Синтез и изучение свойств положительно заряженных гидрофобных производных циклических и ациклических полиолов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

2.1. Введение

2.2. Структура и химический синтез катионных амфифилов

2.2.1. Катионные глицеролипиды с длинноцепными алкильными и ацильными заместителями

2.2.2. Производные холестерина

2.2.3. Липофильные производные полиаминов, аминокислот и пептидов

2.2.4. Амфифильные производные имидазола и пиридина

2.2.5. Четвертичные аммониевые соли-сурфаюганты

2.2.6. Катионные производные полиолов

2.3. Взаимосвязь структуры и активности

2.3.1. Липиды, содержащие холестерин

2.3.2. Липиды, содержащие алифатические углеводородные заместители

Впечатляющие достижения молекулярной биологии и генетики в изучении тонкой структуры генов эукариот, их картировании на хромосомах млекопитающих, успехи проекта «Геном человека» в идентификации и клонировании генов, мутации которых проводят к многочисленным наследственным болезням, а также бурный рост в области биотехнологии и генной инженерии явились необходимыми предпосылками для того, чтобы от опытов на животных и теоретических построений уже в 1989 году перейти к лечению моногенных заболеваний. Успех первых клинических испытаний явился мощным стимулом для ускоренного развития новых терапевтических методов применительно к наследственным болезням, генетическая коррекция которых уже возможна в обозримом будущем. Одновременно с развитием исследований в области генокоррекции наследственных дефектов успешным также оказались поиски методов терапевтического использования смысловых последовательностей ДНК для лечения ненаследственных заболеваний, и главным образом злокачественных опухолей и вирусных инфекций.

Решающим условием успешной генотерапии является обеспечение эффективной доставки, то есть трансфекции или трансдукции (при использовании вирусных векторов) чужеродного гена в клетки-мишени, обеспечение длительного функционирования его в этих клетках и создание условий для полноценной работы гена.

Основные методы доставки чужеродных генов в клетки разделяются на химические, физические и биологические. Несмотря на усилия многих лабораторий мира, все уже известные и испытанные in vitro и in vivo системы доставки экзогенов далеки от совершенства и имеют свои преимущества и недостатки. В последние годы предложены новые способы доставки ДНК в соматические клетки. Один из таких подходов основывается на использование катионных липосом — искусственных мембранных структур, приготовленных их смеси природных и синтетических (катионных) липидов. Такие липосомы, взаимодействуя с ДНК, образуют комплексы, которые эффективно переносят генетический материал во внутреннее пространство клеток посредством эндоцитоза.

Следует отметить, что катионным липосомам присущи такие важные свойства как неинфекционность, способность переносить плазмидную ДНК практически неограниченного размера и защищать ее от действия клеточных ферментов (в этом отношении они превосходят вирусные векторы). Кроме того, катионные липосомы легко получать, они стабильны при хранении. Все эти свойства делают катионные липосомы перспективными транспортными «контейнерами» генов. Вследствие чего, создание новых биодеградируемых и мало токсичных катионных липидов, которые снабжали бы липосомы не только подходящими липидными составляющими, но и специальными лигандами, экспонированными на поверхности этих катионных липосом, является перспективным направлением в генной терапии.

Помимо генной терапии, среди представителей катионных глицеролипидов были обнаружены эффективные антагонисты сильнодействующего липидного биорегулятора — фактора активации тромбоцитов (ФАТ). Кроме того, среди них выявлены соединения, обладающие противоопухолевой и антивирусной активностью, которая подтверждается экспериментами с разнообразными in vivo и in vitro биологическими моделями.

Таким образом, создание новых положительно заряженных липидов с целью их использования в биохимических исследованиях и выявления среди них эффективных медиаторов процесса трансфекции эукариотических клеток, а также веществ с расширенным спектром терапевтического действия является актуальным направлением биоорганической химии и биотехнологии. Настоящая работа выполнена в соответствии с планом научных исследований кафедры ХТТОС МИТХТ им. М. В. Ломоносова по теме № 1Б-18-865 «Получение природных и модифицированных глицеро- и гликолипидов, субстратов липоксигеназ с различным набором гидрофобных и гидрофильных групп с целью создания на их основе препаратов медицинского, экологического назначения и использования для проведения биохимических и биофизических исследований» и в соответствии с Федеральной целевой научно-технической программой «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники гражданского назначения. Генодиагностика и генотерапия социально значимых заболеваний человека». 7

На защиту выносятся следующие основные положения: синтез катионных глицеролипидов с различным набором гидрофобных и положительно заряженных заместителей, представленных гетероциклическими и алифатическими аминами удобный метод синтеза катионных глицеролипидов на основе метилтиометиловых эфиров разработка метода синтеза углеводсодержащих катионных липидов для изучения возможности их применения для направленного переноса генов в эукариотические клетки изучение токсичности и биологической активности (липофекция) полученных соединений в экспериментах in vitro.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

КАТИОННЫЕ АМФИФИЛЫ ЛИПИДНОЙ И НЕЛИПИДНОЙ ПРИРОДЫ

В ГЕННОЙ ТЕРАПИИ

2.1. Введение

Быстрое развитие технологии рекомбинантных ДНК, разработка методов доставки плазмидных ДНК в клетки, выяснение молекулярных основ многих заболеваний привело к возникновению новой области медицины — генной терапии. На сегодняшний день генную терапию можно рассматривать как комплексный метод лечения наследственных и приобретенных заболеваний, который заключается во введении корректирующих генов в клетки с целью направленного изменения генных дефектов. Главным условием успешной коррекции генетического заболевания являются эффективная доставка экзогенного гена в клетки-мишени, создание условий для его экспрессии и обеспечение его длительного функционирования [1].

Генетическая модификация соматических клеток может проводиться методом in vivo либо ex vivo. В настоящее время для доставки экзогенов широко исследованы и развиты такие методы трансфекции, как соосаждение ДНК с фосфатом кальция, электропорация, бомбардировка заряженными частицами, инъекция ДНК, методы, использующие различные рекомбинантные вирусы, липосомы и рецептор-опосредованный эндоцитоз. Каждый из перечисленных методов трансфекции имеет свои ограничения и области применения.

Среди прочих в последнее десятилетие стал широко изучаться метод липофекции, использующий катионные липосомы как средство доставки экзогенных генов [1,2]. Катионные липосомы имеют ряд преимуществ по сравнению с вирусными векторами: защищают молекулы ДНК, мРНК или олигонукпеотидов от инактивации под действием клеточных ферментов, не инфекционны и не иммуногенны, обладают возможностью для направленного транспорта к определенным типам клеток. Катионные липосомы легко получать, они стабильны при хранении и экономически доступны. Все эти свойства катионных липосом делают их перспективными кандидатами для транспорта генов.

Катионные липосомы конструируют из катионного амфифила, для которого в настоящее время предложено название цитофекгин (су^^есйп; суйэ- клетка и 4есПп от трансфекции (transfection))1 и "строительного" липида (липида-хелпера). Однако в некоторых случаях участие липида-хелпера не является необходимым.

Для направленного поиска новых катионных липидов необходима выработка структурных требований, которая должна базироваться на понимании клеточных механизмов генетического транспорта и определении лимитирующих стадий процесса липофекции. От этого также зависит разработка рациональных подходов к методам доставки, а также проверка гипотез, связанных с клеточными и молекулярными механизмами протекания трансфекции.

Для осуществления трансфекции с использованием катионных липидов на первом этапе необходимо сформировать липосомы, а затем их комплексы с плазмидной ДНК — носителем терапевтического гена (рис. 1). Такие комплексы, получившие название геносомы (депоБотез) или липоплексы (ПрорЬхев), образуются за счет электростатического взаимодействия положительно заряженной гидрофильной части катионного липида и отрицательно заряженных фосфатных групп нуклеиновых кислот. Они разнообразны по своей структуре и размеру, что определяется типом используемого катионного липида, способом приготовления катионных липосом и количественным соотношением ДНК и липосомальной композиции.

Вторым этапом трансфекции является взаимодействие геносом с мембраной клеток с последующим их проникновением и распределением во внутриклеточном пространстве. На данном этапе катионный липид обеспечивает остаточный положительный заряд геносомы, что позволяет ему взаимодействовать с отрицательно заряженной клеточной мембраной. Агрегированные на клеточной поверхности комплексы в дальнейшем могут или слиться с клеточной мембраной, или, что реализуется наиболее часто, войти внутрь клетки путем эндоцитоза; кроме того, часть комплексов может остаться невостребованной на поверхности клетки. Было обнаружено, что комплексы после эндоцитоза собираются в перинуклеарном пространстве, где образуют большие агрегаты, которые часто имеют высокоупорядоченную тубулярную структуру.

Рис. 1. Гипотетическая модель процесса трансфекции с использованием катионных липосом [1 ]

Следующим этапом является высвобождение геносомы в цитозоль. На этой стадии оказывает свое действие липид-хелпер, который дестабилизирует эндосомальную мембрану. Такой процесс является одной из лимитирующих стадий в транспорте генетических конструкций, поэтому предпринимаются попытки разрешения этой проблемы путем модификации и дизайна синтетических катионных липидов, которые могли бы эффективно дестабилизировать эндосомальную мембрану, применением средств, предотвращающих гидролиз комплексов в эндосомах, использованием рН-чувствительных агентов, а также обработкой клетки аденовирусами.

На конечном этапе происходит диссоциация комплекса ДНК-катионные липосомы, транспорт экзогенной ДНК в ядро клетки и ее последующая экспрессия.

Необходимо отметить, что наибольшей проблемой для применения и внедрения технологии липофекции для лечения генетических заболеваний является частое несовпадение результатов экспрессии in vitro и in vivo. Такое несовпадение обусловлено несоответствием между физико-химическими характеристиками клеточной мембраны in vitro и in vivo, например зарядом мембраны, плотностью заряда, а также строением и доступностью мембранных рецепторов. Кроме того, в условиях in vivo значительное количество терапевтических комплексов может изменяться и разрушаться под действием компонентов крови, ретикулоэндотелиальной системы и системы комплемента.

5. ВЫВОДЫ

1. Синтезированы новые алкильные гпицеролипиды с различными катионными аммонийными группами алифатического и гетероциклического типа, присоединенными непосредственно к глицериновому скелету.

2. Получен ряд новых катионных глицеролипидов с коротко- и длинноцепными алкильными остатками при С(2) положении глицеринового скелета на основе реакционноспособных метилтиометиловых эфиров.

3. Исследованы различные варианты синтеза гликолипидов с целью использования их для направленного транспорта генетического материала.

4. Проведены биологические исследования по изучению токсичности ряда синтезированных катионных липидов и выявлены соединения, которые могут быть рекомендованы для использования в процессе трансфекции.

5. Проведены исследования трансфекции эукариотических клеток с помощью катионных липосом.

2.4. Заключение

В этом обзоре мы сделали попытку классифицировать катионные липиды, которые используются в качестве медиаторов трансфекции. Однако необходимо отметить, что рамки такой классификации являются достаточно условными, так как катионные липиды можно классифицировать по другим признакам и свойствам [72]. Целью данного обзора было показать многообразие соединений, применяемых в генной терапии в качестве невирусных посредников переноса генетического материала, отметить определенные особенности этих соединений и проследить взаимосвязь между структурой и активностью.

В настоящее время перенос нуклеиновых кислот с помощью катионных липосом является хорошо разработанным и широко используемым методом как in vitro, так in vivo и ex vivo, благодаря простоте и доступности. Можно отметить, что катионным липосомам присущи такие свойства как неиммуногенность и способность переносить плазмидную ДНК практически неограниченного размера, в этом отношении они превосходят вирусные векторы. Однако, зачастую эффективность липофекции оказывается незначительной по целому ряду причин: токсичность катионных липидов, клеточная неспецифичность катионных липосом, низкий процент попадания геносом в клетку, выхода из эндосомального компартмента и попадания в ядро для проявления необходимого терапевтического действия. Маловероятно, что эти проблемы, возможно, решить путем дизайна новых катионных липидов, которые были бы биодеградируемы и мало токсичны, следовательно, необходимо снабжать катионные липосомы не только подходящими липидными составляющими, но и специальными лигандами, которые отвечали бы за клеточно-специфическое попадание (то есть осуществляли направленный транспорт липосом), за взаимодействие с клеточной и эндосомальной поверхностью и за высвобождение и взаимодействие с ядром

Отметим перспективы в создании биодеградируемых катионных липидов на основе природных веществ, например, карнитина, глицина [85—87,111]. Для галакгозосодержащие лиганды, экспонированные на поверхности катионных липосом [19,122,123], гликозилированные производные поли(Ьлизина) [124]. Предложены катионные липиды 61 с ковалентно присоединенными остатками тиогалактозы (схема 12); введение таких углеводных фрагментов в состав катионных липосом позволило осуществить трансфекцию гепатоцитов с высокой эффективностью [125].

121]. клеточно-специфического попадания в гепатоциты использовали

Схема 14 о

1. ВосЩСН^пМНг

2. ТЯА О х

НгЦСНЫпШ О' он

61 п = 2, 4, 6

Проникновение комплексов в клетки можно облегчить использованием олигопептидных лигандов рецептор-опосредованного эндоцитоза, фьюзогенных

39 пептидов [126], пептидов ядерной локализации [127] или комбинации катионных липосом с инактивированными вирусами Сендай (фьюзогенные липосомы) [128] или с аденовирусами [129]. Проблема эндосомального высвобождения комплексов ДНК-катионные липосомы может быть решена использованием молекул липоаминов [58, 59, 66, 69, 70], или использованием в составе катионных липосом рН-чувсгвительных соединений [28, 98,130], в том числе липидов [7, 8, 30], или пептидов способных дестабилизировать и разрывать эндосомальную мембрану [125].

Помимо перечисленных проблем, связанных с подбором состава катионных липосом, существуют определенные трудности их применения in vivo, особенно, при системном введении: малое время циркуляции в организме, взаимодействие с белками системы комплемента и компонентами крови, которые могут быть устранены использованием так называемых стабилизированных ДНК-липидных частиц. Такие частицы содержат, кроме катионного липида и липида-хелпера, небольшое количество полиэтиленгликоля ковалентно связанного с церамидами или DOPE. Таким образом на внешней поверхности ДНК-липидных комплексов находятся гибкие полиэтиленгликолевые цепи, которые позволяют защищать липосомы от преждевременной агрегации и инактивации [131—133].

В заключение необходимо отметить, что получение новых катионных липидов, изучение взаимосвязи структура - активность, а также создание эффективных многокомпонентных катионных липосом, перспективно для развития генной терапии, как метода лечения наследственных и ненаследственных заболеваний.

1. D. D. Lasic, Liposomes in gene delivery, CRC Press, N.-Y., 1997.

2. A. D. Miller, Cationic liposomes for gene therapy// Angew. Chem. Int. Ed., 1998, 37, 1768.

3. И. Д. Константинова, Г. А. Серебренникова, Положительно заряженные липиды: структура синтез применение// Успехи химии, 1996, 65, 581 Russ. Chem. Rev., 1996, 65, 537 (Engl. Transl.).

4. P. L. Feigner, T. R. Gadek, M. Holm, R. Roman, H. W. Chan, M. Wenz, J. P. Northop, G. M. Ringold and M. Danielsen, Lipofection: a hghly efficient lipid-mediated DNA transfection procedure// Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84, 7413.

5. R. Leventis and J. R. Silvius, Interaction of mammalian cells with lipid dispersions containing novel metabolizable cationic amphiphiles// Biochim. Biophys. Acta, 1990, 1023, 124.

6. J. H. Feigner, R. Kumar, C. N. Sridhar, C. J. Wheeler, Y. J. Tsai, R. Border, P. Ramsey, M. Martin and P. L. Feigner, Enhanced gene delivery and mechanism studies with novel series of cationic lipid formulations// J. Biol. Chem., 1994, 269, 2550.

7. M. J. Bennett, R. W. Malone and M. H. Nantz, A flexible approach to synthetic lipid ammonium salts for polinucleotide transfection// Tetrahedron Lett., 1995, 36, 2207.

8. M. J. Bennett, A. M. Aberle, R. P. Balasubramaniam, J. G. Malone, R. W. Malone and M. H. Nantz, Cationic lipid-mediated gene delivery to murine lung: correlation of lipid hydration with in vivo transfection activity// J. Med. Chem., 1997, 40, 4067.

9. R. W. Malon, P. L. Feigner and I. M. Verma, Cationic liposome-mediated RNA transfection// Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6077.

10. P. L. Feigner and G. M. Ringold, Cationic liposome-mediated transfection// Nature, 1989, 337, 387.

11. H. Gershon, R. Ghirlando, S. B. Guttman and A. Minsky, Mode of formation and structural featurees of DNA-cationic liposome complexes used for transfection// Biochemistry, 1993, 32, 7143

12. S. May and A. Ben-Shaul, DNA-lipid complexes: stability of honeycomb-like and spaghetti-like structures// Biophys. J., 1997, 73, 2427.

13. K. W. Mok and P. R. Cullis, Structural and fusogenic properties of cationic liposomes in the presence of plasmid DNAII Biophys. J., 1997, 73, 2534.

14. R. B. Arenas, A. Fichera, P. Mok, M.C. Blanco and F. Michelassi, Introduction of human adenomatous polyposis gene into min mice via cationic liposomes// Surgery, 1996,120, 712.

15. F. Lui, H. Qi, L. Huang and D. Liu, Factors controlling the efficiency of cationic lipid-mediated transfection in vivo via intraenous administration// Gene Ther., 1997, 4, 517

16. J. O. Radier, I. Koltover, T. Salditt and C. R. Safinya, Structure of DNA-cationic liposome complexes: DNA intercalation in multilamellar memranes in distinct interhelical packing regimes// Science, 1997, 275, 810.

17. N. S. Templeton, D. D. Lais, P. M. Frederik, H. H. Strey, D. D. Roberts and G. N. Pavlakis, Improved DNA-liposome comlexes for increased systemic delivery and gene expression// Nature Biotechnol., 1997, 15, 647.

18. N. J. Zuidam, Y. Barenholz and A. Minsky, Chiral DNA paking in DNA-cationic liposome assemblies// FEBS Lett., 1999, 457, 419.

19. G. Gregoriadis, R. Saffie and B. de Souza, Liposome-mediated DNA vaccination//FEBS Lett., 1997, 402, 107.

20. J. Zabner, A.J. Fasbender, T. Moninger, K. A. Poellinger and M. J. Welsh, Cellular and molecular barriers to gene transfer by cationic lipids// J. Biol. Chem., 1995, 270, 18997.

21. T. Ochiya, Y. Takahama, H. Baba-Toriyama, M. Tsukamoto, Y. Yasuda, H. Kikuchi and M. Terada, Evalution of cationic liposome suitable for gene transfer into pregnant animals// Biochem. Biophys. Res. Commun., 1999, 258, 358.

22. P. И. Жданов, О. В. Подобед, Н. Г. Куценко, О. А. Бунеева, Т. А. Цветкова, С. О. Гурьев, Г. А. Серебренникова, И. Д. Константинова, М. А. Маслов, Новые катионные липосомы для трансфекции эукариотических клеток// Док. Акад. Наук, 1998, 362, 557.

23. Y. Kaneko and A. Tsukamoto, Structural characteristics of cationic liposomes with potent enhancing effect on retroviral transduction into human hepatoma cells// Cancer Lett., 1996, 105, 39.

24. V. Budken, V. Gurevich, J. Hagstrom, F. Bortsov and J. Wolff, pH Sensitive cationic liposomes: a new synthetic virus-like vector// Nat. Biotech., 1996, 14, 760.

25. EP 0747 351 A2, C07C 381/12.

26. I. Solodin, C. S. Brown and T. D. Heath, Synthesis of phosphotriester cationic phospholipids// Synlett., 1996, 5, 457.

27. R. C. MacDonald, V. A. Rakhmanova, K. L. Choi, H. S. Rosenzweig and M. K. Lahiri, O-ethylphosphat : A metabolizable cationic phospholipid which is a serum-compatible DNA transfection agent// J. Pharm. Sci., 1999, 88, 896.

28. C. M. Gorman, M. Aikawa, B. Fox, E. Fox, C. Lapuz, B. Michaud, H. Nguyen, E. Roche, T. Sawa and J. P. Wiener-Kronish, Gene Ther., 1997, 4, 983.

29. G. Le Bolch, N. Le Bris, J. -J. Yaouanc, J. -C. Clement and H. des Abbays, Cationic phosphonolipid as non viral vectors for DNAa transfection// Tetrahedron Lett., 1995, 36, 6681.

30. H. Farhood, R. Bottega, R. M. Epand and L. Huang, Effect of cholesterol derivatives on gene transfer and protein kinase C activity// Biochim. Biophys. Acta, 1992, 1111,239.

31. X. Gao and L. Huang, A novel cationic liposome reagent for efficient transfection// Biochem. Biophys. Res. Commun., 1991, 179, 280.

32. R. Okayama, M. Noji and M. Nakanishi, Cationic cholesterol with a hydroxyethylamino head group promotes significantly liposome-mediated gene transfection// FEBS Lett., 1997, 408, 232.

33. A. Singal and L. Huang, Gene transfer in mammalian cells using liposomes as carriers// in Gene Therapeutics: Methods and Application of Direct Gene Transfer (Ed. Wolf J. A.), Birkhauser, Boston, 1994, 118.

34. H. Farhood, N. Serbina and L. Huang, The role of dioleoylphoshpatidylethanolamine in cationic liposome formulations for in vivo gene transfer// Biochim. Biophys. Acta, 1995,1235, 289.

35. A. McQuillin, K. D. Murray, C. J. Etheridge, L. Stewart, R. G. Cooper, P. M. Brett, A. D. Miller and H. M. D. Gurling, Optimization of liposome mediated transfection of neuronal cell line// NeuroReport, 1997, 8, 1481.

36. K. Yang, X. S. Mu, R. L. Hayers, Y. H. Qiu, F. L. Sorgi, L. Huang, G. L. Clifton and L. Vivian, DC-Choi liposome-mediated gene transfer in rat spinal cord// NeuroReport, 1997, 8, 2355.

37. B. Sternberg, F. L. Sorgi and L. Huang, New structures in complex formation between DNA and cationic liposomes visualized by freeze-fructure electron microscopy// FEBS Lett., 1994, 356, 361.

38. K. M. Hui, P. T. Ang, L. Huang and S. K. Tay, Phase I study of immunotherapy of cutaneous metastases of human carcinoma using allogenic and xenogenic MHC of DNA-liposome complexes// Gene Ther., 1997, 4, 783.

39. R. G. Cooper, C. J. Etheridge, L. Stewart, J. Marshall, S. Rudginsky, S. H. Cheng and A. D. Miller, Chem. Eur. J., 1998, 4, 137.

40. D. Moradpour, J. I. Shauer, V. R. Zurdwski, J. R. Wands and R. H. Boutin, Efficient gene transfer into mammalian cells with cholesteryl-spermidine// Biochem. Biophys. Res. Commun., 1996, 221, 82.

41. N. Ouderhiri, J. P. Vigneron, M. Peuchmar T., Leclerc, J. M. Lehn and P. Lehn, Gene transfer by guanidinium-cholesterol cationic lipids into airway epithelial cells in vitro and in vivo!I Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94, 1651.

42. J. P. Bher, DNA strongly binds to micelles and vesicles containing lipopolyamines or lipointercalants// Tetrahedron Lett., 1986, 27, 5861

43. J. P. Bher, B. Demeneix, J. P. Loeffler and J. Perez-Mutul, Efficient gene transfer into mammalian primari endocrine cells with lipopolyamine-coated DNA// Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6982

44. P. Hawley-Nelson, V. Ciccarone, G. Geleyehu, J. Jesse and P. L. Feigner, Focus, 1993, 15, 73.

45. J. P. Behr, Gene transfer with synthetic cationic amphiphiles: prospects for gene therapy// Bioconj. Chem., 1994, 5, 382.

46. K. Lappalainen, R. Miettinen, J. Kellokoski, I. Jaaskelainen and S. Syrjanen, Intracellular distribution of oligonucleotides delivered by cationic lipids: light and electron microscopic study// J. Histochem. Cytochem., 1997, 45, 265.

47. T. Boukhnikachvili, O. Ageurre-Chariol, M. Airau, S. Lesieur, M. Ollivon and J. Vacus, Structure of in-serum transfecting DNA-cationic lipid complexes// FEBS Lett., 1997, 409, 188.

48. D. D. Dunlap, A. Maggi, M. R. Soria and L. Monaco, Nanoscopic structure of DNA condensed for gene delivery// Nucl. Acids Res., 1997, 25, 3095.

49. M. Tsukamoto, T. Ochiya, S. Yoshida, T. Sugimura and M. Terada, Gene transfer and expression in pogeny alter intravenous DNA injection into pregnant mice// Nature Genet., 1995, 9, 243.

50. A. R. Thierry, Y. Lunardi-lskandar, J. L. Bryant, P. Rabinovitch, R. C. Gallo and L. C. Mahan, Systemic gene therapy: biodistribution and long-term expression of a trasgene in mice// Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 9742

51. K. Lappalainen, L. Pirila, I. Jaaskelainen, K. Syrjanen and S. Syrjanen, Effect of liposomal antisense oligonucleotides on mRNA and protein levels of the HPV 16 E7 oncogene// Anticancer Res., 1996,16, 2485.

52. B. A. Demeneix, D. Goula, C. Benoist, J. S. Remy and J. P. Behr, Theory and practicce of using policationic amphiphiles and polymers for in vitro and in vivo gene transfer// in Gene Therapy (Ed. K.G. Xanthopoulos), Springer, 1998, 195.

53. B. A. Demeneix, O. Boussif, M. A. Zanta, J. C. Remy and J. P. Behr, Delivery of polynucleotides with polyamine lipids and polymers// Nucleos. Nucleot, 1997, 16,1121.

54. B. Abdallah, L. Sachs and B. A. Demeneix, Non-viral gene transfer: application in developmental biology and gene therapy// Biol. Cell, 1995, 85, 1.

55. X. Zhou, A. L. Klibanov and L. Huang, Lipophilic polylysines mediate efficient DNA transfection in mammalian cells// Biochim. Biophys. Acta, 1991, 1065, 8.

56. X. Zhou and L. Huang, DNA transfection mediated by cationic liposomes containing lipopolysine: characterization and mechanism of action// Biochim. Biophys. Acta, 1994, 1189, 195.

57. V. Budker, J. E. Hagstrom, 0. Lapina, D. Eifrig and J. Fritz, Protein-amphipathic polyamine complexes enable highly efficient transfection with minimal toxicity// Biotechniques, 1997, 23, 139.

58. A. Nazih, Y. Cordier, R. Bischoff, H. V. J. Kolbe, D. Heissler, Synthesis and stability stydy of the new pentaammonio lipid pcTG90, a gene transfer agent// Teterahedron Lett, 1999, 40, 8089.

59. F. H. Cameron, M. J. Moghaddam, V. J. Bender, R. G. Whittaker, M. Mott and T. J. Lockett, A transfection compound series based on versatile Tris linkage// Biochem. Biophys. Acta, 1999, 1417, 37.

60. A. Ito, R. Miyazoe, J. Mitoma, T. Akao, T. Osaki and T.Kunitake, Synthetic cationic amphiphiles for liposome-mediated DNA transfection// Biochem. Int., 1990, 22, 235.

61. T. Akao, T. Fukumoto, H. Ihara and A. Ito, Conformational change in DNA induced by cationic bilayer membranes// FEBS Lett., 1996, 391, 215.

62. T. Koshizaka, Y. Hayashi and K. Yagi, Novel liposomes for efficient transfection of beta-galactosidase gene into COS-1 cells// J. Clin. Biochem. Nutr., 1989, 7, 185.

63. D. D. Zhao, S. Watarai, Y. T. Lee, S. Kouchi, H. Ohmori and T. Yasuda, Gene transfection by cationic liposomes: comparison of the transfection efficiency of liposomes prepared from various positively charged lipids// Acta Medica Okayama, 1997, 51, 149.

64. H. Arima, Y. Aramaki and S. Tsuchiya, Effects of oligonucleotides on the physicochemical characteristics and cellular uptake of liposomes// J. Pharm. Sci., 1997, 86, 438.

65. T. Tana, S. Watarai, M. Onuma, K. Ochiai, H. Kakidani and T. Yasuda, In vivo antitumor effect of cationic liposomes containing diphteria toxin A-chain gene on cells infected with bovine leukemia virus// J. Vet. Med. Sci., 1997, 59, 617.

66. M. Yanase, M. Shinkai, H. Honda, T. Wakabayashi, J. Yoshida and T. Kobayashi, Antitumor immunity induction by intracellular Hyperthermia using magnetite cationic liposomes// Jpn. J. Cancer Res., 1998, 89, 463, 775.

67. T. Kato, K. Iwamoto, H. Ando, N. Asakawa, I. Tanaka, J. Kiruchi and Y. Murakami, Synthetic cationic amphiphiles for liposome-mediated DNA transfection woth less cytotoxicity// Biol. Pharm. Bull., 1996,19, 860

68. J. K. Wang, X. Guo, Y. H. Xu, L. Barron and F.C. Szoka, Synthesis and characterization of long chain alky acyl carnitine esters. Potentially biodegradable cationic lipids for use in gene delivery// J. Med. Chem., 1998, 41, 2207.

69. F. Tang and J.A. Hughes, Introduction of a disulfide bond into a cationic lipid enhances transgene expression of plasmid DNAII Biochem. Biophys. Res. Commun., 1998, 242, 141.

70. P. S. Ajmani, F. Tang, S. Krishnaswami, E. M. Meyer, C. Sumners and J. A. Hughes, Enhanced transgene expression in rat brain cell cultures with a disulfide-containing cationic lipid// Neuroscience Lett., 1999, 277, 141.

71. J. M. Ruysschaert, A. E. Ouanabi, V. Willeaume, G. Huez, R Fuks, M. Vandenbranden and P. Di Stefano, A novel cationic amphiphile for transfection of mammalian cells// Biochem. Biophys. Res. Comm., 1994, 203, 1622.

72. A. E. Ouhabi, V. Pector, R. Fuks and M. Vandenbranden, Double long chain amidine liposome-mediated self replicating RNA transfection// FEBS Lett., 1996,380,108.

73. A. E. Ouhabi, M. Thiry, V. Pector, R. Fuks, J. M. Ruysschaert and M. Vandenbranden, The role of endosome destabilizing activity in the gene transfer process mediated by cationic lipids// FEBS Lett., 1997, 414, 187.

74. I Martin, and J. M. Ruysschaert, Comparison of lipidd vesicle fusion induced by the putative fusion peptide of fertilin (a protein active in sperm-egg fusion) and the NH2-terminal domain of the HIV2 gp41// FEBS Lett., 1997, 405, 351.

75. G. Zhang, V. Gurtu, T. H. Smith, P. Nelson and S. R. Kain, A cationic lipid for rapid and efficient delivery of plasmid DNA into mammalian cells// Biochem. Biophys. Res. Commun., 1997, 236, 126.

76. I. Solodin, C. S. Brown, M. S. Bruno, C. -Y. Chow, E. -H. Jang, R. J. Debs and T. D. Heath, A novel series of amphiphilic imidazolinium compound for in vitro and in vivo gene delivery// Biochemystry, 1995, 34, 13537.

77. J. W. McLean, E. A. Fox, P. Baluc, P. B. Bolton, A. Haskell, R. Pearlman, G. Thurston, E. Y. Umemoto and D. M. McDonald, Organ-specific endothelial cell uptake of cationic liposome-DNA complexes in mice// Am. J. Physiol., 1997, 273, 387.

78. Y. Liu, L. C. Mounkes, H. D. Liggitt, C. S. Brown, I Solodin, T. D. Health and R. J. Debs, Factors influencing the efficiency of cationic liposome-mediated intravenous gene delivery// Nature Biotechnol., 1997,15, 167.

79. J. A. Hughes, A. I. Aronsohn, A. V. Avrutskaya and R. L. Juliano, Evaluation of adjuvants that enhance the effectiveness of antisense oligonucleotides// Pharm. Res., 1996, 13, 404.

80. E. Liang and J. A. Hughes, Characterization of a pH-sensitive surfactant, dodecyl-2-(1'-imidazolyi|propionate (DIP) and preliminary studies in liposome-mediated gene transfer// Biochem. Biophys. Acta, 1998,1369, 39.

81. I. Van der Woude, A. Wagenaar, A. A. P. Meekel, M.B. A. ter Beest, M. H. J. Ruiters, J. B. F. N. Engberts and D. Hoekstra, Novel pyridinium sursactants for efficient, nontoxic in vitro gene delivery// Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94, 1160.

82. P. Pinnaduwage, L. Schmitt and L. Huang, Use of quaternary ammonium detergent in liposome mediated DNA transfection of mous L-cells// Biochim. Biophys. Acta, 1989, 985, 33.

83. J. K. Rose, L. Buonocore and M. A. Whitt, A new cationic liposome reagent mediating nearly quantitative transfection of animal cells// Biotechniques, 1991, 10, 520.

84. N. Ballas, N. Zakai, I. Sela and A. Loyter, Biochim. Biophys. Acta, 1988, 939, 8.

85. PCT Int. Appl. WO 96/10390 A61K 9/127.

86. S. Bhattacharya and S. S. Mandal, Evidence of interlipidic ion-rairing in anion-induced DNA release from cationic amphiphile-DNA complexes. Mechanistic implications in transfection// Biochemistry, 1998, 37, 7765.

87. T. Kunitake, N .Nakayama, M. Shimomura, Y. Okahaata, K. Kano and T. Ogawa, Unique properties of chromophore-containing bilayer aggregates: enhanced chirality and photochemically induced morphological change// J. Amer. Chem. Soc., 1980, 102, 6642.

88. K. Han, An efficient DDAB-mediated transfection of drosophila S2 cells// Nucl. Acids Res., 1996, 24, 4362.

89. D. L. Reimer, S. Kong and M. B. Bally, Analysis of cationic liposome-mediated interactions of plasmid DNA witj murine and human melanoma cells in vitroll J. Biol. Chem., 1997, 272, 19480.

90. P. Wielbo, N. Shi and C. Sernia, Antisense inhibition of angiotensinogen in hepatoma cell culture is enhanced by cationic liposome delivery// Biochem. Biophys. Res. Commun., 1997, 232, 794.

91. F. M. P. Wong, D. L. Reimer and M.B. Bally, Cationic lipid binding to DNA: characterization of complex formation// Biochemistry, 1996, 35, 5756.

92. D. D. Lasic, H. Strey, M. C. A. Stuart, R. Podgornik and P. M. Frederik, The structure of DNA-liposomes complexes// J. Amer. Chem. Soc., 1997, 119, 832.

93. A. M. Aberle, F. Tablin, J. Zhu, N. J. Walker, D. C. Gruenert and M. H. Nantz, A novel tetraester construct that reduces cationic lipid-associated cytotoxity. Implication for the onsrt of cytotoxicity// Biochemistry, 1998, 37, 6533.

94. T. Ren and D. Liu, Synthesis of cationic lipids from 1,2,4-butanetriol// Tetrahedron Lett., 1999, 40, 209.

95. T. Ren and D. Liu, Synthesis of diether-linked cationic lipids for gene transfer// Bioorg. Med. Chem. Lett., 1999, 9, 1247.

96. K. I. Takeuchi, M. Ishihara, C. Kawaura, M. Noji, T. Furuno and M. Nakanishi, Effect of zeta potential of cationic liposomes containing cationic cholesterol derivatives on gene transfection// FEBS Lett., 1996, 397, 207.

97. C. Kawaura, A. Nogucki, T. Furuno and M. Nakonishi, Atomic force microscopy for studing gene transfection mediated by cationic liposomes with a cationic cholesterol derivatives// FEBS Lett., 1998, 421, 69.

98. J. Bentz, H. Ellens, M. Z. Lai and F. C. Szoka, On the correlation between hexagonal II phase and the contact-induced destabilization of phosphatidyethanolamine containing membranes// Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, 82, 5742.

99. A. M. Aberle, M. J. Bennett, R. W. Malon and M. H. Hantz, The counterion influence on cationic lipid-mediated transfection of plasmid DNA// Biochim. Biophys. Acta, 1996, 1299, 281.

100. S. Obiika, A. Shimoyama, T. Uneda, K. Miyashita, T. Doi and T. Imanishi, A symmetrical and biodegradable cationic lipid. Synthesis and application for efficient gene trnsfectionII Bioorg. Med. Chem. Lett., 1997, 7, 1817.

101. L. Huang, H. Farhood, N. Serbina, and A.G. Teepl, Endosomolytic activity of cationic liposomes enhances the delivery of human immunodeficiecy virus-1 transactivator protein (tat) to mammalian cells// Biochem. ahd Biophys. Res. Commun., 1995, 217, 761.

102. А. П. Каплун, Ле Банг Шон, Ю. М. Краснопольский, В. И. Швец, Липосомы и другие наночастицы как средство доставки лекарственных веществ// Вопросы мед. химии, 1999, 54, 3.

103. S. Kawakami, F. Yamashita, M. Nashikawa, Y. Takakura and M. Hashida, Asialoglycoprotein receptor-mediated gene transfer using novel galactosylated cationic liposomes// Biochem. Biophys. Res. Commun., 1998, 252, 78.

104. H. Kamata, H. Yagisawa, S. Takahashi and H. Hirata, Amphiphilic peptides enhance the efficiency of liposome-mediated DNA transfection// Nucleic Acids Res., 1994, 22, 536.

105. A. Subramanian, P. Ranganathan and S. L. Diamond, Nuclear targeting peptide scaffolds for lipofection of non diving mammalian cells// Nature Biotechnol., 1999, 17, 873.

106. H. Mizuguchi, T. Nakagawa, M. Nakanishi, S. Imasu, S. Nakagawa and T. Mayumi, Efficient gene transfer into mammalian cells using fusogenic liposome// Biochem. Biophys. Res. Commun., 1996, 218, 402.

107. C. Meunier-Durmot, N. Ferry, B. Hainque, J. Delattre and C. Forest, Efficient transfer of regulated genes in adipocytes and hepatoma cells by combination of liposomes and replication-deficient adenovirus// Eur. J. Biochem., 1997, 237, 660.

108. R. Cazzola, P. Viani, P. Allevi, G. Cighetti and B. Cestaro, pH Sensitivity and plasma stability of liposomes containing N-stearoylcysteamine// Biochim. Biophys. Acta, 1997, 1329, 291.

109. K. Hong, W. Zheng, A. Baker and D. Papahadjopoulos, Stabilization of cationic liposome-plasmid DNA complexes by polyamines and poly(ethylen glycol)-phospholipid conjugates for efficient in vivo gene delivery// FEBS Lett., 1997, 400, 233

110. J. J. Wheeler, L. Palmer, M. Ossanlou, I. MacLachlan, R. Graham, P. Scherrer, M. J. Hope and P. R. Cullis, Stabilized plasmid-lipid particles: construction and characterization// Gene Ther., 1999, 6, 271.

111. K. W. С. Мок, A. M. I. Lam and P. R. Cullis, Stabilized plasmid-lipid particles: factors influencing plasmid entrapment and transfection properties// Biochim. Biophys. Acta, 1999, 1419, 137.

112. M. В. Аникин, И. П. Ушакова, Г. А. Серебренникова, Р. П. Евстигнеева, Депонированная статья, ВИНИТИ, 1987, № 915-ХП 87.7.

113. В. Nasser, S. Morpain, В. Laude, and N. Latruffe, Synthesis and characterization of chemical intermediates of acyl and alkyl phospholipids// Can. J. Chem., 1992, 70, 2319.

114. Общая органическая химия, под ред. Д. Бартона, В. Д. Оллиса, Химия, Москва, 1985, 8, 81.

115. М. A. Maslov, N. G. Morozova, and G. A. Serebrennikova, Convenient synthesis of cationic glycerolipids via methylthiomethyl ethers// Mendeleev Commun., 2000, 65.

116. P. M. Pojer and S. J. Angyal, Methylthiomethyl ethers: general synthesis and mild cleavage. Protection of hydroxyl group// Tetrahedron Lett., 1976, 26, 3067.

117. E. J. Corey and M. G. Bock, Protection of primary hydroxyl groups as methylthiomethyl ethers// Tetrahedron Lett., 1975, 25, 3269.

118. К. Yamado, К. Kato, and N. Nagase, Protection of tertiary hydroxyl group as methylthiomethyl ethers// Tetrahedron Lett., 1976, 26, 65.

119. P. M. Pojer and S. J. Angyal, Methylthiomethyl ethers: their use in the protection and methylation of hydroxyl group// Aust. J. Chem., 1978, 31, 1031.

120. K. Suzuki, J. Inanaga, and M. Yamaguchi, A mild and convenient method for the preparation of methylthiomethyl ethers: protection of hydroxyl groups// Chem. Lett., 1979, 29, 1277.

121. L. G. Wade, J. M. Gerdes, and R. P. Wirth, Protection of carboxylic acids as methythiomethyl esters// Tetrahedron Lett., 1978, 28, 731.

122. M. А. Саблина, И. П. Ушакова, Г. А. Серебренникова, Липиды с простой эфирной связью в онкологии// Хим.-фарм. Журнал, 1993, 27, 3.

123. М. А. Саблина, И. П. Ушакова, Г. А. Серебренникова, Аналоги и антагонисты фактора активации тромбоцитов// Хим.-фарм. Журнал, 1994, 28, 9.

124. N. Murahashi, and A. Sasaki, In vivo behavior of liposomes modified with novel galactosyllipid derivative// Biol. Pharm. Bull., 1996, 19, 418.

125. S. Figueroa-Perez, and U. Verez-Bencomo, Synthesis of neoglycolipids containing oligosaccharides based on 3,6-branched-a-D-mannopiranosides as the carbohydrate moieties// J. Carbohyd. Chem., 1998,17, 851.

126. G. Gastaldi, B. Focher, M. Guerrini, and D. Alonso, Synthesis of octyl p-D-glucopyranoside-aminobutiric (GABA) and aminohydroxybutiric (GABOB) conjugates// J. Carbohyd. Chem., 1994,13, 1009.

127. P. Beraud, A. Bourhim, S. Czernecki, and P. Krausz, Modification selective de mono- et di-saccarides non proteges par I'intermeiaire de liaison ester et ether// Tetrahedron Lett., 1989, 30, 325.

128. A. Bourhim, S. Czernecki, and P. Krausz, Selective monoesterification of unprotected mono- and disaccarides// J. Carbohyd. Chem., 1993, 12, 853.

129. M. Varasi, К. A. M. Walker, and M. L. Maddox, A revised mechanism for the Mitsunobu reaction// J. Organ. Chem., 1987, 52, 4235.

130. А. А. Гершкович, и В. К. Кибирев, Химический синтез пептидов, Наукова Думка, Киев, 1992, 144.

131. И. Д. Константинова, И. П. Ушакова, и Г. А Серебренникова, Синтез положительно заряженных липидов с простой эфирной связью// Биоорг. химия, 1993, 19, 844.

132. О. Ю. Абакумова, Современные методы в биохимии, Медицина, Москва, 1977, 285.

133. Т. Mossman, Application of MTT-test in cell toxicity assays// J. Immunol. Methods, 1983, 89, 271

134. F. M. Ausubel, and R Breut, in Current protocols in molecular biology, Wiley, New York, 1991, unit 9.4.1.13.

135. N. Du^ne|, and P. L. Feigner, // Meth. Enzymol., 1993, 221, 361.

136. И. Д. Константинова, И. H. Зайцева, И. П. Ушакова, и Г. А Серебренникова, Синтез катионных липидов алкильного типа с короткоцепными заместителями при С(2) атоме глицеринового скелета// Изв. АН, Сер. хим., 1994, 10, 1826.

137. Р. Досон, Д. Эллиот, У. Эллиот, К. Джонс, Справочник биохимика, Мир, Москва, 1991, 383.

138. И. Д. Константинова, И. П. Ушакова, и Г. А Серебренникова, Синтез положительно заряженных липидов с простой эфирной связью// Биоорг. химия, 1993, 19, 844.