Дизайн, синтез и свойства лактозосодержащих неогликолипидов как компонентов адресных систем доставки биологически активных соединений тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ
|
Гурьева, Людмила Юрьевна
АВТОР
|
||||
|
кандидата химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
|
Москва
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
|
2010
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
02.00.10
КОД ВАК РФ
|
||
|
|
||||
004616505
На правах рукописи
ГУРЬЕВА ЛЮДМИЛА ЮРЬЕВНА
Дизайн, синтез и свойства лакгозосодержащих неогликолнпидов как компонентов адресных систем доставки биологически активных соединений
02.00.10 - Биоорганическая химия
Автореферат
диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук
Москва 2010
-9 ЛЕК 2010
004616505
Работа выполнена на кафедре химии и технологии биологически активных соединений им. Н.Л. Преображенского Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова
доктор химических наук, профессор Себякин Юрий Львович
доктор химических наук, профессор Ямсков Игорь Александрович
доктор химических наук, профессор Степанов Александр Евгеньевич
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
1С ¿с
Защита диссертации состоится 20 декабря 2010 г. в_ч на заседании Диссертационного совета
Д 212.120.01 при Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова по адресу 119571, Москва, пр. Вернадского, 86.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова по адресу 119571, Москва, пр. Вернадского, 86. С авторефератом можно ознакомиться на сайте www.mitht.ru
/5
Автореферат разослан'_ноября 2010 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук
старший научный сотрудник
Научный руководитель
Официальные оппоненты:
Ведущая организация:
А.И. Лютик 2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Разработка транспортных систем, обладающих рядом определенных физико-химических и биологических свойств, для направленной доставки биологически активных соединений (БАС) остается одной из актуальных проблем современной медицины. В качестве агентов для транспорта применяются различные типы носителей -мицеллы, липосомы, полимерные частицы и др. Инкапсулирование в них лекарственных препаратов позволяет значительно уменьшить их токсичность, увеличить время дейсгвия, защитить от ферментативных и иммунологических реакций человеческого организма. Подобные системы могут быть функционализированы маркерами, такими как антитела, короткие пептиды, фолиевая кислота, углеводы, селективно распознаваемыми рецепторами на поверхности клеггок-мишеней.
Известно, что клетки печени, а также некоторые виды опухолей отличаются повышенным уровнем экспрессии белков, обладающих способностью связываться с высокой степенью аффинности с терминальными остатками D-галактозы в составе различных конъюгатов и комплексов. К числу таких специфичных белков относятся асиалогликопротеиновые рецепторы и галектины. Модификация средств доставки БАС олигосахаридами и их производными, содержащими концевые галактозильные фрагменты, способствует приданию им адресных свойств и позволяет создавать на их основе перспективные средства диагностики и лечения различных заболеваний.
В данной связи, синтез новых гликолипидов, полярная область которых представлена лактозой, а гидрофобный домен сформирован остатками высших жирных спиртов, кислот, аминов, а также липоаминокислотами, связанными спейсером различной структуры и длины, и использование их для конструирования липосомальных транспортных систем направленного дейсгвия представляется актуальным направлением биоорганичсской и медицинской химии.
Настоящая работа является частью научных исследований, проводимых на кафедре химии и технологии биологически активных соединений им. H.A. Преображенского МИТХТ им. М.В. Ломоносова в рамках госбюджетной темы № 1Б-4-355 «Разработка химических и биотехнологических методов модификации биологически активных соединений с целью моделирования жизненно важных процессов в природе и создание новых лекарственных препаратов». Работа выполнена при финансовой поддержке российского фонда фундаментальных исследований (грант № 08-04-01150) и АВЦП «Развитие научного потенциала высшей школы» 2.1.1/2889.
Цель работы заключалась в разработке новых подходов к конструированию компонентов углеводсодержащих липосом, представленных алифатическими производными лактозы с различными по длине и строению спейсерными участками, связывающими адресный маркер с гидрофобным фрагментом; изучении физико-химических свойств липидных
3
композиций, содержащих синтезированные соединения; исследовании специфичности взаимодействия модифицированных везикул с галактозосвязывающим лектином RCA/.
Научная новизна работы. В работе предложены новые и оптимизированы ранее описанные методы получения лактозосодержащих амфифилов, различающихся природой агликона.
Разработана новая схема синтеза гликолипоаминокислот с использованием реакции 1,3-диполярного циклоприсоединения, заключающейся во взаимодействии азидокомпоненты в составе производного лактозы с алкином на основе диэфира Z-глутаминовой кислоты. Отработаны условия проведения данного процесса с целью сокращения времени реакции и получения целевых продуктов с высоким выходом. Изучена возможность ее применения для функционапизации соответствующими углеводными фрагментами поверхности липосом.
Исследована зависимость эффективности связывания модифицированных везикул с гапактозоспецифичным лектином клещевины Ricinus communis (RCAi) от процентного содержания неогликолипидов в липидной композиции и длины спейсера. В ряду полученных соединений выделены структуры, характеризующиеся высокой специфичностью к данному белку.
Практическая значимость работы. Осуществлен синтез ряда новых алифатических производных лактозы в качестве компонентов липосомальных транспортных систем направленного действия. Предложенные подходы позволяют получать неогликолипиды в препаративных количествах, достаточных для последующего проведения развернутых биологических исследований по разработке новых средств доставки БАС. Определенная в ходе исследований совокупность свойств позволяет рассматривать лактозосодержащие амфифилы в качестве перспективных компонентов адресных липосом для решения прикладных задач биоорганической химии.
Положения, выносимые на защиту.
1. Разработка новых подходов к сшпезу лактозосодержащих амфифилов, включающих насыщенные алифатические спирты, кислоты, амины, диэфир ¿-глутаминовой кислоты и содержащих фрагменты янтарной кислоты, ди-, три- и полиэтиленгликолей в качестве спейсера.
2. Изучение физико-химических свойств многокомпонентных липидных дисперсий, содержащих синтезированные соединения.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи и 10 тезисов докладов на российских и международных конференциях и конгрессах.
Апробация работы. Результаты диссертации были частично доложены на XVIII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Москва, 2007); XII и XIII
4
Международных научно-технических конференциях «Наукоёмкие химические технологии» (Волгоград, 2008 и Суздаль, 2010); Молодежной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии - 2009» (Москва, 2009), Международных конгрессах «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2007,2009).
Структура и объём диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы. Работа изложена на /ОО страницах, содержит V/ рисунков и ~> таблиц. Список литературы включает НО источников.
РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ II ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В настоящее время наиболее изученными наноразмерными системами для переноса лекарственных препаратов являются лииосомы. Однако широкому их применению в экспериментах in vivo препятствует ряд иедостагков, один из которых - неселективная доставка БАС к пораженным органам и тканям. Для решения этой проблемы используется модификация поверхности липосом различными маркерами специфичного связывания с соответствующим типом рецепторов клеток, например, углеводными фрагментами, входящими в состав сложных композиций. Выделяется группа галактозоспецифичных мембранных белков: асиалогликопротеиновые рецепторы и галектины, в высокой степени экспрессированные на поверхности клеток печени, а также опухолевых тканей. Структурная модификация липосомальных систем доставки галактозосодержащими компонентами способствует приданию им адресных свойств и позволяет создавать на их основе перспективные средства диагностики и лечения различных заболеваний, в том числе гепатитов, а также рака печени и других органов.
В данной работе предложена схема получения и осуществлен синтез компонентов транспортных систем направленного действия, представленных алифатическими производными лактозы с различными по длине и строению спейсерными участками, соединяющими маркер с гидрофобным фрагментом; изучены физико-химические свойства многокомпонентных липидных дисперсий; исследована специфичность взаимодействия везикул, модифицированных углеводами, с галактозосвязывающим лектином RCA¡.
Стратегия синтеза неогликолипидов включала в себя следующие этапы: функционализацию углеводной компоненты, конструирование соответствующего гидрофобного блока, выбор способа их связывания и структуры спейсера, дистанцирующего углеводный маркер от алифатической составляющей.
❖ Согласно литературным данным, для получения различных неогликоконъюгатов используются активированные углеводные производные, содержащие галогены, амино- и карбоксильные группы, по которым могут проводиться реакции присоединения гидрофобного блока.
В последнее время все большее внимание исследователей привлекают оксиаминовые производные углеводов, которые отличаются высокой реакционной способностью и, кроме того, уникальная О-Ы связь при аномерном центре нашла применение в создании новейших противоопухолевых препаратов.
Для синтеза оксиаминов в литературе описан метод, заключающийся в обработке галогенпроизводных углеводов №гидроксисукцинимидом с последующей реакцией с гидразингидратом. Выход промежуточных ЛЧжсисукцинимидных эфиров при этом не превышает 40%, а время реакции достигает 6 часов.
В нашей работе предложен новый подход к получению подобных соединений, основанный на взаимодействии перацетатов Сахаров с УУ-гидроксисукцинимидом в условиях кислотного катализа эфиратом трехфторисгого бора (схема 1), позволяющий повысить выход целевого продукта (2) до 60% и сократить общее время реакции до 1.5 ч.
Схема 1
Отработаны условия проведения данного процесса. Наилучший результат был получен при соотношении реагентов октаацетат лактозы - Л^-гидроксисукцинимид - кислота Льюиса, 1-1.1-1.1. Больший избыток гидроксилсодержащего компонента (отношение 1-1.5-1.1), а также кислоты Льюиса (отношение 1-1.1-1.5) не отражались ни на скорости реакции, ни на выходе Лг-оксисукцинимидного эфира (2). Оптимальное время реакции, позволяющее получить аномерно чистый продует по данным тонкослойной хроматографии (ТСХ), составило 1.5 часа.
Выдержка реакционной смеси в течение 24 ч сопровождалась частичной деструкцией и появлением на ГСХпримеси а-аномера соединения (2).
Структура Л'-оксисукцшшмиднош эфира (2) и соединения (3), полученного после обработки (2) гидразингидратом, была подтверждена данными 'Н-ЯМР-, ИК-спектроскопии и масс-спектрометрии. В 'Н-ЯМР-спектре соединения (2) присутствовали сигналы протонов ацетильных групп, а также М-оксисукцинимидного кольца Сигнал аномерного протона представлен в виде дублета с химическим сдвигом 4.50 м.д. и КССВ .11,2=7.9 Гц, что свидетельствует о ^-конфигурации целевого продукта Удельный угол оптического вращения составил [а]о -23' (с 1.0, СНСЬ).
В 'Н-ЯМР-спектре соединения (3) отсутствовали сигналы протонов ацетильных групп, а в ИК-спектре наблюдали полосы поглощения гидроксильной и аминогруппы, С-0 связей углеводного скелета. В масс-спектре лакгозида (3) присутствовал пик молекулярного иона.
Для получения другого углеводного производного (5), содержащего терминальную азидогруипу, являющегося компонентом реакции 1,3-диполярного циклоприсоединения алкинов к азидам, использовали вышеописанный подход (схема 1). Октаацетат лактозы последовательно обрабатывали бромэтанолом в присутствии кислоты Льюиса, а затем азидом натрия в безводном ДМФА (схема 2). Выход соединений (4) и (5) составил 61% и 91%, соответственно.
Схема 2
Структура азидоэтиллактозида (5) была подтверждена данными ИК-, 'Н-ЯМР- и двумерной гомоядерной корреляционной ('Н/Н-COSY) спектроскопии. В 'Н-ЯМР-спсктре соединения (5) присутствовали сигналы протонов ацетильных групп, этильного фрагмента и углеводного скелета. Сигнал аномерного протона представлен дублетом с химическим сдвигом 4.57 м.д. (J12 8.3 Гц). В ИК-спектрс наблюдали полосы поглощения азидной группы, сложноэфирных группировок, С-О связей углеводного скелета.
❖ Из литературных данных известно о влиянии отдельных структурных элементов синтетических амфифилов на эффективность доставки БАС в экспериментах in vitro и in vivo. Было показано, что наибольшей активностью обладают соединения, в состав которых входят один или два алифатических фрагмента, содержащих от 8 до 18 атомов углерода.
Нами осуществлен синтез ряда одноцепочечных и двухцепоченых лактозосодержащих гликолипидов с длиной алкильной цепи 14 и 18 углеродных атомов.
В качестве базы сравнения для структур с одним углеводородным заместителем использовали соединение (6), содержащее в гидрофобной области тетрадецильный остаток, а для изучения активности амфифилов с двумя заместителями - соединение (12) на основе диэфира ¿-глутаминовой кислоты.
¿-Глутаминовая кислота была выбрана из следующих соображений: во-первых, данная аминокислота является природным соединением и способна легко метаболизироваться в организме; во-вторых, она имеет три реакционных центра, позволяющих создавать различные производные на ее основе. Две карбоксильные группы могут использоваться для получения длинноцепочечных диэфиров, а аминогруппа - для присоединения спейсера. Кроме того, липоаминокислоты на основе 1-глутаминовой кислоты способны самостоятельно формировать в воде упорядоченные структуры мицеллярного и везикулярного типа.
Синтез гликолипида (12) осуществляли следующим образом: ¿-глутаминовую кислоту этерифицировали тетрадециловым спиртом в присутствии и-толуолсульфокислоты с последующей обработкой образующегося тозилата (9) 5%-ным раствором гидрокарбоната натрия. Соединение со свободной карбоксильной группой (11) для последующего связывания с углеводной составляющей получали реакцией основания (10) с ангидридом янтарной кислоты с выходом 91% (схема 3).
Схема 3
О
СН2СОН I
сн2 с14н„он
Н^СНСОН (8)
(7) О
л-ТзОН
" - ♦ I -
ЪО Нз^НСОС14Нв
О (9), 72%
О
ii
СН2СОС14Н25
о о сн2
носюн^ашснсоснни (И), 91% о
СН2СОС„Н„
СН2 5% N31100
5% КзНСО
Н2\СНСОСи11г, о (10), 96%
Структура соединения (11) была подтверждена данными 'П-ЯМР- и ИК-спеетроскопии. В 'Н-ЯМР-спектре присутствовали сигналы протонов алифатических цепей, фрагмента аминокислоты, а также сигналы остатка янтарной кислоты в виде мультиплетов с химическими сдвигами 2.38-2.48 м.д. (СН2СООН) и 2.70-2.77 м.д. (СН2СОШ). В ИК-спсктре производного (11) наблюдали полосы поглощения свободной карбоксильной и сложпоэфирных группировок, а также I и II амидные полосы.
Синтез целевого соединения (12) осуществляли взаимодействием соответствующих компонент (3) и (11) в ДМФА в присутствии Л',Л'"-дициклогснсилкарбодиимида (йСС) и 4-диметиламипопиридина фМАР) с выходом 51% (схема 4).
В ИК-спектре соединения (12) присутствовали полосы поглощения гидроксильных групп, сложпоэфирных группировок, а также I и II амидные полосы. В масс-спектре наблюдали сигнал молекулярного иона.
В экспериментах m vivo для ингибирования процесса связывания везикул с белками крови (опсопииами) и последующего захвата клетками иммунной системы человека их модифицируют различными производными полиэтиленгликоля (ПЭГ). За счет образования водородных связей между молекулами воды и атомами кислорода простых эфирных связей в структуре полимера на поверхности липосомы формируется гидратированная пленка, которая препятствует адсорбции белков и способствует, тем самым, увеличению времени циркулирования частиц в кровотоке.
Кроме того, ПЭГ и его более короткие (низкомолекулярные) аналоги могут быть использованы для дистанцирования лигандов активного нацеливания (углеводов) от поверхности липосом.
В представленной работе осуществлен синтез ряда гликолипидов (25-30), содержащих остатки ди-, три- и полиэтиленгликолей. Различное число оксиэтиленовых звеньев в структуре углеводных производных важно при определении оптимальной длины связующего участка, играющего определенную роль в контакте адресной компоненты с клеточными рецепторами.
Схема 4
н
о
CIIJCOCj^HJ
о о рь
ONHCfCII^CUNCIICOCuHj, (12), 51% О
Синтез гликолипидов с различной длиной этнленгликолевого спсйсера
рн ^,011
ИОА^--^-^-' н0 оп
рН ^011
НО
он
он
о о
II II
0М[СС1110(СН1СИ101„ ^и^- [чнсину, (26,27,29) 0
£Н;СОСыПм О О СИ,
0,М!Са1г0(СН,СН!0)„оСНгС-М1СНС0СыН!, (26,28,30) о
(25,26): в'2, гроизводные ДЭГ (27,28): 0=3, производные ТЭГ (29,30): п=67-87, производиые ПЭГут
Конструирование гидрофобного блока с одной или двумя углеводородными цепями и этиленгликолевыми фрагментами различной длины осуществляли по схеме 5.
Схема 5
Н0(СН2СН20)„Н (13-15)
о
О О
II и
Н0-ССН20(СН2СН20)„.2СН2С-0Н
(16-18), 89-91%
О
НОгеиЛКХ ГШ2С18Н37 или (10)
Н0-ССН20(СНдС1120)„.2С112С- И (19-24), 54-72%
(13,16,19,20): п=2, производные ДЭГ (14,17,21,22): п=3,производные ГЭГ (15,18,23,24): 0=67-87, производя ые ПЭГи№
(19,21,23): И— -Н1ЧС|ЯНз7
0
р12СОС„Ни
сн2
(20,22,24): -шснсосин29
0
Спирты ди- и триэтиленгликоль (13), (14) окисляли азотной кислотой, а полиэталенгликоль (15) - дихроматом калия в растворе 10% серной кислоты. В каждом случае подбор индивидуальных условий реакций позволил получить дикарбоновые кислоты (16-18) с выходом 89-92%.
После активации карбоксильных групп соединений (16-18) Л'-гидроксисукцинимидом в присутствии ОСС и последующего взаимодействия их с остадециламином и диэфиром ¿-глутаминовой кислоты (10) были синтезированы моноамиды (19-24).
Соответствующие углеводные производные (25-30) получали реакцией соединений (19-24) с аминооксилактозидом (3). Целевые соединения выделяли с помощью колоночной хроматографии с выходами 45-54% (схема б).
Структура гликолипидов (25-30) была подтверждена данными ИК-спектроскопии и масс-спекгрометрии. В ИК-спекграх синтезированных соединений (25), (27), (29) присутствовали полосы поглощения гидроксильных групп, I и II амидные полосы, колебания С-О-С (простых эфирных) связей, С-О-связей углеводного скелета, а у соединений (26), (28), (30) также полосы поглощения сложноэфирных групп. В масс-спектрах наблюдали сигналы молекулярных ионов соединений (25-30).
Р"^-0" .он + но-сстг2о (сн2сн20)„_2сн2ё- я он (3) он (19-24)
он он ьсс БМАР
о о ,0К11ССН20(СН2С1120)„.2СН20 и
(25-30), 45-54%
(19,20,25,26): п=2, цюизеодиые ДЭГ (21,22,27,2»): п=3, производим ТЭГ (23,24,29,30): п-67-87, производные ПЭГмао (19.21.23.25.27.29): 11= -1ЮСМН37 О н ^Н2СОС„Нг, сн2 1 (20.22.24.26.28.30): К— 1ШСНО)СиН29 О
Реакция 1,3-диполярного циклопрнсосдинения для синтеза лактозосодсржащих
неогликолипидов
В последнее время для создания сложных биоконыогатов, аналогов природных соединений, иммобилизации биомолскул на матрицах различной природы и конструирования средств доставки лекарственных препаратов активно используется простая и эффективная стратегия, основанная на СгАкатализируемом азид-алкин 1,3-диполярном циклоприсоединении, относящемся к группе реакций под общим названием «сПск-сЬепшиу».
В нашей работе данную реакцию применяли для получения лактозосодержащего гликолипида (33) с двумя углеводородными цепями в гидрофобной области.
Синтез соединения (31) с терминальной тройной связью проводили действием на производное ¿-глугаминовой кислоты (11) пропаргилового спирта в присутствии т-трет-бутилпирокарбоната и пиридина в качестве основания с выходом 65% (схема 7).
Схема 7
О о
II II
СН2С'ОСи112, сШССН2ОН СН2СОС,4Н29
О О СН2 -»> о о СН2
1юс(сн1)2'снкснс0си1г2, Вос2о'(сжс]сн10с(сн2)2'снкснс0смп2, (И) о (31), 65% о
Алкин (31) конденсировали с азидоэтиллактозидом (5) при соотношении исходных реагентов алкин-азид, 1.5-1, с образованием промежуточного конъюгата (32) (схема В). Известно, что данная реакция может проводиться в различных растворителях, включая воду, и является чувствительной к присутствию основания. В нашем случае наилучший выход
производного (32) (87%) был достигнут при использовании тетрагидрофурана и шестикратного избытка Л^АЧдикзопропилэтиламина (DIPEA). В качестве катализатора применяли 10 мол. % иодида меди (I). Реакцию проводили в атмосфере аргона для предотвращения процесса окисления Cul.
Схема 8
о
ОАс/0Ас ОАс сн2сос„н2,
+ I сн; фн.одснзьашснсос^н» ОАс (5) ОАс (31) о
0
ОХу0At ОАс Cnl/DIPEA/THF ÇH2COCMH2,
осн2снд ^ ссн2о цслу/лсчсн сос„н2,
ОАс С ОАс \'= N (32), 87'/. О
он/ОН он I сн2сос14н„
Ц-^Я пЛг^-Я ^ я Я ^
осн2сн2м са120с(снг)2с1шст1с0с|)нг»
он ОН N (33), 20% О
В большинстве случаев для процесса циклоприсоединения не требуются высокие температуры, но нагревание в интервале 25-40°С позволило увеличить нам скорость реакции в 2 раза, и сократить время процесса с 6-и до 3-х ч.
Структура соединения (32) была подтверждена данными 'Н-ЯМР-, ИК-спектроскопии и масс-спектрометрии. В 'Н-ЯМР-спектре наблюдали сигналы протонов ацетильных групп, фрагментов глугаминовой и янтарной кислот, а также протона триазольного гетероцикла в виде синглета в области 7.95 м.д. Сигнал аномерного протона представлен дублетом с химическим сдвигом 4.39 м.д. (/1,2 7.7 Гц). В ИК-спекгре конъюгата (32) присутствовали полосы поглощения сложноэфирных групп, I и II амидные полосы, колебания С-Ы-связи, С=С-связи и Ы=Ы-связи триазольного кольца, С-О связей углеводного скелет В масс-спектре наблюдали сигналы молекулярного иона (32).
Дальнейшая обработка соединения (32) гидразингидратом в метаноле при комнатной температуре приводила к образованию гликолипида (33) с выходом 20%, что обусловлено частичным разрушением сложноэфирных связей в гидрофобной области молекулы.
С целью повышения выхода конечного гликоконъюгата реакцию циклоприсоединения проводили на незащищенном углеводном производном (34) (схема 9), что позволило получить целевой продукт (33) с выходом 65%, но время процесса при этом увеличилось до 4 дней.
CIljON СИ
он /он он
CH2COCuHM
¿он Г-1 , I-L " " ^
(34), 92%
он
(31)
CuI/DIPEA/THF о
он он CH;COC,jlIz,
ОН ОН
.СИ.
о о сн
Н II I
ОСН2СН1\ " CCHjOCiCHJjCHNCHCOC^Hj, N= N (33), 65% о
Структура амфифила (33) была подтверждена данными ИК-спектроскопии и масс-спектрометрии. В ИК-спектре наблюдали полосы поглощения гидроксильных, сложноэфирных групп, I и II амидные полосы, колебания С-Ы-связи, четыре полосы валентных колебаний С-0 связей углеводного скелета. В масс-спектре присутствовали сигналы молекулярного иона (33).
По литературным данным, по реакции 1,3-диполярного циклоприсоединения можно не только получать различные биоконъюгаты и конструировать средства доставки лекарственных препаратов, но и модифицировать поверхность наноразмерных частиц на основе металлов, бактериальных клеток, вирусов.
В нашей работе была качественно изучена возможность проведения данного процесса на поверхности липосом с целью придания им адресной функции посредством конъюгации с углеводными остатками (схема 10). .
Схема 10
кснс—О + Ш
10% 90%
»сзс
)—Соединение (35): кс=с—Q — Соединение (31); - Соединен не (34) i
Для этого везикулы, полученные на основе структурообразующего орнитинового производного дигексадецилового эфира ¿-глутаминовой кислоты (35) и содержащие в качестве компоненты алкин (31), обрабатывали азидоэтиллактозидом (34) в водной среде в присутствии Cul и D1PEA.
о
си2с«г1£н3, о сн2 HjN(CII,).,CIK'- NCHCOC16H33 N11, Н О (35)
Смесь выдерживали 4 часа, после чего агрегаты разрушат этанолом и анализировали продукты реакции методом ТСХ. Наблюдали исчезновение исходного лактозида (34) и появление нового соединения, соответствующего гликолипиду (33), использованного нами в качестве контроля. Кроме того, образование целевого амфифила подтверждали данными масс-спектрометрии, в которых присутствовал пик молекулярного иона (33).
Такая возможность применения реакции позволяет значительно уменьшить количество стадий химического синтеза, широко варьировать конденсируемые компоненты по составу и структуре, а также увеличить внутренний (рабочий) объем липосомы для инкапсулирования в нее лекарственных препаратов.
Исследование свойств смешанных липидных дисперсий, содержащих гликолипиды (<>), (Щ (25-30), (33)
Изучены физико-химические свойства липосом, сформированных фосфатидилхолином или липодипептидом (35), модифицированных синтезированными соединениями (6), (12), (25-30), (33) при соотношении неогликоконъюгат-липид, 5%-95%. Исследованы такие параметры, как критическая концентрация везикулообразования (ККВ), температура фазового перехода (Тф.„,) в бислое, размер образующихся везикул, которые определяют выбор дизайна и оптимальной композиции для конструирования систем доставки БАС с целью проведения последующих экспериментов in vitro.
❖ Критическая концентрация везикулообразования определялась с использованием спектрофотометрического метода по точке перегиба на графике зависимости оптической плотности от концентрации амфифилов в воде. Типичный вид такой зависимости представлен на рис. 1.
Рис. 1. Зависимость оптической плотности от логарифма концентрации в воде для дисперсии, содержащей смесь соединений (35) и (12), при температуре 18-20°С.
Показано, что ККВ для модифицированных неогликолипидами липосом находится в диапазоне 7-15Х10"4 моль/л.
❖ Известно, что агрегаты с диаметром менее 200 нм наиболее легко проникают в клетку. Доступным и удобным методом для изучения относительного распределения частиц по размерам является фотонно-коррелляционная спектроскопия, основанная на измерении рассеяния света шарообразными частицами. Исследования проводились на анализаторе размера частиц серии LS™ 13 320 (Beckman Coulter, USA).
Средний размер липидкых дисперсий, содержащих полученные соединения, после обработки ультразвуком составляет 150 нм.
Рис. 2. Распределение размера частиц по интенсивности рассеяния для смеси соединений (35) и (12).
Diarreter (rm)
❖ Дчя изучения процесса фазового перехода в бислое обычно применяются дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК), ИК-спектроскопия с Фурье-преобразованием (РТЩ, 'Н-ЯМР-спекгроскопия и флуоресцентные метки. В нашей работе был предложен иной подход, основанный на связывании молекулами соответствующего амфифила красителя эозина, существующего в растворе в мономерной или димерной формах, и изучении зависимости интенсивности оптического поглощения димер/мономер от температуры.
DS26/D490
Рис. 3. Зависимость отношения интенсивностей поглощения при 526 и 490 нм от температуры для смеси водных дисперсий соединений (35) и (12) с эозином.
Представленный метод определения Тф.„. характеризуется простотой и незначительными затратами вещества (2 мг/мл) по сравнению с FTIR (50 мг/мл). При этом наблюдается хорошая сходимость результатов, что свидетельствует о его перспективное™.
Полученные в ходе эксперимента данные демонстрируют, что введение в состав липосом на основе липодипептида (35), имеющего Тф.„. 40°С, гликолипидов с тетрадецильными заместителями сопровождается снижением Тф,„, до 36°С, а структур с октадецильными фрагментами - повышением Тф.„. до 42°С. Подобная закономерность наблюдается и в отношении модифицированных синтезированными амфифилами фосфатидилхолиновых липосом, имеющих Тф„ в чистом виде 38°С. Данное свойство может быть полезно при конструировании термочувствительных транспортных систем.
❖ С использованием спектрофотометрического метода была изучена стабильность новых углеводсодержащих липидных дисперсий во времени. Показано, что смешанные везикулы на основе фосфатидилхолина остаются устойчивыми в течение двух суток, а липосомы на основе липодипептида (35) - на протяжении недели.
Таким образом, проведенное изучение физико-химических свойств липосом, сформированных на основе как фосфатидилхолина, так и липодипептида (35) и содержащих синтезированные соединения (б), (12), (25-30), (33), позволяет придавать им заданные свойства путем варьирования их качественного и количественного состава.
Взаимодействие глнкозилированных везикул с лектинами*
Для изучения возможности использования синтезированных соединений как маркерных молекул в составе липосом было исследовано взаимодействие модифицированных везикул с галактозосвязывающим лектином клещевины Ricinus communis (RCAj). Известно, что гликопротеины с концевыми галактозильными остатками, дающими положительную реакцию преципитации с лектином RCA/, обладают также сродством и к другим галактозоспецифичным лектинам, в частности к асиалогликопротеиновым рецепторам гепатоцитов. В связи с этим, логично предположить, что гликозилированные липосомы, преципитирующие в присутствии RCAi, будут также характеризоваться повышенной аффинностью к гепагоцитам.
В данной работе объектами исследования были выбраны соединения (26), (28) и (30), различающиеся длиной этиленгликолевого спейсера. В качестве базы сравнения использовались соединение (12), в котором лактоза связана с диэфиром ¿-глутаминовой кислоты через остаток янтарной кислоты, и соединение (33), полученное реакцией 1,3-диполярного циклоприсоединения.
* Автор выражает благодарность д.х.н., проф. Книрелю Ю.А. (ИОХ PAII) за организацию работ по изучению специфичности связывания синтезированных объектов с лектином клещевины RCA,
.он
9Н,СЯС14Н„ (г6): п„г,1Гои„одш,гДЭГ, О СН2 {28): п=3,праиподпое ТЭГ
.О^а^О^СНгС-ГШСНСОСцНг, <30): Т,проитоднос ПЭГШ,
(26,28,20) О
О
СНгСОСиН„ О О О сн2
.ОМЩСН,),С1ШС11СОСиНи он (12) О
СН,СОСнНИ СИ
он ОН он
са1гос(сн!)!сшснсос14н„ (33)
Ожидалось, что при взаимодействии с лектином ПСА/ наивысшую степень связывания будут проявлять везикулы, модифицированные соединением (30) с максимально длинным полиэтиленгликолевым спейсером. Однако наибольшую эффективность показали липосомы, содержащие гликолипид (28) с триэтиленгликолевым фрагментом. Возможно, длинные цепи полимера экранируют часть экспонированных углеводных групп в производном (30), препятствуя их контакту с белком. Увеличение доли гликолипида в липидной смеси с 5% до 10% значительно повышает эффективность преципитации со специфичным рецептором
Рис. 4. Зависимость процесса преципитации от длины спейсера в соединениях (12), (26), (28), (30),
т
Для других соединений подобная картина не наблюдалась (рис. 5), и оптимальное содержание синтезированных веществ в композиции составило 5%.
Полученные данные свидетельствуют о наличии углеводной специфичности лектана НС АI к терминальной галактозе полученных систем. При этом важным фактором является удаленность галактозильного фрагмента от поверхности липосомы.
Рис. 5. Взаимодействие липосом, модифицированных соединением (28), с лектином КС А/
Кроме того, в данной работе проведена предварительная оценка инкапсулирующих свойств липосом на основе липодипептида (35), содержащих 10% углеводного производного ПЭГ (30).
В качестве модельного вещества для встраивания выбран препарат доксорубицин, широко применяемый для лечения опухолевых заболеваний. Степень его загрузки в липосомы составила 90%. Средний размер везикул, определенный фотонно-коррелляционной спектроскопией, не превышал 130 нм. Липосомы данного состава, согласно результатам, полученным методом спектрофотометрии, оказались стабильны на протяжении недели.
Таким образом, показана возможность использования полученных соединений для создания нацеленных липосомальных систем доставки лекарственных веществ.
Выводы:
1. Разработаны схемы получения неогликолипидов и осуществлен синтез алифатических производных лактозы, различающихся длиной и типом спейсерной группы, а также длиной и количеством углеводородных цепей.
2. Предложена новая схема синтеза гликолипоамшюкислот с использованием реакции 1,3-диполярного циклоприсоединения, заключающейся во взаимодействии азидокомпоненты в составе производного лактозы с алкином на основе диэфира Ь-глугаминовой кислоты.
3. Изучены физико-химические свойства липосом, модифицированных синтезированными соединениями, такие как критическая концентрация везикулообразования, температура фазового перехода, размер частиц. Установлены особенности изменения температуры фазового перехода в зависимости от числа и длины углеводородных цепей в структуре встраиваемых амфифилов.
4. Исследована зависимость степени связывания сформированных везикул с галактозоспецифичным лектином клещевины ПСА/ от процентного содержания неогликолипидов в липидной композиции и длины спейсера в их структуре. Показано, что наибольшей эффективностью обладают липосомы, содержащие 5% соединения с
триэтиленгликолевым спейсером или 10% производного с полиэтиленгликолем.
18
Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:
1. Гурьева Л.Ю., Северьянова А.А., Себякин Ю.Л. Активные производные £)-галактозы и D-лактозы в синтезе неогликоконъюгатов /I Вестник МИТХТ.—2006.—Т. 1 № 4.—С. 33-38.
2. Буданова У.А., Себякин Ю.Л., Гурьева Л.Ю., «Структурно-функциональное разнообразие искусственных мембран на основе катионных липопептидов» // Биологические мембраны.—.2007.—'Т. 24 № 3,—С. 273-279.
3. Гурьева Л.Ю., Буданова У.А., Себякин Ю.Л. «Исследования в области синтеза неогликолипидов на основе D-лактозы» // Журнал органической химии.—2009.—Т. 45 № 2.— С. 186-190.
4. Гурьева Л.Ю., Большебородова А.К., Себякин Ю.Л. Синтез углеводсодержащих компонентов липидных транспортных систем направленного действия методом «click-chemistry» // Вестник МИТХТ,—2009.—'Г. 4 №6.—С. 61-66.
5. Буданова У.А., Гурьева Л.Ю., Северьянова А. А., Цариковская М.В., Себякин Ю.Л. Модифицированные амфифилы и неогликоконъюгаты широкого спектра действия на основе D-галактзы и D-пакют И Московская международная конференция «Биотехнология и медицина».—2006.—Москва.—С. 85-86.
6. Гурьева Л.Ю., Северьянова А.А., Цариковская М.В., Себякин Ю.Л. Направленный синтез углеводсодержащих амфифилов // Международная конференция по органической химии «Органическая химия от Бутлерова и Бельштейна до современности».—2006.—Санкт-Петербург.—С. 426.
7. Гурьева Л.Ю., Буданова У.А., Себякин Ю.Л. Синтез новых углеводсодержащих липидов на основе D-лактозы.// 18-й Менделеевский съезд по общей и прикладной химии.— 2007,—Москва.—'Т. 4,—С. 527.
8. Гурьева Л.Ю., Северьянова А.А., Себякин Ю.Л. Технологии получения и свойства модифицированных гликолипидов.// XII Международная научно-техническая конференция «Наукоемкие химические технологии - 2008».—2008.—Волгоград.—С. 127.
9. Гурьева Л.Ю., Большебородова А.К., Себякин Ю.Л. Создание средств направленного транспорта БАВ на основе модифицированных гликолипидов с использованием реакции 1,3-диполярного циклоприсоединсния // Пятый московский международный конгресс Биотехнология: состояние и перспективы развития.—2009.—Москва.—С. 136.
10. Большебородова А.К., Гурьева Л.Ю., Себякин Ю.Л. Структурная модификация липосомальных транспортных систем углеводсодержащими компонентами // IX Ежегодной международной молодежной конференции «Биохимическая физика» ИБХФ РАН-ВУЗы.— 2009,—Москва,—С. 32-34.
11. Гурьева Л.Ю., Себякин Ю.Л. Разработка технологии получения углеводсодержащих адресных систем доставки на основе производных полиэтилеигликоля // XIII Международная научно-техническая конференция «Наукоемкие химические технологии».—2010.—Суздаль.—С. 183.
12. Большебородова А.К., Гурьева Л.Ю., Себякин Ю.Л. Области применения реакции 1,3-ДИПолярного циклоприсосдинения и транспортные системы для доставки биологически активных соединений // XIII Международная научно-техническая конференция «Наукоемкие химические технологии».—2010.—Суздаль.—С. 201.
13. Большебородова А.К., Гурьева Л.Ю., Себякин Ю.Л. Разработка углеводсодержащих липосомальных систем с использованием реакции 1,3-диполярного циклоприсоединения // II Международная конференция российского химического общества им. Д.И. Менделеева «Инновационные химические технологии и биотехнологии материалов и продуктов».—2010.—Москва.—С.208-209.
14. Гурьева Л.Ю., Себякин Ю.Л. Разработка технологии получения углеводсодержащих липосом с различным расположением «адресной» компоненты // II Международная конференция российского химического общества им. Д.И. Менделеева «Инновационные химические технологии и биотехнологии материалов и продуктов».—2010.— Москва,—С.232-233.
Подписано в печать:
19.11.2010
Заказ Л1» 4564 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru
ВВЕДЕНИЕ.
ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.
Неогликоконъюгаты.
Применение неогликоконъюгатов.
Неогликоконъюгаты в гликобиологии. Роль углеводных систем при межклеточных взаимодействиях.
• Биологические миметики.
• Гликонаночастщы для биоамплификации.
Неогликоконъюгаты в биотехнологии.
• Углеводспецифичные рецепторы.
Лектины.
Галектины.
Неогликоконъюгаты как лиганды для направленной доставки биологически активных соединений.
• Биосенсоры.
Углеводные микрочипы.
Углеводсодержащие углеродные нанотрубки.
Флуоресцентные гликополимеры.
• Вакцины на основе неогликоконъюгатов. Противовирусные средства.
• Транспорт лекарственных препаратов и генетического материала.
Неогликолипиды.
Неогликопептиды и неогликопротеины.
Полимерные транспортёры.
Использование неогликоконъюгатов в генной терапии.
Гликонаночастицы в материаловедении.
Реакция 1,3-диполярного циклоприсоединения в синтезе неогликоконъюгатов.
• 1,3-диполярное циклоприсоединение Huisgen.
• Механизм реакции 1,3-диполярного циклоприсоединения.
• Реакция 1,3-диполярного циклоприсоединения для синтеза неогликоконъюгатов.
Получение гликодендримеров.
Получение гликополимеров.
• Применение реакции 1,3-биполярного циклоприсоединения для модификации липосомалъной поверхности.
РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
• Синтез гликолипидов с различной длиной этиленгликолевого спейсера.
• Реакция 1,3-биполярного циклоприсоединения для синтеза лактозосодержащих неогликолипидов.
• Исследование свойств смешанных липидных дисперсий, содержащих гликолипиды 10, 16, 29-34, 37.
• Взаимодействие гликозилированных везикул с лектинами*.
ВЫВОДЫ:.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
1. Fuente J., Penadés S. Glyconanoparticles: Types, synthesis and applications in glycoscience, biomedicine and material science // Biochim Biophys Acta. — 2006. — 1760. — P. 636-651.
2. Goldstein I., Hugues R., Monsigny M., Osawa Т., Sharon N. What should be called a lectin? // Nature. — 1980. — 285. — P. 66.
3. Lindhorst T. Artificial multivalent sugar ligands to understand and manipulate carbohydrate-protein interactions // Top. Curr. Chem. — 2002. — 218. — P. 201-235.
4. Monsigny M., Roche A., Midoux P., Mayer R. Glycoconjugates as carriers for specific delivery of therapeutic drugs and genes // Adv Drug Del Rev. — 1994. —14. — P. 1-24.
5. Ashwell G., Harford J., Harford J. Carbohydrate-specific receptors on the Hver // Rev.Biochem. 1982. — 51. — P. 531-554.
6. Roy R., Tropper F., Morrison Т., Boratynski J. Syntheses and transformations of glycohydrolase substrates into protein conjugates based on Michael additions // J. Chem. Soc., Chem. Commun. — 1991. — P. 536-537.
7. Paz J.L., Ojeda R., Barrientes A.G., Penadés S., Martín-Lomas M. Synthesis of a Ley neoglycoconjugate and Ley-functionalized gold glyconanoparticles // Tetr. Asym. — 2005. — 16.P. 149-158.
8. Rojo J., Diaz V., Fuente J.M, Segura I., Barrientes A.G., Riese H.H., Bernad A., Penades S. Gold glyconanoparticles as new tools in antiadhesive therapy // Chem. Bio. Chem. 2004. — 5(3). — P.291-297.
9. Fuente J., Fandel M., Berry C., Riehle M., Cronin L., Aitchison G., Curtis A. Quantum dots protected with tiopronin: a new fluorescent system for cell-biology studies // Chem. Bio. Chem. — 2005. — 6. — P. 989-991.
10. Sutherland A. Quantum dots as luminescent probes in biological systems // Curr. Opin. Solid State Mater. Sci. — 2002. — 6. — P. 365-370.
11. Robinson A., Fang J., Chou P., Liao K., Chu R., Lee S. Probing lectin and sperm with carbohydrate-modified quantum dots // Chem. Bio. Chem. — 2005. — 6. — P. 1899-1905.
12. Huwiler A., Kolter Т., Pteilschifter J., Sandhoft K. Phisiology and pathophysiology of sphingolipid metabolism and signaling // Biochim. Biophi. Acta. — 2000: —1485. — P. 63-99.
13. Alexander C., Rietschel E. Bacterial lipopolysaccharides and innate immunity // J. Endotoxin Res. — 2001. — 7. — P. 167-202.
14. Tamai R., Asai Y., Hashimoto M., Fukase K., Kusumoto S., Ishida H., Kiso M., Ogawa T. Cell activation by monosaccharide lipid A analogues utilizing Toll-like receptor 4 // Immunology.2003. —110. — P. 66-72.
15. Baldridge J., McGowan P., Evans J., Cluff C., Mossman S., Johnson D., Persing D. Taking a Toll on human disease: Toll-like receptor 4 agonists as vaccine adjuvants and monotherapeutic agents // Expert Opin. Biol Ther. — 2004. — 4. — P. 1129-1138.
16. Jensen K.J., Brask J. Carbohydrates in Peptide and Protein Design // Inc. Biopolymers (Pept Sci). — 2005. — 80. — P. 747-761.
17. Fuente J., Berry C., Tat peptide as an efficient molecule to translocate gold nanoparticles into the cell nucleus // Bioconj. Chem. — 2005. —16. — P. 1176-1180.
18. Marikanos S., Anderson M., Ryan J., Martin L., Feldheim P. Encapsulation, permeability, and cellular uptake characteristics of hollow nanometer-sized conductive polymer capsules // J. Phys. Chem. — 2001. —105. — P. 8872-8876.
19. Liu Y., Mounkes L.C., Liggitt H.D., Brown C.S., Solodin I., Heath T.D., Debs R.J. Factors influencing the efficiency of cationic liposome-mediated intravenous gene delivery // Nat. Biotechnol.1997. —15. — P. 167-173.
20. Rosenthal S., Tomlinson I., Adkins E., Schroeter S., Adams S., Swafford L., McBride J., Wang Y., DeFelice L., Blakely R. Targeting cell surface receptors with ligand-conjugated nanocrystals // J. Am. Chem. Soc. — 2002. —124. — P. 4586-4594.
21. Westenhoff S., Kotou N. Quantum dot on a rope // J. Am. Chem. Soc. — 2002. — 124. — P.2448-2449.
22. Potapova I., Mrak R., Preht S., Zentel R., Basche T., Mews A., Semiconductor nanocrystals with multifunctional polymer ligands // J. Am. Chem. Soc. — 2003. —125. — P. 320-321.
23. Asian К., Zhang J., Lakowicz J., Geddes C. Saccharide sensing using gold and silver nanoparticles—A review II J. Fluoresc. — 2004. —14. — P. 391-400.
24. Chen Y., Chen S., Chien Y., Chang Y., Liao H., Chang C., Jan M., Wang K., Lin C., Carbohydrate-encapsulated gold nanoparticles for rapid target-protein indentification and bindingepitope mapping // Chem. Bio. Chem. — 2005. — 6. — P. 1169-1173.
25. Игнатов В.В. Углеводузнающие белки лектины // Соросовский образовательный журнал. — 1997. — 2. — Р. 14-20.
26. Lehmann F., Tiralongob Е., Tiralongo J. Sialic acid-specific lectins: occurrence, specificity and function // Cell. Mol. Life Sci. 2006. — 63. — P. 1331-1354.
27. Brito-Arias M. Synthesis and Characterization of Glycosides. Springer, US — 2007. — 352 p.
28. Daniel K., Fu-Tong Liu. Regulation of cellular homeostasis by galectins // Glycoconjugate Journal. — 2004. —19. — P. 507-515.
29. Leffler H., Carlsson S., Hedlund M., Qian Y., Poirier F. Introduction to galectins // Glycoconjugate Journal. — 2004. —19. — P. 433^140.
30. Grancelli A., Morros A., Domenech O., Vazquez J., Vinas M., Hernandez-Borrell J. Interaction of 6-fluoroquinolones with dipalmitoylphosphatidylcholine monolayers and liposomes // Langmuir. — 2002. —18. — P. 9177-9182.
31. Niidome Т., Hung L. Gene Therapy Progress and Prospects: Nonviral Vectors // Gene Therapy. — 2002. — 9(24). — P. 1647-1652.
32. Gref R., Domb A., Quellec P., Blunk Т., Muller R. H., Verbavatz J. M., et al. The controlled intravenous delivery of drugs using PEG-coated sterically stabilized nanospheres // Adv. Drug Deliv. Rev. — 1999. —16. — P. 215-233.
33. Owens D. E., Peppas N. A. Opsonization, biodistribution, and pharmacokinetics of polymeric nanoparticles // Int. J. Pharm. — 2006. — 307. — P. 93—102.
34. Hamidi M., Azadi A., Rafiei P. Pharmacokinetic consequences of pegylation I I Drug Deliv. — 2006. —13. — P. 399-409.
35. Immordino M. L., Brusa P., Arpicco S., et al. Preparation, characterization, cytotoxicity and pharmacokinetics of liposomes containing docetaxel // J. Control. Release. — 2003. — 91. — P. 29-417.
36. Gaucheron J., Santaella C., Verlung P. In Vitro Gene Transfer with a novel galactosylated spermine bolaamphiphile // Bioconjugate Chem. — 2001. —12. — P. 569-575.
37. Barthelemy P., Tomao V., Selb J., Chaudier Y., Pucci B. Fluorocarbon Hydrocarbon nonionic surfactants mixtures : A study of their miscibility // Langmuir. — 2002. —18. — P. 25572563.
38. Perrino S., Contino-Pepin A., Jasseron S., Rapp M., Maurizis J., Pucci B. Design, synthesis and preliminary biological evaluations of novel amphiphilic drug carriers // Bioorg Med Chem Lett.2006. —16. — P. Ill 1-1114.
39. Engel A., Chatterjee S.K., Al-Arifi A., Nulin P. Influence of spacer length on the agglutination of glycolipid-incorporated liposomes by ConA as model membrane // J. Pharm. Sci.2003. — 92(11). — P. 2229-2235.
40. Dizhe E., Akifiev B., Missul B., Orlov S., Kidgotko O., Sukonina V. Receptor-mediated transfer of DNA: galactosylated poIy-L-lysine complexes into mammalian cells in vitro and in vivo // Biochemistry. — 2001. — 66. — P. 55-61.
41. Midoux P., Mendes C., Legrand A., Raimond J., Mayer R., Monsigny M. Specific gene transfer mediated by lactosylated poly-L-lysine into hepatoma cells // Nucleic Acids Res. — 1993.21. — P. 871-878.
42. Diebold S., Kursa M., Wagner E., Cotten M., Zenke M. Mannose polyethylenimine conjugates for targeted DNA delivery into dendritic cells // J. Biol. Chem. — 1999. — 274. — P. 19087-19094.
43. Bettinger T., Remy J., Erbacher P. Size reduction of galactosylated PEI/DNA complexes improves lectin-mediated gene transfer into hepatocytes // Bioconjug. Chem. — 1999. — 10. — P. 558-561.
44. Gotoha Y., Niimib S., Hayakawab T., Miyashita T. Preparation of lactose-silk fibroin conjugates and their application as a scaffold for hepatocyte attachment // Biomaterials. — 2004. — 25. — P. 1131-1140.
45. Angenendt P. Progress in protein and antibody microarray technology // Drug. Discov. Today. — 2005. —10. — P. 503-511.
46. Kersten B., Wanker E.E., Hoheisel J.D., Angenendt P. Multiplex approaches in protein microarray technology // Expert. Rev. Proteomics. — 2005. — 2. — P. 499-510.
47. De Paz J.L., Seeberger P.H. Recent advances in carbohydrate microarrays // Osar. Comb. Sc. — 2006. — 25. — P. 1027-1032.
48. Uzawa H., Ito H., Izumi M., Tokuhisa H., Taguchi K., Minoura N. Synthesis of polyanionic glycopolymers for the facile assembly of glycosyl arrays // Tetrahedr. — 2005. — 61. — P. 58955905.
49. Disney M.D., Seeberger P.H. The use of carbohydrate microarrays to study carbohydrate-cell interactions and to detect pathogens // Chem. Biol. — 2004. —11. — P. 1701-1707.
50. Chen J.R., Miao Y.Q., He N.Y., Wu X.H., Li S.J. Nanotechnology "and biosensors // Biotechnology Advances. — 2004. — 22. — P. 505-518.
51. Jeng E.S., Moll A.E., Roy A.C., Gastala J.B., Strano M.S. Detection of DNA hybridization using the near-infrared band-gap fluorescence of single-walled carbon nanotubes // Nano. Letters.2006. — 6. — P. 371-375.
52. Gu L.R., Elkin T., Jiang X.P., Li H.P., Lin Y., Qu L.W., Tzeng TR.J., Joseph R, Sun Y.P. Single-walled carbon nanotubes displaying multivalent ligands for capturing pathogens // Chem. Commun. — 2005. — P. 874-876.
53. Wang H.F., Gu L.R., Lin Y., Lu F.S., Meziani M.J., Luo PG.J., Wang W., Cao L., Sun Y.P. Unique aggregation of anthrax (Bacillus anthracis) spores by sugar-coated single-walled carbon nanotubes II J. Am. Chem. Soc. — 2006. —128. — P. 13364-13365.
54. Disney M.D., Zheng J., Swager T.M., Seeberger P.H. Detection of bacteria with carbohydrate-functionalized fluorescent polymers // J. Am. Chem. Soc. — 2004. — 126. — P. 13343-13346.
55. Baek M.G., Stevens R.C., Charych D.H. Design and synthesis of novel glycopolythiophene assemblies for colorimetric detection of influenza virus and E.coli // Bioconjug. Chem. — 2000. — 11. — P. 777-788.
56. Xue C.H., Jog S.P., Murthy P., Liu H.Y. Synthesis of highly water-soluble fluorescent conjugated glycopoly(p-phenylene)s for lectin and Escherichia coli // Biomacromolec. — 2006. — 7,—P. 2470-2474.
57. Reichert A., Nagy J.O., Spevak W., Charych D. Polydiacetylene liposomes functionalized with sialic acid bind and colorimetrically detect influenza virus // J. Am. Chem. Soc. — 1995. — 117. — P. 829-830.
58. Johannes F.G., Vliegenthart J. Carbohydrate based vaccines // FEBS Letter. — 2006. — 580(12). — P. 2945-2950.
59. Francis Jr.T., Tillett W.S. Cutaneous reactions in pneumonia. The development of antibodies following the intradermal injection of type-specific polysaccharide // J. Exp. Med. — 1999. — 52.P. 573-585.
60. Penades S., de la Fuentel J., Barrientos A., Clavell C., Martinez-Evilal O., Alcantara D. Nanomaterials for Application in Medicine and Biology. Springer. — 2008. — 204p.
61. Soussan E., Mille C., Blanzat M., Bordat P., Rico-Lattes I. Sugar-derived tricatenar catanionic surfactant: synthesis, self-assembly properties, and hydrophilic probe encapsulation by vesicles // Langmiur. — 2008. — 24(6). — P. 2326-2330.
62. Vautrin C., Dubois M., Zemb T., Schmolzer S., Hoffmann H., Gradzielski M. Colloids Surf. Chain melting in swollen catanionic bilayers // Colloids Surf. A Physicochem. Eng. Asp. — 2003.217. — P. 165-170.
63. Zhu J., Yan F., Guo Z., Marchant R.E. Surface modification of liposomes by saccharides: vesicle size and stability of lactosyl liposomes studied by photon correlation spectroscopy // J Colloid Interface Sci. — 2005. — 289. — P. 542-550.
64. Tomita K., Fukuda M., Kawasaki K. Mechanism of arbutin inhibitory effect on melanogenesis and effect on the human skin with cosmetic use // Fragrance J. — 1990. — 6. — P. 72-77.
65. Fiume L., Di Stefano G., Busi C., Mattioli A., Bonino F., Torrani-Cerenzia M. Liver targeting of antiviral nucleoside analogues through the asialoglycoprotein receptor // J. Viral .Hepat. — 1997. — 4. — P. 363-370.
66. Rochea A., Fajacb I., Grosseb S., Frisona N., Rondaninoa C., Mayera R., Monsigny M. Glycofection: facilitated gene transfer by cationic glycopolymers // Cell. Mol. Life Sci. — 2003. — 60. — P. 288-297.
67. Frese J., Wu C., Wu G. Targeting of genes to the liver with glycoprotein carriers // Adv. Drug Delivery Rev. — 1994. —14. — P. 137-152.
68. Leeuwenburgh M., Marel G., Overkleeft H. Olefin metathesis in glycobiology: new routes towards diverse neoglycoconjugates // Cur Opin Chem Bio. — 2003. — 7. — P. 757-765.
69. Dominique R., Liu B., Das S., Roy R. Synthesis of «molecular asterisks» via sequential cross-metathesis, Sonogashira and cyclotrimerization reactions // Synthesis. — 2000. — P: 862-868.
70. Fiume L., Busi C., Preti P., Spinosa G. Conjugate of ara-AMP with lactosaminated serum albumin: a study on their immunogenicity in mouse and rat // Cancer Drug Deliv. — 1987. — 4. — P. 145-150.
71. Huwe C., Woltering T., Jiricek J., Weitz-Schmidt G., Wong C. Design, synthesis and biological evaluation of aryl-substituted sialyl Lewis X mimetics prepared via cross-metathesis of C-fucopeptides // Bioorg. Med. Chem. — 1999. — 7. — P. 773-788.
72. Duncan R. The dawning era of polymer therapeutics //Nut. Rev. Drug. Discov. — 2003.2. — P. 347-360.
73. Peppas N. Hydrogels and drug delivery // Curr. Opin. Colloid. Interface Sci. — 1997. — 2.P. 531-537.
74. Wolthius van Dijk W., Hoogeboom J., Steenbergen van M., Tsang S., Hennink W. Degradation and release behavior of dextran-based hydrogels // Macromolec. — 1997. — 30. — P. 4639-45.
75. Zhou W., Kurth M., Hsieh Y., Krochta J. Synthesis and thermal properties of a novel lactose-containing poly(N- isopropylacrylamide-co-acrylamidolactamine) hydrogel // J. Polym. Sci, Part A: Polym. Chem. — 1999. —37. — P. 1393-402.
76. Shantha K., Harding D. Synthesis, characterisation and evaluation of polyflactose acrylate-N-vinyl-2-pyrrolidinone. hydrogels for drug delivery // Eur Pol J. — 2003. — 39. — P. 63-68.
77. Osaki F., Kanamori T., Sando S., Sera T., Aoyama Y., A quantum dot conjugated sugar ball and its cellular uptake. On the size effects of endocytosis in the subviral region // J. Am. Chem. Soc.2004. —126. — P. 6520-6521.
78. Gaucheron J., Santaella C., Vierling P. In vitro gene transfer with a novel galactosylated spermine bolaamphiphile //Bioconjug. Chem. — 2001. —12. — P. 569-575.
79. Erbacher P., Roche A., Monsigny M., Midoux P. The reduction of the positive charges of polylysine by partial gluconoylation increases the transfection efficiency of DNA/polylysine complexes // Biochim. Biophys. Acta. — 1997. —1324. — P. 27-36.
80. Aoyama Y. Macrocyclic glycoclusters. From amphiphile through nanoparticles to glycoviruses // Chem. Eur. J. — 2004. —10. — P. 588-593.
81. Aoyama Y., Kanamori T., Nakai T., Sasaki T., Horiuchi S., Sando S., Niidome T. Artificial viruses and their application to gene delivery. Sizecontrolled gene coating with glycocluster nanoparticles // J. Am. Chem. Soc. — 2003. —125. — P. 3455-3457.
82. Boutin V., Legrand A., Mayer R., Nachtigal M., Monsigny M., Midoux P. Glycofection: the ubiquitous roles of sugar bound on glycoplexes // Drug Delivery. — 1999. — 6. — P. 45-50.
83. Smedt S., Demeester J., Hennink W. Cationic polymer based gene delivery systems // Pharm. Res. — 2000. — 77. — P. 113-126.
84. Mornet S., Vasseur S., Grasset F., Duguet E., Magnetic nanoparticles design for medical diagnosis and therapy // J. Mater. Chem. — 2004. —14. — P. 2161-2175.
85. Pankhurst Q., Connolly J., Jones S., Dobson J., Applications of magnetic nanoparticles in biomedicine // D. Appl. Phys. — 2003 .—36. — P. 167-181.
86. Tartaj P., Morales M., Veintemillas-Verdaguer S., Gonzalez-Carreno T., Serna C. The preparation of magnetic nanoparticles for applications in biomedicine // J. Phys. D. Appl. Phys. — 2003. — 36. — P. 182-197.
87. Lopez-Cartes C., Rojas T., Litran R., Martinez-Martinez D., Fuente J., Penades S., Fernandez A. Gold nanoparticles with different capping systems: an electronic and structural XAS analysis II J. Phys. Chem. — 2005. —109. — P. 8761-8766.
88. Kolb H. C., Finn M. G., Sharpless K. B. Click chemistry: diverse chemical function from a few good reactions II Angew. Chem. Int. Ed. Engl. — 2001. — 40. — P. 2004-2021.
89. Kolb H. C., Sharpless K. B. The growing impact of click chemistry on drug discovery // DrugDiscov. Today. — 2003. — 8. —P. 1128-1137.
90. Bock V. D., Hiemstra H., Maarseveen J. H.-V. Cul-Catalyzed alkyne-azide "click" cycloadditions from a mechanistic and synthetic perspective II Eur. J. Org. Chem. — 2006. — P. 51-68.
91. Chinchilla R., Najera C. The sonogashira reaction: a booming methodology in synthetic organic chemistry // Chem. Rev. — 2007. —107. — P. 874-922.
92. Home W. S., Stout C. D., Ghadiri M. R. A heterocyclic polymer nanotube //J. Am. Chem. Soc. — 2003. —125. — P. 9372-9376.
93. Malkoch M., Schleicher K., Drockenmuller E., Hawker C.J., Russell T.P., Wu P., Fokin V.V. Structurally diverse dendritic libraries: A highly efficient functionalization approach using Click chemistry II Macromolecul. — 2005. — 38. — P. 3663-3678.
94. Giguere D., Patnam R., Bellefleur M.A., St-Pierre C., Sato S., Roy R. For recent references on the biological activity of 1,2,3-triazoles // Chem. Commun. — 2006. — P. 2379-2381.
95. Hotha S., Kashyap S. "Click chemistry" inspired synthesis of pseudo-oligosaccharides and amino acid glycoconjugates II J. Org. Chem. — 2006. — 71. — P. 364-367.
96. Hassane S. F., Frisch B., Schuber F. Targeted liposomes: convenient coupling of ligands to preformed vesicles using "click chemistry" // Bioconjugate Chem. — 2006. —17. — P. 849-854.
97. Cavalli S., Tipton A. R., Overhand M., Kros A. The chemical modification of liposome surfaces via a copper-mediated 3+2. azide-alkyne cycloaddition monitored by a colorimetric assay // Chem. Commun. — 2006. — P. 3193-3195.
98. Cao S., Tropper D., Roy R. Stereoselective phase transfer catalyzed syntheses of glycosyloxysuccinimides and their transformations into glycoprobes // Tetrahedr. — 2000. — 51.P. 6679-6686.
99. Dahnren J., Freid Т., Magnusson G., Noori G. Synthesys of some divalent O- and S-Glycosides of galabiose and globotriose // Carbohydr. Res. — 1982. — 111. —P. 1-4.
100. Гурьева Л.Ю., Северьянова А.А., Себякин Ю.Л. Активные производные £>-галактозы и /)-лактозы в синтезе неогликоконъюгатов // Вестник МИТХТ. — 2006. — 1 (4). — С. 33-38.
101. Reineke Т.М., Davis М.Е. Carbohydrate Size and Its Distance from Charge Centers Bioconjugate Chemistry // Bioconjugate Chem. — 2003. —14. — P. 247-254.
102. Heyes J., Niculescu-Duvaz D., Cooper R.G., Springer C.J. Synthesis of novel cationic lipids: effect of structural modification on the efficiency of gene transfer // J. Med. Chem. — 2002. — 45.P. 99-114.
103. Hyvonen Z., Ruponen M., Ronkko S., Suhonen P., Urtti A. Extracellular and intracellular factors influencing gene transfection mediated by 1,4-dihydropyridine amphiphiles // Eur. J. Pharm. Sci. — 2002. —15. — P. 449-460.
104. Regelin A.E., Fankhaenel S., Gurtesch L., Prinz C., von Kiedrowski G., Massing U. Biophysical and lipofection studies of DOTAP analogs // Biochim. Biophys. Acta. — 2000. — 1464(1). — P. 151-164.
105. Ren Т., Zhang G., Song Y.K., Liu D. Synthesis and characterization of aromatic ring-based cationic lipids for gene delivery in vitro and in vivo II J. Drug Target. — 1999. — 7. — P. 285-292.
106. Guan L.P., Zhao D.H, Xiu J.H., Sui X., Piao H.R., Quan Z.S. Synthesis and Anticonvulsant Activity of N-(2-Hydroxyethyl) amide Derivatives // Arch. Pharm. Chem. Life Sci. — 2009. — P. 342. 34-40.
107. Себякин Ю.Л., Федякова Н.Л., Рунова E.A. Синтез амфифильных производных Z-серина И Биоорг. хим. — 1994. — 20. — С. 1101-1114.
108. Immordino M. L., Brusa P., Arpicco S., et al. Preparation, characterization, cytotoxicity and pharmacokinetics of liposomes containing docetaxel // J. Control. Release. — 2003. — 91. — P. 29-417.
109. Heyes J., Hall K., Tailor V., Lenz R., MacLachan I. Synthesis and characterization of novel poly(ethylene glycol)-lipid conjugates suitable for use in drug delivery // J. Control. Release. — 2006. —112. — P. 280-290.
110. Svetlakov N.V., Nikitin V.G., Orekhova A.O. Oxidation of Diethylene Glycol with Nitric Acid // Zh. Org. Khim. — 2002. — 38. No. 5. — P. 789.
111. BogatskiA.V., Luk'yanenko N.G., Kirichenko T.I. // Zh. Org. Khim. 1980.16. 1301.
112. Huisgen, R. In «1.3-Dipolar Cycloadditional Chemistry»/ R. Huisgen. NY: Wiley. — 1984. —176 p.
113. Tornoe C.W., Christensen С., Meldal M.Peptidotriazoles on Solid Phase: 1.2.3.-Triazoles by Regiospecific Copper(I)-Catalyzed 1.3-Dipolar Cycloadditions of Terminal Alkynes to Azides H J. Org. Chem. — 2002. — 67. — P. 3057-3062.
114. Гурьева Л.Ю., Буданова У.А., Себякин Ю.Л. Исследования в области синтеза неогликолипидов на основе £)-лактозы // Журнал органической химии.—2009.—Т. 45 № 2.— Р. 186-190.
115. Себякин Ю.Л., Буданова У. А., Гурьева Л.Ю. Структурно функциональное разнообразие искусственных мембран на основе катионных липодипептидов // Биологичсекие мембраны. —2007. —24. № 3. — С. 273—279.
116. Dulaney J.T. Binding interactions of glycoproteins with lectins // Mol. Cell. Biochem. — 1979. — 21. №1. — P. 43-63.
117. Кочетков H.K. Методы химии углеводов // М.: Мир. — 1967. — 428с.
118. Лурье A.A. Хроматографические материалы, М. Химия — 1978. — 122с.
119. Гурьева Л.Ю., Северьянова А.А., Себякин Ю.Л. Активные производные £>-галактозы и D-лактозы в синтезе неогликоконъюгатов // Вестник МИТХТ.—2006.—Т. 1 № 4.—Р. 33-38.
120. Буданова У.А., Себякин ЮЛ., Гурьева Л.Ю. Структурно-функциональное разнообразие искусственных мембран на основе катионных липопептидов // Биологические мембраны,—2007.—'Г. 24 № 3.—Р. 273-279.
121. Гурьева Л.Ю., Буданова У .А., Себякин Ю.Л. Исследования в области синтеза неогликолипидов на основе .D-лактозы // Журнал органической химии.—2009.—Т. 45 № 2.— Р. 186-190.
122. Гурьева Л.Ю., Болыпебородова А.К., Себякин Ю.Л. Синтез углеводсодержащих компонентов липидных транспортных систем направленного действия методом «click-chemistry» // Вестник МИТХТ.—2009.—'Г. 4 №6.—Р. 61-66.
123. Гурьева Л.Ю., Буданова У.А., Себякин Ю.Л. Синтез новых углеводсодержащих липидов на основе D-лактозы.// 18-й Менделеевский съезд по общей и прикладной химии.— 2007.—Москва,—Т. 4,—Р. 527.
124. Гурьева Л.Ю., Северьянова А.А., Себякин Ю.Л. Технологии получения и свойства модифицированных гликолипидов.// XII Международная научно-техническая конференция «Наукоемкие химические технологии 2008».—2008.—Волгоград.—Р. 127.
125. Болыпебородова А.К., Гурьева Л.Ю., Себякин Ю.Л. Структурная модификация липосомальных транспортных систем углеводсодержащими компонентами // IX Ежегодной международной молодежной конференции «Биохимическая физика» ИБХФ РАН-ВУЗы.—2009—Москва,—Р. 32-34.
