Синтез нейтральных неогликолипидов для создания модульных систем доставки нуклеиновых кислот тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

Иванова Екатерина Алексеевна

СИНТЕЗ НЕЙТРАЛЬНЫХ НЕОГЛИКОЛИПИДОВ ДЛЯ СОЗДАНИЯ МОДУЛЬНЫХ СИСТЕМ ДОСТАВКИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

02.00.10 - Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

16 МАЙ ¿013

Москва 2013

005059270

Работа выполнена на кафедре химии и технологии биологически активных соединений им. H.A. Преображенского Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова»

Научный руководитель

Доктор химических наук, профессор Чупин Владимир Викторович

Официальные оппоненты

Доктор химических наук, профессор кафедры органической химии Московского государственного университета тонких химических технологий

имени М.В. Ломоносова Каплун Александр Петрович

Кандидат химических наук, старший научный сотрудник лаборатории химии углеводов Института органической химии

им. Н.Д. Зелинского РАН Кононов Леонид Олегович

Ведущая организация Центр «Биоинженерия» РАН

Защита диссертации состоится «03» июня 2013 г. в 1630 часов в аудитории М-119 на заседании Диссертационного Совета Д 212.120.01 при Московском государственном университете тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, пр. Вернадского, 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, пр. Вернадского, 86.

Автореферат разослан «30» апреля 2013 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат химических наук,

старший научный сотрудник

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из проблем генной терапии является разработка стабильных, безопасных невирусных систем доставки терапевтических нуклеиновых кислот (НК) в клетки-мишени, которые по своей эффективности не уступали бы вирусным векторам. Использование катионных липосом в качестве таких систем является одним из перспективных подходов генной терапии. Положительно заряженные комплексы катионных липосом с НК (липоплексы) способны накапливаться на поверхности клеток и поглощаться ими по механизму эндоцитоза. Однако препятствием для широкого использования катионных липосом стало наличие внеклеточных и внутриклеточных биологических барьеров, которые снижают эффективность доставки НК. Под внеклеточными барьерами подразумевают нестабильность липоплексов в биологических жидкостях и низкую специфичность взаимодействия с клетками-мишенями, под внутриклеточными — необходимость преодоления эндосомальной и ядерной мембран. Выявление биологических барьеров и установление их роли способствовали разработке новых систем доставки НК, которые эволюционировали от простых липидных молекул до высокоорганизованных модульных липидных транспортных систем (МЛТС).

Модульная липидная система доставки НК представляет собой самособирающийся транспортный контейнер, построенный из ковапентно несвязанных друг с другом липофильных модулей, и «запрограммированный» на преодоление биологических барьеров. МЛТС может содержать в своем составе следующие модули: 1) связывающий модуль -катионный амфифил/катионные липосомы - для электростатического взаимодействия с НК и ее защиты от действия нуклеаз; 2) адресный модуль - липоконъюгат с нацеливающим лигандом - для направленного транспорта в клетки-мишени; 3) стабилизирующий модуль -липофильное производное полиэтиленгликоля, снижающее взаимодействие с молекулами-дезактиваторами и увеличивающее время циркуляции систем доставки в организме; 4) модуль с последовательностью ядерной локализации для активного перемещения НК в ядро. Концепция МЛТС предполагает ее быстрое «переключение» на различные типы переносимых НК, различные типы клеток-мишеней и субклеточные компартменты. Поэтому все компоненты МЛТС должны быть легко заменяемыми, способными к саморазборке внутри клетки для эффективного высвобождения НК. Для быстрой замены липидные компоненты таких систем должны быть построены из унифицированных структурных блоков.

Одним из важнейших органов-мишеней, для которых разрабатываются МЛТС, является печень. Генетические нарушения клеток этого органа приводят к таким заболеваниям, как гемофилия, гиперхолестеринемия, рак печени. Известно, что гепатоциты экспрессируют асиалогликопротеиновые рецепторы, распознающие терминальные остатки О-галактозы или УУ-ацетил-О-галактозамина, поэтому направленную доставку терапевтических НК в этот орган можно осуществить с помощью МЛТС, содержащей адресный модуль, представленный галактозосодержащим липоконьюгатом.

Данная работа посвящена синтезу адресных модулей - нейтральных неогликолипидов, получению адресных МЛТС, определению их физико-химических параметров и исследованию их нацеливающего потенциала.

Работа является частью научных исследований, проводимых на кафедре ХТБАС им. H.A. Преображенского МИТХТ им. М.В. Ломоносова в рамках тематического плана «Фундаментальные исследования в области синтеза, изучения свойств природных биологически активных соединений и их аналогов с целью создания лекарственных субстанций для лечения социально значимых заболеваний человека», а также в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» (госконтракт П715) и грантов РФФИ 09-03-00874-а и 10-03-00995-а.

Цель работы заключалась в разработке препаративных подходов к синтезу нейтральных неогликолипидов линейной и разветвленной структуры, создании на их основе адресных модульных липидных систем доставки нуклеиновых кислот, а также изучении их физико-химических характеристик и исследовании специфичности связывания с углеводузнающим белком in vitro.

Научная новизна работы. Разработаны подходы и осуществлен синтез новых нейтральных неогалактолипидов, предназначенных для использования в качестве адресных модулей МЛТС. Для получения бивалентных неогалактолипидов использованы различные типы полифункциональных матриц, спейсерных и линкерных групп. Для оптимизации синтеза неогалактолипидов на основе L-глутаминовой кислоты предложен подход на основе модифицированной реакции Штаудингера. С целью выбора связывающего модуля адресных МЛТС исследована транспортная способность катионных липосом на основе моно- и поликатионного амфифилов и установлено, что амфифил на основе спермина обеспечивает наиболее эффективную доставку ДНК в клетки. Получены адресные МЛТС, содержащие синтезированные моно- или бивалентные неогалактолипиды, исследовано их связывание с углеводузнающим лектнном RCA120 и установлена зависимость эффективности данного процесса от строения гликолипидов и их количественного содержания в составе МЛТС. Выявлены эффективные адресные МЛТС, перспективные для дальнейших исследований in vitro и in vivo.

Практическая значимость работы. В ходе синтетических исследований, исходя из унифицированных структурных блоков, были разработаны препаративные подходы и получены 18 новых неогалактолипидов (адресный модуль МЛТС). Предложенные подходы и оптимизация отдельных синтетических стадий позволяют получать нейтральные неогалактолипиды в количествах, достаточных для создания новых адресных модульных систем доставки НК и проведения расширенных биологических испытаний in vitro и in vivo. Исследования по связыванию адресных МЛТС с углеводузнающим лектином RCA¡¡0 выявили перспективные системы для дальнейшего изучения их способности доставлять НК в гепатоциты.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Синтез адресных модулей MJTTC, представленных нейтральными моно- и бивалентными неогалактолипидами, с использованием матриц различного типа (L-глутаминовой кислоты, 1,3-диаминопропан-2-ола и спермина);

2. Получение адресных MJITC, содержащих синтезирование неогалактолипиды, и изучение их физико-химических параметров;

3. Исследование специфичности связывания адресных MJTTC с углеводузнагощим лектином RCAno в зависимости от строения неогалактолипидов и их количественного содержания в системе доставки.

Апробация работы. Основные результаты диссертации были представлены на III молодежной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии-2009» (Москва, 2009 г.), XIII Международной научно-технической конференции "Наукоемкие химические технологии - 2010", (Суздаль, 2010 г.), II Международной конференции российского химического общества имени Д.И. Менделеева «Инновационные химические технологии и биотехнологии материалов и продуктов» (Москва, 2010 г.), международной конференции "Liposomes in Jerusalem" (Израиль, Иерусалим, 2011 г.), VIII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Волгоград, 2011г.), а также VI и VII Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011 и 2013 г.г.).

Публикации. По результатам работы опубликовано 10 печатных работ, в том числе 3 статьи в отечественных и зарубежном журналах.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, литературного обзора, обсуждения полученных результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (!Х05~ ссылок). Работа проиллюстрирована рисунками и содержит "/О схем и 'у*- таблиц.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ TI ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Направленная доставка НК в клетки может быть осуществлена с помощью MJITC, в состав которой входят два ковалентно не связанных между собой компонента: связывающий модуль - катионный амфифил, и адресный модуль, содержащий лиганд к клеткам-мишеням. Помимо перечисленных обязательных компонентов для повышения эффективности доставки в состав MJITC могут входить липиды-помощники, например, липид DOPE (1,2-диолеоил-.от-глицеро-3-фосфоэтаноламин), способствующий слиянию и дестабилизации мембран, в частности мембран эндосом. Структура катионных амфифилов является одним из важных факторов, определяющих способность MJITC эффективно доставлять НК, и представляет собой комбинацию двух основных доменов - гидрофобного и гидрофильного (катиогшого), которые соединяются спейсерными группами с помощью химической связи определенного типа (линкера). Для создания эффективных MJITC в качестве связывающих модулей нами

были выбраны поли- и монокатиоиные амфифилы, отличающиеся структурными доменами, синтез которых был разработан ранее в нашей научной группе (рис. 1).

Модульная липидная транспортная система (МЛТС)

11

Связывающий модуль

Адресный модуль

Ж

Ж

Монокатиоиные амфифилы

Поликатионные амфифилы

Моновалентные неогликолипиды

Бивалентные неогликолипиды

Рисунок 1. Компоненты модульной липидной системы доставки НК.

Направленную доставку НК с помощью МЛТС в гепатоциты обеспечивает адресный модуль, содержащий в своем составе терминальные остатки D-галактозы (рис. 1). В работе нами были получены адресные модули двух видов — моно- и бивалентные неогалактолипиды, отличающиеся гидрофобными доменами, линкерными и спейсерными группами для дальнейшего изучения структурно-функциональной зависимости .

Поскольку концепция МЛТС предполагает возможность замены входящих в ее состав компонентов, связывающие и адресные модули построены на основе принципов унификации и биосовместимости. Для этого в качестве гидрофобных доменов нами были выбраны остатки 1,2-ди-О-тетр аде цил-гас-глицерина и холестерина. Соединение структурных элементов осуществлялось через спейсерные группы различной длины и природы при помощи отличающихся по биологической стабильности линкерных групп карбамоильного, амидного или сложноэфирного типов, которые могут обеспечить оптимальный баланс между стабильностью и биотрансформацией молекул.

1. Связывающие модули МЛТС - поли- и монокатиоиные амфифилы

Структура катионных амфифилов является одним из важных факторов, определяющих способность МЛТС эффективно доставлять НК. Для создания связывающего модуля адресных МЛТС нами были получены по разработанным ранее методам поли- и монокатиоиные амфифилы (рис. 2), различающиеся строением гидрофобных и катионных доменов для дальнейшего формирования МЛТС и изучения влияния структуры амфифила на эффективность доставки НК.

Поликатионный амфифил 4, содержащий в качестве катионного домена природный полиамин (спермин), является альтернативой монокатионным амфифилам 1а,Ь-За,Ь и может обеспечивать более эффективный транспорт НК в клетки. В качестве гидрофобной составляющей, обеспечивающей встраивание амфифилов в липосомы, были выбраны остатки 1,2-ди-О-тетрадецил-гас-глицерина и холестерина. Гидрофильные и гидрофобные домены связывали с помощью гексаметиленовых спейсеров посредством карбамоильных линкеров.

V гос,4н2Э

Ме'

С„Н2аО

С14Н29О

-ос14н:

Рисунок 2. Катионпые амфифилы, использованные в качестве связывающего модуля адресных МЛТС.

2. Адресные модули МЛТС — нейтральные моно- н бивалентные неогликолиниды

Концепция модульной липидной системы доставки НК в гепатоциты предполагает, что в состав катионных липосом включается нейтральный амфифил, несущий углеводные лиганды. Известно, что аффинность таких систем к асиалогликопротеиновым рецепторам гепатоцитов зависит от количества адресных (углеводных) маркеров, экспонированных на поверхности систем, а также от их пространственного взаиморасположения. В связи с этим для выявления связи «структура - активность» нами были синтезированы адресные модули МЛТС, представляющие собой нейтральные моно- и бивалентные неогалактолипиды.

Структурной основой бивалентных неогалактолипидов является полифункциональная матрица, к которой посредством спейсерных групп присоединяются адресные и гидрофобные домены. При создании бивалентных неогалактолипидов нами были использованы матрицы на основе Ь-глутаминовой кислоты (Ю1и), 1,3-диаминопропан-2-ола и спермина. Для разнесения в пространстве остатков О-галактозы и гидрофобного домена были использованы спейсерные группы различной длины и природы.

2.1. Синтез моновалентных неогалактолннидов

Синтез моновалентных гликолипидов, отличающихся природой гидрофобного домена (рис. 3), был осуществлен в ходе реакции гликозилирования гас-2,3-ди(тетрадецилокси)проп-1-ил-Л'-(6-гидроксигексил)карбамата и холестен-5-ен-Зр-ил-Л'-(6-гидроксигексил)карбамата а-ацетобромгалактозой (а-4АсОа1Вг) в присутствии С(1СОз в качестве промотора. Дезацетилирование гидроксильных групп в углеводном остатке действием 0.1 М раствора метилата натрия в метаноле давало целевые неогалактолипиды 5а,Ь.

5а,ь

Рисунок 3. Моновалентные неогалактолипиды 7

2.2. Синтез бивалентных неогалактолипидов на основе матриц различного типа

Для синтеза бивалентных неогалактолипидов необходимо было получить наборы углеводных и гидрофобных предшественников, содержащих различные линкерные и спейсерные группы, и провести их связывание с выбранными полифункциональными матрицами (рис. 4). Последовательность присоединения предшественников варьировалась в зависимости от типа используемой матрицы.

УГЛЕВОДСОДЕРЖАЩИЕ ПРЕДШЕСТВЕННИКИ

ОН

иСо

о-х-у

он

X = -(сн2)в-

У = ~МН2 -N3 -МНС(0)СН2СН2С00Н

КО'

ГИДРОФОБНЫЕ ПРЕДШЕСТВЕННИКИ

Р ?

0Н

Я = Диглицерид или холестерин г=-(СН2)6-УУ = -МН2 —NHC(0)CHгCH2COOH

БИВАЛЕНТНЫЕ НЕОГАЛАКТОЛИПИДЫ

Рисунок 4. Структурные компоненты бивалентных неогалактолипидов.

2.2.1. Синтез гидрофобных предшественников

Гидрофобные предшественники с карбамоильным линкером и различными спейсерными группами (гидрофобной и гидрофильной природы) были получены из активированных производных 1,2-ди-О-тетрадецил-гаоглицерина 6а и холестерина 6Ь, взаимодействие которых с избытком диаминов приводило к соединениям 7а,Ь и 8а,Ь с терминальной аминогруппой (схема 1). Соединения 9а,Ь и 10а,Ь, содержащие терминальную карбоксильную группу, получали обработкой аминов 7а,Ь и 8а,Ь избытком янтарного ангидрида.

Схема I

я-сж1

н2м-х-мн2

о

„А,

6а, Я1 = -С(0)РИМ02 6Ь, Я1 = -С(0)С1

а, Р =

Н

7а, Ь (96%, 82%) 8а,Ь (78%, 61%)

О

„А,

—^соон н н

9а,Ь (83%, 66%) 10а, Ь (93%, 96%)

С14Н2;,0 I СцН290-|

ь, и =

7а,Ь и 9а,Ь Х= -1—(СН2)в-!- 8а,Ьи10а,Ь Х = Реагенты и условия: а) Е1зЫ, ОСМ; Ь) янтарный ангидрид, Е1з1Ч, ЭСМ, 40 °С.

Гидрофобные предшественники 12а,b со сложноэфирным линкером получали действием 1.5-кратного избытка янтарного ангидрида на 1,2-ди-О-тетрадецил-гас-глицерин (11а) или холестерин (lib) (схема 2).

Схема 2

ROH

RO.

a, R =

с,4н29о-|

C,„HK0 |

Ь, R =

11а,Ь 12а.Ь (60%, 91%)

Реагенты и условия: а) янтарный ангидрид, Е1зЫ, ОСМ, 40 °С.

2.2.2. Синтез углеводсодержащих предшественников

Синтез углеводсодержащих предшественников 16а,Ь и 17Ь осуществляли исходя из ю-хлорспиртов 13а,Ь, которые гликозилировали а-ацетобромгалактозой по методу Гельфериха (схема 3). При взаимодействии 6-хлоргексан-1-ола (13а) и а-4АсОа1Вг (1.1 экв) в среде безводного хлористого метилена при 24 °С выход целевого р-гликозида 14а составил 54% (табл. 1).

Схема 3

^ОАс

3

Э-Х-С1

ОАс

14а,Ь (81%, 75%)

ОАс

15а,Ь (96%, 83%)

U°Aco

ОАс

16а,Ь (82%, 47%)

а, Х= I—(СН2)а—I

О-ОАС АсО^^Л-О-Х-И

ОАс "

17b (69%)

b, Х=

Реагенты и условия: а) 2,3,4,6-тетра-О-ацетил-а-О-галактопиранозилбромид, Н§(СЫ)г, ЭСМ - МеСЫ (1:1) или ОСМ, 24 °С или 40 °С; Ъ) №Ы3, ДМФА, 80 °С; с) 10% Р<3/С, ЫН4+НСОО", МеОН, 60 °С; с!) янтарный ангидрид, Е13Ы, ЭСМ, 40 °С.

Увеличение количества гликозилирующего агента и использование смеси растворителей (СН2С12 — МеСЫ, 1 : 1) приводили к увеличению выхода соединения 14а до 81%. В случае 3,6-диокси-8-хлороктан-1-ола (13Ь) максимальный выход р-гликозида 14Ь был достигнут при использовании 1.5-кратного избытка а-4АсОа1Вг и 2-кратиого избытка 1-^(СМ)2 в среде безводного хлористого метилена при кипячении в течение 3-х часов.

Соединение Hg(CN)2, экв. Растворитель Избыток а-4AcGalBr т, °С Время, ч Выход гликозидов 14, %

13а 1.5 CH2CI2 1.1 24 15 54

1.5 СН2С1г: MeCN (1:1) 1.5 24 18 81

13Ь 2 СН2С12 1.5 40 3 75

Замена атома хлора на азидо-группу действием избытка азида натрия и последующее восстановление на 10% Pd/C в присутствии формиата аммония приводило к углеводсодержащим предшественникам 16а,b с терминальной аминогруппой. Углеводсодержащий предшественник 17Ь с терминальной карбоксильной группой получали обработкой соединения 16Ь янтарным ангидридом с выходом 69%.

2.2.3. Синтез бивалентных неогалактолипндов на основе L-глутаминовой кислоты

Ключевым этапом в синтезе бивалентных неогалактолипндов на основе L-глутаминовой кислоты (L-Glu) явилось присоединение углеводсодержащих и гидрофобных предшественников к Boc-L-Glu (схема 4). Конденсация галактозида 16а и Boc-L-Glu в присутствии избытка HBTU (0-(бензотриазол-1-ил)-Лг,ЛуУ',Л''-тетраметилуроний гексафторфосфат) и DIEA (¿¥,Л'-диизопропилэтиламин) приводила к образованию дигалактозосодержащего соединения 18 с выходом 87%. В случае предшественника 16Ь с олигоэтиленгликолевым спейсером в сходных условиях получали преимущественно монозамещенное соединение с выходом до 50%, в то время как выход целевого кластера 19 составил 34%.

Для увеличения выхода соединения 19 и сокращения количества синтетических стадий мы предложили другой химический подход, основанный на модифицированной реакции Штаудингера. Классическая реакция Штаудингера используется для трансформации азидов в амины в присутствии фосфинов и протекает через образование промежуточного продукта -иминофосфорана. Было показано, что иминофосфораны являются сильными нуклеофилами и могут взаимодействовать с карбоновыми кислотами с образованием амидов [Е. Saxon et al., Science, 2000, 287, 2007].

Соединение 15b вводили в реакцию с Boc-L-Glu в присутствии Л'.Л'-диизопропилкарбодиимида (DIC), 1-гидроксибензотриазола (HOBt) и различных фосфинов (РРЬз, РВиз). Оптимизация соотношения реагирующих веществ позволила увеличить выход соединения 19 до 86% (табл. 2). Удаление Вос-защитной группы действием 4 M НС1 в диоксане приводило к соединениям 20 и 21 с выходами 96 и 69%, соответственно.

Таблица 2. Оптимизация получения кластера 19

№ опыта Промотор Соотношение реагентов Выход, %

1 PPh3 / DIC / HOBt 5/3.4/2.4

2 РВиз / DIC / HOBt 3 / 2.2/ 2.2 48

3 РВиз / DIC / HOBt 4/2.2/2.2 86

* - по данным тонкослойной хроматографии

Бивалентные неогалактолипиды с карбамоильным линкером получали конденсацией соединений 20 и 21 с гидрофобными компонентами 9а,Ь и 10а,Ь в присутствии НВТи (схема 4). После выделения с помощью колоночной хроматографии соединения 22а,Ь - 25а,Ь были получены с выходами от 64 до 88%. Удаление ацетильных защит приводило к целевым

неогалактолипндам 26а,Ь - 29а,Ь. Полученные соединения охарактеризованы данными масс-спектрометрии и спектроскопии ЯМР 'Н и ,3С.

АсО ^ОАс АсО

Схема 4

АсО ОАс

ОАс АСО ОАС

АсОЛ-—■ч^/0 ОАс

ОАс ,

АсО ОАс

АсО-: АсО ОАс

АсОЛ^Т-^О-Х-й'

ОАс N4 Вое

18(87%) X = |—ССН2)6—|

19(86%) X =

АсО ОАс

. АсО ОАс АсО

^ ОАс

NN2" НС1

АсО

АсО ОАс иА

АсО^Т-^О-Х-М

ОАс п НЫ

0

1

N—¥—N 01* Н Н

20 (96%) X = |—(СН2)в-:

21 (69%) X =

НО он

но он он

ноЛ^-^о-х-ы

он " нг^

22э,Ь (6в%, 67%) 24а,Ь (80%, 72%) 23а,Ь (65%, 64%) 25а,Ь (88%, 64%)

I ОС14Н2э [-ОС^На

О

х

Ы— У—NОЯ Н Н

ь, к =

26а,Ь (93%, 84%) 28а,Ь (95%, 87%) 27а,Ь (70%, 76%) 29а,Ь (80%, 86%)

№ X У

22, 26 —<СНг)6- —(СН2)в-

23, 27

24, 28 .....о"/■ —(СН2)а-

25, 29

Реагенты и условия: а) Вос-Ы31и, НВ"Ш, ЭША, ДМФА, О °С—24 °С; Ь) Вос-Ь-01и, РВи3, 01С, НОВ1, ТГФ, О "С—>24 °С; с) 4 М НС1 в диоксане, О °С; ф 9а,Ь или 10а,Ь, НВТи, ИЕА, ДМФА, О °С—>24 "С; е) 0.04 М Ме(Жа/МеОН, 24 "С.

Для синтеза бивалентных неогалактолипидов со сложноэфирным линкером на первом этапе осуществляли дезацетилирование соединений 20 и 21 (схема 5). Взаимодействие продуктов дезацетилирования 30 и 31 с гидрофобными предшественниками 12а,Ь в условиях, аналогичных синтезу соединений 22а,Ь - 25а,Ь, приводило к целевым неогалактолипндам 32а,Ь и 33а,Ь, которые выделяли обращенно-фазовой хроматографией с выходами от 31 до 54%. Соединения 32а,Ь и 33а, Ь охарактеризованы данными масс-спектрометрии и спектроскопии ЯМР !Н и 13С.

Схема 5

он ОН но^

он

онон но

но ,он но^

ын2

" НО он

но

он

|-ОС14Н29 а, = коС14Н29 Ь, Г* =

V

32а,Ь (40%, 31%) 33а,Ь (54%, 43%)

30,32а,Ь X = |—{СН2)е—| 31,33а,Ь X =

Реагенты и условия: а) 0,04 ЛШеСЖа/МеОН, 24 °С; Ь) соединения 12а,Ь, НВТи, Э1ЕА, ДМФА, 0 °С—24 °С;

2.2.4. Синтез бивалентных неогалактолипидов на основе 1,3-диамннопропан-2-ола

В синтезе бивалентах неогалактолипидов на основе 1,3-диаминопропан-2-ола последовательность присоединения углеводсодержащих и гидрофобных предшественников к матрице была изменена (схема 6). На первом этапе осуществляли присоединение гидрофобных предшественников 7а,Ь к активированному производному 1,3-ди-Вос-диаминопропан-2-ола34, получая соединения 35а,Ь с выходами 88% и 75%, соответственно.

Схема б

2 СР3СООН

ВосЫН—|

ВосМН—]

По.

ВосИН-

34

уО

о

Н_1 н н Н Н

о "о

35а,Ь (88%, 75%)

т

ор*1

и'о еж'

ог?1

о 4 о

36а,Ь (99%, 98%)

| ОСцН29 а, I* = коСкНгэ

'С

37а,Ь Ас (63%, 72%) 38а,Ь Я1 = Н (80%, 73%)

Реагенты и условия: а) соединения 7а,Ь, Е13Ы, ЭСМ, 40 °С; Ь) ТРА, МеОН, 0 °С; с) соединение 17Ь, НВТи, 01ЕА, ДМФА, 0 °С-*24 °С; й) 0.04 ММеОЫа/МеОН, 24 "С.

После удаления Вос-защитных групп действием трифторуксусной кислоты (ТИА) соединения 36а,Ь со свободными аминогруппами конденсировали с карбоксилсодержащим углеводным предшественником 17Ь в присутствии избытка НВТи и ШЕА. Деблокирование гидроксильных групп в углеводном остатке приводило к образованию целевых бивалентных неогалактолипидов 38а,Ь с выходами 80% и 73%, соответственно. Полученные соединения охарактеризованы данными масс-спектрометрии и спектроскопии ЯМР 'н и |3С.

2.2.5. Синтез бивалентных неогалактолипндов на основе спермина

Симметрия молекулы спермина (39) и наличие четырех функциональных центров позволили создать на его основе бивалентные неогликолипиды, содержащие в своем составе два адресных лиганда и два гидрофобных остатка. Химическая структура матрицы и набор синтезированных углеводсодержащих и гидрофобных предшественников определяет порядок и места присоединения выбранных структурных элементов. Нами предложен подход, который предполагает первоочередное введение гидрофобных компонент по вторичным атомам азота спермина и последующее присоединение по первичным атомам азота углеводных компонент (схема 7).

Схема 7

9а,Ь, изо-бутилхлорформиат или НВТи

.СЖ2

39, Я1 = Н

40, Я1 =С(0)СР1

41, I*1 = С(0)СР1; Я2 = Вп (37%)

42, = С(0)СР,; Я2 = Н (99%)

н А

ы-у-м ок н

м-у-ы. ,сж

Н Т

о

■с

43а,Ь Я - С(0)СР3 (72%, 89%) 44а,Ь = Н (60%, 81%)

оя'сж3

О!}3

о^о^

4__ч Н

о

и

К1-У-М СЖ н

Н Т

О

'С

45а,Ь Я3 - Ас (43%, 32%) 46а,Ь Я3 = Н (72%, 89%)

| ОС14Н29

ь, а =

у= |-(СН2)6-|

Реагенты и условия: а) СР3С(0)0Е1, Н20, МеСЫ, 100 °С; Ъ) Вп0С(0)СН2СН2С(0)С1, Ру, ОМАР, Е^Ы, 24 °С; с) 10% РМС, ЫН4+НСОО", МеОН, 60 °С; ф 7а,Ь, НВТи, 01ЕА, ДМФА, 0 °С^24 °С; е) для 43а - К2С03, МеОН, 50 °С; для 43Ь - ЫаОН, МеОН;./) 17Ь, НВТи, 01ЕА, ДМФА, 0 °С—>24 °С; &) 0.04 М МеОМа/МеОН, 24 "С.

Селективная защита первичных аминогрупп спермина (39) достигалась обработкой последнего избытком этилового эфира трифторуксусной кислоты, давая бис-трифторацетамид 40 с количественным выходом. Дальнейшая конденсация соединения 40 и карбоксилсодержащих производных 9а,Ь (см. схему 1) с использованием различных активирующих агентов (изо-бутилхлорформиат, НВТи) не приводила к образованию желаемых продуктов 43а,Ь. Поэтому нами был разработан трехстадийный подход, который включал взаимодействие соединения 40 с хлорангидридом монобензилового эфира янтарной

кислоты в присутствии каталитического количества DMAP (4-диметиламинопиридин), удаление бензильной защиты в соединении 41 и конденсацию карбоксилсодержащего соединения 42 с аминами 7а,b (см. схему 1) в присутствии HBTU. Удаление трифторацетильных защитных групп действием К2СО3 или NaOH приводило к производным спермина 44а,Ь, содержащим два гидрофобных домена.

Взаимодействие углеводсодержащего предшественника 17Ь с терминальной карбоксильной группой и соединений 44а,b осуществляли в присутствии HBTU. Удаление ацетильных защитных групп давало целевые бивалентные неогалактолипиды 46а,b с выходами 72% и 89%, соответственно. Полученные соединения охарактеризованы данными масс-спектрометрии и спектроскопии ЯМР 'Н и 13С.

Таким образом, в ходе данного этапа работы нами был осуществлен синтез восемнадцати новых нейтральных моно- и бивалентных неогалактолипидов, которые различаются типом гидрофобного домена, линкерными и спейсерными группами. Полученные соединения могут быть использованы в качестве адресных модулей MJITC.

3. Физико-химические характеристики и биологические свойства адресных MJITC, полученных на основе катнонных амфифилов и синтезированных нейтральных иеогалактолнпидов

Эффективность доставки с помощью адресных MJITC зависит от успешного выбора связывающего (катионный амфифил) и нацеливающего (адресный липоконьюгат) модулей, а также от их количественного соотношения в системе доставки. Для отбора перспективных адресных МЛТС нами были сформированы различные липосомальные композиции, содержащие поли- и монокатионные амфифилы la,b —За,Ь, 4, синтезированные нейтральные бивалентные неогалактолипиды 26а — 29а, 32а, 33а, 38а, 46а, изучены их физико-химические характеристики и исследовано их взаимодействие с углеводузнающим белком in vitro.

3.1. Выбор связывающего модуля для адресных MJITC1

Катионные амфифилы (КА) составляют основу MJITC, а их структура является одним из важных факторов, определяющих эффективность доставки НК. В большинстве случаев транспорт НК осуществляется более эффективно при использовании катионных липосом (KJI), сформированных из смесей КА и цвиттер-ионного липида DOPE. Нами были приготовлены КЛ, состоящие из амфифилов la,b - 3a,b, 4 и DOPE в соотношении 1:1 (мольн.), и определены величины их среднего гидродинамического диаметра и поверхностного потенциала (^-потенциал). Все КЛ имели положительный заряд и характеризовались мономодальным распределением по размерам (средний гидродинамический диаметр частиц 30 - 100 нм) (табл. 3). Для создания биосовместимой и эффективной МЛТС были исследованы

1 Биологические исследования проводили сотрудники лаборатории биохимии нуклеиновых кислот ИХБФМ СО РАН под руководством проф., д.б.н. Зеиковой М.А.

цитотоксичность КЛ и доставка с их помощью НК. Цитотоксичность оценивали с помощью МТТ-теста, используя клетки почки эмбриона человека (НЕК293) и фибробластов почки сирийского хомячка (ВНК).

Таблица 3. Физико-химические характеристики и цитотоксичность КЛ

КЛ Катионная «головка» Физико-химические характеристики КЛ Цитотоксичность КЛ (IC50, мкмоль)'

Средний диаметр, нм* i;-Потен -циал, мВ НЕК293 ВНК

S-2 S+2 S- S+

la-DOPE -о 50.4 ± 12.5 68.35 >80 >80 >80 >80

2а - DOPE <r 63.4 ± 11.8 62.88 >80 >80 40.9 69.6

За - DOPE —N О Ме \—' 43.3 ±8.2 63.55 >80 >80 >80 >80

lb- DOPE -О 59.9 ± 15.1 60.62 >80 >80 64.8 46.5

2b - DOPE <г 38.9 ± 10.2 75.04 >80 >80 48.1 42.1

3b-DOPE —N О Ме х—' 99.4 ± 16.1 59.21 >80 >80 >80 >80

4 - DOPE Спермин 28.6 ±7.8 46.36 и.о.3 39.0 н.о. н.о.

' индекс полидисперсности варьировался в пределах отО.218 до 0.281

1 Стандартное отклонение не превышало 10% от значения 1С50

2 S- - в отсутствие сыворотки крови, S+ - в присутствие сыворотки крови

' значения 1С5о не определяли

Данные МТТ-теста показали, что клетки ВНК обладали наибольшей чувствительностью к исследованным КЛ, значения IC50 в отсутствие сыворотки для этих клеток варьировались от 40 до 80 мкМ. В случае клеток НЕК 293 липосомы на основе катионных производных диглицерида и холестерина 1а,Ь - За,Ь были нетоксичны вплоть до концентраций 80 мкМ независимо от наличия или отсутствия сыворотки крови в ростовой среде. Значение IC50 для КЛ на основе поликатионного амфифила 4 составило 39 мкМ по отношению к клеткам НЕК293.

С целью определения наиболее эффективных КЛ была изучена доставка плазмидной ДНК pEGFP-C2, кодирующей зеленый флуоресцентный белок, в эукариотические клетки НЕК293. Эксперименты по доставке проводили в присутствии 10% сыворотки в ростовой среде, варьируя соотношение P/N (количество отрицательно заряженных фосфатных групп нуклеиновой кислоты к положительно заряженным группам амфифила). Во всех экспериментах эффективность КЛ сравнивали с эффективностью коммерческого препарата Lipofectamine 2000 (Lf2000, Invitrogene, США). Доставку НК в клетки регистрировали с помощью проточной цитофлуориметрии, оценивая количество трансфицированных клеток и среднюю интенсивность флуоресценции на клетку в популяции.

Сравнение эффективности доставки липосом на основе монокатионных амфифилов 1а,Ь-За,Ь с эффективностью Lf 2000 показало, что амфифилы с гидрофобным доменом на основе дитетрадецилглицерина способствуют более эффективному проникновению ДНК в клетки, чем амфифилы на основе холестерина (рис. 5А). При этом липосомы la-DOPE в 1.5 раза превосходили Lf 2000 по количеству трансфицированных клеток (при P/N =1:4). Однако, по уровню экспрессии зеленого флуоресцентного белка липосомы на основе монокатионных амфифилов la,b-3a,b значительно уступали Lf 2000, поскольку значения средней флуоресценции для этих липосом были в 7-13 раз ниже, чем значения для коммерческого препарата (рис. 5В). Максимальной эффективностью обладали липосомы на основе поликатионного амфифила 4, которые способствовали как активному проникновению плазмидной ДНК внутрь клеток (рис. 5А), так и ее экспрессии (рис. 5В), превосходя показатели Lf 2000 в 2-3 раза.

□ 1/1 □ 1/2 El 1/4

I -

, .-röl , Нйд - -ГУ-1 __СЗЕЭ ,

Рисунок 5. Доставка плазмидной ДНК (рЕвРР-С2) с помощью катионных липосом в клетки НЕК293 в присутствии 10% сыворотки крови в ростовой среде. Процент трансфицированных клеток (А) и уровень средней интенсивности флуоресценции в клеточной популяции (В) измеряли с помощью проточной цитометрии через 48 ч после инкубации клеток с комплексами КЛ/ДНК. Стандартное отклонение не превышает 7%.

Таким образом, в результате биологических испытаний было выявлено, что КЛ, содержащие поликатионный амфифил 4, обеспечивают наиболее эффективную доставку НК в эукариотические клетки и могут быть использованы в качестве связывающего модуля адресных МЛТС.

3.2. Выбор адресного модуля для МЛТС, нацеленных на асиалогликопротеиновые рецепторы.

Высокая степень связывания синтетических неогликолипидов в составе липосом с рецепторами клеток-мишеней является одним из важнейших требований при создании эффективных адресных МЛТС. Для изучения возможности использования синтезированных

неогалактолипидов в качестве адресного модуля МЛТС, а также для выявления связи «структура — активность» были получены адресные КЛ, связывающий модуль которых представлен амфифилом 4, а роль адресного модуля выполняли синтезированные бивалентные неогалактолипиды 26а - 29а, 32а, 33а, 38а, 46а, входящие в состав МЛТС в различном соотношении (2.5, 5 и 10%).

норн

он

¿¿^A-O-X-N

НО,ОН

NH

■о

HN

32а,33а О

ОН он

НО он

ОН

но он

он он он

НоХ—-"^Л-0-X-N

О

N—У—N OR Н Н

ОН,он но

JHон

п29

J-OC„H29

Y4VV

О

Н А

N-Y-N OR Н

Н

N-Y-N. ,OR

Н Y

О

№ X Y № X

26а (СН2)6 —(СН2)6— 32а —(СН2)и—

27а А.....-.....^ 33а о—

28а —(СН2)6- 38а

29а .....—о-^л

46 а —(СН2)б-

Были определены физико-химические характеристики полученных МЛТС: как и в случае «обычных» КЛ 4-DOPE все адресные липосомы имели положительный заряд, а их средний гидродинамический диаметр варьировался от 20 до 95 нм (табл. 4). Отмечено, что для липидов 26а, 29а, 33а, 38а, 46а увеличение доли адресных неогалактолипидов в составе липосом от 2.5% до 5 и 10% приводило к уменьшению среднего диаметра частиц в 1.5-2 раза, что свидетельствует о стабилизирующем действии неогалактолипидов на липосомальные композиции.

Для оценки нацеливающего потенциала МЛТС, а именно доступности адресных лигандов для связывания с рецепторами, была изучена способность адресных липосом агглютинировать с лектином Ricinus communis Agglutinin (RCA¡20)- Данный лектин содержит в своей структуре четыре домена, распознающих и связывающих молекулы с терминальными остатками D-галактозы, и, таким образом, способен вызывать агглютинацию транспортных систем с экспонированными на их поверхности галактозильными лигандами. Эффективность связывания с белком оценивали по изменению оптической плотности липосомальных

суспензий. В присутствии КСАио все адресные КЛ, содержащие бивалентные неогалактолипиды, подвергались агглютинации, в то время как «обычные» липосомы 4-ЭОРЕ при добавлении КС А120 не агглютинировали (рис. 6).

Таблица 4. Средний гидродинамический диаметр адресных KJ14-DOPE (1:1), _содержащих неогалактолипиды 26а-29а, 32а, 33а, 38а, 46а_

№ Содержание неогапактолипидов в составе катионных липосом № Содержание неогалактолипидов в составе катионных липосом

2.5% 5% 2.5% 5% 10%

Средний диаметр, нм* Средний диаметр, нм* Средний диаметр, нм* Средний диаметр, нм* Средний диаметр, нм*

26а 33.6 ±7.2 19.2 ±2.2 27а 59.1 ±11.7 36.5 ±6.8 78.2 ± 15.4

28а 39.3 ±7.7 51.5 ± 9.6 29а 42.0 ±6.1 53.3 ±9.2 43.5 ± 8.3

32а 26.4 ±4.3 76.1 ± 16.1 38а 59.1 ± 10.5 31.1 ±5.0 34.3 ±7.5

33а 72.1 ± 16.1 37.5 ± 11.6 46а 95.1 ±18.3 83.6 ±23.8 43.7 ±7.2

индекс полидисперсности варьировался в пределах от 0.200 до 0.315

Отмечено, что эффективность агглютинации КЛ, содержащих бивалентный неогалактолипид 46а, в присутствии лектина возрастала с увеличением количества неогалактолипида в составе липосом (рис. 6). В условиях эксперимента по конкурентному ингибированию при добавлении раствора свободной Б-галактозы (100 мг/мл) к смеси адресных липосом и лектина происходило резкое уменьшение оптической плотности раствора, что подтверждало специфичность связывания углеводсодержащих липосом и ЯСАпо- Для адресных КЛ, содержащих галактолипиды 26а, 27а и 38а, также была установлена зависимость эффективности агглютинации от содержания гликолииида в липосомах. В случае липосом с бивалентными галактолипидами 28а, 29а, 32а и 33а агглютинация практически не зависела от процентного содержания адресного модуля (данные не приведены).

Рисунок 6 Агглютинация «обычных» (4-DOPE) и адресных катионных липосом с различным содержанием неогалактолипида 46а (2.5, 5 и 10%) в присутствии лектина RCA,20.

Известно, что аффинность к рецепторам зависит не только от количества углеводных лигандов, экспонированных на поверхности адресных MJITC, но также от их пространственного расположения, которое определяется типом и длиной спейсерных групп в молекулах неогалактолипидов. Исследование агглютинации KJ1, содержащих бивалентные неогалактолипиды 26а - 29а, 32а, 33а на основе L-Glu, выявило, что длина и природа спейсерных групп между остатками D-галактозы и матрицей, а также между гидрофобным доменом и матрицей влияют на связывание с пектином (рис. 7).

Спейсерная группа между остатком D-галактозы и матрицей вносит основной вклад во взаимодействие с RCA120 в случае липосом с неогалактолипидами 32а и 33а, содержащими короткий (4 атома) спейсер между остатком диглицерида и L-Glu. Для этих липидов замена гексаметиленового спейсера между остатками галактозы и матрицей на олигоэтиленгликолевый (8 атомов) приводила к заметному повышению эффективности агглютинации. Увеличение длины спейсерной группы между остатком диглицерида и L-Glu до 13 и 20 атомов приводило к росту эффективности связывания КЛ с лектином, при этом влияние спейсерной группы между D-галактозой и L-Glu снижалось. Например, для соединений 27а и 29а, содержащих длинный олигоэтиленгликолевый спейсер (20 атомов) между остатком диглицерида и L-Glu, различий в эффективности связывания с RCAno в зависимости от длины спейсера между остатком D-галактозы и L-Glu не наблюдалось.

Рисунок 7. Зависимость агглютинации адресных КЛ, содержащих 5% неогалактолипидов 26а - 29а, 32а, 33а, от длины и природы спейсерных групп между адресным лигандом, гидрофобным доменом и матрицей. Приведены значения оптической плотности суспензии КЛ при 450 нм через 10 мин после добавления лектина ЯСА^о-

В результате проведенного изучения агглютинации КЛ, содержащих различное количество неогалактолипидов были отобраны четыре липосомальные композиции (адресные МЛТС) с 10%-ым содержанием бивалентных неогалактолипидов, которые наиболее эффективно взаимодействуют с лектином (рис. 8). Наибольшей эффективностью связывания обладают липосомы, содержащие соединение 38а на основе 1,3-диаминопропан-2-ола.

Количество атомов в спейсере между остатком Gal и L-Glu

0.3 т

0.1

29а

33а ------■-- 28а ____

32а 26а

4 13 20

Количество атомов в спейсере между гидрофобным доменом и L-Glu

Липосомальные композиции с иеогалактолипидами 27а и 29а на основе 1.-С1и и 46а на основе спермина менее эффективно взаимодействовали с ЯСАцо.

-О— 4-DOPE-27a (10%) -o-4-DOPE-29a (10%)

—&-4-DOPE-38a (10% ¡ -m-4-DOPE-46a ¡10%)

Время, мин

Рисунок 8. Агглютинация КЛ, содержащих 10% неогалактолипидов (27а, 29а, 38а и 46а) на основе различных матриц в присутствии лектина ДСЛ/го-

Таким образом, в результате проведенных биологических исследований нами установлено, что эффективность процесса агглютинации зависит от строения адресных неогалактолипидов, а также от их количественного содержания в составе КЛ, и выявлены адресные МЛТС, которые можно рекомендовать для дальнейших испытаний in vitro и in vivo.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны методы синтеза и получены 18 новых нейтральных неогалактолипидов, отличающихся количеством углеводных остатков, строением гидрофобного домена, типом линкерных групп, а также природой и длиной спейсерных групп. Полученные углеводсодержащие липоконыогаты предназначены для использования в качестве адресных модулей МЛТС.

2. Для синтеза бивалентных неогалактолипидов на основе L-глутаминовой кислоты использован новый подход, заключающийся во взаимодействии азидосодержащих производных галактозы с Вос-защищенной L-глутаминовой кислотой в присутствии трибутилфосфина.

3. По результатам биологических испытаний установлено, что липосомы, содержащие поликатионный амфифил на основе спермина, способствуют более эффективной доставке ДНК в клетки, чем липосомы на основе монокатионных амфифилов и коммерческий препарат Lf2000.

4. Определены физико-химические параметры «обычных» и адресных MJITC и установлено, что наличие бивалентных неогалактолипидов в составе липосом может приводить к уменьшению размера липосом.

5. Показано, что адресные MJITC, содержащие бивалентные неогалактолипиды, подвергаются агглютинации в присутствии углеводузнающего лектина RCA120, и эффективность этого процесса зависит от строения неогликолипида и его содержания в липосомах.

6. Полученные адресные MJ1TC обладают функцией нацеливания и могут быть использованы для дальнейших биологических исследований in vitro и in vivo.

Список публикаций по теме диссертации:

1. Е.А. Ivanova, M.A.Maslov, N.G. Morozova, G.A. Serebrennikova, V.V. Chupín. Synthesis of bivalent neogalactolipids via modified Staudinger reaction // RSC Advanced. - 2012. - V.2. - P. 4600-4602.

2. Е.А. Иванова, Ю.И. Токарева, Н.Г. Морозова, М.А. Маслов, В.В. Чупин. Синтез поликатионного гемини-амфифила на основе спермина // Вестник МИТХТ. - 2012,- №4. - С. 54-57.

3. Е.А. Иванова, Н.Г. Морозова, М.А. Маслов, Г.А. Серебренникова. Синтез гапактозосодержащих болаамфифилов // Вестник МИТХТ. - 2010. - №5. - С.65-67.

4. Е.А. Иванова, М.А. Маслов, В.В. Чупин, Н.Г. Морозова. Адресные модульные системы доставки терапевтических нуклеиновых кислот в гепатоциты // VII Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». - Москва. -2013.-С. 94-95.

5. Е.А. Ivanova, N.N. Sannikova, N.G. Morozova, М.А. Maslov, G.A. Serebrennokova. Mono-and biantennary galactose-containing lipids for nucleic acid delivery into hepatocytes // International conference "Liposomes in Jerusalem". - Jerusalem. - 2011. - P. 184.

6. Е.А. Иванова, H.H. Санникова, Н.Г. Морозова, М.А. Маслов, Г.А. Серебренникова. Синтез биантенных неогликолипидов // VIII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии. - Волгоград. - 2011. - С. 217.

7. Ю.И. Токарева, Е.А. Иванова, М.А. Маслов, Н.Г. Морозова, Г.А. Серебренникова. Синтез гемини-сурфактанта на основе диглицерида и спермина для доставки нуклеиновых кислот в эукариотические клетки // VI Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». - Москва. - 2011. - С. 103-104.

8. Е.А. Иванова, Н.Г. Морозова, М.А. Маслов, Г.А. Серебренникова. Оптимизация дизайна галактозосодержащего адресного вектора для трансфекции эукариотических клеток // Сборник тезисов докладов XIII Международной научно-технической конференции "Наукоемкие химические технологии - 2010". - Суздаль. -2010. - С. 209.

9. H.H. Санникова, E.A. Иванова, M.A. Маслов, Н.Г. Морозова, Г.А. Серебренникова. Новый биосовместимый адресный компонент для комбинированных липидных систем доставки лекарственных веществ // II Международная конференция российского химического общества имени Д. И. Менделеева «Инновационные химические технологии и биотехнологии материалов и продуктов». - Москва. - 2010. - С. 344.

10. Е.А. Иванова, Н.Г. Морозова, М.А. Маслов, Г.А. Серебренникова. Синтез компактизирующих и адресных компонент «бинарных» систем переноса нуклеиновых кислот // Сборник тезисов докладов 111 молодежной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии-2009». - Москва. - 2009. - С. 50.

Иванова Е.А. Синтез нейтральных неогликолипидов для создания модульных систем доставки нуклеиновых кислот

Формат 60x90/16 Тираж 100 экз. Подписано в печать 26.04.2013. Заказ № 87 Типография ООО «Генезис» 8 (495) 434-83-55 119571, г. Москва, пр-т Вернадского, 86

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова»

на правах рукописи

04201357591

Иванова Екатерина Алексеевна

СИНТЕЗ НЕЙТРАЛЬНЫХ НЕОГЛИКОЛИПИДОВ ДЛЯ СОЗДАНИЯ МОДУЛЬНЫХ СИСТЕМ ДОСТАВКИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

02.00.10 - Биоорганическая химия

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель д.х.н. проф. Чупин В.В.

Москва-2013 г.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений:..........................................................................................................................4

1. Литературный обзор......................................................................................................................5

1.1. Введение......................................................................................................................................5

1.2. Основные стадии транспорта нуклеиновых кислот................................................................6

1.3. Модульные липидные транспортные системы........................................................................8

1.3.1. Связывающий и защищающий модуль МЛТС.....................................................................9

1.3.2. Биосовместимый и стабилизирующий модуль МЛТС.......................................................12

1.3.3. Адресный модуль МЛТС......................................................................................................12

1.3.3.1. Углеводные лиганды для нацеленной доставки НК........................................................13

1.3.3.1.1. Катионные углевод со держащие амфифилы..................................................................16

1.3.3.1.2. Эффект мультивалентности в углеводном распознавании на примере поливалентных нейтральных углеводсодержащих амфифилов..................................................19

1.3.3.1.3. Создание липосомальных систем доставки НК, содержащих поливалентные гликоконъюгаты...............................................................................................................................26

1.3.3.2. Фолиевая кислота как лиганд для нацеливания на опухолевые клетки........................33

1.3.3.3. Другие лиганды для направленной доставки в клетки-мишени....................................34

1.3.4. Дополнительные функциональные модули МЛТС, увеличивающие эффективность доставки НК......................................................................................................................................34

1.4. Заключение................................................................................................................................37

2. Результаты работы и их обсуждение.........................................................................................39

2.1. Синтез связывающих модулей МЛТС - катионных амфифилов.........................................42

2.1.1. Синтез монокатионных амфифилов.....................................................................................42

2.1.2. Синтез поликатионного гемини-амфифила........................................................................45

2.2. Синтез адресных модулей МЛТС - нейтральных неогликолипидов..................................46

2.2.1. Синтез моновалентных неогалактолипидов.......................................................................47

2.2.2. Синтез бивалентных неогалактолипидов на основе разветвленных матриц различного типа...................................................................................................................................................48

2.2.2.1. Синтез гидрофобных предшественников.........................................................................49

2.2.2.2. Синтез углеводных предшественников............................................................................51

2.2.3. Синтез бивалентных неогалактолипидов на основе Ь-глутаминовой кислоты..............54

2.2.4. Синтез бивалентных неогалактолипидов на основе 1,3-диаминопропан-2-ола..............60

2.2.5. Синтез бивалентных нейтральных неогалактолипидов на основе спермина..................62

2.3. Физико-химические характеристики и биологические свойства адресных МЛТС,

полученных на основе катионных амфифилов и синтезированных нейтральных бивалентных

неогалактолипидов..........................................................................................................................66

2.3.1. Выбор связывающего модуля для адресных МЛТС..........................................................66

2.3.1.1. Определение физико-химических характеристик катионных липосом и их комплексов с плазмидной ДНК......................................................................................................67

2.3.1.2. Изучение цитотоксичности катионных липосом и доставки с их помощью плазмидной ДНК..............................................................................................................................69

2.3.2. Выбор адресного модуля для МЛТС, нацеленных на асиалогликопротеиновый рецептор............................................................................................................................................71

2.3.2.1. Определение физико-химических характеристик адресных МЛТС..............................72

2.3.2.2. Изучение агглютинации адресных МЛТС в присутствии лектина ЯСАш..................73

3. Экспериментальная часть...........................................................................................................80

3.1. Основные методы.....................................................................................................................80

3.2. Синтез связывающих модулей МЛТС....................................................................................81

3.2.1. Синтез монокатионных амфифилов.....................................................................................81

3.2.2. Синтез поликатионного амфифила......................................................................................85

3.3. Синтез адресных модулей МЛТС...........................................................................................87

3.3.1. Синтез моновалентных неогалактолипидов........................................................................87

3.3.2. Синтез бивалентных неогалактолипидов............................................................................88

3.3.2.1. Синтез гидрофобных и углеводных предшественников.................................................88

3.3.2.2. Синтез бивалентных неогалактолипидов на основе Ь-С1и.............................................96

3.3.2.2. Синтез бивалентных неогалактолипидов на основе 1,3-диаминопропан-2-ола.........110

3.3.2.3. Синтез бивалентных неогалактолипидов на основе спермина....................................115

3.4. Биологические исследования.................................................................................................119

Выводы............................................................................................................................................123

Список литературы........................................................................................................................124

Список сокращений

BGTC - бисгуанидин-трен-холестерин Con А - лектин конканавалин А COSY

DC-Chol - 3 ß-[jV-(7V ,7V' -диметиламиноэтил)карбамоил]холестерин DMRIE - rac-N- [2,3 -ди(терадецилокси)проп-1 -ил] -тУ-(2-гидроксиэтил)-тЧ N-диметиламмоний бромид

DOGS - диоктадециламидо-#-(6-спермилкарбонил)глицин DOPE - 1,2-диолеоил-5?2-глицеро-3-фосфоэтаноламин

DOTMA - гас-Л^-(2,3-Ди(олеилокси)проп-1-ил)-А/,А^Л^-триметиламмоний хлорид DOTAP - гас-//-[2,3-Ди(олеоилокси)проп-1-ил]-А^,7ЧЛ^-триметиламмоний хлорид DOSPA

NLS - сигнал ядерной локализации

N/P - соотношение количества положительно заряженных групп амфифила к количеству отрицательно заряженных фосфатных групп нуклеиновой кислоты ROESY -

siRNA - малая интерферирующая РНК

АГП - асиалогликопротеин

АСГПр - асиалогликопротеиновый рецептор

ДЛС - динамическое лазерное светорассеяние

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИП - индекс полидисперсности

КА - катионный амфифил

КК - Купферовские клетки

KJI - катионные липосомы

КССВ - константа спин-спинового взаимодействия

MJITC - модульная липидная транспортная система

НК - нуклеиновая кислота

ПЭГ - полиэтиленгликоль

РНК - рибонуклеиновая кислота

ТСХ-

ТФ - трансферрин

ФК - фолиевая кислота

ЭСП - эндотелиальные синусоиды печени

ЯМР - ядерный магнитный резонанс

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Введение

Генная терапия - сравнительно новый метод лечения наследственных и приобретенных заболеваний, направленный на устранение генетических дефектов или придания клеткам новых функций [1, 2] за счет введения в них терапевтических нуклеиновых кислот (НК) (трансфекция). Биофармацевтические препараты на основе НК могут контролировать развитие болезни на уровне активации или ингибирования действия генов, ответственных за ее развитие. В качестве терапевтических НК могут выступать плазмидные ДНК, антисмысловые олигонуклеотиды, малые интерферирующие РНК, рибозимы, ДНК-энзимы и аптамеры. Основными проблемами данного метода лечения являются эффективная доставка НК в нужное место в необходимом количестве, а также создание условий для их длительного функционирования [1 - 3].

Начиная с 90-х годов, разрабатываются невирусные системы доставки на основе катионных амфифилов и липосом, а также полимеров, которые являются альтернативой вирусным системам доставки НК [1, 4 - 10]. Катионные амфифилы (КА) и липосомы имеют ряд преимуществ перед вирусными системами доставки: они не обладают инфекционностью и иммуногенностью, способны переносить НК любого размера. Катионные липосомы (КЛ) легко получать, они стабильны при хранении и экономически доступны. Совокупность вышеперечисленных свойств делает КЛ перспективными транспортными системами для доставки НК в эукариотические клетки. Липосомальные ДНК/РНК-препараты рассматриваются как перспективные фармакологические агенты для лечения онкологических заболеваний, неврологических расстройств (болезнь Паркинсона и Альцгеймера), а также терапии сердечно-сосудистых заболеваний [1, 11].

Однако, для известных на сегодняшний день КЛ характерна низкая эффективность доставки НК, обусловленная наличием внеклеточных и внутриклеточных биологических барьеров, которые должен преодолеть НК-липосомальный комплекс (липоплекс), прежде чем НК осуществит терапевтическое воздействие [12].

Поэтому, в настоящий момент разработка стабильных и нетоксичных транспортных систем для переноса терапевтических генов, которые смогут инкапсулировать и доставлять НК в специфические типы клеток с эффективностью, сравнимой с вирусными векторами, является актуальной задачей биоорганической химии, молекулярной биологии и генной терапии.

1.2. Основные стадии транспорта нуклеиновых кислот с участием катионных липосом

Метод доставки НК в составе комплексов с КЛ называется липофекцией и включает несколько этапов, суммарно определяющих эффективность всего процесса трансфекции.

Для осуществления липофекции клеток необходимо приготовить комплексы НК и катионных липосом, которые образуются за счет электростатических взаимодействий между положительно заряженной группой КА и отрицательно заряженной фосфатной группой НК. В результате такой спонтанной самоассоциации в наноразмерные липоплексы НК оказывается защищенной от разрушающего действия нуклеаз. Липоплексы разнообразны по своей структуре и размеру, причем данные параметры определяются типом используемого КА, количественным соотношением НК и катионных липосом, а также способом их приготовления [13].

Первым этапом липофекции является добавление комплексов к эукариотическим клеткам, их взаимодействие с клеточной мембраной и проникновение внутрь клеток. Использование избытка КЛ (количественное соотношение липосом к НК определяется как среднее отношение Ы/Р - соотношение числа положительно заряженных атомов азота КА к отрицательно заряженным фосфатным группам НК) придает поверхности липоплекса положительный заряд, что способствует взаимодействию комплекса с отрицательно заряженной мембраной клетки. Агрегированные на клеточной поверхности липоплексы проникают внутрь клетки посредством эндоцитоза, кроме того, часть комплексов может остаться невостребованной на поверхности клетки. Следующим этапом является высвобождение липоплекса и НК в его составе из эндосом в цитоплазму прежде, чем НК подвергнется деградации в поздних эндосомах и лизосомах. На конечном этапе происходит диссоциация липоплекса под действием различных полианионных молекул, находящихся в цитоплазме. Дальнейшая судьба доставляемой терапевтической НК будет зависеть от ее типа. В случае з1К]ЧА и антисмысловых олигонуклеотидов доставка в цитозоль является завершающей стадией процесса трансфекции, а для плазмидной ДНК и антигенных олигонуклеотидов понадобится транспорт данных НК в ядро клетки и, в случае ДНК, ее экспрессия.

Для успешного выполнения всех этапов липофекции помимо характеристик самих липоплексов необходимо учитывать и наличие вне- и внутриклеточных барьеров (рис. 1) [12].

Рисунок 1.1. Биологические барьеры, возникающие на пути липоплексов

Под внеклеточными барьерами подразумевают нестабильность липоплексов в кровотоке, а также низкую степень взаимодействия с целевыми клетками-мишенями. Системное введение положительно заряженных липоплексов и взаимодействие их с белками крови, такими как опсонины, альбумин, липопротеины высокой и низкой плотности, может привести к ряду неблагоприятных побочных явлений от разрушения липоплексов и инактивации НК до запуска иммунного ответа через активацию системы комплемента [13].

В ходе трансфекции клеток липоплексам приходится также преодолевать внутренние барьеры, главными из которых являются эндосомальная и ядерная мембраны.

Многочисленные исследования показали, что липоплексы проникают в клетку в основном путем эндоцитоза [14], который может реализовываться по различным механизмам: клатрин-опосредованный эндоцитоз (адсорбционный или рецептор-опосредованный), кавеолин-опосредованный эндоцитоз, фагоцитоз, макропиноцитоз [15]. Было установлено, что механизм проникновения зависит от типа используемых КЛ, типа трансфицируемых клеток, а также от размера комплексов. Относительный вклад каждого способа в проникновение липоплексов через плазматическую мембрану до сих пор изучен недостаточно.

После проникновения в клетку высвобождение липоплексов и НК из эндосом является основным препятствием на пути к осуществлению терапевтического воздействия. Относительно слабая трансфицирующая активность многих КЛ является следствием того, что в большинстве случаев липоплексы и НК не способны успешно высвободиться в цитозоль до деградации в поздних эндосомах и лизосомах. Механизм, который реализуется в ходе высвобождения липоплексов из эндосом, зависит от структуры КА, входящих в их состав. Высвобождение липоплексов и НК происходит в основном за счет локальной дестабилизации мембран в результате взаимодействия молекул КА и анионных липидов из эндосомальной мембраны или по механизму «протонной губки» [6].

В случае плазмидной ДНК и антигенных нуклеотидов для успешной трансфекции необходимо преодолеть ядерную мембрану, представляющую собой оболочку, пронизанную «ядерными порами», с помощью которых происходит обмен веществами между ядром и

цитоплазмой [16] Их проводимость различна и зависит от типа транспортируемых молекул, типа клеток и от стадии клеточного цикла. Небольшие по размеру олигонуклеотиды могут проникать через ядерные поры, диаметр которых составляет 4А Большие молекулы ДНК могут проникать в ядро либо напрямую взаимодействуя с белками комплекса ядерных пор или с помощью специальных белков - транспортинов. Транспортины узнают и связываются с определенными пептидными последовательностями, получившими название «сигнал ядерной локализации» (N1.8), что приводит к переносу белков или НК, связанных с МД через ядерную мембрану [17, 18]

Существование и детальное выяснение лимитирующего действия всех внеклеточных и внутриклеточных барьеров стимулировало разработку липосомальных систем доставки, которые эволюционировали от простых липидных молекул к модульным липидным транспортным системам Все компоненты таких систем должны проходить строгую оценку и отбор с точки зрения эффективности доставки НК, а сами системы должны быть нацелены на специфические органы и ткани.

1.3. Модульные липидные транспортные системы для доставки нуклеиновых кислот

Модульная липидная транспортная система (МЛТС) для доставки НК представляет собой самособирающийся транспортный контейнер, построенный из различных не связанных ковалентно липофильных модулей и запрограммированный на выполнение определенных функций связывание и защиту НК, нацеленность на клетки-мишени, эффективное высвобождение НК из эндосом и транспорт в ядро [19, 20]. Такие МЛТС удачно описывает концепция Л.ВС£)-наночастиц (рис. 2) [20].

Ш о

^ " * «л ш

ш: * ї^'Ш'

4

Рисунок 1.2. АВСИ-наночастицы: (А) НК, (В) липидный защитный слой, (С) биосовместимый или «невидимый» слой, (О) слой биологического распознавания [20]

Ядро АВ представляет собой комплекс НК с катионными липосомами, покрытое защитным слоем С, который обеспечивает целостность частицы в биологических жидкостях, делая ее невидимой для белков сыворотки крови. Слой D обеспечивает активный транспорт транспортных систем к целевым клеткам.

Таким образом, чтобы такая модульная система работала как эффективный переносчик, к ней предъявляют следующие требования [19-21]:

1. Наличие нескольких липофильных модулей:

- связывающий и защищающий модуль - катионные липосомы - для электростатического связывания НК и защиты от действия нуклеаз.

- биосовместимый и стабилизирующий модуль - для снижения степени взаимодействия с молекулами-дезактиваторами (альбумин, липопротеиды низкой плотности, макроглобулины, гепарин) и увеличения времени циркуляции НК в организме;

- адресный модуль - для направленного транспорта НК и более эффективной интернализации внутрь клетки-мишени;

- модуль с последовательностью NLS для активного перемещения НК в ядро (в случае

ДНК).

- дополнительные функциональные модули, «помогающие» основным модулям осуществлять свои ф�