L-Ser) (96%) OH 114 R = Me (L-Thr) (100%)

(CH2)4NH3*CF3C02-NH^COzH

О

OH

116 (L-Lys) (97% (Z))

(CH2)4NHC02CMe3 NH'^VC02CMe3

AcNH 0H

94 (L-Lys)

N3

(СН^НСОгСМез

nh^co2h o=< о

он

115 (L-Lys) (60%/28% (Z/E)) •

Схема 3-8. Синтез (2-акриламидоэтил)гликозидов jV-гликуроноилоаминокислотных производных. Реагенты и условия: а. 1. Н2,10% Pd/C, МеОН, -20 "С; 2. CH2=CHCOCI, Dowex 1*8 (НСОО, 2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенол, Ме0Н-Н20 (8:1), -20 °С; 3. хроматография на силикагеле; Ъ. CF3C02H, -20 °С.

В данной работе разработан улучшенный синтез лактама Омз-олигосахарида и его НГК 157 гликопротеинового типа на основе BSA, а также впервые синтезирован НГК 163

-16-

гликолипидного типа (Схемы 4-4 и 4-5). Поскольку целевой олигосахарид предстояло превратить в НТК различных типов, целесообразным представлялся подход, базирующийся на использовании аномерной защитной группы. Это позволяло превратить синтезированный олигосахарид в гликозил-донор, пригодный как для введения агликона-спейсера (при получении неогликопротеина), так и для конъюгации без спейсера с церамидом (при получении неогликолипида).

conh2 conh,

О а I I

+ T -- HCHjCHJ^HjOHCHsCHWn

conh

59-102,104-110,113,114,116 117-130 CH2CH2OR

117 R - [6(N)-L-A]a]-D-GlcpA(pl-> 124 R = [6(N)-L-Thr]-D-GalpA(ci1->

118 R = [6(N)-L-SerJ-D-GlcpA(pl -> 125 R ■= [6(N")-L-LysJ-D-GalpA(a1 ->

119 R « [B(N)-L-ThrI-D-GlcpA(pi-> 126 R = |6(N)-D-Ala}-D-Ga!pA(a1->

120 R = [6(N»)-L-LysbD-GlcpA(pi-> 127 R = [6(№)-D-Lysl-D-GalpA(a1->

121 R » [6(N)-L-Ala]-D-GalpA(pi-> 128 R = L-Rhap-(a1->3)-[6(N)-L-Ser>D-GlcpA(|í1-»

122 R » [6(N)-L-AlaJ-D-GalpA(a1 129 R = L-Rhap-lal-^HetW-L-'nirl-D-GlcpAflíl-»

123 R = [6(N)-L-Ser]-D-Ga!pA{a1 -> 130 R » D-GlcpNAo-(pl-»3He(Nn)-L-Lys)-D-GlcpA-(pl-»

Схема 3-9. Превращение (2-акриламидоэтил)гликозидов №гликуроноиламинокислотных мономеров в НТК сополимерного типа. Реагенты и условия: а. 1. (NH4)2S208, Me2NCH2CH2NMe2, Н20 или 0.2 M ацетатный буфер (рН 5.8) в случае производных Lys, ~20 °С; 2. гель-хроматография на Sephadex G-50 или Bio-Gel Р-4, элюент- 0.05 M Ру-Ас0Н-Н20 (рН 5.4) (вькоды сополимеров 80-90%).

4.2. Синтез лактамного аналога Смз-лактона

Гликозилирование частично защищенного (2-триметилсилилэтил (8Е))гликозида 132 гликозилбромидом 131 с несоучаствующей азидной группой при С-2 в присутствии силиката серебра привело с выходом 61% к производному 2'-азидо-2'-дезоксилактозы 133 в виде аномерной смеси, в которой преобладал целевой [3-аномер (схема 4-1). При дезацетилировании соединения 133 (в виде смеси аномеров) образовался триол 134 (выход 97%), который был превращен в смесь О-изопропилиденовых производных с преобладанием 3',4'-изомера 135 (выход 78%). Бензилирование спирта 135 и последующее дезацетонирование продукта 136 (выход 86%) дало 3',4'-диол 137 (выход 94%). Соединения 136 и 137 были выделены в виде чистых Р-аномеров.

Региоселективное сиалилирование диола 137 удалось осуществить с помощью сиалилксантата 138а при активации MeSOTf при -78 °С в смеси MeCN-CIhCh (схема 4-2). Целевой аналог Смз-трисахарида 139 с a-связью был выделен с выходом 71% наряду с соответствующим Р-изомером (4%), что позволяет оценить стереоселективность сиалилирования как высокую (18:1).

Для восстановления азидной группы в 139 оптимальным оказалось применение раствора H2S в смеси Py-EtîN-MeOH (2:1:1) с последующим О-дезацетилированием действием MeONa в МеОН, что привело к целевому лактаму 140 с выходом 97% (схема 4-3). Если стадию обработки MeONa опустить, то удается выделить лактам 142 с О-ацетильными группами, хотя и с несколько меньшим выходом (70%). Низкий выход лактама 142 объясняется тем, что при восстановлении азида 139 образуется промежуточный аминоэфир

143, который циклизуется либо в целевой лактам 142, либо в аминолактон 144, теряющийся в ходе хроматографической очистки 142 на силикагеле.

АсО АсО

■ОАс О

R20

N 131 Вг

ВпО-НО", ВпСН

ВпО ■ R2»R3

O^v

SiMe3

132 ¿M33R

; 134 R1 = R2 - R3 »135 R1, R2 ° СМе2, R3 = H dll3SR1,R2-CMe2,R3-Bn 9 ( 137 R1 ■ R2 = H, R3 =Вп

Схема 4-1. Синтез селективно защищенного дисахарида 137. Реагенты и условия: а. силикат Ag, СН2С12, MS 4Â, 20 °С (выход 133 - 61%; а:Р = 8:92); Ь. MeONa, МеОН, СН2С12, 20 °С (выход 134 -97%; а:Р = 8:92); с. 1. Ме2С(ОМе)2, CSA, -20 °С; 2. Et3N, концентрирование досуха; 3. Ме0Н-Н20 (10:1), 85 °С (выход 135 - 78%; a:fî = 9:91); d. BnBr, NaH, DMF, -20 °С (выход 136 - 86%); е. 85% АсОН, 85 °С (выход 137 - 94%).

ОАс НО пр_

¿Г.ОАсСО.Ме LCo Bno-, n

AA°cN^rVOEt + SiMe,

¿AcO ¡1 "3 BnO v „

—- V

HAc° I

138a

H? „ hoJ

BnO 137

,OAc C02Me

AcO" AcN—7 ^cO

lOAc

-o-

OH0Bn B o

Схема 4-2. Синтез защищенного аналога Омз-трисахарида 139. Реагенты и условия: а. МеБВг, AgOTf, МеСН СН2С12, МБ ЗА, -78 °С (выход 139 - 75%; а:Р = 71:4, изомеры разделены).

Y"OBn в Q

ОН он

V0AC I ОН.ОВП „ ЛАсО NuBnO-^-T^

Ç02Me

АсО' Ас

I <-°Bn - «

...............................f.......

ЛАсО ^ЗГВПО^-Т^

SiMe3

SiMe3

Схема 4-3. Синтез лактамов Ош-трисахарида. Реагенты и условия: а. 1. НгБ, Ру-Е^Ы-МеОН (2:1:1), 0 °С -> -20 "С; 2. МеОКа, МеОН (выход 140 - 97%); Ъ. Н2, Рс1/С, АсОН (выход 141 - 94%); с. НА Ру-Е^М-МеОН (2:1:1), 0 °С -> -20 °С (выход 142 - 70%).

Удаление О-бензильных защитных групп из лакгама 140 привело к SE-гликозиду Gm3-лактама 141 с выходом 94% (схема 4-3), который был использован для получения конъюгата 157 с BSA (схема 4-4) и Омз-гликозилцерамида 163 - лактамного аналога вмз-лактона (схема 4-5).

4.3. Синтез лактамов конъюгата вмз-трисахарида с BSA и Смз-гликозилцерамида

Для превращения лактама Омз-трисахарида в конъюгат с белком необходимо было сначала ввести в аномерное положение агликон-спейсер с функциональной группой. Незащищенный SE-гликозид лактама Омз-трисахарида 141 был пер-О-ацетилирован с образованием полностью защищенного SE-гликозида 149 (выход 90%) (схема 4-4), обработка которого СЬСНОМе и ZnCb гладко привела к а-гликозилхлориду 150. Гликозилирование 2-бромэтанола гликозилхлоридом 150 дало неразделимую аномерную смесь (2-бромэтил)гликозидов 152 (<х:(3 ~ 1:6, выход 54%). При ее обработке ЬЩСНгЬСОгМе в присутствии CS2CO3 образовался гликозид 153 с удлиненным агликоном-спейсером (выход 82%), О-дезацетилированием которого был получен спейсерированный гликозид лактама Омз-трисахарида 154 с выходом 86%. Метиловый эфир 154 был превращен в соответствующий ацилгидразид и затем в ацилазид, реакция которого с BSA привела к неогликопротеину 157.

K<J OR

SIMea

I л^

о

ok^LS^Ä с

OR Вг. R = Ас SCH2CH2C02Me, R

tfM52X / 153X

154 X = SCH2CH2C02Me, R

и

BSA ¡

Схема 4-4. Синтез спейсерированных гликозидов лактама Смз-трисахарида и НТК с белком (BSA). Реагенты и условия: a. Ac20, Ру, ОМАР (выход 149 - 90%); Ь. СЬСНОМе, ZnCl2, СНС13 (выход 150 - 100%); с. Br(CH2)2OH, AgOTf, СН2С12, MS ЗА, -28 °С -> -20 °С (выход 152 - 54%, oc:ß = 1:6, неразделимая смесь изомеров); d. HS(CH2)2C02Me, Cs2C03, DMF (выход 153 - 82%, a:ß = 1:6, неразделимая смесь изомеров); е MeONa, МеОН, (выход 154 - 86%, аф = 1:6, неразделимая смесь изомеров);/ 1. N2H, H20, ЕЮН; 2. i-BuONO, HCl, DMSO; 3. H2NS03H; 4. BSA, боратный буфер pH 8.5-9.5 (конъюгат 157 содержит 24 фрагмента трисахаридного гаптена на молекулу белка).

Для получения неогликолипида 163 - лактамного аналога Омз-ганглиозида - была применена схема конъюгации без спейсера, основанная на реакции гликозилирования олигосахаридным гликозил-донором липидного предшественника с азидной группой (схема 4-5). Прежде всего, из ключевого интермедиата 149 действием TFA был удален SE-агликон, что гладко привело к полуацеталю 158, который был превращен в трихлорацетимидат 159 (выход 96%). Гликозилирование производного азидосфингозина 160 гликозил-донором 159 дало смесь (96:4) целевого гликозида 161 и соответствующего изомерного ортоэфира; после кислотной обработки этой смеси с выходом 44% был выделен чистый гликозид 161.

-19-

1 t.. »Nn А„~

Схема 4-5. Синтез вмз-тликозилнерамида 163 - лактамного аналога Смз-ганглиозида. Реагенты н условия: a. CF3CO2H, СН2С12 (выход 158 - 100%); b. CI3CCN, DBU, СН2С12 (выход 159 - 96%, а:|3 = 3:1); с. 1. BF3-Et20, СН2С12, MS AW-300, -33 °С; 2. Ас0Н-Н20 (9:1), -20 °С (выход 161 - 44%); d. 1. H2S, Ру-Н20 (83:17); 2. СПН35С02Н, EDC, СН2С12 (выход 162 - 91%); е. MeONa, МеОН-СН2С12 (10:1) (выход 163 - 92%).

Восстановление азида 161 действием H2S и последующее ацилирование образующегося амина стеариновой кислотой в условиях карбодимидного метода привело с выходом 91% к производному церамида 162. После тотального О-дезацилирования с выходом 92% был получен Смз-гликозилцерамид 163, который может быть использован для адсорбции на гидрофобных поверхностях и в качестве компонента липосом и других супрамолекулярных агрегатов, востребованных при биологических исследованиях.

(RO)„-v——- -м3 Агликон-лреспвйсер

г—-О (ROln-S—V0H

(RO)„-%----- -SiMej

Аномерная защитная группа

(RO)„"

(RO)„"

\---Q

Спейсерированкыв гликозиды: Фиксированная аномерная конфигурация НГК_

нгк

Сложные гликозил-доноры:

Неопределенная аномерная конфигурация НГК_

Схема 4-6 Сравнение двух стратегий спейсеризации. Стратегия синтеза НГК с использованием аномерной защитной группы имеет ограничения. - уходящая группа.

Как видно из описанных в данном разделе результатов, стереоселекгивное введение агликона в уже построенный сложный олигосахарид может представлять серьезные проблемы. В частности, влияние функциональных групп, удаленных от реагирующего моносахаридного остатка, на стереоселективность гликозилирования сложными олигосахаридными гликозил-донорами по сравнению с аналогичными моносахаридными

-20-

производными может быть связано с образованием супрамеров иной структуры, обладающих другими химическими свойствами (подробнее см. главу 7). В связи с этим подход к синтезу НТК с использованием аномерной защитной группы имеет существенные ограничения (схема 4-6). Кроме случаев конъюгации с носителем без спейсера, более удобным нам представляется «преспейсерный» подход (раздел 3.3.1), гарантирующий получение спейсерированных гликозидов, а значит и НТК с фиксированной аномерной конфигурацией.

Глава 5. Синтез НГК гликолипидного типа - сиалил(полипренил)-фосфата* 5.1. Введение

Гликозил(полипренил)монофосфаты являются важными интермедиатами биосинтеза углеводных цепей различных биополимеров клеточной поверхности. Сиалил(ундекапренил)фосфат 164 (схема 5-1), содержащий остаток №и5Ас, был постулирован в качестве возможного биосинтетического предшественника бактериальных полисиаловых кислот, однако его структура не была однозначно установлена, и, в частности, его аномерная конфигурация остается неизвестной. Дальнейший прогресс в выяснении биологических функций этого гликолипида сдерживается отсутствием методов получения его изомеров, а также труднодоступностью необходимого для их синтеза бактериального ундекапренола. В связи с этим в данной работе был предпринят синтез обоих возможных стереоизомеров аналога 164 - неогликолипида 165. В его состав входит «неприродный» (в смысле небактериальный) липидный фрагмент, в качестве которого использован морапренол -аналог ундекапренола бактерий, легко доступный из растительного сырья. Ранее было показано, что морапренилфосфаты Сахаров - НГК гликолипидного типа - распознаются бактериальными ферментами так же, как и соответствующие природные ундекапренилфосфаты Сахаров.

Схема 5-1. Реалистичные подходы к синтезу обоих стереоизомеров сиалил(полипренил)фосфата основаны на реакции гликозилирования. У - уходящая группа. Источники полипренолов: ундекапренол присутствует в бактериях, морапренол - в растениях.

Ретросинтетический анализ показал, что как а-, так и (3-изомеры сиалил(полипренил)фосфата можно синтезировать с использованием подходов А и 2) (схема

о

154 п = 8, т = 2 - ундекапренил 165 п = 6-8, т = 3~ морапренил

' Совместно с В.Н. Шибаевым и др. [2,5,19,21,23,27,31,32,34,36,39-42,46,49,50,52,53].

-21-

5-1), базирующихся на стереоселективном образовании гликозил-фосфатной связи с помощью реакции гликозилирования (сиалилирования в случае производных №и5Ас).

Хотя ранее были известны подходы к получению сиалилфосфатов с р-конфигурацией, способы стереоселективного синтеза даже простейших а-сиалилмонофосфатов отсутствовали. Вследствие присутствия двойных связей в полипренольной цепи использование для решения этой проблемы тиогликозидов и гликозилимидатов №и5Ас, широко применяющихся для синтеза сиалогликозидов (включая сиалоолигосахариды), в данном случае было исключено. Это связано с тем, что для активации таких сиалил-доноров необходимы электрофильные промоторы (например, ОМТБТ, МЭ-ТГОН, Мез5!ОТ£),* которые могут вызывать побочные реакции, затрагивающие изопреноидную цепь.

Таким образом, для реализации синтеза а-сиалил(полипренил)фосфата необходимо было разработать новый метод а-селективного сиалилирования, применимый для получения сиалилфосфатов и сиалил(полипренил)фосфатоз. С этой целью были изучены реакции различных нуклеофилов с сиалилхлоридами 167а-с с (раздел 5.2) с различными защитными группами, которые могут быть легко получены с выходами, близкими к количественному, при обработке полных ацетатов сиаловых кислот 166а-с раствором НС1 в СНгСЬ (схема

5.2. Реакции сиалилхлоридов с нуклеофилами* 5.2.1. Реакции сиалилхлоридов со спиртами

Ранее считалось, что для замещения хлора незаряженными нуклеофилами при стерически затрудненном аномерном атоме углерода сиалилхлоридов требуется создать условия, способствующие генерации третичного оксакарбениевого иона, то есть протеканию реакции по 8ц1 -подобному маршруту. Однако, оказалось, что эти представления нуждаются в пересмотре, когда было обнаружено, что при растворении сиалилхлорида 167с со свободной карбоксильной группой в МеОН или А110Н при отсутствии промотора быстро (< 1 мин и 4 часа, соответственно) протекает реакция, гладко приводящая к образованию а-метилсиалозида 168с или а-аллилсиалозида 169с с выходом -80% (схема 5-3). Сиалилхлорид 167а с метоксикарбонильной группой реагирует с МеОН аналогично и дает а-метилгликозид 168а с выходом 96% (схема 5-4). Удаление защитных групп из 168а и 169с приводит к а-метил- и а-аллилсиалозидам 168(1 и 170, соответственно (схема 5-3).

Схема 5-2. Синтез сиалилхлоридов с различными заместителями. Реагенты и условия: а. НС1 (генерирован in situ из AcCl и МеОН), СН2С12,4 "С (выход 167 —100%).

' NIS - JV-иодсукцинимид, ТГОН - трифторметансульфокислота, DMTST - [Me^SSMeJ^OTf. t Гликозилацетаты 166а-с и гликозилхлориды 167а,с были известны до начала данной работы.

• Совместно с Й. Магнуссоном [19,34], А.М. Шпирт и др. [2,5,21,23,27,31,32,36,37,39-42,46,49,50,52,53].

5-2).*

а Xя Н, R = Me b X = Ac, R = Me CX = H, R = H

¿AcO 166a,b,c

167a,b,c

Этот результат имеет важное практическое значение, так как он открывает простой в экспериментальном отношении путь к крупномасштабным синтезам метил- и аллилсиалозидов, позволяющим получать эти соединения с высокими выходами и высокой стереоселективностью при отсутствии промоторов - солей серебра. Наблюдаемое обращение конфигурации и более медленная реакция со стерически более требовательным аллиловым спиртом свидетельствует о том, что, по-видимому, несмотря на кажущуюся стерическую затрудненность третичного аномерного центра, замещение хлора спиртами без добавления промотора протекает по 5»2-подобному маршруту. Этот вывод имеет принципиальное значение для достижения поставленной цели - разработки нового метода а-селективного сиалилирования.

^ОАсС| ^ОАсСОгН <5£.ОАсСо2Ме

¿^ОАсСО21 CN^S/-0

I^AcO ^AcO ^AcO

t67c , 168c

¿Г">ОАССО2Н CO2-NH4' OH co2H

AcO AcN

Л AcO Л HO Л HO

OH C0,-NH/ ¿i ^OH

OMe

H--H H '

169c 170 168d

Схема 5-3. Реакции сиалилхлорида 167c с МеОН и А1ЮН без добавления промотора. Реагенты и условия: а. МеОН, 23 "С, < 1 мин; Ъ. Me3SiCHN2, PhH-MeOH (4:1) (выход 168а - 83% в расчете на 166с; ct:ß = 30:1); с. АПОН, 23 "С, 4 ч; d. 1. 0.2 М NaOH; 2. Amberlite IR-120 (NH,+); 3. ионообменная хроматография на DEAE-Sepharose CL-бВ (АсО"0, градиент 0.001 0.015 М NH4OAc (выход 170 -79% в расчете на 166с; a:ß ~ 30:1); е. 1) MeONa, МеОН, 2) Н20, 3) АсОН, 4) ионообменная хроматография на Dowex 50x4 (РуН*), Н20 (91%). Здесь и далее выходы продуктов реакций сиалилхлоридов 167а-с с нуклеофилами приведены в расчете на соответствующие гликозилацетаты 166а-с, использовавшиеся для их получения (Схема 5-2).

Реакции сиалилхлорида 167а с АПОН и сиалилхлорида 167Ь с МеОН и АПОН (в том числе в MeCN) протекали медленнее и менее стереоселективно (схема 5-4), что отчасти связано с аномеризацией гликозидов, катализируемой образующимся в ходе реакции HCl. 5.2.2. Реакции сиалилхлоридов с заряженными нуклеофилами

При исследовании реакций с отрицательно заряженными нуклеофилами были использованы сиалилхлориды 167а,Ь, в которых карбоксильная группа защищена в виде метилового эфира, что значительно упрощает мониторинг реакций и выделение продуктов.

S- и N-Нуклеофилы реагировали с Л^-диацетилсиалилхлоридом 167Ь подобно

известному Л'-ацетилсиалилхлориду 167а, давая с высокой а-стереоселективностью

соответствующие продукты замещения (гликозилазиды 174а,Ь, тиогликозиды 175а,b и

гликозилксантаты 138а,Ь), конфигурационно стабильные в условиях реакции. В то же время

реакции с фосфатными нуклеофилами протекали более сложно (схема 5-4) вследствие

известной склонности гликозилфосфатов к аномеризации в условиях образования. Результат

реакции зависел от нуклеофугности фосфатного нуклеофила и его основности.

Взаимодействие сиалилхлоридов 167а,b с [Pr'2NHEt]+[(Bn0)2P02]" в MeCN дало

-23-

сиалилдибензилфосфаты 171а,Ь с Р-конфигурацией аномерного центра (выходы 72% и 74%). Это первый успешный синтез сиалилфосфатов из сиалилхлоридов, а выход р-сиалилдибензилфосфата является наивысшим из когда-либо достигнутых с помощью реакции гликозилирования.

пде п-РГОВп иАС ^ ОВп

ОАс

•С^ЛЭАс С02Ме0

¿АсО

171а X ■ Н (72%, только В 171Ь X = Ас (74%, только й

АсО' АсМ

ргон

СГ Ви4М*

172а X = Н (59%. а:р-172Ь X = АС (60%, а:р>

1:1.6) : 5:1)

ОАс

*С^,ОАс СОгМе

¿АсО

173а Х = Н (11%)" 173ЬХ = АС (4%)

Р~СГ Ви4М*

АсО АсЫ

,>0Ас СОгМе

174а X ■ Н (94%, только а, лит.) 174Й X = Ас (82%, только о)

АсО' АсМ

ОАс С1

167а X = Н 167ЬХ = Ас

АсО' АсМ

^ОАс С02Ме ОМе

-30:1) = 11:1)

АсО' АсЫ

^ОАс С02Ме 37" ЭРГ]

175аХ = Н (80%, только а, 175Ь X - Ас (91%. а:р- 14:

ОАс ¿—.ОАс Ас0..„2-г-°^гС02Ме АсМ-Ь-Г^ ^ ОАс

лит.) 176аХ = Н (95%) 1) 176Ь X * Ас (92%)

АсО' АсМ

ХАС°

168аХ = Н (96%, а:Р-168ЬХ = Ас (96%, а:Р = ОАс

¿~^ОАс С02Ме ¿АСО

169аХ = Н (77%, о:р = 6:1) 169ЬХ» Ас(29%, сс:Р = 1.9:1) в смеси с 169а (47%. а:р= 1.3:1)

^ОАс С02Ме

ЛАсО

Б__,ОЕ1

т

138а X = Н (72%, 16:1. лиг.) 138Ь X ■ Ас (71% (МегСО), только а) (76% (ЕЮН), только а)

Схема 5-4. Реакции сиалилхлоридов 167а,Ь с нуклеофилами без добавления промотора. Реагенты и условия: а. [Рг'зКНЕ^КВпОЬРОзГ МеС1М, -20 °С; Ь. [ВщН]+[(Н0)2Р02]", МеСЫ, -20 °С; с. 1. МеОН, -20 "С; 2. Ас20, Ру; КгОМз, СН2С12, ВщКШО,, 1 М ЫаНСОз, -20 °С; е. 1. А1ЮН, -20 °С; 2. Ас20, Ру;/ РЬЗН, СН2С12, ВщКН504, 1 М КаНС03, -20 °С; №2НР04, МеСЫ, кипячение, 3 ч (для 167а) или 25 °С, 1 мес. (для 167Ь); И. КБСЗОЕ!, Ме2СО или ЕЮН, -20 °С.

Реакция сиалилхлоридов 167а,Ь в \leCN с [ВщМ]+[(Н0)2Р02]", который является источником нуклеофила ([Н2РО4П с нуклеофугностью меньшей, чем у [(Вп0)гР(0)0Г, дала соответствующие сиалилфосфаты №и5Ас 172а,Ь с выходами 59% и 60% в виде смесей аномеров (аф = 1:1.6 и 5:1, соответственно). Это первый пример стереоселективного синтеза сиалилфосфата с а-конфигурацией. Образование в качестве побочных продуктов фосфодиэфиров 173а,Ь (схема 5-4) свидетельствует о принципиальной возможности реакции сиалилхлоридов 167а,Ь со стерически гораздо более требовательными фосфомоноэфирами 172а,Ь в качестве нуклеофилов, что открывает возможность их применения для синтеза сиалил(полипренил)фосфата 165 (раздел 5.3)

Попытка использования КагНР04, являющегося более сильным основанием, в реакции с сиалилхлоридом 167а в кипящем МеСИ привела с выходом 95% к образованию продукта элиминирования - гликалю Кеи5Ас 176а (схема 5-4 и раздел 6.3).

5.3. Синтез сиалил(полипренил)фосфата

Закономерности взаимодействия сиалилхлоридов 167а,b с [Bu4N]+[(H0)2P02]~ с образованием фосфомоноэфиров оказались характерны и для их реакции с морапренилфосфатом [Bu4N]+[(Pre0)(H0)P02r (Pre = остаток морапренола) (179). Так, реакция сиалилхлорида 167Ь с двумя JV-ацетильными группами протекала с большей а-селективностью (аф = 2.5:1, выход фосфодюфира 180Ь 71%), чем аналогичная реакция сиалилхлорида 167а с одной //-ацетильной группой (а:р = 1:1.6, выход фосфодиэфира 180а 58%) (схема 5-5). Удаление защитных групп и хроматографическое разделение изомеров позволило получить как а-, так и p-аномеры целевого неогликолипида 165.

Схема S-5. Реакция сиалилхлоридов 167а,b с полипренилфосфатом без добавления промотора и получение сиалил(полипренил)фосфата 165. Реагенты и условия: а. 1. [BuiN]4[(PreO)(HO)POjr (179) (Pre = остаток морапренола), MeCN-CH2Cl2 (3:1), -20 °С; 2. ионообменная хроматография (Whatman DE-52 (АсСГ), градиент МеОН -> 0.2 М NHtOAc в МеОН); Ъ. 1. 0.008 М MeONa, МеОН-СН2С12 (2:1), 4 °С; 2. как в а; с. 1. 1 М NaOH (aq)-CHCl3-MeOH (0.6:5:2), -20 °С; 2. как в а (изомеры разделены).

Полученные изомеры сиалил(полипренил)фосфата 165 переданы в Ганноверский университет (Ганновер, ФРГ) для изучения их активности в качестве субстратов бактериальных сиалилтрансфераз.*

Глава 6. Синтез и использование сиалил-донора на полимерном Hocm^et 6.1. Введение

Особый тип НГК - гликополимеры на основе защищенных производных углеводов -приобретает все большую значимость в последние годы в связи с существенным прогрессом в разработке автоматических синтезаторов для получения олигосахаридов на полимерных подложках (как нерастворимых, так и растворимых). Однако сиалоолигосахариды по-

Полученные образцы сиалил(полипренил)фосфата 165 могут храниться более 2 лет в 0.1 М растворе ацетата аммония в метаноле при низкой температуре (-18 °С). Добавка соли позволяет затормозить образование полипрепилфосфата 179 в результате расщепления фосфодиэфирной связи, промотируемого карбоксильной группой сиаловой кислоты. По данным наших биологических партнеров, примесь полипренилфосфата 179 не мешает изучению способности изомеров сиалил(полипренил)фосфата 165 выступать в качестве гликозил-акцепторов в ферментативном синтезе полисиаловых кислот.

Совместно с Т. Огава и др. [18] в ходе стажировки автора в Институте физических и химических исследований (РИКЕН, Вако, Саитама, Япония).

прежнему остаются недостижимыми целями для автоматического синтеза из-за трудностей в стереоселективном построении О-сиалозидных связей (подробнее см. главу 7).

В данной работе изучена возможность получения сиалоолигосахаридов с применением сиалил-доноров, иммобилизованных на полимерном носителе. Первый этап состоял в синтезе такого гликозил-донора и оценке его реакционной способности.

6.2. Дизайн полимерного сиалил-донора

Дизайн полимерного сиалил-донора 183 представлен на схеме 6-1. В качестве носителя был выбран монометиловый эфир полиэтиленгликоля (MPEG, молекулярная масса ~5000 Да), углеводные производные которого могут быть легко выделены осаждением трет-бутилметиловым эфиром. В этом случае гликозилирование можно проводить традиционным образом в растворе, что позволяет надеяться на эффективность использования методов, разработанных для реакций с участием низкомолекулярных реагентов, и легко контролировать строение продуктов гликозилирования с помощью спектроскопии ЯМР. Для обеспечения высокой а-стереоселективности сиалилирования, не зависящей от строения гликозил-акцептора или условий реакции, был выбран гликозил-донор, содержащий стереоконтролирующую группу (SPh) при С-3*.

Схема 6-1. Строение целевого полимерного сиалил-донора 183 и его предшественника - гликаля

Для сиалилирования полимера был предложен сукцинатный спейсер, присоединенный к боковой цепи остатка №и5Ас. Он может быть легко удален в основных условиях, не затрагивая О-бензильные защитные группы, что должно облегчить выделение продуктов гликозилирования. Следует отметить, что в синтезах других типов НТК, описанных в данной работе, конъюгация осуществлялась через аномерное положение углеводного фрагмента (через агликон-спейсер или непосредственно). В данном случае этот подход был неприменим, так как использование целевого НГК в качестве гликозил-донора предполагало возможность его активации с одновременным уходом агликона из аномерного положения.

Гликозил-доноры такого типа были предложены ранее, в том числе в работах группы Т. Огава.

Сукцинатный мостик:

легко удалить в основных условиях, не затрагивая бензильные защитные группы (важно для облегчения выделения продуктов гликозилирования)_

Полимер-носитель:

позволяет выделять продукты гликозилирования из реакционной смеси оса ведением МеОСМэ3

|Стереоконтролирующая группа: обеспечивает «-конфигурацию [образующейся гпикозидной связи

176а.

6.3. Синтез гликаля N-ацетилнейраминовой кислоты"

Ключевым интермедиатом для Получения производных Neu5Ac со стереоконтролирующей группой при атоме С-3 являлся гликаль Neu5Ac (176а). Это соединение также нашло применение в синтезе ингибиторов нейраминидазы вируса гриппа, один из которых недавно был коммерциализован в качестве лекарства для борьбы с гриппом (Relenza™). Однако ни один из методов, предложенных для получения этого важного интермедиата, не лишен недостатков. В рамках данной работы был разработан новый улучшенный способ синтеза 176а. В ходе изучения реакций сиалилхлорида 167а с фосфатными нуклеофилами (раздел 5.2.2) было обнаружено, что обработка 167а безводным Na2HP04 в кипящем MeCN приводит к гликалю 176а, который может быть выделен с выходом 95% простым фильтрованием реакционной смеси (схема 5-4). Этот метод получения гликаля 176а отличается мягкостью условий и отсутствием побочных продуктов, что позволяет применять его в крупных масштабах.

6.4. Синтез полимерного сиалил-донора

Гликаль 176а (раздел 6.3) по оптимизированной в данной работе методике был превращен в 8-ацетат 193 (схема 6-2). Наряду с поиском оптимальных условий селективного образования промежуточного 8,9-О-бензилиденового производного 186, ключевыми проблемами на этом этапе были минимизация N-бензилирования и подавление побочного образования сложных бензиловых эфиров сиаловых кислот в условиях реакции О-бензилирования диола 186, содержащего метоксикарбонильную группу. Последнюю проблему удалось решить путем полного омыления всех сложных эфиров, присутствующих в реакционной смеси. В результате после подкисления образовались всего две кислоты, превращенные реакцией с диазометаном в смесь соответствующих метиловых эфиров 189 и 190 (суммарный выход 96%), которые были легко разделены хроматографией. Региоселективное раскрытие бензилиденового цикла в 189 привело к целевому региоизомеру 192 с гидроксильной группой при С-8 (выход 78%), который был превращен в ацетат 193.

Последовательная обработка алкена 193 NBS в водном MeCN и затем PhSK в смеси /-BuOH-TIIF с выходом 88% привела к З-РИЭ-производному в виде смеси диастереомеров 195 и 196, в которой преобладал эпимер с аксиальным заместителем при С-3 (195:196 = 6:1). Обработка этой смеси DBU в толуоле привела к эпимеризации при С-3, и из реакционной смеси с выходом 78% был выделен целевой полуацеталь 196 с экваториальной PhS-группой. Ацетилирование аномерной гидроксильной группы в 196 дало с выходом 93% ацетат 197, превращенный в тиогликозид 198 (выход 91%), при дезацетилировании которого гладко образовалось ключевое производное 199 с гидроксильной группой при С-8.

Было проведено сравнение двух вариантов присоединения спирта 199 к полимерному носителю. Реакция 199 с сукциноилированным MPEG (MPEG-Su) в присутствии 1 -(мезитилен-2-сульфонил)-3-нитро-1Н-1,2,4-триазола (MSNT) в качестве конденсирующего агента привела к целевому полимеру MPEG-Neu5Ac (183) (выход 50-55%). По альтернативному пути спирт 199 был сначала превращен в сукцинат 200 (выход 63%),

' Совместно с A.M. Шпиртидр. [2,27,31,40,50,52,53].

реакция которого с MPEG в присутствии MSNT дала полимер 183 (выход 55-65%), практически неотличимый от образца, полученного первым способом.

Ph Ph

о он -â^b -¿óo

RO^TZ^O^cOjMe —i»ph^0„.zl-0yC02Me * H0-2^°>-C02Me —— BnO^Z^O^-COjMe —— AcNH-¿rAcNH~¿r^ AcNH-¿r-* AcN~¿r~-?

RO HO HO r ОВп

/ 176а R = Ас 185 186 189R = H

8 184 R = H 190 R = Bn

nn1 ОВп ОВп _

, ^ОАСОН ¿Ç^OACOR

AcNHBnO S ВпО

BnO R

191 R1 = H, R2 = Bn , 194R = Br (,196R = H

/192 R1 = Bn, R2 a H 9Wl95R = SPh(ax) v197R = Ac

5 193 R1 = Bn, R2 = Ac 1196 R * SPh (eq) 0H Me(0CH2CH2)„0

o^o су/Л

ОВп ОВп ОВп I ,OBn I

¿Ç.0AcC02Me ¿X1Ü0H C02Me co2Me C02Me

-► Вп0"^7~-о J-SMe —BnO" A-n-J-SMe -► BnO;;;A^0-4~SMe BnO;;/y~-0-J-SMe

AcNH-^ry^-SPh AcNH-^T^ii-SPh AcNH~¿^üí-SPh AcNH-^iZ-spt,

183

_t

Схема 6-2. Синтез сиалил-донора 183 на полимерном носителе. Реагенты и условия: а. 0.05 M MeONa, МеОН (выход 184 - 92%); Ъ. PhCH(OMe)2, CSA, DMF (выходы 185 - 25%, 186 - 72%); с. 1. BnBr, кон, Bu,NT, СаН2> THF—DMSO (10:1), 0 °С -> 21 °С; 2. 1 M NaOH; 3. HCl -» pH 1-1.5; 4. CH2N2, Et20, МеОН (выходы 189 - 75%, 190 - 21%); d. BH3-NMe3, A1C13, THF, MS 4Â (выходы 191 -4%, 192 - 78%); г. Ac20, Py (выход 193 - -99%); f. NBS, H20-MeCN (1:8) (выход 194 - -100%); g. PhSK, /-BuOH-THF, 4 °C (выход смеси 195 + 196 - 88% в расчете на 192); h. 0.005 M DBU, толуол, 4 °C (выход 196 - 78%); i. Ac20, Py, DMAP, CH2C12, 4 °C 26 °C (выход 197 - 93%); j. MeSSiMe3, ■ Me3S¡OTf, C1(CH2)2C1, MS 4A, 50 °C (выход 198 - 91%); к. 0.05 M MeONa, МеОН (выход 199 - 92%); /. янтарный ангидрид, Py, DMAP, 75 °С (выход 200 - 63%); т. 1. Ме(ОСН2СН2)„ОН (MPEG, молекулярная масса -5000 Да), MSNT, Л'-метилимидазол, СН2С12; 2. Ac20, Py, DMAP, СН2С12 (выход 183 - 55-65%); п. Ме(ОСН2СН2)п0С0(СН2ЬС02Н (MPEG-Su), MSNT, Л'-метилимидазол, СН2С12 (выход 183-50-55%). NBS-Л'-бромсукцинимид, DBU- 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ен, MSNT-1-(мезитилен-2-сульфонил)-3-нитро-Ш-1,2,4-триазол, DMAP - 4-(ЛиУ-диметиламино)пиридин.

6.5. Использование полимерного сиалил-донора в гликозилировании

В качестве модельного гликозил-акцептора было выбрано производное галактозы 201 с первичной гидроксильной группой. Наиболее эффективным способом активации полимерного гликозил-донора 183 оказалось использование DMTST. В этом случае выход дисахарида 204, выделенного после отщепления от полимера, составил 65—70%.

Стереоконтролирующий PhS-заместитель был удален из дисахарида 204 радикальной десульфуризацией с образованием защищенного дисахарида с 2—>6-гликозидной связью 205 с выходом 75%. Удаление PhS-группы протекало эффективно также и на полимерном производном дисахарида. Так, десульфуризация 202 привела к полимеру 203 и затем к дисахариду 205 с общим выходом 70%. Аналогичное гликозилирование полимерным гликозил-донором 183 менее реакционоспособного гликозил-акцептора 206 с вторичными гидроксильными группами гладко привело к целевому дисахариду с 2—>3-гликозидной

- 28 -

связью, который был выделен в виде лактона 207 с выходом 50-60%. В обоих случаях с высокой стереоселективностью (а:(3 = 98:2) образовались целевые а-аномеры дисахаридов 205 и 207, выделенные в индивидуальном виде.

ме(осн2сн2)„о

V^o

,OBnl

О С02Ме

AcNHj/^ií-sph BnO

BnO —ОН

ВпО-л—

BnOi.

Ме(ОСНгСН2)лО

OBn I

-О С02Ме

BnO и

■ОН СОгМе

ь(3 4 i

BnO' AcNH

О -Т~—0

- SPh В

; 183

НО —OBn , М ОБл

BnO 208

C02Me

205

BnOi.

Схема 6-3. Гликозшшрование с помощью сиалил-донора 183 на полимерном носителе. Реагенты и условия: а. ОМТЭТ, СН2С12> МБ 4А, -40 °С 27 "С; Ь. РЬ35пН, А1ВЫ, толуол, 80 "С; с. 0.1 М МеСЖа, МеОН (выход 204 - 65-70% в расчете на 183); (1. РЬзЭпН, А1В1\Г, толуол, 80 °С (выход 205 -75%); е. 0.1 М МеО№, МеОН (выход 205 - 70% в расчете на 183 через 202 и 203);/ 1. ОМТвТ, СН2С12, МБ 4А, —40 °С 27 °С; 2.0.1 М МеОКа, МеОН (выход 207 - 50-60% в расчете на 183).

Таким образом, впервые был синтезирован сиалил-донор на полимерном носителе и показано, что его можно использовать для эффективного и стереоселективного гликозилирования галактозных гликозил-акцепторов.

Глава 7. Развитие подходов к стереоселективному синтезу сиалоолигосахаридов для полумения сиалонеогликоконъюгатов*

7.1. Введение

Углеводные цепи ГК, содержащие терминальные остатки сиаловых кислот/ вовлечены в широкий круг биологических явления от межклеточной адгезии и подвижности клеток до онкогенеза и распознавания вирусов и бактерий. В связи с этим получение и биомедицинские исследования сиалоолигосахаридов, их аналогов, сиалосодержащих ГК и НГК на их основе являются важными областями химии углеводов и гликобиологии.

Ключевым и наиболее сложным этапом, который определяет успех синтеза сиалосодержащих НГК (схема 1), является стереоселективное введение остатков сиаловых кислот в состав олигосахаридов реакцией гликозилирования (сиалилирования). В большинстве случаев востребован природный а-изомер с экваториальной ориентацией агликона, однако вследствие аномерного эффекта термодинамически более выгодным является р-изомер с аксиальным агликоном, а стереоконтролирующая группа рядом с

Совместно с H.H. Малышевой и др. [3,28-30,33,47,48,51,54-64].

1 См. также главы 4,5,6.

аномерным центром отсутствует;* кроме того, с нуклеофильным замещением при аномерном центре конкурирует реакция элиминирования. Несмотря на то что в этой бурно развивающейся области в последнее время достигнут значительный прогресс, для сиалилирования по-прежнему характерны плохая предсказуемость и низкая воспроизводимость результатов. Во многих случаях небольшие на первый взгляд изменения в структуре реагентов или в условиях проведения реакции могут определять стереохимию реакции и выход продукта. Например, нами было найдено (глава 5), что замена группы АсИН на АсгК при С-5 в молекулах сиалилхлоридов 167а,Ь существенно влияет на стереоселектив] гость сиалилирования. По этой причине назрела потребность в подходе, с помощью которого можно, если не предсказывать, то хотя бы рационально объяснять результаты конкретных экспериментов по сиалшгарованию, которые порой могут обескураживать.

7.2. Модулирование результата гликозилирования: «супрамерный» подход 7.2.1. Основные положения «супрамерного» подхода

В данной работе предложен новый подход к повышению выхода и стереоселективности гликозилирования, в частности сиалилирования, который основан на недавно выдвинутой нами гипотезе об образовании нековалентно-связанных агрегатов реагирующих молекул -«супрамеров» (сулргшолекулярных изомеров). Согласно этому подходу во многих случаях истинными реагирующими частицами в растворах являются не изолированные молекулы,* а супрамеры реагентов с различной структурой. При этом строение молекул реактантов*, а также условия проведения реакции определяют тип агрегации и пространственную структуру супрамеров, образующихся в том или ином конкретном случае. Модификация защитных 1рупп или других функциональных групп, не участвующих в рассматриваемой реакции, может модулировать тип агрегации и структуру супрамеров, образующихся из сходных молекулярных блоков. Согласно предложенной гипотезе, супрамеры различного строения могут реагировать по-разному. Доступность реакционного центра (реагирующей функциональной группы) в супрамерах, образующихся в конкретных условиях из данного типа молекул, определяет реакционную способность реагентов, селективность реакции и выходы продуктов8.

С точки зрения «супрамерного» подхода результат реакции гликозилирования во многом определяется балансом агрегации и дезагрегации молекул гликозил-донора: дезагрегация повышает реакционную способность гликозил-донора и выход гликозида, а существование несимметричных агрегатов делает возможным стереоконтроль процесса гликозилирования. Хотя к образованию супрамеров могут приводить различные межмолекулярные

См. главу 6, где описаны синтез и применение модифицированного сиалил-донора на полимерном носителе, содержащего временную стереоконтролирующута группу при С-3, которую удаляют после проведения стадии гликозилирования.

* «Супрамерный» подход ни в коей мере не игнорирует феномен сольватации. Более того, хотя в данной главе далее об этом речь не пойдет, в состав супрамеров неизбежно должны входить молекулы растворителя. 1 Под реактантами понимают всех участников химической реакции, т.е. как реагенты, так и продукты. ® Хотя в дальнейшем речь будет идти главным образом о стереоселективности реакции сиалилирования, «супрамерный» подход применим также и к обсуждению регио- и хемоселективности реакций.

взаимодействия, в случае амид-содержащих сиалил-доноров наиболее существенный вклад вносит агрегация за счет образования межмолекулярных водородных связей.

¿SÍS.OAcsPh

R 0Ас 208а,b

С02Ме + н0.

OrOBz

OBz 209

HOrOBz

210а,Ь

¿^.OAccOjMe

208а+ 209 -» 210а + 211а

208Ь + 209 —- 210Ь + 211Ь

208а + 208Ь + 209 —(210а + 211а) + (210Ь + 211Ь)

но 211а,Ь

^Lo

Схема 7-1. Модельная реакция сиалилирования, демонстрирующая синергизм при гликозилировании. Реагенты и условия: а. 1. МБ-ТГОН, МБ ЗА, МеСЫ, -40 "С; 2. гель-хроматография на BioBeads ЭхЗ (толуол). Смеси дисахаридов (210а + 211а) и (210Ь + 211Ь), полученные из смеси 208а и 208Ь, были дополнительно разделены хроматографией на силикагеле. Я = Н (а), Ас (Ь); ЯЕ = (СН2)281Ме3. См. рис. 7-1.

В последующих разделах данной главы будут рассмотрены примеры использования «супрамерного» подхода для выявления экспериментальных параметров, которые ранее не рассматривались как определяющие результат гликозилирования. 7,2.2. Синергизм при гликозилировании

Недавно мы обнаружили синергетическую активацию тиогликозида 208а с одной 1Ч-ацетильной группой в присутстствии Л'.Л'-диацетилтиогликозида 208Ь в реакции с диолом 209 (схема 7-1). Гликозилирование 209 эквимолярной смесью 208а и 208Ь завершилось за 5 мин, в то время как для полной выработки 208а требовалось 3 часа, если в реакционной смеси присутствовал только один гликозил-донор (рис. 7-1).

а 60

so -

vP 40 -

30

§

3 20 -

m

10

0

15 мин 180 мин

40 30 20 10 0

Рис. 7-1. Выходы (%) дисахаридов, образовавшихся в реакции гликозилирования (см. схему 7-1), остановленной спустя указанное время, а. Выход суммы дисахаридов (210b + 211Ь) с двумя N-ацетильными группами; Ъ. Выход суммы дисахаридов (210а + 211а) с одной N-ацетильной группой. Светлые прямоугольники - реакция 208а или 208Ь с 209, темные прямоугольники - реакция смеси (208а + 208Ь) (1:1) с 209.

Мы предположили, что возможной причиной выявленной нами необычной синергетической активации тиогликозида 208а в присутствии тиогликозида 208Ь является

Поскольку в качестве гликозил-акцептора был использован диол 209, в результате реакции гликозилирования образовывались практически неразделимые смеси 2—»3- и 2—>4-связанных изомерных дисахаридов (210а + 211а) и (210Ь + 211Ь), что в данном случае помешало определению стереоселективности.

деполимеризация малореакционноспособных олигомерных водородно-связанных гомо-супрамеров {208а}, вызванная добавлением 208Ь, которая приводит к образованию более активных гетее/>о-супрамеров {208а + 208Ь} (схема 7-2). На макроскопическом уровне это проявляется в повышении наблюдаемой реакционной способности соединения 208а и, как следствие, ускоренном образовании N-ацетилированных дисахаридов (210а + 211а) с большим выходом (см. рис. 7-1). Предполагаемые изменения в системе водородных связей амида 208а в растворе в MeCN при добавлении ЛУУ-диацетилтиогликозида 208Ь, указывающие на образование смешанных супрамеров {208а + 208Ь}, подтверждаются данными ИК-спектроскопии (табл. 7-1).

Таблица 7-1. Данные ИК-спектроскопии для растворов 208а, 208Ь и их смеси (1:1) в MeCN.

Колебания 208а 208Ь 208а + 208Ь

NH («свободные») 3365 см"1 отсутствует интенсивность полосы уменьшается

С=0 (амид) 1688 см ^ (внутренний стандарт) 1713 см-1 1679 см~' полоса исчезает интенсивность полосы возрастает при охлаждении от -25 "С до —30 °С

Из полученных данных следует вывод о том, что определение относительной реакционной способности методом конкурентных реакций при одновременном использовании нескольких гликозил-доноров в одной реакционной смеси может быть некорректным вследствие возможной синергетической активации менее реакционноспособного гликозил-донора. Хотя этот вывод однозначно подтвержден только для реакций сиалилирования, он может оказаться применимым и к другим системам.

Me Me Me

Н J=0---Н /1=о---Н }=0-NN N

медленная реакция

быстрая реакция

быстрая реакция

Me Me Ме

0=1, /1=0---Н /1=0 N N

(208а + 208Ь}

быстрая реакция

Схема 7-2. Возможной причиной синергетической активации 208а в присутствии 1 экв. 208Ь является деполимеризация малореакционноспособных олигомерных супрамеров {208а}, вызванная присутствием 208Ь, которая приводит к образованию более активных смешанных супрамеров {208а + 208Ь}.

Супрамеры любой структуры, образованные молекулами одного типа, например, 208а, будут в дальнейшем обозначаться {208а}, а смешанные супрамеры с другими молекулами, например, 208Ь, - как {208а + 208Ь}.

7.2.3. Влияние добавок «нереагирующих» веществ на результат гликозилирования

Важным следствием полученных результатов является то, что они открывают новые возможности для поиска способов влияния на реакционную способность гликозил-доноров. Так, на структуру водород-связанных супрамеров гликозил-донора и, следовательно, на исход сиалилирования могут влиять и другие амиды/имиды 212-218 (рис. 7-2) со структурами, напоминающими 208Ь.

о

А ^Ме [Г |<

Ме

212Р = Н(ОМР) 213Р = Ме (ИМА)

О О Ме

214 (ОАМА)

1 " О Ме

216(АС1_)

^-ОАс

АсО-АсО

I

Ме 215 (ММЭ) -ОАс

АсО АсО

ОАс ЫАСг 217 (СМАс2)

г-иле

ОВп О

О

218 ^Р)

219 (Эи-Н)

Рис. 7-2. Три типа амидов/имидов, упоминаемых в главе 7.

Для упрощения определения стереоселективности гликозилирования была использована другая модельная реакция между гликозил-донором 208а и гликозил-акцептором 220 с одной гидроксилькой группой при промотировании системой Ж-ТГОН в МеСИ или СН2С12 (схема 7-3). При этом хорошо заметен эффект типа амида на выход дисахарида 221 (рис. 7-3, А). Добавки имидов типа 2 (214-218) не уменьшали выход дисахарида 221 (рис. 7-3, А;/-к) по сравнению с результатами реакции, проводимой без добавок (а). Напротив, избыток амидов типа 1 (212,213) заметно снижал выхода дисахарида 221 (6-е). Эта ранее неизвестная зависимость результата сиалилирования от концентрации амидов типа 1 была объяснена с помощью ИК-спектроскопии. Спектры показали, что при добавлении к раствору 208а 1 экв. амида 212 или 213 (схема 7-4, а) затрагиваются только водородные связи амид-эфир, тогда как добавка 3 экв. амида (схема 7-4, Ь) ослабляет также более прочные водородные связи амид-амид, в большей степени меняя структуру супрамеров {208а}.

ОАс „л ¿^уОАсэРЬ

—ч/о<гон

Л ОАс

'С02Ме

Оо Ь или с

Л

Ме ме

ОАс

С"*ОАссо2Ме

н

""о

ОАс Ме о

Ме о

221

АсО' АсИ

^.ОАс

-0^С02Ме ОАс 176а

X

Ме Ме

Схема 7-3. Модельная реакция сиалилирования, на примере которой было изучено влияние добавок амидов/имидов (см. рис. 7-2) на результат гликозилирования. Реагенты и условия: а. 1. №8-"ГГОН, Мй ЗА, МеСЫ, -40 "С, 3 ч (если не указано иначе); 2. гель-хроматирафия на ВюВсас)з 3*3 (толуол). Ъ. 1. МБ-ТГОН, МЭ ЗА, СН2С12, -40 °С, 3 ч; 2. гель-хроматография на ВюВеас^ ЭхЗ (толуол), с. ОМТЭТ, МЭ ЗА, МеСЫ, ~25 °С, 18 ч (если не указано иначе); 2. гель-хроматография на ВюВеасЬ 8*3 (толуол).

Рис. 7-3. Условия и результаты реакции гликозилирования, показанной на схеме 7-3, в MeCN (N1S-ТГОН, —40 °С, 3 ч). А. Выход дисахарида 221 (%). В. Соотношение аномеров (tx:ß) дисахарида 221. Добавки (экв.): а) нет, Ъ) 212 (1), с) 212 (3), d) 213 (1), е) 213 (3),f) 216 (1), g) 216 (3), h) 208b (1), i) 214 (1)J) 214 (3), к) 217 (3). Концентрация 208a 10 мг/мл.

Наивысшие выходы дисахарида 221 были получены при гликозилирование в MeCN в присутствии следующих имидов типа 2: 208Ь, 214 и 217 (рис. 7-3, h, к). Общей особенностью их строения является присутствие N.N-диацетиламиннного фрагмента (NAC2) (схема 7-1 и рис. 7-2), который может выступать в роли эффективного акцептора водородной связи. Таким образом, сходное влияние этих имидов на результат модельной реакции сиалилирования может быть связано со способностью их молекул встраиваться в систему водородных связей, образуя однотипно организованные супрамеры.

Н-саизи амид-эфир Н-связи амид-амид

Рис. 7-4. Влияние концентрации амидов типа 1 на систему водородных связей в растворе 208а в MeCN по данным ИК-спектроскопии: а) 1 экв., V) 3 экв. Показаны частоты колебаний амидных С=0 групп [изменения] (v/cm4). Для ясности показаны димерные фрагменты супрамеров {208а}. Концентрация 208а 10 мг/мл.

в

з.о

Рис. 7-5. Условия и результаты реакции гликозилирования, показанной на схеме 7-3, в СН2С1г (NIS-ТГОН, -25 °С, 3 ч). А. Выход дисахарида 221 (%). В. Соотношение аномеров (а:р) дисахарида 221. Добавки (экв.): а) нет, Ь) 214 (3), с) 217 (3). Концентрация 208а 10 мг/мл.

Добавка имидов типа 2 значительно изменяет соотношение между аномерами дисахарида 221 даже в CH2CI2, в котором реакция приводит главным образом к (5-изомеру (схема 7-4), что традиционно объясняют отсутствием стереоконтролирующего нитрильного эффекта и термодинамической предпочтительностью образования |3-аномера вследствие аномерного эффекта (схема 7-4). В присутствии имида 217 в реакционной смеси доминирует а-изомер (рис. 7-5). Это необычное обращение стереоселективности при проведении гликозилирования в CH2CI2 в присутствии добавки нереагирующего соединения может быть легко объяснено в рамках «супрамерного» подхода. Действительно, доступность а- и (3-сторон в 208а может существенно отличаться в различно организованных супрамерах, образующихся в присутствии имидов 214 и 217, так как в имиде 217 к фрагменту NAC2 присоединена большая группа, что приводит к лучшему экранированию |3-стороны в гликозил-доноре 208а и интермедиатах, возникающих из него при промотировании. 7.2.4. Влияние времени реакции на стереоселективность в MeCN

При проведении гликозилирования (схема 7-3) в MeCN и промотировании системой N1S-ТГОН основным продуктом устойчиво являлся дисахарид 221 с а-конфигурацией. Однако, в отличие от выхода продукта сиалилирования 221, который изменялся от 57% до 88% (рис. 73, А), заметных изменений стереоселективности в этих реакциях при добавлении амидов/имидов (рис. 7-2) замечено не было (рис. 7-3, В), что представляется необъяснимым в рамках «супрамерного» подхода. Более детальный анализ проблемы выявил, что статический подход, учитывающий строение супрамеров до начала реакции, явно недостаточен и необходимо рассматривать их структурные перестройки в ходе реакции, вызванные изменением концентраций реактантов.

В качестве ключевого партнера в образовании водородных связей может быть выделен сукцинимид 219 (рис. 7-2), количество которого растет в ходе гликозилирования, промотируемого системой NIS-TfOH (схема 7-4). Поскольку сукцинимид 219 содержит наиболее кислый в системе протон NH, он является значительно более сильным донором водородной связи, способным эффективно конкурировать с амидами 208а и 221 за акцепторы водородной связи, присутствующие в реакционной смеси. По этой причине в конце реакции, независимо от присутствия амидов типа 1, содержащих менее кислую группу

КН, или имидов типа 2, лишенных этой группы (рис. 7-2), структура супрамеров гликозил-донора 208а будет определяться главным образом этим дополнительным сильным донором водородной связи (219) (схема 7-5). Как следствие, стереоселективность гликозилирования после завершения реакции должна быть сходной во всех рассматриваемых случаях, что и наблюдается на практике (рис. 7-3). Это также означает, что можно ожидать значительных изменений стереоселективности сиалилирования в ходе реакции, так как влияние сукцинимида 219 на структуру супрамеров будет возрастать по мере роста его концентрации в ходе реакции, что связано с различиями в пространственном расположении донорных и акцепторных сайтов в молекуле сукцинимида 219 и других амидов 208а, 221, 176а, присутствующих в реакционной смеси (схема 7-5).

Схема 7-4. Упрощенная схема, объясняющая механизм контроля стереоселективности при гликозюшровании, промотируемом системой ГОБ-ТГОН в МеОЧ, на примере активации тиогликозида 208а. На основании этой схемы можно предсказать, что а-стереоселективность будет возрастать при разбавлении вследствие преимущественного образования «нитрилиевых аддуктов», в которых Р-сторона экранирована от атаки нуклеофилом. Аномерный эффект способствует образованию Р-сиалозида с аксиальным агликоном. Нитрильный эффект способствует образованию а-сиапозида. Сукцинимид 219 - побочный продукт, образующийся при гликозилировании в этих условиях. Его количество равно количеству прореагировавшего гликозил-акцептора КОН, то есть растет в ходе гликозилирования. № - нуклеофил (например, ЯОН).

Для проверки этой гипотезы было проведено сиалилирование гликозил-акцептора 220 при активации гликозил-донора 208а системой ЫВ-ТЮН (схема 7-3). Однако в даном случае реакцию остановили через 15 мин, а не через 3 часа, в течение которых весь гликозил-донор вырабатывался полностью. Хотя выход продукта гликозилирования 221 несколько уменьшился (62% против 69%), количество а-аномера удвоилось (а:Р = 13:1 против 7:1,

РЬ

Р(1 е

-С02Ме

ОАс Р-сиалозид

соответственно) (рис, 7-6). Подчеркнем, что этот беспрецедентный феномен изменения стереоселективности был предсказан с помощью «супрамерного» подхода.

-'>¡¡43*

1 н

Ме 208а

I

О

MOON

I

Me^N

О О

X X

hí'n мв

д

Y

Умеренное экранирование Р-стороны п/р= 13:1

Плохое экранирование р-стороны

Схема 7-5. Возможные изменения структуры супрамеров гликозил-донора {208а} в зависимости от количества добавленного DAMA (214). Структуры супрамеров в конце сиалилирования близки даже в присутствии DAMA, что связано с образованием смешанных супрамеров с сукцинимидом {208а + 219}.

Рис. 7-6. Стереоселективность сиалилирования, промотируемого NIS-TfOH, меняется в ходе реакции. Результат реакции гликозилирования в MeCN (схема 7-3), остановленной через указанное время (NIS-TfOH, -40 °С; 15 мин или 3 ч). А. Выход дисахарида 221 (%). В. Соотношение аномеров (<х:Р) дисахарида 221. Темные прямоугольники - реакция остановлена через 15 мин, светлые прямоугольники - реакция остановлена через 3 ч. Добавки (экв.): а) нет, Ъ) 214 (1), с) 214 (3). Концентрация 208а 10мг/мл.

Стереоселективность сиалилирования в присутствии переменных количеств DAMA (214) возросла в еще большей степени (до а:(3 = 27:1) (рис. 7-6). Важно, что хотя добавление 1 экв. DAMA (214) значительно увеличивало стереоселективность сиалилирования, избыток

-37-

DAMA (214) приводил к ее падению (рис. 7-6). Это исключает альтернативное «супрамерному» подходу объяснение влияния DAMA (214), предполагающее образование катионоидных интермедиатов имидатного типа.

Таким образом, впервые продемонстрировано, что стереоселективность гликозилирования может меняться в ходе реакции, и на этой основе разработан новый эффективный подход к высокостереоселективному а2->6-сиалилированию, базирующийся на добавлении в реакционную смесь 1 экв. нереагирующего соединения (DAMA) и уменьшении времени реакции с 3 часов до 15 минут.

7.2.5. Влияние концентрации на результат гликозилирования

При обсуждении супрамолекулярной агрегации естественно ожидать, что концентрация гликозил-донора будет влиять на размер и структуру образующихся супрамеров и, следовательно, на их реакционную способность и исход реакции гликозилирования. В настоящее время о супрамерах и их структуре известно немного. Тем не менее, в результате изучения растворов сиалил-донора 208а в MeCN с помощью ИК-спектроскопии и поляриметрии оказалось возможным зарегистрировать фазовые переходы, которые отражают изменение структуры водородно-связанных супрамеров {208а}, происходящее при изменении концентрации (рис. 7-7, а). В свете этого неудивительно, что кривая концентрационной зависимости выхода дисахарида 221, образующегося из гликозил-донора 208а по реакции (208а + 220 —> 221) (схема 7-3), претерпевает излом в том же интервале концентраций (рис. 7-7, Ъ), в котором формируются супрамеры {208а} с другой структурой и реакционной способностью.

Рис. 7-7. Перестройка супрамеров в растворе гликозил-донора 208а в MeCN (а), вызванная изменением концентрации, и выход (%) дисахарида 221 (NIS-ТЮН, MeCN, -40 °С, 3 ч; схема 7-3) при различных концентрациях 208а (Ъ)\ 1 (кружки, пунктирная линия) - содержание «свободных» NH групп в растворе гликозил-донора 208а в MeCN (~25 °С), вычисленное как отношение поглощения полосы колебаний NH при 3365 см"1 и амидной полосы колебаний С=0 при 1676 см~' (A(NH-cbo6.) / а(С=0 амид); при этом последняя была использована в качестве «внутреннего стандарта»; 2 (квадратики, сплошная линия) - величина удельного оптического вращения ([a]D) раствора 208а в MeCN (усреднено в интервале температур 23-26 °С). Темный прямоугольник обозначает область концентраций, в которой происходит перестройка супрамеров.

Из рис. 7-7 следует два вывода. Первый состоит в том, что поляриметрия и ИК-спектроскопия высокочувствительны к супрамолекулярной агрегации и могут быть использованы для ее изучения. Второй, не менее важный вывод - критические точки на

графиках концентрационных зависимостей оптического вращения или интенсивности соответствующей полосы (например, колебаний Ш) в ИК-спектре могут дать информацию об изменениях структуры супрамеров и, следовательно, их реакционной способности и тем самым позволить предсказать результат гликозилирования. Таким образом, изучая физические параметры растворов гликозил-донора в растворителе для гликозилирования можно найти области концентраций, в которых следует ожидать аномалии в его химическом поведении.

Для поиска оптимальных условий проведения проблематичной реакции сиалилирования (222 + 223 -> 224) (схема 7-6) был применен сценарий, основанный на использовании «супрамерного» подхода. На первом этапе анализ концентрационной зависимости величины оптического вращения для серии растворов гликозил-донора 222 в МсСМ выявил несколько критических точек (рис. 7-8, 6)> соответствующих концентрациям 50 мМ, 69 мМ и 103 мМ (помечены жирными стрелками). Далее была проведена серия химических экспериментов в критических точках и при нескольких промежуточных концентрациях (рис. 7-8, а). С ростом концентрации гликозил-донора 222 с ТТА>Щ-группой при С-5 выход дисахарида 224 постепенно увеличивается и после критической концентрации 69 мМ выходит на плато (рис. 7-8, а, 1). В то же время концентрационная зависимость стереоселективности (рис. 7-8, а, 2) не такая простая. Соотношение аномеров продукта гликозилирования 224 может быть очень высоким при некоторых концентрациях (а:(} =» 20:1), умеренным (а:р = 8:1) или низким (а:р = 4:1) при других концентрациях; при этом во всех случаях доминирует гликозид 224 с экваториальным агликоном (см. рис. 7-8, а). Существенно, что изломы этой кривой соответствуют критическим концентрациям, выявленным с помощью поляриметрии (ср. рис. 7-8, Ъ, 2). Однако более тщательный анализ показывает, что при высоких концентрациях ситуация сложнее. Второму максимуму (при 103 мМ) на графике оптической активности (рис. 7-8, Ь) соответствует не явно выраженный максимум, а плохо разрешенный перегиб на графике стереоселективности (рис. 7-8, а). По этой причине было решено учитывать в «супрамерной» модели также второй компонент реакции - гликозил-акцептор 223. С использованием поляриметрии и динамического светорассеяния (ЛЬБ) (рис. 7-8, с, с[) было установлено, что при концентрациях выше критической (69 мМ) в реакционных растворах образуются смешанные супрамеры {222 + 223}, включающие молекулы обоих реагентов. ОАс ,ОАе„, С02Ме ОАс_.

Ме * ВП0^° ~ ♦ Асо^^е

Н иАС ОВП ОАс ОВп Н 0Ас

222 223 224 225

Схема 7-6. Реакция сиалилирования, для оптимизации которой был применен «супрамерный» подход. См. рис. 7-8. Реагенты и условия: а. 1. МБ-ТГОН, МБ ЗА, МеС>Г, ^10 °С; 2. гель-хроматография на ВюВеаёз вхЗ (толуол). МР = 4-метоксифенил.

Важно подчеркнуть, что в области высоких концентраций (выше 69 мМ), где существуют смешанные супрамеры {222 + 223} (рис. 7-8, с, 4), выход дисахарида 224 не зависит от концентрации, и в то же время он возрастает с ее ростом в области низких концентраций, где существуют гомо-супрамеры {222} (рис. 7-8, а, 1).

-39-

0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 С/мольл"'

о

-5 =° -10 -15 -20-

0.00 0.05 0.10 0.15 С /моль-л"1

0.00

0.05 0.10 0.15 С /мопь-л-1

0.20

0.05 0.10 0.15 С /моль-Л"1

Рис. 7-8. Результат реакции гликозилирования, показанной на схеме 7-6, (а) и его корреляция с оптическим вращением (А,с) и данными БЬв (<1) для растворов с различными концентрациями: (а) 1 (квадратики, пунктирная линия) - выход (%) дисахарида 224; 2 (кружки, сплошная линия) -соотношение аномеров (0(/(5) 224. (6) Величина удельного оптического вращения (ВДп28) гликозил-донора 222 в МеСЫ. (с) Оптическое вращение (ап28) в МеС№ 3 (кружки, пунктирная линия) - сумма оптических вращений 222 и гликозил-акцептора 223, измеренных по отдельности; 4 (квадратики, сплошная линия) - оптическое вращение смесей (1:1) 222 и 223. (¿1) Сравнение средних гидродинамических радиусов светорассеивающих частиц (йь/нм) в МеС№ 5 (квадратики, сплошная линия) - смеси (1:1) 222 и 223; 6 (треугольники, пунктирная линия) - растворы гликозил-акцептора 223; 7 (кружки, линия из точек) — растворы гликозил-донора 222. Жирные вертикальные стрелки обозначают критические концентрации (50 мМ, 69 мМ и 103 мМ). Затененная область обозначает диапазон концентраций, в котором существуют гетеро-супрамеры {222 + 223}; в светлой области существуют гомо-супрамеры {222} + {223}.

Обнаруженная сложная концентрационная зависимость стереоселективности

сиалилирования (рис. 7-8, а, 2) важна как с чисто практической точки зрения, так и для

углубленного понимания механизмов процессов, определяющих результат

гликозилирования. При практической оптимизации гликозилирования без учета

существования критических концентраций легко «не заметить» благоприятные условия,

обеспечивающие высокую стереоселективность (а:(3 = 20:1). Анализ рис. 7-8, а показывает,

что результаты экспериментальной проверки любого теоретического предсказания о

характере концентрационной зависимости соотношения аномеров существенно зависят от

выбранного набора тестовых концентраций. В целом они не подтверждают общепринятый

взгляд на причину стереоселективности сиалилирования в МеСИ, основанный на

представлении о соучастии растворителя с образованием так называемых «нитрилиевых

интермедиатов» В (схема 7-4). Поскольку в исследованиях влияния концентрации на

стереоселективность гликозилирования, выполненых другими авторами, не придавалось

- 40 -

значения вопросу адекватного выбора тестовых концентраций, не удивительно, что полученные ранее результаты часто оказывались противоречивыми.

7.3. Значимость «супрамерного» подхода

Применение «супрамерного» подхода позволило выявить новые переменные, которые способны модулировать стереохимический результат гликозилирования. К числу этих ранее не рассматривавшихся в таком аспекте параметров относятся концентрации реагентов, присутствие в реакционной смеси других соединений, включая «нереагирующие» добавки или примеси, и время реакции. Эти факторы могут влиять на структуру супрамеров, образованных в реакционном растворе молекулами реагентов, как это продемонстрировано на серии представительных примеров с помощью ИК-спектроскопии, поляриметрии и светорассеяния. Изменения структуры супрамеров, а значит их реакционная способность, коррелируют с результатом гликозилирования, причем влияние испытывают как стереонаправленность реакции, так и выход продукта гликозилирование. Общепринятый взгляд на происхождение стереоселективности сиалилирования в МеСИ, основанный на представлениях о соучастии растворителя, не подтверждается полученными нами данными, которые позволяют по-новому взглянуть на проблему воспроизводимости результатов гликозилирования.

Хотя «супрамерный» подход был предложен лишь недавно, он уже продемонстрировал свою полезность для рационального объяснения и предсказания неожиданных явлений, существование которых было невозможно предвидеть с традиционной точки зрения. Кроме того, он позволил разработать высокоэффективные и стереоселективные синтезы гликозидных связей Кеи-(а2—>3)-Оа1 и Кеи-(а2-}6)-Оа1, которые присутствуют во многих сиалоолигосахаридах и ГК, важных с биологической и медицинской точки зрения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Несмотря на значительные успехи в области синтеза НТК, достигнутые в результате усилий многих лабораторий во всем мире, в настоящее время по-прежнему невозможно предсказать, на каком этапе встретится «узкое место», которое заставит остановиться и начать более детальное исследование обнаруженной проблемы или оптимизацию проблемной стадии. Вследствие этого, приступая к получению НТК, необходимо хорошо представлять себе все его аспекты и этапы (схема 1) и четко осознавать альтернативы, чтобы сделать оптимальный выбор из возможных вариантов. В связи с этим неслучайно в данной работе большое внимание уделялось проблемам, возникающих на различных стадиях синтеза НТК. Их решение стимулировало развитие соответствующих разделов химии НТК и химии углеводов в целом, что отражено в структуре данной диссертации (схема 1) и выводах.

Отдельно отметим неожиданный «бонус», полученный в данной работе. Попытки разобраться в причинах плохой предсказуемости и невысокой воспроизводимости результатов реакции сиалилирования привели к созданию нового оригинального подхода к планированию экспериментов и анализу их результатов, основанного на учете возможности образования нековалентно-связанных агрегатов реагирующих молекул - супрамеров.

Показано, что в зависимости от условий в растворах присутствуют супрамеры реагентов различной структуры, отличающиеся по своим химическим свойствам, которые могут быть детектированы с помощью физико-химических методов. Таким образом, химические свойства вещества - это атрибут супрамера, а не изолированных молекул. Возможность образования в реакционной смеси супрамеров, ранее почти полностью игнорировавшаяся, должна рассматриваться как важный фактор, учет которого позволит существенно повысить предсказуемость результатов химических реакций.

Наши результаты показывают, что для успешного решения задачи получения НТК необходим комплексный учет всех ее аспектов и согласованное планирование всех этапов (схема 1), включая как синтез углеводного фрагмента, так и дизайн спейсера, а также способ и момент введения последнего, не говоря уже о стадии конъюгации с носителем. Другими словами, синтез НГК должен планироваться так же тщательно, как это делается при разработке многостадийных синтезов сложных соединений.

Полученные в настоящей работе данные позволяют считать выполненной поставленную в ней задачу по разработке эффективных подходов к синтезу НГК различных типов.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны эффективные подходы к синтезу неогликоконъюгатов (НГК) различных типов, имеющих разнообразные медико-биологические приложения: неогликолипидов с неприродным углеводным или неприродным липидным компонентом, неогликопротеина, неогликополимеров с незащищенными сахарами или их производными с защитными группами, конъюгатов полиэдрических соединений бора с углеводами.

2. Впервые синтезированы НГК сополимерного типа на основе олигосахаридов с остатками уроновых кислот в виде амидов с аминокислотами, востребованные для иммунохимической характеристики эпитопов антигенных полисахаридов бактерий.

3. Разработан улучшенный метод синтеза лактама сиалоолигосахаридной цепи ганглиозида Омз, являющегося гидролитически стабильным аналогом Омз-лактона. Получены неогликопротеин и неогликолипид на основе Омз-лактама в качестве перспективных иммуногенов для выработки диагностических антител к опухоль-ассоциированным антигенам.

4. Осуществлен первый стереоселективный синтез НТК гликолипидного типа -сиалил(полипренил)фосфата - предполагаемого интермедиата биосинтеза полисиаловых кислот ряда патогенных менингококков и кишечной палочки.

5. Разработан унифицированный подход к синтезу гликоконъюгатов полиэдрических соединений бора — потенциальных агентов направленной доставки соединений бора к клеткам опухоли для бор-нейтронозахватной терапии рака (так называемое гликоадресование). Особенностью этого подхода является отсутствие защитных групп на остатке углеводного фрагмента, что делает его применимым для присоединения различных полиэдрических соединений бора не только к синтетическим О-гликозидам,

но и к К-гликозиламидным производным более сложных олигосахаридов, выделенных из природных источников.

6. Предложено использовать 2-азидоэтильный агликон с латентной аминогруппой в качестве удобного преспейсера при синтезе НГК. Данный подход позволяет легко модифицировать агликон-спейсер и получать из единого олигосахаридного предшественника различные спейсерированные интермедиаты и НГК на их основе.

7. Изучена 6,3-лактонизация гликопиранозидов уроновых кислот (глюкуроновой, галактуроновой и маннуроновой) под действием уксусного ангидрида и алкоголиз образующихся лактонов различными спиртами (метиловым, бензиловым и аллиловым). На этой основе разработан препаративный метод получения селективно защищенных производных глюкуроновой кислоты со свободной гидроксильной группой при С-3.

8. Обнаружена ранее неизвестная реакция деборирования клозо-орто-карборанов, входящих в состав НГК, которая протекает в водных растворах и приводит к образованию соответствующих конъюгатов с нидо-карборанами. Показано, что скорость деборирования существенно зависит от природы агликона-спейсера, соединяющего углеводный фрагмент с карборановым каркасом.

9. Синтезирован первый сиалил-донор на полимерном носителе и продемонстрирована его применимость для стереоселективного синтеза сиалоолигосахаридов.

10. Найдено, что сиалилхлориды реагируют с незаряженными О-нуклеофилами при отсутствии промоторов и предложено использовать их для стереоселективного синтеза а- и р-сиалилфосфатов, а также а-метил- и а-аллилсиалозидов. Показано, что а-стереоселективность сиалилирования может быть существенно повышена за счет использования новых сиалилхлоридов с двумя ацетильными группами при атоме азота или со свободной карбоксильной группой.

11. На основе реакции дегидрохлорирования сиалилхлоридов предложен новый эффективный метод синтеза гликалей сиаловых кислот — предшественников ряда противовирусных препаратов, пригодный для крупномасштабного получения целевых продуктов.

12. Выдвинута оригинальная гипотеза, объясняющая химическое поведение реагентов образованием нековалентно-связанных агрегатов реагирующих молекул - супрамеров. На ее основе предложен нетрадиционный («супрамерный») подход к планированию экспериментов и анализу их результатов, что позволило а) интерпретировать ряд необычных фактов, б) выявить экспериментальные параметры, которые ранее не рассматривались как определяющие исход гликозилирования (концентрации реагентов, присутствие других соединений, включая «нереагирующие» добавки или примеси, время реакции) и в) разработать высокоэффективные и стереоселективные методы синтеза гликозидных связей К'еи-(а2—>3)-Са1 и Кси-(а2^>6)-Са1, входящих во многие биологически важные сиалоолигосахариды и гликоконъюгаты.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях

Главы в книгах

1. G. Magnusson, A. Ya. Chernyak, J. Kihlberg, L. О. Kononov / Synthesis of neoglycoconjugates // in: Neoglycoconjugates: Preparation and Application, Y. C. Lee and R. T. Lee (Eds.), Academic Press: San Diego, California, 1994, pp. 53-143. ИЦ: 49.*

2. N. Y. Kulikova, A. M. Shpirt, A. Chinarev, L. O. Kononov / Synthesis of O-acetylated N-acetylneuraminic acid glycal // Carbohydrate Chemistry: Proven Synthetic Methods // P. KovaC (Ed.), CRC Press Taylor Francis, Boca Raton, FL, 2011, Vol. 1, Ch. 27, pp. 245-250.

3. L. O. Kononov / Modulation of Stereoselectivity of Glycosylation: A Supramer Approach // in: Advances in Chemistry Research // J. C. Taylor (Ed.), Nova Science Publishers, Inc., Hauppauge, NY, 2013, Vol. 18, Ch. 4, pp. 143-178.

Статьи в сборниках

4. А. В. Орлова, Л. О. Кононов / Синтез конъюгата лактозы с орто-карбораном // Синтезы органический соединений: Сборник 3, ред. М. П. Егоров, МАКС Пресс: Москва, 2008, с. 191-193.

5. А. М. Шпирт, Л. О. Кононов, В. Н. Шибаев / Синтез Р-дибензилфосфата N-ацетилнейраминовой кислоты // Синтезы органический соединений: Сборник 3, ред. М. П. Егоров, МАКС Пресс: Москва, 2008, с. 262-265.

Обзор

6. А. В. Орлова, Л. О. Кононов / Синтез конъюгатов углеводов с полиэдрическими соединениями бора // Усп. химии 2009, 78,683-696.

Экспериментальные статьи

7. А. Я. Черняк, Л. О. Кононов, К. В. Антонов / Синтез и селективный алкоголиз ацетатов D-гексопиранозидуронолактонов // Изв. Акад. наук СССР, сер. хим. 1988,1660-1667.

8. А. Я. Черняк, Л. О. Кононов, Н. К. Кочетков / Синтез 2-акриламидоэтилгликозидов 3-0-(P-D-глюкопиранозилуроновая кислота)-а-Ь-рамкозы и 3-0-(а-Е-рамнопиранозил)-р-О-глюкопирануроновой кислоты и сополимерных искусственных антигенов на их основе // Биоорган, химия 1988,15, 1394-1410.

9. A. Ya. Chernyak, L. О. Kononov, N. К. Kochetkov / Synthesis of carbohydrate-amino acid conjugates related to capsular antigen K54 from Escherichia coli 06:K54:H10 and artificial antigens therefrom // Carbohydr. Res. 1991,216, 381-398. ИЦ: 13.

10. A. Ya. Chernyak, G. V. M. Sharma, L. O. Kononov, P. Radha Krishna, A. V. Rama Rao, N. K. Kochetkov / Synthesis of glycuronamides of amino acids, constituents of microbial polysaccharides and their conversion into neoglycoconjugates of copolymer type // Glycoconjugate J. 1991, 8, 82-89. ИЦ: 18.

11. A. Ya. Chernyak, L. O. Kononov, P. Radha Krishna, N. K. Kochetkov, A. V. Rama Rao / Synthesis of lysine-containing fragments of Proteus mirabilis 027 O-specific polysaccharide and neoglycoconjugates therefrom II Carbohydr. Res. 1992,225, 279-289. ИИ: 12.

12. A. Ya. Chernyak, G. V. M. Sharma, L. O. Kononov, P. Radha Krishna, A. B. Levinsky, N. K. Kochetkov, A. V. Rama Rao / 2-Azidoethyl glycosides: glycosides potentially useful for the preparation of neoglycoconjugates // Carbohydr. Res. 1992,223, 303-309. ИЦ: 81.

13. A. Ya. Chernyak, L. O. Kononov, N. K. Kochetkov / Glycopolymers from synthetic fragments (amides of a-D-galacturonic acid with amino acids) of Proteus O-antigens // J. Carbohydr. Chem. 1994,13, 383-396. ИЦ: 10.

Приведены индексы цитирования (ИЦ) статей с ИЦ >10 по данным Интернет-ресурса Web of Knowledge (http://wokinfo.com), если не указано иначе.

14. J. Radziejewska-Lebrecht, A. S. Shashkov, E. V. Vinogradov, H. Grosskurth, B. Bartodziejska, A. Rozalski, W. Kaca, L. O. Kononov, A. Y. Chernyak, H. Mayer, Y. A. Knirel, N. K. Kochetkov / Structure and epitope characterisation of the O-specific polysaccharide of Proteus mirabilis 028 containing amides of D-galacturonic acid with L-serine and L-lysine // Eur. J. Biochem. 1995, 230, 705-712. ИЦ: 28.

15. Z. Sidorczyk, A. Swierzko, Y. A. Knirel, E. V. Vinogradov, A. Y.Chernyak, L. 0. Kononov, M. Cedzynski, A. Rozalski, W. Kaca, A. S. Shashkov, N. K. Kochetkov / Structure and epitope specificity of the O-specific polysaccharide of Proteus penneri strain 12 (ATCC 33519) containing the amide of D-galacturonic acid with L-threonine // Eur. J. Biochem. 1995, 230, 713-721. ИЦ: 39.

16. M. Wilstermann, L. 0. Kononov, U. Nilsson, A. K. Ray, G. Magnusson / Synthesis of ganglioside lactams corresponding to GMi-, Gm2-, GM3-, and GM4-gangIioside lactones // J. Am. Chem. Soc. 1995,117,4742-4754. ИЦ: 44.

17. B. Bartodziejska, J. Radziejewska-Lebrecht, M. Lipinska, Y. A. Knirel, L. 0. Kononov, A. Y. Chernyak, H. Mayer, A. Rozalski / Structural and immunochemical studies on the lipopolysaccharide of the 'T-antigen'-containing mutant Proteus mirabilis R14/1959 // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1996,13,113-121. ИП: 13.

18. L. O. Kononov, Y. Ito, T. Ogawa / Synthesis of a polymer-supported sialic acid glycosyl donor // Tetrahedron Lett. 1997, 38, 1599-1602. ИЦ: 25.

19. L. O. Kononov, G. Magnusson / Synthesis of methyl and allyl a-glycosides of Л-acetylneuraminic acid in the absence of added promoter // Acta Chem. Scand. 1998, 52, 141144. ИЦ: 13.'

20. А. В. Орлова, А. И. Зинин, H. H. Малышева, Л. О. Кононов, И. Б. Сиваев, В. И. Брегадзе / Конъюгаты полиэдрических соединений бора с углеводами. Сообщение 1. Новый подход к дизайну селективных агентов для бор-нейтронозахватной терапии рака // Изв. АН, сер. хим. 2003, 2617-2620.

21. А. М. Шпирт, JI. О. Кононов, В. И. Торгов, В. Н. Шибаев / Превращение гликозилхлорида Л'-ацетилнейраминовой кислоты в гликозилдибензилфосфат: О-гликозилирование в отсутствие промотора // Изв. АН, Сер. хим. 2004, 684-686.

22. L. О. Kononov, А. V. Orlova, A. I. Zinin, В. G. Kimel, I. В. Sivaev, V. I. Bregadze / Conjugates of polyhedral boron compounds with carbohydrates. 2. Unexpected easy closo- to nido- transformation of a carborane-carbohydrate conjugate in neutral aqueous solution // J. Organometal. Chem. 2005,690,2769-2774. ИЦ: 18.

23. A. M. Шпирт, JI. О. Кононов, В. И. Торгов, В. Н. Шибаев / Селективное образование а-гликозилфосфата из гликозилхлорида iV-ацетилнсйраминовой кислоты // Изв. АН, сер. хим. 2005,470-472.

24. А. В. Орлова, Н. Н. Кондаков, А. И. Зинин, Б. Г. Кимель, JI. О. Кононов, И. Б. Сиваев, В. И. Брегадзе / Конъюгаты полиэдрических соединений бора с углеводами. Сообщение 3. Первый пример синтеза конъюгата додекаборат-аниона с дисахаридом - лактозой - в качестве потенциального агента для бор-нейтронозахватной терапии рака // Изв. АН, сер. хим.2005,1311-1312.

25. А. V. Orlova, L. О. Kononov, В. G. Kimel, I. В. Sivaev, V. I. Bregadze / Conjugates of polyhedral boron compounds with carbohydrates. 4. Hydrolytic stability of carborane-lactose conjugates depends on the structure of spacer between carborane cage and sugar moiety // Appl. Organometal. Chem. 2006, 20,416-420. ИЦ: 16.

26. А. В. Орлова, H. H. Кондаков, А. И. Зинин, Б. Г. Кимель, JI. О. Кононов, И. Б. Сиваев, В. И. Брегадзе / Унифицированный подход к синтезу конъюгатов полиэдрических

По данным Интсрнст-ресурса Scopus (http://www.scopus.com).

-45-

соединений бора с углеводами - потенциальных агентов бор-нейтронозахватной терапии рака // Биоорган, химия 2006, 32, 632-642. ИЦ: 16.

27. N. Yu. Kul¡kova, A. M. Shpirt, L. 0. Kononov / A facile synthesis of JV-acetylneuramimc acid glycal // Synthesis 2006,4113-4114.

28. Л. О. Кононов, H. H. Малышева, Е. Г. Кононова, О. Г. Гаркуша / Первый пример синергизма в реакциях гликозилирования. Возможные причины и следствия // Изв. АН,

сер. хим. 2006, 1263-1265.

29. L. О. Kononov, N. N. Malysheva, Е. G. Kononova, А. V. Orlova / Intermolecular hydrogen' bonding pattern of a glycosyl donor: the key to understanding the outcome of sialylation // Eur.

J. Org. Chem. 2008, 3251-3255.

30. L. O. Kononov, N. N. Malysheva, A. V. Orlova / Stereoselectivity of glycosylation may change during the course of the reaction: highly «-stereoselective sialylation achieved using supramer approach // Eur. J. Org. Chem. 2009, 611-616.

31. A. V. Orlova, A. M. Shpirt, N. Y. Kulikova, L. O. Kononov / AyV-Diacetylsialyl chloride - a novel readily'accessible sialyl donor in reactions with neutral and charged nucleophiles in the absence of a promoter // Carbohydr. Res. 2010, 345,721-730.

32. A. M. Shpirt, L. O. Kononov, S. D. Maltsev, V. N. Shibaev / Chemical synthesis of polyprenyl sialyl'phosphate, a probable biosynthetic intermediate of bacterial polysialic acid // Carbohydr.

Res. 2011,346,2849-2854.

33. L. O. Kononov, N. N. Malysheva, A. V. Orlova, A. I. Zinin, T. V. Laptinskaya, E. G. Kononova, N. G. Kolotyrkina / Concentration dependence of glycosylation outcome: a clue to reproducibility and understanding the reasons behind // Eur. J. Org. Chem. 2012,1926-1934.

Тезисы докладов на научных конференциях

34. L. О. Kononov, G. Magnusson / Easy sialylation without promoter. Rapid and highly stereoselective reaction between acetochloroneuraminic acid and alcohols // International Conference on Biology and Chemistry of Sialic Acids, Moscow, October 2-7, 1994. Book of Abstracts, p. 71 // устный доклад.

35 A. V. Orlova, L. O. Kononov, I. B. Sivaev, V. I. Bregadze / New approach to the preparation of carbohydrate-carborane conjugates as potential BNCT agents // The Carbohydrate Workshop 2003, Guestrow, Germany, March 27-30,2003. Book of Abstracts, P19 // стендовый доклад.

36. A. M. Shpirt, L. O. Kononov, V. N. Shibaev / New synthesis of sialic acid glycosyl phosphate // The Carbohydrate Workshop 2003, Guestrow, Germany, March 27-30, 2003. Book of Abstracts, P20 // стендовый доклад.

37. A. M. Shpirt, L. O. Kononov, V. N. Shibaev /New synthesis of sialic acid glycosyl phosphate // XII European Carbohydrate Symposium (Eurocarb XII), Grenoble, France, July 6-11, 2003. Book of Abstracts, P343 // стендовый доклад.

38. А. В. Орлова, Л. О. Кононов, И. Б. Сиваев, В. И. Брегадзе / Новый подход к получению углевод-карборановых кон югатов в качестве потенциальных агентов для БНЗТ // XVII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии, Казань, 21-26 сентября 2003. Сборник тезисов, т. 4, с. 284 // стендовый доклад.

39. А. М. Шпирт, Л. О. Кононов, В. Н. Шибаев / Новый синтез гликозилфосфата сиаловой кислоты // XVII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии, Казань, 21-26 сентября 2003. Сборник тезисов, т. 2, с. 436 // стендовый доклад.

40. N. Yu. Kulikova, A. M. Shpirt, L. О. Kononov / A facile synthesis of JV-acetylneuraminic acid glycal II The Carbohydrate Workshop 2004, Borstel, Germany, March 17-20, 2004. Book of Abstracts // устный доклад.

41. А. М. Shpirt, L. О. Kononov, V. I. Torgov, V. N. Shibaev / Stereoselective synthesis of key intermediated of biosynthesis of bacterial polysialic acid // 22nd International Carbohydrate Symposium, Glasgow, UK, July 23-27, 2004. Abstract P484 // стендовый доклад.

42. A. M. Шпнрт, Л. О. Кононов, В. И. Торгов, В. Н. Шибаев / Стереонаправленный синтез ключевых интермедиатов биосинтеза бактериальных полинейраминовых кислот // III Всероссийская школа-копференгрш «Химия и биохимия углеводов», Саратов, 9-11 сентября 2004. Тезисы докладов, с. 61 // устный доклад.

43. А. V. Orlova, N. N. Kondakov, L. О. Kononov, A. I. Zinin, S. L. Sedinkin, N. N. Malysheva, L. M. Likhosherstov, O. S. Novikova, V. N. Shibaev, I. B. Sivaev, V. I. Bregadze / A universal approach to the preparation of conjugates of polyhedral boron hydrides with carbohydrate ligands of tumor-specific lectins as potential BNCT agents // 3rd European Meeting on Boron Chemistry (Euroboron 3), Pruhonice-near-Prague, Czech Republic, September 12-16, 2004. Abstract 043 // устный доклад.

44. N. N. Kondakov, A. V. Orlova, L. O. Kononov, A. I. Zinin, N. N. Malysheva, S. L. Sedinkin, I. B. Sivaev, V. I. Bregadze / Straightforward preparation of carbohydrate derivatives of closo-dodecaborate anion as potential BNCT agents // 3rd European Meeting on Boron Chemistry (Euroboron 3), Pruhonice-near-Prague, Czech Republic, September 12-16, 2004. Abstract P36 // стендовый доклад.

45. A. V. Orlova, N. N. Kondakov, L. O. Kononov, A. I. Zinin, N. N. Malysheva, B. G. Kimel, I. B. Sivaev, V. I. Bregadze / A universal approach to the synthesis of oligosaccharide-polyhedral boron hydride conjugates for lectin-mediated targeting // XVIII International Symposium on Glycoconjugates (GLYCO XVIII), Firenze, Italy, September 4-9, 2005. Abstract P059 // Glycoconjugate J. 2005,22,255 // стендовый доклад.

46. A. M. Shpirt, L. O. Kononov, V. I. Torgov, V. N. Shibaev / Chemical synthesis of sialic acid polyprenyl phosphate, a probable biosynthetic intermediate of bacterial polysialic acid // XVIII International Symposium on Glycoconjugates (GLYCO XVIII), Firenze, Italy, September 4-9, 2005. Abstract P064 // Glycoconjugate J. 2005,22, 257-258 // стендовый доклад.

47. L. О. Kononov, N. N. Malysheva, E. G. Kononova / Synergism in Sialylation: Reasons and Consequences // Fifth International Conference «Sialoglycoscience 2006», August 27-30,2006, Mishima, Japan, IL-3-4 // Trends Glycosci. Glycotechnol. 2006, IS, Supplement, S17 // приглашеный доклад.

48. L. О. Kononov, N. N. Malysheva, E. G. Kononova / Intermolecular hydrogen bonding pattern in solutions of sialic acid derivatives dramatically influences their properties // 2nd Baltic Meeting on Microbial Carbohydrates, October 4-8, 2006, Rostock, Germany, Abstract Book, p. 13 // устный доклад.

49. A. M. Shpirt, L. O. Kononov, V. I. Torgov, V. N. Shibaev / Total synthesis of sialic acid polyprenyl phosphate, a probable biosynthetic intermediate of bacterial polysialic acid // 2nd Baltic Meeting on Microbial Carbohydrates 2006, Rostock, Germany, October 4-8, 2006. Book of Abstracts, p. 9 // устный доклад.

50. A. V. Orlova, N. Yu. Kulikova, A. M. Shpirt, L. O. Kononov, V. I. Torgov / A novel glycosyl donor - N,jV-diacetylneuraminic acid glycosyl chloride // 2nd Baltic Meeting on Microbial Carbohydrates, Rostock, Germany, October 4-8, 2006. Book of Abstracts, p. 10 // устный доклад.

51. L. О. Kononov, N. N. Malysheva, E. G. Kononova, A. V. Orlova / Synergism in sialylation: evidence of the importance of intermolecular hydrogen bonding pattern of glycosyl donor // XIV European Carbohydrate Symposium (Eurocarb 14), Lübeck, Germany, September 2-7, 2007. Book of Abstracts, OP-030 // устный доклад.

52. A. M. Shpirt, A. V. Orlova, N. Yu. Kulikova, L. O. Kononov, V. I. Torgov, V. N. Shibaev / AyV-Diacetyl-neuraminic acid glycosyl chloride - a novel glycosyl donor // XIV European

-47-

Carbohydrate Symposium (Eurocarb 14), Lübeck, Germany, September 2-7, 2007. Book of Abstracts, OP-031 // устный доклад.

53. A. M. Шпирт, А. В. Орлова, H. Ю. Куликова, Л. О. Кононов, В. И. Торгов, В. Н. Шибаев / Гликозилхлорид Л',Лг-диацетилнейраминовой кислоты - новый сиалил-донор // XVIII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии, Москва, 23-28 сентября 2007. Тезисы докладов, 2007, т. 4, с. 611 // стендовый доклад.

54. L. О. Kononov, N. N. Malysheva, Е. G. Kononova, А. V. Orlova ! Supramolecular hydrogen bond mediated aggregation of glycosyl donor: a key to understanding the outcome of sialylation // International Conference on Biology and Chemistry of Sialic Acids (Sialoglyco-2008), Moscow-St. Petersburg, July 21-26,2008. Book of Abstracts, p. 29 // приглашенный доклад.

55. L. О. Kononov / A Novel Concept of Supramer-Mediated Reactivity of Carbohydrates // XXIV International Carbohydrate Symposium, Oslo, Norway, July 27-August 1, 2008. Book of Abstracts, A-P134 // стендовый доклад.

56. L. О. Kononov / What can carbohydrate chemistry gain from the existence of supramers? // 3rd Baltic Meeting on Microbial Carbohydrates, Sigtuna, Sweden, August 1-4, 2008. Book of Abstracts // устный доклад.

57. L. О. Kononov, N. N. Malysheva, A. V. Orlova / Stereoselectivity of glycosylation may change during the course of the reaction: highly a-stereoselective sialylation achieved using supramer approach // 15th European Carbohydrate Symposium (Eurocarb 15), Vienna, Austria, July 1924,2009. Book of Abstracts, p. 154, ОС 106 // устный доклад.

58. JI. О. Кононов / Новая концепция супрамер-опосредованной реакционной способности // Всероссийская конференция по органической химии, посвященная 75-летию со дня основания Института органической химии им. Н. Д. Зелинского РАН, Москва, Россия, 2530 октября 2009. Тезисы докладов, с. 227 // стендовый доклад.

59. L. О. Kononov, N. N. Malysheva, А. V. Orlova, A. I. Zinin / Highly stereoselective a-(2-3)-sialylation achieved by changing concentration of reagents // International Conference on Biology and Chemistry of Sialic Acids (Sialoglyco 2010), Potsdam, Germany, August 21-26, 2010, Abstract B-l 1 // стендовый доклад.

60. A. V. Orlova, L. O. Kononov, N. N. Malysheva, A. I. Zinin, Т. V. Laptinskaya / Carbohydrate-carbohydrate interactions detected in the mixture of sialyl donor and acceptor using optical rotation and dynamic light scattering // International Conference on Biology and Chemistry of Sialic Acids (Sialoglyco 2010), Potsdam, Germany, August 21-26, 2010, Abstract B-18 // стендовый доклад с устным выступлением.

61. L. О. Kononov, А. V. Orlova, N. N. Malysheva, Т. V. Laptinskaya / What useful information can a carbohydrate chemist gain from using optical rotation? // 4th Baltic Meeting on Microbial Carbohydrates, Hyytiälä Forestry Field Station, Finland, September 19-22, 2010. Book of Abstracts, p. 64, Poster 13// стендовый доклад.

62. L. О. Kononov, N. N. Malysheva, A. V. Orlova, A. I. Zinin, Т. V. Laptinskaya, N. G. Kolotyrkina / Concentration dependence of glycosylation outcome: a clue for reproducibility// 16th European Carbohydrate Symposium (Eurocarb 16), Sorrento, Italy, July 3-7, 2011. EBook of Abstracts, p.106, OL 47 // устный доклад.

63. JI. О. Кононов / Межмолекулярные взаимодействия между компонентами реакционной смеси при гликозилировании: значимость для теории и практики химии углеводов // IV Всеросийская школа-конференция «Химия и биохимия углеводов», Саратов, 14-16 сентября 2011. Тезисы докладов, с. 24 // устный доклад.

64. Л. О. Кононов / Межмолекулярные взаимодействия в растворах углеводов: значимость для теории и практики // I Всероссийская конференция «Фундаментальная гликобиология», Казань, 20-24 июня 2012. Тезисы докладов, с. 35 // пленарный доклад.

Подписано в печать: 30.08.2013

Заказ № 8699 Тираж - 200 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ОРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. Н.Д. ЗЕЛИНСКОГО РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

05201351525 на правах рукописи

КОНОНОВ Леонид Олегович

СИНТЕЗ НЕОГЛИКОКОНЪЮГАТОВ РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ 02.00.03 — Органическая химия

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора химических наук

Москва — 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ОГЛАВЛЕНИЕ..........................................................................................................................2

ВВЕДЕНИЕ...............................................................................................................................7

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ И ЦЕЛЬ РАБОТЫ.......................................................7

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.......................................................................................................9

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ................................................................................11

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ И ПУБЛИКАЦИИ..................................................................12

ЛИЧНЫЙ ВКЛАД АВТОРА...........................................................................................13

ВЫПОЛНЕНИЕ РАБОТЫ...............................................................................................13

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ И ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ'.................................14

Глава 1. Общие принципы химического синтеза неогликоконъюгатов.....................14

1.1. Основные типы неогликоконъюгатов................................................................15

1.2. Выбор носителя зависит от задачи....................................................................18

1.2.1. Неогликополимеры в широком смысле слова.........................................18

1.2.1.1. Неогликопротеины............................................................................18

1.2.1.2. Синтетические неогликополимеры..................................................20

1.2.1.3. Гликокластеры и гликодендримеры................................................22

1.2.1.4. Гликочастицы и гликонаночастицы.................................................24

1.2.1.5. Гликоповерхности.............................................................................24

1.2.1.6. Гликочипы..........................................................................................25

1.2.2. Неогликолипиды и гликолипосомы..........................................................28

1.2.3. «Меченые» НГК..........................................................................................29

1.2.4. Гликолекарства...........................................................................................30

1.3. Выбор места присоединения носителя к олигосахариду.................................31

1.4. Выбор типа будущей связи с носителем...........................................................31

1.5. Синтез олигосахаридов с функционализованным агликоном........................33

1.5.1. Выбор типа межсахаридной связи в олигосахаридной части НГК и для присоединения олигосахарида к агликону-спейсеру.............................................33

1.5.2. Выбор агликона-спейсера..........................................................................35

1.5.3. Стратегия спейсеризации...........................................................................36

1.5.3.1. Выбор момента спейсеризации сахара............................................37

1.5.3.1.1. Спейсер вводится с самого начала синтеза НГК...................37

1.5.3.1.2. Спейсер вводится после сборки олигосахарида....................40

1.5.3.2. «Универсальные» агликоны позволяют избежать выбора момента спейсеризации сахара..........................................................................................41

1.5.3.3. Аллилгликозиды как предшественники гликозидов с азидо- или аминогруппой в терминальном положении агликона......................................43

1.5.3.3.1. Озонолиз аллилгликозида - восстановление до спирта, далее в азид...............................................................................................................43

1.5.3.3.2. Превращение аллилгликозидов в (2-аминоэтил)гликозиды через имины и оксим.....................................................................................45

1.5.3.3.3. Азидофенилселенилирование аллиллактозида, далее в амин .........................................................................................................................47

1.5.4. Выбор набора защитных групп.................................................................48

1.5.5. Синтез моносахаридных (частично защищенных) блоков.....................50

1.5.6. Сборка олигосахарида................................................................................50

1.6. Присоединение олигосахарида к носителю.........................:............................50

1.7. Примеры синтеза НГК.........................................................................................51

Глава 2. Синтез конъюгатов полиэдрических соединений бора с углеводами..........52

2.1. Введение в БНЗТ..................................................................................................52

2.2. Унифицированный подход к синтезу конъюгатов лактозы с полиэдрическими соединениями бора с углеводами...................................................53

2.3. Деборирование конъюгатов клозокарборана с лактозой................................58

Глава 3. Синтез НГК на основе фрагментов бактериальных полисахаридов,

включающих амиды уроновых кислот с аминокислотами...............................................62

3.1. Введение...............................................................................................................62

3.2.Выбор способа получения гликополимера........................................................63

3.3. Синтез мономеров для сополимеризации.........................................................64

3.3.1. (2-Азидоэтил)гликозиды - гликозиды с удобным агликоном-преспейсером.............................................................................................................65

3.3.2. Синтез (2-азидоэтил)гликозидов уроновых кислот с незащищенной карбоксильной группой............................................................................................69

3.3.3. Синтез (2-азидоэтил)гликозидов дисахаридов, содержащих остаток глюкуроновой кислоты.............................................................................................70

3.3.3.1. Получение селективно защищенных производных уроновых кислот путем лактонизации-алкоголиза...........................................................71

3.3.3.2. Гликозилирование селективно-защищенных производных глюкуроновой кислоты.......................................................................................75

3.3.4. Амидирование уроновых кислот аминокислотами.................................76

3.3.5. Синтез (2-акриламидоэтил)гликозидов N-гликуроноиламинокислот-

ных производных.......................................................................................................78

3.4. Превращение мономеров в НГК сополимерного типа.....................................80

Глава 4. Синтез НГК на основе неприродного аналога гликановой цепи ганглиозида gm3 - лактама Омз-сиалоолигосахарида.............................................................................82

4.1. Введение...............................................................................................................82

4.2. Синтез лактамного аналога Омз-лактона..........................................................83

4.3. Синтез лактамов конъюгата Омз-трисахарида с BSA и Gm3-

гликозилцерамида............................................................................................................86

Глава 5. Синтез НГК гликолипидного типа - сиалил(полипренил)-фосфата............90

5.1. Введение и ретросинтетический анализ............................................................90

5.2. Реакции сиалилхлоридов с нуклеофилами........................................................94

5.2.1. Реакции N-ацетилсиалилхлорида со свободной карбоксильной группой со спиртами................................................................................................................94

5.2.2. Сиалилхлорид с двумя ацетильными группами при атоме азота. Сравнение с N-моноацетильным производным в реакциях с нуклеофилами.....96

5.2.2.1. Получение ранее неизвестного гликозилхлорида НЫ-диацетилнейраминовой кислоты...............................................................96

5.2.2.2. Реакции N-ацетил- и 1\!,М-диацетилсиалилхлоридов со спиртами ...............................................................................................................................96

5.2.2.3. Реакции N-ацетил- и 1Ч,Т\'-диацетилсиалилхлоридов с заряженными нуклеофилами............................................................................100

5.2.2.3.1. Введение..................................................................................100

5.2.2.3.2. Реакции с S- и N-нуклеофилами............................................100

5.2.2.3.3. Реакции с фосфатными нуклеофилами................................101

5.2.3. К вопросу о механизме гликозирования сиалилхлоридами и аномеризации полученных продуктов..................................................................106

5.3. Синтез сиалил(полипренил)фосфата...............................................................109

5.3.1. Синтез защищенного сиалил(полипренил)фосфата из сиалилхлоридов ...................................................................................................................................109

5.3.2. Синтез защищенного сиалил(полипренил)фосфата из сиалилфосфата ...................................................................................................................................112

5.3.3. Удаление защитных групп и синтез сиалил(полипренил)фосфата.....113

5.4. Заключение.........................................................................................................114

Глава 6. Синтез и использование сиалил-донора на полимерном носителе.............116

6.1. Введение.............................................................................................................116

6.2. Дизайн полимерного сиалил-донора...............................................................117

6.3. Синтез гликаля TV-ацетилнейраминовой кислоты..........................................118

6.3.1. Введение. Известные подходы к получению гликалей сиаловых кислот ...................................................................................................................................118

6.3.2. Синтез гликаля N-ацетилнейраминовой кислоты из сиалилхлорида и Na2HP04....................................................................................................................119

6.4. Синтез полимерного сиалил-донора................................................................119

6.5. Использование полимерного сиалил-донора в гликозилировании..............121

Глава 7. Развитие подходов к стереоселективному синтезу сиалоолигосахаридов для

получения сиалонеогликоконъюгатов..............................................................................124

7.1. Введение.............................................................................................................124

7.1.1. Биологическая значимость сиало-олигосахаридов...............................124

7.1.2. Проблемная реакция сиалилирования....................................................124

7.1.3. Ограничения известных подходов..........................................................126

7.2. Модулирование результата гликозилирования: «супрамерный» подход ....126

7.2.1. Основные положения «супрамерного» подхода....................................126

7.2.2. Синергизм при гликозилировании..........................................................129

7.2.3. Влияние добавок «нереагирующих» веществ на результат гликозилирования....................................................................................................134

7.2.3.1. Данные ИК-спектроскопии свидетельствуют об изменениях структуры водородно-связанных супрамеров................................................136

7.2.3.2. Выход дисахарида в MeCN.............................................................136

7.2.3.3. Обращение стереоселективности в дихлорметане.......................140

7.2.4. Влияние времени реакции на стереоселективность в MeCN...............141

7.2.4.1. Продукт реакции модулирует структуру супрамеров гликозил-донора.................................................................................................................142

7.2.4.2. Дополнительные преимущества использования добавок............148

7.2.4.3. Объединение действия времени и добавок - оптимизация сиалилирования.................................................................................................152

7.2.5. Влияние концентрации на результат гликозилирования......................153

7.2.5.1. Перестройка супрамеров, вызванная изменением концентрации

.............................................................................................................................153

7.2.5.2. «Супрамерный» подход к оптимизации гликозилирования

155

7.2.5.3. Открытие смешанных супрамеров.................................................158

7.2.5.4. Результат реакции гликозилирования при различных концентрациях: две области концентраций....................................................159

7.2.5.5. Следствия для практики и теории гликозилирования..................161

7.3. Значимость «супрамерного» подхода..............................................................164

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.....................................................................................................................168

ВЫВОДЫ..............................................................................................................................170

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ....................................................................................172

Материалы и методы......................................................................................................172

Методики.........................................................................................................................177

Эксперимент к главе 2..............................................................................................177

Эксперимент к главе 3..............................................................................................186

Эксперимент к главе 4..............................................................................................210

Эксперимент к главе 5..............................................................................................223

Эксперимент к главе 6..............................................................................................244

Эксперимент к главе 7..............................................................................................254

Таблицы с характеристиками веществ.........................................................................260

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ..................................................................................................266

БЛАГОДАРНОСТИ..............................................................................................................270

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ АВТОРА ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.................................272

Основные результаты данной работы изложены в следующих публикациях:........272

Главы в книгах..........................................................................................................272

Статьи в сборниках...................................................................................................272

Обзор..........................................................................................................................272

Экспериментальные статьи......................................................................................273

Тезисы докладов на научных конференциях.........................................................275

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................................280

ВВЕДЕНИЕ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ И ЦЕЛЬ РАБОТЫ*

Гликоконъюгаты (ГК)1'2'3'4'5'6'7'8 - это соединения, в которых углеводные фрагменты связаны с молекулами других классов (например, белками в гликопротеинах или липидами в гликолипидах).9'10'11'12'13'14'15'16 Так, гликопротеиныи9,20,2.,22,23,24,25_ эт0 сложные белки, в которых белковая (пептидная) часть молекулы ковалентно соединена с одной или несколькими группами олигосахаридов. В последнее время установлено, что большинство белков несет углеводные цепи (гликозилировано),9'14'15'16'26'27'28'29'30'31'32 более того, в ряде случаев массовая доля углеводной компоненты может достигать 90%,18 а негликозилированные формы соответствующих полипептидов часто не проявляют биологической активности, присущей нативному белку.

1-т , 33 34 35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52

Гликолипиды ' ......... • ...... . _ СЛожные липиды, образующиеся в

результате соединения липидов с углеводами. У гликолипидов имеются полярные «головы» (углевод) и неполярные «хвосты» (остатки жирных кислот). Благодаря данному свойству гликолипиды, вместе с фосфолипидами, входят в состав клеточных мембран.

ГК широко распространены в природе и являются важнейшими биомолекулами, определяющими протекание многих иммунологических, нейробиологических, онкологических и других биологических процессов.5'9'10'11'12'13'14'15'16'53'54

Эти процессы основаны на молекулярном распознавании углеводных структур, расположенных на поверхности клеток и кодирующих информацию,55'56'57'58'59'60'61 которая во многом определяет характер межклеточного

взаимодействия,62'63'64'65'66'67'68'69'70'71,72'73'74,75'76'77'78'79,80'81'82 адгезии48'83'84'85'86'87 и

83 84 88

пролиферации ' ' клеток. Явления молекулярного узнавания чрезвычайно важны во многих клинически значимых областях биологии.86'89'90'91'92'93'94'95'96'97'98'99'100 Групповые вещества крови являются классическим примером углевод-белкового узнавания.101'102'103'104'105 Было также убедительно продемонстрировано, что ряд углеводных структур может выступать в качестве опухоль-ассоциированных антигенов43'46'106 и рецепторов, определяющих связывание бактерий и вирусов с клетками организма-хозяина.95'107'108'109 Многие клетки млекопитающих несут на своей поверхности белки, способные специфически узнавать углеводные структуры, например, галактозный рецептор на гепатоцитах110 и маннозный рецептор на макрофагах.111 Распознавание

углеводов белками клеточной поверхности играет ключевую роль в первичных этапах оплодотворения1 13,п4,115,116,117,118, п9,120,ш,.22 и метастазирования

опухолей,'»3,46,106,123,124,125,126,127,128,129,130 & также иррает важную ^ для мобилизации

лейкоцитов в очаги воспаления.128'131'132'133'134'135 Важность углеводов определяет необходимость получения индивидуальных структурно охарактеризованных соединений для использования в биологических исследованиях.

Вследствие малой доступности природных ГК, а также внутренне присущих им ограничений, таких как гетерогенность^ и отсутствие дополнительных функциональных групп для модификации, их применение для изучения взаимосвязей структура-свойство является проблематичным. В связи с этим уже на самых ранних этапах изучения биологической специфичности ГК возникла потребность получения неогликоконъюгатов (НГК) - их синтетических или полусинтетических аналогов, которые тем или иным образом имитируют поведение природных ГК и обладают преимуществами в плане возможности получения индивидуальных и, следовательно, в большей степени структурно-охарактеризованных продуктов по сравнению с природными ГК. В настоящее время НГК востребованы в качестве инструментов исследования практически во всех разделах гликобиологии9'14'15'136,137'138'139'140'141,142'143 для изучения биосинтеза и функционирования углеводных молекул в природных процессах. После определенной доработки НГК могут быть в ряде случаев превращены в фармацевтические препараты, средства диагностики или вакцины; важным направлением является разработка средств направленной углевод-опосредованной доставки* лекарств, антигенов или генного

материала (для генной терапии) к определенным клеткам-мишеням, тканям или

144,145,146,147,148,149,150,151,152,153,154,155,156,157,158,159,160,161,162,163,164,165,166,167,168,169,170,171,172,173,

Ор1апаМ,

174,175,176,177,178,179,180,181,182,183,184,185,186,187,188,189,190,191,192,193,194,195,196,197,198,199,200,201,202,203,204,205,206, 207,208

Одной из наиболее актуальных задач современной химии углеводов является разработка эффективных методов синтеза НГК различных типов. Ее решение подразумевает умение присоединять любые сахариды к любому типу носителя,5 тем самым преодолевая ограничения природных ГК. Как уже упоминалось выше, природные ГК имеют ограниченное применение в биологических исследованиях вследствие их