Моно- и бисфосфорзамещенные 3,5-бис((гетеро)арилиден)пиперидин-4-оны

Леонова, Евгения Сергеевна

Моно- и бисфосфорзамещенные 3,5-бис((гетеро)арилиден)пиперидин-4-оны тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

Леонова, Евгения Сергеевна АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ

2012 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.03 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Моно- и бисфосфорзамещенные 3,5-бис((гетеро)арилиден)пиперидин-4-оны»

Автореферат диссертации на тему "Моно- и бисфосфорзамещенные 3,5-бис((гетеро)арилиден)пиперидин-4-оны"

УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ИНСТИТУТ ЭЛЕМЕ11ТООРГАИИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ им. А.Н. НЕСМЕЯНОВА РАН

Моно- и бнсфосфорзамещенные 3,5-бис((гетеро)арнлиден)п1И1ерндин-4-оны: синтез, строение, противоопухолевые свойства

02.00.03 - Органическая химия 02.00.08 - Химия злемеитооргшшческих соединений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации па соискание ученой степени кандидата химических наук

Па правах рукописи

ЛЕОНОВА ЕВГЕНИЯ СЕРГЕЕВНА

12 янв тг

Москва-2012

005007207

Работа выполнена в лаборатории Тиофосфорорганических соединений Учреждения Российской академии наук Института элементоорганических соединений им. А. Н.

доктор химических наук Одинец Прима Лсоновна кандидат химических наук Макаров Михаил Викторович Член-корреспондент ПАИ Украины, доктор химических наук, профессор Гололобов Юрнй Григорьевич (ИНЭОС РАН)

доктор химических наук, профессор Вацадзе Сергей Зурабовнч (МГУ им. М. В. Ломоносова)

Санкт-Петербургский Государственный университет растительных полимеров

Защита состоится феярам 2012 года в Ю00 часов на заседании диссертационного совета Д 002.250.01 при Учреждении Российской академии наук Институте элементоорганических соединений им. А. Н. Несмеянова РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, 28.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИНЭОС РАН.

Автореферат диссертации разослан_—_2011 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 002.250.01 кандидат химических наук

Несмеянова РАН (ИНЭОС РАН). Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Ларина Т.А.

Общая хараетернстика работы

Актуальность проблемы. Разработка эффективных способов модификации биологически активных соединений с целью повышения их биодоступности, терапевтического индекса и направленности действия является основой развития методов биомедицинской органической химии.

К числу выигрышных модифицирующих функциональных групп относятся

остатки фосфорных (фосфоновых) кислот различного строения. Подобная

функционализация используется для создания так называемых пролекарств,

высвобождающих активное действующее вещество в клетке под действием воды

или ферментов. Действительно, первые представители монофосфорзамещенных 3,5-

бис(арилиден)пиперидин-4-онов, содержащие фосфорильную или ш-

фосфорилалкильную группу, связанную с пиперидоновым атомом азота,

полученные в нашей лаборатории (Одинец и др., 2005; М.В. Макаров и др. 2009),

проявили более высокие противоопухолевые свойства и биодоступность по

сравнению с нефосфорилированными аналогами. В развитие этих исследований с

целью создания более эффективных противоопухолевых препаратов и изучения

зависимости «структура-биологическая активность» разработка подходов к синтезу

соответствующих фосфорилированных производных, содержащих

гетероароматические боковые группы, а также конъюгатов 3,5-

бис((гетеро)арилиден)пиперидин-4-онов с биологически активными

метиленбифосфонатами и фосфонокарбоксилатами, представляет несомненный интерес как с теоретической, так и с практической точки зрения.

Цель работы. Разработка методов получения биодоступных фосфорорсодержащих 3,5-бис((гетеро)арилиден)пиперидин-4-онов, в том числе производных метиленбифосфонатов и фосфонокарбоксилатов, с заданной структурой для установления зависимости «структура - противоопухолевые свойства» и выявления перспективных противоопухолевых препаратов.

Научная новизна и практическая ценность. Разработан эффективный метод синтеза 3,5-бис((гетеро)арилиден)пиперидин-4-онов, основанный на альдольно-кротоновой конденсации NH- и Л'-алкилзамещенных пиперидин-4-онов с (гетеро)ароматическими альдегидами в присутствии кислот Льюиса, где LiC104, MgBr2, BF3Et20 оказались оптимальными системами, и исследованы границы его применимости для синтеза фосфорзамещенных 3,5-

бис((гетеро)арилиден)пиперидин-4-онов. Разработаны методы синтеза монофосфорилированных 3,5-бис((гетеро)арилиден)пиперидин-4-онов, в которых атом фосфора связан с пиперидоновым атомом азота простой связью, алкиленовым или триазольным линкером, а также конъюгатов, содержащих остатки метиленбисфосфонатов и фосфонокарбоксилатов. При исследовании противоопухолевой активности полученных соединений in vitro большое число синтезированных соединений продемонстрировало цитотоксические свойства в микромолярном диапазоне в отношении опухолевых клеточных линий человека (включая лекарственно-резистентные опухоли), превосходящие или сопоставимые с активностью клинически используемых препаратов сарколизина и доксорубицина. Показано, что влияние природы арилиденового фрагмента в молекуле целевых соединений имеет общий характер - противоопухолевая активность возрастает с увеличением их электроноакцепторных свойств, причем активность фосфорзамещенных 3,5-бис((гетеро)арилиден)пиперидонов превышает

цитотоксические свойства их нефосфорилированных аналогов.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы докладывались на Научной конференции по биологически активным Соединениям (Новый свет, Украина, 2009), Международной Конференции по химии азотсодержащих гетероциклов (Харьков, Украина, 2009), 18-ой Международной конференции по химии фосфора (Вроцлав, Польша, 2010), Международном конгрессе по органической химии, посвященном 150-летию открытия A.M. Бутлеровым теории строения органических соединений (Казань, Россия, 2011).

Публикации. Основное содержание работы изложено в 5 статьях в

рекомендованных ВАК журналах и 4 тезисах докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы (279 ссылок). Материал диссертации изложен на 167 страницах и включает 8 таблиц, 36 (литературный обзор) и 15 (обсуждение результатов) схем, а также 22 рисунка.

Диссертационное исследование выполнено при финансовой поддержке Программы Отделения химии и наук о материалах РАН «Биомолекулярная и медицинская химия» (программа ОХМН-9).

Автор выражает глубокую признательность П. В. Петровскому и О. И. Артюшину за регистрацию ЯМР спектров, сотрудникам лаборатории центра РСИ ИНЭОС РАН В.Н. Хрусталеву, И.С. Бушмаринову, а также А. Фонари (Highlands University, New Mexico, США) за проведение рентгеноструктурных исследований, 3. С. Клеменковой за регистрацию колебательных спектров соединений, Н. Э. Шепелю за регистрацию УФ спектров и исследование люминесцентных свойств, сотрудникам лаборатории Микроанализа ИНЭОС РАН, а также Е.Ю. Рыбалкиной (Институт канцерогенеза Российского онкологического научного центра им. H.H. Блохина РАМН) за исследование противоопухолевой активности полученных соединений.

Основное содержание работы

Известные методы модификации структуры 3,5-бис(арилиден)пиперидин-4-онов для улучшения транспорта через клеточную мембрану, повышения водорастворимости и цитотоксичности включают варьирование электронных, стерических и гидрофобных свойств заместителей в арильных кольцах или алкилирование и ацилирование атома азота гетероцикла. Как было впервые установлено в нашей лаборатории, введение в молекулу данного фармакофора фосфорсодержащих остатков оказалось более эффективным для достижения этих целей. Настоящая работа является логическим продолжением этих исследований, существенно расширяющим типы фосфорсодержащих производных данного класса.

Для систематического изучения зависимости «структура-биологическая

активность» в качестве объектов исследования нами выбраны

монофосфорилированные 3,5-бис((гетеро)арилиден)пиперидин-4-оны, где атом

фосфора связан с азотом фармакофора либо непосредственно, либо через

алкиленовый линкер разной длины, включая 1,2,3-триазолилметиленовый. Кроме

того, поскольку введение второго атома фосфора или карбоксилатного фрагмента

могло оказать существенное влияние как на уровень, так и на спектр биологической

активности, представляло интерес осуществить синтез коньюгатов 3,5-бис((гетеро)арилиден)пиперидин-4-онового фармакофора с биологически активными метиленбисфосфонатами и фосфонокарбоксилатами.

Общий синтетический подход для синтеза кросс-сопряженных диенов основан на альдольно-кротоновой конденсации (гетеро)ароматических альдегидов с алканонами или пиперидин-4-онами, обычно протекающей под действием сильных оснований (ЫаОН/ЕЮН) или протонных кислот (НС1газ/АсОН). К сожалению, подобные условия являются малопригодными, если исходные субстраты несут кислотно- или основно-лабильные группы, такие как СЫ, Р(0)(СЖ)2, СОСЖ или некоторые гетероциклические остатки (например, фуранил). С целью создания эффективного способа получения 3,5-бис((гетеро)арилиден)пиперидин-4-онов, несущих кислотно- или основно-лабильные группы, мы оценили возможность применения кислот и оснований Льюиса в указанной альдольно-кротоновой конденсации производных пиперидин-4-онов.

На примере модельной реакции Д'-метилпиперидин-4-она 1 с 4-фторбензальдегидом, выбор которого определялся возможностью мониторинга реакции методом ЯМР |9Р, было установлено, что такие кислые катализаторы как НгБО^Юг и УЬ(ОТ!)з проявляют низкую активность, а основные: фосфониевая ионная жидкость и третичные фосфины, не катализируют данный процесс (Таблица 1). Сопоставимую каталитическую способность проявили три каталитические системы: иСКУТМБМЕЬ, Г^Вгг^О/МеОН/Е^ и ВР3-Е120, которые обеспечили высокий выход целевого продукта по данным спектров ЯМР [9¥. Учитывая, что в процессе конденсации образуется две молекулы воды, в реакции в случае ВРзЕ^О последний необходимо использовать в количестве более 2 эквивалентов (оптимально 4 эквивалента). В присутствии ВЕз^О реакция протекает гладко в СН2С12 и МеСМ, тогда как ТГФ ее ингибирует. Применение МеСЫ обеспечивает

Не1 = арил, гетероарил;(^р) = Р(0)Я'К2; Х= СОСЖ; Р(0)Я'Я:

1. Эффективный метод синтеза 3,5-бис((гетеро)арилиден)пиперидин-4-онов в присутствии кислот Льюиса

самое короткое время реакции и облегчает выделение целевого продукта в виде плохо растворимой тетрафторборатной соли. Реакция может быть проведена без растворителя в присутствии избытка ВРз-Е120 (9 эквивалентов), и в этом случае продукт был выделен с максимальным выходом.

Таблица 1. Влияние природы катализатора на конденсацию Л'-метилпиперидин-4-она 1 с л-Р-беизальдсгидом.

А А V+ рХТн 2°°с> р^ 1 * N 1

1 2а

Опыт Каталитическая система Растворитель Время, ч Выход, %а

1 Н2804/8Ю2 (6 экв.)" - 4 5(12)

2 Н28 04/8Ю2(6 экв.)ь - 58 55

3 УЬ(ОТ1)3 (20 моль%) - 4 10(22)

4 УЬ(О"10з (20 моль%) - 14 15(34)

5 MgBг2■Et20 (1 экв.)/МеОН/ Е13К (2 экв.) - 4 37(63)

6 \^Вг2-Е120 (1 экв.)/МеОН/ РЛ_,Ы (2 экв.) - 14 86(97)

7 УС104(1 экв.)/ТМ8ЫЕЪ(2 экв.) - 4 60(91)

8 ВРз-Е^О (9 экв.) ВРзЕ120 4 77е

9 ВРз-ЕШ (4 экв.) ТГФ 48 13е

10 ВРз-ЕШ (4 экв.) СН2С12 48 51е

11 ВР3 ЕШ (4 экв.) СНзСЫ 48 66е

12 ВРз-ЕЬО"^ экв.) СНзСК 4 38(56)с

13 ВРз-Е120"(4 экв.) СНзСЫ 9 67е

14 (С6Н13)з(С14Н29)Р+СГ(20 моль%) СН2С12 24 0

15 РЬ3Р (20 моль%) СНзСИ 24 0

16 п-Ви3Р (20 моль%) СНзСЫ 24 0

а В скобках выход по данным ЯМР ^Р спектроскопии. ь Относительно Лг-метилпиперидин-4-она 1 с Продукт выделен в виде НВР4 соли. " 80°С.

В то же время, системы на основе М§Вг2 и 1лСЮ4 оказались малоэффективными в случае ЛУ/-пиперидин-4-она 3, используемого в качестве коммерчески доступного гидрохлорида моногидрата (Схема 1). В этом случае выходы целевого продукта 5а после выделения составили 8% и 13% соответственно. При использовании эфирата трехфтористого бора (4 экв.) в комбинации с К2СО3 в ацетонитриле при комнатной температуре выход 5а повышается до 34% (75% по

данным ЯМР |9Р), а в присутствии избытка ВР3'Е120 (6 экв.) в том же растворителе, но в отсутствие поташа, 3,5-бис(4-фторбензилиден)пиперидин-4-он был выделен с выходом 84% (95% по данным ЯМР |9Р) в виде тетрафторборатной соли. Отметим, что применение ВР3-Е120 позволяет проводить аналогичную конденсацию с 1,4-диокса-8-азаспиро[4.5]деканом, т.е. пиперидин-4-оном с оксалановой защитой 4, которая необходима для предотвращения побочных реакций по кето-группе при последующем фосфорилировании. В этом случае образование кратных связей сопровождается удалением кетальной защитной группы, обычное удаление которой в кислых условиях часто сопровождается трансформацией лабильных групп.

4-р-С6Н4-С(0)Н

^ 20°С; ВР3Е120 р

3 5а 4

Схема 1

Оптимизированные методы синтеза в присутствии указанных кислот Льюиса были использованы для конденсации Л'-метил- и А7/-пиперидин-4-она 1,3 с другими (гетеро)ароматическими альдегидами (Схема 2), приводя к целевым соединениям 5Ь-Г,Ь-ш, с выходами, существенно превышающими описанные в литературе для ранее известных соединений 2а,с,е,Г,Ь, 5а-(1,с,г Исключение составляют реакции пиперидонов 1 и 3 с пиридин-2-карбальдегидом: выход Д'-метил-3,5-бис(пиридин-2-илметилиден)пиперидин-4-она 2g не превышал 15%, а попытка получить ЫН-3,5-бис(пиридин-2-илметилиден)пиперидин-4-он не увенчалась успехом. Реакции приводили к смеси продуктов, где 1,2-ди(пиридин-2-ил)этан-1,2-дион - продукт самоконденсации исходного альдегида, был выделен в качестве основного. О О

О, к-та Льюиса

}-Н

N Аг N

I I

X X

, , 2а^; 5а-1', Ь-гп

' 50-91% 80-96%

X = Ме (1,2), Н (3,5)

Аг = 4-Р-С6Н44(а); 4-02Ы-С6Н4 (Ь); 4-Ме2Ы-С6Н4 (с); 4-ЫС-С6Н4 ((1) 2-Т11 (е); З-Ру Ш; 2-Ру (В); 4-Ру (Ь); 4-МеО-С6Н4 №, С6Н5 0); 4-Е12Ы-С6Н4(к); 3,5-0Ви)2-4-НО-С6Н2 (1); 2-02К-С6Н4 (т).

Схема 2

Нами показано, что при применении кислот Льюиса кислотно-лабильные функции в исходных реагентах не затрагиваются. Так, при конденсации 4-CN-C6H4CHO с 1 и 3, где в стандартных условиях (НС1газ/АсОН) циапогруппа гидролизуется до карбамоильной, в присутствии BFj-EtiO она не затрагивается.

Отметим, что альдольно-кротоновая конденсация, проводимая в присутствии BF3-Et20, приводит к образованию конечных продуктов в виде моно- или трис- (в случае производных с дополнительным основным атомом азота в (гетеро)ароматическом кольце) тетрафторборатных солей 4-оксопиперидиния. Поскольку образование тетрафторборатного аниона происходит в результате ступенчатого гидролиза BF3, в ряде случаев были выделены соли, содержащие, наряду с тетрафторборатным, гексафтор-(ц-гидрокси)диборатный анион, строение которого было подтверждено данными рентгеноструктурного анализа монокристаллов. Полученные соли легко могут быть переведены в соответствующие свободные основания обработкой водным раствором соды. Выделенные таким образом М/-3,5-бис((гетеро)арилиден)пиперидин-4-оны 5a-e,f,li-ш были использованы в качестве субстратов для последующего фосфорилирования.

Таким образом, альдольно-кротоновая конденсация в присутствии кислот Льюиса, таких как MgBr2, L¡C104 и DF3-Et20, представляет собой эффективный метод получения jV-алкил- и Л7/-3,5-бис((гетеро)арилиден)пиперидин-4-онов, включая соединения, содержащие кислотно- или основно-лабильные группы; при этом наиболее эффективно применение эфирата трехфтористого бора.

2. ТУ-Фосфорзамещенные 3,5-бис(гетероарнлиден)ш1перндин-4-оны

С целью систематического исследования влияния природы гетероароматического фрагмента на противоопухолевые свойства фосфорилированных 3,5-бис(гетероарилиден)пиперидин-4-онов, нами впервые был осуществлен синтез фосфорсодержащих производных с тиофеновыми и пиридиновыми заместителями, которые сильно различаются по своим электронным свойствам.

Для синтеза соединений, в которых атом фосфора непосредственно связан с пиперидоновым атомом азота, нами было использовано фосфорилирование соответствующих А7/-3,5-бис(2-тиенилиден)- и Л7/-3,5-бис(пиридилметилен)-пиперидин-4-онов 5e,f,h хлорангидридами кислот пятивалентного фосфора в присутствии триэтиламина в качестве основания и ТГФ как растворителя при комнатной температуре (Схема 3). Выходы целевых соединений ба-с, 7а-с, полученных в данных условиях, составляли 57-66% в случае тиофензамещенных

производных и 43-62% для производных пиридина. В качестве побочного продукта в данной реакции образуются соответствующие пирофосфаты или пирофосфонаты И'112Р(0)0Р(0)11'112, сигналы которых в соответствующих областях были

зафиксированы в спектрах ЯМР 3|Р реакционных смесей.

д 0

н {у

сЛ2

ба-с (57-66%)

5с,Г,11 7а-с (51-60%)

6: Не! = 2-ТЬ

8а-с (12-62%) Я'Д^ (ОЕ1)2(а), (ОРЬ)2(Ь), Ме(ОРЬ)(с);

7: Не! = З-Ру; Я.1,Я2 = (ОЕ02(а), Ме(ОЕ0(Ь), Ме(ОРЬ)(с);

8: Не! = 4-Ру; П'Д2 = (ОЕ02(а), Ме(ОЕ!)(Ь), Ме(ОРЬ)(с).

Схема 3

Для получения соединений, в которых диеноновый фармакофор связан с

атомом фосфора алкиленовым линкером, использована альдольно-кротоновая

конденсация гетероароматических альдегидов с со-аминофосфонатами 9а-с1, 10а,Ь на

основе О-защищенного и незащищенного пиперидин-4-она с числом метиленовых

звеньев в линкере от 1 до 4. Методы синтеза таких соединений, отличающиеся в

зависимости от числа метиленовых групп, разработаны ранее в нашей лаборатории

и основаны на реакции Кабачника-Филдса (п=1), аза-Михаэля (п=2) и АГ-

алкилирования в условиях межфазного катализа (п>3).

О ГЛ

О. Х>

6 б

N "ы'

(СН2)„Р(О)(ОЕ02 (СН2)пР(0)(ОЕ!)2

9я-с1 10а, Ь

п = 1(а), 2(Ь), 3(с), 4((1).

Учитывая, что ш-аминофосфонаты претерпевают гидролиз сложноэфирных

групп у атома фосфора в присутствии как кислот, так и оснований Бренстеда, для их

конденсации с гетероароматическими альдегидами можно было бы использовать

М£Вг2, Ь1С1С>4 или ВРз-Е^О, т.е. кислоты Льюиса, хорошо зарекомендовавшие себя

при синтезе нефосфорилированных 3,5-бис(гетероарилиден)пиперидин-4-онов.

Возможность применения таких условий первоначально мы оценили на примере

модельной реакции р-аминофосфонатов 9Ь, 10Ь и 4-фторбензальдегида (Схема 4).

В случае реакции 9Ь применение 1лС104 и К^Вг2 приводит к соответствующему фосфорилированному продукту 11 с выходом около 30% полученному за 4 (1лС104) и 14 часов Увеличение времени реакции не

приводит к его повышению. Примерно с таким же выходом фосфонат 11 был получен при проведении реакции в присутствии ВРз^О (4 экв.) в ацетонитриле, тогда как при использовании избытка ВР3'Е120 (9 экв.) соединение было выделено с 64% выходом (86% по данным ЯМР 19Р, 31Р). В реакции 10Ь с п-фторбензальдегидом выход 11 составил 16% при проведении реакции в присутствии ВРз-Е^О в СН3СЫ и 56% (89% по данным ЯМР) при использовании избытка кислоты Льюиса. Несмотря на продолжительное время протекания реакции в присутствии ВРз^гО (в обоих случаях 96 часов), с точки зрения эффективности для получения фосфорилированных 3,5-бис(арилиден)пиперидин-4-онов такие условия можно считать оптимальными. Отметим, что все указанные реакции проводили при 20°С, поскольку повышение температуры приводит в большей степени к ускорению побочных процессов. В соответствии с данными ЯМР 31Р реакционных смесей, в таких условиях гидролиз эфирных групп при атоме фосфоре не наблюдался.

В то же время, конденсация а-аминофосфоната 10а с 2-тиофенкарбальдегидом в присутствии эфирата трехфтористого бора сопровождалась сильным осмолением реакционной смеси и целевой продукт 12а в таких условиях выделить не удалось. (Схема 5). По этой причине это соединение было получено в классических условиях (г.НС1/АсОН) с выходом 10%. Получение соответствующих р- и у-аминофосфонатов 12Ь,с с 3,5-бис(тиенилиден)пиперидин-4-оновой фармакофорной группой проводили в присутствии MgBr2. В этих условиях целевые соединения 12Ь,с были получены с выходами около 80% по данным ЯМР 31Р, однако в результате разложения соединений при хроматографической очистке на силикагеле выход индивидуальных продуктов 12Ь,с снизился до 46 и 10% соответственно.

В случае синтеза аналогичных соединений 13 с 3-пиридиновым фрагментом, альдольно-кротоновую конденсацию с соответствующими аминофосфонатами 10а, 9d проводили в присутствии избытка эфирата трехфтористого бора (Схема 5). В

(CH2)2P(0)(0Et)2 9b

(CH2)2P(0)(0Et)2 II

Схема 4

(CH2)2P(0)(0Et)2 10Ь

этом случае скорость реакции возрастала с увеличением числа метиленовых групп между атомами фосфора и азота в исходном со-аминофосфонате: 1 неделя для а-аминофосфоната 10а и 3 часа в случае 5-аминофосфоната 9& Целевые соединения 13а,Ь,с1 были получены в виде тетрафторборатных солей.

HetC(0)H Hcf^YT^Het HetC(0)H

гл

0 0

iwiuiiwiuiii ^N*^ ¡wiuu "N"

(CH2)„P(0)(OEt)2 (CHj)BP(0)(0Et)2 CH2P(0)(0Et)2

9b-d 12a-c,13a,b,d 10a

Het >Q (12)TQ (13); n = 1(a), 2(b), 3(c), 4(d) i> N

Условия реакций: / = BF3 Et20 (12a, 13a-c), ii = MgBr2 Et20/Et3N (12b,c), iii = пиперидин/АсОН/ЕЮН (13b)

Схема 5

При выделении свободных оснований 13а,b,d нейтрализацией тетрафторборатных солей водным раствором ИаНСОз в чистом виде удалось выделить только Лг-(3-фосфорилбутил)-3,5-бис(пиридилметилен)пиперидин-4-он 13d, тогда как продукты с более коротким линкером 13а,b выделить в чистом виде не удалось (чистота 85-90% по данным ЯМР 'Н). Соответствующее N-2-фосфорилэтильное производное 13Ь удалось получить с 28% выходом конденсацией (3-аминофосфоната 9Ь с 3-пиридинкарбальдегидом в слабо основных условиях (Схема 5).

Состав и строение полученных соединений подтверждены данными элементного анализа и методами Ж и ЯМР ('Н, 13С, 31Р) спектроскопии, а также рентгенодифракционным исследованием монокристаллов для соединений 6а,с, 7с, 12Ь и 13Ь. Все целевые продукты получены в виде соответствующих Е,Е-изомеров. По данным РСА геометрические параметры центрального фрагмента молекул 3,5-бис(гетероарилиден)пиперидин-4-онов 6а,с, 7с, 12Ь и 13Ь близки между собой, а основное различие заключается в геометрии атома азота и расположении фосфорильных групп (рис. 1,2). В аминоэтилфосфонатах 12b, 13Ь атомы азота имеют тригонально-пирамидальную конфигурацию и фосфорильная группа занимает стерически выгодное экваториальное положение. В молекулах соединений 6а,с где атом фосфора непосредственно связан с атомом азота, последний является почти плоским (сумма углов 359.7(7)и 359.0(0) соответственно), а фосфорильная группа занимает стерически невыгодное псевдо-аксиальное положение. Пиперидоновый

цикл в указанных соединениях как с тиофеновыми, так и с 3-пиридиновыми боковыми кольцами имеет конформацию конверт с отклонением атома азота от плоскости центрального фрагмента на 0.619/0.626Â (6а), 0.592 Â(6c) и 0.710 Л(12Ь) и 0.701 Â(7c) и 0.639 Â(13b) соответственно.

Рнс.1. Строение метил(фенокси)-[3£,5Е-4-оксо-3,5-бис(гетероаршшлиден)пиперидин-1-ил]фосфонатов и с тиофеновыми (6с, слева) и 3-пиридиновыми (7с, справа) кольцами

соответственно.

Рнс.2. Строение диэтил{2-[(ЗЕ,5Е)-4-оксо-3,5-бис(гетероарилидеи)пиперидин-1-

ил]}этилфосфонатов и с тиофеновыми (12Ь, слева) и 3-пиридиновыми (13Ь, справа) кольцами соответственно.

Учитывая известную способность 3,5-бис(гетероарилиден)пиперидин-4-онов к фотохимической Z.-E-изомеризации, а также данные, касающиеся различия в биологической активности изомеров родственных циклоалканонов, на примере 5£,5£-0,0-диэтил{2-[-4-оксо-3,5-бис(2-тиенилметилен)-1-пиперидинил]}-этилфосфоната 12Ь и его нефосфорилированного аналога - 1-метил-3,5-бис(2-тиенилметилен)пиперидин-4-она 2е, нами изучены фотохимические превращения под действием белого света (Hg лампа, 175 Вт). Исследования проведены в различных растворителях, таких как ДМСО-бб, CDCb и CD3CN (Схема 6). В ДМСО

даже после облучения в течение 6 часов никаких трансформаций не наблюдалось, в CD3CN изомеризация, сопровождающаяся фотодеградацией, протекала также очень медленно (выход ¿^-изомера около 5% для М/е-производного 2е и 20% для фосфорсодержащего производного 12Ь после облучения в течение 12 часов). С наиболее высокой скоростью фотохимическая изомеризация протекала в CDCI3, где выход второго изомера составил 45% для Ш/е-производного 2е и 25% для фосфорсодержащего производного 12Ь. Согласно данным 'Н и |3С-ЯМР спектров второй изомер, выделенный в случае соединения 2е в индивидуальном состоянии методом препаративной ТСХ, представляет собой Z.E-форму, о чем свидетельствует удвоение количества соответствующих сигналов вследствие несимметричности структуры.

сгсУг)-^

Е,Е2е,ПЪ Z,£2e,12b

R = Me (2с), (CH2)2P(0)(0Et)2 (12b) Схема 6

Таким образом, нами впервые осуществлен синтез фосфорзамещенных производных 3,5-бис(гетероарилиден)пиперидин-4-онов с боковыми тиофеновыми и пиридиновыми фрагментами, в которых атом фосфора связан непосредственно с пиперидоновым атомом азота или через алкиленовый линкер разной длины.

3. Мопофосфорсодержащие 3,5-бис((гетеро)арилидеи)пиперидин-4-оны с

триазольным линкером

Реакция 1,3-диполярного циклоприсоединения алкин-азид по Хьюсгену, региоселективно протекающая при катализе солями меди® с образованием 1,4-дизамещенного 1,2,3-триазольного цикла (так называемая click- или CuAAC-реакция), представляет собой удобный метод связывания различных биологически активных фрагментов в целевой молекуле по типу «ключ-замок». Подобным образом были получены конъюгаты противораковых лекарственных средств и молекул, обеспечивающих их направленную доставку, ингибиторы цистеинпротеазы пептидного строения, лиганды адренергических рецепторов с повышенной биодоступностью и др. Соответственно подобная методология была нами использована для получения коныогатов 3,5-бис((гетеро)арилиден)пиперидин-

4-она и аминофосфонатов, атомы фосфора и азота в которых связаны триазольным линкером

Для получения целевых соединений можно было использовать два альтернативных подхода А и В, отличающихся последовательностью стадий. Первый из них, А, включает алкилирование М/-пиперидона пропаргилбромидом с последующим 1,3-циклоприсоединением к полученному терминальному алкину фосфорилированного азида и альдольно-кротоновой конденсацией на заключительном этапе. Во втором случае, метод В, пропаргильную группу вводят в сформированный 3,5-бис((гетеро)арилиден)пиперидин-4-оновый фрагмент с последующим циклоприсоединением фосфорилированного азида (Схема 7).

На примере синтеза соответствующего иора-нитропроизводного 17а (неоптимизированные условия) было показано, что синтез //-пропаргил-пиперидона 14 и последующее циклоприсоединение азида протекают с хорошими выходами 60% и 69% соответственно. Однако, ключевая альдольно-кротоновая конденсация осложняется побочными реакциями, и общий выход продукта 17а по трем стадиям составляет лишь около 16%. В то же время проведение циклоприсоединения на последнем этапе синтеза позволяет поднять выход до 37%. Поэтому для получения целевых 3,5-бис((гетеро)арилиден)пиперидин-4-онов с триазольным линкером был использован второй подход.

И'

Си504 5Н20/Аскор6ат натрия; I Ви0Н/Н20

(ЕЮ)2Р(0)(СН2)4Ы,

2. aq.Ыa2COз

1. 4-02Ы-С6Н4С(0)Н ВИзЕ^О

14 (60%)

(ЕЮ)2(0)Р(СН2)4-Ы

15 (69%)

02Ы

N02

(ЕюшаУгЯч«^ т

ы'

(Й0)2Р(0)(СН2)4Ы3 Си1/МеОН

16а (75%)

Схема 7

При оптимизации метода В было показано, что наиболее эффективно алкшшрование Л7/-3,5-бис(арилиден)пиперидин-4-онов пропаргилбромидом

протекает в условиях МФК в ДМСО в присутствии избытка карбоната калия в качестве основания и ТЭБАХ в качестве катализатора межфазного переноса (оптимизированные условия, Схема 8). Выходы пропаргилзамещенных производных 16а-}, выделенных в индивидуальном состоянии, составляют 64-99%.

О О

ЦчГ к2со3/дмсо

5а-Г,1 16 а^ (64-99%)

Аг = 4-0:Ы-С6Н4(а), 4-ЫС-С6Н4СЫ(Ь), 4-МеО-С6Н4(с), 4-Р-С6Н4((1), 4-Ме2Ы-С6Н4(е), ТЬ(0, 3-Ру())

Схема 8

Оценка эффективности различных медных катализаторов в последующей реакции 1,3-диполярного циклоприсоединения 3,5-бис(арилиден)-1-(проп-2-ин-1-ил)пиперидин-4-онов 16Ь с со-азидоалкилфосфонатом показала, что при прочих равных условиях выход, близкий к количественному (по данным ЯМР 31Р), достигается при генерировании Си(1) из двухвалентного предшественника в диметилформамиде в качестве растворителя (Схема 9).

Схема 9

Опыт Катализатор Растворитель ч. Выход*, %

1 Си804-511гО/Аскорбат натрия дмфа/н2о 72 98

2 Си1 МеОН 72 80

3 СиВг сн2сь 72 53

4 Си1/ДИПЭА ТГФ 72 50

♦-данные согласно ЯМР

Такая оптимизированная методика была использована для получения соединений 17а-с, 18а-е с различными заместителями в арильном кольце и различным числом метиленовых звеньев между атомом фосфора и 1,2,316

триазольным кольцом (Схема 10). Отметим, что соедииения 17а-с, 18а-е за счет присутствия в молекуле фосфорильной группы и триазолыюго азота легко образуют стабильные комплексы с неорганическими солями (СаС12, ЫаС1, КаБО^, т.е. применения осушителей и высаливателей следует избегать при выделении индивидуальных соединений.

О О

Лг^г^Ч^Аг (ЕЮ);Р(0)(СН2)„Ы] ЛГ-^/Ч^АГ

СиЭОУАскорбат натрия „

N N

(ЕЮ12(0)Р(СН2)/ 16а-е

17а-е, 27-53% 18а-с, 51-53%

17: п = 4, Аг = 4-02Ы-С6Н4(а), 4-ЫС-С6Н4(Ь),4-МеО-С6Н4(с),

4-Р-С6Н4(с1), 4-Ме2Ы-С6Н4(е) 18: п = 3, Аг = 4-02К-С6Н4(а), 4-МС'-С6Н4(Ь), 4-Р-С6Н4(с)

Схема 10

Состав и строение полученных соединений 17а-с и 18а-е подтверждены данными мультиядерной ЯМР (*Н, 3|Р, 13С, 19Р) и ИК спектроскопии и данными элементного анализа. В частности, в спектрах ЯМР 31Р триазолов наблюдаются синглетные сигналы в области 30-31.5 м.д., сигналы протонов и атомов углерода в спектрах 'Н и 13С подтверждают образование 1,4-дизамещенного 1.2,3-триазола при £,£-конфигурации двойных связей в 3,5-бис(арилиден)пиперидин-4-оновом фрагменте.

Таким образом нами разработан метод синтеза конъюгатов оз-аминофосфонатов с 3,5-бис((гетеро)арилиден)пиперидин-4-оновой фармакофорной группой, основанный на Си(1)-катализируемом 1,3-диполярном циклоприсоединении алкин-азид.

4. Коньюгаты метиленбпсфосфонатов и фосфонокарбоксилатов с 3,5-б11с(ар11Лиден)п11перид1Ш-4-оновым фармакофором

Являясь ближайшими структурными аналогами природных пирофосфатов, метиленбисфосфонаты обладают высоким сродством к гидроксиапатитам костной ткани и способны эффективно ингибировать их резорбцию за счет селективного ингибирования активности остеокластов, т.е. ответственных за этот процесс клеток. Некоторые соединения этого ряда используются в клинической практике для

лечения злокачественной гиперкальцемии, а также заболеваний, связанных с изменениями костной ткани, таких как болезнь Педжета, остеопороз и метастазы при раке различной этиологии. Бисфосфонаты, содержащие в со-положении к атомам фосфора атом азота, включенный в гетероциклическое кольцо (как например в резидронате и золедронате), т.е. препараты третьего поколения, обладают в 10000 более высокой активностью по сравнению с не содержащими атома азота лекарственными средствами первого поколения. Замена в фармакологических препаратах одной фосфонатной группы на карбоксилатную приводит к соединениям, которые специфически ингибируют резорбцию костей in vitro и in vivo, не оказывая цитотоксического действия на остеокласты. Таким образом, представлялось актуальным разработать метод получения конъюгатов метиленбисфосфонатов и фосфонокарбоксилатов с фармакофорным 3,5-бис(арилиден)пиперидин-4-оновым фрагментом как с целью повышения биодоступности исходного фармакофора, так и придания направленного действия на клетки-мишени за счет наличия метиленбисфосфонатного (или фосфонокарбоксилатного) целенаправляющего фрагмента, например, при метастатических поражениях костной ткани при раковых заболеваниях. Кроме того, комбинация двух таких фармакофорных фрагментов могла привести к появлению новых неожиданных биологических свойств.

Для введения бисфосфонатного и фосфонокарбоксилатного остатков в 3,5-

бис(арилиден)пиперидин-4-оновый фрагмент 5b-f,i,l,m мы использовали реакцию

аза-Михаэля - присоединение М/-3,5-бис(арилиден)пиперидин-4-онов в качестве N-

нуклеофилов к тетраэтил(винилиденбисфосфонату) или соответствующему

винилиденфосфонокарбоксилату в качестве винилфосфорильной компоненты

(Схема 11). Реакцию проводили в сухом дихлорметане, используя триэтиламин в

качестве основания. В результате реакции целевые соединения 19a-f и 20a-h были

получены с выходами 57-78% и 77-99% соответственно. С более низким выходом

(32%) в результате двух переосаждений был выделен диметиламинозамещенный

бисфосфонат 20d. Отметим, что время протекания реакции определяется природой

боковых ароматических заместителей в М/-бис(арилиден)пиперидин-4-онах, Так,

при контроле хода реакции методом ЯМР 3|Р спектроскопии было установлено, что

в случае донорных заместителей (Ar = 4-МеО-СсН4; 4-Me2N-C6H4) реакция проходит

за 20-30 минут, тогда как для образования продукта с акцепторными заместителями

(Аг = 4-N02-C6H4; 4-NC-CsH4) требовалось от 8 до 24 часов. Такое различие в

реакционной способности, по-видимому, объясняется как разницей в

нуклеофильности используемых реагентов, так и их растворимостью в

дихлорметане, где в случае плохо растворимых я-нитро- и л-циано-производных 5Ь,с1 реакция протекает в гетерогенной системе, в которой скорость реакции контролируется физико-химическими законами процессов, протекающих на границе раздела фаз.

О ,х О О

л 1 . Н2С=С ^ и л Х-Р(0)(0Е1)2 И

Лг^У^Лг Р(ОХОй)2 Аг/УУ^Аг1.Ме)йВЯС1! Аг-^Ч^Г^Лг

Е1зЫ/СН2С12 2. йодн.МеОН

Н (ЕЮ)2(0)Ру^ (Н0)2(0)Р^

X Р(0)(0Н)2

5Ь-Г,1,1,т 20а-Ь ?32-99%) 21а-с (91-100%)

X = СООЕ1 (19); Р(О)(ОЕ02 (20)

Аг = 4-Ы02-С6Н4(а); 4-ЫС-С6Н4(Ь); 4-МеО-С6Н4(с); 4-ЫМе2-С6Н4(с1);

3,5"(1Ви)2-4-ОН-С6Н2(е); 2-ЫОгС6Н4(Г); ТВД; Ру(Ь) Схема 11

За исключением тиофенового производного которое претерпевает

деструкцию при длительном хранении и легко изомеризуется и разлагается в растворе хлороформа, соединения 19а-Г, 20а-ГЬ стабильны при длительном хранении и не претерпевают ретро-реакции Михаэля или изомеризации в растворах, по крайней мере, в течение недели. Состав и строение конъюгатов 19а-Г и 20а-Н подтверждены данными мультиядерной ЯМР ('Н, 31Р, 13С) и ИК спектроскопии и данными элементного анализа, а также рентгеноструктурным исследованием монокристаллов ряда соединений. Так, в спектрах ЯМР 3,Р соединений обоих типов наблюдаются синглетные сигналы в области 20.6-22.2 м.д. (СОС1з), тогда как сигналы свободных кислот 21а-с смещены в более сильное поле (15.3-17.2 м.д., (ДМСО-с/б))- Такое положение сигналов является характерным для данного окружения у атома фосфора. Спектры ЯМР 'Н и |3С хорошо согласуются с описываемыми структурами. Сигналы альфа-метинового протона проявляются в виде триплета триплетов в области 2.34-2.70 м.д. в спектрах бисфосфонатов 20а-Ь, тогда как в спектрах родственных фосфонокарбоксилатов 19а-Г они в большинстве случаев частично перекрываются сигналами протонов соседнего метиленового звена с неэквивалентными протонами (в области 3.03-3.31 м.д.) и наблюдаются в виде неразрешенного мультиплета. Сигналы соответствующих атомов углерода наблюдаются в виде триплета в области 36 м.д. и дублета в области 45 м.д. для метиленбисфосфонатов 20а-Ь и фосфонокарбокислатов 19а-Г соответственно, с

константой спин-спинового взаимодействия '/рс 130-131 Гц для обоих типов соединений. Сигналы в областях спектров 'Н и 13С, соответствующих ароматическим и винильным протонам и соответствующим им атомам углерода отражают несомненное существование соединений в растворе в виде соответствующих Е,Е - изомеров.

По данным ЯМР !Н, 13С спектроскопии и рентгенодифракционного анализа монокристаллов (соединения 19е, 20аДе), бисфосфонаты и родственные фосфонокарбоксилаты имеют ¿'.¿-конфигурацию двойных связей (рис.3). В целом, основные геометрические параметры исследованных соединений близки между собой. Во всех молекулах, центральный пиперидоновый цикл находится в конформации кресла с отклонением атома азота от плоскости с пятью другими атомами на 0.604- 0.777 А, при этом атом азота имеет тригонально-пирамидальную конфигурацию (сумма углов между связями колеблется в диапазоне 331-333°).

Рис. 3. Строение тетраэтил[2-{(ЗЕ,5Е)-4-оксо-3,5-бис(3,5-ди(трет-бутил)-4-гидроксибензилиден)пиперид-1-ил}этилиден]бисфосфоната 19е (слева) и его фосфонокарбоксилатного аналога 20е (справа)

Полученные бисфосфонаты могут быть легко переведены в соответствующие свободные бисфосфоновые кислоты реакцией с триметилбромсиланом в хлороформе с дальнейшим гидролизом промежуточного триметилсилилового эфира водным МеОН (Схема 12), как проиллюстрировано на примере соединений 21а-с. В то же время получить свободные кислоты для производных фосфонокарбоксилатов нам не удалось, поскольку соединения легко претерпевают расщепление N-C и Р-С связей как при обработке триметилбромсиланом, так и щелочью в спирте, обычно используемой для селективного гидролиза карбалкоксильных фрагментов.

Ранее в совместных исследованиях нашей лаборатории и Highlands University (США) было показано, что 3,5-бис(арилиден)пиперидин-4-оны с донорными заместителями в арильных кольцах обладают флуоресцентными свойствами. Принимая во внимание интерес к флуоресцентным аналогам бисфосфонатов для

выяснения распределения препаратов в костях скелета и других тканях организма, а также визуализации их работы на клеточном уровне, нами проведено исследование этих свойств для полученных функционализированных метиленбисфосфонатов. В УФ спектрах бисфосфонатов 20а-е,Ь (растворы в ацетонитриле) наблюдалось два максимума поглощения: один, расположенный ниже 300 нм, и второй, более интенсивный, смещенный в длинноволновую область на 85-169 нм. Положение обоих пиков коррелирует с электронными свойствами гетероароматических фрагментов - они сдвигаются в коротковолновую область с возрастанием электроноакцепторных свойств этих групп. Для получения флуоресцентных спектров соединения 20а-е,Ь возбуждали при длине волны, близкой к максимуму длинноволнового пика в спектрах поглощения. Установлено, что в ряду исследованных соединений флуоресцентными свойствами обладает только бисфосфонат 20Ь, содержащий донорные диметиламино-группы: Ясх=430 нм, >.ет=583 нм, квантовый выход флуоресценции ф = 2.0% (относительно кумарина). Подобная тенденция - отсутствие флуоресцентных свойств для соединений, содержащих электроноакцепторные заместители в ароматических кольцах и проявляющих наиболее высокую, так называемую «темновую», цитотоксичность, является типичной для производных бис(арилиден)пиперидин-4-онов в целом.

5. Цитотоксические свойства полученных соединений

Оценка цитотоксических свойств синтезированных фосфорзамещенных производных £,£-3,5-бис(арилиден)пиперидин-4-онов проведена на ряде опухолевых клеточных линий человека: БсоуЗ и СаоуЗ (рак яичников), А549 (рак легкого), РСЗ (рак предстательной железы), КВ 3-1 (рак эпидермиса ротовой полости), а также КВ 8-5 (лекарственно-резистентный субклон линии КВ). В целом, активность всех протестированных соединений была значительно выше, чем мелфалана (1С50 50-60 рМ), использованного, по аналогии с литературными данными для нефосфорсодержащих аналогов, в качестве положительного контроля.

Как и ожидалось, установлено, что среди соединений каждого типа более высокие противоопухолевые свойства характерны для производных с электроноакцепторными (гетеро)ароматическими фрагментами (Ру, 4-М02-СбН4, 4-С]Ч-СбН4) по сравнению с их аналогами, содержащими донорные 4-диметиламиногруппы или тиофеновые фрагменты, при этом значения ГС« составляют 1-2 рМ и <80 рМ соответственно. Введение фосфорильной функциональной группы приводит к существенному возрастанию цитотоксических свойств по сравнению с исходными МН- и Д'-алкилированными производными с

аналогичными боковыми (гетеро)ароматическими заместителями. В случае монофосфорилированных соединений наиболее значимое увеличение цитотоксичности наблюдается при непосредственном введении атома фосфора к атому азота гетероцикла (амидофосфаты и фосфонаты), тогда как при наличии дополнительного линкера между атомами фосфора и азота подобное различие для некоторых опухолевых линий менее выражено и зависит также от природы (гетеро)арильного фрагмента. Влияние природы фосфорсодержащего заместителя на цитотоксичность 3,5-бис((гетеро)арилиден)пиперидин-4-онов

проиллюстрировано на примере соответствующего производного с 3-пиридиновыми боковыми кольцами (рис.4), где самая низкая активность выявлена для пиперидин-1-ил-этилфосфоната 13(1.

Следует отметить результаты исследований по противоопухолевым свойствам в отношении обычного и лекарственно-устойчивого клонов опухолевой линии КВ, где последний отличается экспрессией транспортного-трансмембранного протеина Р£р 170, ответственного за выведение гидрофобных соединений, включая цитостатики, из раковых клеток. Учитывая сопоставимые значения (в статистически значимых пределах) ГС50 для соединений 7а,с,8с можно полагать, что такие соединения не являются субстратами для Р§р170 и таким образом, могут представлять интерес для лечения резистентных типов рака.

Рис.4. Влияние природы фосфорного фрагмента на цитотоксичность 3,5-бис(3-пиридилметилен)-пиперидин-4-онов 2£, 7а-с, 13Ь,с1, 20Ь.

СаоЧ'З А549 КВ 3-1 КВ 8-5 клеточные линии

О Н(5Г)

□ Ме(2Г)

□ Р(0)(ЕЮ)2(7а)

□ Р(0)(ЕЮ)Ме(7Ь)

□ Р(0)(РЬ0)Ме(7с)

□ (СН2)2Р(0)(0Е1)2(13Ь) Я (СН2)4Р(О)(ОЕ02(13с))

□ СН2СН[Р(0)(С>ЕЦ2]2(2011)

□ Мелфалан

Конъюгаты бисфосфонатов с £,£-3,5-бис(арилиден)пиперидин-4-онами при

прочих равных условиях более активны (1С50 0.5-15 дМ), чем монофосфорилированные производные. Исключением является бисфосфонат 20е, не проявивший цитотоксических свойств. Влияние природы гетероароматических колец на цитотоксичность соединений 20а-с1,11 показано на рис.5.

Рис.5. Влияние природы (гетеро)арильного заместителя на цитотоксичность тетраэтил{2-[(ЗЕ,5Е)-4-оксо-3,5-бис(2-арилиден)пиперидин-1 -ил]этан-1,1-

диил}бисфосфонатов 20а-11,1)

АГ

^Аг

□ 4-Ше2-С6Н4(20с1)

□ 4-ОМе-С6Н4(20с)

□ 4-М02-С6Н4(20а)

□ 4-СЫ-С6Н4(20Ь) О 3-Ру(20И)

СаоУЗ А 549 РСЗ КВЗ-1 клеточные линии

Р(0)(0Е1)2

Для клеточной линии КВЗ-1 противораковая активность протестированных соединений в данных исследованиях была сопоставима или даже выше, чем у доксирубицина. По аналогии с другими известными 3,5-бис(арилиден)пиперидин-4-онами, бисфосфонаты, несущие электроноакцепторные боковые заместители в бис(арилиденовом) фрагменте, т.е. соединения 20а,Ь,Ь показали более высокую противораковую активность, с величиной 1С50, находящейся в ряду 0.5-4 цМ, по сравнению с соединениями, содержащими электроннодонорные группы в арильных кольцах. Тем не менее высокую противоопухолевую активность, превышающую таковую для мелфалана, продемонстрировали даже производные с донорными заместителями (МегН МеО) в ароматических кольцах.

Таким образом, проведенное исследование полностью подтвердило обоснованность концепции повышения противоопухолевой активности соединений ряда 3,5-бис((гетеро)арилиден)пиперидин-4-онов за счет введения фосфорсодержащего заместителя. Для наиболее активных соединений с остатками метиленбисфосфонатов, включая диметиламинозамещенное производное, обладающее флуоресцентными свойствами, целесообразно проведение углубленных биологических испытаний.

Основные результаты и выводы

1. Разработаны методы получения и выявлены зависимости «структура-активность» четырех новых типов фосфорзамещенных 3,5-

бис((гетеро)арилиден)пиперидин-4-онов, обладающих цитотоксическими и флуоресцентными свойствами.

2. На основе альдольно-кротоновой конденсации NH- и А'-алкилзамещенных пиперидин-4-онов с (гетеро)ароматическими альдегидами в присутствии кислот Льюиса, таких как LiC104, MgBr2, BF3'Et20, разработан эффективный метод синтеза 3,5-бис((гетеро)арилиден)пиперидин-4-онов, в том числе содержащих кислотно- и основно-лабильные группы, и исследованы границы его применимости для синтеза фосфорзамещенных 3,5-бис((гетеро)арилиден)пиперидин-4-онов.

3. Разработаны методы синтеза монофосфорилированных 3,5-бис(гетероарилиден)пиперидонов, в которых атом фосфора связан с пиперидоновым атомом азота простой связью, алкиленовым или 1,2,3-триазолилалкиленовым линкером. Методы основаны на прямом фосфорилировании NH-3,5-бис((гетеро)арилиден)пиперидин-4-онов, конденсации со-аминофосфонатов на основе пиперид-4-она с (гетеро)ароматическими альдегидами и Cu(I)-катализируемой реакции 1,3-диполярного циклоприсоединения алкил-азид с участием ю-азидоалкилфосфонатов.

4. Предложен высокоэффективный и легко масштабируемый способ получения с целенаправляющими в костную ткань остатками метиленбисфосфонатов и фосфонокарбоксилатов, основанный на реакции Михаэля этилиденбисфосфоната или этилиденфосфонокарбоксилата с NH-3,5-бис((гетеро)арилиден)пиперидин-4-онами в качестве N-нуклеофила.

5. При исследовании противоопухолевой активности полученных соединений in vitro установлено, что большинство синтезированных соединений обладает высокой цитотоксичностью в отношении ряда опухолевых клеточных линий человека (включая лекарственно-резистентные) со значениями IC50 в микромолярном диапазоне, превосходящие или сопоставимые с активностью клинически используемых препаратов сарколизина и доксорубицина.

6. Показано, что влияние природы арилиденового фрагмента на цитотоксические свойства 3,5-бис((гетеро)арилиден)пиперидин-4-онов имеет общий характер: активность возрастает с увеличением электроноакцепторных свойств (гетеро)арильных фрагментов, причем активность фосфорзамещенных пиперидонов существенно превышает цитотоксические свойства их нефосфоршшрованных аналогов.

7. На основании проведенного исследования выявлены в качестве наиболее перспективных соединений для углубленного исследования биологической

активности конъюгаты 3,5-бис((гетеро)арилиден)пиперидин-4-онов с метиленбисфосфонатами (фосфонокарбоксилатами), обладающие комбинацией противоопухолевых и антирезорптивных свойств.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях: Статьи в рецензируемых журналах:

1) M.V. Makarov, E.S. Leonova, E.Yu. Rybalkina, P. Tongwa, V.N. Khrustalev, T.V. Timofeeva, I.L. Odinet, "Synthesis, characterization and structure-activity relationship of novel N-phosphorylated £,£-3,5-bis(thienylidene)piperid-4-ones" Eur. J. Med. Chem., 45, 2010, 9921000.

2) E.S. Leonova, M.V. Makarov, E.Yu. Rybalkina, Sh.L. Nayani, P. Tongwa, A. Fonari, T.V. Timofeeva, I.L. Odinets, "Structure-cytotoxicity relationship in a series of N-phosphorus substituted £,£-3,5-bis(3-pyridinylmethylene)- and £,£-3,5-bis(4-pyridinylmethylene)piperid-4-ones" Eur. J. Med. Chem., 45, 2010, 5926-5934.

3) E. Leonova, M. Makarov, Z. Klemenkova, I. Odinets, "Lewis Acids as Mild and Effective Catalysts for the Synthesis of 3,5-Bis[(hetero)arylidene]piperidin-4-ones" Helv. Chim. Acta, 93, 2010, 1990.

4) M.V. Makarov, E.S. Leonova, E.Yu. Rybalkina, G.-V. Roschenthaler, Т. V. Timofeeva, I. L. Odinets., "Synthetic Approaches to Cytotoxic Amidophosphates, Aminophosphonates, and Aminobisphosphonates with 3,5-Bis(arylidene)piperid-4-one" Phosphorus, Sulfur, and Silicon, 186, 2011,908-917.

5) A. Fonari, E. S. Leonova, M. V. Makarov, I. S. Bushmarinov, I. L. Odinets, M. Fonari, M. Yu. Antipin, T. V.Timofeeva, "Experimental and theoretical structural study of (3£,5£j-3,5-bis-(benzylidene)-4-oxopiperidinium mono- and (3£,5£)-3,5-bis-(4-N,N-

dialkylammonio)benzylidene)-4-oxopiperidinium trications", J. Mol. Struct., 2011, 1001, 1-3, 6877.

Тезисы докладов

6) M.B. Макаров, Е.С. Леонова, ЕЛО. Рыбалкина, Т.В. Тимофеева, И.Л. Одинец. Новые флуоресцентные цитостатики ряда фосфорсодержащих 3,5-бис(арилиден)-4-пиперидонов (M.V. Makarov, E.S. Leonova, E.Yu. Rybalkina, T.V. Timofeeva, I.L. Odinets. Novel fluorescent cytostatics of phosphorus-containing 3,5-bis(arylidene)-4-piperidone series). «Биологически активные вещества. Фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения. 25-30 мая 2009, Новый Свет, АР Крым, Украина, Сборник тезисов докладов, с.121.

7) E.S. Leonova, M.V.Makarov, T.V. Timofeeva, I.L.Odinets. Application of Lewis acids in the synthesis of 3,5-bis[(hetero)arylidene]-4-piperidones. V International Conference 'Chemistry of nitrogen-containing heterocycles', CHCN-2009, 5-9 October, Kharkov, Ukraine. Book of abstracts. P-93.

8) M.V. Makarov, E.S. Leonova, E.Yu. Rybalkina, T.V. Timofeeva, I.L. Odinets. Investigation of synthetic routes to antitumor and fluorecent amidophosphates, aminophosphonates and aminobisphosphonates with 3,5-bis(aiylidene)pirerid-4-one framework. 18th International Conference on Phosphorus Chemistry. July 11-15, 2010, Wroclaw, Poland. Book of Abstracts, p.51.

9) I.L. Odinets, M.V. Makarov, E.S. Leonova, A.E. Shipov, E.Yu. Rybalkina, T.V. Timofeeva. Phosphorylation of dienone pharmacophore for targeted design of highly effective and fluorescent cytostatics. International Congress on Organic Chemistry dedicated to the 150-th anniversary of the Butlerov's Theory of Chemical Structure of Organic Compounds. September 18-23, 2011, Kazan, Russia. Book of Abstracts, p.412.

Подписано в печать:

22.12.2011

Заказ № 6435 Тираж - 120 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работы диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Леонова, Евгения Сергеевна, Москва

61 12-2/252

УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ИНСТИТУТ ЭЛЕМЕНТООРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ ИМЕНИ А.Н. НЕСМЕЯНОВА

Леонова Евгения Сергеевна

MOHO- И БИСФОСФОРЗАМЕЩЕННЫЕ 3,5-БИС((ГЕТЕРО)АРИЛИДЕН)ПИПЕРИДИН-4-ОНЫ: СИНТЕЗ, СТРОЕНИЕ, ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ СВОЙСТВА

02.00.03-Химия органических соединений 02.00.08- Химия элементоорганических соединений

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2012

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 3

I. Модификация биологически активных соединений фосфорорганическими остатками: синтетические подходы и влияние 7 на биоактивность (ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР)

1.1 Фосфорорганические пролекарства 8

1.2 Модификация лекарственных средств негидролизуемыми фосфорорганическими остатками

II. Моно- и бисфосфорзамещенные 3,5-бис((гетеро)арилиден)пиперидин-4-оны: синтез, строение, 46 противоопухолевые свойства (ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ)

II. 1 Эффективный метод синтеза 3,5-бис(гетероарилиден)-пиперидин-4-онов в присутствии кислот Льюиса

11.2 TV-Фосфорзамещенные 3,5-бис(гетероарилиден)пиперидин-4-оны

11.3 Монофосфорсодержащие 3,5-бис((гетеро)арилиден)-пиперидин-4-оны с триазольным линкером

11.4 Коньюгаты метиленбисфосфонатов и фосфонокарбоксилатов с 3,5-бис(арилиден)пиперидин-4-оновым фармакофором

11.5 Цитотоксические свойства полученных соединений qq

49 58 70 80

III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 98

III.1 Эффективный метод синтеза 3,5- 101

бис((гетеро)арилиден)пиперидин-4-онов в присутствии кислот Льюиса

111.2.1 jV-Фосфорзамещенные 3,5-бис(гетероарилиден)- 109 пиперидин-4-оны

111.2.2 Фотохимические превращения в ряду 3,5-бис((гетеро)- 118 арилиден)пиперидин-4-онов

111.3 Монофосфорсодержащие 3,5-бис((гетеро)арилиден)- 118 пиперидин-4-оны с триазольным линкером

111.4 Коньюгаты метиленбисфосфонатов и 128 фосфонокарбоксилатов с 3,5-бис(арилиден)пиперидин-4-оновым фармакофором

ВЫВОДЫ 137

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 13 9

ВВЕДЕНИЕ

К числу перспективных противоопухолевых соединений относятся Е,Е-3,5-бис(арилиден)пиперидин-4-оны, цитотоксичность которых обусловлена наличием сопряженной диеноновой системы (фармакофорным фрагментом), тогда как группы (обычно алкильные или ацильные), связанные с гетероциклическим атомом азота, могут либо усиливать, либо ингибировать активность за счет взаимодействия с клеточными компонентами и дополнительными сайтами связывания. Предполагаемый механизм действия таких соединений включает их взаимодействие с биогенными тиолами, а азотсодержащие нуклеофилы, такие как протеины и нуклеиновые кислоты, не обладают либо обладают лишь незначительной аффинностью к таким соединениям [1]. На этом основании 3,5-бис(арилиден)пиперидин-4-оны рассматриваются в качестве перспективных противоопухолевых агентов, не проявляющих мутагенных свойств и, кроме того, в соответствии с литературными данными, они обладают низкой общей токсичностью. Помимо противоопухолевых свойств производные 3,5-бис(арилиден)пиперидин-4-онов обладают антиоксидантными [2], антимикобактериальными [3], а-глюкозидаза-ингибирующими [4], а также флуоресцентными [5-7] свойствами и потенциалом в качестве двухфотонных сенсибилизаторов [8]. Сочетание противоопухолевых свойств и способности к флуоресценции открывает не только перспективу применения таких соединений в классической химиотерапии, но и в качестве фотосенсибилизируемых лекарственных средств для фотодинамической терапии поверхностных новообразований. Основным недостатком 3,5-бис(арилиден)пиперидин-4-онов, препятствующим переходу к расширенным клиническим испытаниям, является их низкая растворимость в водных средах, что затрудняет как введение подобных лекарственных средств пациентам, так и их транспорт к органам-мишеням.

К числу выигрышных модифицирующих функциональных групп относятся остатки фосфорных (фосфоновых) кислот различного строения. Многочисленные фосфорорганические соединения обладают собственной биологической активностью [9], способны придавать растворимость и био доступность органическим соединениям, или улучшать их транспорт через клеточные мембраны. Подобная функционализация используется для создания так называемых пролекарств, высвобождающих активное действующее вещество в

клетке под действием воды или ферментов.

Общеизвестно, что как природные, так и синтетические аминофосфоновые кислоты, являющиеся аналогами аминокислот и конкурирующие с ними за активные центры ферментов и клеточных рецепторов, проявляют разнообразную биологическую активность, тип которой определяется как длиной линкера, так и окружением у атома азота и фосфора [10-13]. Фосфорсодержащие 3,5-бис(арилиден)пиперидин-4-оны, в которых атом фосфора связан с пиперидоновым атомом азота алкиленовым линкером, можно рассматривать как аминофосфонаты с пиперидиноновым фрагментом и, соответственно, для них можно было ожидать проявление, помимо антинеопластических свойств, и других типов биологической активности.

Действительно, первые представители монофосфорзамещенных 3,5-бис(арилиден)пиперидин-4-онов, содержащие фосфорильную или со-фосфорилалкильную группу, связанные с пиперидоновым атомом азота, которые были получены в нашей лаборатории [6, 14], проявили более высокие противоопухолевые свойства и биодоступность по сравнению с нефосфорилированными аналогами.

В качестве логического продолжения этих исследований с целью создания более эффективных фосфорсодержащих противоопухолевых препаратов 3,5-бис((гетеро)арилиден)пиперидин-4-онового ряда, изучения зависимости «структура-биологическая активность» и выявления перспективных противоопухолевых препаратов настоящая диссертационная работа посвящена разработке подходов к синтезу соответствующих монофосфорилированных производных, содержащих гетероароматические боковые группы, а также конъюгатов 3,5-бис((гетеро)арилиден)пиперидин-4-онов с биологически активными метиленбифосфонатами и фосфонокарбоксилатами.

В результате проведенного систематического исследования в соответствии с поставленной задачей нами разработан эффективный общий метод синтеза 3,5-бис((гетеро)арилиден)пиперидин-4-онов, основанный на альдольно-кротоновой конденсации ИН- и А^-алкилзамещенных пиперидин-4-онов с (гетеро)ароматическими альдегидами в присутствии кислот Льюиса, где 1ЛСЮ4, М§Вг2, ВРз Е^О оказались оптимальными системами, и исследованы границы его применимости для синтеза фосфорзамещенных 3,5-

метил енбисфосфонатов и фосфонокарбоксилатов. При исследовании противоопухолевой активности полученных соединений in vitro большое число синтезированных соединений продемонстрировало цитотоксические свойства в микромолярном диапазоне в отношении опухолевых клеточных линий человека (включая лекарственно-резистентные опухоли), превосходящие или сопоставимые с активностью клинически используемых препаратов мелфалана (сарколизина) и доксорубицина. Показано, что влияние природы арилиденового фрагмента в молекуле целевых соединений имеет общий характер - противоопухолевая активность возрастает с увеличением их электроноакцепторных свойств, причем активность фосфорзамещенных 3,5-бис((гетеро)арилиден)пиперидонов превышает цитотоксические свойства их нефосфорилированных аналогов. Таким образом проведенная работа представляет интерес как с теоретической, так и с практической точки зрения.

Результаты диссертационной работы неоднократно докладывались на различных международных конференциях: Научной конференции по биологически активным Соединениям (Новый свет, Украина, 2009), Международной Конференции по химии азотсодержащих гетероциклов (Харьков, Украина, 2009), 18-ой Международной конференции по химии фосфора (Вроцлав, Польша, 2010), Международном конгрессе по органической химии, посвященном 150-летию открытия A.M. Бутлеровым теории строения органических соединений (Казань, Россия, 2011).

Диссертация, построенная по классической схеме, состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы

В первой главе - литературном обзоре, систематизированы литературные данные, касающиеся методов модификации фосфорсодержащими остатками различных лекарственных препаратов и биологически активных веществ и влияния этого остатка на биологическую активность соединений.

Вторая глава посвящена обсуждению экспериментального материала, связанного с разработкой эффективных методов получения NH- 3,5-бис((гетеро)арилиден)пиперидин-4-онов, использованных в качестве субстратов для последующего введения фосфорсодержащего фрагмента, и их /V-алкильных аналогов, монофосфорилированных 3,5-бис(гетероарилиден)пиперидин-4-онов с боковыми тиофеновыми и пиридиновыми кольцами, в которых атом фосфора связан с пиперидоновым атомом азота простой связью и алкиленовым линкером, а также 3,5-бис((гетеро)арилиден)пиперидин-4-онов, в которых фосфорсодержащий фрагмент связан с пиперидиновым атомом азота посредством триазольного

линкера, и конъюгатов 3,5-бис((гетеро)арилиден)пиперидин-4-онов, содержащих остатки метиленбисфосфонатов и родственных фосфонокарбоксилатов. В заключительном разделе этой главы описываются результаты исследования противоопухолевых свойств полученных соединений.

В третьей главе изложена экспериментальная часть работы.

Настоящая работа выполнена при финансовой поддержке Программы Отделения химии и наук о материалах РАН «Биомолекулярная и медицинская химия» (программа ОХМН-9).

Автор выражает глубокую признательность П. В. Петровскому и О. И. Артюшину за регистрацию ЯМР спектров, сотрудникам лаборатории центра РСИ ИНЭОС РАН В.Н. Хрусталеву, И.С. Бушмаринову, а также А. Фонари (Highlands University, New Mexico, США) за проведение рентгеноструктурных исследований, 3. С. Клеменковой за регистрацию колебательных спектров соединений, Н. Э. Шепелю за регистрацию УФ спектров и исследование люминесцентных свойств соединений, сотрудникам лаборатории Микроанализа ИНЭОС РАН, а также Е.Ю. Рыбалкиной (Институт канцерогенеза Российского онкологического научного центра им. H.H. Блохина РАМН) за исследование противоопухолевой активности полученных соединений.

I. Модификация биологически активных соединений фосфорорганическими остатками: синтетические подходы и влияние на биоактивность

- (ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР) Несмотря на значительный прогресс в развитии медицины, генетики и биотехнологии, большинство процессов, происходящих в клетках живых организмов, остаются до конца не изученными. Одной из основных трудностей, с которой сталкиваются исследователи, является способность организма отторгать чужеродные субстраты. Обойти данную проблему частично удалось лишь после значительного скачка в познании биологически важных процессов - за счет использования объектов, максимально приближенных по своим свойствам и строению к реально существующим химическим составляющим клетки. Действительно, активность большинства препаратов, использующихся в настоящее время в клинической практике, основана на способности либо связываться по принципу «ключ-замок» с биологическими объектами, нарушая тем самым клеточный цикл и приводя к гибели клетки, либо имитировать химические составляющие клетки, где «имитаторы» (или миметики) используются организмом для построения клеточных структур и, обладая способностями, отличными от свойств природных компонентов, препятствуют его разрушению.

Разработка эффективных способов модификации биологически активных соединений с целью повышения их биодоступности, терапевтического индекса и направленности действия является основой развития методов биомедицинской органической химии. К числу выигрышных модифицирующих функциональных групп относятся различные остатки кислот фосфора, поскольку фосфорорганические производные являются одними из фундаментальных составляющих живых организмов. Они включены практически во все важнейшие биологические процессы, протекающие в клетке: участвуют в дыхании (НАДН, НАДФ), метаболизме (входят в состав большинства ферментов), хранении генетической информации (ДНК, РНК), являются источником энергии для организма (АТФ, АДФ), а также являются строительными материалами (входят в состав клеточных мембран, являются основой костной и нервной ткани). Более того, фосфорилирование является важнейшим процессом в организме, за счет которого осуществляется транспорт веществ в клетку, а также строительство белков и многие другие процессы [15].

Соответственно, многие фосфорорганические соединения обладают различными видами биологической активности, и в настоящее время в медицинской практике используется значительное число фосфорсодержащих лекарственных препаратов, например, таких как циклофосфамид, резидронат и его

аналоги, фотмустин, этидронат, ПАЛА, обладающих противовоспалительным, цитотоксическим и другими типами действия. Таким образом, введение фосфорорганического остатка в известный лекарственный препарат может не только повысить биодоступность и усилить имеющуюся у него активность, но и, в ряде случаев, привести к проявлению у конечных продуктов новых типов биологической активности. С этой точки зрения исследования в области получения модифицированных фосфорорганическими группами лекарственных средств -природных и синтетических соединений, являются актуальной задачей, привлекающей многочисленные группы исследователей. Для некоторых соединений число работ достаточно ограничено, тогда как для таких биологически активных субстратов как пептиды и нуклеозиды имеется многочисленное количество публикаций, в том числе обобщенных в обзорах различной направленности.

По этой причине в настоящем литературном обзоре, не претендуя на исчерпывающую полноту охвата работ в данной области, мы постарались представить наиболее интересные с нашей точки зрения данные, касающиеся методов введения фосфорных остатков в разнообразные молекулы как уже использующихся в клинической практике лекарственных средств, так и соединений, находящихся на различных стадиях биологических испытаний, и оценить эффект такого влияния модифицирующего фрагмента на биоактивность соединений - биомиметиков нуклеозидов, порфиринов, стероидов, пептидов и т.п.

Литературный обзор состоит из двух основных частей. Первая из них относится к фосфорсодержащим пролекарственным формам (так называемые пролекарства), где фосфорсодержащие остатки закреплены на фармакофорном фрагменте за счет легко гидролизуемых ферментативными системами организма Р-0 или Р-Ы связей (или Р-СН2-0 в случае фосфононуклеозидов), и в результате таких метаболических процессов высвобождается действующее вещество. Примеры введения в биоактивные молекулы остатков фосфоновых кислот за счет создания Р-С связи с субстратом представлены во второй части литературного обзора.

1.1 Фосфорорганические пролекарства

Использование пролекарств, т.е. химически модифицированных форм лекарственного средства, с целью усиления их биоактивности, улучшения направленности действия и снижения системной токсичности, когда ферменты переводят специфичные, обычно менее токсичные пролекарства в активные метаболиты непосредственно в организме, относится к активно развивающемуся в настоящее время направлению в фармацевтике. Такие препараты все шире

применяются для направленной доставки лекарств в необходимые органы, ткани и т.д. Известным примером пролекарств являются эфиры кислот, образованные за счет либо карбоксильной, либо гидроксильной группы молекулы лекарственного средства. Согласно многочисленным исследованиям ключевым моментом в переходе соединения через мембрану в клетку является его фосфорилирование под действием различных киназ. Процесс фосфорилирование-дефосфорилирование может быть управляемым, что активно используется в технологии создания пролекарств, а также для диагностики различных заболеваний и исследования механизмов многочисленных биологических процессов [16].

Иными словами, для действующих веществ, содержащих гидроксильную группу, в качестве пролекарств часто используют эфиры кислот фосфора, т.е. проводят так называемое предварительное фосфорилирование. Поскольку остаток свободной фосфорной кислоты не способен проходить ч�