Синтез глицеролипидов алкильного типа, содержащих функциональные группы в полярном домене тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

ПЛЯВНИК НАТАЛЬЯ ВЛАДИМИРОВНА

СИНТЕЗ ГЛИЦЕРОЛИПИДОВ АЛКИЛЬНОГО ТИПА, СОДЕРЖАЩИХ ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ГРУППЫ В ПОЛЯРНОМ ДОМЕНЕ

Специальность 02.00.10 — Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА — 2004

Работа выполнена на кафедре Химии и технологии биологически активных соединений им. Н. А. Преображенского Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Серебренникова Галина Андреевна

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

доктор химических наук, профессор

Шибаев Владимир Николаевич Смирнов Леонид Дмитриевич

Ведущая организация: Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита диссертации состоится 2004 г. в & часов на заседании

Диссертационного Совета Д 212.120.01 при Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, пр. Вернадского, 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М. В. Ломоносова (119831, Москва, М. Пироговская, 1)

Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного Совета,

кандидат химических наук,

старший научный сотрудник «чуу

Лютик А. И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Фосфорсодержащие глицеролипиды алкильного типа являются предметом интенсивных исследований. Это, прежде всего, связано с открытием липидного биорегулятора широкого спектра действия - фактора активации тромбоцитов (ФАТ). Поскольку сам ФАТ не может быть использован в терапевтических целях из-за его мощного тромбоцит-агрегирующего действия, было синтезировано большое количество его структурных аналогов. Оказалось, что многие структурные аналоги ФАТ алкильного типа проявляют сильную противоопухолевую активность, ингибируя действие клеточных ферментов и пролиферацию злокачественных клеток, что вызывает их лизис, а также активируют цитотоксические макрофаги, препятствуют образованию метастаз.

Одним из соединений, обладающих сильной противоопухолевой активностью, является Эдельфозин (Edelfosine, 1-октадецил-2-метил-гас-глицеро-3-фосфохолин, ЕТ-18-ОМе), близкий по структуре к ФАТ. Выяснилось, что ЕТ-18-ОМе ингибирует рост и пролиферацию различных опухолевых клеток in vivo и in vitro.

В настоящее время большое внимание привлекают неприродные представители катионных бесфосфорных глицеролипидов алкильного типа. Интерес к данному классу соединений, прежде всего, связан с возможностью их использования в липосомальной форме для доставки генетического материала в эукариотические клетки, что является центральной проблемой генной терапии. Данные соединения, как правило, являются производными длинноцепных 1,2-диалкилглицеринов. Модификация молекулы катионных алкильных глицеролипидов путем введения короткоцепного заместителя в С(2) положение глицеринового скелета (как у ФАТ) приводит к появлению у них таких биологических эффектов, как противоопухолевый, противовирусный (анти-ВИЧ-1), ФАТ-антагонистический или антибактериальный. В связи с этим, представляется актуальным создание новых положительно заряженных глицеролипидов алкильного типа с короткоцепными заместителями при С(2) атоме глицерина с целью выявления среди них соединений, обладающих биологической активностью.

Введение реакционноспособных функциональных групп в полярный домен

алкильных глицеролипидов открывает широкие перспективы в использовании таких

соединений для их конъюгации с различными биологически активными веществами

или мечеными зондами. Так, для исследования действия ферментов, участвующих

в метаболизме липилов. или для изучения процессов протекающих в биологических

I РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ ' I БИБЛИОТЕКА ¡

! ¿чей? i

мембранах, широко используют молекулярные липидные зонды, содержащие флуоресцентные, спиновые, фотореактивные метки. Кроме того, наличие функциональных групп открывает возможности для получения на основе таких липидов липофильных производных бора для борнейтронзахватнои терапии рака.

Настоящая работа выполнена в соответствии с планом научных исследований кафедры ХТБАС МИТХТ им. М. В. Ломоносова по теме № 1Б-4-865 «Синтез супрамолекулярных структур на основе порфиринов, липидов и углеводов с целью изучения процессов, протекающих в клетке, и создания препаратов для онкологии, генной терапии и других областей медицины» и при поддержке РФФИ, проекты № 01-03-332334, 03-03-32482, 04-03-32452, научно-технической программы «Научные исследования высшей школы по приоритетным направлениям науки и техники», подраздел «Лекарственные и биологически активные вещества» № 203.05.04.005, фанта Президента РФ по поддержке ведущих научных школ России №НШ-2013.2003.3.

Цель работы.

1. Синтез положительно заряженных глицеролипидов с набором функциональных групп в полярных «головках», представленных гетероциклическими и алифатическими аминами.

2. Получение модификационных рядов алкильных глицеролипидов со спейсерами различной длины, разделяющими гидрофильный и гидрофобный домены.

3. Разработка способов получения функционализированных алкильных глицеролипидов с использованием метода метилтиометиловых эфиров.

4. Проведение предварительных биологических испытаний полученных соединений на противоопухолевую активность in vitro и исследование возможности их применения в борнейтронзахватной терапии.

Научная новизна работы. В результате проведенных исследований нами получены новые типы алкильных липидов, различающиеся отдельными структурными фрагментами: алкильными заместителями при С(2) атоме глицеринового скелета, типом и длиной спейсера, а также природой полярных доменов, содержащих различные функциональные группы (гидроксильную,

карбоксильную и аминогруппу), для оценки влияния отдельных структурных участков на биологическую активность данных соединений.

С целью поиска потенциальных противоопухолевых агентов существенно расширен круг катионных глицеролипидов с короткоцепными заместителями в С(2) положении глицерина и положительно заряженными полярными «головками», представленными аминами алифатического и гетероциклического ряда.

Проведены предварительные биологические испытания in vitro синтезированных соединений на противоопухолевую активность.

Практическая значимость работы. В результате выполнения работы созданы новые ряды функционализированных алкильных глицеролипидов, отличающихся спейсерными и полярными группами, а также длиной и степенью ненасыщенности короткоцепного заместителя в С(2) положении глицерина. Направленная модификация молекулы катионного липида по определенным доменам создает возможность проведения структурно-функциональных исследований по выявлению зависимости возможной биологической активности этих соединений от строения каждой структурной единицы.

Получены глицеролипиды алкильного типа с функциональными группами в полярном домене в количествах, достаточных для проведения биологических испытаний. Наличие в молекулах липидов реакционноспособных функциональных групп позволяет проводить дальнейшие модификации данных соединений, в частности присоединять другие биологически активные вещества, репортерные метки или различные полиэдрические бороводороды для возможного применения в борнейтронзахватной терапии рака.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Получение глицеролипидов с набором алкильных заместителей при С(2) атоме углерода и полярных доменов, представленных гетероциклическими и алифатическими аминами, содержащими различные функциональные группы.

2. Разработка методов синтеза алкильных глицеролипидов со спейсерными фуппами различной длины.

3. Синтез функционализированных алкильных глицеролипидов с использованием метода метилтиометиловых эфиров.

4. Анализ результатов биологических исследований синтезированных липидов и

их борсодержащих производных в экспериментах in vitro.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на 1-ом Международном Конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (2002, Москва), на III Съезде биохимического общества (2002, Санкт-Петербург), на VIII Международной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии - 2002» (2002, Уфа), на отчетной конференции за 2002 год «Химия и химические продукты» (2003, Москва), на X Международной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии - 2004» (2004, Волгоград).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и тезисы 6 докладов, 2 статьи находятся в печати.

Объем и структура работы.

Диссертационная работа изложена на 94 страницах машинописного текста и состоит из введения, литературного обзора, обсуждения экспериментального материала, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 12$ источника. Работа иллюстрирована ¡2. рисунками и содержит ZL схем и таблиц.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В последние годы проводится интенсивное изучение различных представителей нового класса липидов - катионных бесфосфорных глицеролипидов алкильного типа с целью проведения структурно-функциональных исследований. Среди этих соединений выявлены перспективные медиаторы трансфекции генетического материала в эукариотические клетки. Многие липиды данного класса обладают антибактериальной, ФАТ-антагонистической, антивирусной и противоопухолевой активностью.

К настоящему времени сформулированы основные требования к структуре алкильных глицеролипидов с целью получения веществ, обладающих биологической активностью определенного типа. В большинстве случаев при атоме С(1) должен присутствовать длинноцепной углеводородный остаток (Сю - Сго)> присоединенный к глицериновому скелету простой эфирной, тиоэфирной или

амидной связью, а при С(2) - короткоцепной (С1 - С4), кроме тех случаев, когда липиды применяют в качестве медиаторов трансфекции (в этом случае гидрофобный домен состоит из двух длинноцепных насыщенных или ненасыщенных заместителей). Катионная головка - гетероциклического или алифатического ряда должна быть присоединена к глицериновому скелету либо непосредственно, либо с помощью спейсерной группы длиной от 1 до 8 углеродных атомов.

Учитывая широкий спектр биологического действия катионных липидов алкильного типа, интересным представляется создание конъюгатов этих соединений с другими классами биологически активных веществ для достижения аддитивного или синергического эффекта, а также введение в молекулу данных липидов фрагментов, облегчающих проведение биохимических и биофизических исследований (спиновые, флуоресцентные метки и т.д.).

Для развития структурно-функциональных исследований и для выявления потенциальных противоопухолевых агентов, были синтезированы новые модификационные ряды катионных глицеролипидов с простой эфирной связью, содержащих различные функциональные группы в полярном домене (рис. 1).

г-(Ж

СЖ" ^

Варьирование длины и степени ненасыщенности алкильного заместителя

г-у

I

Изменение природы полярной "головки", включение в ее состав различных функциональных групп

Изменение природы, длины спейсера и типа связывания

Рис. 1. Общие направления модификации структуры алкильных глицеролипидов.

1. ПОЛУЧЕНИЕ АЛКИЛЬНЫХ ГЛИЦЕРОЛИПИДОВ, СОДЕРЖАЩИХ РАЗЛИЧНЫЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ГРУППЫ В ПОЛЯРНОМ ДОМЕНЕ

В развитие структурно-функциональных исследований в области липидов нами синтезированы новые модификационные ряды глицеролипидов с простой эфирной связью. Изменение отдельных структурных единиц молекулы липида позволит определить влияние такой единицы на эффективность биологического действия, проявляемого данным соединением, а наличие функциональной группы открывает возможности для дальнейшей модификации липида путем присоединения разнообразных биологически активных соединений и маркерных меток.

Наши исследования по синтезу глицеролипидов с простой эфирной связью включали следующие направления модификации: 1 ) изменение длины и степени ненасыщенности алкильного заместителя при С(2) атоме глицерина, 2) изменение типа полярной группировки с включением в нее различных функциональных групп (гидроксильной, карбоксильной и аминогруппы), 3) изменение типа связи между гидрофильным и гидрофобным доменами, а также длины спейсерной группировки.

1.1. Синтез функционализированных глицеролипидов с полярными головками, представленными аминами гетероциклического и алифатического ряда

Для получения новых типов катионных липидов был проведен синтез положительно заряженных глицеролипидов с этильным (Et) и аллильным (АН) заместителями при С(2) положении глицерина и различными полярными «головками», присоединенными к глицериновому скелету через спейсерную группу, представленную остатком валериановой кислоты (схема 1).

Ключевыми соединениями в синтезе липидов За, Ь, 5а, и 6а, b являлись гас-1 -октадецил-2-этил-3-(5-бромпентаноил)глицерин (2а) и гас-1 -октадецил-2-аллил-3-(5-бромпентаноил)глицерин (2Ь), которые были получены ацилированием исходных диглицеридов 1а, b хлорангидридом 5-бромвалериановой кислоты в присутствии пиридина (Ру) с выходом 92%. Введение в молекулу липида катионной «головки», содержащей функциональную группу, проводилось путем кватернизации соответствующего третичного амина бромидами 2а и 2Ь в присутствии Nal в среде безводного диметилсульфоксида (ДМСО). Замена брома в условиях реакции Финкельштейна на более реакционноспособный йод позволила сократить продолжительность и смягчить температурный режим процесса, что помогло

избежать осмоления продуктов реакции. Реакцией бромидов 2а, Ь с соответствующими аминами, содержащими функциональные группы, были получены липиды За, Ь И 4а с катионными группами алифатического ряда. После хроматографической очистки на силикагеле выходы данных соединений составили 65-78%.

Схема 1

—ОС18Н37

—OR

—ОН 1а, Ь

a: R = Et Ь: R = АН

—OCi8H37 OR

1-ОСО(СН2)4Вг 2а, b

b-f.

—ОС18Нз7 —OR

-ОСО(СН2)4Х За, b - 6а, b

Соединение X Соединение X

СН3 СНз

За, b —N-(CH2)2OH Г 5а —N-(CH2)2NH3+

СНз СНз

2 CF3COO"

СН3 НзС

4а — N-(CH2)2NHBoc Г 6а, Ь ♦Н

СН3 м

СОО"

Реагенты и условия

Соединение Стадия Реагенты Температура, °С Время, ч Выход, %

2а, b а Br(CH2)4COCI, Ру/ СНС13 20 0.5 92,92

За, b Ь Me2N(CHj)2OH, Nal/ДМСО 70 5 68, 65

4а с Me2N(CH2)2NHBoc, Nal / ДМСО 70 4 78

5а d TFA / CH3CI 0 0.75 76

6а, b f Калиевая соль 6-метилникотиновой кислоты, Nal / CHCI3, МеОН 100 3 74,73

В случае синтеза липида 5а, содержащего аминогруппу в катионной головке, непосредственная кватернизация ЛШчметилэтилендиамина приводила к образованию большого количества побочных продуктов. Поэтому, первым этапом синтеза явилось получение Вос-защищенного соединения Последующее

удаление защиты трифторуксусной кислотой (TFA) в хлороформе приводило к образованию глицеролипида 5а, содержащего в полярной головке аминогруппу в виде трифторацетатной соли.

Анализ условий реакции кватернизации калиевой соли 6-метилникотиновой кислоты бромидами 2а, Ь показал, что для получения липидов 6а, Ь требуется более жесткий температурный режим реакции. Выходы этих липидов, полученных в цвиттер-ионной форме, составили 74% и 73%, соответственно.

Данные 1Н-ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии подтвердили структуру полученных катионных глицеролипидов (таблица 1).

Таблица 1

Физико-химические характеристики липидов За, Ь, 5а и 6а, Ь

Соединение Масс-спектр,т/г (МАШ1-М8) Спектр ЯМР1Н, м.д.

СН2Ы* катионная фуппа

За 544.7 [М-1]* м, 3.75-3.81 с, 3 38 МЛад м, 3.58-3.69 ^СНгСЩЭН; м, 4.т.22 ^СНгСНгОН

ЗЬ 556.2 [М-1]* м, 3.57-3.77 с, 3.34 ^Мва; м, 3.57-3.77 ЬГСНзСНгОН; М, 4.05-4.17 М'СНгСНгОН

5а 544.8 [М-2СР3СООТ м, 3.65-3.92 уш.с., 8.60 Ы'НЭ; м, 2.96 СН2М%

6а 614.8 [М+№]+ м, 4.28-4.37 д, 7.22, д.д, 8.15 и с, 9.07 протоны пиридиниевого кольца; с, 2.60 СН3

6Ь 626.8 [М+МаГ м, 4.26-4.38 д, 7.25, д.д, 8.16 и с, 9.10 протоны пиридиниевого кольца; с, 2.61 СН3

1.2. Синтез алкильных глицеролипидов со спейсерными группами различного типа и длины

Из литературных источников известно, что длина и тип спейсерной группы, соединяющей гидрофобный и гидрофильный домены липида, влияют на его биологическую активность. В связи с этим нами были синтезированы липиды, отличающиеся не только типом полярной группировки, но и длиной спейсера.

1.2.1. Получение катионныхлипидов со спейсерами, представленными остатками длинноцепныхаминокислот

Для выяснения влияния длины спейсерной группы на биологическую активность соединения нами были синтезированы положительно заряженные глицеролипиды, содержащие остатки 6-аминогексановой и 11-аминоундекановой кислот при С(3) атоме глицеринового скелета (схема 2).

Схема 2

-ОС18Н37

-еж

—он

1а, Ь

—ОС18Н37 —(Ж

—ОСО(СНг)пМНВос

7а, Ь 8а, Ь

—ОС18Н37

—сж

с, 4

-ОСО(СН2)пЫНз+ СРзСОО"

9а, Ь 10а, Ь

-ОС18Н37

-с«

-OC0(CH2)nNH(0)C(CH2)2C00H

11а, Ь 12а, Ь

Соединения Я п

7а, 9а, 11а 10

7Ь, 9Ь,11Ь АН 10

8а, 10а, 12а 5

8Ь, 10Ь, 12Ь АН 5

Реагенты и условия

Соединение Стадия Реагенты Температура, "С Время, ч Выход, %, (а/Ь)

7а, Ь а ВосЫН(СН2)10СООН, ЭСС / Ру 20 1.5 78/74

8а, Ь ВосМН(СН2)5СООН, ОСС1 Ру 73/70

9а, Ь; Ь ТРА/СНэС] 40 1.5 93/91

10а, Ь 90/90

11а, Ь; с ЕШСВД 20 1 91/89

12а, Ь с1 янтарный ангидрид, Ру, ОМАР ДМСО/СН3С1 80 4 89/89

Путем прямого ацилирования гас-1-октадецил-2-этилгпицерина (1а) и гас-1-октадецил-2-аллилглицерина (1Ь) N^^11-аминоундекановой или N^^6-аминогексановой кислотами в среде пиридина в присутствии DCC были получены соответствующие Вос-производные 7а, Ь и 8а, Ь, которые после очистки с помощью колоночной хроматографии на силикагеле были выделены с выходами 70-78%. Структура полученных липидов подтверждена данными масс-спектров, а также 1Н-ЯМР-спектров, в которых наблюдались сигналы, относящиеся к протонам нововведенных элементов: синглет

остатков Вос-защищенных аминокислот.

Последующее удаление Вос-защиты действием трифторуксусной кислоты в хлороформе приводило к образованию гас-1-октадецил-2-зтил/аллил-3-(11-аммониоундеканоил)глицеринов (9а, Ь) и гас-1-октадецил-2-этил/аллил-3-(6-аммониогексаноил)глицеринов в виде трифторацетатных солей с выходами

90-93%. 1Н-ЯМР-спектры данных липидов указывали на отсутствие сигнала протонов Bu'-группы при 1.42 мд., что свидетельствует о полном удалении защитной группировки.

Полученные катионные глицеролипиды можно использовать для проведения структурно-функциональных исследований с целью выявления влияния длины спейсера на противоопухолевую активность, предположительно проявляемую данными веществами. С другой стороны, при действии триэтиламином в хлороформе на вышеупомянутые трифторацетатные соли 9а, Ь и 10а, Ь они легко переходят в соединения, содержащие свободную аминогруппу, на базе которой возможны дальнейшие превращения этих липидов. Так, взаимодействие данных свободных аминов с янтарным ангидридом в присутствии Ру и каталитического количества Л/,Л/-диметиламинопиридина (DMAP) приводит к получению глицеролипидов 11а, Ь и 12а, Ь, содержащих карбоксильную группу в полярном домене. Строение полученных соединений было подтверждено данными 1Н-ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии.

12.2 Получение алкильныхглицеролипидов со спейсером сукцинильной природы

В данной части диссертационной работы при синтезе липидов мы изменяли как длину спейсерной группы, так и природу полярной «головки».

Взаимодействие гас-1-октадецил-2-этилглицерина (1а) и гас-1-октадецил-2-аллилглицерина с янтарным ангидридом в присутствии каталитического

количества DMAP приводило к гас-1 -октадецил-2-этил/аллил-3-сукцинилглицеринам

(13a, b) с выходами 97% и 96%, соответственно. Последние действием тионилхлорида переводили в хлорангидриды, которые затем вводили в реакцию с N-Boc-6-аминогексанолом в присутствии пиридина (схема 3). Выходы соединений 14а, b составили 91% и 88%, соответственно, а наличие в 1Н-ЯМР-спектрах характеристических сигалов подтвердило присутствие в их структуре Вос-

защитной группы. Трифторацетатные соли гас-1-октадецил-2-этил-3-(6-аммониогексип)сукцинилгпицерина (15а) и гас-1-октадецил-2-аллил-3-(6-аммониогексил)сукцинипгпицерина (15Ь) получали аналогично соединениям 9а, b и 10а, b действием трифторуксусной кислоты в хлороформе. После хроматографической очистки выходы полученных соединений составили 92 и 91%, соответственно. Структура синтезированных соединений подтверждена данными 1Н-ЯМР- и масс-спектров.

Схема 3

—ОС15Н37 —ОС18Н37 —ОС18Н37

a b,c d —OR -»- —OR -—OR -

—OH l—ocO(CH2)2COOH I— ОСО(СН2)гСОО(СН2)бШВос

1а, b 13а, b 14а, b

—ОС18Н37 -—OR

a: R=Et

LOCO(CH2)2COO(CH2)eNH3+ CF3COO' b: R = AII

16a, b

Реагенты и условия: a) янтарный ангидрид, DMAP, Ру, DMSO, CHCI3, 3 ч, 100°С, 97% и 96%; b) SOCI2, СНС13, В ч, 20°С, с) BocNH(CH2)8OH, Ру, CHCI3, 25 мин., 20°С, 91% и 88%; й) трифторуксусная кислота (TFA), CHCI3,1.5 ч., 40°С, 92% и 91%.

Далее нами был получен липид со спейсерной группой, укороченной на 4 метиленовых фрагмента (схема 4). Как и в случае соединений 14а, Ь, реакцией гас-1-октадецил-2-этил-3-сукцинилглицерина (13а) с тионилхлоридом, а затем с N,N-диметилэтаноламином получали амин 16. После хроматографической очистки выход последнего составил 90%.

Для введения карбоксильной группы в гидрофильный домен проводилась кватернизация третичного амина 16 натриевой солью иодуксусной кислоты. В результате реакции липид 17, также как и глицеролипиды 6а, Ь, был получен в цвиттер-ионной форме. При сравнении спектров 1Н-ЯМР соединений 16 и 17

наблюдался сдвиг сигнала протонов метильных групп при атоме азота в область слабого поля («У = 2.25 м.Д. для 16 и 8 = 3.29 м.д. для 17) и появление сигнала протонов группы -СНгСОО' - синглета с химическим сдвигом 3.90 м.д., что подтверждает наличие в молекуле липида остатка уксусной кислоты.

Схема 4

1.3. Синтез функционализированных алкильныхлипидов с ацетальной связью междугидрофильным и гидрофобным доменами.

Для расширения области поиска соединений, обладающих биологической активностью мы предприняли синтез алкильных глицеролипидов с ацетальной связью между гидрофильным и гидрофобным участками молекулы.

При получении липидов такого типа в качестве исходных соединений обычно используют метилтиометиловые эфиры диглицеридов, которые при взаимодействии с бромом легко образуют высокореакционноспособные а-бромэфиры, реагирующие с нуклеофильными реагентами различного типа (схема 5).

Схема 5

РОСНгБМе ^ОСН2Вг] "" ипиМиН> рЮСН2Ми

N11 = С1Ч, Р, N3, ОМе, ОСН2СН2СМ

Таким образом, на основе гас-1-октадецил-2-этил-3-метилтиометилглицерина (18) нами были синтезированы алкильные глицеролипиды с гидроксильной (21) и карбоксильной (22) группами в полярном домене (схема 6).

гас-1-Октадецил-2-этилглицерин (1а) переводили в соответствующий метилтиометиловый эфир 18 обработкой смесью ДМСО-уксусный ангидрид-уксусная кислота (мольное соотношение 6.5: 3.4 :1) в течение 72 ч.

Схема 6

-OC,8Hb7 —OEt -

-он

1а

OC18Hj7 —OEt

—OOfeSCH) 18

"ОС, 8^7

-ов

Me I

—0С,8Нз7

-OEt

—OCHzBr 19

-ООЩСНг^СНгЬОН Г

21 Me

OC1JH37

—OEt

—0CH¡0(»fe)2Br 20

!Г К

-OC^O^N y

22

COO"

Реагенты и условия: а) ДМСО-АсгО-АсОН, 20'С, 72 ч, 66%; Ь) Вг2,2,6-лутидин, Вг(СН2)2ОН, дихлорэтан, 20'С, 20 мин., 56%; с) Me2N(CH2)2OH, Nal, ДМСО, 70*С, 5 ч., 62%; d) калиевая соль 6-метилникотиновой кислоты, МеОН, СНС13, Nal, ЮО'С, 3 ч., 71%.

Для получения ключевого соединения 20 на метилтиометиловый эфир диалкилглицерина 18 воздействовали бромом в присутствии 2,6-лутидина. Образующийся а-бромэфир 19 без выделения вводили во взаимодействие с 2-бромэтанолом. В результате после хроматофафической очистки соединение 20 было получено с выходом 56%. 1Н-ЯМР-спектр данного соединения содержит характеристический сигнал протонов ацетальной группы - синглет с химическим сдвигом 4.73 м.д.

Функционализированные липиды 21 и 22 синтезировали аналогично соединениям За, Ь и 4а, переводя их в четвертичные аммониевые производные путем кватернизации бромидом 20 соответствующих аминов.

Кроме того, на основе соединения 20 были получены серосодержащие глицеролипиды, содержащие гидроксильную, карбоксильную или аминогруппу в полярном домене.

Взаимодействием бромида 20 с соответствующими меркаптанами в среде безводного этанола в присутствии избытка КОН были получены функционализированные липиды 23-25 (схема 7) Во избежание окисления вИ-группы в процессе реакции синтез проводили в атмосфере аргона.

Схема7

—0СН20(СН2)2Вг 1—0СН20(СН2)25СН2Я

20 23-25 Реагенты и условия: НвС^К КОН, ЕЮН, 5 ч, 20°С.

Соединение Я Выход, %

23 -СН2ОН 77

24 -СООН 72

25 -СН2МН2 65

После хроматографической очистки полученные соединения были выделены с выходами 65-77%, а дачные 1Н-ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии подтвердили их структуру.

Дальнейшие модификации полученных соединений можно проводить не только по функциональным группам, но и по атому серы с целью получения положительно заряженных глицеролипидов с катионной головкой сульфониевого типа.

Таким образом, в результате проделанной работы были получены новые модификационные ряды глицеролипидов алкильного типа, отличающиеся по определенным структурным доменам (рис. 2). Характерной особенностью полученных соединений является наличие функциональной группы (карбоксильной, гидроксильной или аминогруппы) в полярном домене, что позволяет проводить дальнейшие химические превращения данных липидов, с целью поиска потенциальных терапевтически активных веществ, а также для проведения биохимических и биофизических исследований.

Рис. 2. Проведенные модификации структуры алкильных глицеролипидов.

2. ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ СИНТЕЗИРОВАННЫХ ЛИПИДОВ

2.1. Исследование цитотоксического действия синтезированныхсоединений

Для поиска потенциальных противоопухолевых агентов нами проводилось изучение цитотоксичности отдельных представителей всех типов синтезированных липидов, а именно - За, Ь, 11а, Ь, 15а И 21. Различия в строении соединений данного ряда позволяют проследить и выявить влияние отдельных структурных элементов на появление у этих глицеролипидов противоопухолевой активности.

Изучение цитотоксической активности исследуемых липидов проводили с использованием колориметрического МТТ-теста на клетках лейкоза человека К562 и на неопухолевых фибробластах кожи1.

Исходя из полученных данных (рис. 3) можно заключить, что наиболее токсичными для клеток лейкоза оказались липиды За и 21 (ICso 4.7±1.0 мкМ и 4.0±0.9 мкМ, соответственно). В то время как IC50 Эдельфозина, проходящего клинические испытания, для этих же клеток составляет 57.9 ± 3.2 мкМ [Civoli F., Daniel L.W. // Cancer Chemother. Pharmacol. - 1998. - Vol. 42. - P. 319-326]. Остальные соединения проявили более низкую цитотоксическую активность.

Полученные результаты позволяют сделать выводы о влиянии отдельных структурных единиц на активность липида. Так, введение ненасыщенного аллильного заместителя вместо этильного в С(2) положение глицерина (липиды За и снижает противоопухолевую активность соединения. Отсутствие

в молекуле катионной группы также уменьшает цитотоксичность соединения (15а и 11а, Ь). В то же время изменение типа связи между гидрофильным и гидрофобным доменами не оказывает заметного влияния на активность липида (соединения и

Рис. 3. Токсичность алкильных глицеролипидов За, b, 11a, b, 15а и 21 по отношению к опухолевым клеткам лейкоза человека К562. Время инкубации клеток с липидами -72 ч.

21).

100

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 концентрация липида, мкМ

1 Экспериментальная работа выполнена д.м.н. Штилем А.А. в лаборатории механизмов клеточной гибели НИИ канцерогенеза ГУ РОНЦ им.Н.Н.Блохина, РАМН.

Одним из главных требований, предъявляемых к противораковым препаратам, является их минимальная токсичность для неопухолевых клеток. Для выяснения этого аспекта были проведены испытания образцов липидов на токсичность по отношению к неопухолевым фибробластам кожи.

В соответствии с экспериментальными данными, представленными на рис. 4., катионные липиды оказались гораздо менее токсичными по

отношению к неопухолевым фибробластам кожи, чем к злокачественным клеткам. При этом наблюдались те же структурно-функциональные закономерности, которые были обнаружены для клеток К562, кроме влияния типа связи между гидрофильным и гидрофобным участками. Так, липид 21 с кислотолабильной ацетальной связью обладает намного большим 1С50 (38.2±2.0 мкМ), чем липид За, у которого гидрофильный домен присоединен к гидрофобному участку сложноэфирной связью (1С6о 9.0±1.2 мкМ).

Таким образом, исследования цитотоксичности синтезированных алкильных глицеролипидов позволили проследить влияние таких

структурных элементов, как длина и степень ненасыщенности заместителя в С(2) положении глицерина, природа полярной «головки» и тип связи между гидрофильным и гидрофобным доменами, на противоопухолевую активность этих соединений. По результатам биологических испытаний липиды За и 21, обладающие низкой для опухолевых клеток К562 и малотоксичные для нормальных клеток, были рекомендованы для дальнейших исследований с целью изучения возможности их применения в качестве противоопухолевых агентов.

О 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 концентрация липида, мкМ

Рис. 4. Токсичность синтезированных глицеролипидов За, Ь, 11а, Ь, 15а и 21 по отношению к неопухолевым фибробластам кожи. Время инкубации клеток с липидами - 72 ч.

2.2. Изучение возможности применения катионных глицеролипидов алкильного типа в борнейтронзахватной терапии раковыхопухолей Из литературных источников известно, что положительно заряженные алкильные глицеролипиды с короткоцепными заместителями при С(2) атоме глицерина обладают способностью накапливаться в раковых клетках. В связи с этим целесообразным представляется изучение возможности применения таких липидв для доставки соединений бора в опухолевые клетки, что лежит в основе одного из перспективных методов лечения рака - борнейтронзахватной терапии (БНЗТ).

С этой целью гас-1-октадецил-2-этилглицерин (1а) и гидроксилсодержащий катионный глицеролипид За были переданы в Институт общей и неорганической химии им. Н.С. Курнакова РАН, где на их основе были синтезированы борсодержащие липофильные соединения 26 и 2 72.

• ВН

26 27

В отличие от положительно заряженного липида За, в опытах in vitro соединения 26 и 27 оказались малотоксичными и для опухолевых (А) и для нормальных (В) клеток (рис. 5).

Предварительные опыты in vivo3 показали, что для соединения 27 накопление бора в опухоли (меланома В-16) в 1.4 раза больше (11.3 мкг В/г), чем для BSH -одного из двух препаратов для БНЗТ, используемых в мировой практике для клинической БНЗТ. В случае соединения 26 концентрация бора в опухолевой ткани была 5.3 мкг/г - в 2 раза ниже, чем требуется для проведения БНЗТ.

2 Данная работа проведена под руководством сн.с, к.х.н. Жижина К.Ю. в лаборатории энергоемких

веществ и материалов, ИОНХ им. Н. С. Курнакова, РАН.

3 Эксперименты in vivo проведены к б н. Григорьевой Е.Ю. в лаборатории радиоизотопных методов

исследования, НИИ канцерогенеза ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина, РАМН.

На основании полученных экспериментакьных данных борсодержащее липофильное производное 27 можно рекомендовать для дальнейших исследований с целью выяснения возможности его использования в борнейтронзахватной терапии рака.

А

0,4 0,8 1,6 3,2 6,4 12,5 25 50 концентрация липида, мкМ

концентрация липида, мкМ

Рис. 5. Токсичность катионного глицеролипида За и карбонил-клозо-боратных липофильных производных 26 и 27 по отношению к клеткам К562 (А) и неопухолевым фибробластам кожи (В). Инкубация клеток с данными соединениями продолжалась 72 ч.

ВЫВОДЫ

1. Синтезированы новые глицеролипиды с набором алкильных короткоцепных заместителей при С(2) атоме углерода и аммониевыми «головками» гетероциклического и алифатического ряда, содержащими различные функциональные группы.

2. Созданы модификационные ряды алкильных глицеролипидов, в которых гидрофильный домен отделен от гидрофобного участка спейсерными группами различной длины.

3. С использованием метода метилтиометиповых эфиров получены новые функционализированные глицеролипиды алкильного типа с ацетальной связью между гидрофильным и гидрофобным доменами.

4. Липиды наработаны в количествах, достаточных для биологических испытаний на противоопухолевую активность in vitro, по результатам которых выявлены соединения, перспективные для дальнейших исследований.

5. Показана перспективность дальнейшего исследования липофильного борсодержащего соединения 27, полученного на основе катионного глицеролипида За с гидроксильной группой в полярном домене, для использования в борнейтронзахватной терапии.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:

1. Плявник Н.В., Маслов МЛ., Серебренникова ГА Синтез катионных глицеролипидов алкильного типа с функциональными группами в полярном домене. // Биоорган, химия. - 2004. -Т. 30, № 5. - С. 507-511.

2. Плявник Н.В., Серебренникова ГА Синтез катионных алкильных глицеролипидов с функциональными группами в полярном домене. // Ученые записки МИТХТ. - 2003. - Вып. 8. - С. 36-38.

3. Маслов М.А., Серебренникова ГА, Морозова Н.Г., Альшоэйби З.Я., Константинова Т.В., Плявник Н.В. Катионные липиды и перспективы их применения в генной терапии. // Тезисы научных докладов 1-го Международного Конгресса «Биотехнология - состояние и перспективы развития». - Москва. - 2002. - С. 31.

4. Плявник Н.В., Серебренникова ГА Получение положительно заряженных функционализированных глицеролипидов. // Тезисы научных докладов III съезда биохимического общества. - Санкт-Петербург. - 2002. - С. 354.

5. Плявник Н.В., Серебренникова ГА Синтез положительно заряженных глицеролипидов алкильного типа с функциональными группами в гидрофильном домене. // Материалы VIII Международной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии - 2002». - Уфа. - 2002. - С. 98.

6. Серебренникова ГА, Морозова Н.Г., Маслов М.А., Соколова Т.В., Плявник Н.В. Разработка методов синтеза физиологически активных катионных липидов с различным набором спиртов, гидрофобных компонентов, азотистых оснований и аминокислот с целью использования их в генной терапии и других областях медицины. // Тезисы докладов отчетной конференции за 2002 год «Химия и химические продукты». - Москва. - 2003. - С. 183-184.

7. Плявник Н.В., Серебренникова ГА. Разработка методов синтеза катионных глицеролипидов, содержащих гидроксильную и аминогруппу в полярном домене. // Тезисы докладов X Международной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии - 2004». - Волгоград. -2004.-Т. 1.-С. 217-218.

8. Лисовский М.В., Плявник Н.В., Серебренникова ГА, Жижин К.Ю., Малинина Е.А., Кузнецов Н.Т. Получение новых липофильных производных кластерных анионов бора для нейтронозахватной терапии. // Тезисы докладов X Международной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии - 2004». - Волгоград. - 2004. - Т. 1. - С. 271-274.

9. Лисовский М.В., Плявник Н.В., Серебренникова Г.А., Жижин К.Ю., Малинина Е.А., Кузнецов Н.Т. Карбонил-клозо-боратные анионы и [Bi2Hii(CO)r в синтезе липофильных соединений. // Журн. неорган, химии, (в печати).

10. Plyavnik N.V., Maslov М.А., Serebrennikova G.A. Synthesis of novel alkyl-type functionalised glycerolipids from methylthiomethyl ethers // Mendeleev Commun. (in press).

■-24887

Принято к исполнению 22/11/2004 Исполнено 23/11/2004

Заказ № 478 Тираж 90 экз

000«11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр т, 20-2-93

www autoreferat ru

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

2.1. Синтез и применение положительно заряженных глицеролипидов с длинноцепными заместителями

2.2. Синтез катионных глицеролипидов апкильного типа с короткоцепными заместителями при С(2) атоме глицерина

2.2.1. Фосфорсодержащие глицеролипиды с простой эфирной связью

2.2.2. Бесфосфорные катионные глицеролипиды алкильного типа

2.3. Биологическая активность катионных глицеролипидов алкильного типа с короткоцепным заместителем при С(2) атоме глицерина

2.3.1. Положительно заряженные глицеролипиды - антагонисты ФАТ

2.3.2. Катионные липиды - ингибиторы мембраносвязанной протеинкиназы С и некоторых других ферментов

2.3.3. Противовирусная активность алкильных глицеролипидов

2.3.4. Противоопухолевое действие положительно заряженных глицеролипидов алкильного типа

2.4. Структурные модификации катионных глицеролипидов с простой эфирной связью

2.4.1. Применение алкильных глицеролипидов в борнейтронзахватной терапии рака

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 42 3.1. Получение алкильных глицеролипидов, содержащих различные функциональные группы в полярном домене

3.1.1. Синтез функционализированных глицеролипидов с полярными головками, представленными аминами гетероциклического и алифатического ряда

3.1.2. Синтез алкильных глицеролипидов со спейсерными фуппами различного типа и длины

3.1.2.1. Получение катионных липидов со спейсерами, представленными остатками длинноцепных аминокислот

3.1.2.2. Получение алкильных глицеролипидов со спейсером сукцинильной природы

3.1.3. Синтез функционализированных алкильных липидов с ацетальной связью между гидрофильным и гидрофобным доменами

3.2. Изучение биологической активности синтезированных липидов

3.2.1. Исследование цитотоксического действия синтезированных соединений

3.2.2. Изучение возможности применения катионных глицеролипидов алкильного типа в борнейтронзахватной терапии раковых опухолей

4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

4.1. Получение алкильных глицеролипидов, содержащих различные функциональные группы в полярном домене

4.1.1. Синтез функционализированных глицеролипидов с полярными головками, представленными аминами гетероциклического и алифатического ряда

4.1.2. Синтез алкильных глицеролипидов со спейсерными группами различного типа и длины

4.1.2.1. Получение катионных липидов со спейсерами, представленными остатками длинноцепных аминокислот

4.1.2.2. Получение алкильных глицеролипидов со спейсером сукцинильной природы

4.1.3. Синтез функционализированных алкильных липидов с ацетальной связью между гидрофильным и

4.2. Изучение биологической активности синтезированных липидов 81 4.2.1. Исследование цитотоксического действия синтезированных соединений

5. ВЫВОДЫ 83 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ФАТ - фактор активации тромбоцитов

ВИЧ-1 - вирус иммунодефицита человека, тип

РНК - рибонуклеиновая кислота

РКС - протеинкиназа С

DOPE -1,2-диолеоилфосфатидилэтаноламин

DOSPA - ЛЦ2,3-ди(олеилокси)проп-1 -ил]-Л/-[2-(6-спермилкарбониламино)этил]

Л/,Л/-диметиламмонийтрифторацетат DOTMA - Л/-[2,3-ди(олеилокси)проп-1 -ил]-Л/,Л/,Л/-триметиламмонийхлорид ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ЕТ-18-ОМе - Edelfosine, 1-октадецил-2-метил-лас-глицеро-3-фосфохолин Тг - тритил Ts - тозил Ms - мезил

DAG - диацилглицеринкиназа

PS - фосфатидилсерин

AZT - З'-азидо-З'-дезокситимидин

Ага-С - l-p-D-арабинофуранозилцитозин dFdC - гемцитабин

DCC - Л/,Л/'-дициклогексилкарбодиимид

Фосфорсодержащие глицеролипиды алкильного типа являются предметом интенсивных исследований. Это, прежде всего, связано с открытием липидного биорегулятора широкого спектра действия - фактора активации тромбоцитов (ФАТ). Поскольку сам ФАТ не может быть использован в терапевтических целях из-за его мощного тромбоцит-агрегирующего действия, было синтезировано большое количество его структурных аналогов. Оказалось, что многие структурные аналоги ФАТ алкильного типа проявляют сильную противоопухолевую активность, ингибируя действие клеточных ферментов и пролиферацию злокачественных клеток, что вызывает их лизис, а также активируют цитотоксические макрофаги, препятствуют образованию метастаз.

Одним из соединений, обладающих сильной противоопухолевой активностью, является Эдельфозин (Edelfosine, 1 -октадецил-2-метил-гас-глицеро-3-фосфохолин, ЕТ-18-ОМе), близкий по структуре к ФАТ. Выяснилось, что ЕТ-18-ОМе ингибирует рост и пролиферацию различных опухолевых клеток in vivo и in vitro.

В настоящее время большое внимание привлекают неприродные представители катионных бесфосфорных глицеролипидов алкильного типа. Интерес к данному классу соединений, прежде всего, связан с возможностью их использования в липосомапьной форме для доставки генетического материала в эукариотические клетки, что является центральной проблемой генной терапии. Данные соединения, как правило, являются производными длинноцепных 1,2-диалкилглицеринов. Модификация молекулы катионных алкильных глицеролипидов путем введения короткоцепного заместителя в С(2) положение глицеринового скелета (как у ФАТ) приводит к появлению у них таких биологических эффектов, как противоопухолевый, противовирусный (анти-ВИЧ-1), ФАТ-антагонистический или антибактериальный. В связи с этим, представляется актуальным создание новых положительно заряженных глицеролипидов алкильного типа с короткоцепными заместителями при С(2) атоме глицерина с целью выявления среди них соединений, обладающих биологической активностью.

Введение реакционноспособных функциональных групп в полярный домен алкильных глицеролипидов открывает широкие перспективы в использовании таких соединений для их конъюгации с различными биологически активными веществами или мечеными зондами. Так, для исследования действия ферментов, участвующих в метаболизме липидов, или для изучения процессов, протекающих в биологических мембранах, широко используют молекулярные липидные зонды, содержащие флуоресцентные, спиновые, фотореактивные метки. Кроме того, наличие функциональных групп открывает возможности для получения на основе таких липидов липофильных производных бора для борнейтронзахватной терапии рака.

Настоящая работа выполнена в соответствии с планом научных исследований кафедры ХТБАС МИТХТ им. М. В. Ломоносова по теме № 1Б-4-865 «Синтез супрамолекулярных структур на основе порфиринов, липидов и углеводов с целью изучения процессов, протекающих в клетке, и создания препаратов для онкологии, генной терапии и других областей медицины» и при поддержке РФФИ, проекты № 01-03-332334, 03-03-32482, 04-03-32452, научно-технической программы «Научные исследования высшей школы по приоритетным направлениям науки и техники», подраздел «Лекарственные и биологически активные вещества» № 203.05.04.005, фанта Президента РФ по поддержке ведущих научных школ России № НШ-2013.2003.3.

На защиту выносятся следующие основные положения:

• Получение глицеролипидов с набором алкильных заместителей при С(2) атоме углерода и полярных доменов, представленных гетероциклическими и алифатическими аминами, содержащими различные функциональные группы.

• Разработка методов синтеза алкильных глицеролипидов со спейсерными группами различной длины.

• Синтез функционализированных алкильных глицеролипидов с использованием метода метилтиометиловых эфиров.

• Анализ результатов биологических исследований синтезированных липидов и их борсодержащих производных в экспериментах in vitro.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

ПОЛОЖИТЕЛЬНО ЗАРЯЖЕННЫЕ ГЛИЦЕРОЛИПИДЫ С ПРОСТОЙ ЭФИРНОЙ

СВЯЗЬЮ

Глицеролипиды алкильного типа широко распространены в природе и, благодаря широкому спектру проявляемой ими биологической активности, вызывают неугасающий интерес исследователей уже на протяжении нескольких десятилетий. Среди этих соединений были обнаружены вещества с ФАТ-антагонистическим, анти-ВИЧ-1 и противоопухолевым действием [1-3], а также показана перспективность применения таких липидов в качестве компонентов липосом для доставки генетического материала в эукариотические клетки [4] и при изучении функционирования модельных мембран [5]. К настоящему времени накоплено большое количество данных по структуре катионных липидов, их синтезу и зависимостью меаду структурой и проявляемой ими биологической активностью. Структуру таких липидов можно представить общей формулой 1 [59]:

CH2-XR' I

СН—OR" СН2—Z-Y* Q" 1 где Х-О, S, OCONH;

R' - длинноцепной (С10-С20) алкил, алкенил или ацил;

R-длинноцепной (Сю-Сго) или короткоцепной (С1-С4) алкильный заместитель; Z - может отсутствовать или представлять собой спейсерную группу алкильного, ацильного или амидного типа длиной 1-8 атомов углерода;

Y* - аммониевая (реже сульфониевая) алифатическая группа с небольшими (Сг Сз) заместителями алкильного типа либо гетероциклическая головка с положительно заряженным атомом азота или серы (пиридиниевая, тиазолиниевая и др.); Q" - противоион (НаГ, АсО', TsO" и тд.).

Было показано что, биологическое действие глицеролипидов с простой эфирной связью зависит от длины углеводородных заместителей, формирующих их гидрофобный домен. Так, эффективными медиаторами процесса трансфекции эукариотических клеток являются соединения, содержащие два длинноцепных заместителя (С12-С18). Замена же длинноцепной группы при С(2) атоме глицерина на короткоцепную приводит к появлению у соединений ФАТ-антагонистического, противоопухолевого или антивирусного действия.

5. ВЫВОДЫ

1. Синтезированы новые глицеролипиды с набором алкильных короткоцепных заместителей при С(2) атоме углерода и аммониевыми «головками» гетероциклического и алифатического ряда, содержащими различные функциональные группы.

2. Созданы модификационные ряды алкильных глицеролипидов, в которых гидрофильный домен отделен от гидрофобного участка спейсерными группами различной длины.

3. С использованием метода метилтиометиловых эфиров получены новые функционализированные глицеролипиды алкильного типа с ацетальной связью между гидрофильным и гидрофобным доменами.

4. Липиды наработаны в количествах, достаточных для биологических испытаний на противоопухолевую активность in vitro, по результатам которых выявлены соединения, перспективные для дальнейших исследований.

5. Показана перспективность дальнейшего исследования липофильного борсодержащего соединения 27, полученного на основе катионного глицеролипида За с гидроксильной группой в полярном домене, для использования в борнейтронзахватной терапии.

1. Civoli F., Daniel L.W. Quaternary ammonium analogs of ether lipids inhibit the activation of protein kinase С and the growth of human leukemia cell lines // Cancer Chemother Pharmacol. 1998. - V. 42. - P. 319.

2. Константинова И.Д., Серебренникова Г.А. Положительно заряженные липиды: структура, методы синтеза, применение // Успехи химии. 1996. -Т. 65 (6).-С. 581.

3. Константинова И.Д., Зайцева Н.М., Ушакова И.П., Серебренникова Г.А. Синтез катионных липидов алкильного типа с коротко цепными заместителями при атоме С(2) глицеринового скелета. // Изв. АН, Сер. хим.- 1994. №. 10.-С. 1826.

4. Miller A.D. Cationic liposomes for gene therapy. // Angew. Chem. Int. Ed. -1998.-V. 37.-P. 1768.

5. Feigner P.L., Ringold G.M. Cationic liposome mediated transfection // Nature.- 1989. V. 337 (26).-P. 387.

6. Feigner P.L., Gadek T.R., Holm M., Roman R.S., Chan H.W., Wenz M., Northrop J.P., Ringold G.M., Danielsen M. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA transfection procedure. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1989. -V. 84.-P. 7413.

7. Malone R.W., Feigner P.L., Verma I.M. Cationic liposome mediated RNA transfection. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1989. - V. 86 (16) - P. 6077.

8. Pat. 4.897.355 USA. МКИ5 A 61 К 9/50. Л/ю,((о 1 )-dialkyloxy.-and A/[cd,(cd - 1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-/V,A/,A/-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefore. / Eppstein D.A., Feigner P.L., Gadek T.R., Jones G.H., Roman R.S.

9. Lasic D.D. Liposomes in gene delivery. CRC Press., N.-Y., 1997.

10. Miller A.D. Cationic liposomes for gene therapy. // Angew. Chem. Int. Ed. -1998.-V. 37.-P. 1768.

11. Богданенко E.B., Свиридов Ю.В., Московцев A.A. и Жданов Р.И. Невирусный перенос генов in vivo в генной терапии. // Вопросы мед. химии.- 2000. Т. 46 (3). - С. 223.

12. Маспов М.А., Сычева Е.В., Морозова Н.Г., Серебренникова Г.А. Катионные амфифилы липидной и нелипидной природы в генной терапии. // Изв. АН, Серия хим. 2000. - №. 3. - С. 385.

13. Фаворова О.О. Лечение генами фантастика или реальность. // Соросовский образовательный журнал. - 1997. - № 2. - С. 21.

14. Okayama R., Noji М., Nakanishi М. Cationic cholesterol with a hydroxyethylamino lead group promotes significantly liposome- mediated gene transfection. // FEBS Lett. 1997. -V. 408. - P. 232.

15. Kisoon N., Ariatti M., Moodely T. A novel cationic cholesterol derivative, its formulation into liposomes and the efficient transfection of the transformed human cell lines HepG2 and HeLa. // Drug Deliv. 2002. - V. 9 (3). - P. 161.

16. Ghosh Y.K., Visweswariah S.S., Bhattacharya S. Advantage of the ether linkage between the positive charge and the cholesteryl skeleton in cholesterol-based amphiphiles as vectors for gene delivery. // Bioconjugate Chem. 2002. - V. 13 (2). - P. 378.

17. Ren T. and Liu D. Synthesis of diether-linked cationic lipids for gene transfer. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1999. - V. 9. - P. 1247.

18. Ren T. and Liu D. Synthesis of cationic lipids from 1,2,4-butanetriol. // Tetr. Lett. 1999.-V. 40.-P. 209.

19. Thierry A.R., Lunardi-lskandar Y., Bryant J.L., Rabinovitcs P., Gallo R.C. Mahan L.C. Systemic gene therapy: biodistribution and long-teem expression of a transgene in mice. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. - V. 92. - P. 9742.

20. Wang J.K., Guo X., Xu Y. H., Barron L. and Szoka F.C. Synthesis and characterization of long chain alkyl acyl carnitine esters. Potentially biodegradable cationic lipids for use in gene delivery. // J. Med. Chem. 1998. -V. 41.-P. 2207.

21. Karmali P.P., Kumar V.V. and Chaudhuri A. Design, Syntheses and In Vitro Gene Delivery Efficacies of Novel Mono-, Di- and Trilysinated Cationic Lipids: A Structure-Activity Investigation. // J. Med. Chem. 2004. - V. 41 (8). - P. 2123.

22. Pinnaduwage P., Schmitt L. and Huang L. Use of quaternary ammonium detergent in liposome mediated DNA transfection of mous L-cells. // Biochim. Biophys. Acta. 1989. -V. 985. - P. 33.

23. Bhattacharya S. and Mandal S.S. Evidence of interlipidic ion-rairing in anion-induced DNA release from cationic amphiphile-DNA complexes. Mechanistic implications in transfection. // Biochemistry. 1998. - V. 37. - P. 7765.

24. Levents R. and Silvius J.R. Interaction of mammalian cells with lipid dispersions containing novel metabolizable cationic amphiphiles. // Biochim. Biophys. Acta. 1990. -V. 1023.-P. 124.

25. Feigner J.H., Kumar R., Sridhar C.N., Wheeler C.J., Tsai Y.L., Border R., Ramsey P., Martin M., Feigner P.L. Enhanced gene delivery and mechanism studies with novel series of cationic lipid formulations. // J. Biol. Chem. 1994. -V. 269. - P. 2550.

26. Маслов M.A., Сычева E.B., Морозова Н.Г., Серебренникова Г.А. Синтез алкильных глицеролипидов с различными катионными головками, присоединенными непосредственно к глицериновому скелету. // Изв. АН, Серия хим. 1999. - №. 7. - С. 1381.

27. Маслов М.А. Синтез и изучение свойств положительно заряженных гидрофобных производных циклических и ациклических полиолов. // Диссертационная работа на соискание ученой степени кандидата химических наук. 2000. - С. 43.

28. Kaneko Y. and Tsukamoto A. Structural characteristics of cationic liposomes with potent enhancing effect on retroviral transduction into human hepatoma cells. // Cancer Lett. -1996. V. 105. - P. 39.

29. Tremblay P.A., Kates M. Chemical synthesis of sn-3-phosphatidylsulfocholine, a sulfonium analog of lecithin. // Can. J. Biochem. 1997. - V. 57. - P. 595.

30. Duclos R.I., Chia H.H., Abdelmageed O.H., Esber H., Fournier D.J. and Makriyannis A. Synthesis of racemic and nearly optically pure ether lipids and evaluation of in vitro antineoplastic activities. // J. Med. Chem. 1994. - V. 37. -P. 4147.

31. Kates M., Adams G.A., Blank M.L. and Snyder F. Chemical synthesis and physiological activity of sulfonium analogues of platelet activating factor. // Lipids. 1991. -V. 26 (12). - P. 1095.

32. Heymans F., Borrel M.C., Broquet C., Lefort J., Godfroid J.J. Structure activity relationship in PAF-acether. 2. rac-1-Octadecyl-2-acetyl-3-y-(dimethylamino) propyl.glycerol. // J. Med. Chem. - 1985. - V. 28. - P. 1094.

33. Godfroid J.J. and Heymans F. Chemistry of PAF antagonists. // In: Progress in Biochemical Pharmacology. / Ed. Braquet P. Basel. Etc. Karger. -1998. V. 22. - P. 25.

34. Pat. 0.321.296 Ai EPA. С 07 D 249/14. Preparation of lipid analogs as Platelet Activation Factor (PAF) antagonists and Antitumor Agents. / Susumu K., Takeaki M., Tatsuo Т., Morio K.

35. Maslov M.A., Morozova N.G. and Serebrennikova G.A. Convenient synthesis of cationic glycerolipids via methylthiomethyl ethers. // Mendeleev Commun. -2000. № 2. - P. 65.

36. Shukla Sh.D. Inositol phospholipid turnover in PAF transmembrane signaling. // Lipids. 1991. -V. 26 (12). - P. 1028.

37. Евр. пат. 0336142, МКИ C07F9/12 Novel antagonists of platelet activating factor/Wissner A., Schaub R.E., Sum P.-E.-Опубл. 11.10.1989. Бюлл. 89/41.

38. Braguest P., Godfroid J.J. Conformational properties of PAF acether receptor on platelets based on structure activity studies. // In: Platelet Activating Factor and Related Lipid Mediators. / Ed. Snyder F. New York: Plenum Press. - 1987. -P. 191.

39. Di Guilio A., Oratore A., Tozzi-Ciancarelli M.G., Grifo C., Finazzi-Argo A. Controlled human RBS modifications affecting the binding of cationic liposomes. // Biochem. Int. 1988. - V. 16 (6). - P. 999.

40. Helmut K. and Mangold H.K. Synthesis of biologically active ether lipids. // In: Prog. Biochem. Pharmacol. / Ed. Braquet P. Basel etc. Karger. 1988. -V. 22. -P. 1.

41. Miyamoto Т., Ohno H., Yano Т., Okada Т., Hamonaka N. and Kawasaki A. ONO 6240: A new potent antagonist of platelet activating factor. // Thrid Intern. Congress of inflammation. Paris. - 1984. - P. 513.

42. Godfroid J.J., Heymans F. Chemistry of PAF antagonists. // In: Prog. Biochem. Pharmacol. / Ed. Braquet P. Basel etc. Karger. 1988. -V. 22. - P. 25.

43. Pat. 0.302.744 A2 Ера. С 07 D 239/36. Preparation of glycerol derivatives and antitumor agents and pharmaceutical compositions containing them. / Keizo I., Hiroaki N., Eiko I.

44. Capaccioli S., Dipasquale G., Mini E., Mazzei T. and Quattrone A. Cationic lipids improve antisense oligonucleotide uptake and prevent degradation in cultured cells and in human serum. // Biochem. Biophys. Res. Com. 1993. - V. 197 (2). -P. 818.

45. Wang K.S., Monden M., Kanai Т., Gotoh M., Umeshita K., Ukei T. and Mori T. Protective effect of platelet-activating factor antagonist on ischemia-induced liver injury in rats. // Surgery. -1993. V. 113 (1). - P. 76.

46. Desquand S. Effects of PAF antagonists in experimental models possible therapeutical implication. //Therapie. -1993. -V. 48 (6). - P. 585.

47. Koltai M., Hosford D., Braquet P. PAF-induced amplification of mediator release in septic shock prevention or downregulation by PAF antagonists. // J. of Lipid Mediators. - 1993. V. 6. - P. 183.

48. Terashita Z., Tsushima S., Yoshioka Y., Nomura H., Inada Y. and Nishikawa K. C-3988 a specific antagonist of platelet activating factor (PAF). // Life Sci. -1983.-V. 32.-P. 1975.

49. Wichrowski В., Jouquey S., Braquet C. Heymans F., Fichelle J. and Worcel M. Structure-activity relationship in PAF-acether. Synthesis of carboxylate isosteres. //J. Med. Chem. 1988. -V. 31 (2). - P. 410.

50. Schreiber B.M., Layne M.D. and Modest E.J. Superoxide production by macrophages stimulated in vivo with synthetic ether lipids. // Lipids. 1994. - V. 29 (4). - P. 237.

51. Vogler W.R., Olson A.C., Hajdu J., Shoji M., Raynor R. and Kuo J.F. Structure-function relationships of alkyl-lysophospholipid analogs in selective antitumor activity. II Lipids. 1993. - V. 28 (6). - P. 511.

52. Seewold M.J., Olsen R.A., Sehgal I., Melder D.C., Modest E.J. and Powis G. Inhibition of grouwn factor dependent inositol phosphate Ca2+ signaling by antitumor ether lipid analogues. // Cancer Res. 1990. - V. 50 (15). - P. 4458.

53. Van Blitterswijk W.J., Van der bend R., Kramer I.M., Verhoeven A.J., Hilkmann H., De Widt J. A Metabolite of an antineoplastic ether phospholipid may inhibit transmembrane signaling via protein kinase C. // Lipids. 1987. - V. 22 (11). -P. 842.

54. Civoli F., Daniel L.W. Quaternary ammonium analogs of ether lipids inhibit the activation of protein kinase С and the growth of human leukemia cell lines. // Cancer Chemother. Pharmacol. 1998. -V. 42. - P. 319.

55. Jan C.R., Wu S.N. and Tseng C.J. The ether lipid ET-18-OCH3 increases cytosolic Ca2+ concentrations in Madin Darby canine kidney cells. // Br. J. Pharmacol. 1999. -V. 127 (6). - P. 1502.

56. Gratas C., Powis G. Inhibition of phospholipase D by agents that inhibit cell growth. // Anticancer Res. 1993. - V. 13. - P. 1239.

57. Winkler J.D., Eris Т., Sung C.M., Chabot-Fletcher M., Mayer R.J., Surette M.E. and Chilton F.H. Inhibitors of coenzyme A-independent transacylase induce apoptosis in human HL-60 cells. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1996. -V. 279. -P. 956.

58. Goddat J., Coste H., Vilgrain I., Chambaz E. and Driguez H. Derivatives of di-O-octanoylglycerol and mono-O-octylglycerol as modulators of protein kinase С and diacylglycerol kinase activities. // Lipids. -1992. -V. 27 (5). P. 331.

59. Morris-Natschke S.L., Meyer K.L., Marasco C.J., Piantadosi C., Rossi F., Godwin P.L., Modest E.J. Synthesis of quaternary amine ether lipids and evaluation of neoplastic cell growth inhibitory properties. // J. Med. Chem. -1990.-V. 33 (6).-P. 1812.

60. Fields A.P., Bednarik D.P., Hess A. and May W.S. Human immunodeficiency virus induces phosphorilation of its cell surface receptor. // Nature. -1988. V. 333. - P. 278.

61. Meyer K.L., Marasco C.J., Morris-Natschke S.L., Ishaq K.S., Piantadosi C. In vitro evaluation of phosphocholine and quaternary ammonium containing lipids as novel anti-HIV agents. //J. Med. Chem. 1991. -V. 34 (4). - P. 1377.

62. Bittman R. and Arthur G. Antitumor ether lipids: biological and biochemical effects. // In: Liposomes: Rational Design. / Ed. Janoff A.S. New York: Marcell Dekker. 1998. - P. 125.

63. Principe P. and Braquet P. Advances in ether phospholipids treatment of cancer. // Crit. Rev. Oncol. Hematol. 1995. -V. 18. - P. 155.

64. Civoli F., Pauig S.B. and Daniel L.W. Differentiation of HL-60 cells distinguishes between cytostatic and cytotoxic effects of the alkylphospholipid ET-I8-OCH3. II Cancer Chemother. Pharmacol. -1996. V. 38. - P. 269.

65. Berdel W.E., Okamoto S. Ether lipids in cancer chemotherapy. // Keio J. Med. -1990.-V. 39 (2).-P. 75.

66. Basill G.W., Dexter T.M. Role of endocitosis in the action of ether lipids on WEHI-3B, HL-60 and FDCP-Mix A4 cells. // Cancer Res. 1990. - V. 50. - P. 7505.

67. Diomede L., Principe P., Domingo M.T., Broquet C., Chabrier P.E., Braquet P. and Salmona M. Effect of PAF antagonists on the cytotoxic activity of antineoplastic ether phospholipids. II Int. J. Oncol. 1993. -V. 2 (5). - P. 777.

68. Wissner A., Schaub R.E., Sum P.E., Kohler C.A., Goldstein B.M. Analogues of platelet activating factor. 4. Some modifications of the phosphoholiene moiety. // J. Med. Chem. 1986. - V. 29 - P. 328.

69. Noseda A., Godwin P.L., Modest E.J. Effects of neoplastic ether lipids on model and biological membranes. // Biochim. Biophys. Acta. 1988. - V. 945 (1). - P. 92.

70. Lasenby C.M., Thompson M.G., Hickman J.A. Elevation of leukemic cell intracellular calcium by the ether lipid SRI 62-834. // Cancer Res. 1990. - V. 50 (11).-P. 3327.

71. Arthur G. and Bittman R. The inhibition of cell signaling pathways by antitumor ether lipids. // Biochem. Biophys. Acta. 1998. - V. 1390. - P. 85.

72. Lohmeyer M. and Workman P. Growth arrest vs direct cytotoxicity and the importance of molecular structure for the in vitro anti-tumor activity of ether lipids. // Br. J. Cancer. 1995. -V. 72. - P. 277.

73. Peters A.C., Ahmad I., Janoff A.S., Pushkareva M.Y., Mayhew E. Growth inhibitory effects of liposome-associated 1-0-octadecyl-2-0-methyl-sn-glycero-3-phosphocholine. // Lipids. 1997. - V. 32. - P. 1045.

74. Steenhauer S.-l., Reitsma P.H., Bertina R.M. Tissue factor expression during monocyte-macrophage differentiation. II Thromb. Haemost. -1997. V. 77. - P. 1129.

75. Pushkareva M.Y., Wannberg S.L., Janoff A.S. and Mayhew E. Increased cell surface receptor expression on U-937 cells indused by l-O-octadecyl-2-O-methyl-sn-glycero-3-phosphocholine. // Cancer Immunol. Immunother. 2000. -V. 48. - P. 569.

76. Berdel E.W. Membrane interactive lipids as experimental anticancer drugs. // Br. J. Cancer. 1991. - V. 64. - P. 208.

77. Jendrossek V. and Handrick R. Membrane targeted anticancer drugs: potent inducers of apoptosis and putative radiosensitisers. // Curr. Med. Chem-Anti-Cancer Agents. 2003. - V. 3. - P. 343.

78. Hoffman J., Utz I., Spitaler M., Hofer S., Rybczynska M., Beck W.T., Herrmann D.B.J, and Grunicke H. Resistance to the new anti-cancer phospholipid ilmofosine (BM 41.440). // Br. J. Cancer. 1997. - V. 76 (7). - P. 862.

79. Crumpton S.C., Goz В., Ishaq K.S. Novel lipid analogs with cytostatic and cytocidal activity. // Anticancer Res. -1988. -V. 8. P. 1316.

80. Pat. 4.920.134 USA МКИ5 С 07 D 239/34. 2-O-pyrimidinyl-glycerol derivatives. / Keizo I., Hiroaki N. Eiko Y.

81. Pat. 0.255.306 EPA МКИ5 С 07 C147/02 Nitrogen- and sulfurcontaining lipid compounds, their production and use. / Inoue K., Nomura H., Aono I.

82. Kudo I., Nojima S., Chang H.-W., Yanoshita R„ Hayashi H., Kondo E., Nomura H., Inoue K. Antitumor activity of synthetic alkyllysophospholipids with or without PAF activity. // Lipids. 1987. - V. 22 (11). - P. 862.

83. Domhauser S., Berdel W.E., Schick H.D., Fromm M., Reichert A., Fink U., Busch R., Eibl H. Structure-cytotoxic studies on alkyl lysophospholipids andsome analogs in leukemic blasts of human origin in vitro. // Lipids. 1987. - V. 22 (11).-P. 911.

84. Kertscher P., Riiger H.-J., Gawrisch K., Nuhn P. Synthese einiger spinmarkierter Glycerophospholipide. // Pharmazie. -1980. -V. 35 (1). S. 39.

85. Meyer K.L., Schwendner S.W., Counsell R.E. Potential tumor or organ-imaging agents. 30. Radioiodinated phospholipid ethers. // J. Med. Chem. 1989. - V. 32. - P. 2142.

86. Hong C., West C.R., Bernacki R.G., Teddi C.K. and Berdel W.E. 1-p-D-arabinofuranosylcytosine conjugates of ether and thioether phospholipids. A new class of ara-C prodrug with improved antitumor activity. // Lipids. 1991. -V. 26. (12). - P. 1437.

87. Hong C., Kirisits A.J., Nechaev A., Buchheit D.J. and West C.R. Nucleoside conjugates. 11. Synthesis and antitumor activity of 1-p-D-arabinofuranosylcytosine and cytidine conjugates of thioether lipids. // J. Med. Chem. 1990. -V. 33. - P. 1380.

88. Andresen T.L., Davidsen J., Begtrup M., Mouritsen O.G. and Jorgensen K. Enzymatic release of antitumor ether lipids by specific phospholipase A2 activation of liposome-forming prodrugs. // J. Med. Chem. 2004. - V. 47. - P. 1694.

89. Hawthrne M.F. The Role of chemistry in neutron capture therapy. // Angew. Chem. Int. Ed. Eng. 1993. -V. 32. - P. 950.

90. Жижин К.Ю., Малинина E.A., Солнцев K.A., Гоева Л.А., Кузнецов Н.Т., Лукьянец Е.А., Чернявский А.С., Иванов С.В. // Новые водорастворимые борсодержащие фталоцианины. ДАН. - 1997. - Т. 357 (2). - С. 206.

91. Boron-Neutron Capture Therapy for Tumor. / ed. Hatanaka H., Nishimura A., Tokyo. -1986.

92. Gabel D. in Progress in medical chemistry. / Harword acad. Pub. - 1995. - P. 342.

93. Evstigneeva R.P., Zaitsev A.V., Luzgina V.N., Ol'shevskaya V.A. and Shtil A.A. Carboranylporphyrins for Boron Neutron Capture Therapy of cancer. // Curr. Med. Chem. Anti-Cancer Agents. - 2003. - V. 3. - P. 393.

94. Lemmen P., Werner B. Syntesis of rac-1-(9-carboranyl)nonyl-2-methyl-sn-glycero-3-phosphocholine, a potencial boron carrier for BNCT. // Chem. Phys. Lipids. 1992. - V. 62. - P. 186.

95. Alanazi F., Li H., Halpern D.S., Qie S., Lu R. Synthesis, preformulation and liposomal formulation of cholesteryl carborane esters with various fatty chains. // Int. J. Pharmaceutical. 2003. - V. 225. - P. 189.

96. Аникин M.B., Ушакова И.П., Серебренникова Г.А., Евстигнеева Р.П., Депонированная статья, ВИНИТИ, 1987, № 915-ХП 87.7.

97. Маслов М.А., Морозова Н.Г., Серебренникова Г.А. Удобный метод получения катионных глицеролипидов с потенциальной биологической активностью. И Изв. АН, Сер. хим. 2002. - № 10. - С. 1778.

98. Mossman Т. Application of MTT-test in cell toxicity assays. // J. Immunol. Methods. 1983. - V. 89. - P. 271.

99. УТВЕРЖДАЮ" Директор НИИ ЭДиТО ГУ Российского онкологического" научы£атсг.--ы,^нтра им. Н . Н .Влохина есЬрр1. А'/1. JL&.

100. АКТ ЗНЕДРЕНИЯ результатов диссертационной работы Плявник Натальи Владимировны

101. Кслдаева Е.;:. СтукалоЕ Ю. В .

102. Председатель комиссии: Члены комиссии: