Синтез бесфосфорных алкильных глицеролипидов - потенциальных противоопухолевых соединений тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

РОМАНОВА СВЕТЛАНА ГЕННАДЬЕВНА

003455504

СИНТЕЗ БЕСФОСФОРНЫХ АЛКИЛЬНЫХ ГЛИЦЕРОЛИПИДОВ -ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ СОЕДИНЕНИЙ

Специальность 02.00.10 — Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

0 5 ДЕК 2008

МОСКВА-2008

003455504

Работа выполнена на кафедре Химии и технологии биологически активных соединений им. Н.А Преображенского Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М В. Ломоносова

Научный руководитель.

доктор химических наук, профессор Серебренникова Галина Андреевна

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Рудакова Инна Павловна

доктор биологических наук, профессор Богуш Татьяна Анатольевна

Ведущая организация. Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина

и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита состоится «22» декабря 2008 г. в 15 часов на заседании Диссертационного совета Д 212.120.01 при Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова по адресу 119571, Москва, пр. Вернадского, 86

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им М В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, пр Вернадского, 86. С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте www.mitht.ru

Автореферат разослан /» ноября 2008 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук, старший научный сотрудник

ЛютикА. И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Создание новых химических соединений с расширенным спектром биологического действия является актуальной задачей биоорганической химии. В последние годы предметом интенсивных исследований стали катионные бесфосфорные глицеролипиды алкильного типа - потенциальные противоопухолевые агенты. Этот класс веществ получен химической модификацией высокоактивного фосфорсодержащего глицеролипида - эдельфозина (1-октадецил-2-метил-ял-глицеро-З-фосфохолин, Et-18-OMe), известного избирательным цитотоксическим действием по отношению к различным линиям раковых клеток.

Благодаря наличию широкого спектра биологической активности синтетические бесфосфорные положительно заряженные глицеролипиды с простой эфирной связью привлекают все большее внимание исследователей. В соответствии с уже установленными требованиями, предъявляемыми к структуре соединений показано, что наличие дпинноцепного алкильного заместителя (Cie-C2o) в положении С(1) и короткоцепного заместителя (Cî-C,») в С(2) положении глицеринового скелета необходимо для того, чтобы соединение обладало антинеопластической активностью.

В то же время, влияние других компонентов структуры (спейсерного участка, катионной «головки» и противоиона) на биологические свойства соединения в настоящее время изучено недостаточно. Поэтому на сегодняшний день актуальным представляется синтез новых бесфосфорных положительно заряженных глицеролипидов алкильного типа - возможных агентов противоопухолевой терапии, модифицированных по спейсерному участку и гидрофильному домену.

Так, создание соединений с различными катионными «головками», представленными аминами алифатического и гетероциклического рядов, отделёнными от глицеринового скелета спейсерами различной длины позволит выявить закономерности проявления цитотоксической активности соединениями в зависимости от их структурных особенностей.

Настоящая работа выполнена в соответствии с планом научных исследований кафедры ХТБАС МИТХТ им. М. В. Ломоносова по теме № 1Б-4-355 «Разработка химических и биотехнологических методов модификации биологически активных соединений с целью моделирования жизненно важных процессов в природе и создания новых лекарственных препаратов» и при поддержке грантов РФФИ, проекты № 04-03-32452-а и 07-03-00632."

* В руководстве работой принимал участие д м н Штиль А А

Цели работы.

1. Синтез бесфосфорных алкильных глицеролипидов с полярными «головками», представленными основаниями алифатического и гетероциклического ряда с целью изучения их биологической активности.

2. Создание модификационных рядов положительно заряженных глицеролипидов со спейсерами различной длины.

3. Синтез флуоресцентно меченых катионных глицеролипидов с простой эфирной связью для оценки типа клеточной гибели, изучения динамики накопления в неопластических клетках и выявления мест их внутриклеточной локализации

4. Проведение биологических испытаний ю vitro синтезированных соединений. Изучение мутагенных свойств и оценка цитотоксической и гемолитической активности

Научная новизна работы. В результате проведённых исследований нами синтезированы новые представители класса катионных алкильных глицеролипидов, бесфосфорных аналогов эдельфозина, отличающихся отдельными структурными фрагментами: длиной спейсерного участка и природой полярной «головки», представленной алифатическими и гетероциклическими основаниями Получены катионные глицеролипиды, содержащие флуоресцентную метку в гидрофильной части молекулы, представляющие собой удобную модель для исследования биологической активности синтезированных веществ и изучения противоопухолевого механизма их действия.

Проведены биологические испытания in vitro. Изучена цитотоксическая и гемолитическая активности полученных соединений, а также представлены данные о динамике накопления глицеролипидов в клетке Показано влияние синтезированных веществ на клеточный цикл клетки, а также установлены места их наиболее вероятной локализации во внутриклеточных компартментах.

Практическая значимость работы. Созданы новые ряды бесфосфорных положительно заряженных глицеролипидов с простой эфирной связью. Соединения отличаются длиной спейсерного участка (два-четыре) метиленовых звена и пять (в случае глицеролипида, содержащего остаток 6-аминокапроновой кислоты), а также -природой и типом катионного домена, представленного основаниями как алифатического ряда: Л/,А/-диметиламиноэтанол, А/,Л/,Л/'Л/'-тетраметилэтилендиамин, А/,/\/,/\/-триэтаноламин так и гетероциклического: пиридин; Л/,А/-диметиламинопиридин; W-метил-имидазол; Л/-метилморфолин; Л/-метилпиперидин, 4-гидрокси-Л/-метилпиперидин.

Направленная модификация молекулы катионного липида по определённым доменам создаёт возможность проведения структурно-функциональных исследований

по выявлению зависимости биологической активности этих соединений от строения каждой структурной единицы.

В результате проведённых исследований значительно расширен класс катионных липидов, которые могут быть рекомендованы для использования в качестве потенциальных противоопухолевых агентов в химиотерапии рака. Получены первоначальные данные о типе клеточной гибели, к которому приводит действие синтезированных веществ и изучены основы антинеопластического механизма действия класса бесфосфорных алкильных глицеролипидов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Создание модификационных рядов бесфосфорных положительно заряженных алкильных глицеролипидов, содержащих спейсерные фрагменты различной длины и разные типы катионных «головок».

2. Получение алкильных глицеролипидов с аминами алифатического ряда в полярном домене.

3. Синтез катионных глицеролипидов с простой эфирной связью, содержащих гетероциклические основания в качестве катионной «головки».

4. Получение положительно заряженных алкильных глицеролипидов с флуоресцентной меткой, присоединённой к полярному домену.

5. Исследование противоопухолевой и гемолитической активности полученных соединений.

6. Проверка мутагенных свойств и изучение динамики накопления катионных глицеролипидов в неопластических клетках.

7. Выявление взаимосвязи структура/биологическая активность в ряду синтезированных соединений.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на Первой научно-технической конференции молодых ученых «Наукоемкие химические технологии» (2005, Москва), на V Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» (2006, Москва), на Международной конференции «Биотехнология и медицина» (2006, Москва), на Международной конференции молодых ученых по фундаментальным наукам "Ломоносов-2006" (2006, Москва), на Международном симпозиуме «Advanced Science in Organic Chemistry» (2006, Судак), на Юбилейных Научных Чтениях, посвященных 110-летию со дня рождения проф. H.A. Преображенского (2006, Москва), на Международной конференции по органической химии «Органическая химия от Бутлерова и Бейльштейна до современности» (2006, Санкт-Петербург), на XI Международной научно-технической конференции "Наукоемкие химические технологии - 2006" (2006, Самара), на XVIII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (2007, Москва), на VII Всероссийской научно-практической конференции с международным

участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (2008, Москва), на Меяодународной конференции молодых ученых по фундаментальным наукам "Ломоносов-2008" (2008, Москва), на IV Съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (2008, Новосибирск), на XII Международной научно-технической конференции "Наукоемкие химические технологии - 2008" (2008, Волгоград).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 13 тезисов докладов.

Объём и структура работы.

Диссертационная работа изложена на Ю$ страницах машинописного текста и состоит из введения, литературного обзора, обсуждения полученных результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, включающего

источника. Работа иллюстрирована [Ь_ рисунками и содержит схем и ю таблиц.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При проведении предварительного скрининга глицеролипидных соединений на выявление среди них веществ, обладающих биологической активностью в ряду катионных бесфосфорных глицеролипидов с простой эфирной связью были обнаружены потенциальные противоопухолевые агенты.

Установлено, что данные соединения способны накапливаться в неопластических клетках, ингибировать их рост и пролиферацию, а также действие некоторых клеточных ферментов. Проявляя высокую биологическую активность, они могут быть рассмотрены в качестве возможных агентов для химиотерапии. Известно, что антибактериальной, противогрибковой, и высокой противооопухолевой активностью обладает их структурный аналог - алкильный глицерофосфолипид эдельфозин (рис.1).

—ОС,8Н37

—ОСН}

—0-Р-0-СН2СН2Ы+(СНз)з О О"

Рис.1 Структурная формула эдельфозина.

На сегодняшний день он известен как коммерческий противоопухолевый препарат, успешно прошедший первую и вторую фазы доклинических и клинических испытаний. В качестве контроля биологической активности вновь синтезированных глицеролипидов эдельфозин видится адекватной оценочной моделью. В отличие от других известных препаратов он не обладает мутагенностью и, следовательно, не вызывает изменений в структуре клеточной ДНК.

Несмотря на многочисленные исследования, механизм действия алкильных глицеролипидов до конца не изучен, однако, известно, что, связываясь на поверхности неопластических клеток с определённого рода рецепторами, они выступают инициаторами процесса запрограммированной клеточной гибели, приводя к апоптозу.

( катионные глицеролипиды, общая формула )

—OC1SH37 Q"

—ОСН3

- отсутствие фосфорной

ч,^^ составляющей

Полярный домен амины алифатического и Спейсерный участок гетероциклического ряда изменение длины цепи

Рис.2 Направления модификации структуры алкильных глицеролипидов, предпринятые в работе.

Также известно, что проявляемая биологическая активность соединений связана с особенностями их строения, поэтому синтез новых модификационных рядов алкильных катионных глицеролипидов, отличающихся отдельными структурными фрагментами, является перспективным направлением в химии глицеролипидов (рис 2). Это даст возможность проследить закономерность изменения свойств соединений, а также поможет в изучении основных элементов механизма их антинеопластического действия.

1. ПОЛУЧЕНИЕ АЛКИЛЬНЫХ ГЛИЦЕРОЛИПИДОВ С' ПОЛЯРНЫМИ «ГОЛОВКАМИ» АЛИФАТИЧЕСКОГО И ГЕТЕРОЦИКЛИЧЕСКОГО РЯДА

Для создания новых представителей класса катионных липидов был проведен синтез положительно заряженных глицеролипидов с октадецильным и метильным заместителями при С(1) и С(2) положениях глицерина и различными полярными «головками», присоединенными к глицериновому скелету через спейсерные группы, представленные остатками валериановой, масляной и пропионовой кислот.

1.1 Создание глицеролипидов с различной длиной спейсерного фрагмента и

структурой алифатической катионной «головки»

Для получения положительно заряженных липидов, отличающихся длиной спейсера и строением полярного домена был проведён синтез соединений, где в качестве катионных «головок» использовались Л/,Л/-диметиламиноэтанол и N,N,Ni,Nr тетраметилэтилендиамин, а спейсерная группа представляла собой остатки масляной, валериановой и пропионовой кислот (схема 1).

/

-ОС|8Н37 -ОСН3 --ОН

i

-ОС,8Н37

—ОСН3 -

-ОСО(СН2)пВг 2а-с

—ОС,8Н37 —ОСНз —ОСО(СН2)пХ За-с; 4а, Ь; 5а

а: 11-3, Ь: п=4, с: п=2

Соед-нение За-с 4а, b 5а

СН3 СН3 СП3 СН2СН2ОН

X —ÍN-(CH2)2OH Г -^N-CH2CH2-N Г —^-СН2СН2ОН

СН3 СН3 СН3 СН2СН2ОН

Введение в молекулу липида катионной «головки» проводилось по реакции кватернизации третичного атома азота соответствующих аминов бромидами 2а-с, синтез проводили в присутствии Nal в среде диметилсульфоксида (DMSO).

Реагенты и условия

Стадия Соединение Реагенты T, °C Время, ч Выход, %

А 2а/2Ь Br(CH2)„COCI, Ру/СНС13 20 05 91

2с С1(СН2)2СОС1, Ру/СНСЬ, К2С03 20 0.5 46

За, Ь,с DMAE, Nal/ DMSO 70 4.5 64, 63, 60

В 4а/4Ь TMEDA, Nal/DMSO 70 5.0 80/78

5а TEA, Nal/DMSO 55 4.5 29

Ключевыми соединениями в синтезе липидов За-с и 4а, Ь явились гас-1-октадецил-2-метил-3-(4-бромбутаноил)глицерин 2а, лас-1-октадецил-2-метил-3-(5-бромпентаноил)глицерин 2Ь и гас-1-октадецил-2-метил-3-(3-хлорпропаноил)- глицерин 2с, которые были получены с выходами порядка 90% при ацилировании в присутствии пиридина (Ру) исходного диглицерида 1 хлорангидридами 5-бромвалериановой и 4-броммасляной кислот и выходом 46% при ацилировании соединения 1 хлорангидридом 3-хлорпропионовой кислоты в присутствии пиридина (Ру) и карбоната калия.

Из литературных источников известно, что реакция кватернизации обычно протекает довольно медленно (20-70 ч.) при нагревании с избытком аминокомпоненты.

В нашем случае время проведения реакции колебалось от 3 до 5 ч. Замена брома в условиях реакции Финкельштейна на более реакционноспособный йод позволила сократить продолжительность и смягчить температурный режим процесса и, следовательно, избежать осмоления продуктов реакции, повысить выходы целевых соединений. Так, были получены липиды За-с, 4а, Ь с катионными группами алифатического ряда. После хроматографической очистки на силикагеле и последующей перекристаллизации из безводного диэтилового эфира выходы соединений составили 60-80%.

Данные 1Н-ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии подтвердили структуру полученных катионных глицеролипидов (таблица 1).

Таблица 1

Физико-химические характеристики липидое 3 а, b и 4 а, Ь

Соединение Масспектр, m/z (MALDI-MS) Спектр ЯМР 1Н, м.д.

CH2N+ катионная группа

За 516.4 [M-l]+ м, 3.78-3.82 с, 3.36-3 Nv(CH3)2; м, 3.56-3 62 NTCHjCHjOH; м, 4.12-4.23 N+CH2CH2OH

ЗЬ 530 3 [M-l]+

4а 543.7 [M-l]+ м, 3.42-3.46 с, 2.31 N(CH3)2l м, 2.80 CH2CH2N(CH3)2; с, 3.23 N+(CH3)2; м, 3 42-3.46 N+(CH3)2CH2CH2

4Ь 559.9 [M-l]+

В случае липида 5а, где катионная «головка», образованная N,N,N-триэтаноламином отделена от глицеринового скелета спейсерной группой, представленной остатком 5-броммасляной кислоты во избежание осмоления реакционной массы синтез проводили при температуре не выше 55 °С. Выход целевого продукта при этом составил 29.2%.

Полученное соединение стало продолжением создаваемого модификационного ряда, затрагивая строение полярного домена (схема 1).

1.1.1 Синтез алкильного глицеролипида, содержащего остаток 6-аминокапроновой кислоты

Для дальнейших исследований в области химии катионных глицеролипидов алкильного типа был также получен глицеролипид 7, содержащий остаток 6-аминокапроновой кислоты при С(3) атоме глицерина. В случае соединения 6 решается вопрос присоединения спейсерной группы длиной в пять метиленовых звеньев, а при снятии Вос-защитной группировки под воздействием трифторуксусной кислоты в хлороформе возникает положительный заряд на атоме азота, образуя целевое соединение схемы - липид 7 с выходом 87%.

-ос18н37

-ОСНз -

-он 1

А

|—ОС|8Н37

_ОСН3 -—

—ОСО(СН2)5К1Юос 6

-ОС18Н37

СР3СОО"

-ОСН3

-ОСО(СН2)5МН3+ 7

Реагенты и условия

Стадия Соединение Реагенты Т, °С Время, ч Выход, %

А 6 ВосЫН(СН2)5СООН, йСС/Ру 20 1 62

В 7 СРзСООН /СНС13 40 1.5 87

Ацилирование лас-1-октадецил-2-метилглицерина (1) проводили Л/-Вос-6-аминогексановой кислотой, взятой в 1,5-кратном избытке, в среде безводного пиридина в присутствии ОСС (схема 2). После хроматографической очистки выход целевого продукта 7 составил 62%. В спектре ЯМР 1Н этого соединения присутствовал сигнал, относящийся к протонам нововведенного элемента' синглет (ё= 1.42 м д ) Ви'-группы.

Последующее удаление Вос-защитной группы действием трифторуксусной кислоты в хлороформе приводило к образованию гас-1-октадецил-2-метил-3-(6-аммониогексаноил)глицерина 7 в виде трифторацетатной соли с выходом 87% Отсутствие сигнала протонов Ви'-группы при 1.42 м.д в 1Н-ЯМР-спектре данного соединения свидетельствует о полном удалении защитной группировки.

1.1.2 Создание катионных глицеролипидов с флуоресцентной меткой в полярном домене

С целью диагностики проникновения вещества в клетку, изучения динамики его накопления и распределения во внутриклеточной среде и компартментах был осуществлён синтез катионных липидов ЗЬ-сШ и БЬ-сШ, содержащих флуоресцентную метку (схема 3). В качестве вводимого флуорофора выступал дансилхлорид Как известно из литературных источников, его использование при получении меченых производных эдельфозина не приводило к статистически различимому снижению показателей биологической активности соединений.

В качестве исходных соединений для получения флуоресцентных меченых производных взяты катионные глицеролипиды ЗЬ и 8Ь. Соединение 8Ь было получено в нашей лаборатории ранее. Оно, как было установлено, обладает высокой цитотоксической активностью по отношению к опухолевым клеткам К562. Катионный глицеролипид ЗЬ был выбран как структурный аналог 8Ь, отличающийся лишь метильным заместителем вместо этильного во втором положении глицеринового скелета.

i—ос,8н37 г

—OR СН3 —

|

I—OCO(CH2)4N+(CH2)2OH ЗЬ, 8Ь ¿Нз

3b, 3b-dh: R= СН3 ; 8b, 8b-dh: R= C2H5

Катионные глицеролипиды ЗЬ и 8Ь вводили во взаимодействие с дансилхлоридом (dh) в среде безводного ацетона в присутствии триэтиламина. Синтез завершался за 10 часов при 18-20 °С. Выход целевых соединений схемы, содержащих флуоресцентную метку, составил 58% (ЗЬ-dh) и 54% (8b-dh).

Структура полученных соединений была подтверждена данными 1Н-ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии.

1.2 Получение глицеролипидов с различной длиной спейсерного фрагмента и

структурой гетероциклической катионной «головки»

Наряду с алкильными глицеролипидами, содержащими в полярном домене алифатические амины известно, что высокой биологической активностью обладают также липиды, содержащие гетероциклические основания в полярном домене. С целью расширения области поиска эффективных соединений, проявляющих цитотоксические свойства по отношению к неопластическим клеткам, представлялось актуальным синтезировать новые алкильные глицеролипиды с гетероциклическими катионными «головками», присоединёнными к глицериновому остову посредством спейсерных участков.

1.2.1 Синтез бесфосфорных пиридинсодержащих глицеролипидов с простой эфирной связью

Известно, что многие пиридинсодержащие соединения оказывают сильное цитотоксическое действие in vitro и in vivo. Проводя соответствующую модификацию полярного домена, нами были получены липиды 9а и 9Ь с катионной «головкой» представленной пиридином, присоединенным к гидрофобному остатку через ацильные спейсерные группы длиной в три и четыре метиленовых звена.

Помимо самого пиридина осуществлялось также введение и других гетероциклических оснований. Так, в синтезе положительно заряженных глицеролипидов 10а и 10Ь в качестве гидрофильной составляющей использован замещённый пиридин - 4-Л/,Л/-диметиламинопиридин (DMAP), (схема 4).

-ОС18Н37 -OR

Г

сн3 I.

0C0(CH2)4N+(CH2)20-3b-dh, 8b-dh ¿H3

(—ОС18Н37 —ОМе —

—ОСО(СП2)пВг

2а, Ь а: п = 3; Ь: п = 4

Соеди- X Соеди- X

нение нение

9а, Ь 10а, Ь V У^СНз),

Реагенты и условия-

Соединение Реагенты Т, °С Время, ч Выход, %

9а/9Ь Ру 80 4.5 85/81

10а /10Ь ОМАР, МеССО 80 35 86/82

Введение в молекулу катионнсй «головки» проводили по реакции кватернизации гетероциклических оснований полученными ранее бромсодержащими производными 2а, Ь. В случае липидов 9а и 9Ь синтез проводили в пиридине в течение 4.5 ч при 80 °С. Для получения глицеролипидов 10а и 10Ь реакцию проводили в среде безводного метилэтилкетона. Выход целевых соединений составил порядка 80-85% Соединения охарактеризованы данными масс-спектрометрии и 1Н-ЯМР спектроскопии (таблица 2).

Таблица 2

Физико-химические характеристики глицеролипидов 9а, Ь и 10а, Ь

Соединение Масс-спектр, т/г (МАЮШЭ) Спектр ЯМР 1Н, м.д.

СН2Ы+ катионная группа

9а 506.1 [М-Вг]+ м, 4.72-4.84 м, 8.00-8 10 N>0-1, м, 8,40-8,48 ЫУСН; м, 9.12-9.18 Ы+а-СН

9Ь 520.2 [М-ВгГ

10а, Ь м, 4.32-4.47 с, 3.19-3.30 (СНз)гЫ'; м, 6 90-7.10 Ы+Р-СН; м, 8.54-8.68 1Ч+а-СН

—ОС,8Н37 в —ОМе

— ОСО(СН2)пХ 9а, Ъ; 10а, Ь

1.2.2 Синтез катионных глицеролипидов с полярной головкой, представленной метилпиперидином и 4-гидрокси-Ы-метилпиперидином

Для выяснения влияния отдельных структурообразующих элементов полярного домена на биологическую активность соединения нами были получены положительно заряженные алкильные глицеролипиды с такими гетероциклическими аминами как Л/-метилпиперидин (МеР!р) и 4-гидрокси-Л/-метилпиперидин (ОНМеРф), присоединенными к глицериновому скелету при помощи линкеров, состоящих из трёх и четырёх метиленовых групп. Кватернизацией третичного атома азота Л/-метилпиперидина и 4-гидрокси-Л/-метилпиперидина бромпроизводными 2а, Ь были получены целевые соединения синтеза 11а, Ь и 12а, Ь (схема 5).

Схема 5

г-ОС]8Н37 Г —ОС18П37

л в

—ОМе г—. - —ОМе -

—ОСО(СН2)Х\ ) ^0С0(СН2)пВг

11а, Ь ¿Н\-' 2а, Ь

а: п = 3; Ь: п = 4

Реагенты и условия:

Стадия Соединение Реагенты Т, °С Время, ч Выход, %

А 11а, Ь МеР1р, МеСОЕМа! 80 4 68, 70

В 12а, Ь ОНМеРф, МеСОЕМа! 85 4.5 72, 68

Таблица 3

Физико-химические характеристики липидов 11 а, Ь и 12 а, Ь

Соединение Масс-спектр, т/г (МАиШ-МЭ) Спектр ЯМР 'Н, м.д.

СН2Ы+ катионная группа

11а 527.0 [М-1П м, 3.62-3.74 с, 3.31 1\ГСНз; м, 3.62-3.74 Ы+СН2-а; М, 1.73-1.94 Ы+СНг-р; Ы+СН2-у

11Ь 540.9 [М-1]*

12а 542.8 [М-1]+ м, 3.54-3.78 с, 3.24 Г^СНз, м, 3.70-3.78 КГСНг-а; м, 2.08-2.26 М+СН2-р

12Ь 556 9 [М-1]+

-ОС, ¿137 Г -ОМс

-ОСО(СН2)Х Уон 12а, Ь СП,—7

1.2.3 Синтез катионных глицеролипидов, содержащих Ы-метилимидазол и Ы-метилморфолин в полярном домене

Синтез алкильных глицеролипидов с катионными «головками» в виде Л/-метилимидазола (Ме1т) и /У-метилморфолина (МеМо) осуществляли двояким образом (схема 6).

Схема 6

С

-ос|8н37

-ОМе -

А

ОСО(СН2)пВг 2а, Ь

а: п= 3: Ь: п= 4

-ос18н37

-ОМе — -ОСО(СН2)пХ 13а, Ь 15а, Ь

-ОС18Н37 -ОМе

-ОСО(СН2)„Г 14а, Ь 16а, Ь

Вг/Г

Соединение 13а, Ь 14а, Ь 15а, Ь 16а, Ь

основание —т/ \=к —>/ \> —-п \э СН3

Через стадию А получали незаряженные имидазольные и морфолиновые липидные производные 13а, Ь и 15а, Ь. Их получение может быть рассмотренно как удобная основа для создания алкильных глицеролипидов с функциональными группами в полярном домене. Последующая кватернизация 13а, Ь и 15а, Ь иодистым метилом в среде безводного метилэтилкетона приводила к образованию целевых продуктов схемы 14а, Ь и 16а, Ь. При проведении синтеза по однастадийному варианту (через стадию С) третичные атомы азота А/-метилимидазола и Л/-метилморфолина подвергались непосредственной кватернизации бромпроизводными 2а, Ь (схема 6). В обоих случаях выход продуктов составлял 77-85%.

Реагенты и условия'

Стадия Соединение Реагенты Т,°С Время, ч Выход, %

А 13а/13Ь 1т, МеСОЕ! 75 3.5 89/91

В 14а/14Ь СН3], МеСОЕ1 60 3 77/78

С 14а/14Ь Ме1т, МеСОЕШа! 75 4 82/84

А 15а/15Ь Мо, МеСОЕ1 65 4.5 87/88

В 16а/16Ь СН31, МеСОЕ! 60 3 82/81

С 16а/16Ь МеМо, МеСОЕ1/№1 75 3 84/85

Таблица 4

Физико-химические характеристики синтезированных липидов

Соединение Масс-спектр, т/2 (МАЮ1-М8) Спектр ЯМР 1Н, м д.

СИХ катионная группа

14а 509.2 [М-1]+ м, 4.12-4.15 с, 4.02-4.10 МСНз, м, 7.08-7.12 Ма-НСНЫ, м, 7.14-7.18 ^-НСНМ; м, 10 10-10.15 Ыа-СНЫ

14Ь 523.3[М-1Г

16а 528.4 [М-!]+ м, 4 02-4.10 м, 3.72-3.78 Г\ГСН2-а; м, 3 80-3.89 Ы+СНг-р

16Ь 542 3 [М-1]+

Спектры 1Н-ЯМР соединений с противоионами различной природы были идентичны (таблица 4).

2 ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ СИНТЕЗИРОВАННЫХ ЛИПИДОВ

В рамках изучения биологических свойств синтезированных соединений была дана оценка их цитотоксического действия, гемолитической активности и мутагенности. Кроме того, при помощи флуоресцентномеченных соединений, полученных в работе, была изучена динамика накопления катионных глицеролипидов в клетке, установлено их влияние на клеточный цикл и выявлены общие черты механизма антинеопластического действия.

Для оценки цитоксического показателя катионных глицеролипидов в тест-системе в качестве контроля использовался эдельфозин (Е^

2.1 Исследование цитотоксического действия синтезированных соединений1

Изучение цитотоксичности полученных положительно заряженных алкильных глицеролипидов проводили на различных линиях опухолевых клеток лейкоза человека К562, К562/4, и937, а также на клетках рака толстой кишки НСТ116 Результаты по биологической активности соединений оценивали при помощи колориметрического МТТ-теста*.

1 Экспериментальная работа по оценке цитотоксичности соединений выполнена в лаборатории механизмов клеточной гибели НИИ канцерогенеза ГУ РОНЦ им Н Н Блохина РАМН, под руководством д м н Штиля А А

'Водорастворимый витальный краситель - 3-(4,5-диметил-тиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиний бромид (МТТ) - под действием митохондриальной дегидрогеназы живых клеток превращается в темно-синий формазан, растворимый только в органических растворителях Фотометрическое измерение оптической плотности окрашенного раствора формазана позволяет определить количество живых клеток после инкубации с препаратом Этот тест учитывает позднюю (конечную) стадию клеточной гибели, к которой сводится многообразие отдельных механизмов смерти

2.1.1 Алифатические производные глицеролипидов

Данные по цитотоксическому эффекту для синтезированных соединений За, Ь; 4а, Ь и 5а приведены ниже (таблица 5).

Для более детального изучения антинеопластической активности представленные модификационные линии соединений были дополнены еще одним катионным глицеролипидом 8Ь, полученным в нашей лаборатории ранее. Поскольку он отличается от синтезированного в работе катионного глицеролипида ЗЬ лишь длиной короткоцепного алкильного заместителя в С(2) положении глицеринового скелета виделось целесообразным включить данный катионный гпицеролипид в эксперимент по изучению цитотоксических свойств синтезированных соединений.

Таблица 5

Цитотоксичность алкильных глицеролипидов 1Ст, ммоль.

Клеточная культура К562.

Время инкубации клеток с липидами - 72 ч.

OClgH37 OR 1

ОСО{СН2)пХ Общая структурная формула

-ОС18Н37 -ОСНз о

- О—Р- О - CH2CH2N+(CH3)3 6" Ef

Соединение R при С(2) п полярный домен, X IC50, ммоль

Ef Коммерческий препарат Edelfosine 3.2±1.0

За СНз 3 3.9+1.2

ЗЬ СН3 4 л -+N(CH3)2CH2CH2OH 3 6±1.0

8Ь С2Н5 4 4.2±0.8

4а СНз 3 -+N(CH3)2CH2CH2N(CH3)2 >60

4Ь СНз 4 >60

Исходя из полученных данных по биологическим испытаниям (таблица 5) можно заключить, что наиболее токсичными для клеток лейкоза оказались липиды За, ЗЬ и 8Ь (Ю50 3.9±1.2; 3.6±1.0 мкМ; 4.2±0.8 мкМ, соответственно). Соединения 4а и 4Ь оказались не активными по отношению к клеткам К562. Полученные результаты позволяют сделать выводы о влиянии отдельных структурных единиц глицеролипида на его биологические характеристики. Так, замена этильного заместителя метильным в С(2) положении глицерина несколько повышает противоопухолевую активность соединения: /С5о, ммоль 8Ь (4.2+0,8) и За (3.9±1,2), ЗЬ (3.6+1,2). Можно сказать и о влиянии длины спейсера: его уменьшение на одну метиленовую группу (бутаноильный остаток вместо пентаноильного) приводит к некоторому уменьшению цитотоксического действия, За, Ь.

Для оценки биологической активности в отношении резистентных клеток лейкоза человека К562/4 был выбран гпицеролипид ЗЬ как одно из синтезированных в данной работе соединений с высоким показателем цитотоксичности для обычных клеток К562 (рис.3).

Невосприимчивость опухолевых клеток к действию различных препаратов обусловлена их способностью к быстрому становлению множественной лекарственной устойчивости (МЛУ). Одним из способов ее предотвращения является снижение чувствительности опухолевых клеток к стрессу, что в свою очередь будет препятствовать активации дополнительных систем защиты опухолевых клеток и повысит эффективность противораковой терапии Так, устойчивость можно преодолеть с использованием определенного рода соединений, воздействующих на специфические клеточные рецепторы В частности, известно, что верапамил (альфа-/3-//2-(3,4-диметоксифенил)этил/метил-амино/пропил/-3,4-диметокси-альфа-(1 -метил-этил )-бензолацетонитрил) - инертное соединение для клеток в отношении проявления цитотоксических свойств активно снимает действие МЛУ, ослабляя защитные функции клеток.

О 1,5 3,1 6,3 12,5 25 50 —Д— К5В2/4 ЗЬ -Ф—К582/4 3Ь+уег -а-К582 ЗЬ с- "»оль

Рис.3 Цитотоксичность глицеролипида ЗЬ по отношению к клеткам К562 и К562/4 в присутствии и отсутствии верапамила

При обработке клеточной культуры К562/4 липидом ЗЬ клетки остаются нечувствительными к воздействию препарата (/С50 24 8 ммоль) В качестве контроля показано действие того же соединения на клетках К562 (/С50 4 5 ммоль). Совместная обработка резистентных клеток липидом ЗЬ и верапамилом приводит к снижению устойчивости опухолевых клеток К562/4, (/С5012.3 ммоль).

Полученные результаты хорошо согласуются с литературными данными для эдельфозина:

резистентные клетки К562/4 - 31.1 ммоль (Е0; резистентные клетки К562/4 - 17.4 ммоль (ЕГ+верапамил); не резистентные клетки К562 - 2.3 ммоль (ЕГ).

Изучение цитотоксических свойств соединения ЗЬ-с1И (катионного глицеролипида, содержащего флуоресцентную метку в виде дансильной группы в полярном домене) показало сопоставимую цитотоксическую активность с глицеролипидом ЗЬ. Так, данные по 1С$о (К562) получены соответственно: 4.8 ммоль ЗЬ и 9 3 ммоль ЗЬ-М (рис.4).

* 110

{Ь 100

о> Ц 90

ас КП

/0

3 ЯП

о а 50

* 4П

л <3 30

■л 20

10

0

;

I

!

\ V

N _ „ !

»-— . 5

!

"ЗЬ

В.З 12,5 25

50

С, ммоль

Рис. 4 Цитотоксичность глицеролипида ЗЬ и его флуоресцентного аналога ЗЬ-сШ.

Аналогичные результаты были получены для пары 8Ь и (5.5 ммоль и 10.0 ммоль соответственно)

2.1.2 Гетероциклические производные глицеролипидов

При изучении цитотоксической активности гетероциклических производных глицеролипидов, в частности, пиридинсодержащих соединений, внимание уделялось различию длины спейсерного участка, а также заместителя при атоме С(2) глицеринового скелета. Изменение отдельных структурных элементов позволит проследить их влияние на противоопухолевые свойства

9а

■ОС18Н37 ■ОСНз Г/ I—ОСО(СН2)зК<"

■ОС18Н37' —ОС2Н5 -ОСО(СН2)41\Г

Вт"

ОС18Н37 —ОСН3 Г/ ОСО(СН2)4К+

Вг"|

Вг"

9Ь

1 9с

//

9с)

(—ОС18Н37

■О

Вг"

-ОС,8Н37 -ОСНз

В г"

О

-ос)8н37

—ОС2Н5 0

-осо(а12)3>Г

—ОС18Н37 Вг" 1-ОСЛ,

-•о

Вг"

9е

9f

—ОС|8Н37 ОС,8Н37

Вг"

О

9д 9И ■

С целью расширения представлений о влиянии структурной модификации на биологические свойства в работе также исследованы пиридинсодержащие соединения Эс-И, синтезированные в нашей лаборатории ранее,. Изучение цитотоксической активности проводили на клетках лейкоза человека К562 и раковых клетках толстой кишки НСТ116 (таблица 6).

Таблица 6

Значение /С50 синтезированных соединений

Соединение К при С(2) п /Сю, ммоль (К562) 1С50, ммоль (НСТ116)

9а СНз 3 12,6 2,4

9Ь СНз 4 12,5 2,3

9с С2Н5 3 12,6 2,6

9с1 С2Н5 4 12,8 2,8

9е СНз - 4,6 7,3

9Г С2Н5 - 3,1 4,7

эд ОН - - 1,2

9И С18Н37 - 2,3 »40

Таким образом, можно отметить, что в зависимости от типа тестируемой клеточной линии результаты, полученные по цитотоксичности соединений неодинаковы. В большей мере пиридинссдержащие глицеролипиды оказались цитотоксичными по отношению к клеткам НСТ116, в то время как контрольный препарат эдельфозин оказался малоактивен для данной клеточной линии (»40 ммоль), однако, для клеток К562 значение /С50 эдельфозина составило 3.2 ммоль

Таблица 7

Цитотоксическая активность гетероциклсодержащих катионных глицеролипидов. 1С5о, ммоль

Соединение /С50, ммоль (К562) /Сю, моль (НСТ116)

11а 4,5 ±0,4 22,1 ±0,6

11Ь 4,8 ±0,6 20,4 ±0,3

12а 4,0 + 0,5 15,8 ±0,4

12Ь 4,1 ±0,4 16,2 + 0,3

14Ь 6,3 + 0,3 24,3 ± 0,5

16а 7,5 + 0,4 25,1 ±0,6

16Ь 6,9 ±0,4 26,0 ±0,2

При изучении цитотоксической активности других представителей катионных глицеролипидов с гетероциклическими катионными «головками» были получены данные, позволяющие выявить соединения с высокой антинеопластической активностью. Результаты биологических испытаний, проводимых на клеточных линиях лейкоза человека К562 и НСТ116, представлены в таблице 7.

2.1.3 Исследование гемолитической активности соединений2

Часто при высоких показателях цитотоксической активности по отношению к опухолевым клеткам соединения могут обладать и гемолитической активностью.

При изучении синтезированных катионных глицеролипидов За,b; 4а,Ь и 9 на гемолитическую активность было показано, что процент гибели клеток для исследуемых соединений достоверно не превышает таковой для растворителя (33.2%, ДМСО). Полученные данные сопоставимы с данными по контрольному препарату (рис.5). Таким образом, открывается возможность использования синтезированных веществ в экспериментах in vivo.

За ЗЬ 8Ь 4а 4Ь ЕГ

□ % неповреждённых клеток ■ % разрушенных клеток, гемолиз

Рис. 5 Гемолитическая активность алифатических производных

Была изучена гемолитическая активность в ряду пиридинсодержащих соединений. Оказалось, что наибольшей гемолитической активностью отличается липид 9д, соединения 9а-с) также превышают %-ый предел по растворителю, являясь гемолитически активными.

ОМБО 9а 9Ь 9с 9с1 9е 9д 9И ЕГ

□ % неповреждённых клеток ■ % разрушенных клеток, гемолиз

Рис. 6 Гемолитическая активность пиридинсодержащих соединений Что касается остальных синтезированных соединений, в частности, алкильных глицеролипидов с другими гетероциклическими основаниями, было показано, что, обладая высокой цитотоксической активностью по отношению к клеткам К562 и НСТ116, они не проявляли гемолитической активности.

2 Экспериментальная работа по оценке гемолитической активности соединений выполнена на кафедре органической химии Самарского Государственного Университета под руководством В.А Ерохина и H.A. Кленовой.

2.3 Изучение мутагенных свойств синтезированных соединений3

Первичную оценку мутагенной активности и учет генных мутаций вновь синтезированных глицеролипидов проводили при помощи теста Эймса". Для соединения ЗЬ, согласно протоколу исследований показано, что оно не обладает мутагенными свойствами и в связи с этим наличие у него канцерогенной активности, связанной с генотоксичностью, маловероятно.

2.4 Исследование изменений клеточного цикла под влиянием синтезированных катионных глицеролипидов4

Уникальным инструментом, позволяющим проследить за ходом инициируемых изменений в клетке является проточная цитометрия. При попытке выявить тип клеточной гибели, к которому сводится цитототоксическое действие агентов, принадлежащих классу бесфосфорных катионных глицеролипидов, а также оценить изменения клеточного цикла была проведена серия соответствующих экспериментов. Для анализа были выбраны схожие линии лейкозных клеток человека К562 и 11937. В качестве тестируемого препарата выступал катионный глицеролипид ЗЬ.

На рис.7 и рис.8 приведены развёртки клеточного цикла для клеток, подвергшихся обработке препаратом в различных концентрациях.

I

I

Рис.7 Культура К562. а Ь

Рис.8 Культура U937.

а) контроль; Ь) 3.1 ммоль; с) 6.3 ммоль; d) 12.5 ммоль липида.

3 Экспериментальная работа по изучению мутагенной активности соединения ЗЬ выполнена в лаборатории методов скрининга канцерогенов НИИ канцерогенеза ГУ РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН, под руководством проф. Бепицкого Г.А.

" В работе использовались индикаторные штаммы Salmonella typhimurium ТА100 и ТА98

4 Экспериментальная работа выполнена а институте Иммунологии РАМН, под руководством Литвиной М.В.

С увеличением концентрации липида ЗЬ наблюдается картина перераспределения клеточной плотности: возрастает доля клеток, находящихся в состоянии апоптоза. При этом клеток, подвергшихся некротической гибели даже при критических концентрациях препарата (выше 1С50, ммоль) зафиксировано не было. Выводы справедливы для обоих типов рассматриваемых клеточных линий.

2.5 Изучение динамики накопления катионных глицеролипидов в клетке5

Для липида ЗЬ при помощи проточной цитофлуорометрии на клеточной культуре К562 было показано, что соединение проникает в клетки, и, более того, при конечной концентрации 6.3 ммоль - накапливается в них.

MCF

Рис. 9 Временная зависимость динамики накопления препарата в клетках К562.

Время накопления соединения в клетке до достижения своего максимального значения составляет 40 минут, при этом величина среднего концентрационного канала флуоресценции (МСР) равна 30% от исходного (рис.9).

2.6 Установление типа клеточной гибели под воздействием катионных глицеролипидов6

С целью установления типа клеточной гибели проводили исследование синтезированных соединений при помощи электронной микроскопии. На рис.10 и рис.11 для катионного глицеролипида ЗЬ представлены электронные фотографии клеток контроля и клеток, обработанных препаратом в концентрации 6.3 ммоль.

Снимки электронной микроскопии показали, что под воздействием препарата -для обработанных клеток наблюдаются характерные признаки, присущие апоптозу: выраженная конденсация маргинального хроматина и фрагментация ядра при хорошо сохранённой цитоплазме клеток (рис. 10Ь).

5 Экспериментальная работа выполнена в институте Иммунологии РАМН.

° Экспериментальная работа выполнена в лаборатории гистохимии и электронной микроскопии отдела патологической анатомии опухолей человека на базе института РОНЦ им. H.H. Блохина при участии сотр. Филипповой H.A.

Аналогичная картина наблюдается для обработанных клеток линии НСТ116. Образование в цитозоле клеток многочисленных вакуолей, расширенные цистерны ГЭР (гладкого эндоплазматического ретикулума), увеличение периферического гетерохроматина в ядрах свидетельствуют о том, что клетки явно находятся в состоянии апоптоза, при этом чётко видна фрагментация ядра (рис. 11Ь).

Рис.10 Увеличение 2500. Культура К562; а) контроль, Ь) препарат.

Рис.11 Увеличение 5000. Культура НСТ116; а) контроль; Ь) препарат.

2.7 Изучение распределения катионных глицеролипидов клетке, установление мест их наиболее вероятной локализации7

Было установлено, что бесфосфорные алкильные катионные глицеролипиды, наряду с эдельфозином, способны проникать в опухолевые клетки, накапливаться в них и вызывать апоптическую гибель. Для препарата ЗЬ-сИп при помощи микроскопа с освещением поддерживаемым ртутной лампой были получены снимки клеток контроля и обработанных препаратом в концентрации 3.1 ммоль (рис. 12а, Ь клеточная культура НСТ116).

При помощи конфокальной микроскопии было показано распределение исследуемого липида в клетке (рис. 12с-е).

Установлено, что распределение катионного глицеролипида ЗЬ-сЖ отличается от мест локализации эдельфозина для той же культуры клеток. Конденсация Ef нередко наблюдается в лизосомах. Однако, в случае синтезированного бесфосфорного липида ЗЬ-сЖ зафиксировано его полное отсутствие в лизосомальных тельцах клетки, а

7 Экспериментальная работа выполнена на кафедре инструментального анализа биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

именно: при одновременном введении в клетку лизотреккера и катионного липида, содержащего флуоресцентную метку, места локализации препарата и лизосомной метки не совпадали. Выдвинуто предположение, что локусом накопления для бесфосфорных катионных глицеролипидов в клетке могут служить митохондрии. Общим же местом локализации для исследуемого липида и Ef является цитоплазматическая мембрана.

а)фазовый контраст, Ь)свечение липида в клетках

с) клетки до обработки, d) контрастирование, е) свечение липида;

Рис. 12 Распределение катионного глицеролипида ЗЬ-dh в клетках НСТ116.

Являясь по своей природе не мутагенными селективными соединениями, обладающими антинеопластическими свойствами и характеризующиеся отсутствием гемолитической активности, катионные глицеролипиды с простой эфирной связью зарекомендовали себя в качестве потенциальных агентов противоопухолевой терапии.

ВЫВОДЫ

1. Синтезированы новые бесфосфорные глицеролипиды с набором аммониевых катионных «головок» гетероциклического и алифатического ряда.

2. Получены модификационные ряды алкильных глицеролипидов, в которых гидрофильный домен отделён от гидрофобного участка спейсерными группами различной длины.

3. Синтезированы флуоресцентномеченые катионные глицеролипиды с простой эфирной связью для изучения динамики накопления в раковых клетках и выявления мест их наиболее вероятной внутриклеточной локализации .

4. Проведены биологические испытания in vitro полученных в работе соединений. Дана оценка цитотоксической и гемолитической активности, изучены мутагенные свойства. Показана корреляция структуры липидов с их активностью. По результатам исследований могут быть рекомендованы определённые соединения для дальнейших биологических испытаний.

5. Выявлен тип гибели опухолевых клеток под воздействием катионных алкильных глицеролипидов.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:

1. Романова С.Г., Штиль A.A., Серебренникова ГА Синтез новых бесфосфорных аналогов эдельфозина и их цитотоксичность. // Биоорган Химия. - 2008. - Т. 34. - №6. - С. 827-830.

2 Романова С.Г. , Романов В Г., Плявник Н.В., Серебренникова Г.А. , Штиль A.A. Синтез бесфосфорных пиридинсодержащих глицеролипидов с простой эфирной связью // Вестник МИТХТ. - 2008. - Вып. 3. - №4. - С 53-57.

3. Романова С.Г., Серебренникова Г.А , Штиль А А Синтез, изучение цитотоксических свойств и гемолитической активности катионных глицеролипидов алкильного типа. // Вестник МИТХТ - 2008 - Т. 3. - №5. - С 101-105.

4. Плявник Н.В., Романова С.Г, Серебренникова ГА Синтез физиологически активных глицеролипидов алкильного типа. // Тезисы докладов Первой научно-технической конференции молодых ученых «Наукоемкие химические технологии». - Москва - 2005 - Т. 1 - С. 36-37

5. Романова С Г., Плявник Н.В , Маслов M А., Штиль А.А , Серебренникова Г.А. Бесфосфорные глицеролипиды алкильного типа - новый класс противоопухолевых соединений. II Тезисы докладов (Российский Биотерапевтический Журнал) V Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты». - Москва - 2006 -Т. 5 - №1 - С.19.

6. Плявник HB, Романова С.Г., Штиль АА, Серебренникова Г.А. Положительно заряженные глицеролипиды - потенциальные противоопухолевые агенты. // Тезисы докладов Международной конференции «Биотехнология и медицина». - Москва - 2006 - С 107.

7. Романова С.Г., Плявник H В., Серебренникова Г.А. Синтез катионных глицеролипидов с простой эфирной связью. // Тезисы докладов Международной конференции молодых ученых по фундаментальным наукам "Ломоносов-2006" -Москва - 2006 - Т.2 - С.42.

8. Плявник H В, Романова С.Г., Никитин H.A., Серебренникова Г.А Амфифильные производные алифатических и гетероциклических аминов и их биологическая активность. // Тезисы докладов Международного симпозиума «Advanced Science in Organic Chemistry».-CyflaK - 2006 - С 134.

9. Романова С.Г., Плявник Н.В, Серебренникова Г.А. Синтез бесфосфорных апкильных глицеролипидов с катионными «головками» гетероциклического ряда. // Тезисы докладов Юбилейных Научных Чтений, посвященных 110-летию со дня рождения проф. H.A. Преображенского -Москва-2006 - С.22.

10. Романова С.Г., Плявник Н.В., Штиль А.А , Серебренникова Г.А. Синтез и исследование биологической активности бесфосфорных катионных глицеролипидов алкильного типа. // Тезисы докладов V Международной конференции по органической химии «Органическая химия от Бутлерова и Бейльштейна до современности». - Санкт-Петербург - 2006 - С.469-470.

11. Романова С.Г^ Плявник Н.В., Серебренникова Г.А. Разработка методов синтеза новых бесфосфорных катионных глицеролипидов алкильного типа. // Тезисы докладов XI Международной научно-технической конференции "Наукоемкие химические технологии - 2006". - Самара - 2006 -Т.1 - С.161-162.

12. Романова С.Г., Серебренникова Г.А. Синтез бесфосфорных алкильных глицеролипидов с катионными головками гетероциклического ряда II Тезисы докладов XVIII Менделеевского съезда по общей и прикладной химии. - Москва - 2007 - Т.4 - С.573.

13. Романова С.Г., Серебренникова Г.А., Штиль A.A. Антинеопластические свойства бесфосфорного аналога эдельфозина - катионного глицеролипида с простой эфирной связью. II Тезисы докладов VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты». (Российский Биотерапевтический Журнал) -Москва - 2008 - Т. 7 - №1 - С.51.

14. Романова С.Г., Серебренникова Г.А. Синтез бесфосфорных алкильных глицеролипидов с катионными головками гетероциклического ряда. II Тезисы докладов Международной конференции молодых ученых по фундаментальным наукам "Ломоносов-2008". - Москва - 2008 - С 44.

15. Романова С.Г., Серебренникова Г.А, Штиль A.A. Катионные бесфосфорные алкильные глицеролипиды - потенциальные агенты противоопухолевой терапии. // Тезисы докладов IV Съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. - Новосибирск - 2008 - С. 232.

16. Романова С.Г.^ Серебренникова Г.А. Создание алкильных глицеролипидов с пиридиниевыми полярными «головками». // Тезисы докладов XII Международной научно-технической конференции "Наукоемкие химические технологии - 2008". - Волгоград - 2008 - Т.1 - С.53.

Подписано в печать 18.11.2008 г.

Печать трафаретная

Заказ № 1214 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

2.1 Свойства л ипидов с простой эфирной связью.

2.2 Создание модифицированных аналогов эдельфозина.

2.3 Биологическая активность фосфорсодержащих глицеролипидов.

2.4 Бесфосфорные глицеролипиды алкильного типа, аналоги эдельфозина.

2.4.1 Структура и основные свойства катионных глицеролипидов.

2.4.2 Химический синтез бесфосфорных глицеролипидов с простой эфирной вязью.

2.4.3 Создание модифицированных форм катионных глицеролипидов алкильного типа.

2.4.4 Биологическая активность в ряду бесфосфорных алкильных глицеролипидов.

2.5 Изучение механизма действия алкильных глицеролипидов.

2.5.1 Механизмы запуска апоптоза.

2.5.2 Внутриклеточные процессы активации.

2.5.3 Создание флуоресцентно-меченых соединений.

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ^АБОТЫ.

3.1 Получение бесфосфорных алкильных глицеролипидов с алифатическими полярными «головками».

3.2 Получение бесфосфорных алкильных глицеролипидов с гетероциклическими полярными «головками».

3.3 Изучение биологической активности синтезированных в работе соединений.

3.3.1 Оценка цитотоксичности.

3.3.2 Гэмолитическая активность.

3.3.3 Оценка мутагенности

3.3.4 Установление типа клеточной гибели.

3.3.5 Изучение динамики накопления катионных глицеролипидов в клетке.

3.3.6 Изучение типа клеточной гибели с помощью электронной микроскопии.

3.3.7 Изучение распределения катионных глицеролипидов в клетке, установление мест их наиболее вероятной локализации.

4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

5. ВЫВОДЫ.

Интерес к химии фосфорсодержащих глицеролипидов возрос с открытием природного биорегулятора широкого спектра действия - ФАТ (фактора активации тромбоцитов) [1].

Уникальность механизмов клеточной регуляции с участием ФАТ обусловлена прежде всего тем, что ФАТ обнаружен в организмах, стоящих на разных ступенях эволюционной лестницы: бактерии, простейшие, грибы, растения, беспозвоночные, низшие позвоночные, млекопитающие. ФАТ выделен из лейкоцитов, базофилов, макрофагов, тромбоцитов человека, лошадей, кроликов и некоторых других видов животных.

ФАТ принадлежит к универсальным биорегуляторам, влияющим на самые разнообразные жизненно важные системы организма [2]. Так, он является одним из самых сильных индукторов активации тромбоцитов, приводящей в конечном итоге к их агрегации. ФАТ оказывает влияние и на другие типы клеток крови, вызывая активацию и хемотаксис нейтрофилов, эозинофилов, макрофагов и моноцитов, стимуляцию лимфоцитов; отвечает за аллергические и воспалительные процессы в организме; выявлено его влияние на сердечнососудистую, иммунную и центральную нервную системы, кроме того ФАТ влияет на увеличение проницаемости кровеносных сосудов и сокращение гладких мышц. Такое многообразие функций и направленность воздействия нашло своё отражение в повышенном интересе среди учёных к этому соединению. Однако, наличие сильного тромбоцит-агрегирующего действия делает невозможным его использование в терапевтических целях.

Эра фосфорсодержащих структурно-модифицированных аналогов ФАТ началась с открытия в 1979 году тремя независимыми лабораториями США, Франции и Великобритании его природной формулы [3].

Среди многочисленных производных фактора активации тромбоцитов отдельного внимания заслуживают вещества немутагенной природы, обладающие биологической полиактивностью. Так, например, в литературе описаны: перифозин [4, 5], милтефозин [6-8], илмофозин [8-10], эдельфозин [11, 12] и другие. Вышеназванные липиды проявляют анти-ВИЧ-1 и ФАТ-антагонистическую активности, обладают антинеопластическими свойствами. Кроме того, эти соединения характеризуются высокой избирательностью действия, вызывая цитостатическое действие и цитотоксический эффект преимущественно раковых клеток [11].

Наиболее известным соединением, созданным на основе ФАТ, является эдельфозин (1-октадецил-2-метил-гас-глицеро-3-фосфохолин, ЕТ-18-ОМе). Он обладает высокой противоопухолевой активностью, ингибируя рост и пролиферацию различных опухолевых клеток in vivo и in vitro. В настоящее время эдельфозин - коммерческий препарат, прошедший фазы предклинических и клинических испытаний.

Поиск других структурных композиций биологически активных веществ, дополняющих представление о взаимосвязи строения и проявляемых свойств привело к созданию на основе эдельфозина нового перспективного класса бесфосфорных алкильных глицеролипидов. Предварительные исследования таких соединений показали, что среди них обнаружены агенты, обладающие антилейкемической, противогрибковой, противоопухолевой и противовирусной активностью, а также ингибиторы протеинкиназы С.

Благодаря наличию широкого спектра биологической активности синтетические бесфосфорные катионные глицеролипиды с простой эфирной связью привлекают всё большее внимание исследователей. В соответствии с уже установленными требованиями к структуре этого класс соединений: наличие длинноцепного алкильного заместителя в С(1) положении и короткоцепного - в С(2) положении глицеринового скелета обеспечивают проявление антинеопластической активности у этих липидов [13]. Влияние других фрагментов структуры (спейсерного участка, гидрофильного домена, противоиона) на биологические свойства катионных глицеролипидов изучено пока недостаточно.

В настящее время представляется актуальным синтез новых бесфосфорных положительно заряженных глицеролипидов алкильного типа - потенциальных агентов противоопухолевой терапии, модифицированных по спейсерному и гидрофильному доменам. Так, создание структур с варьируемой длиной спейсера, изменением его природы и типа связывания с глицериновым остовом, а также получение соединений с различным набором катионных «головок» позволит выявить закономерность проявления цитотоксической активности соединениями этого типа в зависимости от их структурных особенностей.

Настоящая работа выполнена в соответствии с планом научных исследований кафедры ХТБАС МИТХТ им. М. В. Ломоносова по теме № 1-Б-4-355 «Разработка химических и биотехнологических методов модификации биологически активных соединений с целью моделирования жизненно важных процессов в природе и создания новых лекарственных препаратов» при поддержке грантов РФФИ, проекты № 04-03-32452-а и 07-03-00632.

На защиту выносятся следующие основные положения:

• Создание модификационных рядов бесфосфорных положительно заряженных алкильных глицеролипидов, содержащих спейсерные фрагменты различной длины и разные типы катионных «головок».

• Получение алкильных глицеролипидов с аминами алифатического ряда в полярном домене.

• Синтез катионных глицеролипидов с простой эфирной связью, содержащих гетероциклические основания в качестве катионной «головки».

• Получение положительно заряженных алкильных глицеролипидов с флуоресцентной меткой, присоединённой к полярному домену.

• Исследование противоопухолевой и гемолитической активности полученных соединений.

• Проверка мутагенных свойств и изучение динамики накопления катионных глицеролипидов в неопластических клетках.

• Выявление взаимосвязи структура/биологическая активность в ряду синтезированных соединений.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

ГЛИЦЕРОЛИПИДЫ С ПРОСТОЙ ЭФИРНОЙ СВЯЗЬЮ, БИОЛОГИЧЕСКАЯ

АКТИВНОСТЬ, МЕХАНИЗМ АНТИНЕОПЛАСТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ

Среди фосфорсодержащих глицеролипидов с простой эфирной связью, долгие годы удерживающих первенство по созданию лекарственных препаратов на их основе наиболее изученным является 1-0-октадецил-2-0-метил-гас-глицеро-3-фосфохолин (Edelfosine, 1, ЕТ-18-ОМе) [14-16]. Это синтетический аналог фактора активации тромбоцитов ФАТ (ацильного фосфорсодержащего глицеролипида - природного биорегулятора, обладающего широким спектром биологической активности).

ОС18Н37

ОСН3

0-Р-0-СН2СН2М+(СНз)з о/А°-1

С точки зрения химической классификации эдельфозин является родоначальником и ярким представителем особого класса соединений -алкилфосфохолинов. Данные глицеролипиды в своём большинстве, обладая селективным цитотоксическим эффектом по отношению ко многим линиям опухолевых клеток, зарекомендовали себя в качестве потенциальных агентов химиотерапии рака. Этот ряд соединений на фоне ацильных фосфорсодержащих аналогов видится более привлекательным в плане использования их в медицинской практике. Химическая структура алкильных глицеролипидов (соединений, содержащих только простые эфирные связи в положениях С1 и С2 глицеринового скелета) предполагает наличие устойчивости к воздействию фосфор-расщепляющих ферментов - фосфолипаз при использовании препаратов in vitro [17-19]. Эдельфозин обладает сильным канцеростатическим и канцеротоксическим действием по отношению к опухолевым клеткам различных линий, в основном к лейкозу [20, 21]; при этом данный препарат практически не токсичен для нормальных клеток человека [22].

При попытке раскрыть механизм противоопухолевого действия эдельфозина выдвигались различные гипотезы, основанные на экспериментальных данных различных отечественных и зарубежных лабораторий. Так, вопросом изучения принципа действия эдельфозина занимаются ведущие научные центры США, Канады, Англии, Австрии и России.

Из-за схожести структуры эдельфозина и его аналогов с фосфатидилхолином (PC), основные исследования были сфокусированы на поиске общих закономерностей PC метаболизма эдельфозина и других представителей алкилфосфохолинов. Основной идеей, которая легла в основу теории рафтовых изменений под воздействием препаратов - стало наблюдение того, что помимо самого эдельфозина некоторые другие холин-содержащие алкилфосфолипиды ингибируют PC синтез и это влияет на ингибирование клеточного роста различных линий опухолевых клеток [23]. Кроме того, было отмечено, что среди фосфолипидов только те, что содержат холиновую группу способны проявлять противоопухолевые свойства [24], в отличие от липидов, содержащих другие группы, например, этаноламин, серин, аланин. Поиск структурных доменов липидов, которые в той или иной степени оказывают влияние на противоопухолевые свойства соединения продолжаются. В настоящее время действующим предположением остаётся эдельфозин-опосредованная цитотоксичность, наблюдение которой происходит в результате модификации биофизической структуры липидных рафтов [25, 26].

5. ВЫВОДЫ

1. Синтезированы новые бесфосфорные глицеролипиды с набором аммониевых катионных «головок» гетероциклического и алифатического ряда.

2. Получены модификационные ряды алкильных глицеролипидов, в которых гидрофильный домен отделён от гидрофобного участка спейсерными группами различной длины.

3. Синтезированы флуоресцентномеченые катионные глицеролипиды с простой эфирной связью для изучения динамики накопления в раковых клетках и выявления мест их наиболее вероятной внутриклеточной локализации.

4. Проведены биологические испытания in vitro полученных в работе соединений. Дана оценка цитотоксической и гемолитической активности, изучены мутагенные свойства. Показана корреляция структуры липидов с их активностью. По результатам исследований могут быть рекомендованы отдельные соединения для дальнейших биологических испытаний.

5. Выявлен тип гибели опухолевых клеток под воздействием катионных алкильных глицеролипидов.

1. Snyder F., Lee T.Ch., Blank M.L. Platelet-activating factor and related ether lipid mediators. Biological activities, metabolism and regulation. // Annals of New York Academy of Sciences. 1989. -V. 568. - P. 35.

2. Braguest P., Godfroid J.J. Conformational properties of PAF acether receptor on platelets based on structure activity studies. // Platelet Activating Factor and Related Lipid Mediators. - 1987. - P. 191.

3. Tence, M., E. Coeffier, E Heymans, J. Polonsky, J. J.Godfroid, and J. Benveniste. Structural analogs of platelet-activating factor (PAF-acether). // Biochimie. 1981. - V.63 - P. 3-20.

4. Edward A. S. Phase I Trial of Perifosine (NSC 639966) on a Loading Dose/Maintenance Dose Schedule in Patients with Advanced Cancer. // Clinical Cancer Research. 2004. -V. 10.-7450-7456.

5. Lynn V. U., Kim В., Jennifer V., Rebecca M., Kendra Т., Jill K., Rhoda A., Dona A., George W. Miltefosine: great expectations against visceral leishmaniasis. // Drug review. -2003. -V. 49. P. 101-103.

6. Murray H. W., Etienne S. Visceral leishmanicidal activity of hexadecylphosphocholine (miltefosine) in mice deficient in Tcells and activated macrophage microcidal mechanisms. // J. Inf Dis. 2000. - V. 181. - P. 795-799.

7. Ricardo M. S., Andrea H. P., Helene S. В., Solange L. de Castro. Effect of the lysophospholipid analogues edelfosine, ilmofosine and miltefosine against Leishmania amazonensis. // J. of Antimicrobial Chemotherapy. 2004. -V. 54. - P. 704-710.

8. Hanauske A. R., Degen D., Marshall M. H., Hilsenbeck S. G., McPhillips J. J., Von Hoff D. D. Preclinical activity of ilmofosine against human tumor colony forming units in vitro. // Anticancer Drugs. 1992. - V. 3. - P. 43-46.

9. H.Gajate C., Mollinedo F. Biological activities, mechanisms of action and biomedical prospects of the antitumor ether phospholipid ET-18-OCH3 (Edelfosine), a proapoptotic agent in tumor cells. // Curr. Drug Metab. 2002. - V. 3. - P. 491- 525.

10. Helmut K., Mangold H.K. Synthesis of biologically active ether lipids. // Prog. Biochem. Pharmacol. 1988. -V. 22. - P. 100-108.

11. Jan C.R., Wu S.N., Tseng C.J. The ether lipid ET-18-OCH3 increases cytosolic Ca2+ concentrations in Madin Darby canine kidney cells. // Br. J. Pharmacol. 1999. -V. 127.- №6. P. 1502.

12. Civoli F., Pauig S.B., Daniel L.W. Differentiation of HL-60 cells distinguishes between cytostatic and cytotoxic effects of the alkylphospholipid ET-18-OCH3. // Cancer Chemother. Pharmacol. 1996. -V. 38. - P. 269.

13. Ruiter G. A., Verheij M., Zerp S. F., and van W. Blitterswijk. Alkyl-lysophospholipids as anticancer agents and enhancers of radiation-induced apoptosis. // J. Rad. Oncol. Biol. Phys. 2001. - V. 49. - P. 415-419.

14. Samadder P., Richards C., Bittman R. The antitumor ether lipid 1-Q-octadecyI-2-0-methyl-rac-glycerophosphocholine (ET-18-OCH3) inhibits the association between Ras and Raf-1. //Anticancer Res. 2003. - V. 23. - P. 2291-225.

15. Zhou X., Arthur G. The relationship between cellular ether glycerophospholipid content and sensitivity of cancer cells to l-O-octadecyl-2-O-methyl-glycerophosphocholine. // Anticancer Res. 1992. - V. 12. - №5. - P. 1559-1562.

16. Mollinedo F., Martinez-Dalmau R., Modolell M. Early and selective induction of apoptosis in human leukemic cells by the alkyl-lysophospholipid ET-18-OCH3. Biochem Biophys. // Res Commun. 1993. -V. 192. - P. 603-609.

17. Botzler C., Ellwart J., Gunther W., Eissner G., Multhoff G. Synergistic effects of heat and ET-18-OCH3 on membrane expression of hsp70 and lysis of leukemic K562 cells. // Exp. Hematol. 1999. - V.27. - №3. - P. 470-478.

18. Girgert R., Schweizer P., Bock I., Narr R., Bruchelt G.Cytotoxicity of ether phospholipid BM 41.440 on neuroblastoma cells. // J. Cancer Res. Clin. Oncol. 1995. -V. 121. - P. 262-266.

19. Hanahan, D. J. Platelet activating factor: a biologically active phosphoglyceride. // Rev. Biochem. 1986. -V. 53. - P. 483-509.

20. Scheel-Toellner D., Wang K., Singh R., Majeed S., Raza K., Curnow S.J., Salmon M., Lord J.M. The death-inducing signalling complex is recruited to lipid rafts in Fas-induced apoptosis. // Biochem. Biophys. Res. Commun. -2002. -V. 297. P. 876-879.

21. Zaremberg V., Gajate C., Cacharro L.M., Mollinedo F., McMaster C.R. Cytotoxicity of an anti-cancer lysophospholipid through selective modification of lipid raft composition. // J. Biol. Chem. 2005. -V. 280. - P. 38047-38058.

22. Hoffman J., Utz I., Spitaler M., Hofer S., Rybczynska M., Beck W.T., Herrmann D.B.J., Grunicke H. Resistance to the new anti-cancer phospholipid ilmofosine (BM 41.440). // Br. J. Cancer. 1997. - V. 76. - P. 862.

23. Hanauske A. R., Degen D., Marshall M. H., Hilsenbeck S. G., McPhillips J. J., Von Hoff D. D. Preclinical activity of ilmofosine against human tumor colony forming units in vitro. // Anticancer Drugs. 1992. - V. 3. - P. 43-46.

24. Herrmann D. В., Pahlke W., Opitz H. G., Bicker U. In vivo antitumor activity of ilmofosine. // Cancer Treat. Rev. 1990. -V. 17. - P. 247-252.

25. Duclos R.I., Chia H.H., Abdelmageed O.H., Esber H., Fournier D.J., Makriyannis A. Synthesis of racemic and nearly optically pure ether lipids and evaluation of in vitro antineoplastic activities. // J. Med. Chem. 1994. - V. 37. - P. 41-47.

26. Principe P., Braquet P. Advances in ether phospholipids treatment of cancer. // Crit. Rev. Oncol. Hematol. 1995. -V. 18. - P. 155.

27. Berdel W.E., Okamoto S. Ether lipids in cancer chemotherapy. // J. Med. Clin. 1990. -V. 39. - №2. - P. 75-78.

28. Berdel W.E., Andereesen R., Murder P.G. Synthetic alkyl-phospholipid analogs: a new class of antitumor agents. // Phospholipids and Cellular Regulation.- 1989. P. 42-73.

29. Vogler W.R., Olson A.C., Hajdu J., Shoji M., Raynor R., Kuo J.F. Structure-function relationships of alkyl-lysophospholipid analogs in selective antitumor activity. // Lipids. -1993. V. 28. - №6. - P. 511.

30. Andereesen R. Ether-phospholipids in the therapy of cancer. II Progress in Biochemical Pharmacology. 1998. - V.22. - P. 118-131.

31. Ivan Blitterswijk W.J., Hilkmann H., Storme G.A. Accumulation of an alkyl lysophospholipid in tumor cell membranes affects membrane fluidity and tumor cell invasion. И Lipids. 1987. - V. 22. - P. 820-823.

32. Seewold M.J., Olsen R.A., Sehgal I., Melder D.C., Modest E.J., Powis G. Inhibition of grouwn factor dependent inositol phosphate Ca2+ signaling by antitumor ether lipid analogues. // Cancer Res. 1990. - V. 50. - P. 4458.

33. Shen N.Y., Hwang S.B., Doebber T.W., Robbins J.C. The chemical and biological properties of PAF agonist, antagonist and biosynthetic inhibitors. // Platelet Activating Factor and Related Lipid Mediators. 1987. - P. 153-158.

34. Civoli F., Daniel L.W. Quaternary ammonium analogs of ether lipids inhibit the activation of protein kinase С and the growth of human leukemia cell lines. // Cancer Chemother Pharmacol. 1998. - V. 42. - P. 319.

35. Van Blitterswijk W.J., Van der bend R., Kramer I.M., Verhoeven A.J., Hilkmann H., De Widt J. A. Metabolite of an antineoplastic ether phospholipid may inhibit transmembrane signaling via protein kinase C. // Lipids.- 1987.-V. 22. P. 842.

36. Hoffman D. R., Hajdu J., Snyder F. Cytotoxicity of platelet activating factor and related alkyl-phospholipid analogs in human leukemia cells, polymorphonuclear neutrophils, and skin fibroblasts. // Blood. 1984,- V. 63 - P. 545-552.

37. Winkler J.D., Eris Т., Sung C.M., Chabot-Fletcher M., Mayer R.J., Surette M.E., Chilton F.H. Inhibitors of coenzyme A-independent transacylase induce apoptosis in human HL-60 cells. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1996. - V. 279. - P. 956.

38. Van der Luit A. H., Budde M., Ruurs P. Alkyl-lysophospholipid accumulates in lipid rafts and induces apoptosis via raftdependent endocytosis and inhibition of phosphatidylcholine synthesis. И J Biol Chem. 2002. -V. 277. - P.39541-39547.

39. Diomede L., Principe P., Domingo M.T., Broquet C., Chabrier P.E., Braquet P., Salmona M. Effect of PAF antagonists on the cytotoxic activity of anti-neoplastic ether phospholipids. // J. Oncol. 1993. -V. 2. - P. 777-782.

40. Pat. 0.302.744 A2 Ера. С 07 D 239/36. Preparation of glycerol derivatives and antitumor agents and pharmaceutical compositions containing them. / Keizo I., Hiroaki N., Eiko I.

41. Berdel W.E., Greiner E., Fink U., Zenker K.S., Stavrov D., Trappe A., Fahlbusch R., Reichert A., Rasstetter. Cytotoxic effects of alkyl-lysophospholipids in human brain tumor cells.//Oncology. -1989. V.41. - P. 140-145.

42. Berdel E.W. Membrane interactive lipids as experimental anticancer drugs. II Br. J. Cancer. 1991. -V. 64. - P. 208.

43. Crumpton S.C., Goz В., Ishaq K.S. Novel lipid analogs with cytostatic and cytocidal activity. //Anticancer Res. 1988. -V. 8. - P. 1316.

44. Евр. пат. 0336142, МКИ C07F9/12 Novel antagonists of platelet activating factor / Wissner A., Schaub R.E., Sum P.E. Опубл. 11.10.1989. Бюлл. 89/41.

45. Godfroid J.J., Heymans F. Chemistry of PAF antagonists. // Prog. Biochem. Pharmacol. — 1988. — V. 22.-P. 25.

46. Маслов M.A., Морозова Н.Г., Серебренникова Г.А. Удобный метод получения катионных глицеролипидов с потенциальной биологической активностью. II Изв. АН, Сер. хим. 2002. - № 10. - С. 1778.

47. Kudo I., Nojima S., Chang H.-W., Yanoshita R., Hayashi H., Kondo E., Nomura H., Inoue K. Antitumor activity of synthetic alkyllysophospholipids with or without PAF activity. II Lipids. 1987. - V. 22. - P. 862.

48. Ricardo M. Santa-Rita, Andrea Henriques-Pons, Helene S. Barbosa, Solange L. Castro. Effect of the lysophospholipid analogues edelfosine, ilmofosine and miltefosine against. // Leishmania amazonensis. 2002. - V.4. - P. 704-710.

49. Shen N.Y., Hwang S.B., Doebber T.W. and Robbins J.C. The chemical and biological properties of PAF agonist, antagonist and biosynthetic inhibitors. // Platelet Activating Factor and Related Lipid Mediators. 1987. - P. 153-158.

50. Peters A.C., Ahmad I., Janoff A.S., Pushkareva M.Y., Mayhew E. Growth inhibitory effects of liposome-associated 1-0-octadecyl-2-0-methyl-sn-glycero-3-phosphocholine. //Lipids. 1997. - V. 32. - P. 1045.

51. Berdel W.E., Munder P.G. Antineoplastic actions of ether lipids related to platelet-activating factor. Platelet-activating factor and related lipid mediators // Plenum Publishing Corporation. 1987. - P. 449-467.

52. Константинова И.Д., Серебренникова Г.А. Положительно заряженные липиды: структура, методы синтеза, применение // Успехи химии. 1996. - Т. 65. - №6. - С. 581.

53. Маслов М.А., Сычева Е.В., Морозова Н.Г., Серебренникова Г.А. Синтез алкильных глицеролипидов с различными катионными головками, присоединенными непосредственно к глицериновому скелету. // Изв. АН, Серия хим. 1999. - №7. -С. 1381.

54. Schreiber B.M., Layne M.D. and Modest E.J. Superoxide production by macrophages stimulated in vivo with synthetic ether lipids. // Lipids. 1994. - V. 29. - №4. - P. 237.

55. Heymans F., Borrel M.C., Broquet C., Lefort J., Godfroid J.J. Structure activity relationship in PAF -acether. 2. rac-1-Octadecyl-2-acetyl-3-y-(dimethylamino) propyl.glycerol. // J. Med. Chem. - 1985. -V. 28. - P. 1094.

56. Godfroid J.J. and Heymans F. Chemistry of PAF antagonists. // Progress in Biochemical Pharmacology. 1998. -V. 22. - P. 25.

57. Pat. 0.321.296 Ai EPA. С 07 D 249/14. Preparation of lipid analogs as Platelet Activation Factor (PAF) antagonists and Antitumor Agents. / Susumu K., Takeaki M., Tatsuo Т., Morio K.

58. Desquand S. Effects of PAF antagonists in experimental models possible therapeutical implication. // Therapie. -1993. - V. 48. -№6. - P. 585-589.

59. Blank, M. L., T-c. Lee, V. Fitzgerald, and F. Snyder. A specific acetylhydrolase for 1-alkyl-2-acetyl-sn-glycero-3-phosphocholine (a hypotensive and platelet-activating lipid). //J. Biol. Chem. 1981. - P. 175-178.

60. Noseda A., White J.G., Godwin P.I., Jerome W.G. Membrane damage in leukemic cells induced by ether and ester lipids: an electron microscopic study.// Experimental and Molecular Pathology. 1989. - V.50. - P. 69-83.

61. Arthur G., Bitmann R. The inhibition of cell signaling pathways by antitumor ether lipids. // Biochim. Biophys. Acta. 1998. - P. 85-102.

62. Vallari D.S, Record M, Smith Z.L, Snyder F. O-alkyl-O-methylglycerophosphocholine, an antineoplastic lipid, undergoes spontaneous redistribution between biological membranes prepared from HL-60 cells. // Biochim Biophys Acta. 1989 - P. 250-254.

63. Jon V. Busto a, Jesus Sot a, Felix M. Surface-active properties of the antitumour ether lipid 1-0-octadecyl-2-0-methyl-rac-glycero-3-phosphocholine (edelfosine) // Biochimica et Biophysica Acta. 2007. - P. 1855-1860.

64. Torrecillas A., Aroca-Aguilar J.D., Aranda F.J., Gajate C., Mollinedo F., Corbalan-Garcia S. Effects of the antineoplastic agent ET-18-OCH3 and some analogs on the biophysical properties of model membranes. // J. Pharm. 2006. - P. 28-40.

65. Berdel W.E. and Munder P.G. Antineoplastic actions of ether lipids related to platelet-activating factor. Platelet-activating factor and related lipid mediators // Plenum Publishing Corporation. 1987. - P. 449-467.

66. Barbara L. Herwaldt. Miltefosine — The Long-Awaited Therapy for Visceral Leishmaniasis. // Biochemistry. 1999. - V. 341. - P. 1840-1842.

67. Croft, S. L., Neal, R. A., Thornton, E. A. Antileishmanial activity of the ether phospholipid ilmofosine. // Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. -1993. -V. 87. P. 217-219.

68. Maslov M.A., Morozova N.G. and Serebrennikova G.A. Convenient synthesis of cationic glycerolipids via methylthiomethyl ethers. // Mendeleev Commun.-2000. № 2. - P. 65.

69. Константинова И.Д., Зайцева H.M., Ушакова И.П., Серебренникова Г.А. Синтез катионных липидов алкильного типа с коротко цепными заместителями при атоме С(2) глицеринового скелета. // Изв. АН, Сер. хим. 1994. - №. 10. - С. 1826.

70. Gajate С., Mollinedo F. Biological activities, mechanisms of action and biomedical prospect of the antitumor ether phospholipid ET-18-OCH3 (edelfosine), a proapoptotic agent in tumor cells. // Curr. Drug Metab 2002,— V. 3. - P. 491-525.

71. Jendrossek V., Handrick. R. Membrane targeted anticancer drugs: potent inducers of apoptosis and putative radiosensitisers. // Curr. Med. Chem. Anti-Canc. Agents. 2003. - V. 3. - P. 343-353.

72. Wang K.S., Monden M., Kanai Т., Gotoh M., Umeshita K., Ukei T. and Mori T. Protective effect of platelet-activating factor antagonist on ischemia-induced liver injury in rats. // Surgery. 1993. - V. 113. - №. 1. - P. 76.

73. Arthur G., Bitmann R. The inhibition of cell signaling pathways by antitumor ether lipids. // Biochim. Biophys. Acta. 1998. -V. 390. - P. 85-102.

74. Godfroid J.J., Heymans F. Chemistry of PAF antagonists. // Biochem. Pharmacol. -1988.-V. 22.-P. 25

75. Berdel W.E. and Munder P.G. Antineoplastic actions of ether lipids related to platelet-activating factor. // Platelet-activating factor and related lipid mediators. 1987. - P. 449-467.

76. Nieto-Miguel Т., Gajate C., Mollinedo F. Differential targets and subcellular localization of antitumor alkyl-lysophospholipid in leukemic versus solid tumor cells. // J. Biol. Chem. -2006.-V. 281.-P. 14833-14840.

77. Gajate C., Mollinedo F. The antitumor ether lipid ET-18-OCH(3) induces apoptosis through translocation and capping of Fas/CD95 into membrane rafts in human leukemic cells. // Blood. 2001. -V. 98. - P. 3860-3863.

78. Gajate C., Mollinedo F. Edelfosine and perifosine induce selective apoptosis in multiple myeloma by recruitment of death receptors and downstream signaling molecules into lipid rafts. // Blood. 2007. - V. 109. - P. 711-719.

79. Anatoly N. Pinchuk, Mark A. Rampy, Marc A. Longino, Scott Skinner. Synthesis and Structure-Activity Relationship Effects on the Tumor Avidity of Radioiodinated Phospholipid Ether Analogues. // Med. Chem. -2006. -V. 49. P. 2155-2165.

80. Meyer K. L., Schwendner S. W. Counsell R.E. Potential tumor or organ imaging agents. Radioiodinated phospholipid ethers. //J. Med. Chem. 1989. V. 32. - P. 2142-2147.

81. Counsell R.E., Schwendner S.W., Meyer K. L., Haradahira T. Tumor visualization with a radioiodinated phospholipids ether. // J. Nucl. Med. 1990. -V. 31. - P. 332-336.

82. Plotzke K. P., Fisher, S. J., Wahl, R. L„ Olken, N. M„ Skinner, R.W., Gross, M. D„ Counsell R. E. Selective localization of a radioiodinated phospholipid ether analog in human tumor xenografts. // J. Nucl. Med. 1993. - V.34. - P. 787-792.

83. Plotzke К. P., Haradahira Т., Stancato L, Olken N. M., Skinner R. W. Gross, M. D„ Wahl, R.L.; Counsell, R.E. Selective localization of radioiodinated alkylphosphocholine derivatives in tumors. // Nucl. Med. Biol. -1992. V. 19. - P. 765-773.

84. Rampy M. A., Chou T. S., Pinchuk A. N., Skinner R. W. S., Gross M. D., Fisher S., Wahl R. L., Counsell R. E. Synthesis and biological evaluation of radioiodinated phospholipid ether analogs. // Nucl. Med. Biol. 1995. - V. 22. - P. 505-512.

85. Eibl H., Hilgard P., Unger C. A comparison of hemolytic activity, serum binding and tissue distribution. // In Progress in Experimental Tumor Research. 1992. - V. 34. - P. 131-142.

86. Kotting J., Berger M. R., Unger C., Eibl H. Alkylphosphocholines:lnfluence of structural variation and biodistribution at antineoplasticallyactive concentrations. // Cancer Chemother. Pharmacol. 1992. -V. 30. - P. 105-112.

87. Романова С.Г., Штиль А.А., Серебренникова Г.А. Синтез новых бесфосфорных аналогов эдельфозина и их цитотоксичность. // Биоорган. Химия. 2008. - Т. 34. -№6. - С. 827-830.

88. Романова С.Г. Заявка на патент:получение бесфосфорного алкильного глицеролипида, содержащего флуоресцентную метку в полярном домене. От 24.10.08. №054578. - регистрационный номер 2008142023.

89. Wagner, В. A.; Buettner, G. R.; Oberley, L. W.; Burns, С. P. Sensitivity of K-562 and HL60 cells to edelfosin, an ether lipid drug, correlates with production of active oxygen species. // Cancer Res. 1998. - V. 58. - P. 2809-2816.

90. Mossman T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation. // J. Immunol. Methods. 1983. -V. 89. - P. 271-277.

91. Справочник (под ред. А.Д.Третьякова). Оценка мутагенного действия препаратов. В кн.: Ветеринарные препараты. Москва, ВО Агропромиздат. - 1988. - С. 258271.

92. Белицкий Г.А., Фонштейн Л.М., Худолей В.В. Совол как индуктор микросомальных ферментов, активирующих проканцерогены. // Экспериментальная онкология. -1987.-Т. 9. №3. - С.20-22.

93. Фонштейн Л.М., Абелев С.К., Бобринев Е.В. Методы первичного выявления генетической активности с помощью бактериальных тест-систем m (методичекие указания) 1983.

94. Pinchuk, A. N.; Mitsner, В. I.; Shvets, V. I. l-O-Benzyl-2-O-methylrac-glycerol: a key intermediate for synthesis of ether glycerolipids. // Chem. Phys. Lipids. 1991. - V. 59. - P. 263-265.

95. Rampy M. A., Pinchuk A. N„ Weichert J. P., Skinner R. W. S„ Fisher S. J., Wahl R. L., Gross M. D., Counsell R. E. Synthesis and biological evaluation of radioiodinated phospholipid ether stereoisomers. // J. Med. Chem. 1995. -V. 38. - P. 3156-3162.