Синтез адресных липоконъюгатов для изучения направленной доставки нуклеиновых кислот в клетки-мишени тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

Шмендель Елена Васильевна

СИНТЕЗ АДРЕСНЫХ ЛИПОКОНЪЮГАТОВ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ НАПРАВЛЕННОЙ ДОСТАВКИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В КЛЕТКИ-МИШЕНИ

02.00.10 - Биоорганическая химия

5 ДЕК 2013

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

005541480

Москва 2013

005541480

Работа выполнена на кафедре химии и технологии биологически активных соединений им. H.A. Преображенского федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова"

Научный руководитель

Доктор химических наук, доцент Маслов Михаил Александрович

Официальные оппоненты

Член-корреспондент РАН, доктор химических наук, Костров Сергей Викторович профессор, директор, заведующий Отделом молекулярных основ биотехнологии и белковой инженерии Института молекулярной генетики РАН

Кандидат химических наук, научный сотрудник Болдырев Иван Александрович лаборатории химии липидов Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Ведущая организация Институт органической химии

им. Н.Д. Зелинского РАН

Защита диссертации состоится "23" декабря 2013 г. в 14.00 часов в аудитории М-119 на заседании Диссертационного Совета Д 212.120.01 при Московском государственном университете тонких химических технологий имени М. В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, пр. Вернадского, 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, пр. Вернадского, 86.

Автореферат разослан «22» ноября 2013 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат химических наук,

старший научный сотрудник У] / А.И. Лютик

ОБЩАЯ ХАРАКТИРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние десятилетия предложен новый подход к терапии наследственных и приобретенных заболеваний, который основан на коррекции генетических нарушений с помощью терапевтических нуклеиновых кислот (НК). По химической природе НК являются полианионами и не способны самостоятельно проникать через биологические мембраны в пораженные клетки (клетки-мишени). Для решения этой проблемы создаются системы доставки НК, которые можно подразделить на биологические (вирусы) и искусственные (липосомы, полимеры). Вирусные системы переносят НК с высокой эффективностью, реализуя заложенные в их природе механизмы. Однако для них характерны иммуногенность, онкогенность, способность переносить НК ограниченного размера и высокая стоимость. Искусственные системы доставки НК лишены этих недостатков, но к настоящему времени не создано еще ни одной системы, сравнимой по эффективности с вирусными векторами.

Одним из важных требований, которые предъявляют к современным невирусным системам доставки, является способность направленно переносить НК в специфические клетки-мишени, что позволяет, с одной стороны, повысить эффективность таких систем, а с другой - уменьшить их неспецифическое поглощение здоровыми клетками, что должно положительно отразиться на безопасности систем доставки.

Известно, что на мембранах клеток определенных органов и тканей экспонированы специфические рецепторы, которые селективно распознают, связывают и поглощают молекулы (лиганды) определенного строения. Так, асиалогликопротеиновые рецепторы гепатоцитов связывают молекулы с терминальными остатками О-галактозы и Л^ацетил-Р-галактозамина, рецепторы дендритных клеток распознают остатки о-маннозы. Кроме того, различные патологические состояния могут характеризоваться повышенной экспрессией рецепторов определенного типа. Например, на мембранах опухолевых клеток при раке яичников, матки, толстой кишки, молочной железы, легких и почек, так же как и при опухолях, метастазирующих в головной мозг, наблюдается гиперэкспрессия фолатных рецепторов, которые селективно связывают и поглощают молекулы фолиевой кислоты. Таким образом, модификация поверхности липосомальных систем доставки НК лигандами, которые узнаются и связываются рецепторами клеток-мишеней, позволяет осуществить направленную доставку НК к месту ее терапевтического воздействия с помощью механизма рецептор-опосредованного эндоцитоза.

Данная работа посвящена синтезу липоконъюгатов, содержащих в качестве адресных лигандов остатки фолиевой кислоты или углеводов, конструированию с их помощью

липосомальных систем доставки НК и исследованию их способности осуществлять направленный транспорт НК в клетки-мишени.

Работа является частью научных исследований, проводимых на кафедре ХТБАС им. H.A. Преображенского МИТХТ им. М.В. Ломоносова в рамках тематического плана "Фундаментальные исследования в области синтеза, изучения свойств природных биологически активных соединений и их аналогов с целью создания лекарственных субстанций для лечения социально значимых заболеваний человека", а также в рамках ФЦП "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" (госконтракт П715) и грантов РФФИ 09-03-00874-а, 10-03-00995-а и 13-04-40183-н комфи.

Целью работы является разработка подходов к синтезу липоконъюгатов, содержащих в качестве лигандов к специфическим рецепторам клеток-мишеней фолиевую кислоту, D-галактозу или D-маннозу, включение их в состав адресных липосомальных систем доставки НК и исследование их биологических свойств.

Научная новизна работы. Разработаны подходы и осуществлен синтез новых фолат- и углеводсодержащих липоконъюгатов, предназначенных для модификации катионных липосом с целью придания им направленности к определенным рецепторам клеток-мишеней. Полученные липоконъюгаты, различающиеся типами лигандов, спейсерных и линкерных групп, использованы для создания адресных липосомальных систем доставки НК. Установлена зависимость трансфицирующей активности фолатсодержащих адресных липосом от структуры и количественного содержания в них адресных липоконъюгатов. Выявлены соотношения между количеством НК и адресных катионных липосом, необходимые для осуществления рецептор-опосредованного переноса НК. Показано, что липосомы, в состав которых входит 1.5% фолатсодержащего липоконъюгата с 20-звенным этиленгликольным спейсером, обеспечивают наиболее эффективную направленную доставку НК. С помощью маннозилсодержащих липосом осуществлена эффективная трансфекция незрелых дендритных клеток и их CD11с+ предшественников.

Практическая значимость. Предложены удобные подходы к получению фолат- и углеводсодержащих липоконъюгатов и получены 15 новых соединений в количествах, необходимых для проведения расширенных биологических испытаний. Разработана двухстадийная процедура, включающая твердофазную экстракцию и колоночную хроматографию на силикагеле, которая позволяет успешно выделять фолатсодержащие липоконъюгаты. На основе синтезированных липоконъюгатов созданы адресные липосомальные системы доставки НК к специфическим клеткам-мишеням, а исследование их трансфицирующей активности позволило выявить перспективные системы для дальнейшего осуществления направленной доставки НК в условиях in vivo.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Синтез новых липоконъюгатов, содержащих в качестве лиганда фолиевую кислоту, Б-галактозу и О-маннозу.

2. Создание на основе синтезированных липоконъюгатов адресных катионных липосом и изучение их цитотоксичности и трансфицирующей активности.

Апробация работы. Основные результаты диссертации были представлены на III, IV и V молодежной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии» (Москва, 2009, 2011, 2013), XIX Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Волгоград, 2011), XIV Международной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии - 2012» (Тула, 2012).

Публикации. По результатам работы опубликовано 8 печатных работ, в том числе 3 статьи в ведущих отечественных научных журналах.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 119 страницах машинописного текста и состоит из введения, литературного обзора, обсуждения полученных результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (140 ссылок). Работа проиллюстрирована 24 рисунками и содержит 5 схем и 6 таблиц.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Направленная доставка НК в клетки-мишени может быть реализована при использовании катионных липосом, в состав которых входит липидный конъюгат с лигандом, селективно распознающимся и связывающимся специфическими клеточными рецепторами.

Такой липоконъюгат состоит из гидрофобного домена, связанного спейсерной группой с терминальным адресным лигандом (рис. 1). В качестве гидрофобного домена, обеспечивающего встраивание конъюгата в липидный бислой, был использован остаток 1,2-ди-О-тетрадецил-гас-глицерина, который ранее применялся в нашей лаборатории для синтеза компонентов липосомальных систем доставки НК. Известно, что длина и природа спейсерной группы определяют доступность лиганда для последующего взаимодействия с рецептором. Поэтому получение липоконъюгатов с гидрофобными и гидрофильными спейсерами различной длины (рис. 1) позволит в дальнейшем изучить влияние данного структурного элемента на эффективность доставки НК. В качестве адресных лигандов нами были выбраны: фолиевая кислота, проявляющая высокую специфичность к фолатным рецепторам опухолевых клеток, Б-галактоза, селективно связывающаяся с асиалогликопротеиновыми рецепторами гепатоцитов, и О-манноза, которая является лигандом для рецепторов дендритных клеток.

Присоединение лиганда к гидрофобному домену может быть осуществлено с использованием различных химических методов. Однако наибольшее распространение

позволил получить синтоны 6а-% в одну стадию с выходами 57 - 73%. Таким образом, реализация данного подхода позволила сократить количество стадий синтеза, время и затраты на получение ключевых синтонов а также увеличить их выходы в 1.5 - 2 раза.

Для синтеза гликоконъюгатов II типа был получен синтон с терминальной карбоксильной группой (синтон Б, рис. 1), обработкой соединения 6Ь янтарным ангидридом с образованием карбоксилсодержащего производного 7 с выходом 97%.

Таким образом, на данном этапе в структуру 1,2-ди-О-тетрадецил-гаоглицерина были введены спейсерные группы различной длины и природы, что привело к синтонам и 7 (А и Б, рис. 1), содержащим терминальные амино- и карбоксильную группы для дальнейшего присоединения по ним адресных лигандов.

1.2. Связывание адресных лигандов с функционализированными диглицеридами

1.2.1. Синтез фолатсодержащих липоконъюгатов

Синтез фолатсодержащих липоконъюгатов осуществляли взаимодействием синтонов 6а-£ с фолиевой кислотой (ФК) в присутствии Л',ДЛ'',Л''-тетраметил-0-(бензотриазол-1-ил)уроний тетрафторбората (ТВТи) и диизопропилэтиламина (01РЕА) (схема 2). Поскольку полученные фолатные липоконъюгаты 8а^ обладают ярко выраженными амфифильными свойствами, процесс их очистки с использованием обычной колоночной хроматографии на силикагеле не позволяет выделить соединения в индивидуальном состоянии.

Схема 2

ЕОС14Н29 а [— OC14H29

ОС„Н29 ---Ьос„н29

o_nh-x-nh2 lcx.nh-x-nh

Y о

О о 6a-g

а: X = -(СН2)4-Ь: X = -(СН2)6-с: X = -(СН2)8-d: X = -(СН2)12-

н^/г

ГО'

Реагенты и условия: (а) ФК, ТВТи, 01РЕА, 45 °С, 2 ч.

Нами была разработана двухстадийная процедура2 очистки соединений 8а^, которая включает твердофазную экстракцию в градиентном режиме в системе растворителей СНСЬ-МеОН-водный N1-13 и колоночную хроматографию на силикагеле. Благодаря твердофазной экстракции из реакционной смеси удалялись ДМСО и избыток ФК, а колоночная хроматография позволила избавиться от ТВТи и других продуктов реакции. В результате новые фолатсодержащие липоконъюгаты 8а-£ были выделены с выходами 39 - 68%.

2 совместно с к.х.н., ст. преп. кафедры БТ и БНТ Ереминым C.B.

8

1.2.2. Синтез гликоконъюгатов

Для синтеза гликоконъюгатов со спейсерными группами различной длины и типа было разработано два подхода. Первый основан на использовании хемоселективного реагента диэтилскварата, который позволяет связать друг с другом две молекулы - синтон А и производные углевода с терминальными аминогруппами. Второй подход построен на взаимодействии синтона Б, содержащего терминальную карбоксильную группу, с аминопроизводными углеводов с образованием амидной связи.

Для осуществления этих подходов необходимо было предварительно модифицировать углеводы спейсерами с терминальной аминогруппой (схема 3).

Схема 3

а .. с или d

_ R __ -sug-o^^NH2.Hx

9а, R = NHBoc 10a, R = NHBoc (43%) 11a, X = Cl (97%)

9b, R = Cl с ЮЬ, R = Cl (40%) 11b, X = OTs(36%)

v10c, R=N3(96%)

Жс X°ac

10a, 11a, 4AcSug = АсОЛ-^Л/ 10b, 10c, 11b, 4AcSug = ^¿X^Si

OAc |

Реагенты и условия: (а) 2,3,4,6-тетра-0-ацетил-а-0-галактопиранозилбромид, CdC03, С6Н6, 80 °С или 2,3,4,6-тетра-О-ацетил-а-О-маннопиранозилбромид, Hg(CN)2, CH2Cl2, 24 °С; (Ь) NaN3, DMF, 80 °С; (с) 4 МНС1, диоксан, 0 °С; (d) 10% Pd/C, NH„+HCOO\ МеОН, TsOH, 65 °С.

Для синтеза галактозида 11а в качестве исходного соединения использовали б-(трет-бутоксикарбониламино)гексанол (9а), который вводили во взаимодействие с 2,3,4,6-тетра-О-ацетил-а-О-галактопиранозилбромидом в условиях модифицированного метода Кенигса-Кнорра (при использовании в качестве промотора CdCCb), получая ß-гликозид 10а с выходом 43%. Присутствие в спектре ЯМР 'Н сигнала аномерного протона с химическим сдвигом 8н 4.37 м.д. и КССВ J|>2 = 7.9 Гц, а в спектре ЯМР |3С сигнала аномерного атома углерода с химическим сдвигом 6с 100.78 м.д. указывает на ß-конфигурацию гликозидной связи. После удаления трет-бутоксикарбонильной защитной группы действием 4 М раствора HCl в диоксане получили соединение 11а с выходом 97%.

В синтезе маннозида IIb был использован другой подход, основанный на гликозилировании 6-хлоргексанола (9Ь) 2,3,4,6-тетра-0-ацетил-а-0-маннопиранозилбромидом по методу Гельфериха в присутствии Hg(CN)2 в качестве промотора (схема 3). После колоночной хроматографии был получен а-маннозид ЮЬ с выходом 40%. а-Конфигурация аномерного центра была подтверждена данными спектроскопии ЯМР. Так, в спектре ЯМР 'Н присутствовал сигнал аномерного протона с химическим сдвигом 6н 4.73 м.д. и КССВ Ju =

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова"

на правах рукописи

04201451657

Шмендель Елена Васильевна

СИНТЕЗ АДРЕСНЫХ ЛИПОКОНЪЮГАТОВ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ НАПРАВЛЕННОЙ ДОСТАВКИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В КЛЕТКИ-МИШЕНИ

02.00.10 - Биоорганическая химия

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель д.х.н., доц. Маслов М.А.

Москва 2013

Оглавление

Список сокращений........................................................................................................5

Введение.............................................................................................................................7

1. Литературный обзор...................................................................................................9

1.1. Направленная доставка НК в эукариотические клетки.......................................................9

1.1.1. Рецептор-опосредованный эндоцитоз..............................................................................10

1.2. Типы адресных лигандов и их использование для доставки различных терапевтических агентов..............................................................................................................11

1.2.1. Использование фолиевой кислоты в качестве адресного лиганда................................11

1.2.1.1. Адресная доставка терапевтических НК с помощью фолатсодержащих транспортных систем...................................................................................................................13

1.2.1.2. Адресная доставка противоопухолевых препаратов в опухолевые клетки...............16

1.2.1.3. Адресная доставка терапевтических молекул для лечения воспалительных заболеваний...................................................................................................................................21

1.2.2. Использование маннозы в качестве адресного лиганда.................................................22

1.2.2.1. Дендритные клетки.........................................................................................................22

1.2.2.2. ДНК-вакцинация..............................................................................................................25

1.2.2.3. Рецептор маннозы...........................................................................................................27

1.2.3 Галактоза и ее производные...............................................................................................29

1.2.3.1. Доставка нуклеиновых кислот с помощью углеводсодержащих липосом................31

1.2.3.2. Использование неогалактоконъюгатов для лечения заболеваний печени................33

1.3. Заключение.............................................................................................................................35

2. Обсуждение результатов..........................................................................................37

2.1. Синтез липоконъюгатов с адресными лигандами различных типов................................38

2.1.1. Присоединение спейсерной группы к 1,2-ди-О-тетрадецил-гас-глицерину................39

2.1.2. Связывание адресных лигандов с функционализированными диглицеридами...........43

2.1.2.1. Синтез фолатсодержащих липоконъюгатов.................................................................43

2.1.2.2. Синтез гликоконъюгатов................................................................................................45

2.2. Создание и исследование свойств адресных липосомальных систем доставки нуклеиновых кислот в клетки-мишени......................................................................................50

2.2.1. Определение цитотоксичности адресных катионных липосом.....................................52

2.2.2. Изучение трансфицирующей активности адресных катионных липосом....................55

2.2.2.1. Изучение влияния соотношения компонентов липоплексов на адресную доставку НК в эукариотические клетки.....................................................................................56

2.2.2.2. Скрининг адресных липосом с фолатсодержащими липоконъюгатами по трансфицирующей активности...................................................................................................60

2.2.2.3. Оценка способности адресных липосом направленно доставлять НК в клетки, экспрессирующие фолатные рецепторы....................................................................................64

2.2.2.4. Доставка плазмидной ДНК в дендритные клетки с помощью

маннозилсодержащих адресных липосом..................................................................................66

3. Экспериментальная часть.......................................................................................70

3.1. Основные методы..................................................................................................................70

3.2. Синтез липоконъюгатов с адресными лигандами различных типов................................71

3.2.1. Присоединение спейсерной группы к 1,2-ди-О-тетрадецил-гас-глицерину................71

3.2.2. Присоединение адресных лигандов к функционализированным диглицеридам........80

3.2.2.1. Синтез фолатсодержащих липоконъюгатов.................................................................80

3.2.2.2. Синтез гликоконъюгатов................................................................................................84

3.3. Создание и исследование свойств адресных липосомальных систем доставки нуклеиновых кислот в клетки-мишени......................................................................................99

3.3.1. Приготовление адресных катионных липосом................................................................99

3.3.2. Олигонуклеотиды и плазмидная ДНК..............................................................................99

3.3.3. Приготовление комплексов КЛ/НК................................................................................100

3.3.4. Определение размера и поверхностного потенциала липосом и их комплексов с нуклеиновыми кислотами..........................................................................................................100

3.3.5. Электрофорез....................................................................................................................100

3.3.5.1. Электрофорез в ПААГ в нативных условиях.............................................................100

3.3.5.2. Электрофорез в агарозном геле....................................................................................101

3.3.6. Клеточные культуры........................................................................................................101

3.3.7. Исследование цитотоксичности с помощью МТТ-теста..............................................101

3.3.8. Трансфекция клеток комплексами, сформированными FITC-ODN и КЛ..................102

3.3.9. Трансфекция клеток комплексами, сформированными pEGFP-C2 и KJI...................102

3.3.10. Проточная цитометрия...................................................................................................102

3.3.11. Доставка нуклеиновых кислот в дендритные клетки.................................................103

3.3.11.1 CDI 1с+ предшественники ДК.....................................................................................103

3.3.11.2 Незрелые ДК.................................................................................................................104

3.3.11.3. Трансфекция CD11 с+ предшественников и незрелых ДК......................................104

ВЫВОДЫ......................................................................................................................105

Список литературы.....................................................................................................106

Список сокращений

Вое - wpe/w-бутоксикарбонил

Chol - холестерин

CHEMS - холестерилгемисукцинат

COSY - гомоядерная корреляционная спектроскопия ЯМР DOPE - 1,2-диолеоил-лтг-глицеро-З-фосфоэтаноламин

DOTMA - гас-Л^-(1-(2,3-Диолеилокси)пропил)-Л',Л',уУ-триметиламмоний хлорид DIPEA - диизопропилэтиламин DMF - диметилформамид

DSPE - 1,2-дистеароил-5«-глицеро-3-фосфоэтаноламин EGFP - зеленый флуоресцентный белок FBS - эмбриональная телячья сыворотка

FITC-ODN - флуоресцеин-меченный олигодезоксирибонуклеотид

HBTU - 0-( 1 -//-Бензотриазол-1 -ил)-^N, NN'-тетраметилурониум гексафторфосфат

ODN - олигодезоксирибонуклеотид

МНС - главный комплекс гистосовместимости

МТТ - 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромид PBS - натрий-фосфатный буфер PEG - полиэтиленгликоль

P/N - соотношение количества отрицательно заряженных фосфатных групп НК к количеству положительно заряженных атомов азота KJI

siRNA - малая интерферирующая РНК

TBTU - N,N,N',N'-тетраметил-0-(бснзотриазол-1 -ил)уропий тетрафторборат

Thl - воспалительный иммунный ответ

Th2 - противовоспалительный иммунный ответ

АГПр - асиалогликопротеиновый рецептор

АПК - антигенпредставляющие клетки

ДК- дендритные клетки

ДМСО - диметилсульфоксид

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИП- индекс полидисперсности

КЛ - катионные липосомы

КССВ - константа спин-спинового взаимодействия

ЛНП - липопротеины низкой плотности

ЛВП - липопротеины высокой плотности

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

нДК - незрелые дендритные клетки

НК - нуклеиновая кислота

ПАБК - шра-аминобензойная кислота

ПЭГ - полиэтиленгликоль

РНК - рибонуклеиновая кислота

ТА - трансфицирующая активность

ТРК - транс-ретиноевые кислоты

ТСХ - тонкослойная хроматография

ТЭМ - трансмиссионная электронная микроскопия

ФК - фолиевая кислота

ФР - фолатный рецептор

ЯМР - ядерный магнитный резонанс

Введение

Многие заболевания, вызванные генными аномалиями, не поддаются лечению обычной терапией. Последние научные разработки в области молекулярной биологии привели к возникновению генной терапии, одной из самых перспективных развивающихся областей, направленной создание новых лекарственных препаратов для устранения дефектов, вызванных мутациями (изменениями) в структуре ДНК, или для придания клеткам новых функций [1]. Генная терапия основывается на введении функциональных последовательностей нуклеиновых кислот в клетки-мишени для лечения наследственных патологий, например кистозного фиброза [2], или онкологических, инфекционных и сердечно-сосудистых заболеваний [3]. С момента успешного использования генной терапии в клинике в 1995 г. более 1400 клинических протоколов были разработаны и осуществлены по всему миру.

В генной терапии используются препараты на основе нуклеиновых кислот (НК), которые включают плазмидные ДНК, антисмысловые олигонуклеотиды, малые интерферирующие РНК, рибозимы, ДНК-энзимы и аптамеры. Основными проблемами успешной коррекции генетического отклонения являются эффективная доставка НК в нужное место в необходимом количестве, а также создание условий для их длительного функционирования. В генной терапии используется три различных подхода для осуществления транспорта НК. В первом подходе используются различные физические методы, которые позволяют доставить «незащищенную» (naked) молекулу ДНК в клетку. Второй включает использование генетически измененных вирусов, которые очень эффективны с точки зрения доставки НК и последующей экспрессии трансгена [4]. Однако их широкое применение ограничивается иммуногенностыо и онкогенностыо. В третьем подходе для транспорта НК применяют искусственные невирусные системы доставки на основе катионных липосом [4, 5], которые обладают преимуществами по сравнению с вирусными системами доставки; они защищают молекулы НК от инактивации под действием клеточных ферментов, не обладают инфекционностью и иммуногенностью, способны переносить НК любого размера. В настоящее время

липосомальные ДНК/РНК-препараты рассматриваются как перспективные фармакологические агенты для лечения онкологических заболеваний, неврологических расстройств (болезнь Паркинсона и Альцгеймера), а также терапии сердечно-сосудистых заболеваний [4].

Однако, существующие на сегодняшний день липосомы далеки от идеала, что связано с низкой эффективностью и специфичностью доставки НК. Ожидается, что модификация поверхности липосом адресными лигандами, способными связываться с рецепторами специфических клеток-мишеней, позволит увеличить эффективность процесса транспорта НК.

Данная работа посвящена созданию липосомальных систем доставки НК и представляет собой комплексное исследование, в котором разработан и проведен синтез адресных липоконъюгатов, получены адресные катионные липосомы, исследована их цитотоксичность и способность опосредовать направленный транспорт НК в различные клетки-мишени.

1. Литературный обзор

1.1. Направленная доставка НК в эукариотические клетки.

Доставка терапевтических НК в «нужное время» и в «нужное место» организма

\

является не простой задачей. При инъекционном введении НК непосредственно в ткань она очень быстро дренируются в лимфатическую систему. Кроме того вне своей нормальной биологической среды НК инактивируются ферментами (ДНК-азами, РНК-азами). Потому для проявления своего терапевтического действия НК должна быть помещена в «переносчик», способный осуществить направленный транспорт НК к специфическим клеткам-мишеням.

Использование в качестве «переносчика» катионных липосом позволяет предохранить НК от взаимодействия с компонентами окружающей биологической среды, тем самым, защитив их от преждевременной деградации [6], что способствует увеличению количества НК в целевых органах и эффективности внутриклеточного проникновения.

Электростатическое взаимодействие отрицательно заряженных молекул НК и положительно заряженных катионных липосом приводит к образованию наноразмерных комплексов (липоплексы). Количественное соотношение между НК и катионными липосомами (соотношение P/N) определяет поверхностный заряд (^-потенциал) липоплексов, который влияет на эффективность доставки НК. Клеточная поверхность заряжена отрицательно за счет наличия сульфированных гликопротеинов, сиаловых кислот, а также отрицательно заряженных липидов [7]. Поэтому положительно заряженные липоплексы эффективно взаимодействуют с отрицательно заряженной клеточной мембраной за счет электростатического взаимодействия и проникают внутрь клетки с помощью неспецифического адсорбционного эндоцитоза [8,9].

Известно, что липосомы способны пассивно накапливаться в патологически измененных тканях (например, опухолях), благодаря EPR (enhanced permeability and retention) эффекту. Однако, несмотря на то, что пассивное нацеливание является основным подходом в терапии онкологических заболеваний, оно имеет ряд недостатков. Во-первых, пассивное накопление сложно контролировать, что ведет к развитию множественной лекарственной устойчивости к препаратам [10]. Во-вторых, для опухоли с нарушенной проницаемостью EPR эффект может не работать.

Для решения проблемы направленной доставки НК необходимо создавать липосомы, которые после проникновения из сосудов в ткани будут способны связываться с рецепторами, расположенными на поверхности клеток. Это связывание может быть

достигнуто введением в состав липосом липофильных молекул, содержащих в своей структуре адресные лиганды, способные с высокой селективностью связываться с рецепторами, сверхэкспрессирующимися в клетках-мишенях.

1.1.1. Рецептор-опосредованный эндоцитоз

При взаимодействии лиганда с рецептором запускается процесс рецептор-опосредованного эндоцитоза (рис. 1.1) [9].

Рисунок 1.1. Схема рецептор-опосредованного эндоцитоза [3].

Взаимодействие лиганда с внеклеточным рецептором плазматической мембраны приводит к образованию углублений, которые "втягиваются" в клеточную цитоплазму, где затем отщепляются с образованием везикул, покрытых белком - клатрином. Вскоре после образования, везикулы теряют белковую оболочку и сливаются с себеподобными везикулами и специализированными мембранными органеллами - эндосомами, образуя ранние эндосомы. В большинстве случаев, в этом процессе с парой лиганд-рецептор и переносимыми терапевтическими молекулами не происходит никаких изменений. Тем не менее, уменьшение рН и любое незначительное изменение окружающей среды в эндосоме может привести к частичной диссоциации лиганда и рецептора.

Во время процесса "созревания" ранних эндосом в поздние эндосомы, изменяется рН эндосомальной среды и происходит проникновение ферментов из аппарата Гольджи, что приводит к полной диссоциации лиганда и рецептора и транспорту рецепторов обратно на клеточную поверхность. Однако часть поглощенных рецепторов остается в эндосомах и подвергается деградации. Переносимые терапевтические молекулы также могут отделяться от лиганда или носителя и высвобождаться из ранних или поздних

эндосом. Поздние эндосомы в итоге взаимодействуют с лизосомами, при этом происходит уменьшение значения эндосомального рН до 4.5-5. В большинстве случаев, именно на этом этапе происходит высвобождение в цитоплазму терапевтических НК [11].

Доставка НК с помощью адресного нацеливания возможна в любые клетки, сверхэкпрессирующие рецептор, который будет специфично узнавать, и связывать лиганд определенной структуры. Для увеличения нацеливания могут быть использованы мультивалентные лиганды, которые обеспечивают более сильное взаимодействие лиганда с рецептором, чем моновалентные. Например, системы доставки, связанные с 3-15 молекулами фолиевой кислоты, обладают в 2500-170000 раз большим сродством к рецепторам по сравнению со свободной фолиевой кислотой [12, 13].

1.2. Типы адресных лигандов и их использование для доставки различных терапевтических агентов

Среди адресных лигандов наиболее часто используются малые молекулы, такие как витамины и углеводы, пептиды, так как они обладают простой структурой, легко конъюгируются с другими молекулами и не проявляют иммуногенных свойств.

1.2.1. Использование фолиевой кислоты в качестве адресного лиганда

Фолиевая кислота (ФК) - водорастворимый витамин группы В (витамин В9), необходимый для синтеза нуклеотидов, а следовательно, для роста и развития всех клеток. Кроме того, для создания 8-аденозилметионина, субстрата при метилировании ДНК, гистонов, в-белков и многих метаболических строительных блоков также требуется ФК

Фолиевая кислота состоит из трех структурных единиц: остатка 2-амино-4-окси-6-метилптеридина (I), и-аминобензойной (II) и L-глутаминовой (III) кислот.

[14].

О^ОН

он

H2N N N

2 Н

__ ._

Y

"V

J

II

III

Коферментные фун�