Синтез катионных амфифилов липидной природы и создание на их основе липосомальных систем доставки нуклеиновых кислот тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

оо

На правах рукописи « 1

Маслов Михаил Александрович

СИНТЕЗ КАТИОННЫХ АМФИФИЛОВ ЛИПИДНОЙ ПРИРОДЫ И СОЗДАНИЕ НА ИХ ОСНОВЕ ЛИПОСОМАЛЬНЫХ СИСТЕМ ДОСТАВКИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

02.00Л0 - Биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

1 2 т? Ж

Москва 2012

005012212

Работа выполнена на кафедре химии и технологии биологически активных соединений им. H.A. Преображенского Московского государственного университета тонких химических технологий им. М.В.Ломоносова

Научный консультант:

доктор химических наук, профессор

Серебренникова Галина Андреевна

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАМН, Северин Сергей Евгеньевич

доктор химических наук, профессор,

зам. директора по биомедицинским технологиям

НБИК-центра НИЦ «Курчатовский институт»,

заведующий кафедрой биологической химии

Первого МГМУ им. И.М. Сеченова

доктор химических наук, профессор, Молотковский Юлнан Георгиевич

главный научный сотрудник лаборатории химии липидов ИБХ РАН

доктор химических наук, профессор, . Позмогова Галина Евгеньевна

заведующая лабораторией искусственного антителогенеза НИИ ФХМ ФМБА РФ

Ведущая организация Институт молекулярной биологии

Защита диссертации состоится «26» марта 2012 г. в 15.00 часов на заседании Диссертационного Совета Д 212.120.01 при Московском государственном университете тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, пр. Вернадского, 86. С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте на Интернет-сайте ВАК РФ http://vak.ed.gov.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, пр. Вернадского, 86.

Автореферат разослан «24» февраля 2012 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат химических наук,

им. В.А. Энгельгардта РАН

старший научный сотрудник

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ1

Актуальность проблемы. Быстрое развитие технологии рекомбинантных ДНК и выяснение молекулярных основ многих заболеваний привело к возникновению новой области медицины — генной терапии. Этот метод лечения наследственных и приобретенных заболеваний основан на доставке терапевтических нуклеиновых кислот в клетки (трансфскция) с целью направленного устранения генетических дефектов или придания клеткам новых функции. Важными условиями успешной коррекции генетического отклонения являются эффективная доставка нуклеиновых кислот (НК) и создание условий для их длительного функционирования.

В настоящее время наиболее эффективными системами доставки ПК служат вирусные векторы, однако они имеют ряд серьезных недостатков. Это стимулирует разработку альтернативных невирусных подходов к трансфекции клеток, одним из которых является лилофекция — метод доставки НК в составе комплексов с катионными липосомами. К преимуществам катионных липосоМ следует отнести безопасность и неиммуиогенностъ, способность переносить НК любого размера, а также стабильность при хранении и экономическую доступность. Однако для известных на сегодняшний день лнпосом характерна низкая эффективность доставки НК, обусловленная наличием внеклеточных и внутриклеточных биологических барьеров, которые должен преодолеть НК-липосомальный комплекс (липоплекс), прежде чем НК осуществит терапевтическое воздействие. К таким барьерам относят компоненты крови и белки иммунной системы, которые дестабилизируют липоплекс vi вызывают преждевременное высвобождение и разрушение НК, а также клеточную, эндосомальную и ядерную мембраны.

Лнпосомы для доставки НК создаются на основе катионных амфифилов (КА), структура которых является одним из важных факторов, определяющих эффективность лнпофекции. Молекула КА представляет собой комбинацию двух основных структурных доменов -гидрофобного и гидрофильного катионного, которые соединяются спейсерными группами с помощью химической связи (линкера) определенного типа. На сегодняшний день накоплено большое количество данных по синтезу КА, однако для направленного поиска новых амфифилов необходимо выработать структурные требования, которые должны базироваться на понимании клеточных механизмов генного транспорта и определении лимитирующих стадий процесса лнпофекции. От этого также зависит разработка рациональных подходов к синтезу КА и созданию лилосомальных систем доставки, и проверка гипотез, связанных с клеточными и молекулярными механизмами протекания трансфекции.

В настоящее время для трансфекции эукариотичсских клеток in vitro используются несколько зарубежных коммерчески доступных липосомальных систем доставки НК. Их

1 Список сокращений, использованных в автореферате: НК - нуклеиновая кислота, КА - катионный амфифил, ПКА - поликатионньш амфифил, Ю1 - катионные липосомы. АСМ - атомно-силовая микроскопия, ТЭМ -трансмиссионная >лсктрониая микроскопии, ДЛС - динамическое лазерное светорассеяние, ИИ - индекс полидиспсрсности, ДК - дендритные клетки, ОСА - опухоль-ассоцяировашшс антигеиы.

применение in vivo ограничено высокой токсичностью, либо потерей активности в присутствии сыворотки крови или ее компонентов. Кроме того, высокая стоимость данных систем доставки НК и отсутствие отечественных аналогов сдерживает развитие и интенсивное использование как самого метода липофекцин, гак и генной терапии в российских научно-исследовательских организациях и биотехнологических компаниях.

Таким образом, создание отечественных липосомальиых систем доставки НК становится актуальной междисциплинарной задачей, лежащей на стыке биоорганической, биологической химии и молекулярной биологии. Поиск таких систем представляет собой комплексное исследование, которое включает разработку и оптимизацию подходов к синтезу новых КА, получение па их основе липосом и комплексов с НК, изучение физико-химических характеристик комплексов, установление зависимости эффективности трансфекцин от структуры КЛ.

Основной целью работы является создание эффективных и безопасных липосомальиых систем доставки, способных переносить терапевтические НК в клетки млекопитающих, для лечения наследственных и приобретенных заболеваний. Для достижения поставленной цели, в первую очередь, было необходимо предложить дизайн и разработать современные подходы к синтезу малотоксичных положительно заряженных амфифильных молекул - . основных компонентов липосом - с различной компоновкой структурных доменов, после чего изучить физико-химические и биологические свойства супрамолекулярных структур, образуемых катионными амфифилами с НК. На основании результатов биологических исследований требовалось установить связь между структурой КА и его активностью, выработать требования к молекуле КА как эффективному трансфектанту и предложить липосомальную транспортную систему, способную переносить различные IIK в условиях in vitro и in vivo.

Научная новизна. В данной работе сформировано новое междисциплинарное направление по конструированию липосомальиых систем доставки НК, которое включает разработку синтетических подходов к получению КА с различной компоновкой структурных доменов, создание на их основе катионных липосом и установление связи между структурой амфифила и его биологическими свойствами:

- Предложен дизайн новых моно- и поликатионных амфифилов и разработаны новые подходы и -стратегии синтеза амфифилов с различной компоновкой структурных доменов и способом их связывания. Синтезированы амфифилы с линкерными группами, способными разрушаться под действием внутриклеточных стимулов. Совокупность всех разработанных подходов представляет собой общую технологическую платформу, которая позволяет на основе унифицированных блоков в короткие сроки получать КА, отличающиеся тинами структурных элементов и способом их компоновки.

- Впервые предложены новые эффективные подходы к получению углеводсодержащих КА с линейной и разветвленной компоновкой структурных доменов, а также амфифилов,

содержащих в качестве спейсерной группы остаток D-глюкозы, связанный с гидрофобным доменом с помощью биодегрздируемой гликозиднон связи.

- Для создания многокомпонентных транспортных систем, в которых функции связывания НК и ее доставки в клетки-мишени разделены между двумя амфифильными компонентами, получены нейтральные амфифилы с адресными лигандами на основе галактозы и фолиевой кислоты.

- Сформирована библиотека микроэлсктронных фот01рафии, полученных с помощью трансмиссионной электронной микроскопии, для 33 образцов комплексов катионных липосом с НК (более 500 изображений). Анализ изображений позволил выявить общие закономерности образования комплексов и показал, что вне зависимости от структуры КА и формы липосом при взаимодействии с НК формируются комплексы с ламеллярной структурой.

- Установлена связь между структурой КА и трансфицирующей активностью, что позволило впервые сформулировать требования к структуре амфифила, которые должны учитываться при создании новых эффективных трансфицирующих реагентов. Показано, что важными элементами структуры, которые позволяют достичь высокой эффективности трансфекции, являются два гидрофобных домена, гексаметиленовый спейсер и линкер карбамоильного типа.

- Впервые с помощью разработанных липосомальных систем осуществлена доставка мРНК, кодирующей опухоль-ассоциированные антигены, в трудно трансфицируемые дендритные клетки.

Практическая значимость работы. Липосомальные системы доставки НК находят широкое применение в научно-исследовательских организациях и коммерческих компаниях, работающих в области биотехнологии, молекулярной и клеточной биологии, а также генной терапии. В настоящее время потребности научных учреждений и компаний России в таких реагентах удовлетворяются исключительно за счет импортных препаратов, которые, наряду со своей высокой стоимостью, проявляют значительную токсичность, а их применение ограничено типом переносимой НК. Это делает использование данных препаратов невыгодным как с терапевтической, так и с коммерческой точки зрения. В настоящей диссертационной работе, используя синтезированные катионные амфифилы, впервые получены отечественные высокоэффективные липосомальные системы доставки НК, не уступающие по своим характеристикам зарубежным коммерческим препаратам, и показана принципиальная возможность создания на их основе онковакшш нового поколения. Результаты исследований ш vitro и in vivo, позволяют рассматривать разработанные липосомальные системы доставки НК в качестве перспективных отечественных трансфицирующих препаратов для нужд молекулярной и клеточной биологии, генной терапии, биотехнологии и медицины. По результатам исследований получено 3 патента на изобретение.

Основные положения выносимые на защиту.

1. Разработка новых подходов и синтетических стратегий, позволяющих получать модификационные ряды катонных амфнфилов, отличающихся строением структурных элементов и способом их компоновки;

2. Выявление общих закономерностей образования комплексов катионных амфифилов с НК на основании изучения их физико-химических характеристик;

3. Создание эффективных и универсальных липосомальиых систем доставки НК, способных переносить различные типы НК in vitro и in vivo. Выявление связи между структурой катионного амфифила и его биологическими свойствами.

Личный вклад автора. Автору принадлежит решающая роль на всех этапах исследования от постановки задачи, планирования и непосредственного участия в проведении ключевых экспериментов до обсуждения и оформления полученных результатов.

Апробация работы. Основные результаты диссертации были представлены на Менделеевских съездах по общей и прикладной химии (2003, Казань; 2007, Москва; 2011, Волгоград), Международных конгрессах «Биотехнолошя - состояние и перспективы развития» (2002, 2005, 2006, 2009, 2011, Москва), Съездах Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (2002, С.-Петербург; 2008, Новосибирск), Международной конференции по органической химии "Органическая химия от Бутлерова и Бейльштейна до современности" (2006, С.-Петербург), Международных научно-технических конференциях . «Наукоемкие химические технологии» (2001, Ярославль; 2002, Уфа; 2004, Волгоград; 2006, Самара; 2008 Волгоград; 2010, Суздаль), International conference on chemical biology "1CCB 2005" (2005, Новосибирск), International Symposium on Advanced Science in Organic Chemistry (2006, Судак, Украина), Iм Russian-Hellenic symposium "Biomaterials and bionanomaterials: recent advances and safety - toxicology issues" (2010, Heraklion, Greece), XIX International Round Table on Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids (2010, Lyon, France), International conference "Liposomes in Jerusalem" (2011, Jerusalem, Israel)

Публикации. Основные результаты исследований, полученные при выполнении диссертации, изложены в 1 монографии, 1 обзоре, 3 патентах, 21 оригинальных статьях (в том числе 8 в зарубежных журналах), более 50 тезисах докладов на российских и международных конференциях.

Работа является частью научных исследований, проводимых на кафедре ХТБАС им. H.A. Преображенского МИТХТ им. М.В.Ломоносова в рамках тематического плана № 1Б-4-355 «Разработка химических и биотехнологических методов модификации биологически активных соединений с целью моделирования жизненно важных процессов в природе и создания новых лекарственных препаратов», а также в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (госконтракт 02.512.11.2200), ФЦП «Научные и научно-

педагогические кадры инновационной России» (госконтракт П715) и грантов РФФИ (00-03-32881-а, 04-03-32452-а, 04-03-32822-а, 05-04-48985-а, 07-03-00632-а, 09-03-00874-а, 10-03-

00995-а) и МНТЦ(1813р).

Объем диссертации и ее структура. Диссертация изложена на 275 страницах машинописного текста, содержит 21 схему, 15 таблиц, 30 рисунков и состоит из введения, литературного обзора, изложения и обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (254 ссылок).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Создание эффективных и нетоксичных липосомальных систем доставки ПК представляет собой комплексную проблему, решение которой включает разработку и оптимизацию подходов к синтезу новых катионных амфифилов (КА), получение на их основе липосом и комплексов с НК (лнпоплексов), изучение характеристик липоплексов и установление связи между структурой КА и эффективностью трансфекции.

Решающее влияние на эффективность доставки НК в клетки оказывает структура КА. Она определяет не только индивидуальные биохимические свойства КА (такие как токсичность и способность к деградации под воздействием биохимических стимулов), но также отвечает за его способность образовывать супрамолекулярные ансамбли. Каждый из структурных компонентов в молекуле КА выполняет определенную функцию: гидрофобный домен ответственен за формирование липосомальных структур, катионмый домен необходим для связывания с отрицательно заряженной молекулой НК, а спейсерная группа обеспечивает подвижность катионного и гидрофобного доменов в пространстве. Большое значение в структуре КА отводится линкерной группе - связи между гидрофобным и полярным доменом -поскольку ома определяет стабильность и токсичность молекулы в биологических системах. Кроме того, присутствие линкеров, способных разрушаться под действием биологических стимулов, может приводить к увеличению эффективности трансфекции. Так, введение в структуру амфифила кислотолабильных линкеров, гидролизуюшихся в эндосоме при ее созреваний (повышение кислотности среды от физиологического значения рН 7.4 до 5.0), приводит к деградации КА и дестабилизации липоплекса. что облегчает высвобождение НК, тем самым увеличивая эффективность трансфекции. Другим примером линкериых групп, чувствительных к биологическим стимулам, являются дисульфидные связи, способные разрушаться под действием внутриклеточных восстановителей (глутатиона, редуктаз). Таким образом, каждый структурный элемент КА может оказывать влияние как на образование супрамолекулярных комплексов, так и на биологическую активность молекулы КА и формируемых на его основе катионных липосо.м.

Для создания липосомальных систем доставки ПК необходимо было предложить дизайн КА и разработать унифицированные подходы к их синтезу. В качестве исходного объекта нами был выбран КА, в котором гидрофобный домен связан непосредственно с катионной группировкой (амфифил I типа, рис. 1). Основываясь на данной структуре, нами были предложены другие варианты КА, в которых гидрофобный и катионный домены связаны спейсерами с помощью линкерных групп различного типа (амфифилы II и IV типов). Кроме того, в структуру КА вводили адресные лиганды для возможного создания липосомальных систем направленной доставки НК (амфифлы У-VII типов).

^ &

ИШюзф ЕЕВ® о

ТИП II ТИП I

^ ^ -г.

ЕШхрЭ

Ж, ТИП VII

Ваш типу

Гидрофобный домен

В

Линкер -С(0)0-, -0СН,0-,

□ -ЫНС(ОК -МСН,0-, -5-3-Спейсер

-(СН3)„. п = 2,4,5,6,10

КЗ

но- Г ТР"

Лигакд "о^г-о

П

Ч^ он ОН

Рисуиок 1. Компоновка структурных элементов в молекулах катионных амфифилов.

Для достижения биосовместимости при создании КА мы опирались на аналоги метаболизируемых липидов, содержащих в качестве гидрофобного домена производные глицерина, стеролов и длинноцепных спиртов (рис. 1). Катионный домен представлен остатками азотсодержащих гетероциклических и алифатических оснований. Кроме того, для получения амфифилов с несколькими положительными зарядами был использован биогенный полиамин спермин. Наличие четырех аминогрупп в молекуле спермина позволяет уменьшить количество амфифила при формировании липоплексов, а также предотвратить деградацию НК внутри эндосом. Связывание. структурных доменов достигалось линкерными группами карбамоильного, сложноэфирного, ацетильного и дисульфидного типов. Два последних линкера могут разрушаться под действием внутриклеточных стимулов. Для направленной доставки НК в клетки печени в структуру КА вводили углеводные адресные лиганды.

Чтобы иметь возможность получать КА в количествах, необходимых для проведения биологических испытаний и последующего практического применения, на первом этапе работы

требовалось разработать совокупность химических подходов, позволяющих в короткие сроки и макисмальиыми выходами синтезировать КА с различной компоновкой структурных доменов. Наличие такого химического инструментария дает возможность масштабировать микросинтетические процедуры и перейти в дальнейшем к созданию лабораторной технологии получения КА. С этой целью, используя принципы унификации и взаимозаменяемости, были проведены поиски простых и универсальных подходов, с помощью которых путем направленных модификаций гидрофобного и катионного доменов, а также изменения длины спенсера и типа линкера были получены различные тины КА, отличающиеся не только строением структурных элементов, но и способом их компоновки (рис. 1). Совокупность всех синтезированных нами амфифилов с различными структурными характеристиками послужит основой для формирования химических «библиотек» КА, с помощью которой по результатам биологических испытаний можно оценить вклад каждого структурного элемента в трансфицирующую активность и выявить соединения с оптимальным вариантом компоновки структурных единиц.

1. Синтез катионных амфифилов на основе жирных спиртов, диглнцеридов и холестерина

С целью создания КА, обладающих низкой токсичностью и способностью эффективно доставлять НК в эукариотические клетки, нами были разработаны подходы к синтезу амфифильных молекул, содержащих в качестве гидрофобного домена остатки жирных спиртов, диглнцеридов и стеролов. Известно, что в ряду производных глицерина с насыщенными длинноцепными углеводородными остатками максимальная эффективность трансфекции характерна для амфифилов с тетрадецильными заместителями. Среди стеролсодержащих катионных амфифилов наибольшее применение получили соединения, в которых гидрофобный домен представлен холестерином (например, коммерческий трансфектант БС-С1ю1). Поскольку структура и природа катионного домена может влиять на токсичность амфифила, его способность связывать НК и образовывать липоплексы, нами были синтезированы два класса амфиф!£лов, содержащих один (монокатионные амфифилы) или несколько (поликатионные амфифилы) положительно заряженных атомов азота в молекуле.

1.1. Монокатионные амфифилы

1.1.1. Синтез амфифилов с карбамоильным, сложноэфирным и ацетильным линкерами

Ранее нами было показано, что прямое алкилироваиие азотистых оснований гетероциклического и алифатического типа 3-бром-, 3-мезил- или 3-тозилпроизводными 1,2-диалкилглицеринов является удобным подходом к получению, амфифилов I типа [М.А. Маслов и др., Известия АН, сер. хим., 1999]. Основываясь на этой реакции, был разработан подход к получению КА II и III типов (рис. 1), в которых катио/шый н гидрофобный домены связаны с помощью карбамоильного, сложноэфирного или ацетальиого линкера. Поскольку в основу предлагаемоего подхода к синтезу КА положено алкилироваиие

азотсодержащих оснований бромпроизводными гидрофобной компоненты, то на первом этапе потребовалось разработать методы введения в молекулы тетрадеканола. 1,2-днаткилглицернна и холестерина галогенсодержащей спейсерной группы путем создания сложноэфирной, карбамоильной или ацет&тьной связи (схема 1).

Для создания соединений с карбамоильным линкером на основе тетрадеканола (1а), 1,2-ди-О-тстрадецил-гас-глнцерииа (1Ь) и холестерина (1с) был реализован трехстадийный синтез, который позволил получить бромиды 4а-с с выходами 78-87%. Важным преимуществом данного синтеза является отсутствие необходимости хроматографической очистки промежуточных соединений 2а-с и За-с, что позволяет провести наработку бромидов 4а-с за короткое время. Бромнроизводное холестерина 5 со сложноэфирным линкером было получено ацилированием холестерина (1с) количественным выходом.

хлорангидридом 5-брс)мвалериановон кислоты с

Схема 1

ROH 1а*

ROH 1с

ROH 1Ь,С

a, R =

О

H

4а-с

(Chol)

Реагенты «условия2: a) CDI, Et3N, DCM, 40 "С, 11 ч; Ъ) NH;(CH2),,OM, DCM. 40 "С. 7-13 ч; с) СВг4, РЬР, DC.VI. 24 °С, 1-3 ч; d) Br(CH2)4COCI, Ру, DCM, 24 'С, 1 ч; е) DMSO-Ac.O-AcOH, бензол, 24 "С, 4872 ч; fi Вг, или NBS, DCE, 24 °С, 5-10 мин; g) Вг(СН2ЬОН, 2,6-лутидин, DCE, 24 °С, 20 ч.

Для получения бромидов 7Ь,с и 8Ь нами были использованы метилтиометиловые (МТМ) эфиры 6Ь,с, которые при обработке бромом или „V-бромсукцинимидом (NBS) превращаются в а-бромметиловыеэфиры, способные в мягких условиях легко взаимодействовать с N- и О-нуклеофилами. В связи с высокой реакционной способностью бромидов 7Ь,с, их без выделения вводили в реакции алкнлировання органических оснований (см. далее схему 2). Бромид 8Ь с линкерной группой О.О-ацетадьного типа был синтезирован взаимодействием соединения 7Ь с 2-бромэтанолом в присутствии 2,6-лутндина.

Полученные таким образом бромиды гидрофобных компонент применялись далее для алкилировапия гетероциклических и алифатических оснований. Так, кватернизациен гетероциклических оснований (пиридина, А-метнлимидазола и Л'-метилморфолина) бромидами

"CDI- /У,,¥-карбошшдиимидазол, DCM - дихлорметан, DCE - дихлорэтан, NBS - Л'-бромсукцинимид

10

4а-с были синтезированы КА 9а-с, 10а-с, 11а-с с карбамоильным линкером (схема 2). В случае кватернизацпи /\-метилморфолина реакцию проводили в присутствии йодида натрия, что позволило сократить продолжительность процесса и увеличить выходы целевых продуктов. При получении амфифилов 12а-с со сложнозфирным линкером было опробовано 2 подхода к формированию катионного домена. В первом случае амфифнл 12а получали прямым взаимодействием пирндина с бромидом 5 с выходом 91%. Для синтеза лнпидов с А-метшшмидазолиевой (12Ь) и А-метилморфолиниевой (12с) группами первоначально проводили алкилирование имидазола и морфолина бромидом 5, а последующая кватсрнизация третичных оснований йодистым метилом приводила к образованию КА 12Ь,с.

Схема 2

1

R'X-Y-Br

9а-с- 1Sa-c

a,Z =

b,Z =

c, Z =

-О

-N

—N О Me V_7

4а-с, X = ОСОМН, У = (СН2)в 5, X = ОСО, У = (СН2)4 7Ь,с, X = ОСН2 У - отсутствует 8Ь,Х = 0СН20,'У = (СН2Ь

Реагенты „условия-, а) гетероцикл. основание, 70-100 °С, 10 мин - 24 ч; Ь) имидазол или морфолин, МеСОЕ1,80 °С, 2 ч, затем СН31,40 °С.

Амфифил R X Y Hal Выход, %

9а С14Н29 OCONH (СНг)6 Br 66

9Ь Br 98

9с 1 89

10а —ОС14Н29 —ос14н29 Br 76

10Ь 1 74

10с 1 83

11а Br 86

11Ь Br 52

11с 1 69

12а ОСО (СН2), Br 91

12Ь 1 72"

12с 1 72-i

13а осн2 - Br 52

13Ь Br 54

13с ОС14Н29 Br 52

14а осн2о (СН2)2 Br 71

14Ь Br 97

14с 1 69

15а осн2 - Br 67

15Ь Br 58

15с Br 62

" Указан суммарный выход по двум стадиям

Катиониые амфнфилы 13а-с и 15а-с с линкером МО-адетального типа получали взаимодействием образующихся in situ бромидов 7Ь,с с гетероциклическими основаниями. Продолжительность реакции зависела от нуклеофильности атома азота в молекуле основания. Взаимодействие бромида 8Ь с основаниями приводило к образованию КА 14а-с с линкером 0,0-ацстального типа.

Исходя из МТМ эфира холестерина 6с были синтезированы КА 16а-е Л',О- и О.О-ацеталыюго типа, в которых в качестве катионных группировок были использованы основания гетероциклического и алифатического типа. Соединение 16с было получено в две стадии путем взаимодействия бромида 7с с А-трифторацетиламиноэтил-.^Д'-диметиламином и последующего удаления трифторацетильной защиты боргидридом натрия в метаноле.

Амфифил X V Выход, % Амфифил X Y Выход, %

16а -О Mo \—! вг 21 Shd -О— - 46

16Ь Ме ОН Ме Вг" 67 16с Ме Ме * Вг' 58

16с Ме —N+ Ме 1 N' Ме Ме Вг' 51

Таким образом, были разработаны подходы к синтезу КА II и III типов, в которых остатки гетероциклических и алифатических оснований связаны с гидрофобным доменом с помощью карбамоильной, сложно-эфирной и ацетальной связей. Для синтеза КА с линкерами N,0- и 0,0-ацетального типов были использованы МТМ эфиры, которые обладают высокой реакционной способностью и позволяют получать широкий набор амфифильных молекул. Структура полученных КА и промежуточных продуктов подтверждена совокупностью методов физико-химического анализа.

1.1.2. Синтез монокатиоиных амфифилов с углеводным звеном в качестве сиейсера

Введение остатка углевода в структуру КА снижает токсичность и увеличивает коллоидную стабильность липосомальных агентов трансфекции. В продолжение исследований по поиску новых эффективных и нетоксичных КА был разработан синтез производных холестерина 23a-d, содержащих в качестве спейсерной группы остаток D-глюкозы, соединенный с холестерином биодеградируемой ß-гликозидной связью (КА II типа, рис. 1). Стратегия синтеза, как и в случае амфифилов 9а-с - 15а-с, основана на кватернизации гетероциклических оснований. В качестве алкюшрующего агента был предложен 6-О-метансульфонат холестернлглюкозида 20, для получения которого потребовалось провести региоселектнвное введение в незащищенную молекулу холестерушглюкозида мезильной группы по атому С(6) углевода (схема 3). Глкжозиды 18а,Ь (63%, a/ß = 1 :2.3) были получены конденсацией ацетобромглюкозы 17 и холестерина (1с) в условиях реакции Гслъфериха при использовании Hg(CN)2 в качестве катализатора. Резкое увеличение стереоселективиости (a/ß = 1 : 51) с небольшим понижением выхода (57%) было достигнуто при замене Hg(CN)2 на CdCO,. Были подобраны оптимальные условия реакции ß-D-холестерилглюкозида 19 с мезилхлоридом, приводящие к

преимущественному образованию 6-О-мезильного производного. Последующая обработка уксусным ангидридом давала соединение 20 с выходом 70%.

Прямая кватернизация пиридина и JV-метилимидазола мезилатом 20 приводила к соединениям 21а и 21Ь с выходами 78 и 80%, соответственно. Кватернизация Л'-метнл.морфолина и iV-метилпиперидина в сходных условиях оказалась безуспешной: выходы соединений 21с,d составили меньше 5-10%. Поэтому, как и при получении соединений 12Ь,с, использовали двухстадийный подход: алкилирование морфолина и пиперидина мезилатом 20 и последующую кватернизацию третичных аминов 22а,b йодистым метилом. Катнонные амфифилы 21с и 21d были получены с выходами 82 и 72%, соответственно.

Схема 3

ПАг

АсО АсО

OMs

НО

но

но

19

НО

но

<R2X"

но. 23а-Й

Соединение R2 X

21а, 23а -О MsO

21Ь, 23Ь —Njgp-Me MsO

21с, 23с iO5 I

21d, 23d ¿р I

Реагенты и условия: а) холестерин (lc), Hg(CN)2 или CdCOj, MePh, 100 "С, 7 ч; Ь) McONa/MeOH, 20 С, 3 ч- с) 1 экв MsCl Ру, -15 "С, 20 ч, затем АсО, 20 СС, 3 ч; d) Ру или Melm, 110 °С. 9-19 ч; е) морфолин или пиперидин, 70 °С, 3-9 ч, затем АсА20 °С, 3 ч;/) Mel, 40 °С, 3 ч; g) MeONa/MeOH, 20 °С, 1-3 ч.

В связи со сложностью отнесения сигналов глкжозильного остатка при подтверждении структуры соединений 21a-d помимо одномерной спектроскопии ЯМР были использованы двумерная гомоядерная ('Н,'Н COSY) и 'Н,13С гетероядерная (HSQC) спектроскопия. Было обнаружено, что в спектрах соединений 21с,d наблюдается сдвиг сигналов аномерного прогона (6,„ 5.40 - 5.48 м.д.) и протона при С(5) (б5Н 4.70 - 5.00 м.д.) в область слабого поля, в то время как в соединениях 21а, b сигналы этих протонов находятся в сильном поле (81Н 4.60 4.70 м.д., 5?н 4.12 - 4.25 м.д.). Наличие положительно заряженного атома азота вблизи пиранозного цикла в соединениях 21c,d вызывает снижение электронной плотности на атоме кислорода цикла. Это, в свою очередь, приводит к перераспределению электронной плотности на соседних с ним атомах С(1) и С(5), результат чего и наблюдается в спектрах ЯМР. В молекулах соединений

13

21a,b положительный заряд делокализован за счет наличия я-орбиталей ароматического кольца, поэтому атом азота проявляет меньшую электрофильность и не взаимодействует с атомом кислорода пиранозного цикла.

После дезацетилирования соединений 21a-d в условиях реакции Земплсна целевые катионные амфифилы 23a-d были выделены с выходами 45-89%.

К амфифилам II типа также относятся глюкозиды 2ба,Ь, в которых протонируемая аминогруппа удалена от углеводного остатка при помощи спейсерной группы, присоединенной к атому С(6) D-глюкозы посредством сл0ЖН0Эф1фН0Й связи (схема 4). Для получения этих соединений было разработано региоселективное 6-О-ацилирование p-D-тетрадецилглюкозида (24) Вос-защищенными аминокислотами по реакции Мицунобу. В качестве оптимального конденсирующего агента был выбран DIAD1, при использовании которого были получены наибольшие выходы продуктов моноацилирования (52% для соединения 25а и 48% для соединения 25Ь), тогда как в случае DEAD и ADP выходы не превысили 33%. Деблокирование аминогрупп трифгоруксусной кислотой приводило к целевым амфифилам 26а,b (68 и 70%, соответственно).

Таким образом, в ходе выполнения данного этапа работы были разработаны синтетические схемы получения КА II типа, содержащих в качестве спейсерной группы остаток О-глюкозы, связанный с гидрофобным доменом с помощью биодеградируемой Р-гликозидной связи. В синтезах были успешно реализованы региоселективные подходы, позволяющие модифицировать незащищенные молекулы гликозидов по С(6) атому углеводного остатка.

1.2. Синтез полнкатионных амфифнлов на основе биогенного полиамина - спермина

Известно, что спермин способен упаковывать ДНК в комплексы тороидальной и стержневой формы. Структурно-функциональные исследования показали, что липофильные производные спермина конденсируют ДНК более эффективно, чем сам спермин. Уникальность молекулы спермина состоит в наличии симметрии, что позволяет создавать на его основе как-классические амфифилы «голова-хвост», так и гемиии-амфифилы - соединения симметричной структуры, в которых два гидрофобных домена связаны через спейсерные группы с гидрофильным доменом.

' DIAD- днизолропил-азоднкарбоксилэт, DEAD - дютилазоднсарбоксилат, ADP- 1,1'-

(модикарбонил)д1типеридин

Схема 4

24

25а, п = 10 25Ь, п = 5

26а, п = 10 26b, п = 5

Реагенты иус.ювгш: а) Вое-аминокислота, DIAD, Ph3P, DMF, 24 "С, 24 ч; Ь) TFA, DCM, 24 °С, 50 s

Описано несколько подходов к получению ПКА, гидрофобная часть которых связана с полиамином снейсерами различной длины. Большинство методов основано на первоначальном присоединении сиейсерной группы к полиамину, после чего полученный фрагмент связывают с активированной гидрофобной составляющей. Альтернативный подход к получению новых ПКА II и ГУ типов, предложенный в рамках данной работы, включает связывание спейсера с гидрофобной компонентой и последующую конденсацию с полиамином (схема 5). Для реализации этого подхода на первом этапе был осуществлен, синтез региоселективно защищенных производных спермина, поскольку для проведения последующей конденсации с гидрофобной компонентой требуется избирательная модификация концевой аминогруппы. Далее были получены производные холестерина, в которых спеисерпая группа (в том числе с днсульфндной связью) соединена со стероидным остовом карбамоильной, сложноэфирной или ацетальной связью. Заключительный этап включал конденсацию холестериновой и сперминовой компонент и удаление защитных групп. Для осуществления конденсации нами были выбраны методы, позволяющие проводить синтез в мягких условиях с высокими выходами: реакция получения вторичных аминов по методу Фукуямы и классическая реакция создания амидной связи. Реакция Фукуямы представляет собой алкнлирование 2-нитро-бензодсульфонамидов, полученных из первичных аминов, алкилгалогенидами с последующим удалением 2-нитробензолсульфонильной группы и образованием вторичных аминов.

Схема 5

Защищенные производные спермина 28а-с были получены путем региоселективного введения и удаления защитных групп в спермине (27) (схема 6). Для осуществления реакции Фукуямы проводили М-сульфонилирование соединений 28а-с действием избытка 2-нитробензолсульфонилхлорида. Сульфонамиды 29а-с были выделены с выходами 80-91%.

Карбоксильное производное спермина 31 получено алкилированием соединения 29а метилбромацетатом в присутствии ОСО, с последующим удалением 2-нитробеизолсульфошмыюй и метилыюй защитных групп в соединении 30 (схема 6).

Полученные на данном этапе производные спермина с модифицированными концевыми аминогруппами были использованы в синтезе ПКА.

Схема 6

a или Ь. затем с

28a,R' = R2 = Boc 28b, R1 = R2 = Cbz 28c, R1 = H, R2 = Boc

29a, R1 = R2 = Boc 29b, R1 = R2 = Cbz 29c, R1 = S02C6H4N02, R2 = Boc

30 (90%) 31(85%)

Реагенты и условия-, а) СР,СООЕ1 МеОН, -70 °С, 1 ч, затем Вос20 или ОкС1, Е^Ы, -10 °С, 3 т Ь)СТ,СООЕ|, МеОН, О «С, затем Вос20, Н1зЫ; с) №ОН, МеОН, 25 °С, 4 ч; О) 2-Ы0-С,,Н480-С1, Е|31Ч ОСМ, 24 "С, 1-5 ч; е) ВгСН2СООМе, ОцСО* ОШ. 75 «С, 3 ч; /) РЬБН, К,СО,, БМР, 25 °С, .1 ч, затем N3011. МеОН, 25 "С, 1 ч, затем 3% води. НС1.

1.2.1, Синтез поликатиониых амфифилов со сложноэфирным и карбамонльным линкерами

На основе производных спермина 29а и 29с были получены два различных класса ПКА: классические несимметричные «голова-хвост» амфифилы (тип II, рис.1) и симметричные гсмини-амфифилы (тип IV, рнс.1). Исходя из соединения 29а разработай синтез несимметричных ПКА с линкерами сложноэфириого и карбамоилыгаго типов (схема 7), который осуществляли по реакции Фукуямы при использовании в качестве алкилирующих агентов бромпроизводные 4с, 5 и 32 (последний был получен аналогично 4с).

Схема 7

£

o=s=o

no2

4с, X = C(0)NH, n = 6 5. X = C(O), n = 4 32, X = C(0)NH, n = 4

H

29a

Вое

Ntkx-o'Ch01

Hf-r

4 HCf

33a, X = C(O), n = 4 33b, X = C(0)NH, n = 4 33c. X = C(0)NH, n = 6

Реагенты и условия: а) CsiCOj, DMF.60T, 1 ч; fe) PhSH, K,CO,, DMF, 24 "С, 1 ч; с) 4M HC1 в диоксане, 24 "С, 2 ч.

34а, X = С(О), п = 4 34b, X = C(0)NH, п = 4 34с, X = C(0)NH, п =

Взаимодействие бромидов 4с, 5, 32 с сульфонамидом 29а в присутствии С$;СОз приводило к соединениям ЗЗа-с с выходами 86-94%. Удаление 2-иитробензолсульфонилыюй защиты

действием РИБН в присутствии К;С03 и последующее отщепление Вос-групп действием Ш НС1 в диоксане давало амфифилы 34а-с с выходами 77,78 и 99 %, соответственно.

Для синтеза гемини-амфифилов Зба-с, содержащих два остатка холестерина (катионные амфифилы IV типа), проводили конденсацию бромидов 4с, 5, 32 с дисульфониламидными производными спермина 29с (схема 8) в тех же условиях, как и для соединений ЗЗа-с. После удаления защитных групп ПКА Зба-с были получены с выходами 49-76% по двум стадиям.

Схема 8

Вос„,

N02 0=Б=0

4с,х = с(0)мн,п = б 7 "М, о ну

□ой ■ ^ » уж Вос 0=3=0 ^^н

28с II 36а,Х = С(0).п = 4

^^ 36Ь, X = С(0)№Н, п = 4

35а, X = С(0). п = 4 *с.Х = С(0Жп = 6

35Ь, X = С(0)МН, п = 4 35с, X = С(0)МН, п = 6

Реагенты и условия-, а) С$2СО}, ИМР, 60 "С, 1 ч; Ь) 1^511, К:С03, СМР, 24 "С, 1 ч; с) 4А/ НС1 в диоксане, 24 "С, 2 ч.

г-ОСцН29

5. X « С(0). п = 4

N02 32, X = С(0^Н, п = 4 [ Ь.с ( 4 нс,

Аналогично исходя из бромида 4Ь бьш

(-ОС14Н29

синтезирован амфифил 36<1, гидрофобный Г" ° рос14Ни

домен которого представлен остатком 1,2-ди- 1 н н _,

нм—^"«"у0

О-тетрадецил-гас-глицерина. Д

зба

рОСцНгв

1.2.2. Синтез поликатиопных амфифилов с ацетальпым линкером

Несимметричные ПКА II типа, в которых остаток спермина связан с холестерином О, О-ацетальным линкером, были получены с использованием МТМ эфира холестерина 6с (схема 9).

Схема 9

N02 0=Б=0

- на^о^о^ —

37а, На| = Вг, п = 2 „

СЬ2 ^ — СЬг

ЗТь! На! = а п » 4 37с, На| = С|, п = 6

... 39а, п = 2 38а, п - 2 „ _ л

38Ь, П-4 39еп = б

Зве, П = 6 ЗЗС.П-0

Реагенты и условия: а) Вг>, 2,6-лутидин, затем Н0(С1Ь)пНа1, 25 "С, 20 мин; Ь) 29Ь, Са£0<, (1ВА1), П\!Р, 60 °С, 2-20 ч; с) РЬБН, К,СО:„ ОМР, 25 X, 15 мин;/) Н2, РАС, 24 °С, 2 ч.

Обработка МТМ эфира 6с ШБ в присутствии диизопропилэтиламина (01ЕЛ) и дальнейшее взаимодействие образующегося бромметилового эфира с галогензамещенными спиртами (1.5 - 10 кратный избыток) давало галогенпроизводные холестерина 37а-с с низкими выходами (< 30 %). Оптимизация условий реакции путем замены 01ЕА на 2,6-лутиднн, а КВ Б на бром привела к увеличению выходов соединений 37а-с до 55-75% (табл. 1).

Таблица 1. Оппптюация условий получения соединений ¡7а-с

Продукт реакции Нуклеофил (экв.)11 Основание (экв.) Реагент (экв.) т,ос Выход, %

37а НО(СН3):Вг(4) 15ША (4) N155 (3> 20 5

Вг> (1.1) 30

2,6-Лутидин (4) Вг2 (2) 55

37Ь НО(СНЛСКЮ) 2,6-Лу'тидии (3) ВГ2(2) 20 75

37с НО(СН3),.С1(5) - МВБ (3.0). ТГОН (0.2) -10 30

НО(СНЛ.С1 (3) 01ЕА ПО) Вг2 (3) 20 20

НО(СН,Ш (5) 2,6-Лутидин (3) Вь<2) 66

11 количество мольных эквивалента« по отношению к метилтиометшовому эфиру 6с

Амфифилы 39а-с с <?,0-ацетальной связью получали взаимодействием галогенпроизводных холестерина 37а-с с СЬг-защшценным спермином 29Ь (схема 9). Алкилирование соединения 29Ь бромидом 37а проходило легко и после хроматографической очистки выход коиыогата 38а составил 94%. В случае хлорпроизводны.х 37Ь,с из-за их меньшей реакционной способности алкилирование протекало в более жестких условиях и требовало присутствия катализатора -тетрабутиламмоний йодида (ТВА1), выходы соединений 38Ь,с составили 50%. Последовательное удаление защитных групп приводило к целевым амфифилам 39а-с с выходами 74-97%.

1.2.3. Получение поликатионных амфифилов с дисульфидной связью

Дисульфидная группа в молекуле амфифила является участком, потенциально чувствительным к действию внутриклеточных восстановителей. Разрушение в-Б-группы может понижать стабильность липоплекса и способствовать высвобождению НК, тем' самым, увеличивая эффективность трансфекции. Один из наиболее простых способов получения амфифилов с дисульфидной связью заключается в присоединении к холестерину спенсера, содержащего З-Б-группу. Спейсеры с З-в-группой были получены с количественными выходами окислением 2-меркаптоуксусной и З-меркаптопропионовой кислот, а также цистеамина перекисью водорода.

В соответвствии с предлагаемым нами подходом к синтезу ПКА были получены производные холестерина, в которых Б-Б-содержащие спейсерные группы соединены со стероидным фрагментом сложноэфириой или карбамоильной связью. Синтез производных холестерина 40а.Ь со сложноэфирным линкером был осуществлен ацилнрованием холестерина (1с) дитиодикарбоновыми кислотами в присутствии ОССЛОМАР (схема 10). Варьирование соотношений реагентов показало, что при использовании 2-кратного избытка дикарбоновых

кислот и 0.5 экв. ОМАР соединения 40а,Ь образуются с наилучшими выходами (67 и 45%, : соответственно). Использование других активирующих агентов (Вор, СТО, Вос20)4 оказалось неудачным: выходы соединений 40а,Ь в этих случаях не превышали 10%. При дальнейшей конденсации карбокснпроизводных холестерина 40а,Ь с три-Вос-замещеиным спермином 28а был подобран наиболее эффективный конденсирующий агент; среди всех опробованных реагентов (ОССЛМАР, Вор, ТВТи5) максимальные выходы соединений 41а,Ь (60-82%) достигались при использовании ТВТи. Удаление Вос-защитных групп приводило к целевым ПКА 42а,Ь с количественными выходами.

Схема 10

но

40b, n = 2 Boc ^— Вое

41а, п = 1 41Ь, n в 2

42а, п = 1 42Ь, п = 2

Реагенты и условия: а) ОСС, ОМАР, МеС(0)0Ш,25 "С, 12 ч; Ь) 28а, ТВТи, ЕЬЫ, 1)МН, 25 °С, 1 ч; с) Ш НС1 в дноксане, 24 "С, 2 ч.

С целью создания дисульфпдното ПКА 45 с карбамоильной связью между гидрофобной составляющей и спенсером первоначально проводили взаимодействие имидазолида холестерина 2с с избытком цистамнна (схема И). Полученное производное холестерина 43 с концевой аминогруппой конденсировали с полиаминным синтоном 31 в присутствии ТВТО, и после удаления Вос-грулп в соединении 44 получали амфифил 45 с выходом 81%.

Схема 11

н

„. ... . « ^ И Л -А. ----2-

о

43 (59%)

О

н

^ Вое

О

Н Д

с _____ м о 44(82%)

HN'^"' S—^ V" Chol О

О

Реагенты и условия: а) NHACH^SSCQbbNH,, DCM-EtjN-диоксац, 70 "С, 35 ч; А) 36, TBTU, DIEA, DMF, 25 "С, 2 ч; с) 4M HCl в диоксане, 24 "С, 2 ч.

' DCC - А'. А' -днциклогексилкарбодшшид, DMAP - 4-диметиламинопиридин. Вор - бекзотриазол- 1-идокси-1рис(диметаламшю)фосфо»]ин гексафторфосфаг, Вос20 - ди -m/wm-бутшширокарбонат

5 TBTU - 0-(бензотриазол-1-нл)-.гУ,Л:,Л",Л'-тС1рамстилуроний теграфторборат

Таким образом, на данном этапе исследования были разработаны новые подходы к получению ПКА II и IV типов, содержащих фрагменты биогенных молекул - холестерина и спермина - и отличающихся количеством гидрофобных доменов, способом присоединения к ним спермина (сложноэфирный, карбамоильный, ацетальный, днеульфидный линкеры) и длиной спейсера. Предлагаемые методы синтеза характеризуются мягкими условиями, а также использованием эффективных активирующих агентов, что позволяет получать различные по структуре ПКА с высокими выходами.

2. Ка тонные амфифиды на основе желчных кислот

Желчные кислоты представляют собой биогенные амфифилы стероидной природа, среди которых самыми распространенными в организме человека являются холевая и дсзоксихолевая кислоты. Наличие нескольких ОН-групп, ориентированных в одну сторону относительно стероидного скелета, придает их молекулам уникальные амфифильные свойства (фасциальную амфифильность), благодаря которой конъюгаты желчных кислот с пептидами и олигонуклеотидами могут проникать через биологические мембраны. Известно о способности катионных производных холевой кислоты облегчать транспорт НК в эукариотические клетки, что стимулировало исследования по созданию на основе желчных кислот новых амфнфнльных агентов трансфекции.

2.1. Синтез moho- и дмаминоаиалогов холевой кислоты

В молекуле холевой кислоты ОН-группы различаются по реакционной способности, что позволяет проводить их селективную модификацию. В развитие наших исследований по синтезу КА были получены моно- и диаминоаналоги холевой кислоты 52а,b и 55а,Ь путем избирательной замены одной или двух ОН-групп на аминогруппы (схемы 12, 13). Для сохранения фасииальной амфифильности было необходимо сохранить природную а-стереоконфигурацию при атомах С(3), С(7) и С(12). Это может быть достигнуто либо двойным обращением конфигурации при каждом хиральном центре, что делает такой синтез многостадийным и дорогостоящим, либо стереоселективным восстановлением оксимов, полученных из оксопроизводных холевой кислоты. С целью поиска удобных подходов к регио-и стереоселективному введению аминогрупп в стероидную полшшклнческую систему с применением доступных и недорогих восстанавливающих агентов нами был разработан синтез амфифилон 52а.Ь и 55а,Ь, ключевой стадией которого является восстановление оксимов действием TiCl3 в присутствии NaBHjCN.

Для окисления соединений 46а,b нами впервые был использован мягкий окислитель IBX6 (6-кратн. изб.), который позволяет получать 3,7,12-трноксопроизводные холатов 47а,b с высокими выходами. Используя различие в реакционной способности функционхтьных групп при атомах С(3), С(7) и С(12) стероидного остова, проводили регио- и стереоселективное

4 ШХ - 1-П1Дрокси-1,2-бснзиодоксол-3(1Д)-он-1-оксид

восстановление карбонильных групп в соединениях 47а,Ь, с помощью КаВН„. В результате были получены 12-оксопроизводные 48а,Ь с природной стереоконфигурапией при атомах С(3) и С(7), что подтверждалось данными спектроскопии ЯМР'Н и ПС. Взаимодействие соединений 48а,Ь с 50%-иым водным Ш2ОН давало оксимы 49а,Ь с выходами 91 и 72%, соответственно.

При восстановлении оксима 49а с помощью ПСЬ в комбинации с КаВГЬСЫ и последующем введении Вос-защитной группы (для улучшения хроматографического разделения) был получен целевой продукт 50а с выходом 51%, а также Р-изомер 51а (5%), который не вступает во взаимодействие с Вос20, по-видимому, в силу пространственной недоступности аминогруппы. Кроме того, наблюдался частичный гидролиз метилового эфира, приводящий к образованию кислоты 50с (3%). Сравнение результатов предложенного нами метода с классическим каталитическим гидрированием оксима 49а в присутствии РЮ2 показало . что оба метода соизмеримы как по выходам, так и по стереоселектнвности. Деблокирование аминогруппы в соединении 50а позволило получить амфифил 52а с выходом 81%.

Схема 12

52а, я = Мв (31%) 52Ь, я = СцН» (30%)

Реагенты «условия: а) 1ВХ, ОМЭО, 24 "С, 94 ч; Ь) МаВН4, МеОН, 0 "С, 10-30 мин; с) 50%-водн. Ш:ОН, МеОН 65 СС ¡7-48 ч' с1) "ПС1з, №ШН:С1^, Тч'Н^АсО, МеОН, 24 "С, 24 ч, затем Вос20, Е^И, МеОН, 24 С, 5 ч; е) 4МНС1 в диоксане, МеОН, 24 "С, 1 ч;У) Т1СЬ, ЫаВНзСЫ, ЫН4ЛсО, МеОН, 24 °С, 4 ч.

Однако в ходе восстановления оксима 49Ь действием ИСЬ-КаВНзО! в тех же условиях, что и для соединения 49а, наблюдалась его неполная конверсия, а увеличение количества восстановителей приводило к отщеплению тетрадецильного остатка, в результате соединение

50Ь было выделено с выходом 11%. Оптимизируя метод восстановления окснма 49Ь мы отказались от введения Вос-группы и подобрали условия, которые позволили получить целевой амин 52Ь с выходом 30%.

Синтез 3.7-диаминоаналогов холевой кислоты 55а,Ь (схема 13). был осуществлен путем региоселективно! о окисления двух ОН-групп в соединениях 46а,Ь действием 2-кратного избытка 1ВХ, обработки 3,7-диоксопроизводных 53а,Ь избытком 50%-ого водного МН2ОН с последующим восстановлением оксимов 54а,Ь с помощью "ПОл-НаВПСК

Схема 13

о

46а,Ь 3 > ^

53а,Я = Мв (55%) 54а, = Ме (51%) 55а,Я = Ме (45%)

53Ь,Н = С„На(57%) 54Ь,Н = С,дНг9(50%) 55Ь, Р = С„Н29 (45%)

Реагенты и условии: а) 1ВХ. ОМЭО, 24 "С, 20 ч; Ь) 50%-водн. N4,011, МеОН 24 "С 24-50 ч- с) ЮТ-МаВИ.СК, Ш.ЛсО, МсОИ, 24 °С, 4 ч. ' ' ""

Для установления структуры диаминов 55а,Ь была использована двумерная гомоядерная ('Н.'Н-СОвУ) и гетероядерная ('Н,13С-НЗдС, 'Н,13С-НМВС, 'Н^С-НМОС-СОБУ) спектроскопия ЯМР. Поскольку одномерные и двумерные ('Н.'Н-СОЭУ) протонные спектры не позволяют однозначно установить структуру соединений из-за перекрывания сигналов, мы применили модифицированную методику 'Н,1:1С-НМ(2С-С08У, позволяющую отредактировать спектр гомоядерных корреляций по КССВ частотой углерода "С, и, тем самым, избежать перекрывания протонных сигналов. Для соединения 55а было установлено, что сигналы при 3.10 и 3.50 м.д. соответствуют протонам при атомах С(3) и С(7) холанового скелета. Величина КССВ 11.8 Гц сигнала протона при атоме С(3) указывает на его аксиальное расположение, а ширина сигнала прогона при атоме С(7) (22 Гц) свидетельствует об его экваториальной ориентации. Суммируя все данные спектроскопии ЯМР, был сделан вывод, что полученные нами соединения 55а,Ь имеют конфигурацию, аналогичную природной.

2.2. Синтез катонных производных желчных кислот с карбамоильным и сложиоэфирнмм линкерами

На основе холевой и дезоксихолсвой кислот были получены новые представители КА, в которых положительно заряженные группировки связаны с гидрофобным стероидным остовом линкерами различной природы. Для синтеза амфифилов 57а-с и 60 со сложиоэфирным линкером использовали ранее описанную стратегию, основанную на алкилировании органических оснований бромпроизводными гидрофобной компоненты, которая применялась нами при получении КЛ на основе холестерина и днтетрадецилглицерина (см. 1.1.1). Кватернизация пиридина, Лг,А',Л",Л"-тетраметилэтиленднамина и А'Л'-диметилэтаноламина

трибромидом 56 в присутствии йодида натрия давала соединения 57а-с выходами 36-40% (схема 14).

Схема 14

Реагенты и vc.nmm: я) 13r(CH;)jCOCI, Ру, DCM, 25 °С, 2 ч; />) основание, Nal, 70-100 =С, 10-25 ч; с) Nal, MeC(0)Et, 70 °С, 25 ч; J) TFA, DCM, 0 "С, 30 мин.

Для достижения однозначных результатов при кватернизации ЛУУ-диметилэтилендиамина его первичную аминогруппу блокировали Вос-защитой. Алкилнрование амина 58 бромидом 56 и последующее удхтение Вос-защиты давало целевой амфифил 60 с выходом 77% по двум стадиям.

Синтез КА 6-(а-с с карбамоильной связью между азотистым основанием и стероидным остовом (схема 15) проводили путем взаимодействия эфиров 46а и 61а,b с CDI, обработки полученных имидазолидов 62а-с А'.ЛГ-диметилэтилендиамином и дальнейшей кватернизации третичных аминов бЗа-с метилиодндом.

Таким образом, нами были разработаны удобные методы синтеза фасциальных КА на основе холевой и дезоксихолевой кислот, в которых остатки гетероциклических и алифатических оснований соединены со стероидным остовом с помощью карбамоильной и сложноэфирной связей. Кроме того, показано, что синтез моно- и диаминоаналогов холевой кислоты может быть осуществлен путем восстановления оксимов с использованием комбинации реагентов TiCb-NaBHjCN.

о

ь

он

46а, R = ОН, R1 = Me 61а, R = Н, R1 = Me elb,R = H,R, = C,BH37

62а, R = 0C(0)lm. R1 = Me (49%) ■Ц 62b, R - H, R1 = Me (97%) ' 62c, R = H, R' = C,8H37 (93%)

С

О

O^NH / L___NMe3

64a, R = 0C(0)NHCH2CHjN*(Meb Г, R' = Me (99%)

A

63a, R = 0C(0)NHCH2CH2N(Me)2. R1 = Me (34%)

63b, R = H. R1 = Me 63c, R=H. R* = C,8H37

(66%) 64b. R = H, R1 = Me (62%) 64c,R = H,R1 = CieH37

(88%) (70%)

Реагенты и условия', a) CDI, DCM, 50 °C, 30 ч; b) NH4CH,),NMe,, DCM. 50 °C, 25 ч; с) Mel, MeC(0)Et, 70 °C, 20 ч.

3. Скитез катионных амфифилов с углеводными адресными лигандами

Как было отмечено ранее (см. 1.1.2), наличие в структуре КА углеводного фрагмента снижает токсичность и увеличивает коллоидную стабильность липосомальных агентов трансфекщш. Также известно, что остатки углеводов (D-галактоза, D-манноза) могут играть роль адресных лигандов, нацеленных на генатоциты, макрофаги и дендритные клетки. Следовательно, введение углеводного фрагмента в молекулу КА может привести к созданию малотоксичных стабильных липосом для направленной доставки IIK в клетки-мишени. Согласно предложенной компоновке структурных элементов КА (рис. 1), нами были разработаны подходы к синтезу линейных (тип V и VI) и разветвленных (тип VII) амфифилов с углеводными адресными лигандами.

3.1. Синтез мопокатионных углеводсодержащих амфифилов

Описанные в литературе методы синтеза мопокатионных углеводсодержащих амфифилов характеризуются отсутствием вариабельности в выборе структурных компонентов и низкими общими выходами. Нами предложен иной подход, основанный на направленном получении вторичных аминов по реакции Фукуямы (см. раздел 1.2.2), использование которого позволяет варьировать тип гидрофобного домена (остатки тетрадецилового спирта, 1,2-ди-О-тетрадецил-гаг-глицерина и холестерина), а также увеличить выходы целевых соединений. Для связывания катионного, гидрофобного и адресного доменов в единую линейную молекулу углеводсодержащего амфифила (КА V и VI типов, рис. 1) использовали гексаметиленовые спенсеры.

но

"С

65, R = Н

66, R=S02C6H,N02

'R

Ь

68a<d, R2 = ОАс, R3 = Н ^ 69а,Ь, R2 = Н, R3 - O-^p-D-Gal

d,e

7I)a-d,R2 = OH,R3=H 71a,b, R2 = Н, R3 = O-JJ-D-Gal

72a-d, R2 = OH, R3 = H 73a,b, R2 = H, R3 = O-jWD-Gal

a, R1 = — C„H29 b, R' =

fOCnH;9 OC14h2g

c, r1 = -(chjfenh^o-

JOC„H2s OC„H29

,

Реагенты и усчовня: a) 2-N02C6H4S02Cl, El3N, 24 °C, 24 ч; b) СцН2.,Вг или 1,2-ди-О-тетрадецил-З-бром-гаг-глицернн или бромиды 4b,«, Cs,C03, DMF, 80 °С, 3-48 ч; с) 4AtGaIBr а™ 7АЫсВг, CdCOj, Cf,Н„, 80 "С, 7-15ч; d) MeONa/McOH, 24 °С, 30 мин; е) PhSH, К2СО„24 "С, 2 ч; J) Mel, K;C03, MeCOEt, 50 °С, 2.5 ч.

Монокатионпые углеводсодержащие амфифилы 72a-d и 73а,b синтезировали исходя из 6-аминогексанола (65). взаимодействие которого с 2-нитробензолсульфолилхлоридом и олкилирование образовавшегося сульфонамида 66 тетрадецилбромндом, 1,2-ди-О-тетрадецил-3-бром-гас-глицерином или бромидами 4Ь,с в присутствии Cs2CO¡ приводило к амидам 67a-d с выходами 64-86% (схема 16). Гликозклирование соединений 67a-d 2,3,4,6-тетра-0-ацетид-а-0-галактозия- и 2,2',3,3',4',6,6'-геп1а-0-ацетил-а-лактозилбромидом давало целевые продукты 68a-d и 69а,b с выходами от 45% (в случае лактозы) до 69% (в случае галактозы). Сопутствующие а-аномеры были выделены с выходами от 3 до 8%. После удаления защитных групп в соединениях 68a-d и 69а,b и кватернизации вторичных аминов 70a-d и 71а,b избытком йодистого метила монокатионпые гликолиниды 72a-d и 73а,b были выделены с выходами 69-87%, а их структура подтверждена данными спектроскопии ЯМР и масс-спектрометрии.

3.2. Синтез поликатионных углсводсодержаших амфифилов

С целью создания малотоксичных амфифильных агентов трансфекции, способных компактно упаковывать ПК и направленно переносить ее в клетки-мишени, была разработана стратегия синтеза новых углеводсодержащих ПКА 79а-с, включающих остаток- спермина. Амфифилы имели разветвленную компановку структурных элементов (KA VII типа, рис. 1), которая достигалась путем присоединения поликатиоштой н углеводной составляющих к гидрофобному

домену через единое линксрное звено. Ключевой этап синтеза углсводеодержащих ПКА 76а-с состоял в создании базисной структуры неогликолипидов 76а-с, в которую через сукцинильный спейсер вводили остаток спермина (схема 17).

Cxe.ua 17

78а-с

76а-78а, Я1 = = ОАс.

76Ь-78Ь, И1 = И4 = Н, Г?2 = = ОАс

76с-78с, в' = ОАс. = (У1 = Н. ^ = О-^-О-ва!

79Ь, ^ = = Н, = Я3 = ОН

79с, = ОН, = = Н, Р!3= О-Р-И^За!

Реагенты н условия: а) 4-М0;С6Н,502С1, Е131Я, БСМ, 24 °С, 1 ч; Ь) 1.2-ди-О-тетрадецил-З-бром-гас-глицернн, С^СОа, ЭМ!1, 80 "С; с) ,ЛсСа!Вг, м'МапВг или 7АсЬасВг, СйСО,, СЛ. 80 °С, 1.5 ч; О) НС02Ш4> РА'С, МеОН-ТШ (2:1), 60 "С, 30 мин; е) янтарный ангидрид, Е13М, ОМАР, ПСМ, 24 "С, 36 ч;/) три-Вос-спермин 33а, НВТи, 01ЕА, ИМР, 4 °С, 40 мин; ТРА, С'Н2С1,, 24 "С, 3 ч; А) 0.04Л/МеОМа/МеОН, 24 °С. 4 ч.

Неогликолипиды 76а-с были получены путем алкилпрования амида 74 1,2-ди-О-тетрадецил-З-бром-гае-глицерином в условиях реакция Фукуямы и последующего гликозилирования соединения 75 гликознлбромидами. Оптимизация условий реакции гликозилирования позволила получить (3-галактозид 76а и р-лактозид 76с с выходами до 65%, а а-маннозид 76Ь -с выходом 45.%. Восстановление нитрогруппы и последующее ацилирование аминов янтарным ангидридом приводило к сукцинатам 77а-с с выходами 60-65% по двум стадиям.

Конденсация соединений 77а-с с Вос-зашищённым производным спермина 28а с использованием НВТО7 давала конъюгаты 78а-с. Деблокирование аминогрупп в остатке спермина и гидроксильных групп углеводного фрагмента приводило к углеводсодержащим ПКА 79а-с с выходами 55-64% по двум стадиям.

7 НВТи - бЛ(Бск^отриаюл-1-ип1-Лг,Л'.Лг'.Л?-тетра\1стип>-ро)П1Й гсксафторфосфат

Таким образом, нами были разработаны рациональные подходы к получению новых углеводеодержащих КА с различной компоновкой структурных доменов,, которые могут одновременно выполнять функции связывания молекулы нуклеиновой кислоты и ее направленной доставки к клеткам-мишеням.

4. Синтез адресных компонентов модульных липосомальных транспортных систем

Направленная доставка НК может быть также осуществлена с помощью катионных липосом. в состав которых входят два несвязанных ковалентно амфифильных компонента: КА I - IV типов, отвечающий за взаимодействие с НК и ее упаковку, и нейтральный амфифил с адресным лигандом, предназначенный для нацеливания на клетки-мишени. Для создания таких модульных липосом необходимо разработать подходы к получению нейтральных амфифшюв, содержащих нацеливающие лиганды. В наших синтетических исследованиях в качестве адресных лигандов были использованы галактоза и фолиевая кислота, способные связываться с рецепторами клеток печени и опухолевых клеток. Гидрофобный домен представлен, как и в молекулах КА, остатками тетрадеканола. 1,2-диалкилглицерина и холестерина. Для связывания гидрофобной компоненты с адресным лигандом был выбран карбамоильный линкер, а спенсеры различной длины и природы призваны обеспечить подвижность структурных доменов в пространстве.

4.1. Синтез нейтральных неогликолнппдов

Для получения нейтральных амфифилов 81а-с, отличающихся природой гидрофобного домена, использовали реакцию гликозилирования соединений За-с ацетобромгалактозой в присутствии Сс1СОз в качестве промотора (схема 18). Целевые р-галактозиды 80а-с были выделены с выходами 46-70%. Дезацетшшрование галактозидов 80а-с действием метилата натрия в метаноле давало нейтральные неогалактолипиды 81а-с с выходами 76-80%.

Схема 18

сж

'N 0(3 н

- 80а<с, Я1 = Ас -81а-с, Я' = Н

ОС,4Н2Э

V1 V*

Реагенты и условия: а) 2,3,4,6-тетра-0-аиепи-а-0-галакто1транозилбромид, С<1СС)3, С6Н6, 80 "С, 1.5 ч; Ь) 0.1ЛШеО№, МеОН, 24 "С, 4 ч.

Другая предлагаемая нами стратегия сборки нейтральных углеводеодержащих амфифилов из унифицированных структурных доменов основана на использовании диэтилскварата (3,4-диэтоксициклобут-3-ен-1,2-диона) (схема 19). Являясь хемоселективным реагентом,

взаимодействующим с первичными аминогруппами, диэтилскварат позволяет в мягких условиях получать углеводные конъюгаты с высокими выходами.

Схема 19

а (-ОСцНа ь г—ОС14Н29 рОС„Н» <Ч—/>

—- Ьос.-н» —, —- Нос„ня —^ос„н23

х—МНг Н ой

о о о

82 83а-? (57-73%) 84а-Г (72-99%)

Н

Н о Г0С"Ни иос,4н23

Я=Ас(5М9%)

Реагенты и условия-, а) 4-МО;С„}14ОСОС1, 24 "С, 11 ч; Ь) МЬХЖТ:, Е^К 24 "С, 1 ч; с) диэтилскварат, ЕШ, 24 °С, 4 ч; й) Е13М, 24-40 "С, 34-48 ч; е) МеШа/МеОН, 24 СС, 40 мин.

Неогликолипиды 87а-Г синтезировали исходя из 1,2-ди-О-тетрадецнл-гас-глицерина (1Ь), к которому на первом этапе присоединяли спейсеры различной природы и длины путем конденсации активированного производного 82 с различными диаминами. Реакции лшшдных составляющих 83а-Г с диэтилскваратом приводили к образованию монозамещенных продуктов 84а-Г, последующее взаимодействие которых с углеводной составляющей 85 давало конъюгаты 86а-{ с выходами 50-89%. ГГосле удаления ацетильных групп целевые галактозосодержащие липиды 87а-Г были выделены с высокими выходами. Для подтверждения структуры соединений 87а-Г и отнесения сигналов протонов углеводного остатка была использована двумерная гомоядерная корреляционная спектроскопия ЯМР ('Н.'Н-СОБУ).

Таким образом, нами разработаны удобные синтетические подходы к получению нейтральных галактозосодержащих амфифилов, предназначенных для использования в качестве адресных компонент при создании многокомпонентных липидных систем направленной доставки ПК в гепатоциты.

4.2. Синтез липофилъных производных фолиевой кислоты

Быстро развивающиеся или недифференцированные опухоли, в отличие от нормальных тканей, отличаются повышенным содержанием фолатных рецепторов на клеточной поверхности. Поэтому, да я селективной доставки ИК в раковые клетки перспективным является создание транспортных систем, снабженных адресным лигандом на основе фолиевой кислоты. Нами был разработан синтез фолатсодержащих амфифилов 88а-£ которые могут быть использованы в качестве одного из компонентов системы доставки НК в опухолевые клетки

(схема 20). Производные ].2-ди-0-тстрадецил-гаоглннертт 84а-Г с терминальной аминогруппой конденсировали с фолиевой кислотой посредством создания амидной связи. Варьирование типа активирующего агента (ОСС или ТВТО) и соотношения реагирующих веществ, а также оптимизация условий выделения и очистки позволили получить целевые амфифилы 88а-Гс выходами 50-68%.

Схема 20

н2м

Гос»н*> N.

У У1 н

Ьос,«н29

X—ын2 он

° Й0^0Н п ¿1 ^"и23

84а ^ ОСцН29

* «Ли Н I Ъ

Реагенты нусловия: (а) фолиевая кислота, ТВТ1!, 01ЕА, ОМЭО, 45 "С, 2 ч.

Обобщая итоги синтетических исследований, следует отметить, что исходя из структуры самого простого КА I типа, нами был предложен дизайн сложных многофункциональных амфифнльных молекул. Используя широкий арсенал современных методов и конденсирующих агентов, были разработаны универсальные подходы, приводящие к целевым КА заданной структуры с высокими выходами. Совокупность разработанных подходов и методов синтеза представляет собой общую технологическую платформу, которая позволяет в короткие сроки получать различные типы КА. Па основе синтезированных КА сформирована химическая «библиотека» для дальнейшего исследования биологических свойств амфнфилов, изучения супрамолекулярных комплексов с НК и выявления соединений с оптимальным вариантом компоновки и типом структурных доменов.

5. Изучение физико-химических характеристик липосом и их комплексов с нуклеиновыми кислотами

Изучение физико-химических характеристик - размера и поверхностного потенциала (^-потенциала) - липосом и лилоплексов. связанных с их коллоидной стабильностью, является одним из необходимых этапов при создании липосомальных систем доставки НК. В литературе имеются противоречивые данные о влиянии размера липоплексов на эффективность трансфекции, однако эксперименты т то налагают определенные ограничения на размер комплексов в связи с возможностью эмболии сосудов и необходимостью контроля биораспределення частиц в организме при исследовании нового терапевтического средства. В качестве объектов исследования были выбраны монокатионные (10а-с, 11а-с и 15а,с) и поликатионные (34а-с и Зба-с) амфифилы. Для определения размера и ^-потенциала липосом и липоплексов использовали метод динамического лазерного светорассеяния (ДЛС), а изучение

морфологии липосом и липоплексов проводили с помощью трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) и атомно-силовой микроскопии (АСМ).

По данным ДЛС КА Па, Иа-с, 15а,с образуют в водном буферном pací воре частицы с мультимодадьным распределением, размер которых не превышает 300 им. С помощью АСМ было уточнено, что эти частицы имеют форму сфер с диаметром 20-100 нм (рис. 2А). Исключение составляет амфифил 12Ь, размер частиц которого по данным ДЛС доходил до 670 нм. При взаимодействии КА с 20-звенным олигодезоксирнбонуклеотидом формируются более крупные агрегаты с размером 300-700 нм. Комплексы монокатионных амфифилов с ДНК различались по своей структуре и размеру в зависимости от типа используемого КА. Так, в случае соединения 11а образовывались небольшие плотные сферические частицы с диаметром 20-30 нм (рис. 2В), тогда как размер комплексов амфифилов 12а,b с ДНК варьировался от 30 до 120 нм. Амфифилы 12с и 15а,с при взаимодействии с ДНК формируют «рыхлые» глобулы с диаметром 80-220 нм (рис. 2С).

Рисунок 2, Изображения, полученные с помощью АСМ: амфифил 11а (А) и комплексы ДНК с амфифияами 11а (В) и 15а (С). Размер шкалы 100 нм.

Известно, что в большинстве случаев транспорт НК осуществляется более эффективно при использовании катионных липосом (КЛ). а не индивидуальных амфифилов, поэтому были приготовлены КЛ из смесей КА с цвнттер-ионным липидом 1,2-диолеоил-5н-глицеро-3-фосфоэтаноламином (DOPE) в соотношении 1:1 (мольн.). DOPE наиболее часто применяют в качестве липида-помошника в экспериментах но доставке НК. так как его фьюзогенные свойства способствуют высвобождению НК из эндосом в цитоплазму.

Липоеомы, состоящие из монокатионных амфифилов Юа-с, 11а-с и DOPE, имели положительный заряд и характеризовались бимодальным распределением по размерам с преобладанием частиц меньшего размера (табл. 2). Существенные различия были выявлены в случае липосом, сформированных из поликатионных амфифилов 34а-с и Зба-с. Средний гидродинамичекий диаметр КЛ, полученных из несимметричных амфифилов 34а-« и DOPE, составил 65-100 нм, а индекс полидисперсности (ИП) указывал на узкое распределение частиц по размерам. Средний гидродинамический диаметр липосом, состоящих из гемини-амфифилов Зба-е и DOPE, зависел от структуры амфифила (табл. 2). Так, липоеомы Зба-DOPE состояли из

двух фракций частиц, равноценных по количеству, но значительно различащихся по размерам. Для липосом 36Ь-ООРЕ было характерно мономодальное распределение частиц, гидродинамический диаметр которых составил 256 нм. В липосомальной композиции 36с-ООРЕ доля частиц с меньшим размером была приблизительно в 5 раз больше доли частиц с большим размером.

Таблица 2. Средний гидродинамический диаметр и ¿-потенциал кстшонных ттосом

КЛ Диаметр, нм ИП ^-Потенциал, мВ КЛ Диаметр, нм ИП ^-Потенциал, мВ

1 Oa-DOPE 55.4 ± 10.9 129.9 ±32.9 0.218 68.35 34a-DOPE 65.5±11.7 0.256 30.05

ЮЪ-DOPE 70.9 ± 14.9 0.281 62.88 34b-DOPE 77.9+16.6 0.209 39.63

Юс-DOPE 48.4 ±9.9 222.9 ±33.9 0.261 63.55 34C-DOPE 100.5±20.3 0.251 46.57

1 la-DOPE 62.5 ±10.3 154.1 ±31.6 0.220 60.62 36a-DOPE 67.7115.8 4U.7±110.0 0.312 59.50

11 b-DOPE 43.5 ±9.1 148.9 ±28.2 0.257 75.04 36b-DOPE 255.7±63.1 0.318 57.34

[ lc-DOPE 108.6 ±20.9 0.237 59.21 Збс-DOPE 39.1±8.0 108.1*22.9 0.307 56.85

С помощью ТЭМ было выявлено многообразие форм и размеров липосомальных частиц". Были обнаружены полые моно- и мультислойные сферические объекты, которые сильно деформировались при высыхании в вакууме (рис 3).

Рисунок 3. Микроэлекгронпые изображения частиц, обнаруженных в образцах КЛ на основе моно- или поликатионных амфифилов: ÍOa-DOPE (A), 34b-DOPE (В). Збс-DOPE (С).

Характеристики липоплексов, образующихся при взаимодействии катионных липосом с НК. зависели от соотношения компонентов (отношение 1Я/Р количественное соотношение положительно заряженных атомов азота к отрицательно заряженным фосфатным группам НК) и типа НК. Так, по данным ДЛС в случае 25-звенного олигодезоксирибонуклеотида увеличение

s Микромектронные фотографии KJ1 и лилоплсксов были получены сотрудниками НБХ РАН - к.х.н., и.с. Болдыревым И.А. и м.н.с. Алексеевой A.C.

количества липосом на основе монокагионных амфифилов 10а-с и 11а-с (изменение соотношения N/P от 1:2 до 1.2:1) приводило к увеличению размеров комплексов от 130 до 600 им. Уменьшение индекса нолидисперсности (ИП) свидетельствовало об образовании более однородных по размеру частиц, чем исходные лнпосомы. При образовании комплексов с плазмидной ДНК наблюдалась иная картина: при соотношении N/P = 1:1 образовывались крупные частицы с широким распределением по размеру (300-2000 нм), а увеличение доли катионных липосом до N/P = 2:1 приводило к уменьшению размеров частиц и значений ИП, что свидетельствует о комлакгизации и стабилизации липоплексов. Комплексы становились более гетерогенными по составу с ростом отношения N/P до 4:1.

Существенные различия были выявлены при изучении комплексов, сформированных ДНК и липосомами, состоящими из ПКА 34а-с и Зба-с. При взаимодействии липосом 34a-c-DOPE с ДНК независимо от соотношениях N/P происходило образование положительно заряженных комплексов с размерами 120-180 нм, при этом уменьшение ИП свидетельствовало о повышении их упорядоченности по сравнению с липосомами. При формировании комплексов ДНК с липосомами Зба-c-DOPE при соотношении N/P = 2:1 возникали крупные полвдисперсные частицы (500-3000 нм) с отрицательным поверхностным зарядом. Увеличение количества липосом (до N/P = 4:1 и 6:1) приводило к уплотнению комплексов и возникновению положительного заряда на поверхности, Следует отметить, что комплексы ДИК с липосомами Збс-DOPE, полученные при соотношенях N/P = 4:1 и 6:1, имели наименьший размер среди всех липоплексов на основе гемини-амфифилов Зба-с.

Визуализация строения липоплексов, сформированных при различных соотношениях N/P, выявила их отличительные морфологические особенности. Как показали данные ТЭМ, независимо от структуры КА и формы исходных КЛ все комплексы имели ламеллярное строение, что говорит о ключевой роли НК в формировании липоплекса. Например, лнпоплексы ДНК/1 la-DOPE при соотношении N/P = 1:1 состояли из нескольких плотно прилегающих друг к другу деформированных липосом и небольших участков упорядоченной ламеллярной фазы (рис. 4 А). По-видимому, агрегация и деформация липосом происходит за счет адсорбции нитей ДНК на их катионной поверхности. При увеличении доли липосом в комплексе (N/P = 2:1) в центре липоплекса формируется массив ламеллярной фазы, а на его периферии присутствуют деформированные липосомы (рис. 4 В). При дальнейшем увеличении соотношения N/P до 4:1 липоплексы уменьшаются в размере, и все липосомы реорганизуются в протяженные ламеллярные липоплексы (рис. 4 C,D).

Для комплексов ДНК с несимметричными ПКА 34а-с при соотношении N/P = 2:1 также характерно мультиламеллярное строение с замкнутыми контурами ламелл (рис. 4 Е). Однако при соотношении N/P = 6:1 (рис. 4 F) в образцах присутствовало большое количество деформированных липосом, плотно прилегающих друг к другу, а также небольшие участки ламеллярной фазы. Таким образом, в отличие от липоплексов, полученных на основе

монокатионных амфифилов 11а. для комплексов ДНК с несимметричными ПКА 34а-с не характерно возрастание доли ламеллярной фазы при увеличении соотношения Ы/Р.

В случае гемини-амфифилов 36а-с повышение соотношения №Р не приводило к существенным изменениям морфологии липоплексов. Для комплексов ДНК/Збс-СЮРЕ ламеллярная фаза не выражена явно, однако, несмотря на аморфность, среди них обнаружены регулярные структуры, отличающиеся от других липоплексов этой группы (рис. 4 О).

Рисунок 4. Микроэлектроники изображения комплексов плаэмидной ДНК с катионными липосомами. 11 a-DOPH при соотношении N/'P = 1:1 (А), N/P = 2:1 (В) и N/P = 4:1 (С, D); с липосомами 34b-DOPE при соотношении N/P = 2:1 (Е) и N/P = 6:1 (F); с липосомамии Збс-DOPF. при N/P = 2:1 (G).

В результате исследований морфологии липоплексов с помощью ТЭМ была сформирована библиотека микроэлектронных фотографий для 33 образцов липоплексов (более 500 изображений), анализ которых позволил сформулировать общие закономерности образования комплексов между НК и КЛ:

- вне зависимости от структуры используемого КА и формы КЛ при взаимодействии с НК образуются комплексы ламеллярной структуры;

- липоплексы, образованные КЛ и ДНК при низких соотношениях N/P, характеризуются большими размерами, чем исходные лииосомы. Структура липосом может не нарушаться, а молекулы ДНК связываются с их неверностью за счет электростатических взаимодействий, что приводит к формированию крупных агрегатов;

- при увеличении соотношения N/P липоплексы переформировываются в более компактные и однородные частицы с ламеллярной структурой. Для моиокатионных амфифилов образование ламеллярной структуры происходит легче (при более низких соотношениях N/P), чем для иоликатионных амфифилов.

6. Изучение связи между структурой катиониых амфифилов и их биологическими свойствами. Создание липосомальных систем доставки ПК9

Для достижения основной цели работы ..... создания липосомальных систем доставки

различных типов НК в эукариотические клетки - необходимо провести комплекс исследований по изучению биологических свойств полученных КЛ и формируемых ими супрамолекулярных структур с НК. Данные исследования должны не только выявить соединения, способные эффективно переносить НК, но также установить влияние структурных компонентов КА на прояштяемые ими свойства, что в конечном итоге позволит сформулировать требования к структуре амфифила как перспективного агента трансфекции.

В связи с наличием внеклеточных и внутриклеточных барьеров, а также требованием биосовместимости, при разработке липосомальных систем доставки НК необходимо определять токсичность КА и липосом на их основе, а также эффективность транспорта НК. Таким образом, все биологические исследования можно разбить на 2 основные этапа: 1) изучение цитотоксичности КА и их липосомальных композиций, 2) изучение доставки НК в клетки с помощью КА и их липосомальных композиций и сравнительная оценка эффективности этого процесса в ряду исследуемых КА.

Цитотоксичность КА и липосом на их основе оценивали с помощью МТТ-теста, используя клетки почки эмбриона человека (НЕК 293), фибробластомы ночки сирийского хомячка (линия ВНК) и аденокарциномы шейки матки человека (HeLa). По результатам МТТ-теста были определены значения ICjo - концентрации соединения, при которой выживает 50% клеток.

Для оценки эффективности трансфекции в качестве объектов были выбраны короткий 25-звенный олигодезоксирибонуклеотид, меченый по 5'~концу флуоресцеином (FITC-ODN), илазмидная ДНК pEGFP-C2 (4700 и.о.), кодирующая зеленый флуоресцентный белок (EGFP) и малая интерферирующая РНК (siRNA, 21 и.о.), способная разрушать мРНК EGFP, который стабильно экспрессируется трансгенными клетками ВНК 1R-780. Использование такого набора НК позволяет оценить эффективность трансфекции на всех этапах, начиная от проникновения НК через плазматическую мембрану, накопления во внутриклеточном пространстве

'' Биологические исследования проведены при участии автора в лаборатории биохимии нуклеиновых кислот 11ХБФМ СО РАН под руководством д.б.н.. проф. Зснковой М.А.

(FITC-ODN) и заканчивая высвобождением НК из эндосомального и липидного окружения (ДНК, siRNA) и экспрессией трансгена (ДНК). Эксперименты по доставке НК проводили при варьировании соотношения N/P (количественного соотношения положительно заряженных атомов азота к отрицательно заряженным фосфатным группам НК), которое является одним из факторов, влияющих на эффективность трансфекции. Доставку НК в клетки регистрировали с помощью проточной цитометрни, определяя процент транефшшрованных клеток (эффективность проникновения в клетки) и среднее значение интенсивности флуоресценции в клеточной популяции (эффективность трансфекции клеток). Эффективность доставки ПК амфифилами сравнивали с эффективностью коммерческого препарата Lipofectamine 2000 (Lf2000, Invitrogene Inc.), который признан «золотым стандартом» среди трансфицирующих реагентов.

6.1. Трансфицирующая активность моиокатионных амфифнлов

С целыо выяснения зависимости трансфицнрующей активности от природы линкера, катионного домена и длины спейсера был исследован ряд а.мфифилов 11а, 12а-с, 15а,с, в которых гетероциклический катионный и гидрофобный холестериновый домены связаны карбамоильным, сложноэфирным и Л',0-ацетальным линкерами. Согласно данным МТТ-теста тип линкера и катионной группировки не оказывает значительного влияния на цитогоксичность исследуемых КА. В отсутствие сыворотки крови (далее сыворотка, FBS) значения 1С*> в отношении клеток HeLa лежали в диапазоне 15-18 рМ, для клеток НЕК 293 - от 27 до 36 р.М, для клеток ВНК - от 17 до 23 рМ. Наличие сыворотки в ростовой среде практически не изменяло цитотоксичность КА. Для сравнения значения IC50 Lf 2000 составляют 7 рМ в отношении клеток HeLa и 22 цМ для клеток НЕК 293. Таким образом, амфифилов 11а, 12а-с, 15а,с проявляют меньшую токсичность, чем Lf 2000.

При изучении трансфекшш клеток НЕК 293 выявлено, что структура КА влияет на эффективность проникновения и накопления FITC-ODN в цитоплазме (таблица 3). Наибольшей способностью доставлять в клетки FITC-ODN характеризуется амфифил 11а, содержащий катионную головку лиршшниевого типа и карбамоильный линкер, а минимальной активностью обладает соединение 15с с МО-ацетальным линкером и .V-метилморфолшшевой группировкой. При этом сравнение исследуемых амфифилов с Lf 2000 показало, что при использовании в качестве агентов трансфекции КА 11а, 12а-с, 15а,с FITC-ODN хуже накапливается в клетках, о чем свидетельствуют низкие значения интенсивности флуоресценции.

В опытах по доставке ДНК, кодирующей EGFP, наибольшую активность проявили соединения с ниридиииевой и Л-метилимидазолиевой группами (На, 12а,Ь) (таблица 3). Важно отметить, что лип ид 11а по способности доставлять ДНК в клетки немногим уступает Lf 2000, однако среднее значение интенсивности флуоресценции (то есть уровень экспрессии гена EGFP) при его использовании было в 3-4 раза ниже, чем в случае Lf2000.

Таблица 3. Эффективность доставки FITC-ODN и тазмидной ДНК в клетки НЕК 293

Катионные амфифилы ,_ FITC-ODN ДНК

без FBSn + 10% FBS без FBS + 10% FBS

Трансф. клетки,% 1фл., отн. ед.2) Трансф. клетки,% 1фл., отн. ед. Трансф. клетки.% 1фл, отн. ед. Трансф. клетки,% 1фл., отн. ед.

11а 89.7 : 21.5 46.9 : 18.4 19.6 14.2 12.7 11.5

12а 92.5 5.2 51.3 1.3 11.1 8.1 3.3 6.9

12Ь 89.3 2.7 33.3 1.4 14.2 ^ 10.3 7.6 : 5.4

12с 81.2 6.2 42.4 2 6.5 4.4 3 2.1

15а 79.9 3.5 57.7 1.1 7.3 6.2 2.5 3.9

15с 37.6 4.3 29.8 3 4.1 3.6 3.8 3.5

Lf 2000 92.6 45 86.6 25.4 26.2 50.1 28.9 43.7

' Эмбриональная бычья сыворотка

21 Среднее значение интенсивности флуоресценция в клеточной популяции. Стандартное отклонение не превышало 7%.

Было установлено, что трансфицирующая активность исследованных КА коррелирует с размерами формируемых ими комплексов с НК. Небольшие комплексы с узким распределением по размеру, образованные ДНК и амфифилом 11а (см. раздел 5), обеспечивают более высокую эффективность трансфекции, чем комплексы с размерами около 200 им, характерные для амфифилов 12с и 15а,с. Таким образом, в ряду КА 11а, 12а-с, 15а,с, различающихся природой катионных доменов, линкеров и длиной спейсеров, наиболее перспективным оказался амфифил 11а с пиридиниевой катионной «головкой», линкерной группой карбамоильного типа и гексаметиленовым спейсером.

6.2. Трансфицирующая активность лнпосом на основе монокатнонных амфифилов

Продолжая структурно-функциональные исследования в ряду монокатионных амфифилов, мы изучили токсичность п трансфицирующую активность катионных лнпосом, состоящих из наиболее удачного амфифнла 11а, его структурных аналогов - соединениями 9а-с, 10а-с и lib,с и цвип ер-ионного лшгада 1,2-диолеоил-.ул-пшцеро-3-фосфоэтаноламином (DOPE) в соотношении 1:1 (мольн.). Выбранные амфифилы имеют одинаковый спейсер и линкерную группу, но различаются типом гидрофобного и катнониого доменов, что позволяет выяснить влияние структуры последних на биологическую активность КА.

Результаты МТТ-теста показали, что цитотоксичность амфифилов 9а-с, 10а-с и 11а-с определяется только структурой их гидрофобного домена, а не природой катионной группировки. Так, амфифилы с одним тетрадецильным остатком 9а-с обладали большей токсичностью в отношении всех типов клеток по сравнению с их диглицериднымй (10а-с) и холестериновыми (11а-с) аналогами. Использование KJI, состоящих из амфифилов 9а-с, 10а-с и 11а-с с DOPE, повышало выживаемость клеток, однако липосомы на основе амфифилов 9а-с проявляли ярко выраженный токсический эффект, поэтому они были исключены из дальнейших биологических испытаний. В отношении клеток НЕК 293 липосомы на основе КА 10а-с и 11а-с были нетоксичными вплоть до концентраций 80 рМ.

Все исследуемые КЛ способствовали накоплению ПТС-СЮК в 80-90% клеток как в отсутствие, так и в присутствии сыворотки в клеточной среде, при этом эффективность трансфекции была сравнима или превышала эффективность ЬГ2000 (таблица 4). Максимальные значения средней интенсивности флуоресценции в отсутствие сыворотки наблюдались для липосом с амфифилами 10Ь, 10с и 11с, которые содержат в качестве катионного домена Л-мстилимидазолиевую или А'-метнлморфолиниевую группировки. В присутствии сыворотки эффективность накопления РГГС-СЮМ в клетках ПЕК 293 снижалась, однако это изменение не было существенным для липосом 10с-ГХ)РЕ и 11 с-ООРЕ на основе амфифилов с Лг-метилморфолиниевой группой. Также важно отметить, что при использовании данных липосом, эффективность трансфекции комплексами с РГГС-СЮК превышала в 2.5-3 раза эффективность ЬГ2000.

Таблица 4. Эффективность доставки FITC-ODN и тазмидной ДНК в клетки НЕК 293 _с помощью катионных липосом'*_

Катионные липосомы FITC-ODN ДНК

без FBS + 10% FBS без FBS + 10% FBS

Трансф. клетки,% 1Ф„ OTII. ел/' Трансф. клетки,% 1фл., оти. ел.2) Трансф. клетки, % 1фл , оти. ед."' Траисф. клетки,% 1ф„ отн. ед.2'

10a-DOPE 88.1 202 96.6 110 26.8 7.5 12.8 4.3

lOb-DOPE 93.8 302 87.3 127 26.6 8.0 10.8 3.6

lOc-DOPE 86.4 292 88.9 243 26.8 3,8 10.9 3.9

lla-DOPE 91.2 85.5 н.о. и.о. 18.4 15.1 11.6 30.8

llb-DOPE 88.6 96.9 и.о. и.о. 21.5 8.1 11.9 12.9

llc-DOPE 88.7 288 77 211 16.4 15 6.6 25.1

Lf2000 92.6 107 44.8 84.3 65.1 158 53.6 136

" В таблице проведены данные по доставке FITC-ODN при соотношении N/P = 1:1 и плазмидной ДНК при соотношении N/P = 2:1. Стандартное отклонение не превышает 7%.

Среднее значение интенсивности флуоресценция в клеточной популяции, и.о. - значения не определялись

В экспериментах по доставке плазмидной ДНК было показано, что максимальные значения средней интенсивности флуоресценции наблюдаются для липосом lla-DOPE и llc-DOPE, несмотря на меньший процент трансфицированных клеток по сравнению с липосомами 10а-с-DOPE (таблица 4). В присутствии сыворотки количество трансфицированных клеток уменьшалось во всех случаях, однако для холсстсринсодержащих амфифилов 11а-с было характерно увеличение значений интенсивности флуоресценции. Данные результаты позволяют предположить, что для осуществления доставки ДНК в присутствии сыворотки крови предпочтительно использовать КА с холестерином в качестве гидрофобного домена. Все исследованные КЛ уступали по эффективности Lf 2000.

Чтобы оценить влияние углеводного спенсера на биологические свойства амфифилов, нами были проведены исследования для КА 23a-d, содержащих в качестве спейсерой группы остаток D-глюкозы. Как и ожидалось, данные амфифнлы и катионные липосомы на их основе оказались менее токсичными р отношении клеток ВНК (IC50 дая КА 23a-d составляет 20-35 цМ. для

катконных липосом - более 100 рМ) по сравнению с их монокатионными аналогами. Результаты экспериментов по доставке ПТС-ООК свидетельствовали, что в качестве переносчиков могут использоваться только КЛ, а не индивидуальные амфифилы, при этом эффективность трансфекции липосомами 23с1-ВОРЕ сравнима с эффективностью Lf 2000.

Таким образом, на данном этапе исследований было устано&тено, что лнпосомы на основе КА с А'-метилморфолиииевой группировкой были эффективнее У 2000 в экспериментах по накоплению РГГС-СЮН и не теряли своей активности в присутствии сыворотки крови. Для осуществления транспорта ДНК в присутствии сыворотки лучше использовать КА, содержащие в качестве гидрофобного домена холестерин. Однако, низкая эффективность доставки ДНК по сравнению с ЬГ 2000 свидетельствует о том, что исследованные монокатионные амфнфнлы и липосомы на их основе могут иметь ограниченное применение в качестве трансфицирующих реагентов'.

6.3. Биологические свойства поликатиоинмх амфифилов

Среди полученных в рамках данной работы ПКА (см. 1.2, 2.2 и 3.2) для изучения биологических свойств нами были выбраны амфифилы с катионным доменом на основе спермина. Наличие четырех аминогрупп в молекуле спермина позволяет использовать меньшее количество амфифила для формирования липоплексов, а также снизить деградацию НК внутри эндосом.

6.3,1. Доставка нуклеиновых кислот с помощью углеводсодержащего поликатионного амфифила

В качестве первого объекта был выбран амфифил 79а, содержащий остаток галактозы. Данное соединение хорошо растворяется в воде за счет наличия углеводного фрагмента, что позволяет избежать необходимости приготовления липосом и изучать его свойства в индивидуальном виде. Исследование цитотоксичности с помощью МТТ-теста показало, что значения 1С50 амфифила 79а варьируются от 18 до 21 рМ в отсутствие сыворотки и от 36 до 42 рМ в присутствии сыворотки. Эти значения превышают значения 1С50 монокатионных амфифилов, свидетельствуя о том, что введение углеводного остатка, как и ожидалось, снижает цитотоксичнось амфифила.

Амфифил 79а способствовал проникновению Р1ТС-ООМ в эукарнотическне клетки НЕК 293 и ВНК и накоплению в цитоплазме как в отсутствие, так и в присутствии сыворотки с эффективностью, превосходящей эффективность 2000 (таблица 5). Эффективность доставки плазмидной ДНК в клетки НЕК 293 в бессывороточной среде была сравнима с эффективностью ЬГ 2000, однако в присутствии сыворотки количество трансфицированных клеток и средняя интенсивность флуоресценции значительно снижались, что свидетельствует об ннгибирующем действии компонентов сыворотки на транспортные свойства ПКА 79а.

Таблица 5. Доставка различных типов ПК с помощью _поликатионного амфифта 79а_

НК 10% FBS Lf2000 Амфнфил 79а

Трансф. клетки.% 1фл., отн. ед. Трансф. клетки, % 1фл., отн. ед.

FITC-ODN 75.4 2714 63.3 4198

+ 72.7 1654 94.6 13243

ДНК - 29 7512 31.2 5108

+ 27 8295 2.9 406

siRNA - 39.8" - 49.4° -

+ 45.4" - 19.6" -

''Процент иефлуоресцирующих клеток ВПК IR-780 указывает па подавление экспрессии гена EGFP под действием siRNA.

Эффективность доставки siRNA амфифилом 79а в трансгенные клетки ВНК IR-780, определяемая по ингибированшо биосинтеза EGFP, в бессывороточной среде была выше, чем эффективность Lf 2000 (таблица 5). Однако, наличие сыворотки крови в клеточной среде снижало эффективность транспорта siPIlK в 2.5 раза при использовании ПКА 79а, в то время как способность Lf 2000 переносить siRNA не изменялась.

Таким образом, амфнфил 79а с углеводным остатком и катионным доменом на основе спермина, показал себя перспективным соединением, обладающим низкой токсичностью и способностью эффективно доставлять различные типы НК в эукариотнческие клетки in vitro в бессывороточной среде.

6.3.2. Доставка нуклеиновых кислот с помощью холестериисодержащих полнкатионных амфифилов

Поликатионные амфифилы 34а-с и 36а-с являются удобными объектами, позволяющими установить влияние структурных особенностей молекулы (количества гидрофобных доменов, типа линкерной группы и длины спейсера) на цитотоксичность и трансфицирующую активность. Как и в случае монокатнонных амфифилов, были исследованы липосомы, состоящие из ПКА 34а-с и Зба-с и DOPE в мольном соотношении 1:1.

Изучение цитотоксичности показало, что тип линкерной группы и длина спейсера в молекуле ПКА по-разному влияют на способность ингибировать рост эукариотических клеток в диапазоне концентраций от 1 до 80 рМ. Катионные липосомы проявили различную токсичность в отношении выбранных клеточных линий. Так, значения iCjo амфифилов 34а-с и Зба-с в отношении клеток ВНК составили 15-19 рМ в отсутствие сыворотки и 16-31 рМ в присутствии сыворотки. Выживаемость клеток HeLa и НЕК 293 была выше (1С5о 35-40 рМ). Важно отметить, что для всех липосом, кроме 34c-DOPE, цитотоксичность в присутствии сыворотки была ниже, чем в бессывороточиой среде.

В продолжение исследований по поиску эффективной системы доставки НК было проведено изучение способности КЛ на основе ПКА 34а-с и Зба-с трансфицировать клетки НЕК 293. В

случае доставки Р1ТС-ООК наибольшая эффективность была отмечена для липосом 34Ь-ВОРЕ и Зба-ООРЕ,- содержащих амфифилы с карбамоилышм и сложноэфирным линкерами и тетрамегиленовым спейсером. Сыворотка крови снижала активность несимметричных ПКА 34а-с, но не влияла на активность гемини-амфифилов Зба-с. По совокупности результатов проникновения и накопления Р1ТС-СЮ]\! в присутствии и отсутствие сыворотки, КЛ с гемини-амфифилами 36а и 36с доставляют олигонуклеотид в 90% клеток с эффективностью большей, чем эффективность 2000 (табл. 6).

Исследование доставки плазмидной ДНК в клетки НЕК 293 в бессывороточной среде позволило установить, что наибольшей активностью обладают лшюсомы на основе несимметричных амфифилов 34а,Ь. а также гемини-амфифила 36с (рис. 5). Эффективность этих липосом превосходит таковую для ЬГ 2000, Данные по трансфекции клеток плазмидной ДНК в присутствии сыворотки крови показывают, что липосомы с амфифилами 34Ь (тетрамешленовый снейсер) и 36с (гексаметиленовый спейсер), содержащими карбамоильный линкер, сохраняют свою активность, в то время как остальные КЛ ее теряют (табл. 6).

ШЫ!Р = гл И N/P = 4:1 С MfP = 6.1

£ SO 3 я

ш й щ

М $ щ

-I- щ Ж Mm Щ......щ t §§ Щ й-м

Lf 2000 34а- 34Ь-DOPE DOPE

34С-DOPE

36а-DOPE

36Ь-DOPE

36с-DOPE

34а- 34Ь- 34с- 36а- 36Ь- 36с-DOPE DOPE DOPE DOPE DOPE DOPE

Рисунок 5. Доставка плазмидной ДНК в клетки НЕК293 с использованием катионных липосом в отсутствие сыворотки крови. Процент трансфнцированных клеток (А) и уровень средней интенсивности флуоресценции в популяции (В) измеряли с помощью проточной цитомегрии через 48 ч после инкубации клеток с липоплексами. Стандартное отклонение не превышает 6%.

Таблица 6. Эффективность доставки различных типов ЯКе клетки НЕК 293 с помощью

Катиошше липосомы FITC-ODN pDNA siRNA11

N/P Трансф. клетки,% 1фя, OTH. ед. N/P Трансф. клетки, % 1фл„ огн. ед. N/P Ингибирование экспрессии EGFP, %

34a-DOPEj - И.О. н.о. 4:1 29.6 21.4 10:1 67.7

346-DOPE 2:1 81.74 69,9 6:1 44.2 42.1 20:1 83.0

34c-DOPE 2:1 79.9 108 4:! 18.9 8.1 15:1 81.3

36a-DOPE 4:1 91.9 192.5 4:1 21.5 5.9 10:1 27.2

36b-DOPE 4:1 72.1 89.25 6:1 21.8 3.3 10:1 20.6

36c-DOPE 4:1 88.1 mm 6:1 75.7 42.0 8:1 12.1

Lf2000 - 40.6 34.3 - 31.4 17.2 - 19.9

Ингибирование экспрессии EGFP в трансгенных клетках ВНК. 1R-780 в % по Отношению к контролю

Поиск зависимости между эффективностью доставки ДНК и размером дипоплексов не выявил четкой корреляции между этими параметрами. Связь между величиной ^-потенциала и эффективностью трансфекции была более очевидна: отрицательно заряженные или нейтральные комплексы, образующиеся при низких значениях N/P имели низкую эффективность доставки. Увеличение соотношения N/P приводило к формированию положительно заряженных лмпоплексов, что позволяло им более эффективно взаимодействовать с отрицательно заряженной клеточной мембраной и поглащаться клетками.

Результаты экспериментов по трансфекции клеток ВНК 1R-780 липоплексами с siRNA показали, что в отсутствие сыворотки крови все ЮТ способствуют доставке siRNA в трансгенные клетки, что приводит к ингибированию биосинтеза EGFP (рис. 6А). Однако, липосомы с гемини-амфифилами Зба-с проявляли свое действие при более низких соотношениях N/P с эффективностью сравнимой или превосходящей эффективность L f 2000. Наличие сыворотки приводило к полной потери активности несимметричных амфифилов 34а-с, в то время как активность амфифилов Зба-с не изменялась (рис. 6В). Следовательно, присутствие двух остатков холестерина в молекуле ГТКА является необходимым условием для осуществления эффективной доставки siRNA.

Lf 2000 -л-зоь-ооре 34a-DOPE -»~34c-DOPE

-О— Зба-DOPE -о-Збс-ООРЕ -*— 34b-DOPE

Lf 2000 -o— 36a-DOPE (1:1}

-¿i-36b-DOPE(1:1) -a—Збс-DOPE (1:1)

-•—34a-DOPE (1:1) -<-34b-DOPE (1:1) -B-34c-DOPE(1:1)

Рисунок 6. Ингибирование эксперссии EGFP в клетках BUK IR-780 в экспериментах по доставке комплексов siRNA с катионными липосомами, сформированных при различных соотношениях N/P в отсутствие (А) и присутствии сыворотки крови (В), стандартное отклонение не превышает 6%.

Для исследования трансфицирующей активности КЛ в условиях in vivo проводили изучение внутривенной доставки комплексов иммуностимулирующей: РНК (isRNA) и липосом Збс-DOPE в организм мышей линии CBALac/'Sto. Эффективность доставки оценивали, измеряя уровень интерферона-a (ИНФ-а) и цитокинов: интер лейки на-6 (ИЛ-6) и фактора некроза опухоли (ФНО) в крови мышей (рис. 7). При внутривенном введении комплексов isPHK как с Lf 2000.

LF

2000

Lf 3:1 2000

так и с липосомами Збс-ООРЕ значительной индукции цитокинов воспаления (ИЛ-б и ФИО) не наблюдалось. Комплексы ¡вРНК с Збс-ЭОРЕ вызывали повышение уровня ИНФ-а в 50 раз по сравнению с контролем, и в 3 раза по сравнению с и 2000, что свидетельствует о зависимости уровня индукции интерферона от типа траисфицирующего реагента.

Рисунок 7. Индукция цитокинов ИФИ-а (белые столбцы), ИЛ-6 (серые столбцы) и ФНО-а (черные столбцы) в сыворотке крови мышей линии CBALac/Slo препаратами ssPHK (10 мкг/мышь) в комплексе с Lf 2000 или липосомами Збс-DOPE при внутривенном введении.

Таким образом, анализируя результаты доставки НК in vitra, представленные в таблице 6, была выявлена связь между структурой ПКА и его трансфицирующей активностью. Так, среди всех исследованных ПКА гемини-амфифил 36с, содержащий два остатка холестерина, связанных с катиониым доменом через гексаметиленовые спейсеры с помощью карбамоильных линкеров проявляет наилучшие трансфицирующие свойства, а липосомы на его основе обеспечивают эффективную доставку и выполнение биологических функций различных типов НК. Результаты доставки isRNA в условиях in vivo позволяют рассматривать лилосомальную композицию Збс-DOPE как замену существующих коммерческих трансфектантов, и как перспективного кандидата для дальнейших медицинских исследований.

6.3.3. Разработка липосомальной системы доставки НК в дендритные клетки50

Дендритные клетки (ДК) являются наиболее мощными антиген-презентирующими клетками, способными представлять новые антигены неактивированным Т-клеткам, тем самым, запуская антиген-специфичный иммунный ответ. Иммунизация организма ДК, нагруженными опухоль-связанными антигенами (ОСА), представляет собой перспективный подход в создании онковакцин. направленных на распознавание, атаку и уничтожение опухолевых клеток собственной иммунной системой организма. ДК, трансфицированные НК, кодирующими ОСА,

10 Эксперименты по -трансфекции дендритных клеток выполнены сотрудниками лаборатории биохимии нуклеиновых кислот ИХЬФМ СО РАИ асп. О.О. Марковым и к.6.н., с.н.с. Н.Л. Мироновой (рук. д.&.н.. проф. Зеикова М.А.)

способны к длительной экспрессии антигена в иативной форме и презентации всех его эпитопов посредством главного комплекса гистосовместнмости класса I, что приводит к активации цитотоксичяых Т-лимфоцитов. ДК являются сложными объектами для трансфекции из-за измененной способности захватывать антнгены при созревании. Несмотря на огромное количество сконструированных систем доставки НК в ДК, проблема эффективного переноса

I

НК и экспрессии антигенов окончательно не решена.

С целью поиска эффективных систем доставки НК в ДК и выявления структурно-функциональных зависимостей были изучены свойства КЛ на основе ПКА 36с и 34Ь, проявивших максимальную активностью в экспериментах по доставке ДНК in vitro, а также их аналога 36d, содержащего в качестве гидрофобной составляющей остаток 1,2-дитерадецилглицерина. Кроме того, для исследования влияния дисульфидной группы на эффективность доставки была исследована трансфицирующая активность КЛ на основе ' амфифплов 42а,Ъ и 45.

Способность КЛ опосредовать доставку мРНК. кодирующей EGFP. при различных I соотношениях N/P была изучена на C'DI 1с+ предшественниках ДК и незрелых ДК. Результаты показали, что эффективность трансфекции CD11 с+ предшественников комплексами катионных липосом и мРНК (N/P = 2:1) в несколько раз превышала эффективность Lf 2000 (рис. 8 А,В). Кроме того, эти эксперименты позволили выявить КЛ. приводящие к высокой экспрессии EGFP, которые затем были использованы для трансфекции незрелых ДК (рис.8 C,D).

Анализ связи между эффективностью доставки РНК и структурными праметрами КА (тип гидрофобного домена, количество остатков холестерина, наличие дисульфидной связи) позволил выявить сходные зависимости как в случае трансфекции CDllc+ предшественников ДК, так и незрелых ДК (рис. 8). Липосомы Збс-DOPE и 36d-DOPE обладают сходной активностью, следовательно, в ряду гемнни-амфифилов тип гидрофобного домена не оказывает существенного влияния на эффективность трансфекции. Наличие в структуре КА двух гидрофобных Доменов положительно влияет на эффективность трансфекции in vitro. Так, невысокие значения интенсивности флуоресценции для липосом с амфифилом 34Ь с одним остатком холестерина, по сравнению с геминн-амфифилом 36с, свидетельствуют о низкой экспрессии EGFP. При анализе результатов доставки РНК липосомами на основе дисульфидных амфифилов 42а,b и 45 и их аналога 34Ь, несодержащего S-S-группы, выявлено, что липосомы с соединениями 42а,b и 45 трансфицируют меньшее количество клеток по сравнению с липосомами 34b-DOPE, однако более высокие значения интенсивности флуоресценции говорят о высокой экспрессии EGFP, что, возможно, является результатом более эффективного высвобождения РНК вследствие разрушения дисульфидных связей в молекулах амфифилов под действием внутриклеточных восстановителей.

Для изучения противопухолевой активности in vivo ДК, нагруженных РНК, кодирующей опухоль-ассоциированные антигены (ОСА), были использованы КЛ с амфифилами 34Ь и 36с,d. На первом этапе ДК трансфицировали липоплексами, сформированными КЛ и суммарной РНК, выделенной из клеток меланомы В16 (источник ОСА), а затем вводили в виде внутривенных инъекций в хвостовую вену мышей С57В1 с индуцированной меланомой В16 и определяли количество метастазов в легких. Разовое введение таких ДК в организм животных приводило к 3-4-х кратному уменьшению количества метастазов в легких, по сравнению с контрольной группой и к 2-х кратному - по сравнению с группой животных, получивших инъекцию ДК, трансфицированных комплексами PHK/Lf 2000 (рис. 9). Для ДК, трансфицнрованных с помощью липосом 34b-DOPE противоопухолевая активность была выражена в меньшей степени.

Изучение противоопухолевой активности ДК, загруженных РНК, кодирующей ОСА, выявило, что ингибирование развития метастазов связано с количеством трансфицированных незрелых ДК и экспрессией трансгена (рис. 8), предполагая прямую зависимость между количеством и уровнем трансфекции ДК, уровнем презентации антигена и интенсивностью иммунного ответа против опухолевых клеток. Полученные результаты позволяют рассматривать новые катионные липосомы Збс-DOPE и 36d-DOPE в качестве высоко эффективных реагентов для трансфекции ДК нуклеиновыми кислотами, а в перспективе эти липосомы могут использоваться для создания онковакцин нового поколения.

160 л

х 140 £

5 120

п

а

8 юо

/3=0.032

р=0.000Э

р=0.00002

75±16 О

р=0.0s

43Í11

°о

27±7 О л

1744

О

о-п

в"'

о

Контроль Lf2000

Збс-DOPE 36d-DOPE 34ЫЮРЕ

Рисунок 9. Подавление роста метастазов у мышей линии C57BL при внутривенном введении ДК, нагруженных комплексами КЛ и РНК(В16). Контрольная груши мышей получала физиологический раствор. **- данные статистически незначимые.

Таким образом, совокупность всех результатов биологических исследований in vitro и in vivo, проведенные для амфифилов, отличающихся строением структурных элементов и способом их компоновки, позволяют сформулировать структурные требования, которыми должны учитываться при создании новых эффективных KA: 1) наличие двух гидрофобных доменов на основе холестерина или дитетрадецилглицерина; 2) наличие катионного домена на основе полнамина; 3) лннкерная группа карбамоильного типа; 3) спейсерная группа, содержащая не менее 6 метиленовых звеньев.

ВЫВОДЫ

1. Предложен дизайн и разработаны новые подходы и стратегии синтеза моио- и поликатионных амфифилов на основе унифицированных блоков. Совокупность всех разработанных подходов представляет собой общую технологическую платформу, которая позволяет путем направленных модификаций гидрофобного и катионного доменов, а также изменения длины спейсера и типа линкера получать различные тины КА, отличающиеся не только строением структурных элементов, по и способом их компоновки.

2. С использованием разработанных подходов синтезированы моно- и поликатионные амфифилы, в которых остатки гетероциклических, алифатических оснований гг спермина связаны с гидрофобным доменом с помощью карбамоильно го, сложноэфирного, ацетального или дусульфидного линкера. Использование методов, позволяющих проводить синтез в мягких условиях, п эффективных активирующих агеггтов, позволили получить амфифилы с высокими выходами.

3. Разработаны рациональные подходы к получению углеводсодержащих катионных амфифилов с линейной, и разветвленной компоновкой структурных доменов, в том числе, содержащих в качестве спейсерной группы остаток О-глюкозы, связанный с гидрофобным

доменом e помощью биодеградируемой гликозидной связи. В ходе синтеза были успешно реализованы региоселективные подходы, позволяющие модифицировать незащищенные молекулы гликозидов по С(6) атому углеводного остатка.

4. Для создания многокомпонентных липосомальных систем доставки НК, в которых функции связывания IIK и ее доставки в клетки-мишени разделены между двумя амфифильными компонентами, разработаны методы получения нейтральных амфифилов с адресными лигандами на основе гатактозы и фолиевой кислоты.

5. Проведено изучение физико-химических характеристик супрамолекулярных структур КА и их комплесов с НК, сформулированы общие закономерности образования комплексов между НК и катионными линосомами и показано, что при взаимодействии липосом с НК происходит образование комплексов с ламеллярной структурой.

6. Результаты биологических испытаний по доставке различных типов НК в клетки позволили установить связь между структурой КА и его трансфицирующей активностью, а также сформулировать структурные требования, которыми должны учитываться при создании новых КА. Важными элементами структуры, которые позволяют достичь высокой эффективности трансфекцни, являются два гидрофобных домена, гексаметиленовый спенсер и линкер карбамоильного типа.

7. В экспериментах in vitro только липосомы на основе гемини-амфнфила 36с обеспечивают эффективную доставку и выполнение биологических функций различных типов НК не зависимо от наличия сыворотки крови в клеточной среде.

8. С помощью разработанных катионных липосом осуществлена эффективная доставка иммуностимулирующих РНК в условиях ш vivo, приводящая к селективной индукции интерферона-а. Для создания противоопухолевых вакцин нового поколения проведена трансфекция дендритных клеток комплексами катионных липосом и мРНК, кодирующей опухоль-ассоциированные антигены, и показано, что ингибирование развития метастазов в легких мышей связано с числом трансфицированных дендритных клеток и уровнем экспрессии трансгена. Разработанные липосомальные системы могут служить заменой коммерческих трансфицирующих систем и перспективными кандидатами для дальнейших медицинских исследований по созданию новых технологически доступных средств для терапии социально значимых заболеваний.

Список публикаций по теме диссертации

Обзоры и монографии

1. Maslov М.A., Zenkova М.А., Non-viral gene delivery systems based on cholesterol cationic lipids: structure-activity relationships // Non-viral gene therapy, Ed. X. Yuan. - InTech. - Rijeka. - 2011. - P.349-380.

2. Серебренникова Г.А., Маслов М.А., Морозова Н.Г., Модульные транспортные системы на основе катионных и нейтральных амфифнлов для генной терапии // Вестник МИТХТ - 2011. -Т.6,№5.-С.72-8б.

Статьи

3. Maslov М.А., Kabilova Т.О., Petukhov [.A., Morozova N.G., Serebrennikova G.A., Vlassov V.V., Zenkova M.A., Novel cholesterol spermine conjugates provide efficient cellular delivery of plasmid DNA and small interfering RNA // J. Control. Release — 2011.

doi.l 0.1016/j.jconrel.2011.11.023. -

4. Markov O.O.. Mironova N.L., Maslov M.A., Petukhov I.A., Morozova N.G., Vlassov V.V., Zenkova M.A., Novel cationic liposomes provided efficient delivery of DNA and RNA into dendritic cell progenitors and their immature offsets // J. Control. Release — 2011. —

doi: 10.1016/j .jconrel.2011.11.034.

5. Maslov M.A., Morozova N.G., Solomatina Т.V., Sergeeva O.A.. Cheshkov D.A., Serebrennikova G.A., Synthesis of amino analogues of cholie acid using NaBH3CN-TiCl3 //Mendeleev Commun. -2011. - V.21, №3. - P. 137-139.

6. Maslov M.A., Medvedeva D.A., Rapoport D.A., Serikov R.N., Morozova N.G., Serebrennikova G.A., Vlassov V.V., Zenkova M.A. Synthesis and transfection activity of novel galactosylatcd polycationic lipid И Bioorg. Med. Chem. Lett. - 2011. - V.21, № 0. - P.2937-2940.

7. Маслов M.A., Морозова Н.Г., Соломатнна T.B., Шафоростова Н.Г, Серебренникова Г.А., Синтез аминоаналогов холевой кислоты // Биоорг. химия - 2011. - Т.37, №4. - С.567-576.

8. Maslov М.А., Morozova N.G., Cbizhik H.I., Rapoport D.A., Zenkova M.A., Serebrennikova G.A. Synthesis and delivery activity of new cationic cholesteryl glucosides // Carbohydrate Res. - 2010, - V.345. №17 - P.2438-2449.

9. Петухов И.А., Маслов M.A., Морозова Н.Г., Серебренникова Г.А., Синтез холестеринсодержащих поликатионных липидов // Изв. АН. Сер. хим. - 2010. - № 1. - С.254-261.

10. Морозова Н.Г., Маслов М.А., Петухова О.А., Андронова С.В., Грищаева А.О., Серебренникова Г.А. Синтез липидных медиаторов для направленной доставки олиго- и полинуклеотидов в гепатоциты // Изв. АН. Сер. хим. - 2010. - №1. - С.245-253.

11. Шмендель Е.В., Маслов М.А., Морозова Н.Г., Серебренникова Г.А. Синтез неогликолипидов для применения в невирусных системах доставки генетического материала // Изв. АН Сер. хим. - 2010. - №12. - С.2225-2239.

12. Морозова Н.Г., Маслов М.А., Мягченков В.В., Серебренникова Г.А. Синтез положительно заряженных галактозосодержащих сурфактантов /У Биоорг. Химия - 2010. - Т.36, №5.

С.714-720.

13. Соколик В.Н., Маслов М.А., Морозова Н.Г., Серебренникова Г.А. Синтез поликатионных амфифнлов на основе холевой кислоты Н Вестник МИТХТ - 2010 - Т.5, №6. - С.58-62.

14. Иванова Е.А., Морозова Н.Г., Маслов М.А., Серебренникова Г.А., Синтез галактозосодержащих болаамфифилов // Вестник МИТХТ- 2010 - Т.5, №5. - С.65-70.

15. Medvedeva D.A., Maslov М.А., Serikov R.N., Morozova N.G., Serebrenikova O.A., Sheglov D.V., Latyshev A.V., Vlassov V.V., Zenkova M.A. Novel cholesterol-based cationic lipids for gene delivery // J. Med. Chem. - 2009. - V.52, №21. - P.6558-6568.

16. Petukhov I.A., Maslov M.A., Morozova N.G., Serebrennikova G.A. Convenient synthesis of polycationic amphiphiles by the Fukuyama reaction // Mendeleev Commun. - 2009. - V.19, №5. -P.250-252.

17. Маслов M.A., Морозова Н.Г., Сенан И.М., Серебренникова Г.А. Синтез катионных липидных агентов траисфекции с 0,0- или Л'.О-ацетальными связями // Биоорг. химия -2009. - Т.35, №5,- С.696-700.

18. Маслов М.А., Аль-Шоэйби З.Я., Андрюшина Т.В., Морозова Н.Г., Серебренникова Г.А. Положительно заряженные адилаты углеводов как потенциальные медиаторы траисфекции И Биоорг. химия - 2007. - Т.ЗЗ, №5. - С.538-543.

19. Sokolik V.N., Sokolova T.V., Maslov М.А., Morozova N.G., Serebrennikova G.A. Synthesis of cationic cholesterol-containing amphiphiles with an acid-labile linker // Mendeleev Commun. -2007. - V.17, №5. -P.281-283.

20. Морозова Н.Г., Маслов M.A., Мягченков B.B., Серебренникова Г.А., Модельный синтез катионного неогликолипида И Вестник МИТХТ - 2006. - Т. 1, Х»4. - С.55-58.

21. Соколова Т.В., Маслов М.А., Серебренникова Г.А. Получение катионных амфифилов на основе дезоксихолевой кислоты // Биоорг. химия - 2004 - Т.30, №5. С.531-536.

22. Коломейчук C.II., Абакумова О.Ю., Маслов М.А., Калашникова Е.А., Морозова Н.Г., Серебренникова Г.А., Швец В.И., Соколов H.H. Трансфекция эукариотических клеток геном цитохрома CYP450 2В6: появление чувствительности к циклофосфамиду // Вопросы мед. хим. - 2002. - Т.48, №5. - С.469-476.

23. Константинова Т.В., Клыков В.Н., Маслов М.А., Серебренникова Г.А. Синтез катионных производных холестерина с сукцинильной спенсерной группой // Журн. орг. химии - 2002. -Т.38, №8. -С.1240-1242.

Патенты

24. Маслов М.А., Кабилова Т.О., Петухов И.А., Зенкова М.А., Морозова Н.Г., Серебренникова Г.А., Власов В.В. Композиция для доставки нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих // Патент № 2423147 опубл. 10.07.2011, Бюл. X» 19.

25. Маслов М.А., Медведева Д.А., Власов В.В., Зенкова М.А., Морозова Н.Г., Серебренникова Г.А., Углеводсодержащие катионные амфифилы, обладающие способностью доставлять нуклеиновые кислоты в клетки млекопитающих // Патент JV» 2394834, опубл. 20.07.2010.

26. Маслов М.А., Медведева Д.А., Власов В.В., Зенкова М.А., Морозова Н.Г., Серебренникова Г.А., гас-Л-[2,3-ди(тетрадецилокси)проп-1-пл]пнридиний бромид в качестве агента для

доставки нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих // Патент Л» 2405772, опубл. 10.12.2010

Избранные тезисы докладов

27. Markov О.А., Maslov М.А., Mironova N.L., Morozova N.G., Serebrennokova G.A., Vlassov V.V., Zenkova M.A. Novel derivatives of cationic lipids for delivery of DNA and RNA into dendritic cells // International conference "Liposomes in Jerusalem". - Jerusalem. - 2011.- P.201.

28. Maslov M., Kabilova Т., Petukhov I., Morozova N., Zenkova M., Serebrennikova G. New polycationic cholesterol amphiphiles for efficient gene deliver)' into eukaryotic cell // International conference "Liposomes in Jerusalem". - Jerusalem. -2011. - P.203.

29. Санников O.A., Маслов M.A.. Петухов И.А., Морозова Н.Г., Серебренникова Г.А. Синтез поликатионных амфифилов с биодеградируемым типом линкера // VI Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». - Москва. -2011.-С.92-93.

30. Токарева Ю.И., Иванова Е.А.. Маслов М.А., Морозова Н.Г., Серебренникова Г.А. Синтез темини-сурфактанта на основе диглицерида и спермина для доставки нуклеиновых кислот в эукариотические клетки // VI Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». - Москва. - 2011. — С. 103-104.

31. Маслов М.А., Петухов И.А., Морозова Н.Г., Серебренникова Г.А., Липофилыше полиамины для доставки генетического материала // 3 Международная конференция «Фундаментальные науки - медицине». - Новосибирск. -2007. - С.149.

32. Маслов М.А., Морозова Н.Г., Серебренникова Г.А. Липндные векторы адресной доставки генов в гепатоциты // Московская международная конференция «Биотехнология и медицина». - Москва. - 2006. - С.214.

33. Maslov М., Plyavnik N.. Morozova N., Serebrennikova G. Cationic lipids: promising agents for gene delivery // International conference on chemical biology "ICCB 2005". - Novosibirsk - 2005. - P.37.

34. Маслов M.A., СоколоваТ.В., Плявиик H.B., Морозова Н.Г., Серебренникова Г.А. Метилтиометиловые эфиры в создании липидных медиаторов трансфекции // III международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». - Москва. -2009. -Т.1. - Р.160.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.;.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Основные стадии транспорта нуклеиновых кислот с участием катионных липосом.

1.2. Внеклеточные и внутриклеточные барьеры.

1.3. Модульные системы доставки НК.

1.4. Катионные амфифилы - основные компоненты модульной системы доставки НК.

1.4.1. Моно- и дикатионные амфифилы с длинноцепными алкильными или ацильными заместителями.

1.4.2. Катионные производные фосфатидилхолина.

1.4.3. Амфифильные производные имидазола и пиридина.

1.4.4. Монокатионные липиды холестеринового ряда.

1.4.5. Поликатионные амфифилы.

1.4.6. Катионные амфифилы на основе аминокислот.

1.4.7. Гемини-амфифилы.

1.5. Стратегии по увеличению эффективности доставки.

1.5.1. Клеточное нацеливание катионных липосом с использованием различных лигандов.

1.5.1.1. Углеводные лиганды для нацеливания на гепатоциты.

1.5.1.2. Фолиевая кислота для нацеливания на опухолевые клетки.

1.5.1.3. Другие лиганды.

1.5.2. Улучшение интернализации систем доставки.

1.5.3. Увеличение высвобождения НК.

1.5.3.1. рН-чувствительные линкеры.

1.5.3.2. Линкеры, чувствительные к действию внутриклеточных восстановителей.

1.5.3.3. Другие подходы к увеличению высвобождения НК.

Актуальность проблемы. Быстрое развитие технологии рекомбинантных ДНК и выяснение молекулярных основ многих заболеваний привело к возникновению новой области медицины — генной терапии. Этот метод лечения наследственных и приобретенных заболеваний основан на доставке терапевтических нуклеиновых кислот (НК) в клетки (трансфекция) с целью направленного устранения генетических дефектов или придания клеткам новых функций [1]. Биофармацевтические препараты на основе НК могут контролировать развитие болезни на уровне активации или ингибирования действия генов, ответственных за ее развитие. Такие препараты включают плазмидные ДНК, антисмысловые олигонуклеотиды, малые интерферирующие РНК, рибозимы, ДНК-энзимы и аптамеры.

Плазмиды - высокомолекулярные ДНК-конструкции, содержащие трансгены, кодирующие специфические белки [2]. На молекулярном уровне плазмиды можно рассматривать как про-лекарства, которые при проникновении внутрь клетки и последующей экспрессии будут оказывать терапевтическое воздействие на организм [2].

Олигонуклеотиды - короткие одноцепочечные фрагменты ДНК, способные при проникновении в клетку избирательно подавлять экспрессию специфического белка [3]. Олигонуклеотиды обеспечивают ингибирование транскрипции при взаимодействии с молекулой геномной ДНК (антигенные олигонуклеотиды), либо ингибирование трансляции целевого белка при взаимодействии с мРНК-мишенями (антисмысловые олигонуклеотиды). Узнавание и связывание антисмысловых последовательностей обеспечивается комплементарным взаимодействием молекул олигонуклеотида с целевой мРНК или образованием триплекса с двухцепочечной геномной ДНК [3].

Малые интерферирующие РНК (siRNA) могут быть использованы для подавления экспрессии дефектных генов за счет механизма РНК-интерференции. siRNA представляет собой короткий двухцепочечный фрагмент РНК (21 - 23 пар оснований), комплементарный последовательности мРНК белка, синтез которого должен быть заблокирован [4]. При попадании в клетку siRNA образует РНК-белковый комплекс RISC (RNA-induced silencing complex), который связывается с целевой мРНК и вызывает ее расщепление рибонуклеазами. Использование siRNA в качестве терапевтической НК имеет ряд преимуществ перед использованием плазмидных ДНК и антисмысловых олигонуклеотидов: более высокая специфичность к молекулам мРНК, отсутствие иммуногенности и необходимости проникать через ядерную мембрану для оказания терапевтического воздействия. siRNA не встраивается в геном, поэтому она более безопасна по сравнению с плазмидными ДНК. Кроме того, существует возможность единовременно доставить в клетки разные siRNA с помощью одной транспортной системы для ингибирования экспрессии сразу нескольких дефектных генов.

Рибозимы представляют собой молекулы РНК, которые содержат антисмысловые участки для связывания с последовательностями мРНК и участки, осуществляющие их расщепление, в результате чего прекращается биосинтез белка [5]. Недостатком рибозимов является их низкая химическая устойчивость in vivo. ДНК-энзимы являются аналогами рибозимов, обладающие большей биологической стабильностью [6]. Благодаря своей высокой каталитической активности ДНК-энзимы являются мощным инструментом для молекулярной биологии и имеют высокий потенциал терапевтического применения [7].

На 2004 год известно два препарата на основе НК официально разрешенных к применению: Gendicine (рекомбинантный аденовирусный противораковый препрат) [8] и Vitravene (антисмысловой олигонуклеотид для подавления цитомегаловирусной инфекции у пациентов, инфицированных вирусом ВИЧ) [6]. Более 27 антисмысловых олигонуклеотидов проходят разные стадии клинических испытаний по лечению различного рода заболеваний, в том числе раковых заболеваний различной этиологии [9]. Также в настоящее время проводится более 650 клинических испытаний, связанных с доставкой терапевтических ДНК [9].

Основными проблемами успешной коррекции генетического отклонения являются эффективная доставка НК в нужное место в необходимом количестве, а также создание условий для их длительного функционирования [1, 10-12].

Генетическая модификация соматических клеток может проводиться методами in vivo либо ex vivo. Исторически в генной терапии существует три различных подхода. Первый заключается в использовании незащищенной ДНК, прямая инъекция которой в клетку приводит к высокому уровню экспрессии. Простота этого подхода обуславливает его использование в ряде экспериментальных протоколов [1, 13]. Однако применение незащищенных НК ограничивается легкодоступными для непосредственной инъекции тканями (кожа или мускулы) и совершенно не подходит для системной доставки из-за наличия внеклеточных нуклеаз. Поэтому были разработаны подходы, в которых для переноса НК используются «транспортные контейнеры», защищающие НК от разрушительного воздействия ферментов и способствующие ее проникновению внутрь клетки, а в некоторых случаях и дальнейшей экспрессии в ядре.

Один из таких подходов включает использование генетически измененных вирусов [1, 12, 14]. Вирусные системы доставки НК - это биологические системы, происходящие из нативных вирусов, способных переносить собственный генетический материал в клетки хозяина. Многие вирусы, включая ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы и вирус герпеса, были лишены своей высокой токсичности с сохранением высокой способности транспортировать гены [1]. Вирусные векторы очень эффективны с точки зрения доставки НК и последующей экспрессии трансгена. Однако использование вирусов ограничивается их иммуногенностью, онкогенностью, ограниченным размером переносимой НК и высокой стоимостью.

Начиная с 90-ых годов, разрабатываются невирусные системы доставки НК на основе катионных амфифилов и полимеров, которые являются альтернативой вирусным системам доставки [1, 10, 15-21]. Среди прочих в последнее десятилетие стал широко изучаться метод липофекции, использующий катионные липосомы как средство доставки НК [1, 15, 18-21]. Катионные амфифилы и липосомы имеют ряд преимуществ по сравнению с вирусными системами доставки: они защищают молекулы НК от инактивации под действием клеточных ферментов, не обладают инфекционностью и иммуногенностью, способны переносить НК любого размера. Катионные липосомы легко получать, они стабильны при хранении и экономически доступны. Совокупность вышеперечисленных свойств делает липосомы перспективными транспортными системами для доставки НК в эукариотические клетки. Липосомальные ДНК/РНК-препараты рассматриваются как перспективные фармакологические агенты для лечения онкологических заболеваний, неврологических расстройств (болезнь Паркинсона и Альцгеймера), а также терапии сердечно-сосудистых заболеваний [1, 13].

Однако, для известных на сегодняшний день липосом характерна низкая эффективность доставки НК, обусловленная наличием внеклеточных и внутриклеточных биологических барьеров, которые должен преодолеть НК-липосомальный комплекс (липоплекс), прежде чем НК осуществит терапевтическое воздействие. К таким барьерам относят компоненты крови и белки иммунной системы, которые дестабилизируют липоплекс и вызывают преждевременное высвобождение и разрушение НК, а также клеточную, эндосомальную и ядерную мембраны.

Липосомы для доставки НК создаются на основе катионных амфифилов (КА), структура которых является одним из важных факторов, определяющих эффективность липофекции. На сегодняшний день накоплено большое количество данных по синтезу КА, однако, для направленного поиска новых амфифилов необходимо выработать структурные требования, которые должны базироваться на понимании клеточных механизмов генного транспорта и определении лимитирующих стадий процесса липофекции. От этого также зависит разработка рациональных подходов к синтезу КА и созданию липосомальных систем доставки, и проверка гипотез, связанных с клеточными и молекулярными механизмами протекания трансфекции.

В настоящее время для трансфекции эукариотических клеток in vitro используются несколько зарубежных коммерчески доступных липосомальных систем доставки НК. Их применение in vivo ограничено высокой токсичностью, либо потерей активности в присутствии сыворотки крови или ее компонентов. Кроме того, высокая стоимость данных систем доставки НК и отсутствие отечественных аналогов сдерживает развитие и интенсивное использование как самого метода липофекции, так и генной терапии в российских научно-исследовательских организациях и биотехнологических компаниях.

Таким образом, создание отечественных липосомальных систем доставки НК становится актуальной междисциплинарной задачей, лежащей на стыке биоорганической, биологической химии и молекулярной биологии. Поиск таких систем представляет собой комплексное исследование, которое включает разработку и оптимизацию подходов к синтезу новых КА, получение на их основе липосом и комплексов с НК, изучение физико-химических характеристик комплексов, а также установление зависимости эффективности трансфекции от структуры КА.

Основной целью работы является создание эффективных и безопасных липосомальных систем доставки, способных переносить терапевтические НК в клетки млекопитающих, для лечения наследственных и приобретенных заболеваний. Для достижения поставленной цели, в первую очередь, было необходимо предложить дизайн и разработать современные подходы к синтезу малотоксичных положительно заряженных амфифильных молекул - основных компонентов липосом - с различной компоновкой структурных доменов, после чего изучить физико-химические и биологические свойства супрамолекулярных структур, образуемых катионными амфифилами с НК. На основании результатов биологических исследований требовалось установить связь между структурой КА и его активностью, выработать требования к молекуле КА как эффективному трансфектанту и предложить липосомальную транспортную систему, способную переносить различные НК в условиях in vitro и in vivo.

Научная новизна. В данной работе сформировано новое междисциплинарное направление по конструированию липосомальных систем доставки НК, которое включает разработку синтетических подходов к получению КА с различной компоновкой структурных доменов, создание на их основе катионных липосом и установление связи между структурой амфифила и его биологическими свойствами:

- Предложен дизайн новых моно- и поликатионных амфифилов и разработаны новые подходы и стратегии синтеза амфифилов с различной компоновкой структурных доменов и способом их связывания. Синтезированы амфифилы с линкерными группами, способными разрушаться под действием внутриклеточных стимулов. Совокупность всех разработанных подходов представляет собой общую технологическую платформу, которая позволяет на основе унифицированных блоков в короткие сроки получать КА, отличающиеся типами структурных элементов и способом их компоновки.

- Впервые предложены новые эффективные подходы к получению углеводсодержащих КА с линейной и разветвленной компоновкой структурных доменов, а также амфифилов, содержащих в качестве спейсерной группы остаток 1)-глюкозы, связанный с гидрофобным доменом с помощью биодеградируемой гликозидной связи.

- Для создания многокомпонентных транспортных систем, в которых функции связывания НК и ее доставки в клетки-мишени разделены между двумя амфифильными компонентами, получены нейтральные амфифилы с адресными лигандами на основе галактозы и фолиевой кислоты.

- Сформирована библиотека микроэлектронных фотографий, полученных с помощью трансмиссионной электронной микроскопии, для 33 образцов комплексов катионных липосом с НК (более 500 изображений). Анализ изображений позволил выявить общие закономерности образования комплексов и показал, что вне зависимости от структуры КА и формы липосом при взаимодействии с НК формируются комплексы с ламеллярной структурой.

- Установлена связь между структурой КА и трансфицирующей активностью, что позволило впервые сформулировать требования к структуре амфифила, которые должны учитываться при создании новых эффективных трансфицирующих реагентов. Показано, что важными элементами структуры, которые позволяют достичь высокой эффективности трансфекции, являются два гидрофобных домена, гексаметиленовый спейсер и линкер карбамоильного типа.

- Впервые с помощью разработанных липосомальных систем осуществлена доставка мРНК, кодирующей опухоль-ассоциированные антигены, в трудно трансфицируемые дендритные клетки.

Практическая значимость работы. Липосомальные системы доставки НК находят широкое применение в научно-исследовательских организациях и коммерческих компаниях, работающих в области биотехнологии, молекулярной и клеточной биологии, а также генной терапии. В настоящее время потребности научных учреждений и компаний России в таких реагентах удовлетворяются исключительно за счет импортных препаратов, которые, наряду со своей высокой стоимостью, проявляют значительную токсичность, а их применение ограничено типом переносимой НК. Это делает использование данных препаратов невыгодным как с терапевтической, так и с коммерческой точки зрения. В настоящей диссертационной работе, используя синтезированные катионные амфифилы, впервые получены отечественные высокоэффективные липосомальные системы доставки НК, не уступающие по своим характеристикам зарубежным коммерческим препаратам, и показана принципиальная возможность создания на их основе онковакцин нового поколения. Результаты исследований in vitro и in vivo, позволяют рассматривать разработанные липосомальные системы доставки НК в качестве перспективных отечественных трансфицирующих препаратов для нужд молекулярной и клеточной биологии, генной терапии, биотехнологии и медицины. По результатам исследований получено 3 патента на изобретение.

Основные положения выносимые на защиту.

1. Разработка новых подходов и синтетических стратегий, позволяющих получать модификационные ряды катионных амфифилов, отличающихся строением структурных элементов и способом их компоновки;

2. Выявление общих закономерностей образования комплексов катионных амфифилов с НК на основании изучения их физико-химических характеристик;

3. Создание эффективных и универсальных липосомальных систем доставки НК, способных переносить различные типы НК in vitro и in vivo. Выявление связи между структурой катионного амфифила и его биологическими свойствами.

4.

Апробация работы. Основные результаты диссертации были представлены на Менделеевских съездах по общей и прикладной химии (2003, Казань; 2007, Москва; 2011, Волгоград), Международных конгрессах «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (2002, 2005, 2006, 2009, 2011, Москва), Съездах Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (2002, С.-Петербург; 2008, Новосибирск), Международной конференции по органической химии "Органическая химия от Бутлерова и Бейлыптейна до современности" (2006, С.-Петербург), Международных научно-технических конференциях «Наукоемкие химические технологии» (2001, Ярославль; 2002, Уфа; 2004, Волгоград; 2006, Самара; 2008 Волгоград; 2010, Суздаль), International conference on chemical biology "ICCB 2005" (2005, Новосибирск), International Symposium on Advanced Science in Organic Chemistry (2006, Судак, Украина), 1st Russian-Hellenic symposium "Biomaterials and bionanomaterials: recent advances and safety - toxicology issues" (2010, Heraklion, Greece), XIX International Round Table on Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids (2010, Lyon, France), International conference "Liposomes in Jerusalem" (2011, Jerusalem, Israel)

Публикации. Основные результаты исследований, полученные при выполнении диссертации, изложены в 1 монографии, 1 обзоре, 3 патентах, 21 оригинальных статьях (в том числе 8 в зарубежных журналах), более 50 тезисах докладов на российских и международных конференциях.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

ВЫВОДЫ

1. Предложен дизайн и разработаны новые подходы и стратегии синтеза моно-и поликатионных амфифилов на основе унифицированных блоков. Совокупность всех разработанных подходов представляет собой общую технологическую платформу, которая позволяет путем направленных модификаций гидрофобного и катионного доменов, а также изменения длины спейсера и типа линкера получать различные типы КА, отличающиеся не только строением структурных элементов, но и способом их компоновки.

2. С использованием разработанных подходов синтезированы моно- и поликатионные амфифилы, в которых остатки гетероциклических, алифатических оснований и спермина связаны с гидрофобным доменом с помощью карбамоильного, сложноэфирного, ацетального или дусульфидного линкера. Использование методов, позволяющих проводить синтез в мягких условиях, и эффективных активирующих агентов, позволили получить амфифилы с высокими выходами.

3. Разработаны рациональные подходы к получению углевод со держащих катионных амфифилов с линейной и разветвленной компоновкой структурных доменов, в том числе, содержащих в качестве спейсерной группы остаток Э-глюкозы, связанный с гидрофобным доменом с помощью биодеградируемой гликозидной связи. В ходе синтеза были успешно реализованы региоселективные подходы, позволяющие модифицировать незащищенные молекулы гликозидов по С(6) атому углеводного остатка.

4. Для создания многокомпонентных липосомальных систем доставки НК, в которых функции связывания НК и ее доставки в клетки-мишени разделены между двумя амфифильными компонентами, разработаны методы получения нейтральных амфифилов с адресными лигандами на основе галактозы и фолиевой кислоты.

5. Проведено изучение физико-химических характеристик супрамолекулярных структур КА и их комплесов с НК, сформулированы общие закономерности образования комплексов между НК и катионными липосомами и показано, что при взаимодействии липосом с НК происходит образование комплексов с ламеллярной структурой.

6. Результаты биологических испытаний по доставке различных типов НК в клетки позволили установить связь между структурой КА и его трансфицирующей активностью, а также сформулировать структурные требования, которыми должны учитываться при создании новых КА. Важными элементами структуры, которые позволяют достичь высокой эффективности трансфекции, являются два гидрофобных домена, гексаметиленовый спейсер и линкер карбамоильного типа.

7. В экспериментах in vitro только липосомы на основе гемини-амфифила 36с обеспечивают эффективную доставку и выполнение биологических функций различных типов НК не зависимо от наличия сыворотки крови в клеточной среде.

8. С помощью разработанных катионных липосом осуществлена эффективная доставка иммуностимулирующих РНК в условиях in vivo, приводящая к селективной индукции интерферона-a. Для создания противоопухолевых вакцин нового поколения проведена трансфекция дендритных клеток комплексами катионных липосом и мРНК, кодирующей опухоль-ассоциированные антигены, и показано, что ингибирование развития метастазов в легких мышей связано с числом трансфицированных дендритных клеток и уровнем экспрессии трансгена. Разработанные липосомальные системы могут служить заменой коммерческих трансфицирующих систем и перспективными кандидатами для дальнейших медицинских исследований по созданию новых технологически доступных средств для терапии социально значимых заболеваний.

1. Gene and cell therapy: therapeutic mechanisms and strategies (Ed. Templeton N. S.). -Boca Raton 2009. - CRC Press.

2. Uherek C, Wels W. DNA-carrier proteins for targeted gene delivery. // Adv Drug Delivr

3. Rev. 2000. - V. 44. - P. 153-166.

4. Crooke S.T. Molecular mechanisms of action of antisense drugs. // Biochim. Biophys. Acta.- 1999.-V. 1489.-P. 31-43.

5. Scherr M., Morgan M.A., Eder M. Gene silencing mediated by small interfering RNAs in mammalian cells. // Curr Med Chem. 2003. - V. 10. - P. 245-256.

6. Stull R.A., Szoka F.C. Antigene, ribozyme and aptamer nucleic acid drugs: progress and prospects. // Pharm. Res. 1995. - V. 12. - P. 465-483.

7. Akhtar S., Hughes M.D., Khan A., Bibby M., Hussain M., Nawaz Q., Double J., Sayyed P. The delivery of antisense therapeutics. // Adv. Drug Deliv. Rev. 2000. - V. 44. - P. 3-21.

8. Zhang L, Gasper W.J., Stass S.A., Ioffe O.B., Davis M.A., Mixson A.J. Angiogenic inhibition mediated by a DNAzyme that targets vascular endothelial growth factor receptor 2. // Cancer Res. 2002. - V. 62. - P. 5463-5469.

9. Wilson J. M. Gendicine: the first commercial gene therapy product. // Hum. Gene Ther. -2005.-V. 16-P. 1014-1015.

10. Rayburn E.R., Zhang R. Antisense, RNAi, and gene silencing strategies for therapy: mission possible or impossible? // Drug Discov. Today. 2008. - V. 13. - P. 513-521,

11. Nucleic acid transfection (Eds. Biekle W., Erbacher C.) Berlin. - 2010. - Springer.

12. Blau H.M., Springer M.L. Gene therapy a novel form of drug delivery. // N. Engl. J. Med. - 1995. - V. 333. - P. 1204-1207.

13. Verma I.M., Weitzman M.D. Gene therapy: twenty-first century medicine. // Ann. Rev. Biochem. 2005. - V. 74. - P. 711-738.

14. Huang L., Hung M.C. Wagner E. Non-viral vectors for gene therapy. 2nd ed. Part 2. //. Advances inGenetics. V. 53 - Amsterdam. - 2005. - Elsevier Academic Press.

15. Lundstrom, K. Latest development in viral vectors for gene therapy. // Trends biotechnol. -2003.-V. 21.-P. 117-122.

16. Huang L., Hung M.C., Wagner E. Non-viral vectors for gene therapy. 2nd ed. Part 1. //. Advances inGenetics. V. 53 - Amsterdam. - 2005. - Elsevier Academic Press.

17. Lv H.T., Zhang S.B., Wang B., Cui S.H., Yan J. Toxicity of cationic lipids and cationic polymers in gene delivery. // J. Control. Release 2006. - V. 114. - P. 100-109.

18. Morille M., Passirani C., Vonarbourg A., Clavreul A., Benoit, J.-P. Progress in developing cationic vectors for non-viral systemic gene therapy against cancer. // Biomaterials. 2008. - V. 29. - P. 3477-3496.

19. Karmali P.P., Chaudhuri A. Cationic liposomes as non-viral carriers of gene medicines: resolved issues, open questions, and future promises. // Med. Res. Rev. 2007. - V. 27. -P. 696-722.

20. Non-viral gene therapy (Ed. X. Yuan). -Rijeka. 2011 - InTech.

21. Mahato R.I. Water insoluble and soluble lipids for gene delivery. // Adv. Drug Del. Rev. -2005. V. 57.-P. 699-712.

22. Tseng Y.-C., Mozumdar S., Huang L. Lipid-based systemic delivery of siRNA. // Adv. Drug Deliv. Rev.-2009. -V. 61. P. 721-731.

23. Wasungu L., Hoekstra D. Cationic lipids, lipoplexes and intracellular delivery of gene. // J. Control. Release. 2006. - V. 116. - P. 255-264.

24. Hui S.W., Langner M., Zhao Y.L., Hurley E., Chan K. The role of helper lipids in cationic liposome-mediated gene transfer. // Biophys. J. 1996. - V. 71. - P. 590-599.

25. Mok K.W.C., Cullis P.R. Structural and fusogenic properties of cationic liposomes in the presence of plasmid DNA. // Biophys. J. 1997. - V. 73. - P. 2534-2545.

26. Zuidam N.J., Barenholz Y. Electrostatic and structural properties of complexes involving plasmid DNA and cationic lipids commonly used for gene delivery. // Biochim. Biophys. Acta. 1998,-V. 1368.-P. 115-128.

27. Zuidam N.J., Hirsch-Lerner D., Margulies S., Barenholz Y. Lamellarity of cationic liposomes and mode of preparation of lipoplexes affect transfection efficiency. // Biochim. Biophys. Acta, 1999. - V. 1419. - P. 207-220.

28. Liu Y., Mounkes L.C., Liggitt H.D. Brown C.S., Solodin I., Heath T.D., Debs R.J. Factors influencing the efficiency of cationic liposome-mediated intravenous gene delivery. // Nat. Biotech. 1997. - V. 15. - P. 167-173.

29. Sternberg B., Hong K., Zheng W., Papahadjopoulos D. Ultrastructural characterization of cationic liposome-DNA complexes showing enhanced stability in serum and high transfection activity in vivo. II Biochim. Biophys. Acta. 1998. - V. 1375. - P. 23-35.

30. Simberg D., Weisman S., Talmon Y., Faerman A., Shoshani T., Barenholz Y. The role of organ vascularization and lipoplex-serum initial contact in intravenous murine lipofection. // J. Biol. Chem. 2003. - V. 278. - P. 39858-39865.

31. Crook K., Stevenson B.J., Dubochet M., Porteous D.J. Inclusion of cholesterol in DOTAP transfection complexes increases the delivery of DNA to cells in vitro in the presence of serum. // Gene Ther. 1998. - V. 5. - P. 137-143.

32. Zuhorn I.S., Engberts J.B.F.N., Hoekstra D. Gene delivery by cationic lipid vectors: overcoming cellular barriers. // Eur. Biophys. J. 2007. - V. 36. - P. 349-362.

33. Rao N.M., Gopal V. Cell biological and biophysical aspects of lipid-mediated gene delivery. // Biosci. Rep. 2006. - V. 26. - P. 301-324.

34. Passirani C. Complement activation by injectable colloidal drug carriers. In "Biomaterials for delivery and targeting of proteins and nucleic acids" (Ed. Mahato R.I.). 2005. - CRC Press. - P. 187-230.

35. Vonarbourg A., Passirani C., Saulnier P., Benoit J.P. Parameters influencing the stealthiness of colloidal drug delivery systems. // Biomaterials. 2006. - V. 27. - P. 4356-4373.

36. U'Ren L., Kedl R., Dow S. Vaccination with liposome-DNA complexes elicits enhanced antitumor immunity. // Cancer Gene Ther. 2006. - V. 13. - P. 1033-1044.

37. Whitmore M., Li S., Huang L. LPD lipopolyplex initiates a potent cytokine response and inhibits tumor growth. // Gene Ther. 1999. - V. 6. - P. 1867-1875.

38. Romberg B., Hennink W.E., Storm G. Sheddable coatings for long-circulating nanoparticles. // Pharm. Res. 2008. - V. 25. - P. 55-71.

39. El Ouahabi A., Thiry M., Schiffmann S., Fuks R., Nguyen-Tran H., Ruysschaert J.M., Vandenbranden M. Intracellular visualization of BrdU-labeled plasmid DNA/cationic liposome complexes. // J. Histochem. Cytochem. 1999. - V. 47. - P. 1159-1166.

40. Xu Y., Szoka F.C. Mechanism of DNA release from cationic liposome/DNA complexes used in cell transfection. // Biochemistry. 1996. - V. 35. - P. 5616-5623.

41. Boussif O., Lezoualch F., Zanta M.A., Mergny M.D., Scherman D., Demeneix B. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. - V. 92. - P. 7297-7301.

42. Wente S.R. Gatekeepers of the nucleus. // Science. 2000. - V. 26. - P. 1374-1377.

43. Lukacs G.L., Haggie P., Seksek O., Lechardeur D., Freedman N., Verkman A.S. Size-dependent DNA mobility in cytoplasm and nucleus. // J. Biol Chem. 2000. - V. 275. - P. 1625-1629.

44. Gorlich D., Mattaj I.W. Nucleocytoplasmic transport. // Science. 1996. - V. 271. - P. 1513-1518.

45. Bremner K.H., Seymour L.W., Logan A., Read M.L. Factors influencing the ability of nuclear localization sequence peptides to enhance nonviral gene delivery. // Bioconjugate Chem. 2004. - V. 15. - P. 152-161.

46. De Laporte L., Cruz Rea J., Shea L.D. Design of modular non-viral gene therapy vectors. // Biomaterials. 2006. - V. 27. - P. 947-954.

47. Kostarelos K., Miller A.D. Synthetic, self-assembly ABCD nanoparticles; a structural paradigm for viable synthetic non-viral vectors. // Chem. Soc. Rev. 2005. - V. 34. - P. 970-994.

48. Mintzer M.A., Simanek E.E. Nonviral Vectors for Gene Delivery. // Chem. Rev. 2009. -V. 109. -P. 259-302.

49. Martin B., Sainlos M., Aissaoui A., Oudrhiri N., Hauchecorne M., Vigneron J.-P., Lehn J.-M., Lehn P. The Design of Cationic Lipids for Gene Delivery. // Curr. Pharm. Design. -2005.-V. 11.-P. 375-394.

50. Guo X., Szoka F.C. Chemical approaches to triggerable lipid vesicles for drug and gene delivery. // Acc. Chem. Res. 2003. - V. 36. - P. 335-341.

51. Hyndman L., Lemoine J.L., Huang L., Porteous D.J., Boyd A.C., Nan X. HIV-1 Tat protein transduction domain peptide facilitates gene transfer in combination with cationic liposomes. // J. Control. Release. 2004. - V. 99. - P. 435^144.

52. Masson C., Garinot M., Mignet N., Wetzer B., Mailhe P., Scherman D., Bessodes M. pH-Sensitive PEG lipids containing orthoester linkers: new potential tools for nonviral gene delivery. // J. Control. Release. 2004. -V. 99, - P. 423^34.

53. Molas M., Gomez-Valades A.G., Vidal-Alabro A., Miguel-Turu M., Bermudez J., Bartrons R., Perales J.C. Receptor-mediated gene transfer vectors: progress towards genetic pharmaceuticals. // Curr. Gene Ther. 2003. - V. 3. - P. 468-485.

54. Carriere M., Escriou V., Jollet A., Scherman D., Azoulay M., Monneret C. New synthetic glycolipids for targeted gene transfer: synthesis, formulation in lipoplexes and specific interaction with lectin. // Drug Deliv. 2004. - V. 11. - P. 351-363.

55. Feigner P. L., Gadek T. R., Holm M., Roman R., Chan H. W., Wenz M., Northop J. P., Ringold G. M., Danielsen M. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. - Vol. 84. - P. 7413-7417.

56. Malon R. W., Feigner P. L., Verma I. M. Cationic liposome-mediated RNA transfection. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - Vol. 86. - P. 6077-6081.

57. Feigner, P. L., Ringold, G. M. Cationic liposome-mediated transfection. //Nature. 1989. -Vol. 337.-P. 387-388.

58. Gershon H., Ghirlando R., Guttman S. B., Minsky A. Mode of formation and structural features of DNA-cationic liposome complexes used for transfection. // Biochemistry. -1993.-Vol. 32.-P. 7143-7151

59. Liu F., Qi H., Huang L., Liu D. Factors controlling the efficiency of cationic lipid-mediated transfection in vivo via intravenous administration. 11 Gene Ther. 1997. - Vol. 4.-P. 517-523.

60. Zuidam N.J., Barenholz Y., Minsky A. Chiral DNA packaging in DNA-cationic liposome assemblies. // FEBS Lett. 1999. - Vol. 457. - P. 419-422.

61. Templeton N.S., Lais D.D., Frederik P.M., Strey H.H., Roberts D.D., Pavlakis G.N. Improved DNA: liposome complexes for increased systemic delivery and gene expression. // Nature Biotechnol. 1997. - Vol. 15. - P. 647-652.

62. Zabner J., Fasbender A.J., Moninger T., Poellinger K.A., Welsh M.J. Cellular and Molecular Barriers to Gene Transfer by a Cationic Lipid. // J. Biol. Chem. 1995. - Vol. 270.-P. 18997-19007.

63. Bentz J., Ellens H., Lai M.Z., Szoka F.C. On the correlation between HII phase and the contact-induced destabilization of phosphatidylethanolamine-containing membranes. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. - V. 82. - P. 5742-5745.

64. Wang J.K., Guo X., Xu Y.H., Barron L., Szoka F.C. Synthesis and Characterization of Long Chain Alkyl Acyl Carnitine Esters. Potentially Biodegradable Cationic Lipids for Use in Gene Delivery. // J. Med. Chem. 1998. - V. 41. - P. 2207-2215.

65. Ghosh Y.K., Visweswariah S.S., Bhattacharya S. Nature of linkage between the cationic headgroup and cholesteryl skeleton controls gene transfection efficiency. // FEBS Lett. -2000.-V. 473.-P. 341-344.

66. Aljaberi A., Spelios M., Kearns M., Selvi B., Sawa M. Physicochemical properties affecting lipofection potency of a new series of 1,2-dialkoylamidopropane-based cationic lipids. // Colloid. Surface B. 2007. - V. 57. - P. 108-117.

67. Solodin I., Brown C.S., Bruno M.S., Chow C.Y., Jang E.H., Debs R.J., Heath T.D. A novel series of amphiphilic imidazolinium compounds for in vitro and in vivo gene delivery. // Biochemistry. 1995. -V. 34. -P. 13537-13544.

68. McLean J.W., Fox E.A., Baluc P., Bolton P.B., Haskell A., Pearlman R., Thurston G., Umemoto E. Y., McDonald D.M. Organ-specific endothelial cell uptake of cationic liposome-DNA complexes in mice. // Am. J. Physiol. 1997. - V. 273. - P. 387-404.

69. Liu Y., Mounkes L.C., Liggitt H.D., Brown C.S., Solodin I., Health T.D., Debs R.J. Factors influencing the efficiency of cationic liposome-mediated intravenous gene delivery. // Nature Biotechnol. 1997. - V. 15. - P. 167-173.

70. Liang E., Hughes J.A. Characterization of a pH-sensitive surfactant, dodecyl-2-(l'-imidazolyl) propionate (DIP), and preliminary studies in liposome mediated gene transfer. // Biochem. Biophys. Acta. 1998. - V. 1369. - P. 39-50.

71. Van der Woude I., Wagenaar A., Meekel A.A.P., ter Beest M.B.A., Ruiters M.H.J., Engberts J.B.F.N., D. Hoekstra. Novel pyridinium surfactants for efficient, nontoxic in vitro gene□ delivery. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - V. 94. - P. 1160-1165.

72. Ilies M.A., Seitz W.A., Ghiviriga I., Johnson B.H., Miller A., Thompson E.B., Balaban A.T. Pyridinium Cationic Lipids in Gene Delivery: □ A Structure-Activity Correlation Study. // J. Med. Chem. 2004. - V. 47. - P. 3744-3754.

73. Hyvonen Z., Plotniece A., Reine I., Chekavichus B., Duburs G., Urtti A. Novel cationic amphiphilic 1,4-dihydropyridine derivatives for DNA delivery. // Biochim. Biophys. Acta. 2000. - Vol. 1509. - P. 451 -466.

74. Gao X., Huang L. A novel cationic liposome reagent for efficient transfection of mammalian cells. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991. - V. 179. - P. 280-285.

75. Litzinger D.C., Brown J.M., Wala I., Kaufman S.A., Van G.Y., Farrell C.L., Collins D. Fate of cationic liposomes and their complex with oligonucleotide in vivo. II Biochim. Biophys. Acta.- 1996,-V. 1281.-P. 139-149.

76. Song Y.K., Liu F., Chu S., Liu D. Characterization of cationic liposome-mediated gene transfer in vivo by intravenous administration. // Hum. Gene. Ther. 1997. - V. 8. - P. 1585-1594.

77. Rodríguez-Pulido A., Ortega F., Llorca O., Aicart E., Junquera E. A physicochemical characterization of the interaction between DC-Chol/DOPE cationic liposomes and DNA. // J. Phys. Chem. B. 2008. - V. 112. - P. 12555-12565.

78. Muñoz-Ubeda M., Rodríguez-Pulido A., Nogales A., Martin-Molina A., Aicart E., Junquera E. Effect of lipid composition on the structure and theoretical phase diagrams of DC-Chol/DOPE-DNA lipoplexes. II Biomacromolecules. 2010. - V. 11. - P. 33323340.

79. Farhood H., Bottega R., Epand R.M., Huang L. Effect of cationic cholesterol derivatives on gene transfer and protein kinase C activity. II Biochim. Biophys. Acta. 1992. - V. 1111.-P. 239-246.

80. Takeuchi K., Ishihara M., Kawaura C., Noji M., Furuno T., Nakanishi M. Effect of zeta potential of cationic liposomes containing cationic cholesterol derivatives on gene transfection. // FEBS Lett. 1996. - V. 397. - P. 207-209.

81. Kawaura C., Noguchi A., Furuno T., Nakanishi M. Atomic force microscopy for studying gene transfection mediated by cationic liposomes with a cationic cholesterol derivative. // FEBS Letters. 1998. -V. 421. - P. 69-72.

82. Okayama R., Noji M., Nakanishi M. Cationic cholesterol with a hydroxyethylamino head group promotes significantly liposome-mediated gene transfection. // FEBS Letters. 1997.-V. 408.-P. 232-234.

83. Hasegawa S., Hirashima N., Nakanishi M. Comparative study of transfection efficiency of cationic cholesterols mediated by liposomes-based gene delivery. // Bioorg. Medicinal Chem. Lett. 2002. - V. 12. - P. 1299-1302.

84. Hattori Y.W., Ding Y., Maitani J. Highly efficient cationic hydroxyethylated cholesterol-based nanoparticle-mediated gene transfer in vivo and in vitro in prostate carcinoma PC-3 cells. // J. Control. Release. 2007. - V. 120. - P. 122-130.

85. Kearns M.D., Donkor A.-M., Sawa M. Structure-transfection activity studies of novel cationic cholesterol-based amphiphiles. // Mol. pharm. 2008. - V. 5. - P. 128-139.

86. Briane D., Lesage D., Cao A., Coudert R., Lievre N., Salzmann J.L., Taillandier E. Cellular pathway of plasmids vectorized by cholesterol-based cationic liposomes. // J. Histochem. Cytochem. 2002. - V. 50. - P. 983-991.

87. Percot A., Briane D., Coudert R., Reynier P., Bouchema N., Lievre N., Hantz E., Salzmann J.L., Cao A. A hydroxyethylated cholesterol-based cationic lipid for DNA delivery: effect of conditioning. // Int. J. Pharm. 2004. - V. 278. - P. 143-163.

88. Ding W.X., Hattori Y., Higashiyama K., Maitani Y. Hydroxyethylated cationic cholesterol derivatives in liposome vectors promote gene expression in the lung. // Int. J. Pharm. 2008. - V. 354. - P. 196-203.

89. Ghosh Y.K., Visweswariah S.S., Bhattacharya S. Advantage of the ether linkage between the positive charge and the cholesteryl skeleton in cholesterol-based amphiphiles as vectors for gene delivery. // Bioconjugate Chem. 2002. - V. 13. - P. 378-384.

90. Han S.-E., Kang H., Shima G.Y., Suha M.S., Kimc S.J., Kimd J.-S., Oh Y.-K. Novel cationic cholesterol derivative-based liposomes for serum-enhanced delivery of siRNA. // Int. J. Pharm. 2008. - V. 353. - P. 260-269.

91. Gao H., Hui K.M. Synthesis of a novel series of cationic lipids that can act as efficient gene delivery vehicles through systematic heterocyclic substitution of cholesterol derivatives. // Gene Ther. 2001. - V. 8. - P. 855-863.

92. Bajaj A., Mishra S.K., Kondaiah P., Bhattacharya S. Effect of the headgroup variation on the gene transfer properties of cholesterol based cationic lipids possessing ether linkage. // Biochim. Biophys. Acta. 2008. -V. 1778. - P. 1222-1236.

93. Keller M., Jorgensen M.R., Perouzel E., Miller A.D. Thermodynamic aspects and biological profile of CDAN/DOPE and DC-Choi/ DOPE lipoplexes. // Biochemistry-US. 2003. - V. 42. - P. 6067-6077.

94. Geall A.J., Taylor R.J., Earll M.E., Eaton M.A.W., Blagbrough I.S. Synthesis of cholesterol-polyamine carbamates: pKa studies and condensation of calf thymus DNA. // Bioconjugate Chem. 2000. - V. 11. - P. 314-326.

95. Remy J.S., Sirlin C., Vierling P., Behr J.-P. Gene transfer with a series of lipophilic DNA-binding molecules. // Bioconjugate Chem. 1994. - V. 5. - P. 647-654.

96. Behr J.P., Demeneix B.A., Loeffler J.P., Perez-Mutul J. Efficient gene transfer into mammalian primary endocrine cells with lipopolyamine-coated DNA. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - V. 86. - P. 6982-6986.

97. Hawley-Nelson P., Ciccarone V., Gebeyehu G., Jesse J., Feigner P.L. Lipofectamine reagent: a new higher efficiency polycationic liposome transfection reagent. // Focus. -1993.-V. 15.-P. 73-79.

98. Dodds E., Dunckley M.G., Naujoks K., Michaelis U., Dickson G. Lipofection of cultured mouse muscle cells: a direct comparison of lipofectamine and DOSPER. // Gene Ther.- 1998.-V. 5.-P. 542-551.

99. Ahmed O.A.A., Adjimatera N., Pourzand C., Blagbrough I.S. N4,N9-Dioleoyl spermine is a novel nonviral lipopolyamine vector for plasmid DNA formulation. // Pharm. Res. -2005. V. 22. - P. 972-980.

100. Ahmed O.A.A., Pourzand C., Blagbrough I.S. Varying the unsaturation in N4,№-dioctadecanoyl spermines: Nonviral lipopolyamine vectors for more efficient plasmid DNA formulation. // Pharm. Res. 2010. - V. 23. - P. 31-40.

101. Spagnou S., Miller A.D., Lipidic M.K. Carriers of siRNA: Differences in the formulation, cellular uptake, and delivery with plasmid DNA. // Biochemistry. 2004. -V. 43.-P. 13348-13356.

102. Moradpour D., Shauer J.I., Zurawski V.R., Wands J.R., Boutin R.H. Efficient gene transfer into mammalian cells with cholesteryl-spermidine. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. - V. 221. - P. 82-88.

103. Ouderhiri N, Vigneron J.P., Peuchmaur M., Leclerc T, Lehn J.M., Lehn P. Gene transfer by guanidinium-cholesterol cationic lipids into airway epithelial cells in vitro and in vivo. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - V. 94. - P. 1651-1656.

104. Belmont P., Aissaoui A., Hauchecorne M., Oudrhiri N., Petit L., Vigneron J.P., Lehn J.M., Lehn P. Aminoglycoside-derived cationic lipids as efficient vectors for gene transfection in vitro and in vivo. II J. Gene Med. 2002. - V. 4. - P. 517-526.

105. Sainlos M., Hauchecorne M., Oudrhiri N., Zertal-Zidani S., Aissaoui A., Vigneron J.P., Lehn J.M., Lehn P. Kanamycin A-Derived Cationic Lipids as Vectors for Gene Transfection. // Chem. Biochem. 2005. - V. 6. - P. 1023 - 1033.

106. Fujiwara T., Hasegawa S., Hirashima N., Nakanishi M., Ohwada T. Gene transfection activities of amphiphilic steroid-polyamine conjugates. // Biochim. Biophys. Acta. -2000.-V. 1468.-P. 396-402.

107. Choi S., Lee E.J., Jang H.S., Park J.S. New cationic liposomes for gene transfer into mammalian cells with high efficiency and low toxicity. // Bioconjugate Chem. 2001. -V. 12.-P. 108-113

108. Ito A., Miyazoe R., Mitoma J., Akao T., Osaki T., Kunitake T. Synthetic cationic amphiphiles for liposome-mediated DNA transfection. // Biochem. Int. 1990. - V. 22. -P. 235-241.

109. Arima H., Aramaki Y., Tsuchiya S. Effects of oligodeoxynucleotides on the physicochemical characteristics and cellular uptake of liposomes. // J. Pharm. Sci. 1997. -V. 86.-P. 438-442.

110. Tana T., Watarai S., Onuma M., Ochiai K., Kakidani H., Yasuda T. In vivo antitumor effect of cationic liposomes containing diphtheria toxin A-chain gene on cells infected with bovine leukemia virus. // J. Vet. Med. Sci., 1997, 59, 617.

111. Obata Y., Suzuki D., Takeoka S. Evaluation of cationic assemblies constructed with amino acid based lipids for plasmid DNA delivery. // Bioconjugate Chem. 2008. - V. 19.-P. 1055-1063.

112. Zana R., Xia J. Gemini surfactants: synthesis, interfacial and solution-phase behavior, and applications. 2004. - Science.

113. Moss R.A., Li J.M. Bilayer-bridging bolaamphiphilic lipids. // J. Am. Chem. Soc. -1992. V. 114. - P. 9227-9229.

114. Rosenzweig H.S., Rakhmanova V.A., MacDonald R.C. Diquaternary Ammonium Compounds as Transfection Agents. // Bioconjugate Chem. 2001. - V. 12. - P. 258-263.

115. Biswas J., Bajaj A., Bhattacharya S. Membranes of cationic gemini lipids based on cholesterol with hydroxyl headgroups and their interactions with DNA and phospholipid. // J. Phys. Chem. B. 2011. - V. 115. - P. 478^86.

116. Bajaj A., Kondaiah P., Bhattacharya S. Synthesis and gene transfer activities of novel serum compatible cholesterol-based gemini lipids possessing oxyethylene-type spacers. // Bioconjugate Chem. 2007. - V. 18. - P. 1537-1546.

117. Sapra P., Allen T.M. Internalizing antibodies are necessary for improved therapeutic efficacy of antibody-targeted liposomal drugs. // Cancer Res. 2002. - V. 62. - P. 71907194.

118. Aneed A.E. Targeted Cationic Liposomes. // Pharm. Technol. 2003. - V. 27. - P. 5862.

119. Ashwell G., Harford J. Carbohydrate-specific receptors of the liver. // Annu. Rev. Biochem. 1982. -V. 51. - P. 531- 554.

120. Spiess M. The asialoglycoprotein receptor: a model for endocytic transport receptors. // Biochemistry. 1990. - V. 29. - P. 10009-10018.

121. Zhang Y., Rong X., Gao Q., Maitani Y., Nagai T. Mechanisms of co-modified liver-targeting liposomes as gene delivery carriers based on cellular uptake and antigens inhibition effect. // J. Control. Release. 2007. - V. 117. - P. 281-290.

122. Salvador F., Alin O., Benet M., Dasi' F., Crespo J. Asialofetuin Liposomes for Receptor-Mediated Gene Transfer into Hepatic Cells. // Method. Enzymol. 2003. - V. 373. - P. 0076-6879.

123. Wu G.Y., Wu C.H. Receptor-mediated gene delivery and expression in vivo. // J. Biol. Chem. 1988. - V. 263. - P. 14621-14624.

124. Kunath K., Von Harpe A., Fischer D., Kissel T. Galactose-PEI-DNA complexes for targeted gene delivery: degree of substitution affects complex size and transfection efficiency. // J. Control. Release. 2003. - V. 88. - P. 159-172.

125. Alino S.F., Benet M., Dasi F., Crespo J. Asialofetuin liposomes for receptor-mediated gene transfer into hepatic cells. // Method. Enzymol. 2003. - V. 373. - P. 399-421.

126. Kawakami S., Munakata C., Fumoto S., Yamashita F., Hashida M. Novel galactosylated liposomes for hepatocyte-selective targeting of lipophilic drugs. // J. Pharm. Sci. 2001. -V. 90.-P. 105-113.

127. Iters L.E., Ren T., Liu D. Synthesis of targetable cationic amphiphiles. // Tetrahedron Lett. 1999. - V. 40. - P. 7621-7625.

128. Ren T., Zhang G., Liu D. Synthesis of galactosyl compounds for targeted gene delivery. // Bioorgan. Med. Chem. 2001. - V. 9. - P. 2969-2978.

129. Fabio K., Gaucheron J., Di Giorgio C., Vierling P. Novel galactosylated polyamine bolaamphiphiles for gene delivery. // Bioconjugate Chem. 2003. - V. 14. - P. 358-367.

130. Connolly D.T., Townsend R.R., Kawaguchi K., Bell W.R., Lee Y.C. Binding and endocytosis of cluster glycosides by rabbit hepatocytes. Evidence for a short-circuit pathway that does not lead to degradation. // J. Biol. Chem. 1982. - V. 257. - P. 939945.

131. Lee Y.C., Lee R.T. Carbohydrate-Protein Interactions: Basis of Glycobiology. // Accounts Chem. Res. 1995. -V. 28. - P. 321-327.

132. Lee Y.C., Townsend R.R., Hardy M.R., Lônngren J., Arnarp J., Haraldsson M., Lônn H. Binding of synthetic oligosaccharides to the hepatic Gal/GalNAc lectin. Dependence on fine structural features. // J. Biol. Chem. 1983. - V. 258. - P. 199-202.

133. Y.C. Lee, R.T. Lee in "Carbohydrates in Chemistry and Biology" (Eds. Ernst B., Hart G.W., Sinay P.). Weinheim. - 2000. - V. 4. - Wiley-WCH. - P. 549-561.

134. Biessen E.A., Vietsch H., Van Berkel T.J. Cholesterol derivative of a new triantennary cluster galactoside lowers serum cholesterol levels and enhances secretion of bile acids in the rat. // Circulation. 1995. - V. 91. - P. 1847-1854.

135. Leamon C.P., Low P.S. Folate-mediated targeting: from diagnostics to drug and gene delivery. // Drug Discov. Today. 2001. - V. 6. - P. 44-51.

136. Wu M., Gunning W., Ratnam M. Expression of folate receptor type a in relation to cell type, malignancy, and differentiation in ovary, uterus, and cervix. // Cancer Epidem. Biomar. 1999. - V. 8. - P. 775-782.

137. Hattori Y., MaitaniY. Folate-linked lipid-based nanoparticle for targeted gene delivery. // Curr. Drug Deliv. 2005. - V. 2. - P. 243-252.

138. Kim S.H., Jeong J.H., Mok H., Lee S.H., Kim S.W., Park T.G. Folate receptor targeted delivery of polyelectrolyte complex micelles prepared from ODN-PEG-folate conjugate and cationic lipids. // Biotechnol. Prog. 2007. - V. 23. - P. 232-237.

139. Leamon C.P., Reddy J.A., Vlahov I.R., Vetzel M., Parker N., Nicoson J.S., Xu L.C., Westrick E. Synthesis and biological evaluation of EC72: a new folate-targeted chemotherapeutic. // Bioconjug. Chem. 2005. - V. 16. - P. 803- 811.

140. Lee R.J., Low P.S. Folate-mediated tumor cell targeting of liposome entrapped doxorubicin in vitro. // Biochim. Biophys. Acta. 1995. - V. 1233. - P. 134-144.

141. Leamon C.P., Cooper S.R., Hardee G.E. Folate-liposome-mediated antisense oligodeoxynucleotide targeting to cancer cells: evaluation in vitro and in vivo. // Bioconjugate Chem. 2003. - V. 14. - P. 738-747.

142. Guo W.J., Lee T., Sudimack J., Lee R.J. Receptor-specific delivery of liposomes via folate-PEG-Chol. // J. Liposome Res. 2000. - V. 10. - P. 179-195.

143. Gabizon A., Horowitz A.T., Goren D., Tzemach D., Shmeeda H., Zalipsky S. In vivo fate of folate-targeted polyethene-glycol liposomes in tumorbearing mice. // Clin. Cancer Res. 2003. - V. 9. - P. 6551-6559.

144. Xiang G., Wu J., Lu Y., Liu Z., Lee R.J. Synthesis and evaluation of a novel ligand for folate-mediated targeting liposomes. // Int. J. Pharm. 2008. - V. 356. - P. 29-36.

145. Leamon C.P., DePrince R.B., Hendren R.W. Folate-mediated drug delivery: eVect of alternative conjugation chemistry. // J. Drug Target. 1999. - V. 7. - P. 157-169.

146. Zhang Y., Guo L., Roeske R. W., Antony A.C., Jayaram H.N. Pteroyl-gamma-glutamate-cysteine synthesis and its application in folate receptor-mediated cancer cell targeting using folate-tethered liposomes. // Anal. Biochem. 2004. - V. 332. - P. 168177.

147. Laine C., Mornet E., Lemiegre L., Montier T., Cammas-Marion S., Neveu C., Carmoy N., Lehn P., Benvegnu T. Folate-equipped pegylated archaeal lipid derivatives: synthesis and transfection properties. // Chemistry. 2008. - V. 14. - P. 8330-8340.

148. Yoshizawa T., Hattori Y., Hakoshima M., Koga K., Maitani Y. Folate-linked lipid-based nanoparticles for synthetic siRNA delivery in KB tumor xenografts. // Eur. J. Pharm. Biopharm. 2008. - V. 70. - P. 718-725.

149. Hattori Y., Maitani Y. Enhanced in vitro DNA transfection efficiency by novel folate-linked nanoparticles in human prostate cancer and oral cancer. // J. Control. Release. -2004.-V. 97.-P. 173-183.

150. Hofland H.E.J., Masson C., Iginla S., Osetinsky I., Reddy J.A., Leamon C.P., Scherman D., Bessodes M., Wils P. Folate-targeted gene transfer in vivo. II Mol. Ther. 2002. - V. 5.-P. 739-744.

151. Turk M.J., Breur G.J., Widmer W.R., Paulos C.M., Xu L.C., Grote L.A., Low P.S. Folate-targeted imaging of activated macrophages in rats with adjuvantinduced arthritis. // Arthr. Rheum. 2002. - V. 4. - P. 1947-1955.

152. Tros De Ilarduya C., Duzgune§ N. Efficient gene transfer by transferrin lipoplexes in the presence of serum. // Biochim. Biophys. Acta. 2000. - V. 14. - P. 333-342.

153. Mendon9a L.S., Firmino F., Moreira J.N., Pedroso De Lima M.C., Simoes, S. Transferrin receptor-targeted liposomes encapsulating anti-BCR-ABL siRNA or asODN for chronic myeloid leukemia treatment. // Bioconjugate Chem. 2010. - V. 21. - P. 157-168.

154. Singh M., Hawtrey A., Ariatti M. Lipoplexes with biotinylated transferrin accessories: novel, targeted, serum-tolerant gene carriers. // Int. J. Pharm. 2006. - V. 321. - P. 124137.

155. Temming K., Schiffelers R.M., Molema G., Kok R.J. RGD-based strategies for selective delivery of therapeutics and imaging agents to the tumour vasculature. // Drug Resist. Update. 2005. - V. 8. - P. 381-402.

156. Suzuki T., Futaki S., Niwa M., Tanaka S., Ueda K., Sugiura Y. Possible existence of common internalization mechanisms among arginine-rich peptides. // J. Biol. Chem. -2002. V. 277. - P. 2437-2443.

157. Tyagi M., Rusnati M., Presta M., Giacca M. Internalization of HIV-1 tat requires cell surface heparan sulfate proteoglycans. // J. Biol. Chem. 2001. - V. 276. - P. 3254-3261.

158. Rajur S.B., Roth C.M., Morgan J.R., Yarmush M.L. Covalent protein-oligonucleotide conjugates for efficient delivery of antisense molecules. // Bioconjugate Chem. 1997. -V. 8.-P. 935-940.

159. Morris M.C., Vidal P., Chaloin L., Heitz F., Divita G. A new peptide vector for efficient delivery of oligonucleotides into mammalian cells. // Nucleic Acids Res. 1997. - V. 25. - P. 2730-2736.

160. Simeoni F., Morris M.C., Heitz F., Divita G. Insight into the mechanism of the peptide-based gene delivery system MPG: implications for delivery of siRNA into mammalian cells. //Nucleic Acids Res. -2003. -V. 31. P. 2717-2724.

161. Rudolph C., Plank C., Lausier J., Schillinger U., Muller R.H., Rosenecker J. Oligomers of the arginine-rich motif of the HIV-1 Tat protein are capable of transferring plasmid DNA into cells. // J. Biol. Chem. 2003. - V. 278. - P. 11411 - 11418.

162. Liu Z., Li M., Cui D., Fei J. Macro-branched cell-penetrating peptide design for gene delivery. // J. Control. Release. 2005. - V. 102. - P. 699-710.

163. Boomer J.A., Thompson D.H., Sullivan S.M. Formation of plasmid-based transfection complexes with an acid-labile cationic lipid: characterization of in vitro and in vivo gene transfer. // Pharm. Res. 2002. - V. 19. - P. 1292-1301.

164. Zhu M.Z., Wu Q.H., Zhang G., Ran T., Liu D., Guo Q.X. Synthesis and evaluation of cationic lipids bearing cholesteryl groups for gene delivery in vitro. II Bull. Chem. Soc. Jpn. 2002. - V. 75. - P. 2207-2213.

165. Zhu J., Munn R.J., Nantz M.H. Self-cleaving ortho ester lipids: a new class of pH-vulnerable amphiphiles. // J. Am. Chem. Soc. 2000. - V. 122. - P. 2645-2646.

166. Kuppusamy P., Li H., Ilangovan G., Cardounel A.J., Zweier J.L., Yamada K., Krishna M.C., Mitchell J.B. Noninvasive imaging of tumor redox status and its modification by tissue glutathione levels. // Cancer Res. 2002. - V. 62. - P. 307-312.

167. Tang F., Hughes J.A. Introduction of a disulfide bond into a cationic lipid enhances transgene expression of plasmid DNA. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. - V. 242.-P. 141-145.

168. Tang F., Hughes J.A. Use of dithiodiglycolic acid as a tether for cationic lipids decreases the cytotoxicity and increases transgene expression of plasmid DNA in vitro. // Bioconjugate Chem. 1999. - V. 10. - P. 791-796.

169. Huang Z., Li W., MacKay J.A., Szoka F.C. Thiocholesterol-based lipids for ordered assembly of bioresponsive gene carriers. // Mol. Ther. 2005. - V. 11. - P. 409-417.

170. Ferrer-Miralles N., Vázquez E., Villaverde A. Membrane-active peptides for non-viral gene therapy: making the safest easier. // Trend. Biotechnol. 2008. - V. 26. - P. 267275.

171. Мок H.J., Park T.G. Self-crosslinked and reducible fusogenic peptides for intracellular delivery of siRNA. // Biopolymers. 2008. - V. 89. - P. 881-888.

172. Gottschalk S., Sparrow J.T., Hauer J., Mims M.P., Leland F.E., Woo S.L., Smith L.C. A novel DNA-peptide complex for efficient gene transfer and expression in mammalian cells. // Gene Ther. 1996. - V. 3. - P. 448-457.

173. Mann A., Thakur G., Shukla V., Ganguli M. Peptides in DNA delivery: current insights and future directions. // Drug Discov. Today. 2008. - V. 13. - P. 152-160.

174. Torchilin V.P. Recent advances with liposomes as pharmaceutical carriers. // Nat. Rev. Drug Discov. 2005. - V. 4. - P. 145-160.

175. Nakamura Т., Akita H., Yamada Y., Hatakeyama H., Harashima H. A Multifunctional envelope-type nanodevice for use in nanomedicine: concept and applications. // Accounts Chem. Res. -2012 doi:10.1021/ar200254s.

176. Маслов M.A., Сычева E.B., Морозова Н.Г., Серебренникова Г.А. Синтез алкильных глицеролипидов с различными катионными группами, присоединенными непосредственно к глицериновому скелету. // Изв. АН. Сер. хим. 1999.-№7.-С. 1381-1384.

177. Pojer P.M., Angyal S.J. Methylthiomethyl ethers: their use in the protection and methylation of hydroxyl group. // Aust. J. Chem. 1978. -V. 31. - P. 1031-1040.

178. Cordes E.H., Bull H.G. Mechanism and catalysis for hydrolysis of acetals, ketals, and ortho esters. // Chem Rev. 1974. - V. 74. - P. 581-603.

179. Tolkach A.M., Polonik S.G., Uvarova N.I. USSR Inventor's certificate no. 1428755. // Byull. Izobret. 1988, - no. 37.

180. Mitsunobu O. in "Comprehensive Organic Synt." (Eds. Trost B.M., Fleming I.). 1991. - V. 6. - P.63. - Oxford: Pergamon.,

181. Fukuyama Т., Jow C.-K., Cheung M. 2- and 4-Nitrobenzenesulfonamides: Exceptionally versatile means for preparation of secondary amines and protection of amines. // Tetrahedron Lett. 1995. - V. 36. - P. 6373-6374.

182. Protective Groups in Organic Synthesis (Eds. P. G. M. Wuts, T. W. Greene). 1999. -Wiley-Interscience.

183. Broderick S., Davis A.P, Williams R.P. The "triamino-analogue" of methyl cholate; a facial amphiphile and scaffold with potential for combinatorial and molecular recognition chemistry. // Tetrehedron lett. 1998. - V. 39. - P. 6083-6086.

184. Li C., Rehman A., Dalley N.K., Savage P.B. Short synthesis of triamine derivatives of cholic acid. // Tetrahedron lett. 1999. - V. 40. - P. 1861-1864.

185. Vandenburg Y.R., Smith B.D., Perez-Payan M.N., Davis A.P. Non-leaky Vesicle Fusion and Enhanced Cell Transfection Using a Cationic Facial Amphiphile. // J. Am. Chem. Soc. 2000. - V. 122. - P. 3252-3253.

186. Davis A.P., Perez-Payan M.N. The "Triamino-analogue" of methyl cholate; a practical, large-scale synthesis // Synlett. 1999. - P. 991-993.

187. Anikin A., Maslov M., Sieler J., Blaurock S., Baldamus J., Hennig L., Findeisen M., Reinhardt G., Oehme R., Welzel P. Synthesis of a la-amino-l-deoxy analogue of forskolin. // Tetrahedron. 2003. - V. 59. - P. 5295-5305.

188. Hofmann A.F. The preparation of chenodeoxycholic acid and its glycine and taurine conjugates. // Acta Chem. Scand. 1963. - V. 17. - P. 173-186.

189. Riva S., Bovara R., Pasta P., Carrea G. Preparative-scale regio- and stereospecific oxidoreduction of cholic acid and dehydrocholic acid catalyzed by hydroxysteroid dehydrogenases. // J. Org. Chem. 1986. - V. 51. - P. 2902-2906.

190. Kuwada S., Furushiro S., Kawashima M. Partial oxidation of methyl cholate // Ann. Rep. Takeda Res. Lab. 1949. - V. 8. - P. 50-61.

191. Dueffels A., Green L.G., Ley S.V., Miller A.D. Synthesis of high-mannose type neoglycolipids: active targeting of liposomes to macrophages in gene therapy. // Chem. Eur. J. 2000. - V. 6. - P. 1416-1430.

192. Jacopin C., Hofland H., Scherman D., Herscovici J. Synthesis and transfecting properties of a glycosylated polycationic DNA vector. // Bioorg. Med. Chem. Lett. -2001.-V. 11.-P. 419-422.

193. Mukthavaram R., Marepally S., Venkata M.Y., Vegi G.N., Sistla R., Chaudhuri A. Cationic glycolipids with cyclic and open galactose head groups for the selective targeting of genes to mouse liver // Biomaterials. 2009. - V. 30. - P. 2369-2384.

194. Carbohydrate Chemistry (Ed. G.J. Boons). London. - 1998. - Blackie Academic and Professional.

195. Bergh A., Magnusson B.G., Ohlsson J., Wellmar U., Nilsson U.J. Didecyl squarate—A practical amino-reactive cross-linking reagent for neoglycoconjugate synthesis. // Glycoconjugate J. 2001. - V. 18. - P. 615-621.

196. Salvati A., Ciani L., Ristori S., Martini G., Masi A., Arcangeli A. Physico-chemical characterization and transfection efficacy of cationic liposomes containing the pEGFP plasmid. // Biophys. Chem. 2006. - V. 121. - P. 21-29.

197. Le D.T., Pardoll D.M., Jaffee E.M. Cellular vaccine approaches. // Cancer J. 2010. -V. 16.-P. 304-310.

198. Proudfoot O., Apostolopoulos V., Pietersz G.A. Receptor-mediated delivery of antigens to dendritic cells: anticancer applications. // Molecular Pharmaceutics. 2007. - V. 4. - P. 58-72.

199. Brossart P., Goldrath A.W., Butz E.A. Virus-mediated delivery of antigenic epitopes into dendritic cells as a means to induce CTL. // J. Immunol. 1997. - V. 158. - P. 3270-3276.

200. Metharom P., Ellem K.A., Scmidt C., Wei M.Q. Lentiviral vector-mediated tyrosinase-related protein 2 gene transfer to dendritic cells for the therapy of melanoma. // Hum. Gene Ther. 2001. - V. 12. - P. 2203-2213.

201. Andre F., Mir L.M. DNA electrotransfer: its principles and an updated review of its therapeutic applications. // Gene Ther. 2004. - V. 11. - P. 33-42.

202. Kim T.H., Nah J.W., Cho M.H., Park T.G., Cho N.S. Receptor-mediated gene delivery into antigen presenting cells using mannosylated chitosan/DNA nanoparticles. // J. Nanosci. Nanotechnol. 2006. - V. 6. - P. 2796-2803.

203. Weecharangsan W., Opanasopit P., Ngawhirunpat T., Apirakaramwong A., Rojanarata T., Ruktanonchai U., Lee R.J. Evaluation of chitosan salts as non-viral gene vectors in CHO-K1 cells. // Int. J. Pharm. 2008. - V. 348. - P. 161-168.

204. Streitz J., Tormo D., Schweichel D., Tuting T. Comparison of recombinant adenovirus and synthetic peptide for DC-based melanoma vaccination. // Cancer Gene Ther. 2006. -V. 13.-P. 318-325.

205. Murakami T., Tokunaga N., Waku T., Gomi S., Kagawa S., Tanaka N., Fujiwara T. Antitumor effect of intratumoral administration of bonemarrow-derived dendritic cells transduced with wild-type p53 gene. // Clin. Cancer Res. 2004. - V. 10. - P. 3771-3880.

206. Yuba E., Kojima C., Sakaguchi N., Harada A., Koiwai K., Kono, K. Gene delivery to dendritic cells mediated by complexes of lipoplexes and pH-sensitive fusogenic polymer-modified liposomes. // J. Control. Release. 2008. - V. 130. - P. 77-83.

207. Lu Y., Kawakami S., Yamashita F., Hashida M. Development of an antigen-presenting cell-targeted DNA vaccine againstmelanoma bymannosylated liposomes. // Biomaterials. 2007. - V. 28. - P. 3255-3262.

208. Foged C., Arigita C., Sundblad A., Jiskoot W., Storm G., Frokjaer S. Interaction of dendritic cells with antigencontaining liposomes: effect of bilayer composition. // Vaccine. 2004. - V. 2. - P. 15-16.

209. Van Driessche A., Ponsaerts P., Van Bockstaele D.R., Van Tendeloo V.F., Berneman Z.N. Messenger RNA electroporation: an efficient tool in immunotherapy and stem cell research. // Folia Histochem. Cytobiol. 2005. - V. 43. - P. 213-216.

210. Аникин М.В., Ушакова И.П., Серебренникова Г.А., Евстигнеева Р.П. Синтез 1,2-ди-О-алкилглицеринов с использованием аллильной защитной группы. Черкассы. - 1987. - Деп. ОНИИТЭИХим. - №915-хп87.

211. Miller К.А., Kumar E.V.K.S., Wood S.J., Cromer J.R., Datta A., David S.A. Lipopolysaccharide Sequestrants: Structural Correlates of Activity and Toxicity in Novel Acylhomospermines. // J. Med. Chem. 2005. - V. 48. - P. 2589-2599.

212. Dahmen J., Frejd T., Magnusson G., Noori G. Preparation and applications of 2-bromoethyl glycosides: synthesis of spacer-arm glycosides and agglutination inhibitors. // Carbohyd. Res. 1982. - V. 111. - P. CI-C4.

213. Hudson C.S., Johnson J.M. Isomeric Octaacetates of Lactose. // J. Am. Chem. Soc. -1915.-V. 37.-P. 1270-1275.

214. Boeckman R.K., Shao P., Mullins J.J. The Dess-Martin periodinane: 1,1,1-triacetoxy-1,1 -dihydro-1,2-benziodoxol-3( 1 H)-one. // Org. Synth. 2000. - V. 77. - P. 141-152.

215. Донсон P., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. // Москва. -1991.-Мир.

216. Kritchevsky D., Kirk M.R. Detection of steroids in paper chromatography. // Arch. Biochem. Biophys. 1952. - V. 35.-P. 346-351.

217. Uvarova N.I., Atopkina L.N., Elyakov G.B. Synthesis of triterpene and steroid glycosides. // Carbohydr. Res. 1980. - V. 83. - P. 33-42.

218. Hardegger E.; de Pascual J. Glucoside und (3-1,3,4,6-Tetraacetyl-glucose aus Triacetyl-glucosan-a<l,2>p<l,5>. // Helvetica Chimica Acta. 1948. - V. 31. - P. 281-286.

219. Yuuki H., Michiko I., Toshiaki F. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2003. - V. 13. - P. 905908.

220. Hill R.A., Kirk D.N., Makin H.L.J., Murphy G.M. Dictionary of Steroid. // London. -1991,-Chapman & Hall.

221. Proudnikov D., Mirzabekov A. Chemical methods of DNA and RNA fluorescent labeling. // Nucleic Acids Res. 1996. - V. 24. - P. 4535-4542.

222. Darnha M.J., Ogilvie K.K. Oligoribonucleotide Synthesis The Silyl-Phosphoramidite Method. // Methods Mol. Biol. 1993. - V. 20. - P. 81-114.

223. Donis-Keller H., Maxam A.M., Gilbert W. Mapping adenines, guanines, and pyrimidines in RNA. // Nucleic Acids Res. 1977. - V. 4. - P. 2527-2538.

224. Carmichael J., De Graff W.G., Gazdar A.F., Minna J.D., Mitchell J.B. Evaluation of tetrazolium based semi-automated colorimetric assay: Assessment of chemosensitivity testing. // Cancer Res. 1987. - V. 47. - P. 936-942.