Получение и структурное исследование липидных пленок Ленгмюра-Блоджетт тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.18 ВАК РФ

—

> в? §

Российская Академия наук / Институт кристаллографии им.А.В.Шубникова

Институт биоорганической химии им.М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова

На правах рукописи УДК 539.216

Орехова Людмила Лазаревна

Получение и структурное исследование липидных пленок Ленгмюра-Блоджетт

Специальность: 01.04.18 - кристаллография,

физика кристаллов

АВТОРЕФЕРАТ диссертации иа соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва - 1997

Работа выполнялась в Институте кристаллографии им.А.В.Шубникова РАН и Институте биоорганической химии им.М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН.

Научные руководители:

кандидат физико-математических наук В.В.Клечковская кандидат химических наук Л.И.Барсуков

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук Р.М.Имамов кандидат химических наук И.В.Мягков

Ведущая организация:

Московский государственный университет, химический факультет

Защита состоится "-/<Р" 1997г. в на заседании Ученого

Совета Д.002.58.01 при Институте кристаллографии РАН по адресу: Москва, 117333, Ленинский проспект, 59

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института кристаллографии РАН. Отзыв на реферат в 2-х экземплярах, заверенных печатью, просьба высылать по вышеуказанному адресу на имя ученого секретаря специализированного совета.

Автореферат разослан " МАЛ-_1997г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат физико-математических наук

В.М.Каневский

Характеристика работы

Актуальность. В последние годы большое число научных работ тосвящается изучению ориентированных мульгислойных пленок, получаемых методом Ленгмюра-Блоджетт (ЛБ), в связи с перспективностью их «пользования в научных исследованиях как моделей биологических мембран, I также потенциальными возможностями их практического применения в <ачестве элементной базы микроэлектронных устройств. Этот интерес в шачительной мере обусловлен тем, что метод Ленгмюра-Блоджетт позволяет i контролируемых условиях переносить мономолекулярные слои шфифильных соединений с поверхности водной фазы на твердые подложки, хавая возможность получать пленки требуемой толщины с заданной структурой и составом.

Среди многих органических соединений, потенциально пригодных для толучения ЛБ-пленок, значительный интерес представляют липиды, тоскольку лииидпые пленки могут найти применение для решения целого ряда <ак фундаментальных, так и прикладных проблем. В частности, в качестве шалогов природных мембранных структур липидные ЛБ-пленки дают зозможпость моделировать процессы самосборки мембран и взаимного /знавания их компонентов, выяснять факторы, определяющие характер кежмолекулярных взаимодействий в мембранах и изучать механизмы, ответственные за формирование в них молекулярных кластеров и чикродоменных структур. Большой интерес представляет и применение тапидных ЛБ-пленок в качестве матрицы для мембранотропных функционально-активных соединений (ионофоров, каналообразователей, зелковых систем электронного транспорта, светочувствительных комплексов и хр.) при их переносе на твердые подложки.

Необходимым условием научно-обоснованного применения лигшдных ЧБ-пленок в мембранных исследованиях и их использования в ^икроэлектронных нанотехнологиях является предварительное проведение

структурных исследований с целью выяснения взаимосвязи между структурой пленок и физико-химическими параметрами образующих их молекул.

Цель настоящей работы состояла в получении и структурном исследовании липидных ЛБ-пленок, построенных из основных компонентов биомембран - глицеролипидов, сфинголипидов и стеринов. Такие пленки позволяют достаточно хорошо моделировать структурную организацию биологических мембран и изучать взаимное влияние липидов на их упаковку и фазовое поведение в бислое.

Научная новизна и практическая ценность работы

В настоящий момент в литературе достаточно полно описаны исследования структуры ЛБ-пленок солей жирных кислот, которые дают наиболее простые и легко получаемые ориентированные пленки. Фосфолипидные пленки изучались, главным образом, на примере лишь одного фосфолипида - фосфатидилхолина, тогда как для большинства других мембранных липидов сведения о структуре ЛБ-пленок были фрагментарны. Данных о получении и исследовании ЛБ-пленок сфинголипидов до настоящей работы в литературе вообще не имелось. Также не были изучены и ЛБ-пленки стеринов - одних из важнейших представителей мембранных липидов. Практическая ценность настоящей работы состоит в значительном расширении круга липидов для приготовления ЛБ-пленок, воссоздающих липидные композиции нативных мембран. С этою целю нами были получены ЛБ-пленки глицеролипидов, сфинголипидов и стеринов и исследовано влияние химической природы липидных молекул на их организацию в ЛБ-лленках.

Среди многокомпонентных липидных ЛБ-пленок наибольший интерес вызывают смешанные пленки на основе композиции фосфолипид - стерины, поскольку эти липиды играют важную роль в структурной организации биологических мембран. Влияние стеринов на параметры фосфолипидных бислоев достаточно широко изучалось в слабо ориентированных пленках, нанесенных на подложку путем упаривания раствора липида в органическом растворителе. В связи с этим представляло интерес изучить взаимодействия

стеринов с фосфолипидами в составе строго ориентированных ЛБ-пленок и, в частности, исследовать фазовое поведение смешанных ЛБ-пленок из фосфатидилхолина и холестерина при различном соотношении липидных компонентов пленки.

Одним из перспективных направлений в ЛБ-технологии является получение полимерных пленок из соединений, которые могут полимеризоваться при воздействии внешних факторов. С целью расширения ассортимента таких пленок нами был исследован новый фосфолипид - 1,2-ди(9г,11Е-октадекадиеноил)-5п-глицеро-3-фосфохолин (DODPC), синтезированный в Государственной академии тонкой химической технологии (А.В.Аникин и сотр.), который по своему химическому строению близок к диолеоилфосфагидилхолину, широко применяемому в мембранных исследованиях. Было доказано протекание УФ-индуцированной полимеризации DODPC в монослоях и ЛБ-пленках, а также впервые исследована морфология монослоев мономерного и полимерного DODPC на гидрофобных подложках.

На основании собственных результатов и литературных данных был проведен детальный анализ взаимосвязи между химической структурой липидных молекул и характером их организации в ЛБ-пленках. Сравнительный анализ искажений кристаллической упаковки в ЛБ-пленках солей жирных кислот, фосфолипидов и стеринов . позволяет определить условия отбора липидных компонентов для приготовления ЛБ-нленок, предназначенных как для решения задач пленочной технологии, так и для построения систем, моделирующих структурную организацию биомембран.

Апробация работы. Основные положения работы и ее отдельные результаты докладывались на 3-й Международной конференции по рентгеновскому и нейтронному рассеянию на поверхности (Дубна, 1993, Россия), 1-й Международной конференции по физике низкоразмерных систем (Черноголовка, 1993, Россия), 2-й Международной конференции по интеллектуальным материалам (Вильямсбург, 1993, США), 15-м Симпозиуме

по молекулярной структуре (Остин, 1994, США), 3-м Международном конгрессе но биосенсорам (Новый Орлеан, 1994, США), 7-м Международном симпозиуме по недеструктивным методам анализа материалов (Прага, 1995^ Чехия), 6-й Европейской конференции по межфазному и поверхностному анализу (Монтре, 1995, Швейцария).

Публикации. Основные результаты диссертации отражены в 8 печатных работах.

Структура и объем, диссертации. Работа состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Объем диссертации - 150 страниц машинописного текста, включая 55 рисунков, 9 таблиц и 110 библиографических ссылок.

Основное содержание работы

Первая глава диссертации посвящена обзору литературных данных. Анализ опубликованных работ показывает, что число 'липидов, применяемых для получения пленок Ленгмюра-Блоджетт в настоящий момент невелико и ограничивается, в основном, жирными кислотами и их солями, а среди двухцепочечных липидов - фосфатидилхолином. Не изученными в настоящий момент остаются ЛБ-пленки стеринов - большой группы мембранных липидов. В то же время, получение ЛБ-пленок, близких по своему составу нативным мембранам, невозможно без использования этих липидов, поскольку взаимодействия стеринов с фосфолипидами играют важную роль в структурной организации биомембран.

На основании проведенного анализа литературы для получения и последующего структурного исследования липидных ЛБ-пленок нами были выбраны представители трех основных классов мембранных липидов -глицеролипидов, сфинголипидов и стеринов. Для изучения поведения полимеризуемых липидов в монослоях и ЛБ-пленках был выбран новый фосфолипид, 1,2-ди(92,11Е-октадекадиеноил)-зп-глицеро-3-фосфохолин,

содержащий способные к полимеризации группировки в середине углеводородных цепей.

Во второй главе описаны методы исследования липидных пленок, полученных в настоящей работе. Структурным исследованиям ориентированных ЛБ-пленок предшествовало изучение характеристик мономолекулярных слоев липидов на поверхности воды с помощью микропленочных весов. Для получения ЛБ-пленок липидные монослои переносились с поверхности воды на гидрофобные и гидрофильные подложки методами вертикального (Ленгмюра-Блоджетт) и горизонтального (Ленгмюра-Шеффер) переноса.

Высокая упорядоченность липидных молекул в ЛБ-пленках позволяет применить для изучения их структурной организации дифракционные методы. Основная часть структурной информации в проведенных исследованиях была получена методом дифракции электронов, который в данном случае более предпочтителен, чем другие методы дифракционного анализа, т.к. сильное взаимодействие электронов зондирующего луча с исследуемым веществом позволяет получать структурную информацию от тонких (толщиной в несколько монослоев) липидных пленок. Это особенно важно в тех случаях, когда наблюдается влияние подложки на структуру изучаемой пленки, а также тогда, когда структура пленки зависит от числа образующих ее слоев: Предпочтительность метода дифракции электронов для анализа структуры липидных ЛБ-пленок определяется также и малым временем измерений, что необходимо при исследовании органических пленок, структура которых может изменяться в процессе длительного облучения.

Регистрация интенсивности дифракционных картин осуществлялась с использованием автоматизированной системы регистрации сцинтилляционных импульсов в режиме пошагового сканирования, а также фоторегистрацией. Для проведения анализа распределения интенсивности дифракционной картины (ДК) был разработан специальный комплекс программ, предназначенный для обработки данных, полученных при помощи

автоматизированной системы регистрации, и позволяющий проводить прецизионный анализ формы дифракционных максимумов.

Морфология полученных липидных ЛБ-пленок изучалась методом атомной силовой микроскопии, позволяющим анализировать ультратонкие пленки, имеющие толщины вплоть до одного мономолекулярного слоя. Это особенно важно при исследовании пленок ненасыщенных липидов, недостаточная когезия которых не позволяет формировать мультислои и использовать дифракционные методы анализа. Данные атомной силовой микроскопии использовались нами также для сопоставления с результатами электронографического анализа, поскольку в условиях последнего, связанных с использованием высокого вакуума, могли произойти структурные перестройки липидных ЛБ-пленок, вызванные потерей связанной воды. Атомно-силовая микроскопия липидных ЛБ-пленок выполнялась в группе электронной микроскопии Института биоорганической химии РАН (В.В.Прохоров, Д.В.Клинов, И.В.Тузов).

ЛБ-пленки глицеролипидов и сфингалипидов

В третьей главе изложены результаты исследования ЛБ-пленок димиристоилфосфатидилхолина, дипальмитоилфосфатидилхолина,

дистеароилфосфатидилхолина и дипальмитоилфосфатидилэтаноламина, относящихся к классу глицеролипидов, и пленок сфинголипидов - церамида и сфингомиелина. Пленки наносились на коллодиевые подложки при поверхностном давлении монослоя ЗОмН/м при комнатной температуре. Как было опубликовано ранее в литературе, при этом давлении площадь, приходящаяся на одну молекулу в монослое и изменение этой площади при фазовых переходах липида совпадают с соответствующими значениями в бислойных системах, поэтому такое поверхностное давление наиболее предпочтительно при формировании ЛБ-пленок, моделирующих свойства биомембран.

Проведенный структурный анализ показал, что ЛБ-пленки глицеро- и сфинголипидов текстурированы, состоят из азимуталыю разориентированных кристаллических доменов, расположенных базисными плоскостями параллельно подложке.

Структурная организация всех исследованных пленок в плоскости подложки определяется упаковкой углеводородных цепей, которой соответствует двумерная гексагональная элементарная, ячейка с периодом равным 4.8А (рис.1). Такая упаковка, называемая ротационной фазой, имеет, по-видимому, универсальный характер и встречается в ламеллярных (слоистых) структурах многих липидов. Углеводородные цепи не имеют каких-либо специфических взаимодействий между собой и могут Рис.1 Гексагональная упаковка в ЛБ-поворачиватъея вокруг своей оси на пленках глицеро- и сфинголипидов несколько градусов.

Различия в химической природе полярных групп липидных молекул и в длине их углеводородных цепей не влияют на характер упаковки молекул в пленках Ленгмюра-Блоджстт. Позиционный порядок ( в упаковке углеводородных цепей сохраняется на расстояниях порядка 50-100А. Дегидратация образцов в условиях вакуума в процессе проведения электронографического анализа не меняет параметры упаковки молекул в плоскости подложки, однако может приводить, по-видимому, к изменению угла наклона углеводородных цепей.

ЛБ-пленки полимеризуемого фосфолипида, 1,2-дu(9Zl11E-oкmaдeкaдueнouл)-зп-глицеро-З-фосфохолина (ОООРС)

В данном разделе работы описаны исследования полимеризуемого фосфатидилхолина, 1ЭОВРС, имеющего сопряженные диеновые группировки

в середине углеводородных цепей. Полимеризация БОБРС в мономолекулярных слоях проводилась при комнатной температуре при помощи ртутной лампы низкого давления при различных поверхностных давлениях монослоя липида.

В результате воздействия УФ-света при разных поверхностных давлениях наблюдалось уменьшение площади монослоя ОСШРС. Абсолютная величина сокращения площади монослоя возрастала с ростом поверхностного давления; время, за которое происходило сжатие монослоя, коррелировало с поверхностным давлением и возрастало с его увеличением. Полученная информация свидетельствовала о протекании УФ-идуцированной полимеризации в монослоях ОСШРС. Времена реакции полимеризации в нашем случае хорошо согласуются с опубликованными ранее результатами, полученными при полимеризации в монослоях фосфатидилхолина, содержащего диеновые группировки вблизи сложноэфирных связей.

Для подтверждения УФ-индуцированной полимеризации БООРС и исключения возможности изменений монослоя за счет причин, не связанных с воздействием УФ-света (таких, например, как локальное повышение температуры монослоя и полимеризация, индуцированная поверхностным давлением), были проведены контрольные эксперименты для диолеоилфосфатидилхолина, структурно близкого к исследуемому липиду. Полимеризация БСЮРС в монослое была подтверждена также данными УФ-спектроскопии. Спектральный анализ показал уменьшение интенсивности поглощения на длине волны Я,=254нм, соответствующей поглощению диеновой группировки, при увеличении длительности облучения мультислойных пленок ОСЮРС.

Полимеризация липидов в ориентированной пленке, как правило, сопровождается изменением морфологии ее поверхности. Полученные нами мономерные и полимерные пленки ОСШРС, перенесенные на поверхность пирролитического графита, были исследованы методом атомной силовой микроскопии (рис.2).

•{Чг

У

/

И

'.ГгНяю

<лл i

500 2 ООО 3500 3000

Р

ад,,»

рпсо 4ооо аго

Рис.2 АСМ-изображения монослоев мономерного (а) и полимерного (б) БСЮРС на поверхности пирролитического графита. Протяженные области различной высоты относятся к разным ступеням графита, темные участки изображений соответствуют разрывам пленки ло поверхности графита.

Для всех исследованных пленок ОООРС характерно наличие дефектов пленки. Однако, в случае полимерных пленок были обнаружены также практически бездефектные участки размером до Юмкм2; небольшие дефекты на таких участках наблюдались только на границах ступеней графита.

Детальный анализ структуры поверхности ЛБ-пленок ОООРС показал, что молекулы липида претерпевают, по-видимому, конформационные перестройки, связанные с изменением ориентации полярной области молекулы. При этом молекулы липида с одинаковой конформацией полярной области организованы в домены, имеющие размеры' от десятков до сотен нанометров.

ЛБ-пленки стеринов

Четвертая глава диссертации посвящена получению и исследованию структуры ЛБ-пленок стеринов. Нами был выбран ряд липидов этой группы -

холестерин и эфиры холестерина, различающиеся по строению заместителей при атоме С3.

ЛБ-пленки холестерина

На поверхности водной субфазы холестерин образует мономолекулярную пленку с предельной площадью на одну молекулу в максимально сжатом состоянии равной 39А2. Эта площадь соответствует поперечным размерам стероидного ядра молекулы и свидетельствует о вертикальном положении молекулы холестерина на поверхности воды. ЛБ-пленки холестерина, перенесенные на коллодиевую подложку, дают дифракционные картины типа косой текстуры, свидетельствующие о том, что во всех образцах холестерин находится в виде кристаллитов, лежащих одинаковыми кристаллографическими плоскостями на подложке, и азимутально разориентированпых относительно друг друга. Кристаллиты холестерина имеют высокую упорядоченность как в плоскости подложки, так и вдоль нормали к ней. Оценка размеров области когерентного рассеяния

лб-пленки объемный кристалл

холестерин д=10.5А, Ь=14.2А, с=34.2А, а=9Г, 0=96', а=10.48А, Ь=ЫА7К, с=34.21А, а=90.67°,

у=95° [5=96.32', 7=94.64'

ацетат холестерина а=6.7А, 6=8.2А, я=9.3А, 6=16.5А,

с=15.0А, р=50° с=17.6А, р=107°

пальмитат холестерина а=7.75А, Ь=10.15А, й=7.55А, Ь=10.15А,

(3=90° с=105.5А, Д=95.6°

стеарат холестерина Й=7.7А, Ь=10.2А, а=7.55А, Ь=10.2А,

С=36А, р=90° с=57.5А, р=95,6°

Таблица 1. Параметры упаковки стеринов в ЛБ-пленках и объемном кристалле

(ОКР) в ЛБ-пленках холестерина дает величину -500А.

Анализ дифракционной картины позволил определить параметры триклшшой элементарной ячейки: я=10.5А, Ь=14.2А, с=34.2А, а=91°, Р=9б°, у=95", которые в пределах точности электронографических измерений ±0.1 А совпадают с параметрами объемного кристалла холестерина в безводной форме (таблица 1).

При анализе пленок, полученных из органических молекул, которые могут содержать связанную воду, необходимо контролировать возможные структурные перестройки в процессе анализа, вызванные дегидратацией образца. Изучение холестерина в водных суспензиях показывает, что в присутствии воды холестерин находится в форме моногидрата. В то же время, холестерин легко теряет связанную воду; энергия дегидратации моногидрата холестерина составляет 1.44 ккал/моль. Для ответа на вопрос, вызвана ли дегидратация ЛБ-пленок холестерина условиями анализа в вакууме, либо она происходит в процессе получения и хранения пленок, образцы были проанализированы методом атомной силовой микроскопии.

Анализ АСМ изображений (рис.3) показал, что ЛБ-плешш холестерина состоят из кристаллических областей размерами до 5мкм, для которых было

Рис.3 АСМ-изображение (а) ЛБ-пленки холестерина и результат его обработки программой "Crisp"(6)

получено молекулярное разрешение.

Структурная организация образцов холестерина в плоскости подложки определяется элементарной ячейкой близкой к прямоугольной (угол 7 для различных участков изображения составлял 90±5') с параметрами а=11±1А, £>=15+1А. Определенные методом атомной силовой микроскопии параметры плоской ячейки кристаллитов холестерина в пределах точности метода АСМ соответствуют параметрам элементарной ячейки, полученным при электронно-дифракционном анализе и совпадают с параметрами кристалла холестерина в безводной форме. Это позволяет утверждать, что дегидратация холестерина происходит в процессе формирования пленки, и в данном случае условия электронно-дифракционного анализа не влияют на структуру ЛБ-пленок холестерина.

ЛБ-пленки эфиров холестерина

Ацетат холестерина. Исследование мономолекулярных слоев ацетата холестерина показывает, что на поверхности водной фазы молекулы данного липида находятся в вертикальном положении. ЛБ-пленки ацетата холестерина на коллодиевых подложках дают дифракционную картину типа косой текстуры с узкими hkO рефлексами и уширенными hkl рефлексами. Электронограммы ЛБ-пленок свидетельствует о увеличении углового разброса осей текстуры кристаллитов ацетата холестерина до 10°. Анализ дифракционной картины показал, в ЛБ-пленках ацетат холестерина кристаллизуется в новой кристаллической фазе, параметры элементарной ячейки которой отличаются от параметров объемного кристалла. Этой упаковке соответствуем моноклинная элементарная ячейка с параметрами а=6.7А, Ь=8.2А, с=15.0А, ¡3=50° (таблица 1).

Пальмитат холестерина. На поверхности водной субфазы пальмитат холестерина образует жесткий мономолекулярный слой. При сжатии монослоя выше давлений ~20 мН/м происходит отклонение измерительной пластины от

вертикали, свидетельствующее о низкой сжимаемости пленки. Электронографический анализ показывает, что перенесенная на гидрофобную поверхность пленка состоит из кристаллических доменов, ориентированных базисными плоскостями параллельно подложке. Бедность дифракционной картины для больших I свидетельствует о слабой упорядоченности образца в направлении нормали к плоскости подложки. Характер дифракционной картины позволяет надежно определить только параметры плоской ячейки. Эти параметры соответственно равны й=7.75А, Ь=10.15А, (5=90° (таблица 1). Позиционная упорядоченность в ЛБ-пленках пальмитата холестерина сохраняется на расстояниях -150А.

Стеарат холестерина. В отличие от пальмитата холестерина стеарат холестерина кристаллизуется в видимые кристаллиты в момент нанесения на поверхность водной фазы. Когезия молекул, не позволяющая пленке находиться в газообразном состоянии монослоя, определяется по-видимому сильными гидрофобными взаимодействиями стероидных ядер молекул и их углеводородных цепей, имеющих большую протяженность. Полученная пленка легко переносится на гидрофобную коллодиевую подложку методом горизонтального лифта. При этом оставшаяся на поверхности воды пленка не поджимается в режиме поддержки постоянного поверхностного давления.

Дифракционная картина полученных пленок относится к типу косых текстур, кристаллические домены высокой упорядоченности лежат базисными плоскостями параллельно подложке. Размер области когерентного рассеяния, как и случае ЛБ-пленок холестерина, соответствует величине ~500А. Параметры плоской ячейки исследованных ЛБ-пленок стеарата холестерина близки периодам а и Ь объемного кристалла, в обоих случаях плоская ячейка является прямоугольной с периодами: а=7.7А, 6=10.2А в случае ЛБ-пленки и й=7.55А, ¿>=10.2А для объемного кристалла (таблица 1). Однако величины периода с значительно различаются, что определяется различием в характере упаковки вдоль длинной оси молекул. Так, если в случае объемного кристалла величина периода с составляет 57.5А и соответствует упаковке типа бислоя, то

в ЛБ-пленке период с составляет ЗбД и может соответствовать только укладке молекул с частичным перекрыванием слоев.

Двухкомпонентные ЛБ-плеики на примере композиции фосфатидилхолин -холестерин

Для получения и исследования смешанных ЛБ-пленок была выбрана двухкомпонентная липидная композиция, состоящая из двух важнейших мембранных липидов фосфатидилхолина и холестерина, взаимодействие которых играет большую роль в структурной организации биомембраи. Смешанные монослои дипальмитоилфосфатидилхолина (ДПФХ) и холестерина с различным соотношением компонентов переносились на коллодиевые подложки при поверхностном давлении ЗОмН/м. Профили электронограмм в окрестности рефлекса 4.15А от смешанных ЛБ-пленок приведены на рис.4.

Анализ дифракционных картин позволяет определить предельное мольное количество холестерина, начиная с которого нарушается гомогенность пленок и появляется фазовое разделение липидов. В наших экспериментах появление фазы кристаллического холестерина наблюдалось, начиная с 40 мол.% холестерина. Выше этого значения электронограммы свидетельствуют о присутствии в смешанных ЛБ-пленках кристаллических доменов холестерина; которые имеют ту же структурную организацию, что и домены холестерина в однокомпонентных образцах.

В смешанных ДПФХ/холестериновых ЛБ-пленках рефлекс 4.1-4.2А от плотно упакованных углеводородных цепей наблюдался для всех мольных соотношений компонентов, что свидетельствует о сохранении поликристаллической организации, по крайней мере, для части фосфолипидных молекул.

Для образцов, содержащих от 20 до 40 мол.% холестерина, на дифракционной картине наблюдалось появление диффузного рефлекса в

дпфх

dtoo

дпфх

dioo

ДПФХ'.ХОЛ=1:0

ДПФХ:ХОЛ=7:3

дпфх dlOO

ДПФХ

dioo

ДИФХ:ХОЛ=5:5

0.4

ДПФХ : ХО Л=2 :8 __ 2sinö/X, Л"1

Рис.4 Профили электронограмм двухкомпонентных ЛБ-пленок

0.2

области ~4.7а, причем наиболее выраженная картина присутствия этой фазы регистрировалась - при 30 мол.% холестерина. Сопоставление полученных результатов с литературными данными позволяет заключить, что в образцах с содержанием от 20 до 40 мол.% холестерина кристаллические домены ДПФХ в ЛБ-пленках сосуществуют со смешанной ДПФХ-холестериновой фазой. Такая фаза наблюдалась ранее рядом исследователей в ламеллярных фосфолипид-холестериновых системах и одиночном бис'лое.

Заключение. Характер упаковки молекул в липидных ЛБ-пленках

Анализ литературных данных и результаты собственных исследований, приведенные выше, позволили нам обобщить имеющуюся информацию о характере упаковки молекул в липидных пленках Ленгмюра-Блоджетт.

Исследования ЛБ-пленок солей жирных кислот, опубликованные ранее в литературе, показали, что упаковка молекул в таких пленках определяется плоской прямоугольной ячейкой с параметрами <2=4.96А, Ь=7.41А. Такая упаковка характерна для укладки бесконечных углеводородных цепей и характеризует плотную упаковку молекул с наличием сильных взаимодействий между цепями. Электронограммы от ЛБ-пленок солей жирных кислот свидетельствуют о высокой упорядоченности в таких пленках. Присутствие четко выраженных слоевых линий говорит о том, что углеводородные цепи молекул практически параллельны друг другу. Однако постепенное размытие рефлексов с возрастанием номера слоевой линии свидетельствует о наличии искажений в кристаллической упаковке молекул.

Математический аппарат, разработанный Хоземаном и примененный Вайнштейном к анализу искажений в кристаллической упаковке агрегатов цепных молекул, позволил оценить степень разупорядочений в упаковке молекул. Оценки сдвиговых искажений кристаллической упаковки молекул в липидных ЛБ-пленках приведены в таблице 2.

Переход к Л Б-п л елкам двухцепочечных липидов, таких как глицеро- и сфинголипидов, кардинально метает степень упорядоченности молекул в

образце. Как и в случае солей жирных кислот, характер укладки молекул определяется углеводородными цепями липидов, но при этом их организация в пленках описывается более рыхлой гексагональной упаковкой. D этой фазе, называемой ротационной, углеводородные цепи • не имеют сильных взаимодействий. Для ЛБ-пленок двухцепочечных липидов характерно увеличение разупорядочений в укладке молекул в направлении перпендикулярном подложке, что выражается в уменьшении номера слоевой с полным размытием рефлексов до 1=1.

Наличие ненасыщенных химических связей в углеводородных цепях двухцепочечных липидах приводит к уменьшению когезии между цепями молекул. Мультислойные пленки таких липидов и, в частности, исследованного в данной работе полимеризуемого фосфолипида DODPC, как правило, получить не удается.

Стерины - группа мембранных липидов, построенных на основе сильно гидрофобного стероидного ядра. Как было показано выше, ЛБ-пленки стеринов представляют собой ориентированные поликристаллические образцы. Область когерентного рассеяния в них составляет несколько сотен ангстрем. Однако, как и в случае жирных кислот и фосфолипидов, различие в химической структуре стероидных молекул приводит к различного рода искажениям кристаллической упаковки молекул в ЛБ-пленках.

ЛБ-пленки холестерина представляют собой поликристаллические пленки с сохранением дальнего порядка на расстояниях ~500Ä. Введение небольшого заместителя в положении С3 (ацетат холестерина) приводит к ухудшению степени ориентированности молекул в пленке, что выражается в увеличении углового разброса осей текстуры кристаллитов. При этом резкие рефлексы в плоскости подложки свидетельствуют, как и в случае ЛБ-пленок холестерина, о размерах областей когерентного рассеяния в этих пленках до нескольких сотен ангстрем.

Исследованные пленки длинноцепочечных эфиров холестерина : иальмитата (C,ß) и стеарата (С18) - обнаруживают сильно отличающийся

Таблица 2

упаковка в ЛБ-пленках нарушения в кристаллической упаковке

соли жирных кислот а= -ek^V 4.9А, b= 7.4А сдвиговые нарушения Д2 -0.4 - 0.6 А ОКР ~ 500 А

фосфолипиды й=4.8А сдвиговые нарушения Az ~ 1.2 А ОКР-50 - 100 А

холестерин а=10.5А, 6=14.2А, с=34.2А, а=91", Р=96', y=95' ОКР ~ 500 А

ацетат холестерина д=8.2А, Ь=6.7А, с=15.0А, р=50° разброс осей текстуры Да-10°

пальмитат холестерина а=10.15А, Ь=7.75А, (5=90° двумерная упорядоченность ОКР ~ 150 А

стеарат холестерина й=10.2А, Ь=7.7А, с=36А, (5=90° ОКР ~ 500 А

характер их упорядоченности. В случае стеарата холестерина кристаллизация молекул в протяженные кристаллиты происходит, по-видимому, в момент нанесения раствора липида на поверхность водной фазы. Образцы, перенесенные на подложку, представляют собой высокоупорядоченные ориентированные поликристаллические пленки. В противоположность этому, пленки пальмитата холестерина имеют только двумерную упорядоченность в плоскости подложки. Это определяется, по-видимому, недостаточной когезией боковых цепей пальмитата холестерина по сравнению со стеаратом.

Результаты настоящей работы показывают, что метод Ленгмюра-Блоджетт позволяет получать упорядоченные липидные пленки, которые могут служить модельными системами при изучении структурной организации биологических мембран. Проведенный анализ взаимосвязи химической структуры липидных молекул и характера их организации в ЛБ-пленках позволяет определять условия выбора липидных компонентов для получения липидных ЛБ-пленок с требуемыми характеристиками для решения задач пленочной технологии Ленгмюра-Блоджетт и при построении модельных мембранных систем.

Основные результаты и выводы

1. Исследованы ЛБ-пленки, состоящие из трех основных липидных компонентов биомембран - глицеролипидов, сфинголипидов и стеринов. Показано, что упаковка молекул глицеро- и сфинголипидов в ЛБ-пленках определяется упаковкой их углеводородных цепей, которой соответствует метиленовая гексагональная подъячейка с расстоянием между углеводородными цепями й=4.8А. Показано, что различия в химическом строении полярных областей исследованных липидов и в длине их углеводородных цепей не влияет на параметры упаковки молекул.

2. Впервые получены ЛБ-пленки холестерина и его зфиров (ацетата, пальмитата и стеарата). Показана возможность направленной кристаллизации молекул стероидного типа в ЛБ-пленках, при которой кристаллические микродомены имеют параллельные грани. Методами атомной силовой микроскопии и электронной дифракции исследована структура стериновых ЛБ-пленок, охарактеризована их морфология и определены параметры элементарной ячейки.

3. Исследованы смешанные ЛБ-пленки, состоящие из фосфатидилхолина и холестерина. Показано, что при определенном мольном соотношении этих компонентов в ЛБ-пленках наблюдается фазовое разделение. Так, при содержании холестерина выше 20 мол.% в ЛБ-пленках наряду с кристаллическими доменами фосфолипида появляются смешанные фосфолипид/холестериновые области со стехиомстрическим соотношением липидов 1:1. Выше 40 мол.% холестерина в смешанных ЛБ-пленках появляется фаза кристаллического холестерина, структурные параметры которой соответствуют параметрам объемного кристалла.

4. Впервые проведены исследования мономолекулярных слоев 1 ,2^h(9Z, i IE7 октадекадиеноил)-5П-глицеро-3-фосфохолина, способного к полимеризации. Показано, что УФ-облучение DODPC в пленках вызывает полимеризацию липида. Методом АСМ исследована морфология монослоев, образуемых мономерным и полимерным DODPC. Показано, что монослои DODPC организуются в липидные домены, в которых молекулы липида могут иметь различную пространственную ориентацию полярной области.

5. Разработан пакет программ для обработки дифракционных картин, полученных с помощью автоматизированной системы регистрации интенсивности, позволяющий проводить локальный анализ распределения интенсивности дифракционной картины и прецизионный анализ формы дифракционных максимумов.

6. Проведен сравнительный анализ искажений кристаллической упаковки в ЛБ-пленках различных липидов. Сделаны оценки сдвиговых нарушений и

наклонов молекул в кристаллической упаковке молекул в ЛБ-пленках солей жирных кислот, фосфолипидов и стеринов.

Материалы диссертации опубликованы в следующих работах:

1. L.L.Orekhova, S.V.Orekhov, V.V.Klechkovskaya, L.A.Feigin "Electron diffraction study of deposited lipid multilayers"//Physica B,198 (1994) 144-145

2. L.L.Orekhova, L.I.Barsukov, S.V.Orekhov, V.V.Klechkovskaya "Electron diffraction Study of deposited DPPC-Cholesterol Multilayers" // Phys. Low: Dim. Struct., 4/5(1994) 117-120

3. L.L.Orekhova, L.I.Barsukov, S.V.Orekhov, V.V.Klechkovskaya "Structure of L-B films of cholesterol and cholesterol esters" // Proceedings of the II Int. Conf. on Intelligent materials, 5-8Jun, 1994, Williamsburg, VA, USA, 971-975

4. L.L.Orekhova, L.I.Barsukov, S.V.Orekhov, V.V.Klechkovskaya, L.A.Feigin "Crystallographic studies of deposited lipid films" // Abstracts of III World Congress on Biosensors, l-3Jun, 1994, New Orleans, USA, p.4.32

5. L.L.Orekhova, A.Mogilevich, L.I.Barsukov, S.V.Orekhov, V.Klechkovskaya "Structure of artificial membranes from cholesterol and cholesterol esters",VII Int. Symp. on Syntetic Membranes in Science and Industry, 29Aug-lSept, 1994, Tubingen, Germany

6. L.L.Orekhova, L.I.Barsukov, S.V.Orekhov, V.V.Klechkovskaya, "Fabrication and structural analysis of multilayer films from cholesterol and cholestrol esters" // XV Austin Symp. on Molecular Structure, 21-23 March, 1994, Austin, USA

7. L.Orekhova, D.Klinov, M.Anikin, L.Barsukov, "Study of polymeric lipid films" // VI Europ.Conf. on application of surface and interface analysis, 9-13 Oct, 1995, Montrcux, Switzerland

8. Anikin A., Anikin M., Vasilenko I., Barsukov L., Demin V., Klinov D., Orekhova L., Prokhorov V. "Monolayer Properties of a Novel Polymerizable Phosphatidylcholine, l,2-Di-(9Z,llE-octadecadienoyI)-sn-glycero-3-phospho-choline", Mendeleev Communications, 1997, (в печати)