Синтез катионных амфифилов на основе стероидных соединений

Соколова, Татьяна Валерьевна

Синтез катионных амфифилов на основе стероидных соединений тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Соколова, Татьяна Валерьевна АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ

2003 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.10 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Синтез катионных амфифилов на основе стероидных соединений»

Автореферат диссертации на тему "Синтез катионных амфифилов на основе стероидных соединений"

На правах рукописи

СОКОЛОВА ТАТЬЯНА ВАЛЕРЬЕВНА

СИНТЕЗ КАТИОННЫХ АМФИФИЛОВ НА ОСНОВЕ СТЕРОИДНЫХ СОЕДИНЕНИЙ

Специальность 02.00.10 — Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА —2003

Работа выполнена на кафедре Химии и технологии тонких органических соединений Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Серебренникова Галина Андреевна

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Предводителев Дмитрий Александрович

доктор химических наук, вед н с. Ведущая организация:

Степанов Александр Евгеньевич

Российский Кардиологический Научно-производственный Комплекс МЗ РФ

Защита диссертации состоится « ££ »г. в часов на заседании Диссертационного Совета Д 212.120.01 при Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, пр. Вернадского, 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М. В. Ломоносова (119831, Москва, М. Пироговская, 1) Автореферат разослан 2003 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат химических наук, > /

старший научный сотрудник Д^&ги*^

ЛютикА. И.

---з

117}

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В современной медицине известно большое число заболеваний, непосредственно связанных с нарушениями функционирования генов Для их лечения успешно развивается одна из перспективных областей медицины -генная терапия, которая направлена либо на коррекцию наследственного заболевания, возникшего вследствие генетического дефекта, либо на придание клеткам новых функций, способствующих устранению патологических процессов. Необходимым условием генотерапии является эффективная доставка терапевтического гена (трансфекция) в клетки-мишени и обеспечение его экспрессии и длительного функционирования в этих клетках.

В настоящее время большое внимание уделяется разработке невирусных систем доставки гена. Среди них высоким терапевтическим потенциалом обладает липофекция, в основе которой лежит транспорт генетического материала в клетки с помощью катионных липосом. Положительно заряженные липосомы выступают в качестве компактизирующего средства, защищая молекулы ДНК, мРНК и олигонукпеотидов от инактивации под действием клеточных ферментов. Они способны переносить через клеточную мембрану молекулы ДНК больших размеров и инициировать эндоцитоз. Важным преимуществом систем доставки генов на основе липосом является их биодеградируемость, низкая вероятность инициации иммунного ответа или воспалительной реакции. Катионные липосомы можно получить традиционными методами, они коммерчески доступны и стабильны при хранении. Необходимо отметить, что метод трансфекции, использующий в качестве медиаторов положительно заряженные липосомы, может оказаться перспективным в ферментно- и гормоно-заместительной терапии при лечении разных форм таких заболеваний, как сахарный диабет, дефекты роста, заболевания крови и онкологические заболевания.

Разнообразие состава липосом и структурных параметров образующих их

липидов определяет механизмы их взаимодействия с биологическими системами.

Положительно заряженные липосомы, сформированные из катионных липидов и

липидов-«хелперов» способны образовывать комплексы с плазм ид ной ДНК

(геносомы или липоплексы) за счет электростатического взаимодействия между

положительно заряженной гидрофильной частью катионного липида и отрицательно

заряженными фосфатными группами нуклеиновых кч^пГ1" Пппгг пряигжрлит

проникновение геносомы в клетки-мишени, внутр л¡ние

С. Петербург (¿Ур— РЭ «яг/? 'г

комплекса, его диссоциация и последующая экспрессия ДНК в ядре. Для повышения эффективности метода липофекции необходимо оптимизировать такие характеристики как стабильность геносомы, способность эндосомального высвобождения комплекса липосома-ДНК, регулируемость экспрессии.

Для получения катионных липосом наиболее перспективными являются метаболизируемые липиды с минимальной цитотоксичностью. В связи с этим целесообразно проводить их поиск в ряду модифицированных природных липидов.

В настоящее время синтезирован большой набор положительно заряженных глицеролипидов с различными алифатическими и гетероциклическими катионными головками, которые показали высокую эффективность трансфекции. Дальнейшее i получение и изучение новых катионных липидов, в частности производных холестерина и желчных кислот, может привести к созданию удобных и эффективных систем для введения в клетку различных биологически активных веществ: нуклеозидов, олиго- и полинуклеотидов, гормонов, белков и других природных и синтетических макромолекул с отрицательно заряженными участками молекулы.

Данная работа является продолжением исследований в области катионных амфифилов, предназначенных для трансфекции, и посвящена созданию модификационных рядов катионных липидов с одной или несколькими катионными фуппами на основе стероидных соединений.

Настоящая работа выполнена в соответствии с планом научных исследований кафедры ХТТОС МИТХТ им М. В. Ломоносова по теме № 1Б-4-865 «Синтез супрамолекулярных структур на основе порфиринов, липидов и углеводов с целью изучения процессов, протекающих в клетке и создания препаратов для онкологии, генной терапии и других областей медицины» и при поддержке РФФИ, проекты № 01-03-33234, 00-15-866, 03-03-32482, научно-технической программы «Научные исследования высшей школы по приоритетным направлениям науки и техники», подраздел «Лекарственные и биологически активные вещества» № ,

203.05.04.005, фанта Президента РФ по поддержке ведущих научных школ России № НШ-2013.2003.3, фанта МНТЦ № 1813р.

Цель работы.

1. Синтез положительно заряженных производных холестерина с различными азотистыми основаниями гетероциклического и - алифатического ряда.

■ ' '.' I г

■ Ь >

"»• < <

2. Разработка метода синтеза катионных амфифилов на основе холестерина с использованием метилтиометиловых эфиров.

3. Разработка способов полумения поликатионных амфифилов на основе дезоксихолевой кислоты с целью повышения плотности положительного заряда на поверхности катионных липосом.

4. Получение модификационных рядов катионных производных холестерина и дезоксихолевой кислоты для изучения взаимосвязи структуры и биологической активности.

Научная новизна работы. В результате проведенных исследований нами впервые синтезированы новые катионные липиды на основе холестерина с различными азотистыми основаниями алифатического и гетероциклического ряда и с различными спейсерными группами.

Предложены новые способы синтеза поликатионных амфифилов на основе дезоксихолевой кислоты. Получены модификационные ряды катионных липидов, отличающихся структурой гидрофобного домена (дезоксихолевая кислота, холестерин), полярной группировки (пиридиниевая, метилимидазолиевая, метилморфолиниевая, диметиламинопиридиниевая, пиперазиниевая, амина-, триметиламмониевая группы), а также типом связи между гидрофобной и гидрофильной областями (сложноэфирная, карбамоильная, ацетальная).

Для синтеза новых катионных производных холестерина с ацетальной связью впервые применен способ, основанный на применении метилтиометиловых эфиров.

Практическая значимость работы. Разработаны удобные способы синтеза положительно заряженных производных холестерина и дезоксихолевой кислоты. Впервые получены катионные амфифилы на основе стероидных соединений с различными алифатическими и гетероциклическими основаниями и различным типом присоединения полярной группы к гидрофобному домену.

Направленная модификация молекулы катионного липида по определенным доменам создает возможность проведения структурно-функциональных исследований по выявлению зависимости трансфекционной активности этих соединений от строения каждой структурной единицы.

В результате проведенных исследований нами значительно расширен класс катионных липидов на основе стероидных производных, которые могут быть рекомендованы для использования в процессе трансфекции. Новые положительно

заряженные липиды получены в количествах, достаточных для проведения биологических испытаний.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Синтез положительно заряженных производных холестерина с азотистыми основаниями гетероциклического и алифатического ряда.

2. Получение катионных амфифилов на основе холестерина с использованием метилтиометиловых эфиров

3. Синтез поликатионных амфифилов на основе дезоксихолевой кислоты.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на Международной конференции молодых ученых «Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок. Экологически безопасные технологии - 2001» (2001, Тверь), на VII Международной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии - 2001» - 2-я школа молодых ученых (2001, Ярославль), на 1 Международном конгрессе "Биотехнология - состояние и перспективы развития" (2002, Москва), на VIII Международной научно-технической конференции по проблемам наукоемких химических технологий "Наукоемкие химические технологии - 2002" (2002, Уфа), на III Съезде биохимического общества (2002, Санкт-Петербург), на отчетной конференции за 2002 год «Химия и химические продукты» (2003, Москва), на XVII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (2003, Казань).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и тезисы 7 докладов.

Объем и структура работы.

Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной часта, выводов и списка цитируемой литературы, включающего {ЗЧисточника. Работа иллюстрирована JO рисунками и содержит схем и S" таблиц.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Липофекция как метод трансфекции использует катионные липосомы в качестве средства доставки экзогенной ДНК в клетки. Проводится интенсивное изучение положительно заряженных липидов, которые формируют липосомы, для выявления связи менаду структурой и биологической активностью.

Молекулу катионного амфифила можно рассматривать как структурную комбинацию нескольких единиц (доменов), связанных мехаду собой определенным типом химической связи. Можно выделить три основных структурных домена в молекуле катионного липида: гидрофобная область, положительно заряженная группа и соединяющий их спейсер. Природа, взаимное расположение и размеры структурных доменов катионных липидов обуславливают определенный тодрофильно-липофильный баланс в молекуле, что оказывает влияние на эффективность образования геносом и их стабильность.

Наши исследования направлены на структурную модификацию различных доменов в молекуле амфифила, что поможет установить влияние природы каждой составляющей на эффективность трансфекции (рис. 1).

изменение гидрофобного домом

изменение природы изменение природы, длины

основания слей сера и типа связывания

Рис. 1. Общие направления модификации структуры катионных липидов на основе стероидных соединений

1. СИНТЕЗ КАТИОННЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ХОЛЕСТЕРИНА С АЗОТИСТЫМИ ОСНОВАНИЯМИ ГЕТЕРОЦИКЛИЧЕСКОГО И АЛИФАТИЧЕСКОГО РЯДА

Из литературных данных известно, что катионные амфифилы, содержащие в качестве гидрофобного остатка холестерин, обладают высокой трансфекционной

активностью, низкой токсичностью и применяются для исследования механизмов слияния искусственных мембран и структурно-функционального изучения сформированных на их основе геносом. Среди синтезированных производных холестерина можно выделить коммерческий препарат, созданный на основе 3fi-[N-(W'N-диметипаминоэтил)карбамоип]холестерина (DC-Choi). Липосомы, приготовленные из смеси липидов DC-Chol/DOPE (1,2-диолеоил-бп-глицеро-3-фосфатидилэтаноламин) (3:2), широко используются для доставки генетических конструкций при иммунотерапии опухолей, искусственной вакцинации и проходят клинические испытания для лечения муковисцидоза.

На трансфекционную активность положительно заряженных липидов t оказывает влияние природа гидрофобного домена, тип катионной головки, длина спейсера и тип связи между гидрофобной и гидрофильной областями. Установлено, что для эффективной трансфекции оптимальный размер спейсерной группировки должен быть эквивалентен цепи до 6 метиленовых звеньев.

В связи с этим наши исследования по синтезу катионных производных холестерина развивались по нескольким направлениям: 1) изменение природы полярной группировки (метилимидазолиевая, пиридиниевая,

диметиламинопиридиниевая, метилморфолиниевая, пиперазиниевая, амино-, триметиламмониевая группы); 2) изменение длины спейсера, представленного остатками бромвалериановой и янтарной кислоты; 3) изменение типа связи между гидрофильным и гидрофобным доменами (сложноэфирная, карбамоильная, ацетальная).

1.1. Синтез катионных липидов со спейсерной группой, представленной остатком 5-бромвалериановой кислоты

С целью получения новых типов катионных липидов мы предприняли синтез холестеринсодержащих катионных амфифилов, в которых гетероциклические основания (имидазол, пиридин, диметиламинопиридин, морфолин, пиперазин) присоединены к холестерину через спейсерную группу, представленную остатком 5-бромвалериановой кислоты (схема 1).

Ключевым соединением в синтезе липидов являлся 5-бромвалерат холестерина (2), который был получен ацилированием холестерина (1) хлорангидридом 5-бромвалериановой кислоты в присутствии безводного пиридина с выходом 70%. Реакцию соединения (2) с такими гетероциклическими основаниями как имидазол, Л/,Л/-диметиламинопиридин, морфолин, пиперазин мы проводили в

присутствии Nal в среде безводного DMSO. Замена брома в условиях реакции Финкельштейна на более реакционноспособный йод позволила уменьшить продолжительность процесса и снизить температуру, что помогло избежать осмоления продуктов реакции. Выходы конечных продуктов 3,6, 7 и 9 колебались от 62 до 86%.

Реакция пиридина с бромидом 2 успешно протекала при нагревании, в отсутствие Nal. Выход катионного производного 5 в реакции кватернизации достигал 91%. Третичные амины 3 и 7, полученные взаимодействием бромида 2 с имидазолом и морфолином, в дальнейшем были превращены в четвертичные аммониевые производные 4 и 8 обработкой метилиодидом с выходами 78 и 73%, соответственно.

Схема 1

Вг(СН2)4СО

оЛ-^-"^ RÍC

R(CH2)4CO

Соединение

"О

—N—VMe

|- N

тО

NMej

—N^_О

—^NH

Реагенты и условия

Стадия Продукт Реагенты Температура, °С Время, ч Выход, %

а 2 Br(CH2)4COCI, Ру/СНС13 20 48 70

Ь 3 Имидазол, Nal/DMSO 75 8 62

с 4 Mel/MeCOMe 60 5 78

d 5 Ру 65 9 91

е 6 DMAP, Nal/DMSO 70 8 85

f 7 Морфолин, Nal/DMSO 75 10 86

д 8 Mel/MeCOMe 60 3 73

h 9 пиперазин, Nal/DMSO 70 7 67

Данные ЯМР 1Н и масс-спектров подтвердили структуру полученных катионных липидов (таблица 1).

Таблица 1

Физико-химические характеристики катионных липидов 4, 5, 6 и 8

№ соединения [alo20 * Масс-спектр, m/z (MALDI-MS) Спектр ЯМР 'H, м.д./ J, Гц

n*ch2 Катионная фуппа

4 -12.28 551.8 [M-lf т, 4.31/7.4 с, 4.02 N*Me, м, 7.40 и с, 9.91 имидазол

5 -20 08 548 3 IM-Br]* т, 5 02/ 7.0 три М, 8 16, 8 58 и 9.32 пиридин

6 -11 20 591.8 [M-l]' т, 4.35/7.0 с, 3 25 NMe2, два м, 6.95 и 8.42 C5H¿N

8 -11.90 570.5 [M-lf м, 3 65 с, 3.58 N*Me, два м, 3.71 и 4.06 морфолин

* с 1.0, CHCI3-MeOH (2.1)

Из литературных данных известно, что глицеролипиды с катионной головкой, представленной алифатическими основаниями (Л/,Л/-диметилэтаноламин, N,N-диметилэтилендиамин) успешно применяются в качестве медиаторов трансфекции. С целью изучения влияния типа положительно заряженной головки на трансфекционную активность нами осуществлен синтез катионных амфифилов с алифатическими основаниями (схема 2).

Взаимодействием бромида 2 с А/,Л/-диметилэтаноламином в среде DMSO в присутствии Nal был получен целевой продукт Л/-[(4'-(3/9*олестерилоксикарбонил-бутил))-Л/,Л/-диметил-Л/-гидроксиэтил]аммонийиодид 10 с выходом 75%.

Схема 2

MezNCH^HzN^CH^COO^4^4^ Me *Ме

Реагенты и условия: a) Me2NCH2CH2OH, Nal, DMSO, 7 ч, 90°С, 75%; Ь) Me2NCH2CH2NMe2, Nal, DMSO, 10 ч, 90°С, 83%.

При кватернизации А/,А/,Л/',А/'-тетраметилэтилендиамина бромидом 2 при нагревании в DMSO в тех же условиях был синтезирован катионный липид 11 с выходом 83%. Спектральные характеристики (данные ИК-, ЯМР 1Н-спектроскопии) подтвердили предполагаемую структуру полученных соединений.

Известно, что амины (первичные, вторичные или третичные) при физиологических условиях способны протонироваться, т.е. приобретать положительный заряд и эффективно инкапсулировать молекулу ДНК. В частности, DC-Choi, являясь третичным амином, эффективно используется для доставки генетических конструкций в эукариотические клетки. Полученные нами третичные амины 3, 7 и 9 расширяют ряд амфифилов, которые могут являться потенциальными медиаторами процесса трансфекции. Вероятно, что действие этих липидов может облегчить эндосомальное высвобождение плазмидной ДНК и оказать влияние на эффективность трансфекции.

1.2. Синтез катионных амфифилов с сукцинильной спейсерной группой

В данной части диссертационной работы при синтезе катионных липидов мы изменяли как природу катионной группировки, так и тип спейсерной группы. Нами были синтезированы амфифильные производные холестерина, в которых присоединение гидрофильной головки осуществлялось через спейсер, представленный остатком янтарной кислоты (схема 3). Формирование катионной группировки проводилось на основе таких аминов как Л/,Л/-диметилэтаноламин, пиперазин.

Взаимодействием холестерина (1) с янтарным ангидридом в безводном хлороформе в присутствии каталитического количества DMAP был получен 3J3-холестерилсукцинат (12) с выходом 97%. Последний действием тионилхлорида переводили в хпорангидрид, который затем вводили в реакцию с N,N-диметилэтаноламином. После хроматографической очистки был выделен N,N-диметил-М-(2-(ЗД-холестерилоксисукцинилокси)этил)амин (13) с выходом 89%.

Последующем взаимодействие с алкилгалогенидами (метилиодид, 2-бромэтанол) позволило получить катионные липиды 14 и 15. Нагреванием третичного амина 13 с метилиодидом в среде DMSO был получен катионный липид 14 с выходом 76%.

Из литературных данных известно, что введение гидроксильной группы в полярную область молекулы способствует повышению эффективности трансфекции. С этой целью мы провели кватернизацию амина 13 2-бромэтанолом в

среде кипящего метилэтилкетона. Целевой продукт 15 был выделен после хроматографической очистки с выходом 71%. Анализ условий реакции кватернизации третичного амина 13 метилиодидом или 2-бромэтанолом показал, что в случае производного 15 потребовалась более высокая температура для протекания реакции.

Схема 3

14 Г* = Ме У = I

15 Г* = СН2СН2ОН У = Вг

Реагенты и условия

Стадия Продукт Реагенты Температура, °С Время, ч Выход %

а 12 Янтарный ангидрид, ОМАР, 60 10 97

Е(з№СНС1з

Ь 1) ЭООг/СНОз, 20 10

с 13 2) МвгИСНгСНгОН, Ру/СНС1з 20 24 89

(1 14 МеШМвО 60 в 76

в 15 ВгСНгСНгОН/МеСС® 80 7 71

( 16 пиперазин, ОСС, ОМАР/ АМЖ 60 10 58

Наряду с производными холестерина 14 и 15, включающими четвертичные азотистые основания алифатического ряда, был получен N-(3/5-холестерилоксисукцинил)пиперазин (16). Синтез данного соединения осуществлялся взаимодействием эквимолярных количеств 3^-холестерилсукцината (12) с пиперазином в ацетонитриле в присутствии конденсирующего агента ОСС и каталитического количества ОМАР. Целевой продукт был выделен после хроматографической очистки с выходом 58%. Данные ЯМР 1Н и масс-спектров подтвердили структуру полученных липидов 14-16 (таблица 2).

Таблица 2

Физико-химические характеристики липидов 14-16

№ соединения lob2"' Масс-спектр, т/г (MALDI-MS) Спектр ЯМР 'Н, м д полярная группа

14 -11.62 572.0 [ЛНГ с, 3.45 Ы*Мез

15 -14 08 602 6 [М-ВгГ с, 3.15 и два м, 3 55 и 3.72 Me,N4CH2CH2OH

16 -15.10 577.3 [ЛЯ-Naf два м, 2.84 и 3 48 пиперазин

* с 0.8, CHCIj-MeOH (2.1).

1.3. Синтез катионного липида с карбамоильной связью С целью выявления взаимосвязи между структурой и биологической активностью осуществлен синтез катионного липида 19, в котором азотистое основание присоединено к молекуле холестерина 1 более стабильной в биологических средах карбамоильной связью (схема 4).

Схема 4

Реагенты и условия: а) С01, ЕУ\1, СНгС!2, 3 ч, 40°С; Ь) Ме2ИСН2СН2№Н2, СН2С12, 28 ч, 25°С, с) Ме1, ^ СН2С1г, 8 ч, 40»С

При взаимодействии холестерина (1) с 1,1'-карбонилдиимидазолом (СЭ1) в среде дихлорметана в присутствии триэтиламина было получено устойчивое производное 17 с выходом 79%. Далее соединение 17 вводили в реакцию с А/,А/-диметилэтилендиамином в среде дихлорметана и получали третичный амин 18 с выходом 89%. Кватернизацией третичного амина 18 метилиодидом был синтезирован катионный липид 19 с выходом 78%. Структура полученных соединений доказана данными ИК-, ЯМР 1Н и масс-спектров. При сравнении

спектров ЯМР 1Н соединений 18 и 19 наблюдали сдвиг протонов метальных групп при атоме азота (S = 2.81 м.д. для 18 и <5 = 3.42 м.д. для 19), что подтверждает структуру положительно заряженного липида.

1.4. Синтез катионных амфифилов с ацетальной связью с использованием метилтиометилового эфира холестерина

Для расширения области поиска эффективных медиаторов трансфекции наряду с липидами, в которых катионная группа присоединяется к гидрофобной области сложноэфирной и карбамоильной связями, нами осуществлен синтез положительно заряженных липидов с ацетальной связью с использованием метилтиометилового эфира (МТМ) холестерина.

В нашей лаборатории МТМ эфиры были успешно применены для синтеза катионных глицеролипидов с различными положительно заряженными группировками, с помощью которых была осуществлена трансфекция клеточных линий НГУК и HeLa.

Метилтиометиловые эфиры впервые были выделены и охарактеризованы как сопутствующие продукты окисления спиртов смесью DMSO-уксусный ангидрид (схема 5, путь Ь). Затем их использовали для защиты гидроксильной и карбоксильной группы, благодаря их стабильности и возможности удаления в мягких условиях. Добавление к смеси DMSO-уксусный ангидрид небольших количеств уксусной кислоты позволило увеличить выход метилтиометиловых эфиров, вследствие чего был предложен возможный механизм их образования (схема 5, путь а).

Являясь несимметричными 0,5-ацеталями, МТМ эфиры при взаимодействии с бромом образуют высокореакционноспособные а-бромэфиры, которые могут взаимодействовать с различными нуклеофильными реагентами (схема 6). Использование брома в реакции с МТМ эфиром холестерина может инициировать реакцию бромирования двойной связи. Поэтому нами был использован другой

b R,R2CHOH

MeSMe + RjRjC^O-«-MeSMe + AcOH

подход к превращению алкилтиоалкильной группы в а-галогенэфир — взаимодействием с Л/-бромсукцинимидом (ЫВЭ). Дальнейшее взаимодействие с нуклеофильными реагентами открывает перспективы для получения различных модифицированных липидов.

Схема 6

Вг2 Штили №Н

РОСНгвМе -*• [кОСНгВг]-ЯОСН2Ыи

Ыи = СЫ, N3, ОМе

С использованием МТМ эфира . нами осуществлен синтез катионных производных холестерина 21-24 (схема 7). Исходным соединением в синтезе служил холестерин (1), который переводили в метилтиометиловый эфир 20 обработкой смесью ОМЭО-уксусный ангидрид-уксусная кислота в мольном соотношении 6.5:3.4:1. Выход производного 20 составил 76%. Структура данного соединения доказана наличием соответствующих сигналов протонов метилтиометильной группы в спектре ЯМР 1Н (с, 5= 2.16 м.д.) для группы -БМе и (с, 8- 4.64 м.д.) для ОСНгБ-группы.

Схема 7

Соединение X У Выход, % Соединение X У Выход, %

21 —Ы^МегСНгСНаОН Вг 67 23 ■ЩГ Вг" 58

22 -О Вг 66 24 —\э Ме Вг 62

Реагенты и условия: а) ОМЭО-АсгО-АсОН, С6Нв, 24°С, 90 ч; Ь) X, ЛЛбромсукцинимид, дихлорэтан, 24°С, 30 мин.

Катионные липиды 21-24 получали взаимодействием метилтиометилового эфира 20 с Л/-бромсукцинимидом и соответствующим амином в среде дихлорэтана. После хроматографической очистки катионные липиды 21-24 были выделены с выходами 58-67%.

Полученные соединения охарактеризованы данными масс-спектрометрии, которые содержали значения масс молекулярных ионов, соответствующих ожидаемым, а также данными ЯМР 1Н спектроскопии. При анализе спектров ЯМР 1Н соединений 21-24 были отмечены различия сигналов протонов ЬГСНгО-группы (таблица 3). Так, для катионных липидов 21, 24 сигналы имели вид двух дублетов с константами спин-спинового взаимодействия 7.2 и 7.7 Гц, соответственно. Сигналы этих же протонов в соединениях 22, 23 представляли собой синглет.

Таблица 3

Физико-химические характеристики катионных липидов 21-24

№ соединения MD"* Масс-спектр, m/z (ESI-MS) Спектр ЯМР 1Н, м д / J, Гц

N*CH2O Катионная головка

21 -18 50 488.8 [M-Br]* д, 4 92/ 7.2 д, 4.99/7.2 с, 3 29 и 2м, 3 55 и 4.10 Me2N*CH2CH2OH

22 -12.40 478 8 [M-Brf с, 6.12 три м, 8.18, 8 60 и 9 20 пиридин

23 -12.08 481.1 [Af-BrJ* С, 5 68 с, 4.02 NTMe. три С, 7.51, 7.60 и 9.45 имидаэол

24 -14 50 500.4 [M-Brf д, 4.94/ 7.7 д, 4.99/7.7 с, 3.22 N*Me, два м, 3 42 и 4 01 морфолин

* сО 8, СНИэ-МеОН (1:1)

Таким образом, синтезированы модификационные ряды катионных производных холестерина, отличающиеся природой катионной головки, типом спейсера и характером связи гидрофобного и гидрофильного доменов для дальнейших исследований их биологической активности. Полученные третичные 4 амины существенно расширяют ряд амфифилов, которые могут оказаться потенциальными медиаторами трансфекции.

2. СИНТЕЗ ПОЛИКАТИОННЫХ АМФИФИЛОВ НА ОСНОВЕ ДЕЗОКСИХОЛЕВОЙ КИСЛОТЫ

Для структурно-функционального исследования катионных амфифилов синтезируется большое количество соединений, где модификации подвергается

гидрофобный домен катионных липидов. Использование в качестве гидрофобного домена такого полифункционального соединения как дезоксихолевая кислота позволит получать катионные амфифилы, содержащие несколько положительно заряженных групп, что может оказать влияние на эффективность трансфекции, поскольку устойчивость геносом зависит от плотности положительного заряда на поверхности липосом.

Нами синтезированы катионные производные дезоксихолевой кислоты, отличающиеся природой полярной группировки и способом присоединения ее к стероидной части молекулы (схема 8).

Схема 8

Ь: И = С1вНз7

Реагенты и условия

Стадия Соединение Реагенты Температура, "С Время, ч Выход %

а 26а МеОН, Н2304 65 3 91

Ь 26Ь СиНзтОН, п-ТСК 100 3 70

с 27а СО!, Еи№СН2С12 40 5 97

27Ь 40 3 93

с( 28а Ме2МСН2СН2МНг/СН2С12 20 10 66

28Ь 20 24 62

е 29а МеЦМеССЮ 60 8 88

29Ь МеШМБО 70 9 70

Из литературных данных известно, что увеличение липофильности молекулы желчных кислот посредством введения углеводородного остатка в стероидный остов молекулы способствует повышению стабильности образующихся геносом. В качестве исходных соединений использовали метилдезоксихолат (26а) и октадецилдезоксихолат (26Ь), полученные этерификацией метилового или

октадецилового спирта дезоксихолевой кислотой (25), что позволило' изменить общую гидрофобность молекулы и обеспечило защиту карбоксильной группы.

При взаимодействии соединений 26а, Ь с 1,1'-карбонилдиимидазолом в среде дихлорметана в присутствии триэтиламина были получены производные дезоксихолевой кислоты 27а, Ь с выходами 97 и 93%, соответственно. В спектре ЯМР 1Н сдвиг сигнала протонов при С-3 и С-12 атомах дезоксихолевой кислоты в слабое поле указывает на протекание реакции по двум гидроксильным группам.

Далее взаимодействием соединений 27а, Ь с Л/,Л/-диметилэтилендиамином в среде дихлорметана получили третичные амины 28а, Ь с выходами 66 и 62%, соответственно. Следует отметить, что продолжительность реакции в случае производного 28Ь была в два раза больше, чем для 28а. Кватернизацией соединений 28а, Ь метилиодидом при нагревании получили катионные липиды 29а, Ь с выходами 88 и 70%, соответственно. При анализе спектров ЯМР 1Н положительно заряженных липидов 29а, Ь наблюдался сдвиг сигналов протонов метильных групп при атоме азота в слабое поле (5= 3.48 м.д. для 29а и 8= 3.44 м.д. для 29Ь).

Синтез катионных липидов 31а, Ь, содержащих в полярной головке ЫНз*-труппу осуществлялся ацилированием исходных эфиров дезоксихолевой кислоты 26а, Ь А/-Вос-е-аминокапроновой кислотой в среде безводного пиридина в присутствии ЭСС и каталитического количества ОМАР (схема 9).

Схема 9

а: Я = Ме

' Ь:И = С18Нз7

Реагенты и условия

Стадия Продует- Реагенты Температура, °С Время, ч Выход, %

а 30а ВосНГ^СНг^ООН, 45 13 64

ЗОЬ ОСС, ОМАР/Ру 45 9 67

Ь 31а СР3СООН/СНС1з 40 3 74

31Ь 40 3 90

После хроматографической очистки выходы целевых продуктов 30а, Ь составили 64 и 67%, соответственно. В спектре ЯМР 1Н для соединений 30а, Ь присутствовали ситалы относящиеся к нововведенным элементам: синглет {3 = 1.42 м.д.) для Ви'-группы и мультиплет (3 = 2.10 м.д.) для а-СН2СОО-группы остатка аминокапроновой кислоты. Последующее удаление Вос-защитной группы осуществляли с помощью трифторуксусной кислоты в хлороформе. Для соединений 31а, Ь в спектре ЯМР 1Н отсутствовал сигнал Ви'-группы при 1.42 м.д. при сохранении остальных, что свидетельствует о снятии Вос-защиты. Конечные продукты 31а, Ь были выделены после хроматографической очистки с выходами 74 С и 90%, соответственно.

С целью установления влияния природы катионной головки на эффективность трансфекции, наряду с соединениями, содержащими алифатические катионные головки, синтезирован липид 33, полярная головка которого представлена пиридином (схема 10).

Схема 10

Реагенты и условия: а, Вг(СН2)4СОС1, Ру, СНС13 5 ч, 20°С; Ь, Ру, 6 ч, 60°С

В метилдезоксихолат 26а спейсерную группу вводили ацилированием последнего хлорангидридом 5-бромвалериановой кислоты. Целевой продукт был выделен с выходом 81%. В спектре ЯМР 'Н обнаружен сдвиг протонов при атомах С-3 и С-12, что подтверзадает протекание реакции ацилирования по двум реакционным центрам. Также обнаружены сигналы протонов с интегральной интенсивностью, соответствующей двум СНгВг-группам (3 = 3.43 м.д.) и двум а-СН2СОО-группам остатка 5-бромвалериановой кислоты (3 = 2.35 м.д.). Кватернизацией пиридина бромидом 32 был получен катионный липид 33 с выходом 90%, структура которого была подтверждена данными ЯМР 1Н и масс- спектров.

Таким образом, синтезирован ряд поликатионных амфифилов на основе дезоксихолевой кислоты, отличающихся природой полярной группировки

(алифатического и гетероциклического ряда) и способом присоединения к гидрофобному домену (сложноэфирная и карбамоильная связь).

Изучение биологической активности синтезированных соединений

Синтезированные катионные амфифилы 4, 5, 8, 14, 18, 22, 24 были использованы в рамках проекта МНТЦ (Na 1813р, проф. Филатов Ф.П.) по разработке экспериментальной аэрозольной ДНК-вакцины против хантавирусных инфекций, при которых происходит поражение почек и легких человека. Причем при поражении легких летальность составляет 50-60%. Наиболее эффективным методом борьбы с хантавирусной инфекцией является специфическая профилактика, т.е. вакцинация населения эпидемичных районов. Помимо создания ДНК-вакцины целесообразна разработка метода ее оптимальной доставки. Предусматривается эффективная доставка ДНК-вакцины в комплексе с катионными липосомами.

В связи с этим были получены катионные липосомы, которые были приготовлены методом инжекции (впрыскивание раствора липидов с DOPE (в качестве липида-хелпера) в летучем органическом растворителе в водную среду) с последующим продавливанием через поликарбонатный фильтр (100 нм) с использованием экструдера (Liposofast-1, Avestin Inc.). Проводятся эксперименты на животных по аэрозольной доставке ДНК-вакцины с помощью катионных липосом в дыхатепьные пути. По данным предварительных исследований среди протестированных катионных липидов наилучшие результаты по трансфекции показал катионный липид 5.

В настоящее время катионные липосомы переданы в Институт вирусологии им. Д.И.Ивановского, РАМН и Новосибирский институт биоорганической химии, СОРАН для проведения биологических испытаний по исследованию токсичности синтезированных соединений и выявлению среди них эффективных медиаторов трансфекции.

ВЫВОДЫ

1. Разработан и осуществлен синтез новых катионных производных холестерина с различными аммониевыми группировками гетероциклического и алифатического ряда, присоединенными к гидрофобному домену с помощью сложноэфирной или карбамоильной связи.

2. Впервые для синтеза катионных амфифилов на основе холестерина применен метод с использованием метилтиометкповых эфиров.

3. Разработаны удобные способы получения новых поликатионных амфифилов на основе дезоксихолевой кислоты с повышенной плотностью положительного заряда для использования в качестве медиаторов трансфекции.

4. Получены модификационные ряды катионных производных холестерина и дезоксихолевой кислоты в количествах достаточных для изучения взаимосвязи структуры и биологической активности синтезированных соединений.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:

1. Константинова Т.В. (Соколова Т.В.), Клыков В.Н., Серебренникова Г.А. Синтез холестеринсодержащих катионных амфифилов с гетероциклическими основаниями // Биоорг. химия - 2001. - Т. 27. - № 6. - С. 453-456.

2. Константинова Т.В. (Соколова Т.В.), Клыков В.Н., Маслов М.А., Серебренникова Г.А. Синтез катионных производных холестерина с сукцинильной спейсерной группой // ЖОрХ. - 2002. -Т. 38. - № 8. - С. 12401242.

3. Константинова Т.В. (Соколова Т.В.), Клыков В.Н., Серебренникова Г.А. Синтез холестеринсодержащих катионных амфифилов с гетероциклическими основаниями II Тезисы докладов международной конференции «От фундаментальной науки - к новым технологиям. Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок. Экологически безопасные технологии». -Тверь. - 2001. - С. 9.

4. Константинова Т.В. (Соколова Т.В.), Клыков В.Н., Серебренникова Г.А. Синтез катионных производных холестерина с азотистыми основаниями // Тезисы докладов VII международной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии-2001». - Ярославль. - 2001. - С. 104.

5. Маслов М.А., Серебренникова Г.А., Морозова Н.Г., Апьшоэйби З.Я., Константинова Т.В. (Соколова Т.В.), Плявник Н.В. Катионные липиды и перспективы их применения в генной терапии II Тезисы научных докладов 1-го Международного Конгресса "Биотехнология - состояние и перспективы развития". - Москва. - 2002. - С. 31.

6. Константинова Т.В. (Соколова Т.В.), Серебренникова Г.А. Синтез холестеринсодержащих катионных амфифилов с алифатическими основаниями II Тезисы докладов восьмой международной научно-технической

конференции по проблемам наукоемких химических технологий "Наукоемкие химические технологии-2002". - Уфа. - 2002. С. 89.

7. Константинова Т.В. (Соколова Т.В.) , Клесарева Ю.С., Серебренникова Г.А. Синтез и применение холестеринсодержащих катионных липидов в генной терапии // Тезисы научных докладов III съезда биохимического общества. -Санкт-Петербург. - 2002. - С. 354.

8. Серебренникова Г.А., Морозова Н.Г., Маслов М.А., Соколова Т.В., Плявник Н.В. Разработка методов синтеза физиологически активных катионных липидов с различным набором спиртов, гидрофобных компонентов, азотистых оснований и аминокислот с целью использования их в генной терапии и других областях медицины II Тезисы докладов отчетной конференции за 2002 год «Химия и химические продукты». - Москва. - 2003. - С. 183.

9. Соколова Т.В., Серебренникова Г.А. Получение катионных амфифилов на основе стероидных соединений // Тезисы докладов XVII Менделеевского съезда по общей и прикладной химии. - Казань. - 2003. - Т. 4. С. 300.

Ю.Соколова Т.В., Маслов М.А., Серебренникова Г.А. Получение катионных амфифилов на основе дезоксихолевой кислоты II Биоорг. химия - 2003 (в печати).

Подписано в печать 19.11.2003 г. Формат 60x90, 1/16. Объем 1,5 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 672

Отпечатано в ООО "Фирма Блок" 107140, г. Москва, ул. Русаковская, д. 1. т. 264-30-73 www.blok01centre.narod.ru Изготовление брошюр, авторефератов, переплет диссертаций.

»W? з

Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата химических наук, Соколова, Татьяна Валерьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

2.1. Структура и химический синтез катионных амфифилов на основе стероидных соединений

2.1.1. Катионные производные на основе холестерина

2.1.2. Холестерилсодержащие производные дистамицина

2.1.3. Катионные липиды на основе витаминов D2 и D

2.1.4. Углеводсодержащие амфифилы

2.1.5. Катионные производные полиаминов и аминокислот

2.2. Генная терапия и механизм липофекции

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

3.1. Синтез положительно заряженных производных холестерина с различными азотистыми основаниями гетероциклического и алифатического ряда

3.1.1. Синтез катионных липидов со спейсерной группой, представленной остатком 5-бромвалериановой кислоты

3.1.2. Синтез катионных амфифилов с сукцинильной спейсерной группой

3.1.3. Синтез катионного липида с карбамоильной связью

3.1.4. Синтез катионных амфифилов с ацетальной связью с использованием метилтиометилового эфира холестерина

3.2. Синтез поликатионных амфифилов на основе дезоксихолевой кислоты

4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 69 4.1. Синтез положительно заряженных производных холестерина с различными азотистыми основаниями гетероциклического и алифатического ряда

4.1.1. Синтез катионных липидов со спейсерной группой, представленной остатком 5-бромвалериановой кислоты

4.1.2. Синтез катионных амфифилов с сукцинильной спейсерной группой

4.1.3. Синтез катионного липида с карбамоильной связью

4.1.4. Синтез катионных амфифилов с ацетальной связью с использованием метилтиометилового эфира холестерина

4.2. Синтез поликатионных амфифилов на основе дезоксихолевой кислоты 5. ВЫВОДЫ СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

DOPE - 1,2-диолеоил-5л-глицеро-3-фосфатидилэтаноламин

DOPC - 1,2-диолеоил-5/7-глицеро-3-фосфатидилхолин

DOTMA - Л/-[1-(2,3-диолеилокси)пропил]-Л/,Л/,Л/-триметиламмоний хлорид

DOSPA - 2,3-диолеилокси-Л/-[2-(сперминкарбоксиамидо)этил]-Л/,Л/-диметил-1 пропанаммоний трифторацетат

DC-Choi - 3^-[Л/-^А/'Л/-диметиламиноэтил)карбамоил]холестерин

Cho-TB - Л/-(3/^холестерилбутироил)-Л/,Л/,Л/-триметиламмоний иодид

Спермин - Ы,М'-бис(3-аминопропил)-1,4-диаминобутан

BGSC - бис-(гуанидилспермидил)холестерин

BGTC - бис-[гуанидил-(трис-(2-аминоэтил)амин)]холестерин

Lipofectin - липосомальная композиция DOTMA/DOPE (1:1)

Lipofectamine - липосомальная композиция DOSPA/DOPE (3:1)

PEI - полиэтиленимин

PEG - полиэтиленгликоль

PLL - поли-1-лизин

Введение диссертация по химии, на тему "Синтез катионных амфифилов на основе стероидных соединений"

В современной медицине известно большое число заболеваний, непосредственно связанных с нарушениями функционирования генов. Для их лечения успешно развивается одна из перспективных областей медицины -генная терапия, которая направлена либо на коррекцию наследственного заболевания, возникшего вследствие генетического дефекта, либо на придание клеткам новых функций, способствующих устранению патологических процессов. Необходимым условием генотерапии является эффективная доставка терапевтического гена (трансфекция) в клетки-мишени и обеспечение его экспрессии и длительного функционирования в этих клетках.

В настоящее время большое внимание уделяется разработке невирусных систем доставки гена. Среди них высоким терапевтическим потенциалом обладает липофекция, в основе которой лежит транспорт генетического материала в клетки с помощью катионных липосом. Положительно заряженные < липосомы выступают в качестве компактизирующего средства,. защищая молекулы ДНК, мРНК и олигонуклеотидов от инактивации под действием клеточных ферментов. Они способны переносить через клеточную мембрану молекулы ДНК больших размеров и инициировать эндоцитоз. Важным преимуществом систем доставки генов на основе липосом является их биодеградируемость, низкая вероятность инициации иммунного ответа или воспалительной реакции. Катионные липосомы можно получить традиционными методами, они коммерчески доступны и стабильны при хранении. Необходимо отметить, что метод трансфекции, использующий в качестве медиаторов положительно заряженные липосомы, может оказаться перспективным в ферментно- и гормоно-заместительной терапии при лечении разных форм таких заболеваний, как сахарный диабет, дефекты роста, заболевания крови, сердечно-сосудистые и онкологические заболевания.

Разнообразие состава липосом и структурных параметров образующих их липидов определяет механизмы, их взаимодействия с биологическими системами. Положительно заряженные , липосомы, сформированные из катионных липидов и липидов-«хелперов» способны образовывать комплексы с плазмидной ДНК (геносомы или липоплексы) за счет электростатического взаимодействия между положительно заряженной гидрофильной частью катионного липида и отрицательно заряженными фосфатными группами нуклеиновых кислот. Далее происходит проникновение геносомы в клетки-мишени, внутриклеточное распределение комплекса, его диссоциация и последующая экспрессия ДНК в ядре. Для повышения эффективности метода липофекции необходимо оптимизировать такие характеристики как стабильность геносомы, способность эндосомального высвобождения комплекса липосома-ДНК, регулируемость экспрессии.

В настоящее время синтезирован большой набор положительно заряженных глицеролипидов с различными алифатическими и гетероциклическими катионными. головками, которые показали высокую эффективность трансфекции. Дальнейшее получение и изучение новых катионных липидов, в частности производных холестерина и желчных кислот, может привести к созданию удобных и эффективных систем для введения в клетку различных биологически активных веществ: нуклеозидов, олиго- и полинуклеотидов, гормонов, белков и других природных и синтетических макромолекул с отрицательно заряженными участками молекулы.

Данная работа является продолжением исследований в области катионных амфифилов, предназначенных для трансфекции, и посвящена созданию модификационных рядов катионных липидов с одной или несколькими катионными группами на основе стероидных соединений.

На защиту выносятся следующие основные положения:

2. Получение катионных амфифилов на основе холестерина с использованием метилтиометиловых эфиров.

3. Синтез поликатионных амфифилов на основе дезоксихолевой кислоты.

2. Литературный обзор 2.1. Структура и синтез катионных амфифилов на основе стероидных соединений

Современный этап исследований в области биоорганической химии в значительной степени связан с созданием веществ, обладающих биологической активностью. Это в полной мере относится и к разделу генной терапии, связанной с введением корректирующих генов в клетки с целью направленного устранения или изменения генетических дефектов.

К настоящему времени накоплено большое количество данных по структуре катионных липидов, их синтезу и зависимости между структурой и проявляемой ими биологической активностью. В данном обзоре обобщены сведения о катионных липидах, полученных за последние годы и эффективно использующихся в трансфекции (доставка терапевтических генов в эукариотические клетки), рассмотрена их классификация по строению и приведены синтезы отдельных соединений.

Доставка плазмидной ДНК и РНК в эукариотические клетки впервые была осуществлена in vivo с использованием композиции DOTMA/DOPE (1:1), которая получила название Lipofectin (GIBCO BRL), а также DOSPA/DOPE (3:1) Lipofectamine (GIBCO BRL) (рис. 1). Следовательно, трансфекционную активность новых катионных липидов сравнивают с активностью данных липосомальных композиций. г—0(СН2)8СН=СН(СН2)7СНз

0(СН2)8СН=СН(СН2)7СНз

N+(CH3)3 СГ

DOTMA

Г— 0(СН2)8СН= СН(СН2)7СН3

0(СН2)8СН=СН(СН2)7СН3

N+CH2CH2NHCOCH(CH2)3N+H2(CH2)3N+H3 Н3С СН3 N+H2(CH2j3N+H3

5 CF3COO"

DOSPA

Г—ОСО(СН2)7СН=СН(СН2)7СН3 —ОСО(СН2)7СН=СН(СН2)7СН3 —OP4OCH2CH2N+H3

Рис. 1. Компоненты коммерческих препаратов Lipofectin и Lipofectamine

Заключение диссертации по теме "Биоорганическая химия"

5. ВЫВОДЫ

2. Впервые для синтеза катионных амфифилов на основе холестерина применен метод с использованием метилтиометиловых эфиров.

Список источников диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Соколова, Татьяна Валерьевна, Москва

1. Bennett М., Nantz М., Rajiv P., Walker N. Jaslin J. Cholesterol enchances cationic liposome-mediated DNA transfection of human respiratory epithelial cells// Bioscience Rep. 1995. - V. 15. - P. 47-53.

2. Garcia R.A., Pantazatos S.P., Pantazatos D.P., MacDonald R.C. Cholesterol stabilizes hemifused phospholipid bilayer vesicles// Biochim. Biophys. Acta. -2001.-V. 1511.-P. 264-270.

3. Miller A.D. Cationic liposomes for gene therapy// REVIEWS Angew. Chem. Int. Ed. 1998. - V. 37. - P. 1768-1785.

4. Маслов M.A., Сычева E.B., Морозова Н.Г., Серебренникова Г.А. Катионные липиды липидной и нелипидной природы в генной терапии// Изв. Акад. Наук. 2000. - №3. - С. 4-46: ЗЭ5-^00

5. Noguchi A., Furuno Т., Kawaura С., Nakanishi М. Membrane fusion plays an important role in gene transfection mediated by cationic liposomes// FEBS Lett. -1998.-V. 433.-P. 169-173.

6. Тараховский Ю.С., Иваницкий Г.Р. Липосомы в генной терапии. Структурный полиморфизм липидов и эффективность доставки генетической информации// Биохимия. 1998. - Т. 63. - С. 723-736.

7. Zitzinger D.f Brown J., Wala I., Kaufman S. Fate of cationic liposomes and their complex with oligonucleotide in vivofl Biochim. Biophys. Acta. 1996. -V. 1281. -P. 139-149.

8. Konopka K., Pretzer E., Feigner P. Human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) infection increases the sensitivity of macrophages and THP-1 cells to cytotoxicity by cationic liposomes// Biochim. Biophys. Acta. 1996. - V. 1312. -P. 186-196.

9. Huang L., Farhood H., Serbina N. Endosomolytic activity of cationic liposomes enhances the delivery of human immunodeficiency virus-1 trans-activator protein (TAT) to mammalian cells// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995. -V. 217.-P. 761-768.

10. Wollf J.A. Methods and applications of direct gene transfer// Gene terapeutics. -1994. P. 1-10.

11. Hasegawa S., Hirashima N., Nakanishi M. Comparative study of transfection efficiency of cationic cholesterols mediated by liposomes-based gene delivery// Bioorg. Med. Chem. Lett. 2002. -V. 12. - P. 1299-1302.

12. Gao X., Huang L. A novel cationic liposome reagent for efficient transfection of mammalian cells// Biochem. Biophys. Res. Commun. -1991. V. 179. - P. 280285.

13. Takeuchi K., Ishikara M., Kawaura C., Noji M. Effect of zeta potentional of cationic liposomes containing cationic cholesterol derivatives on gene transfection// FEBS Lett. 1996. - V. 397. - P. 207-209.

14. Константинова И.Д., Серебренникова Г.А. Положительно заряженные липиды: структура, методы синтеза, применение// Успехи химии. 1996. -Т. 65(6).-С. 581-598.

15. Behr J.P. Gene transfer with synthetic cationic amphiphiles: prospects for gene therapy// Bioconjugate Chem. 1994. - V. 5. - P. 382-389.

16. Okayama R., Noji M., Nakanishi M. Cationic cholesterol with a hydroxyethylamino lead group promotes significantly liposome-mediated gene transfection// FEBS Lett. -1997. V. 408. - P. 232-234.

17. Feigner J., Kumar R., Sridhar C. Enhanced gene delivery and mechanism studies with a novel series of cationic lipid formulations// J. Biol. Chem. -1994. -V. 269. P. 2550-2561.

18. Kisoon N, Ariatti M, Moodley T. A novel cationic cholesterol derivative, its formulation into liposomes, and the efficient transfection of the transformed human cell lines HepG2 and HeLa// Drug Deliv. 2002. - V. 9(3). - P. 161-167.

19. Ghosh Y.K., Visweswariah S.S., Bhattacharya S. Nature of linkage the cationic headgroup and cholesteryl sceleton controls gene transfection efficiency// FEBS Lett. 2000. - V. 473. - P. 341 -344.

20. Ghosh Y.K., Visweswariah S.S., Bhattacharya S. Advantage of the ether linkage between the positive charge and the cholesteryl skeleton in cholesterol-based amphiphiles as vectors for gene delivery// Bioconjugate Chem. 2002. - V. 13 (2). - P. 378-384.

21. Предводителев Д.А., Маленковская M.A., Нифантьев Э.Е. Катионные фосфолипиды на основе холестерина и высших жирных спиртов// Тезисыдокладов XVII Менделеевского съезда по общей и прикладной химии. Казань. 2003. С. 195.

22. Предводителев Д.А., Косарев Г.В., Суворкин С.В., Нифантьев Э.Е. Синтез диэфироамидных фосфолипидов катионного типа// ЖОрХ. 2002. - Т. 38. -№ 11.-С. 1671-1675.

23. Vigneron J., Oudrhiri N., Fauguet M. Vergely L. Guanidinum-cholesterol cationic lipids: efficient vectors for the transfection of eucariotic cells// Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 1996. -V. 93. - P. 9682-9686.

24. Pitard В., Oudrhiri N., Vigneron J., Hauchecorne M. Structural characteristics of supramolecular assemblies formed by guanidinium-cholesterol reagents for gene transfection// Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 1999. - V. 96. - P. 2621-2626.

25. Bleczinski C.F., Richert C. Steroid-DNA interactions increasing stability, sequence-selectivity, DNA/RNA discrimination, . hypochromicity of oligonucleotide duplexes// J. Am. Chem. Soc. 1999. - V. 121. - P. 1088910894.

26. Oudrhiri N., Vigneron J., Hauchecorne M., Peuchmaur M. Guanidinium-cholesterol cationic lipids novel reagents for gene transfection and perspectives for gene therapy// Biog. Amines. - 1998. - V. 14. - P. 537-552.

27. Densmore C.L., Giddings Т.Н., Waldrep J.C., Kinsey B.M., Knight V. Gene transfer by guanidinium-cholesterol: dioleoylphosphatidyl-ethanolamine liposome-DNA complexes in aerosol// J. Gene Med. 1999. - V. 1(4). - P. 251264.

28. Bhattacharya S., Thomas M. Novel distamycin analogues: facile synthesis of cholesterol conjugates of distamycin-like oligopeptides// Tetrahedron Lett. -2001.-V.42.-P. 3499-3502.

29. Ren Т., Zhang G., Liu D., Liu F. Synthesis and evaluation of vitamine D-based cationic lipids for gene delivery in vitro// Bioorg. Med. Chem. Lett. 2000. - V. 10.-P. 891-894.

30. Walker S., Sofia M., Kakarla R., Kogan A., Wierichs L„ Longley C., Bruker K., Axelrod H., Midha S., Babu S., Kahne D. Cationic facial amphiphiles: a promising class of transfection agents// Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 1996. - V. 93.-P. 1585-1590.

31. Zuidam N., Barenholz Y. Electrostatic and structural properties of complexes involving plasmid DNA and cationic lipids commonly used for gene delivery// Biochim. Biophys. Acta. 1998. - V. 1368. - P. 115-128.

32. Jacopin C., Hofland H., Scherman D., Herscovici J. Synthesis and transfecting properties of a glycosylated polycationic DNA vector// Bioorgan. Med. Chem. Lett. 2001. - V. 11. - P. 419-422.

33. Bennett M., Malone R., Nantz M. A flexible approach to synthetic lipid ammonium salts for polynucleotide transfection// Tetrahedron Lett. 1995. - V. 36. - P. 2207-2210.

34. Song Y., Liu D. Free liposomes enhance the transfection activity of DNA/lipid complexes in vivo by intravenous administration// Biochim. Biophys. Acta. -1998.-V. 1372.-P. 141-150.

35. Kawakami S., Yamashita F., Nishikawa M. Asialoglycoprotein receptor-mediated gene transfer using novel galactosylated cationic liposomes// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. -V. 252. - P. 78-83.

36. Дижи Э.Б., Акифьев Б.Н., Миссюльгид Б.В. Рецептор-опосредованный перенос комплексов ДНК-галактозилированный поли^-лизин в клетки млекопитающих in vivo и in vitro/f Биохимия. 2001. - Т. 66(1). - С. 71-79.

37. Hashida М., Takemura S., Nishikawa М. Targeted delivery of plasmid DNA complexed with galactosylated poly(L-lisine)// J. Controlled Rel. 2000. - V. 53. -P. 301-310.

38. Takakura Y., Nishikawa M., Yamashita F., Hashida M. Development of gene drug delivery systems based on pharmacokinetics studies// Eur. J. Pharm. Sci. -2001. -V. 13.-P. 71-76.

39. Kempen M., Hoes C„ Boom J., Santbrink P., Rensen P. A water-soluble cholesteryl-containing trisgalactoside: synthesis, properties and use in directing lipid-containing particles to the liver// J. Med. Chem. 1994. - V. 27. - P. 13061312.

40. Gaucheron J., Santaella C., Vierling P. In vitro gene transfer with a novel galactosylated spermine bolaamphiphile// Bioconjugate Chem. 2001. - V. 12. -P. 569-575.

41. Ghosh P.C., Bachhawat B.K. Role pf surface glycolipids natural or synthetic origin on the biodistribution of liposomes// J. Liposome Research. - 1992. - V. 2(3). - P. 369-382.

42. Duffels A., Green L.G., Ley S.V., Miller A.D. Synthesis of high-mannose type neoglycolipids: active targeting of liposomes to macrophages in gene therapy// J. Chem. Eur. -2000. -V. 6(8). P. 1416-1430.

43. Bessodes M„ Dubertret C., Jaslin G. and Scherman D. Synthesis and biological properties of new glycosidic cationic lipids for DNA delivery// Bioorgan. Med. Chem. Lett. 2000. - V. 10. - P. 1393-1395.

44. Benhamon P., Moriscot C., Prevost P., Rolland E. Standartization of procedure for efficient ex vivo gene transfer in to porcine pancreatic islets with cationic liposomes//Transplantation. 1997. -V. 63. - P. 1798-1803.

45. Kim Y.H., Gihm S., Park C. Structural characteristics of size-controlled self-aggregates of deoxicholic acid modified chitosan and application as a DNA delivery carrier// Bioconjugate Chem. - 2001. - V. 12. - № 6. - P. 932-938.

46. Li S., Rizzo M., Bhattacharya S., Huang L. Characterization of cationic lipid-protamine-DNA (Lpd) complexes for intravenous gene delivery// Gene therapy. -1998.-V. 5.-P. 930-937.

47. Liu F., Yang J., Huang L., Liu D. New cationic lipid formulations for gene transfer// Pharm. Res. -1996. V. 13. - P. 1856-1860.

48. Balasubramaniam R., Bennet M.f Aberle A., Malone J., Nantz M., Malone R. Structural and functional analisis of cationic transfection lipids the hydrophobic domain// Gene therapy. -1996. - V. 3. - P. 163-172.

49. Moradpour D., Schauer J., Zurawski V., Wands J. Efficient gene transfer in to mammalian cells with cholesteryl-spermidine// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. -V. 221. - P. 82-88.

50. Behr Y.P., Demeneix B.A., Loeffler Y., Perez-Mutu L.Y. Efficient gene transfer into mammalian primary endocrine cells with lipopolyamine-coated DNA// Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1998. - V. 86. - P. 6982-6986.

51. Thierry A.R., Lunardi-lskandar Y., Bryant J.L., Rabinovitch P., Gallo R.C., Mahan L.C. Systemic gene therapy: biodistribution and long-teem expression of a transgene in mice// Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1995. - V. 92. - P. 97429747.

52. Farhood M., Serbina N., Huang L. The role of dioleoylphosphatidylethanolamine in cationic liposome mediated gene transfer// Biochim. Biophys. Acta. 1995. -V. 1235. - P. 289-295.

53. Escrion V., Ciolina C., Lacroixet F. Cationic lipid-mediated gene transfer: effect of serum on cellular uptake and intracellular fate of lipopolyamine/DNA complexes// Biochim. Biophys. Acta. -1998. V. 1368. - P. 276-288.

54. Geall A.J., Eaton M., Baker T. The regiochemical distribution of positive charges along cholesterol polyamine carbamates plays significant roles in modulating DNA binding affinity and lipofection// FEBS Lett. 1999. - V. 459. - P. 337-342.

55. Tang F., Hughes J. Introduction of a disulfide bond in to a cationic lipid enhances transgene expression of plasmid DNA// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. -V. 242. - P. 141-145.

56. Choi J.S., Lee E.J., Jang H.S., Park J.S. New cationic liposomes for gene transfer into mammalian cells with high efficiency and low toxicity// Bioconjugate Chem. -2001. -V. 12(1).-P. 108-113.

57. Fujiwara Т., Hirashima N., Hasegawa S., Nakanishi M., Ohwada T. Space-filling in membrane disruption by cationic amphiphiles// Bioorg. Med. Chem. Lett. -2001. -V. 9.-P. 1013-1024.

58. Fujiwara Т., Hasegawa S., Hirashima N. Nakanishi M., Ohwada T. Gene transfection activities of amphiphilic steroid-polyamine conjugates// Biochim. Biophys. Acta. 2000. - V. 1468. - P. 396-402.

59. Yoshimura Т., Hasegawa S., Hirashima N., Nakanishi M., Ohwada T. Anchoring and bola cationic amphiphiles for nucleotide delivery. Effect of orientation and extension of hydrophobic regions// Bioorg. Med. Chem. Lett. 2001. - V. 11. - P. 2897-2901.

60. Takakura Y., Nishikawa M., Yamashita F., Hashida M. Development of gene drug delivery systems based on pharmacokinetic studies// Eur. J. Pharm. Sci. -2001.-V. 13.-P. 71-76.

61. Geall A., Hadithi D., Blagbrough I. Efficient calf thymus DNA condensation upon binding with novel bile acid polyamine amides// Bioconjugate Chem. 2002. - V. 13.-P. 481-490.

62. Каплун А.П., Шон Л.Б., Краснопольский Ю.М., Швец В.И. Липосомы и другие наночастицы как средство доставки лекарственных веществ// Вопросы медицинской химии. 1999. - Т. 45. - №1. - С. 3-12.

63. Guy-Caffey J., Bodepudi V.f Bishop J. Novel polyaminolipids enhances the cellular uptake of oligonucleotide// J. Biol. Chem. 1995. - V. 270. - P. 3139131396.

64. Zelphati O., Uyechi L., Barron L., Szoka F. Effect of serum components on the physicochemical properties of cationic lipid/oligonucleotide complexes and on their interactions with cells// Biochim. Biophys. Acta. -1998. -V. 1390. P. 119133.

65. Ito A., Miazoe R., Mitoma J., Akao Т., Osaki T. and Kunitake T. Syntetic cationic amphiphiles for liposome-mediated DNA transfection// Biochem. Inter. 1990. -V. 22. - P. 235-241.

66. Xu Y., Szoka F.C. DNA transfection mediated by cationic liposomes containing lipopolylysine: characterization and mechanism action// Biochemistry. 1996. -V. 35. - № 18. - P. 5616-5623.

67. Drummond D.C., Zingnani M., Leroux J.C. Current status of pH-sensitive liposomes in drug delivery// Prog, in lipid research. 2000. - V. 39. - P. 409-460.

68. Зеленин A.B. Генная терапия на границе третьего тысячелетия// Вестник РАН. 2001. - Т. 71. - №5. - С. 387-404.

69. Баранов B.C. Генная терапия медицина XXI века// Соросовский образовательный журнал. - 1999. - № 3. С. 63-68.

70. Han S., Mahato R.I, Kim S.W. Water-soluble lipopolymer for gene delivery// Bioconjugate Chem. 2001. -V. 12. - P. 337-345.

71. Zanta M.A., Boussif O., Adib A., Behr J.P. In vitro gene delivery to hepatocytes with galactosylated polyethylenimine// Bioconjugate Chem. 1997. - V. 8. - P. 339-344.

72. Huh К., Lee К, Kwon I., Kim Y -Н., Kim С., Jeong S. Synthesis of triarmed poly-(ethyleneoxide)-deoxycholic. acid, conjugate and its micellar characteristics// Langmuir. 2000. - V. 16. - P. 10566-10568.

73. Brash D. Strontium phosphate transfection of cells in primary culture: stable expression of the similar virus to large T-antigen gene in primary human Gronchial epithelial cells// Mol. Cell. Biol. -1987. V. 7. - P. 2031.

74. Zou Y., Zong G.t Ling Y.H., Perez-Soler R. Development of cationic liposome formulations for intratracheal gene therapy of early lung cancer// Cancer Gene Ther. 2000. - V. 7(5). P. 683-696.

75. Akao Т., Fukumoto Т., lhara H., Ito A. Conformational change in DNA induced by cationic bilayer membranes// FEBS Lett. -1996. V. 391. - P. 215.

76. Sternberg В., Sorgi F., Huang L. New structures in complex formation between DNA and cationic liposomes visualized by freeze-fracture electron microscopy// FEBS Lett. -1994. V. 356. - P. 361-366.

77. Lasic D.D. Novel application of liposomes// Tibtech. 1998. - V. 16. - P. 307331.

78. Egilmel N.K., Iwanuma Y., Bankert R.B. Evaluation and optimization of direct cationic liposome formulations for in vivo gene transfer// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. -V. 221. - P. 163-173.

79. Deshpande D., Blezinger P., Pillai R.f Duguid J., Freimark В., Rolland A. Target specific optimization of cationic lipid based systems for pulmonary gene therapy// Pharm. Res. - 1998. - V. 15. - № 9. - P. 1340-1347.

80. Filion M., Phillips N. Toxicity and immunomodulatory activity of liposomal vectors formulated with cationic lipids toward immune effector cells// Biochim. Biophys. Acta. -1997. V. 1329. - P. 345-356.

81. Kikuchi A., Sugaya S., Ueda H., Tanaka K. Efficient gene transfer to receptor overexpressing cancer by means of E6F labeled cationic liposomes// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. -V. 227. - P. 666-671.

82. Boncuk P., Kaser M., Yu Y.f Taeusch W. Effects of cationic liposome DNA complexes on pulmonary surfactant function in vivo and in vitroJJ Lipids. - 1997. -V. 32.-№3.-P. 247-253.

83. Мок К. W., Cullis P. R. Structural and fusogenic properties of cationic liposomes in the presence of plasmid DNA// Biophys. J. -1997. V. 73. - P. 2534.

84. Hui S„ Landler M., Zhao L. The role of helper lipids in cationic liposome -mediated gene transfer// Biophys. J. 1996. - V. 71. - P. 590-599.

85. Ouahabi A., Thiry M., Pector V., Fuks R. The role of endosome destabilizing activity in the gene transfer process mediated by cationic lipids// FEBS Lett. -1997.-V. 414.-P. 187-192.

86. Zuidam N. J., Barenholz Y. Electrostatic and structural properties of complexes involving plasmid DNA and cationic lipids commonly used for gene delivery// Biochim. Biophys. Acta. 1998. - V. 1368. - № 1. - P. 115-128.

87. Wattiaux R., Jadot M.f Dubous F., Laurent N. Cationic lipids delay the transfer of plasmid DNA to lysosomes// Biochem. Biophys. Res. Commun. -1996. V. 227. . p. 448-454.

88. Zuidam N. J., Barenholz Y., Minsky A. Chiral DNA paking in DNA-cationic liposome assemblies// FEBS Lett. -1999. V. 457. - P. 419.

89. Wong F., Reimer D., Bally M. Cationic lipid-binding to DNA characterization of complex formation// Biochemistry. -1996. V. 35. - P. 5756-5763.

90. Nagasaki Т., Taniguchi A., Tamagaki S. Photoenhancement of transfection efficiency using novel cationic lipids having a spaser// Bioconjug. Chem. 2003. -V. 14(3).-P. 513-516.

91. Hong K., Zheng W., Baker A., Papahadjopoulas D. Stabilization of cationic liposome-plasmid DNA complexes by polyamines and poly(ethylene glycol)-phospholipid conjugates for efficient in vivo gene delivery// FEBS Lett. 1997. -V. 400. - P. 233-237.

92. Perrie Y., Gregoriadis G. Liposome-entrapped plasmid DNA: characterisation studies// Biochim. Biophys. Acta. 2000. -V. 1475. - P. 125:132.

93. Баранов B.C. Молекулярная медицина: молекулярная диагностика, превентивная медицина и генная терапия// Молекулярная биология. -2000. Т. 34. - № 4. - С. 684-695.

94. Yang К., Mu X. S., Hayers R. L., Qiu Y. Н., Sorgi F. L.f Huang L., Clifton G. L., Vivian L. DC-Choi liposome-mediated gene transfer in rat spinal cord// Neur. Report. 1997. - V. 8. - P. 2355.

95. Sochanik A., Kaida I., Mitrus I., Rajca A., Szala S. A new cholesterol derivative suitable for transfecting certain type of cells in the presence of 10% serum// Cancer Gene Ther. 2000. - V. 7. - P. 513-520.j

96. Фаворова O.O. Лечение генами фантастика или реальность// Соросовский образовательный журнал. -1997. - №2. - С. 21-27.

97. Mizuguchi Н, Nakagawa Т., Nakanishi М., Imasu S., Nakagawa S., Mayumi Т. Efficient gene transfer into mammalian cells using fusogenic liposome// Biochem. Biophys. Res. Commun. -1996. -V. 218. P. 402.

98. Van der Woude I., Wagenaar A., Meekel A. A. P., Beest M.B.A., Ruiters M.H.J, Engberts J. B. F., Hoekstra D. Novel pyridinium sursactants for efficient, nontoxic in vitro gene delivery// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - V. 94. - P. 1160.

99. Ruyschaert. J. M., Ouanabi A. E., Willeaume V., Huez G., Fuks R., Vandenbranden M., Stefano P. A novel cationic amphiphile for transfection of mammalian cells// Biochem. Biophys. Res. Comm. 1994. - V. 203. - P. 1622.

100. Banerjee R., Das P.K., Srilakshmi G.V., Chaudhuri A. Novel series of non-glycerol-based cationic transfection lipids for use in liposomal gene delivery// J. Med. Chem. -1999. -V. 42. P. 4292-4299.

101. Gregoriadis G., Saffie R., Sousa B. Liposome technology: dehydration-rehydration vesicles and their application in drag and vaccine delivery// FEBS Lett.-1997.-V. 402.-P. 107.

102. Tochtrop G.P., DeKoster G.T., Cistola D.P., Covey D.F. Synthesis of 3,4 -13C2.-enriched bile salts as NMR probes of protein-ligand interactions// J. Org. Chem. 2002. - V. 67. - P. 4027-4035.

103. Simoes S., Slepushkin V., Gaspar R., Lima M.P., Duzgunes N. Gene delivery by negatively charged ternary complexes of DNA, cationic liposomes and transferin or fusogenic peptides// Gene therapy. -1998. V. 5. - P. 955-964.

104. Palmer L.R., Chen Т., Lam A.M.,,Fenske D.B., Wong K.F., MacLachlan I., Cullis P.R. Transfection properties of stabilized plasmid-lipid particles containing cationic PEG lipids// Biochim. Biophys. Acta. 2003. - V. 1611(1-2). - P. 204216.

105. Capaccioli S., Pasquale G., Mini E. Cationic lipids improve antisense oligonucleotide uptake and prevent degradation in cultured cells and in human serum// Biochem. Biophys. Res. Commun. -1993. V. 197. - P. 818-823.

106. Мок K.W., Lam A. M., Cullis P. R. Stabilized plasmid-lipid particles: factors influencing plasmid entrapment and transfection properties// Biochim. Biophys. Acta. 1999. -V. 1419. - P. 137.

107. Demeniex В., Boussif O., Zanta M., Remy J., Behr J. Delivery of polynucleotides with polyamine lipids and polymers// Nucleosides and Nucleotides. 1997. - V. 16.-P. 1121-1127.

108. Arima H., Aramaki Y., Tsuchiya S. Effects of oligonucleotides on the physicochemical characteristics and cellular uptake of liposomes// J. Pharm. Sci. 1997. -V. 86. - P. 438-441.

109. Thierry A. R., Lunardi-lskandar Y., Bryant J. L., Rabinovitch P., Gallo R. C., Mahan L. C. Systemic gene therapy: biodistribution and long-term expression of a trasgene in mice// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. - V. 92. - P. 9742.

110. Langner M. The intracellular fate of non-viral DNA carriers// Cell. Mol. Biol. Lett. -2000.-V. 5.-P. 295-313.

111. Ochiya Т., Takahama Y., Baba-Toriyama H., Tsukamoto M., Yasuda Y., Kikuchi H., Terada M. Evalution of cationic liposome suitable for gene transfer into pregnant animals// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. - V. 258. - P. 358.

112. Crystal R. Transfer of genes to humans: early lessons and obstacles to success// Science. 1995. - V. 270. - P. 404-410.

113. Filion M., Phillips N. Major limitations in the use of cationic liposomes for DNA delivery// Int. J. Pharm. 1998. -V. 162. - P. 159-170.

114. Verma I., Somia N. Gene therapy promises, problems and prospects// Nature. - 1997.-V. 389.-P. 239-242.

115. Kawaura C., Nogushi A., Furuno T. Atomic force microscopy for studing gene transfection mediated by cationic liposomes with a cationic cholesterol derivative// FEBS Lett. 1998. - V. 421. - P. 69-72.

116. Kim C., Lee S., Kang S. Synthesis and the miccelar characteristics of poIy(ethyleneoxide)-deoxicholic acid conjugates// Langmuir. 2000. - V. 16. - P. 4792-4797.

117. Janout V., Jing В., Regen S. Molecular umbrella-assisted transport of thiolated AMP and ATP across phospholipid bilayers// Bioconjugate Chem. 2002. - V. 13.-P. 351-356.

118. Kobuke Y„ Nagatani T. Transmembrane ion channels constructed of cholic acid derivatives//J. Org. Chem. 2001. -V. 66. - P. 5094-5101.

119. Flemming C. Cholesterol modulation of molecular activity of reconstituted shark Na+, K+-ATPase// Biochim. Biophys. Acta. -1997. -V. 1329. P. 205-212.

120. Bahdyopadhyaya A.K., Sangeetha N.M., Maitra U. Highly diastereoselective synthesis of the 1,1'-binaphtol unit on a bile acid template// J. Org. Chem. -2000. V. 65. - P. 8239-8244.

121. Solaja В., Terzic N., Pocsfalvi G., Gerena L., Tinant В., Opsenica D., Mithous W. Mixed steroidal 1,2,4,5-tetraoxanes: antimalarial and antimicobacterial activity// J. Med. Chem. 2002. - V. 45. - P. 3331-3336.

122. Li C., Budge L.P., Driscoll C.D., Willardson B.M., Allman G.W., Savage P.B. Incremental conversion of outer-membrane permeabilizers into potent antibiotics for gram-negative bacteria// J. Am. Chem. Soc. 1999. - V. 121. - P. 931-940.

123. Maslov M. A., Morozova N. G., and Serebrennikova G. A. Convenient synthesis of cationic giycerolipids via methylthiomethyl ethers// Mendeleev Commun. -2000.-P. 65.

124. Veeneman G.H., Van Der Marel G.A., Van Gen Elst H.,.,Van Boom J.H. An efficient approach to the synthesis of thymidine derivatives containing phosphate-isosteric methylene acetal linkages// Tetrahedron Lett. 1991. - V. 47(8). - P. 1547-1562.