Синтез и изучение свойств поликатионных липофильных агентов трансфекции тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На пппдах тжппигн

0046

4£Ь (

¿Л'

ПЕТУХОВ ИВАН АЛЕКСЕЕВИЧ

СИНТЕЗ И ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ПОЛИКАТИОННЫХ ЛИИОФИЛЬНЫХ АГЕНТОВ ТРАНСФЕКЦИИ

02.00.10 — Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

2 5 ноя ?0Ю

МОСКВА —2010

004614267

Работа выполнена на кафедре химии и технологии биологически активных соединений им, H.A. Преображенского Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор

Г.А. Серебренникова

Официальные оппоненты: доктор химических наук, проф.

А.П. Каплун

доктор химических наук

Г.Е. Позмогова

Ведущая организация

Институт биоорганической химии имени М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита диссертации состоится « б » декабря 2010 г. в 1630 часов на заседании Диссертационного Совета Д 212.120.01 при Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, пр. Вернадского,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, пр. Вернадского, 86. С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте http://mitht.ru

Автореферат разослан « 2 » ноября 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат химических наук,

86,

старший научный сотрудник

А. И. Лютик

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Быстрое развитие технологии рекомбинантных ДНК, методов переноса плазмидных ДНК в клетку и выяснение молекулярных основ многих заболеваний привело к возникновению новой области медицины — генной терапии. Этот метод лечения наследственных и приобретенных заболеваний основан на введении терапевтических нуклеиновых кислот (НК) в клетки с целью направленного устранения генетических дефектов или придания клеткам новых функций. Важным условием успешной коррекции генетического повреждения являются эффективная доставка НК в клетки-мишени, создание условий для ее длительного функционирования.

В настоящее время наиболее эффективными системами доставки НК являются вирусные векторы, однако они имеют ряд серьезных недостатков. Это стимулирует разработку альтернативных подходов, одним из которых является липофекция — метод доставки НК с помощью катионных лилосом. Преимуществами катионных липосом являются неинфекционность, способность переносить НК неограниченного размера и защищать ее от действия клеточных ферментов, а также стабильность при хранении и экономическая доступность. В настоящее время катионные липосомы проходят клинические испытания для лечения ряда заболеваний. Однако, существенным недостатком известных на сегодняшний день липосомальных систем доставки является их низкая эффективность, обусловленная наличием внеклеточных и внутриклеточных биологических барьеров, которые должен преодолеть НК-липидный комплекс (липоплекс) прежде чем осуществить терапевтическое воздействие. К внеклеточным барьерам можно отнести компоненты крови и белки иммунной системы, которые дестабилизируют липоплекс и вызывают преждевременное высвобождение НК. Основными внутриклеточными барьерами, приводящими к снижению эффективности доставки, являются эндосомальная и ядерная мембраны.

Большое значение для повышения эффективности катионных липосом имеет структура формирующих их липидов. Молекула катаонного липида представляет собой комбинацию двух структурных доменов - гидрофобного и гидрофильного, - которые соединяются посредством линкеров различной природы. В качестве гидрофобного домена используют остатки длинноцепных углеводородов, стероидов и диглицеридов. Гидрофильный домен может содержать одну (монокатионные липиды) или несколько положительно заряженных групп (поликатионные липиды). Монокатионные липиды чаще всего представляют собой третичные или четвертичные производные алифатических или гетероциклических азотистых оснований. В поликатионных липидах в качестве гидрофильного домена выступают природные или синтетические полиамины а также аминокислоты.

\ / \'

Трансфицирующую активность катионного амфифила, а также его стабильность в биологических системах и токсичность во многом определяет тип связывания гидрофобного и гидрофильного доменов. Устойчивые липиды с простой эфирной связью более токсичны по сравнению с адильными липидами, которые легко гидролизуются в клетке эндогенными эстеразами. Наиболее удачное сочетание стабильности и токсичности амфифила обеспечивает уретановый линкер. Создание новых положительно заряженных амфифилов липидной природы с линкерами различного типа, обладающих низкой токсичностью и высокой эффективностью высвобождения НК в клетке, является актуальным направлением биоорганической и биомедицинской химии. Кроме того, для увеличения эффективности выхода НК из эндосом в структуру катионных амфифилов вводят лабильные структурные модули, которые разрушаются под действием внутриклеточных факторов и агентов, приводя к дестабилизации липоплекса. Известно, что процесс эвдоцитоза сопровождается увеличением кислотности среды от физиологического значения рН 7.4 до 5.0, поэтому включение в структуру амфифила кислотолабильных связей способствует дестабилизации липоплекса и облегчает высвобождение НК из эндосом в цитоплазму, тем самым увеличивая эффективность трансфекции. Другим примером катионных амфифилов, чувствительных к внутриклеточным агентам, служат липиды с дисульфидными связями, разрушаемые под действием восстановителей (НАДФН, глутатион, редуктазы).

Данная работа посвящена синтезу и изучению биологических свойств новых поликатионных амфифилов на основе биогенных компонентов - холестерина и спермина для доставки НК.

Работа является частью научных исследований, проводимых на кафедре ХТБАС МИТХТ им. М. В. Ломоносова по теме № 1Б-4-355 «Разработка химических и биотехнологических методов модификации биологически активных соединений с целью моделирования жизненно важных процессов в природе и создания новых лекарственных препаратов», а также в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса Россш на 2007-2012 годы» (02.512.11.2200), ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» (госконтракт П715), и грантов РФФИ (07-03-00632-а, 10-03-00995-а).

Цель работы

Разработка новых подходов к синтезу поликатионных амфифилов на основе биогенных компонентов - холестерина и спермина, с линкерами и спейсерами различной длины и типа и исследование их биологической активности.

Научная новизна работы В результате проведенной работы получены новые поликатионные амфифилы, содержащие в качестве гидрофобного домена остаток холестерина, а в качестве положительно заряженной группы - остаток спермина. Для увеличения эффективности высвобождения НК из эндосом связывание холестериновой и сперминовой компонент поликатионных амфифилов осуществляли с помощью ацетальных и дисульфидных связей, чувствительных к внутриклеточным агентам. Предложена и разработана универсальная схема синтеза поликатионных амфифилов на основе реакции Фукуямы, и показана ее перспективность по сравнению с методами, описанными ранее. Биологические исследования взаимосвязи структура-активность в ряду полученных поликатионных амфифилов выявили соединения, обладающие высокой трансфицирующей активностью.

Практическая значимость работы Разработан универсальный метод синтеза катионных амфифилов на основе реакции Фукуямы, который характеризуется высокими выходами и хорошей масштабируемостью. Применение этого метода позволило получить набор поликатионных амфифилов различной структуры в количествах, достаточных для проведения исследований по установлению взаимосвязи между строением и биологической активностью. Биологические испытания in vitro позволили выявить амфифилы, обладающие высокой трансфицирующей активностью и низкой токсичностью, которые перспективны для создания липосомальных систем доставки НК в организм млекопитающих с целью лечения наследственных и приобретенных заболеваний.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработка универсального метода синтеза поликатионных амфифилов на основе холестерина и биогенного амина - спермина, со сложноэфирным, уретановым или кислотолабильным ацетальным линкером.

2. Получение поликатионных амфифилов, содержащих в составе спейсера дисульфидную связь, чувствительную к действию внутриклеточных восстановителей.

3. Изучение биологической активности поликатионных амфифилов в экспериментах in vitro.

Апробация работы Основные результаты работы доложены на XVIII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Москва, 2007), на Ш Международной конференции «Фундаментальные науки - медицине» (Новосибирск, 2007), на XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008» (Москва, 2008), на V Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009); на XIII Международной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии - 2010» (Суздаль, 2010).

Публикации По результатам диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 2 статьи в ведущих отечественных научных журналах.

Объем и структура работы Диссертационная работа изложена на НО страницах машинописного текста и состоит из введения, литературного обзора, обсуждения полученных результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, включающего источника. Работа проиллюстрирована ЛО рисунками и содержит ¿Г схем и у таблиц.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для создания поликатионных липофильных агентов трансфекции в качестве основных структурных компонентов нами были выбраны природные нетоксичные соединения -холестерин и спермин. Известно, что катионные амфифилы, содержащие в качестве гидрофобного остатка холестерин, обладают высокой трансфицирующей активностью, низкой токсичностью и применяются для исследования механизмов слияния искусственных мембран и структурно-функционального изучения сформированных на их основе липоплексов. Природные полиамины, в том числе спермин, способны упаковывать ДНК в тороидальные и стержневые структуры, при этом метиленовые фрагменты, разделяющие атомы азота, играют важную роль во взаимодействии полиамина с двойной спиралью ДНК. Среди липофильных полиаминов производные спермина наиболее эффективно связывают и упаковывают ДНК и поэтому лучше переносят ее в клетки. На основе спермина были созданы коммерческие препараты для трансфекции. Спермин также является удобным синтоном для получения гемини-сурфактангов, которые характеризуются наличием двух заряженных «головок» и двух гидрофобных доменов, связанных жестким или гибким спейсером.

В литературе описано несколько подходов к получению поликатионных амфифилов, гидрофобная часть которых связана с полиамином посредством спейсеров различной длины. Большинство методов основано на первоначальном присоединении спейсерной группы к полиаминной матрице, после чего полученный фрагмент связывают с активированной гидрофобной составляющей.

Альтернативный подход к синтезу новых поликатионных амфифилов, предложенный нами, подразумевает первоначальное присоединение спейсерной группы к гидрофобной компоненте и последующую конденсацию с полиамином (схема 1).

Я = -ЗОАН^Ог, Н X = Вг, С). СООН

На первом этапе осуществляется синтез региоселективно защищенных производных спермина, поскольку полифункциональность молекулы требует избирательной модификации концевой КН2-группы для однозначного протекания последующей конденсации с гидрофобным доменом. На втором этапе проводится получение производных холестерина, в которых спейсерная группа соединена со стероидным остовом уретановой, сложноэфирной или ацетальной связью. На последнем этапе осуществляется конденсация холестериновой и сперминовой компонент и последующее удаление защитных групп.

Для конденсации сперминовой и холестериновой компонент нами были выбраны реакции, позволяющие проводить синтез в мягких условиях с высокими выходами. В синтезе поликатионных амфифилов с алкильным спейсером использовалась реакция Фукуямы - алкилирование 2-нитробензолсульфонамидов, полученных из первичных аминов, алкилгалогенидами с последующим удалением 2-нитробензолсульфонильной группы и образованием вторичных аминов (схема 2).

Схема 2

где остаток спермина

РГ - остаток холестерина со спейсерной группой

Для получения поликатионных амфифилов с дисульфидной группой в составе спейсера была выбрана классическая реакция создания амидной связи,, используемая в пептидной химии (схема 3).

Схема 3

R'—NH2 + НО

ОТ'

о

он

спейсер линкер

спейсер пинкер

о

RvN,^v-[cneücep|—|линкер[—Chol

спейсер!—[линкер!—Chol

где R - остаток спермина

Chol - остаток холестерина

1. Получение избирательно защищенных производных спермина

Согласно выбранной стратегии синтеза на первом этапе необходимо было получить защищенные производные спермина. Для создания несимметричных поликатионных амфифилов, исходя из спермина (1), были получены производные 5а,Ь и 8 путем региоселективного введения и удаления защитных групп (схема 4).

Выбор защитных групп был сделан с учетом условий проведения последующих реакций конденсации. Так, для синтеза амфифилов со сложноэфирной и уретановой связью, осуществляемого в основной среде, использовалась /ире/я-бутоксикарбонильная (Вое) защитная группа, стабильная в основных условиях, но легко удаляемая в кислых. Для синтеза амфифилов с кислотолабильными ацетальными связями использовали бензилоксикарбонильную (СЬг) защиту, легко удаляемую каталитическим гидрогенолизом.

Схема 4

н

в (90%)

а - CF3COOEt, -70-80 °С; Ь - Вос20 или CbzCl/Et3N, -10 °С; с - NaOH, 25 °С; d- 2-N02C6H4S02Cl, Et3N, 0 "С; е - ВтСН2СООМе, Cs2C03,60 °С;/- PhSH, К2С03, 25 °С; g - NaOH, 25 °С, 3% водный раствор HCl.

Для получения три-Вос и три-СЬг-защшценных производных спермина 4а,Ь (схема 4) первоначально проводили региоселективное моноацилирование первичной аминогруппы в молекуле спермина (1) действием эквимолярного количества этилтрифторацетата при -7080 °С, а через 1 ч проведения реакции осуществляли блокирование остальных свободных аминогрупп ди-т/>ея/-бутилпирокарбонатом либо бензилоксикарбонилхлоридом, при этом получали полностью защищенные производные спермина За,Ь. Последующее селективное удаление трифторацетильной защиты действием водного раствора гидроксида натрия приводило к образованию соединений 4а,Ь, которые содержат свободную первичную аминогруппу, что необходимо для дальнейшего связывания с производными холестерина. Для осуществления на последнем этапе синтеза реакции Фукуямы проводили N-сульфонилирование соединений 4а,b действием 1.2-кратного избытка 2-нитробензолсульфонилхлорида в присутствии триэтиламина. Амиды 5а,b были выделены с выходами 88 и 91%, соответственно, а их структуры подтверждены данными спектроскопии ЯМР. Появление сигналов ароматических протонов в районе 7.5-8.3 м.д. свидетельствует о наличии в молекулах 5а,b 2-нитробензолсульфонильной группы.

Для синтеза тетракатионного дисульфидного амфифила с амидной связью между остатком спермина и спейсерной группой (схема 3), необходимо было получить карбоксильное производное спермина 8. Для этого проводили алкилирование соединения 5а метиловым эфиром бромуксусной кислоты в присутствии карбоната цезия (схема 4). Удаление метальной и 2-нитробензолсульфонильной защитных групп в соединении б осуществлялось в различной последовательности. В первом варианте сначала удаляли 2-нитробензолсульфонильную группу действием тиофенола в ДМФА, образующийся при этом вторичный амин 7 был выделен с выходом 86%. Последующее омыление метилового эфира раствором гидроксида натрия давало соединение 8 с количественным выходом и не требовало дополнительной очистки. Во втором варианте сначала осуществляли омыление метилового эфира, а затем удаление 2-нитробензолсульфонильной группы. В этом случае целевой продукт 8 был загрязнен дифенилсульфидом, а высокая полярность соединения 8 затрудняет его хроматографическое выделение. В связи с этим в дальнейшем предпочтение было отдано первому варианту.

Для синтеза поликатионных амфифилов, относящихся к классу гемини-сурфактантов, необходимо было получить симметричное производное спермина 12 (схема 5).

а - СРзСОС®, О °С; Ъ - Вос20,0 °С; с - ЫаОН, 25 °С; с! - г-ГТОгСбИ^СЬС!, Е13Ы, О °С.

Спермин (1) обрабатывали 2-кратным избытком этилтрифторацетата для защиты первичных аминогрупп, после чего блокировали оставшиеся аминогруппы действием ди-тлрет-бутилпирокарбоната, получая полностью защищенное производное спермина 10. После удаления трифторацетильных групп получили частично защищенный полиамин 11, содержащий две свободные первичные аминогруппы. Далее проводили Л-сульфонилирование производного 11 2-нитробензолсульфонидхлоридом с образованием соединения 12 с выходом 78%.

Таким образом, нами были получены симметрично и несимметрично защищенные производные спермина 5а,Ь, 8 и 12 для дальнейшего синтеза целевых поликатионных амфифилов.

2. Получение производим* холестерина с различными линкерными группами

Для синтеза поликатионных амфифилов со сложноэфирным, уретановым и ацетальным линкерами нами была выбрана реакция Фукуямы - взаимодействие 2-нитробензолсульфонамвдных производных спермина с галогенпроизводными холестерина (схема 2). В соответствии с заложенной стратегией синтеза, на втором этапе необходимо было ввести в молекулу холестерина галогенсодержащую спейсерную группу путем создания между ними сложноэфирной, уретановой или ацетальной связи. Для получения поликатионных амфифилов с дисульфидной связью (схема 3) требовалось синтезировать производные холестерина, содержащие на конце спейсера амино- и карбоксильную группу.

2.1. Синтез бромпроизводных холестерина со сложноэфирным и уретановым линкером

Бромпроизводное холестерина 14 со сложноэфирным линкером получали путем взаимодействия холестерина (13) с хлорангидридом 5-бромвалериановой кислоты в присутствии пиридина (схема 6).

14(96%)

^Cho,

.Chol

or

„__________16a:n =3 (90%) 17a:n =3(84%)

15 b: n = 5 (87%) b: n = 5 (84%)

HO—Chol -13

С1ю1=

а - Вг(СН2)4СОС1, Ру, 0 °С; Ъ - С01, Е^И, 40 °С; с - НО(СН2)„МН2, п = 4, 6,40 °С; й- СВг4, РЬ3Р, 25 °С.

Для создания соединений с уретановой связью на первой стадии холестерин (13) обрабатывали 1.1-кратным избытком 1,Г-карбонилдиимидазола (СБ!), получая имидазолид 15, дальнейшее взаимодействие которого с 4-аминобутанолом или 6-аминогексанолом давало гидроксипроизводные 16а,Ь. Нуклеофильное замещение гидроксильной группы на атом брома действием избытка тетрабромметана в присутствии трифенилфосфина приводило к бромидам 17а,Ь с высокими выходами. Структура полученных соединений была подтверждена данными элементного анализа и спектроскопии ЯМР. Так, в спектре ЯМР соединения 17а наблюдалось смещение сигналов ядер СН2Х-группы (СЬЬОН 8Н = 3.59 м.д., 8с = 62.10 м.д.) в сильное поле (СН2Вг 5н = 3.34 м.д., 8с = 33.43 м.д.).

2.2. Синтез галогенпроизводных холестерина с кислотолабилъным 0,0-ацетальным линкером

Получение галогенпроизводных холестерина с ацетальным линкером основано на использовании метилтиометилового (МТМ) эфира холестерина (18) (схема 7).

Схема 7

НО—Chol —-—CH-S^o'Ch01-13 18(73%)

Br

19 20a:n=2,Hal = Br(55%)

20b: n =4, Hai = Cl(75%) 20c: n = 6, Hai = Cl (66%)

а - ОМЗО, Ас20, АсОН, 25 °С; Ь - Вг2,25 °С; с - НО(СН2)пНа1, п = 2,4, 6, 2,6-лутидин, 25 °С.

Метилтиометиловый (МТМ) эфир холестерина (18) получали обработкой холестерина (13) смесью БМ80-Ас20-Ас0Н. Для синтеза галогенпроизводных холестерина 20а-с МТМ эфир 18 переводили в высокореакционноспособный бромметиловый эфир 19 обработкой

эфира 18 Л'-бромсукцинимидом (NBS) в присутствии диизопропилэтиламина (DIEA). Дальнейшее взаимодействие эфира 19 с галогензамещенными спиртами (1.5-10 кратный избыток) давало целевые продукты 20а-с с низкими выходами (< 30 %). С целью увеличения выходов была проведена оптимизация условий реакции, которая показала, что замена DIEA на 2,6-лутидин, а NBS на бром приводит к увеличению выходов соединений 20а-с до 55-75 % (табл. 1).

Табл. 1. Оптимизация условий получения соединений 20а-с

Продукт реакции Нуклеофил (экв.)* Основание (экв.) Реагент (экв.) Т,°С Выход, %

20а НО(СН2)2Вг (4) DIEA (4) NBS (3) 20 5

Вг2 (1.1) 30

2,6-Лутидин (4) Вг2 (2) 55

20Ь НО(СН2)4С1 (10) 2,6-Лутидин (3) Вг2 (2) 20 75

20с НО(СН2)6С1(5) - NBS (3.0), ТЮН (0.2) -10 30

НО(СН2)6С1 (3) DIEA (10) Вг2 (3) 20 20

НО(СН2)6С1(5) 2,6-Лутидин (3) Вт, (2) 66

* количество мольных эквивалентов по отношению к метилтиометиповому эфиру 18

2.3. Синтез амино- и карбоксипроизводных холестерина с дисульфидной группой в составе спейсера

Дисульфидная группа в молекуле амфифила является участком, чувствительным к действию внутриклеточных восстановителей. Один из наиболее простых способов получения амфифилов с дисульфидной связью заключается во введении в молекулу холестерина спейсера, содержащего 8-8 группу. Спейсеры с Э-Э группой мы получали окислением 2-меркаптоуксусной и 3-меркаптопропионовой кислот, а также цистеамина перекисью водорода с количественными выходами.

Схема 8

Н<¥*^он ■ а и

13 21b: п = 2 о

22а: n = 1 (67%) 22b: n = 2 (45%)

О

Ь и —■ с II

— Л/™-^-— H2N^ S^^ A0.Chol

Oi О H

15 23(59%)

а - DCC, DMAP, 0 °C; b - CDI, Et3N, 40 °C; с - Et3N, 40 °C.

Ацилирование холестерина 13 дитиодиуксусной (21a) и дитиодипропионовой кислотами (21b) с использованием в качестве конденсирующего агента N,N'-

дициклогексилкарбодиимида (ЭСС), а в качестве катализатора -диметиламинопиридина (ОМАР) позволило синтезировать производные холестерина со сложноэфирной связью между стероидным остатком и спейсером (схема 8). Варьирование соотношений реагентов показало, что использование 2-кратного избытка дикарбоновых кислот 21а,Ь и 0.5 экв. ОМАР приводит к образованию соединений 22а,Ь с наилучшими выходами (67 и 45 %, соответственно). Использование других конденсирующих агентов (Вор1, СЭ1, Вос}0) не привело к увеличению выхода (< 10%).

Для создания амфифила 23 с уретановым линкером использовали тот же подход, что и при синтезе бромпроизводных холестерина 17а,Ь, а именно взаимодействие имидазолида холестерина 15 с избытком цистамина (схема 8).

Таким образом, на данном этапе работы были получены производные холестерина, в которых к стероидному остатку посредством сложноэфирного (14, 22а,Ь), уретанового (17а,Ь, 23) или кислотолабильного ацетального линкера (20а-с) присоединены спейсерные группы, отличающиеся количеством метиленовых звеньев и наличием дисульфидной связи.

3. Конденсация холестериновой и сперминовой компонент. Получение целевых поликатконных амфифилов.

Завершающий этап синтеза заключался в конденсации холестериновой и сперминовой компонент и последующим удалении защитных групп.

3.1. Синтез поликатионных амфифилов со сложноэфирным и уретановым линкером.

Для синтеза амфифилов 26а-с со сложноэфирным и уретановым линкером проводили алкилирование защищенного спермина 5а бромпроизводными холестерина 14, 17а,Ь в условиях реакции Фукуямы (схема 9).

Схема 9

14:Х = СО, п = 3 17а: X =ЫНСО, п = 3 Ь: Х=ЫНСО, п = 5

24а: X =СО, п - 3 (06%) Ь:Х=ННСО, п = 3 (94%) с: X = N НСО, п = 5 (89%)

А

Вое

25а: X = СО, п = 3(83%) Ь: X = ЫНСО, п = 3 (99%) с: X = МНСО, п = 5 (89%)

Вое

Вое

н

с

26а: X = СО, п = 3(99%) Ь: X = ЫНСО, п = 3 (97%) с: X = ННСО, п = 5 (95%)

1 Вор - гексафторфосфат бензотриазол-1-илокси-трис-(диметиламино)фосфония

13

а - Сз2С03, ОМР, 60 °С; Ъ - РИБН, К2С03, 25 °С; с - 4н НС1 в диоксане, 25 °С.

Реакция проходила гладко за 2 часа, и после хроматографической очистки выходы соединений 24а-с составили 86-94%. Соединения 24а-с охарактеризованы данными масс-спектрометрии, а также данными 'Н- и 13С-спекгроскопии ЯМР. Масс-спектры содержат сигналы молекулярных ионов со значениями масс, соответствующими ожидаемым. Спектры ЯМР представляют собой совокупность сигналов ядер полиаминной и холестериновой компонент.

При удалении защитных групп сначала проводили десульфонилирование соединений 24а-с действием тиофенола в ДМФА, а затем удаляли Вос-защитные группы в соединениях 25а-с 4н раствором НС1 в диоксане. Целевые амфифилы 26а-с получены с выходами 82-96% на 2 стадии.

Для синтеза амфифилов 29а-с, относящихся к классу гемини-сурфактантов, осуществляли конденсацию бромидов 14,17а,Ь с полиаминным производным 12 (схема 10) в тех же условиях, как и для соединений 24а-с.

Схема 10

вГ«;*

14: X = СО, п и 3 17*: X *ННСО, п = 3 Ь: X « ЫНСО, и ж 5

б"' 27а:Х=СО, п«3(61%Г

Ь: X * ЫНСО, п * 3 (60%) с: X = N НСО, и * 5 (56%)

28а: X -СО, п « 3 (60%) Ь: X = ИНСО, п = 3 (77%) с:Х»Г(НСО,п = 5(71%)

4НС1

'■„. ....... , ■А. 1 \ Н Н

Н Н п

29а:X »СО, п = 3(82%)

Ь: X = ЯНСО, п = 3 (99%)

с: X = N400, п Ж 5 (95%)

а - СэгСОз, ОМР, 60 °С; Ъ - РЬБН, К2С03, 25 °С; с - 4н НС1 в диоксане, 25 °С.

Для деблокирования аминогрупп в полученных соединениях 27а-с, как и в случае синтеза амфифилов 26а-с сначала удаляли 2-нитробензолсульфонильную группу, а затем Вос-защиту. Гемини-сурфактанты 29а-с получены с выходами 49-76% на 2 стадии.

3.2. Синтез поликатионных амфифилов с ацетильным линкером

Для синтеза амфифилов с кислотолабильной ацетальной связью галогенпроизводные холестерина 20а-с вводили во взаимодействие с региоселективно защищенным спермином 5Ь (схема 11).

Алкилирование защищенного спермина 5Ь бромидом 20а проходило легко и после хроматографической очистки выход соединения 30а составил 94%. В случае хлорпроизводных 20Ь,с из-за их меньшей реакционной способности взаимодействие протекало в более жестких условиях (85 °С, 20 ч) и требовало присутствия катализатора -тетрабутиламмонийиодида, при этом выходы соединений 30Ь,с составили около 50%. Удаление 2-нитробензолсульфонильной группы привело к соединениям 31а-с с выходами от 74 до 97%.

Схема 11

n --f, Н«|«Вг «« СМ

п * 3, Hai <= С1 5Ь

п - 5, Hai = CI

п ■ 1 (94%) п " 3 (50%) п = 5 (54%)

Chol

I СЬг Cht

Cbz

31а: и >1 (97%) Ь: п « 3 (74%) с: п =5 (83%)

а - Cs2C03, Bu4N+I" в случае соединения 20b,c, DMF, 60-85 °С; b - PhSH, К2С03, 25 °С; с - 10% Pd/C, Н2, 25 °С.

Для удаления Cbz-защиты нами бьшо опробовано несколько реагентов (триметилсилилиодид, 40% КОН, Na/ЫНз), но только каталитическое восстановление водородом на 5 и 10 % Pd/C приводило к целевым амфифилам 32а-с.

3.3. Получение поликатионных амфифилов с дисульфидной связью

Использованная нами стратегия синтеза поликатионных амфифилов с дисульфидной группой в структуре спейсера основана на образовании амидной связи между производными спермина 4а или 8, с одной стороны и производными холестерина 22а,b и 23, с другой.

ОС)10|

22а: п = 1 Ь:п = 2

33а: и = 1 (60%) Ь: п = 2 (82%)

а - ТВТи, Е13Х, ОМР, 25 °С; Ь- 4н НС1 в диоксане, 25 °С.

Для синтеза дисульфидных трикатионных амфифилов 34а,Ь (схема 12) проводил конденсацию карбоксипроизводных холестерина 22а,Ь с соединением 4а с использованиек различных конденсирующих агентов. Исследования показали, что максимальный выхо соединений 33а,Ь достигался в случае применения ТВТи2 (табл. 2). После удаления Вое защитных групп получали трикатионные амфифилы 34а,Ь.

Табл. 2. Оптимизация синтеза соединений 33а,

Карбоксильная компонента Конденсирующий агент Выход соединения 33, %

22а Вор 28

БСС/ОМАР 27

твти 60

22Ь твти 82

Для увеличения количества аммонийных групп в молекуле поликатионного амфифила, потенциально участвующих в нейтрализации отрицательно заряженных фосфатных групп НК, получали соединение 36 конденсацией полиаминного синтона 8 с аминопроизводным холестерина 23 (схема 13). В качестве конденсирующего агента был выбран ТВТи. Реакция проходила гладко и после хроматографической очистки на силикагеле производное 35 было выделено с выходом 92 %. Последующее удаление Вос-групп в соединении 35 давало целевой тетракатионный амфифил 36 с выходом 81%.

■ ТВТИ - тетрафторборат (2-(1Я-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилмочевины

Т~ н

■r^Tr™ +

Вое О CI

Ь

8а 35(92%)

36(81%)

а - TBTU, DEA, DMF, 25 "С; b-4u НС1 в диоксане, 25 °С.

Таким образом, в результате проделанной работы нами синтезированы новые амфифилы на основе холестерина и спермина, отличающиеся способом присоединения спермина к гидрофобному домену (сложноэфирная, уретановая, ацетальная, амидная, дисульфидная связь), длиной спейсерного участка, а также количеством катионных аммонийных групп (трикатионные и тетракатионные амфифилы) и гидрофобных доменов.

4. Биологические исследования поликатионных амфифилов1

Для синтезированных поликатионных амфифилов 26а-с, 29а-с, 34а,Ь, 36 была исследована цитотоксичность и способность переносить нуклеиновые кислоты в эукариотические клетки. Изучение свойств данного ряда соединений позволяет выявить влияние структуры катионных амфифилов на токсичность и трансфицирующую активность. Были получены липосомальные композиции, состоящие из поликатионных амфифилов и нейтрального липида диолеоилфосфатидилэтаноламина (DOPE) в соотношении 1:1 (мольн.). Для приготовления липосом использовался метод гидратации липидной пленки с последующей обработкой мультиламеллярной эмульсии в ультразвуковой бане в течение 10-15 мин.

3 Исследования выполнены в лаборатории биохимии нуклеиновых кислот ИХБФМ СО РАН под руководством д.б.н., проф. М.А. Зенковой

29а: Х=СО. п=3

34а: п=1 Ь: п=2

Результаты исследования на цитотоксичность (МТТ-тест) показали, что вс поликатионные амфифилы в комплексе с DOPE нетоксичны для клеток линий HeLa НЕК293 вплоть до концентрации 40 мкМ, а для клеток ВНК - до 5-10 мкМ. Наличи дисульфидной связи в соединениях 34а,Ь, 36 не влияет на токсичность амфифилов.

В качестве объектов для доставки НК в эукариотические клетки были выбрань короткий 25-звенный меченный флуоресцеином дезоксирибонуклеотид (FITC-ODN) плазмидная ДНК, кодирующая зеленый флуоресцентный белок (pEGFP). Доставку НК клетки регистрировали с помощью проточной цитофлуориметрии. Эксперименты п доставке проводили при варьировании соотношения P/N (количественное соотношени отрицательно заряженных фосфатных групп нуклеиновой кислоты к положительн заряженным группам амфифила), поскольку известно, что это соотношение влияет н эффективность трансфекции. Эффективность доставки в клетки оценивали по количеству трансфицированных клеток и по средней интенсивности флуоресценции на клетку популяции.

Эксперименты проводили как в присутствии 10% сыворотки в ростовой среде, так и ее отсутствии, поскольку известно, что наличие сыворотки в среде может влиять н стабильность частиц, образованных амфифилами и на их взаимодействие с клетками. Эффективность доставки НК в клетки сравнивали с коммерческим препаратом Липофектамин, который является «золотым стандартом» среди липосомальных систем доставки НК.

Для липосомальных композиций, состоящих из соединений 26а-с и гемини-сурфактантов 29а-с были определены оптимальные соотношения P/N в присутствии и в

отсутствие сыворотки крови. Показано, что в отсутствие сыворотки при изменении соотношения P/N количество трансфицированных клеток изменяется незначительно от 75 до 90% (рис. 1А, 2А). Лучшую эффективность среди амфифилов 26а-с показали липосомы на основе соединения с уретановым линкером 26Ь при соотношении P/N = 1 : 1.25 (рис. 1В). Приэтом Липофектамин был менее эффективен, чем липосомы с амфифилами 26а-с.

BP/N=1:1 0P/N=1:1.25 SP/N=1:1.5 0P/N=1:2 ESP/N=1:1 0P/N=1:1.25 SP/N=1:1.5 SP/N=1:2

[.¡ро1ес1апнпе 26а-ООРЕ 26Ь-ООРЕ 26с-йОРЕ иро)ес1ат!пе 26а-ООРЕ 2вЬ-й0РЕ 26с-ООРЕ

Рис. 1. Результаты трансфекции клеток НЕК293 комплексами, состоящими из ПТС-ООЫ и катионпых липосом 26а-с-ООРЕ в отсутствии сыворотки крови (А,В).

Результаты, полученные для липосом с гемини-сурфактантами 29а-с, показали, что число трансфицированных клеток в два раза превышает количество клеток, трансфицированных с помощью Липофектамина (рис. 2А). Значения средней интенсивности флуоресценции возрастали с увеличением соотношения P/N (рис. 2В). Максимальные интенсивности флуоресценции были зафиксированы при P/N = 1:4 для амфифилов 29а и P/N =1:3 для 29с с сложноэфирной и уретановой связью и длиной спейсера 4 и 6 метиленовых звеньев, соответственно. Геминя-сурфактант 29Ь обладал небольшой способностью доставлять FITC-ODN в клетки (рис. 2В).

HP/N = 1:1 0P/N = 1:2 a P/N = 1:3 i P/N = 1:4-

Lipofectamine 2Sa-D0PE 29b-DOPE 29c-DOPE

: sP/N = 1:1 и P/N = 1:2 aP/N = 1:3 mP/N = 1:4;

¡300 -i- j)-

Lipofectamine 29a-DOPE 29b-DOPE 29c-DOPE

Рис. 2. Результаты траисфекции клеток НЕК293 комплексами, состоящими из FITC-ODN\ и катионных липосом 29a-c-DOPE в отсутствие (А,В) и в присутствии 10% сыворотки (C.D).

Введение в ростовую среду 10% сыворотки крови снижало эффективность доставки' олигонуклеотида в 2-7 раз в случае соединений 26а-с (данные не представлены). Наибольшее значение интенсивности флуоресценции на клетку наблюдалось для липосом | 26b-DOPE при соотношении P/N =1:2. Количество трансфицированных клеток снижалось; при высоких соотношениях P/N в случае гемини-амфифилов 29Ь,с и не изменялось для амфифида 29а (кроме P/N =1:1) (рис. 2С). Однако значения средней интенсивности флуоресценции на клетку (то есть количества переносимого в клетки FITC-ODN) существенно уменьшалось для соединения со сложноэфирным линкером 29а (рис. 2D), что говорит об ингибирующем действии сыворотки на трансфицирующую активность этого амфифила, Таким образом, наличие в структуре амфифила уретанового линкера желательно для проведения трансфекции в условиях, приближающихся к in vivo.

Lipofectamine 29a-DOPE

Lipofectamine 29a-DOPE 29b-DOPE 29c-DOPE

29b-DOPE 29c-DOPE ;

v. В

P/N = 1:1 0P/N = 1

:2BP/N = 1:3aP/N = 1:4

/

Для изучения влияния структуры амфифила на доставку в клетки плазмидной ДНК были выбраны поликатиовные соединения с уретановым линкером и разным количеством гидрофобных доменов 26Ь и 29с, показавшие наибольшую эффективность транспорта FTTC-ODN, а также дисульфидные поликатионные амфифилы 34а,b и 36. Результаты трансфекции клеток НЕК293 в отсутствие сыворотки показали, что дисульфидные трикатионные амфифилы со сложноэфирной связью 34а,b неэффективно доставляют ДНК в клетки (рис. ЗА,В). Для тетракатионных амфифилов с уретановым линкером 26Ь и 36 наблюдали увеличение эффективности доставки ДНК с увеличением количества катионного амфифила в НК-липидном комплексе. Наибольшее количество трансфицированных клеток было зафиксировано для гемини-сурфактанта 29с при P/N = 1 : 4, а дальнейшее увеличение количества гемини-сурфактанта приводило к снижению эффективности доставки. Проведение трансфекции в присутствии сыворотки крови вызывало уменьшение количества трансфицированных клеток, при этом максимальные значения наблюдались при соотношении P/N =1:6 (рис. ЗС). Гемини-сурфактант 29с трансфицировал наибольшее количество клеток (рис. ЗС), а максимальное значение средней интенсивности флуоресценции наблюдали в случае соединения 26Ь (рис. 3D).

P/N=1:8

,6.dope34a.oopewooре lipo«*®™1"29c-dope26b-dope 36-dope 34алоремь.00ре

а P/N=1:2 es P/N=1:4 «P/N=1:6 EP/N=1:8

J -

i 30

£ to

5 so

| 50

ä 40

Lipo'

rfMrtamtaeHc-DOPEjso.DOPE 36-DOPE3j3.DOPE3tjj.DOPE

BPIN=1:2 BP/N=1:4 aP/N=1:6 SP/N=1:8

5 Ю o

joofertsm^TSt-DOP^Sb-BOPE 5fr.DOPE34a-DOPE3Ab.DOPE

Рис. 3. Результаты трансфекции клеток НЕК293 комплексами, включающими pDNA катионные композиции из липидов 26Ь, 29с, 34а,Ь, 36 и DOPE в отсутствие (А,В) и присутствии 10% сыворотки (C,D).

По сравнению с соединениями 26Ь и 29с дисульфидный амфифил 36 трансфициров меньшее количество клеток (рис. ЗС), но среднее значение интенсивности флуоресценци зеленого флуоресцентного белка при использовании соединения 36 (рис. 3D) было сравним или превышало интенсивность флуоресценции, наблюдаемую для комплексов на осно соединений 26Ь и 29с. Следовательно, при худшем проникновении комплекса наблюдаете повышенная экспрессия зеленого флуоресцентного белка, что вероятно обусловлен разрушением дисульфидных связей в молекулах амфифила 36 под действие-внутриклеточных восстановителей и более эффективным высвобождением ДНК.

Таким образом, в результате проведенных биологических испытаний было показан что для эффективной трансфекции в структуре катионного амфифила желательно имет линкер уретанового типа и тетракатионную полярную группировку. Гемини-сурфактант 29 является наиболее активным трансфектантом. Наличие дисульфидной связи в молекул амфифила приводит к увеличению доставки плазмидной ДНК в эукариотические клетки.

Выводы:

1. Разработана новая универсальная схема синтеза поликатионных амфифилов, н основе холестерина и спермина, предназначенных для доставки генетического материала эукариотические клетки.

2. Синтезирован ряд поликатионных амфифилов, отличающихся линкеров (сложноэфирный, уретановый), длиной спейсера и количеством гидрофобных доменов.

3. Синтезированы кислотолабильные поликатионные амфифилы ацетального типа н основе холестерина и спермина.

4. Впервые получены дисульфцдные поликатионные липиды на основе холестерина спермина, чувствительные к действию внутриклеточных восстановителей.

5. Биологические испытания показали, что липосомальные композиции на основ амфифилов с уретановым линкером 26Ь и 29с обладают высокой эффективностью доставк коротких и протяженных НК в клетки млекопитающих, как в присутствии, так и отсутствие сыворотки в ростовой среде, что позволяет рассматривать их в качеств перспективных коммерческих агентов трансфекции.

6. Показано, что включение в состав амфифилов дисульфидной связи ведет увеличению эффективности трансфекции.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:

1. Петухов И.А., Маслов М.А., Морозова Н.Г., Серебренникова Г.А. / Синтез поликатионных липидов на основе холестерина и спермина // Известия АН. Сер. Химическая, 2010, Т. 1, С. 254-261.

2. Petukhov I.A., Maslov М.А., Morozova N.G. and Serebrennikova G.A. / Convenient synthesis of polycationic amphiphiles by the Fukuyama reaction // Mendeleev Commun., 2009, V. 19, P. 250-252

3. Петухов И.А., Маслов M.A., Морозова Н.Г., Серебренникова Г.А. / Оптимизация синтеза поликатионных липоидов с ацетальными связями // Тезисы докладов XIII Международной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии -2010», Суздаль, 2010, С. 190.

4. Петухов И.А., Маслов М.А. / Создание липидных медиаторов трансфекции на основе биогенной полиаминной матрицы // Тезисы докладов Пятого международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 2009, С. 187-188.

5. Петухов И.А., Маслов М.А., Морозова Н.Г., Серебренникова Г.А. / Синтез холестеринсодержащих поликатионных липидов с ацетальными связями // Тезисы докладов Ш молодежной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии-2009», Москва, 2009, С. 46.

6. Петухов И.А., Маслов М.А., Морозова Н.Г., Серебренникова Г.А. / Синтез и изучение свойств липофильных поликатионных агентов трансфекции // Тезисы докладов XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008», Москва, 2008, С. 286.

7. Петухов И.А., Маслов М.А., Морозова Н.Г., Серебренникова Г.А. / Липофильные производные спермина для трансфекции эукариотических клеток // Тезисы докладов XIX зимней молодежной научной школы «Перспективыные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 2007, С. 17.

8. Петухов И.А., Маслов М.А., Морозова Н.Г., Серебренникова Г.А. / Новые коньюгаты спермина и холестерина для переноса ДНК в эукариотические клетки // Тезисы докладов XVIII Менделеевского съезда по общей и прикладной химии, Москва, 2007, С. 2164.

9. Маслов М.А., Петухов И.А., Морозова Н.Г., Серебренникова Г.А. ! Липофильные полиамины для доставки генетического материала // Тезисы докладов 3 Международной конференция «Фундаментальные науки - медицине», Новосибирск, 2007, С. 149.

10. Петухов И.А., Маслов М.А., Морозова Н.Г., Серебренникова Г.А. / Синтез холестеринсодержащих амфифилов для транспорта олигонуклеотидов в клетки эукариот // Тезисы докладов II молодежной научно-технической конференций «Наукоемкие химические технологии», Москва, 2007, С. 52.

Список сокращений.

1. Введение.

2. Литературный обзор.

2.1 Введение и основные положения генной терапии.

2.2. Невирусные векторы на основе поликатионных амфифилов.

2.3. Свойства и эффективность гемини-сурфактантов.

2.4. рН чувствительные конъюгаты для биомедицинского применения.

2.5. Полимеры, липиды и биоконъюгаты, чувствительные к восстановлению.

2.5.1. Катионные полимеры, чувствительные к действию восстанавливающих агентов для внутриклеточной доставки НК.

2.5.2. Полипептиды и белки, чувствительные к восстановлению.

2.5.3. Липосомы, чувствительные к действию восстановливающих агентов.

3. Обсуждение результатов.

3.1. Получение избирательно защищенных-производных спермина.

3.2. Получение производных холестерина с различными линкерными группами.

3.2.1. Синтез бромпроизводных холестерина со сложноэфирным и уретановым линкером.

3.2.2. Синтез галогенпроизводных холестерина с кислотолабильным 0,0-ацетальным линкером.

3.2.3. Синтез амино- и карбоксипроизводных холестерина - с дисульфидной группой в составе спейсера.

3.3. Конденсация холестериновой и сперминовой компонент. Получение целевых поликатионых амфифилов.

3.3.1. Синтез амфифилов типа «голова-хвост» и гемини-амфифилов со сложноэфирным и уретановым линкером.

3.3.2. Синтез поликатионных амфифилов с ацетальным линкером.

3.3.3. Получение поликатионных амфифилов с дисульфидной связью.

3.4. Биологические исследования поликатионных амфифилов.

3.4.1. Изучение токсичности синтезированных амфифилов.

3.4.2. Доставка Р1ТС-меченного дезоксирибонуклеотида (РГГС-СЮМ) комплексами на основе амфифилЮОРЕ.

3.4.2. Доставка плазмидной ДНК комплексами на основе амфифилЮОРЕ.

4. Выводы:.

5. Экспериментальная часть.

Стремительное развитие молекулярной биологии и расширение представлений о молекулярных механизмах, лежащих в основе патогенеза различных заболеваний, привели к значительным изменениям в терапевтических подходах. К настоящему времени известны многие заболевания, не поддающиеся лечению методами традиционной терапии, так как они обусловлены нарушениями в клеточном геноме. Для их лечения развивается одна из перспективных областей медицины — генная терапия. Эта форма терапии заключается в устранении причины заболевания путем введения терапевтического гена, обеспечивающего синтез недостающего белка с последующим восстановлением метаболического равновесия.

Как концептуально перспективный терапевтический подход, генная терапия интенсивно развивается по многим направлениям, которые определяются разнообразием методов введения терапевтического гена в эукариотические клетки (трансфекция). Известны различные методы доставки генетического материала в клетки, в основе которых лежат электропорация, бомбардировка заряженными частицами, инъекция ДНК, использование вирусов, липосом и полимеров. Среди них заметное место занимает метод липофекции, использующий в качестве средства доставки генетической информации в клетки катионные липосомы, обладающими такими преимуществами, как защита ДНК, мРНК и олигонуклеотидов от инактивации и деградации под действием клеточных ферментов, неинфекционность, неиммуногенность, доступность и простота в изготовлении.

В настоящее время для повышения эффективности доставки НК с помощью липидных векторов разрабатываются и изучаются различные модификации структуры катионных липидов, формирующих катионные липосомы, которые отличаются компановкой структурных доменов, природой катионной головки и гидрофобной области, спейсером.

Данная работа является продолжением исследований в области катионных амфифилов липидной природы, предназначенных для генетической трансфекции, и посвящена синтезу и изучению свойств поликатионных амфифилов на основе спермина и холестерина.

2. Литературный обзор

4. Выводы:

1. Разработана новая универсальная схема синтеза поликатионных амфифилов, на основе холестерина и спермина, предназначенных для доставки генетического материала в эукариотические клетки.

2. Синтезирован ряд поликатионных амфифилов, отличающихся линкером (сложноэфирный, уретановый), длиной спейсера и количеством гидрофобных доменов.

3. Синтезированы кислотолабильные поликатионные амфифилы ацетального типа на основе холестерина и спермина.

4. Впервые получены дисульфидные поликатионные липиды на основе холестерина и спермина, чувствительные к действию внутриклеточных восстановителей.

5. Биологические испытания показали, что липосомальные композиции на основе амфифилов с уретановым линкером 26Ь и 29с обладают высокой эффективностью доставки коротких и протяженных НК в клетки млекопитающих, как в присутствии, так и в отсутствие сыворотки в ростовой среде, что позволяет рассматривать их в качестве перспективных коммерческих агентов трансфекции.

6. Показано, что включение в состав амфифилов дисульфидной связи ведет к увеличению эффективности трансфекции.

5. Экспериментальная часть

В работе использовались перегнанные растворители, реагенты отечественного (Химмед) и зарубежного производства (Merck, Fluka, Aldrich, Acros). CH2CI2 и Et3N кипятили с СаН2 и перегоняли перед реакцией. ДМФА выдерживали над прокаленными молекулярными ситами 4 А. Л/1,Л/4,Л/9-три-трет-бутоксикарбонил-1,12-диамино-4,9-диазадодекан [39] (4а) и ДЛл^-ди-трет-бутоксикарбонил-1,12-диамино-4,9-диазадодекан [149] (11), метилтиометиловый эфир холестерина (18) [156], соединение 22а [158] получали согласно известным методикам.

Тонкослойную хроматографию проводили на пластинках Kieselgel 60 F254 (Merck) в системах растворителей: петролейный эфир-ЕЮАс, 4 : 1 (А); CHCI3-МеОН, 40 : 1 (Б); 36 : 1 (В); 25 : 1 (Г); 20 : 1 (Д); 13:1 (Е); CHCI3-MeOH-Pr1NH2, 4:1:2 (Ж), 3:1:2 (3), CHCI3 (И); толуол (К); петролейный эфир- ЕЮАс, 1 :2 (Л); CHCI3-MeOH-25% водн. NH3, 1:0.1:0.05 (M); CHCI3-MeOH, 10:1 (H); CHCI3-МеОН-СН3СООН, 200: 1 :0.3 (О), CHCI3-MeOH, 10 :0.6 (П); CHCI3-MeOH-СНзСООН, 1 : 0.16 : 0.05 (Р); 1 : 0.12 : 0.05 (С).

Обнаружение пятен на хроматограммах проводили действием хлора с последующим проявлением раствором бензидина [160], реактива Драгендорфа [160], раствора фосформолибденовая кислота - сульфат церия (IV) с последующим прогреванием [161] и с помощью УФ-лампы (254 нм). Колоночную хроматографию осуществляли на силикагеле Kieselgel 60 (0.040 - 0.063 mm, Merck). Спектры ЯМР1Н и 13С регистрировали на импульсном Фурье-спектрометре Bruker DPX-300 (Германия), в CDCI3, если не указано другое (внутренний стандарт SiMe4). Значения химических сдвигов (5) приведены в миллионных долях (м.д.), КССВ (J) в герцах (Гц). Масс-спектры получали на время-пролетном масс-спектрометре Bruker Ultraflex (Германия) методом лазерно-десорбционной ионизации с использованием 2,5-дигидроксибензойной или цианогидроксикоричной кислот в качестве матрицы. Для соединений 25а,с, 26а-с, 29Ь,с масс-спектры записаны на хромато-масс-спектрометре Agilent 1100 (Agilent Technologies) (США) методом химической ионизации при атмосферном давлении. ИК-спектры регистрировались на спектрофотометре Shimadzu IR-435 (Япония). Температуру -плавления определяли- на приборе «Boetius» (Германия). Соединения 26а-с, 29а-с, 32а-с, 34а,Ь, 36 разлагаются без плавления свыше 230°С. лЛлЛм12-Три-бензилоксикарбонил-1,12-диамино-4,9-диазадодекан (4b): Раствор 1.00 г (5.17ммоль) спермина (1) в 40 мл абсолютного метанола, охладили до -78°С (жидкий азот + изопропанол) и в течение 10 минут прикапывали охлажденный до 0°С этилтрифторацетат (0.7 мл, 5.7 ммоль). Реакционную смесь перемешивали, пока температура не поднялась до -10°С (30 минут) и добавили по каплям бензилоксикарбонилхлорид (6.64 мл, 46.5 ммоль) и Et3N (7.20 мл, 51.7 ммоль). Реакционную смесь выдерживали при 25 °С в течение 36 часов. (Rf0.85(Jl) для полностью защищенного полиамина ЗЬ). Метанол удаляли в вакууме, остаток растворяли в CH2CI2 (35 мл) и промывали 3% водным раствором HCl (3 х 10 мл), водой (2x10 мл), сушили над Na2S04, упаривали. Проводили деблокирование трифторацетильной защиты действием раствора NaOH (2.06 г, 51.7 ммоль) в метаноле (15 мл) при комнатной температуре в течение 36 часов. После удаления растворителя в вакууме, остаток растворяли в хлористом метилене (30 мл) и промывали водой (2 х 30 мл), сушили над Na2S04 и упаривали. После хроматографии на силикагеле (CHCI3-MeOH-25% водн. NH3, (25: 1 :0.1)) получили соединение 4Ь в виде масла желтоватого цвета (0.633 г, 30%). Rf 0.51 (Б). Масс-спектр, m/z (/отн(%)): 605.1 [М + Н]+ (100). Вычислено для C34H44N4O6: 604.326 [М]+. Спектр ЯМР 1Н. 1.30-1.55 (м, 4 Н, NCH2(CH2)2CH2N), 1.551.80 (м, 4 Н, 2 ЫСНгСНгСНгЫ), 2.50-2.76 (м, 2 Н, СНгЫНг), 2.93-3.45 (м, ЮН, 5 NCH2), 4.95-5.17 (м, 6 Н, 3 ChbPh), 7.20-7.40 (м, 15 Н, 3 Ph). Спектр ЯМР 13С: 25.55, 25.92, 28.70, 31.20, 37.99, 39.38, 44.36, 44.69, 46.76, 66.68, 67.21, 67.34, 128.03, 128.16, 128.64, 136.87, 137.04, 156.44, 156.63.

Л/4,Л/9,Л/12-Три-(трет-бутоксикарбонил)-Л/1-(2-нитрофенилсульфонил)-1,12-диамино-4,9-диазадодекан (5а): К охлажденному до 0°С раствору соединения 4а (0.431 г, 0.858 ммоль) в безводном CH2CI2 (5 мл) добавили молекулярные сита 4 А (1.0 г) Et3N (0.239 мл, 1.716 ммоль) и 2-нитробензолсульфонилхлорид (0.228 г, 1.02 ммоль). Реакционную смесь перемешивали 1 ч при 24°С. Молекулярные сита отфильтровали, промывали CH2CI2, растворители удаляли в вакууме. Остаток хроматографировали на колонке с силикагелем, элюируя смесью CHCI3-MeOH (50 : 1). Получили соединение 5а в виде кристаллизующегося масла (0.507 г, 88%). Rf 0.40 (Г). Масс-спектр, m/z (/отн(%)): 710.341 [М + Na]+ (100). Вычислено для CsiHssNsOkjS: 687.351 [М]+. Спектр ЯМР 1Н: 1.27 (уш. с, 31 Н, 3 С(СН3)3 и NCH2(CH2)2CH2N), 1.52-1.71 (м, 4 Н, 2 NCH2ch2ch2N), 2.92-3.11 (м, 8 Н, 4 NCH2), 3.11-3.30 (м, 4 Н, 2 NHChb), 7.597.71 (м, 2 Н), 7.71-8.89 (м, 1 Н) и 8.00-8.11 (м, 1 Н, С6Н4). Спектр ЯМР 13С: 25.96,

68

28.54, 28.59, 28.93, 37.91, 41.03, 43.78, 44.23, 46.82, 47.05, 79.16, 79.74, 80.02, 125.25, 130.93, 132.68, 133.51, 148.29, 156.17.

Л^.Л^.Л/^-Три-бензилоксикарбонил-^^г-нитрофенилсульфонил)-!,^-диамино-4,9-диазадодекан (5b): К охлажденному до 0°С раствору соединения 4а (0.918 г, 1.152 ммоль) в безводном CH2CI2 (7 мл) добавили Et3N (0.422 мл, 3.04 ммоль), а затем двумя равными порциями 2-нитробензолсульфонилхлорид (0.403 г, 1.82 ммоль). Реакционную смесь перемешивали 1ч при 24°С. Затем добавили 3 % HCl (10 мл) и перемешивали 3 ч. Реакционную смесь переносили в делительную воронку, промывали CH2CI2 (10 мл), органическую фазу промывали насыщенным раствором NaCI (2x15 мл), сушили над Na2S04, фильтровали и упаривали. Остаток хроматографировали на колонке с силикагелем, элюируя смесью CHCI3-MeOH (100:1). Получили соединение 5Ь в виде масла (1.091 г, 91%). Rf 0.40 (Н). Спектр ЯМР 1Н: 1.30-1.60 (м, 4 Н, NCH^ChbbCHzN), 1.60-1.75 (м, 4 Н, 2 NCH2CH2CH2N), 3.00-3.45 (м, 12 Н, 6 NCH2), 5.05-5.25 (м, 6 Н, 3 CI±>Ph) 7.207.40 (м, 15 Н, 3 Ph), 7.60-7.70 (м, 2 Н), 7.70-7.80 (м, 2 Н) и 8.03-8.13 (м, 1 Н, С6Н4). Спектр ЯМР 13С: 25.10, 25.65, 28.06, 28.51, 37.67, 40.76, 44.09, 46.53, 46.69, 66.47, 67.16, 67.19, 125.11, 127.85, 127.98, 128.45, 130.73, 132.54, 133.31, 136.57, 148.03, 155.99, 156.40, 156.62.

Метип-й-^^^^-три^трет-бутоксшарбонмгЦ-^-аммно-ЛЯ-диазадодец-1-ил]-М-(2-нитрофенилсульфонил)аминоацетат (6): К раствору соединения 5а (0.271 г, 0.394 ммоль) в безводном ДМФА (3 мл) последовательно добавили Cs2C03 (0.128 г, 0.394 ммоль) и метиловый эфир бромуксусной кислоты (0.149 мл, 1.58 ммоль). Реакционную смесь перемешивали Зч при 75°С. К реакционной массе добавляли 15 мл CH2CI2, промывали 5% лимонной килотой (3 х 20 мл), сушили над Na2S04, упаривали. Остаток хроматографировали на колонке с силикагелем, элюируя смесью CHCI3-MeOH (175:1). Получили соединение 6 в виде кристаллизующегося масла желтоватого цвета (0.270 г, 90%). Rf 0.51 (В). Спектр ЯМР 1Н: 1.26-1.46 (м, 4 Н, NCH2(CH2)2CH2N), 1.32 (с, 18 Н), 1.35 (с, 93СМе3) 1.46-1.60 (м, 2 Н), 1.60-1.75 (м, 2 Н, 2 NCH2CH2CH2N), 2.90-3.23 (м, 10 Н, 2 СЬЩВосЭСНг, NH(Boc)CH2), 3.23-3.37 (м, 2 Н, N(Nps)CH2CH2), 3-54 (с> 3 Н, ОСН3), 4.10 (с, 2 Н, 0С(0)СН2), 7.46-7.68 (м, 3 Н), 7.87-8.02 (м, 1 Н, С6Н4). Спектр ЯМР 13С: 25.87, 26.92, 28.46, 28.48, 37.63, 43.96, 44.49, 46.42, 46.75, 47.81, 52.27, 78.96, 79.59, 124.20, 130.86, 131.74, 133.13, 133.70, 148.04, 155.46, 156.07, 169.14.

Метил-Л/-[Л/4,А/9,М12-три-(шре/Т1-бутоксикарбонил)-12-амино-4,9-диазадодец-1-ил]аминоацетат (7): К раствору соединения 6 (0.178 г, 0.235 ммоль) в ДМФА (2 мл) при перемешивании добавили К2С03 (0.036 г, 0.258 ммоль), а затем PhSH (0.241 мл, 2.35 ммоль). Через 1 ч к реакционной массе добавляли 10 мл CH2CI2, промывали водой (15 мл), сушили над Na2S04, упаривали. После хроматографии на силикагеле CHCI3-MeOH-25% водн. NH3, (5 : 0.1 : 0.01) получили соединение 7 в виде кристаллизующегося масла (0.116 г, 86%). Rf 0.33 (П). Масс-спектр, m/z (/от„(%)): 575.456 [М+Н]+ (100). Вычислено для C28H54N4O8: 574.394 [М]+. Спектр ЯМР 1Н: 1.25-1.48 (м, 4 Н, NCH2(ch2hch2N), 1.34 (с, 9 Н), 1.35 (с, 9 Н), 1.36 (с, 93 СМе3) 1.48-1.70 (м, 4 Н, 2 NCH2CH2CH2N), 2.51 (т, 2 Н, J = 7.0, NHCH2CH2), 2.91-3.25 (м, 10 Н, 2 CHaNiBocJChh, NH(Boc)ch2), 3.31 (с, 2 Н, 0С(0)СН2), 3.63 (с, 3 Н, ОСН3). Спектр ЯМР 13С: 25.52, 25.93, 28.39, 28.93, 37.36, 43.75, 44.10, 44.82, 46.80, 50.73,51.66, 78.77, 79.20, 79.43, 155.51, 155.99, 172.79.

2-[Л/4,Л/9,Л/12-три-(трет-бутоксикарбонил)-12-амино-4,9-диазадодец-1-ил]аминоуксусной кислоты гидрохлорид (8): К раствору соединения 7 (0.100 г, 0.174 ммоль) в МеОН (Змл) при перемешивании добавили NaOH (0.031 г, 0.783 ммоль) в 0.5 мл воды. Через 2ч к реакционной массе добавляли 10 мл CH2CI2, промывали 3% водным раствором HCl (15 мл), сушили над Na2S04, упаривали. Получили соединение 8 в виде кристаллов белого цвета (105 мг, 100%). Kf0.33(P). Масс-спектр, m/z (10тн(%)): 561.476 [M-Cl]+ (100). Вычислено для C27H53CIN408: 561.386 [М - Cl]+. Спектр ЯМР 1Н (MD3OD - CDCI3, 1 : 5): 1.171.40 (уш. с, 31 Н, NCH^CbUbC^N, 3 СМе3) 1.40-1.60 (м, 2 Н), 1.70-1.93 (м, 2 Н, 2 NCH2CH2CH2N) 2.63-2.82 (м, 2 Н, CH2NH2CH2CO), 2.83-3.18 (м, ЮН, 2 СНЩВо^СНг, NH(Boc)CH2), 3.30 (с, 2 Н, 0С(0)СН2). Спектр ЯМР 13С: 24.21, 25.10, 27.59, 27.64, 28.16, 36.74, 42.78, 43.29, 43.67, 44.19, 45.79, 46.29, 49.07, 78.47, 79.18, 79.60, 155.73, 155.80, 155.85, 169.73. лЛл^-Ди^трет-бутоксикарбонилН ,12-бис(2-нитрофенилсульфониламино)-4,9-диазадодекан (12): К охлажденному до 0°С раствору соединения 11 (0.676 г, 1.68 ммоль) в безводном CH2CI2 (5 мл) последовательно добавили молекулярные сита 4 А (0.5 г), Et3N (1.0 мл, 6.72 ммоль) и 2-нитробензолсульфонилхлорид (0.893 г, 4.03 ммоль). Реакционную смесь перемешивали 5 ч при 24°С. Молекулярные сита отфильтровали, промывали СН2С12, растворители удаляли в вакууме. Остаток хроматографировали на колонке с силикагелем, элюируя СНС13 с последующим увеличением полярности до СНС13-МеОН (50 : 1). Получили соединение 12 в виде кристаллизующегося масла желтоватого цвета (1.01 г, 78%). f?f0.35(I~). Спектр ЯМР 1Н: 1.35 (уш. с, 22 Н, 2 С(СН3)3, СН^СНгЬСНг), 1.48-1.70 (м, 4 Н,

2 СН2СН2СН2), 2.86-3.10 (м, 8 Н, 4 NCH2) 3.10-3.38 (м, 4 Н, 2 NCH2), 7.50-7.75 (м, 4 Н), 7.95-8.05 (м, 2 Н) и 8.05-8.20 (м, 2 Н, 2 С6Н4). Спектр ЯМР 13С: 25.42, 25.83, 28.38, 28.86, 29.22, 40.66, 43.32, 44.25, 46.46, 46.90, 79.84, 124.47, 130.62, 132.41, 135.69, 148.02, 148.18, 155.42, 156.38.

5-Бромпентаноил)холестерин (14). К охлажденному до 0°С раствору холестерина (13) (2.18 г, 5.6 ммоль) в безводном CH2CI2 (15 мл) добавили Ру (3 мл), а затем раствор хлорангидрида бромвалериановой кислоты (2.25 г, 11.3 ммоль) в CH2CI2 (2.5 мл). Реакционную смесь перемешивали 1 ч при 24 °С, промывали 10%-ным водным раствором HCl (3x5 мл), водой (1x5 мл), сушили над Na2S04, растворитель упаривали. Остаток хроматографировали на колонке с силикагелем, элюируя вещество смесью CHCI3-MeOH (40:1). Получили соединение 14 в виде белых кристаллов (2.955 г, 96%). f?f0.48(A), т.пл. 112-114°С. Найдено (%): С, 70.30; Н, 10.00. С32Н53Вг02. Вычислено (%): С, 69.92; Н, 9.72. ИК-спектр, v/cm-1: 2830, 1736, 1460, 1370, 1240, 670. Спектр ЯМР 1Н: 0.68 (с,

3 Н, С(13)Ме), 0.79 (д, 3 H, J = 6.5, С(25)Ме), 0.80 (д, 3 H, J = 6.5, С(25)Ме), 0.86 (д, ЗН, J =6.5, С(20)Ме), 1.02 (с, 3 Н, С(Ю)Ме), 0.88-1.65 (м, 23 Н, протоны Chol, 0С(0)СН2(СН2)2), 1.68-2.00 (м, 7 Н, протоны Chol), 2.13-2.34 (м, 2 Н, Н2С(4)), 3.063.19 (м, 2 Н, 0С(0)СН2), 3.40 (т, 2 H, J = 6.7, СН2Вг), 4.34-4.49 (м, 1 Н, Н(3)), 5.275.34 (м, 1 Н, Н(6)).

Холест-5-ен-ЗЭ-ил)имидазол-1-карбоксилат (15): К раствору холестерина (13) (4.00 г, 10.35 ммоль) в безводном CH2CI2 (20 мл) добавили карбонилдиимидазол (1.678 г, 10.35 ммоль), триэтиламин (2 мл, 3.74 ммоль) и кипятили 16 ч при перемешивании. Реакционную смесь промывали 10%-ным водным раствором HCl (3x5 мл), водой (1x5 мл), сушили над Na2S04, растворитель упаривали. Получили соединение 15 в виде белых кристаллов (4 904 г, 99%). Rf 0.7 (Б), т.пл. 124-126°С. Найдено (%): С, 76.26; Н, 10.40; N, 5.56.

2 C35H61N03xH20. Вычислено (%): С, 76.03; Н, 10.08; N, 5.72. ИК-спектр, v/cm"1: 2840, 1730, 1640, 1520, 1460, 1380. Спектр ЯМР 1Н: 0.61 (с, 3 Н, С(13)Ме), 0.79 (д,

3 H, J = 6.5, С(25)Ме), 0.80 (д, 3 H, J = 6.5, С(25)Ме), 0.84 (д, 3 H, J = 6.5, С(20)Ме), 0.99 (с, 3 Н, С(Ю)Ме), 0.90-1.58 (м, 19 Н, протоны Chol), 1.58-2.02 (м, 7 Н, протоны

Chol), 2.38-2.47 (м, 2 H, Н2С(4)), 4.69-4.83 (м, 1 Н, Н(3)), 5.34-5.40 (м, 1 Н, Н(6)), 7.00, 7.36, 8.09 (все с, по 1 Н Im). Спектр ЯМР 13С: 11.88, 18.88, 19.35, 21.21, 22.63, 22.87, 23.98, 24.44, 27.81, 28.19, 28.38, 31.98, 35.96, 36.33, 36.71, 36.92, 38.03, 39.67, 39.83, 42.47, 50.11, 56.27, 56.81, 79.20, 117.44, 123.95, 130.05, 137.14, 138.74, 148.05.

Холест-5-ен-33-ил)-М-(4-гидроксибутил)карбамат (16а): К раствору соединения 15 (1.00 г, 2.08 ммоль) в безводном CH2CI2 (10 мл) добавили 4-амино-1-бутанол (0.287 г, 2.78 ммоль) и кипятили 18 ч при перемешивании. Реакционную смесь промывали 3%-ным водным раствором HCl (1*8 мл), водой (5*5 мл), органический растворитель упаривали. Остаток хроматографировали на колонке с силикагелем, элюируя смесью CHCI3-MeOH (30 : 1). Получили соединение 16а в виде белых кристаллов (0.895 г, 87%). Rf0.45(fl), т.пл. 154-156°С. Масс-спектр, m/z (/отн(%)): 524.314 [М + Na]+ (100). Вычислено для Сз2Н56МОз: 501.418 [М]+. Спектр ЯМР 1Н: 0.61 (с, 3 Н, С(13)Ме), 0.79 (д, 3 Н, J = 6.5, С(25)Ме), 0.80 (д, 3 Н, J = 6.5, С(25)Ме), 0.85 (д, 3 Н, J = 6.5, С(20)Ме), 0.94 (с, 3 Н, С(Ю)Ме), 0.98-1.57 (м, 23 Н, протоны Chol, NHCH^Chbb), 1.68-2.02 (м, 7 Н, протоны Chol), 2.14-2.38 (м, 2 Н, Н2С(4)), 3.05-3.20 (м, 2 Н, CH2N), 3.59 (т, 2 Н, J = 5.9, СН2ОН), 4.36-4.48 (м, 1 Н, Н(3)), 4.48-4.62 (м, 1 Н, NH), 5.27-5.35 (м, 1 Н, Н(6)). Спектр ЯМР 13С: 12.10, 18.99, 19.56, 21.14, 22.79, 23.07, 23.93, 24.38, 26.54, 28.12, 28.26, 29.64, 31.96, 35.91, 36.27, 36.65, 37.06, 38.65, 39.61, 39.82, 40.70, 42.40, 49.94, 56.21, 56.77, 62.10, 74.57, 122.63, 139.89, 156.72.

Холест-5-ен-Зр-ил)-№(6-гидроксигексил)карбамат (16Ь): Получали как соединение 16а исходя из соединения 15 (1.00 г, 2.08 ммоль), 6-амино-1-гексанола (0.366 г, 3.12 ммоль). После хроматографии на силикагеле CHCI3-МеОН (50 : 1), получили соединение 16Ь в виде белых кристаллов (0.992 г, 90%). Rf 0.48 (Д), т.пл. 186-188°С. Найдено (%): С 76.96; Н 11.22; N 2.57. C35H6iN03. Вычислено (%): С, 77.29; Н, 11.30; N, 2.58. Спектр ЯМР 1Н: 0.61 (с, 3 Н, С(13)Ме), 0.79 (д, 3 Н, J = 6.5, С(25)Ме), 0.80 (д, 3 Н, J = 6.5, С(25)Ме), 0.85 (д, 3 Н, J = 6.5, С(20)Ме), 0.94 (с, 3 Н, С(Ю)Ме), 0.98-1.57 (м, 27 Н, протоны Chol, NHCH2(CH2)4), 1.68-2.00 (м, 7 Н, протоны Chol), 2.13-2.35 (м, 2 Н, Н2С(4)), 3.03-3.16 (м, 2 Н, CH2N), 3.57 (т, 2 Н, J = 6.4, СН2ОН), 4.34-4.49 (м, 1 Н, Н(3)), 5.27-5.34 (м, 1 Н, Н(6)). Спектр ЯМР 13С: 12.03, 18.89, 19.51, 21.21, 22.73, 22.99, 24.00, 24.46, 25.48, 26.57, 28.19, 28.35, 28.41, 30.19 , 32.06, 35.97, 36.36, 36.73, 37.17, 38.76, 39.69,' 39.91, 40.87, 42.49, 50.18, 56.30, 56.86, 62.90, 74.39, 122.64, 140.03, 156.40.

Холест-5-ен-ЗЭ-ил)-Л^-(4-бромбутил)карбамат (17а): К охлажденному до О °С раствору соединения 16а (0.843 г, 1.68ммоль) в безводном CH2CI2 (10 мл) добавили Ph3P (0.793 г, 3.02 ммоль), а затем порциями СВг4 (1.0 г, 3.02 ммоль) и перемешивали 1 ч при 24°С. К реакционной смеси добавили 5 мл МеОН, растворитель упарили. Остаток хроматографировали на колонке с силикагелем, элюируя CHCI3. Получили соединение 17а в виде белых кристаллов (0.400г, 84%). Rf 0.8 (Д), т.пл. 92-94°С. Найдено (%): С, 68.10; Н, 9.90; N, 2.48. C32H54BrN02. Вычислено (%): С, 68.06; Н, 9.64; N, 2.48. Спектр ЯМР 1Н: 0.61 (с, 3 Н, С(13)Ме), 0.79 (д, 3 Н, J = 6.5, С(25)Ме), 0.80 (д, 3 Н, J = 6.5, С(25)Ме), 0.85 (д, 3 Н, J = 6.5, С(20)Ме), 0.94 (с, 3 Н, С(Ю)Ме), 0.98-1.57 (м, 23 Н, протоны Chol, NHCH2(CH2)2), 1.70-2.00 (м, 7 Н, протоны Chol), 2.15-2.38 (м, 2 Н, Н2С(4)), 3.05-3.16 (м, 2 Н, CH2N), 3.35 (т, 2 Н, J = 6.5, СН2Вг), 4.36-4.48 (м, 1 Н, Н-3), 4.48-4.62 (м, 1 Н, NH), 5.27-5.34 (м, 1 Н, Н-6). Спектр ЯМР 13С: 12.17, 18.74, 19.37, 21.20, 22.87, 23.14, 24.00, 24.44, 28.18, 28.33, 28.90, 30.00, 32.02, 33.43, 35.97, 36.33, 36.71, 37.12, 38.72, 39.67, 39.88, 40.12, 42.46, 50.02, 56.27, 56.83, 74.48, 122.69, 139.93, 156.34.

Холест-5-ен-ЗЭ-ил)-Л/-(6-бромгексил)карбамат (17Ь): Получали как соединение 17а, исходя из соединения 16Ь (0.585 г, 1.1 ммоль), Ph3P (0.579 г, 2.2 ммоль) и СВг4 (0.945 г, 2.89 ммоль). Получили соединение 17Ь в виде белых кристаллов (0.548 г, 84%). f?f0.85(fl), т.пл. 106-108 °С. Найдено (%): С, 69.24; Н, 10.15; N, 2.31. C35H6oBrN02. Вычислено (%): С, 69.28; Н, 9.97; N, 2.31. Спектр ЯМР 1Н: 0.61 (с, 3 Н, С(13)Ме), 0.79 (д, 3 Н, J = 6.5, С(25)Ме), 0.80 (д, 3 Н, J = 6.5, С(25)Ме), 0.85 (д, 3 Н, J = 6.5, С(20)Ме), 0.94 (с, 3 Н, С(Ю)Ме), 0.98-1.57 (м, 27 Н, протоны Chol, NHCH2(CH2)4), 1.68-1.98 (м, 7 Н, протоны'Chol), 2.12-2.34 (м, 2 Н, Н2С(4)), 3.03-3.15 (м, 2 Н, CH2N), 3.34 (т, 2 Н, J = 6.8, СН2Вг), 4.35-4.48 (м, 1 Н, Н(3)), 4.48-4.62 (м, 1 Н, NH), 5.28-5.33 (м, 1 Н, Н(6)). Спектр ЯМР 13С: 12.04, 18.90; 19.52, 21.23, 22.74, 23.00, 24.01, 24.47, 26.08, 27.99, 28.19, 28.37, 28.42, 30.08, 32.07, 32.81, 33.91, 35.98, 36.37, 36.75, 37.18, 38.76, 39.70, 39.92, 40.94, 42.50, 50.20, 56.32, 56.87, 74.40, 122.66, 140.03, 156.35.

Зр-[(2-Бромэтокси)метокси]холест-5-ен (20а): К раствору метилтиометилового эфира (18) (0.115 г, 0.26 ммоль) в безводном дихлорэтане (Змл) в атмосфере аргона добавили 2,6-лутидин (0.120 мл, 1.03 ммоль), 2-бромэтанол (0.073 мл, 1.03 ммоль) и через 5 мин. бром (0.026 мл, 0.51 ммоль). Через 20 мин к реакционной массе прилили дихлорэтан (10 мл), промывали водой (3x10 мл), сушили над Na2S04, упаривали. Остаток хроматографировали на колонке с силикагелем, элюируя толуолом. Получили соединение 20а в виде кристаллизующегося светло-желтого масла (0.074 г, 55%). /?f 0.40 (К). Масс-спектр, m/z (/отн(%)): 562.2 [М]+. Вычислено для СзоН51Вг02: 562.274 [М]+. Спектр ЯМР 1Н: 0.60 (с, 3 Н, С(13)Ме), 0.79 (д, 3 Н, J = 6.5, С(25)Ме), 0.80 (д, 3 Н, J = 6.5, С(25)Ме), 0.84 (д, 3 Н, J =6.5, С(20)Ме), 0.93(с, 3 Н, С(Ю)Ме), 0.93-1.63 (м, 21 Н, протоны Chol), 1.65-2.05 (м, 5 Н, протоны Chol), 2.10-2.35 (м, 2 Н, Н2С(4)), 3.33-3.48 (м, 1 Н, Н(3)), 3.43 (т, 2 Н, J = 6.1, СН2СН2О), 3.81 (т, 2 Н, J = 6.1, СН2Вг), 4.72 (с, 2 Н, 0СН20), 5.23-5.33 (м, 1 Н, Н(6)). Спектр ЯМР 13С: 11.82, 18.68, 19.32, 21.00, 22.54, 22.81, 23.79, 24.24, 27.96, 28.20, 28.78, 30.82, 31.80, 31.87, 35.75, 36.13, 36.65, 37.13, 39.37, 39.46, 39.69, 42.24, 50.05, 56.07, 56.67, 67.72, 77.06, 93.43, 121.84, 140.44.

Зр-[(4-Хлорбутокси)метокси]холест-5-ен (20Ь): Получали как соединение 20а исходя из 18 (0.400 г, 0.90 ммоль), дихлорэтана (9 мл), 2,6-лутидина (0.313 мл, 2.69 ммоль), 4-хлорбутан-1-ола (1.22 мл, 8.95 ммоль), брома (0.091мл,

I.79 ммоль). Получили соединение 20Ь в виде кристаллизующегося светло-желтого масла (0.340 г, 75%). Rf0.42(K). Масс-спектр, m/z (/0Тн(%)): 506.861 [М]+ (100). Вычислено для C32H55CI02: 506.389 [М]+. Спектр ЯМР 1Н: 0.67 (с, 3 Н, С(13)Ме), 0.86 (д, 3 Н, J = 6.5, С(25)Ме), 0.87 (д, 3 Н, J = 6.5, С(25)Ме), 0.91 (д, 3 Н, J =6.5, С(20)Ме), 1.00 (с, 3 Н, С(Ю)Ме), 0.93-1.63 (м, 23 Н, протоны Chol, CH2CH2CH2CH2CI), 1.65-2.05 (м, 7 Н, протоны Chol, (CH2)2CH2CH2CI), 2.15-2.43 (м, 2 Н, Н2С(4)), 3.34-3.50 (м, 1 Н, Н(3)), 3.57 (т, 2 Н, J = 6.1, СНгСНгО), 3.58 (т, 2 Н, 6.1, J = 6.5, CH2CI), 4.73 (с, 2 Н, 0СН20), 5.30-5.40 (м, 1 Н, Н(6)). Спектр ЯМР 13С:

II.84, 18.69, 19.35, 21.03, 22.56, 22.82, 23.80, 24.27, 27.06, 28.01, 28.23, 28.87, 29.49, 31.85, 31.91, 35.78, 36.16, 36.72, 37.21, 39.49, 39.52, 39.74, 42.29, 44.91, 50.11, 56.10, 56.72, 66.81, 76.88, 93.40, 121.78, 140.682.

ЗР-[(6-Хлоргексилокси)метокси]холест-5-ен (20с): Получали как соединение 20а исходя из 18 (1.00 г, 2.25 ммоль), дихлорэтана (14 мл), 2,6-лутидина (0.786 мл, 6.75 ммоль), 6-хлоргексан-1-ола (1.50 мл, 11.25 ммоль), брома (0.231 мл, 4.50 ммоль). Получили соединение 20с в виде бесцветного масла 0.800 г (66%). f?f0.44(K). Масс-спектр, m/z (/0™(%)): 534.499 [М]+ (100). Вычислено для C34H59CI02: 534. 420 [М]+. Спектр ЯМР 1Н: 0.67 (с, 3 Н, С(13)Ме), 0.86 (д, 3 Н, J = 6.5, С(25)Ме), 0.87 (д, 3 Н, J = 6.5, С(25)Ме), 0.91 (д, 3 Н, J = 6.5, С(20)Ме), 1.00 (с, 3 Н, С(Ю)Ме), 0.93-1.63 (м, 27 Н, протоны Chol, (CH2)3CH2CH2CI), 1.65-2.05 (м, 7 Н, протоны Chol, (CH2)4CH2CH2CI), 2.15-2.43 (м, 2 Н, Н2С(4)), 3.54

3.50 (м, 1 Н, Н(3)), 3.54 (т, 2 Н, J = 6.4, СНгСНгО), 3.55 (т, 2 Н, 6.1, J = 6.7, CH2CI), 4.73 (с, 2 Н, 0СН20), 5.31-5.40 (м, 1 Н, Н(6)). Спектр ЯМР 13С: 12.29, 19.14, 19.81, 21.48, 23.01, 23.27, 24.25, 24.72, 26.00, 27.14, 28.45, 28.67, 29.31, 29.98, 32.30, 32.36, 33.00, 36 22, 36.61, 37.17, 37.67, 39.94, 39.97, 40.18, 42.74, 45.49, 50.56, 56.55, 57.17, 68.01, 77.21, 93.84, 122.16, 141.18.

3-[3-(Холест-5-ен-Зр-илоксикарбонил)пропил]дитиопропионовая кислота (22Ь). К раствору холестерина (13) (1.0 г, 2.59 ммоль) в безводном этилацетате (40 мл) в атмосфере аргона добавили дитиодипропионовую кислоту (1.09 г, 5.17 ммоль) и при 0°С добавили DCC (1.067 мг, 5.17 ммоль), а затем DMAP (0.158 мл, 1.29 ммоль) и Et3N (0.54 мл, 3.88 ммоль). Через 12 ч реакционную массу фильтровали, промывали 3 % раствором соляной кислоты (3 х 30 мл), сушили над Na2S04, упаривали. После хроматографии на силикагеле (CHCI3-MeOH-CH3COOH, (25 : 0.1 : 0.03)) получили соединение 22Ь в виде кристаллов белого цвета (0.681 г, 45%). Rf 0.40 (О). Масс-спектр, m/z (/отн(%)): 601.217 [М + Na]+ (100). Вычислено для C33H5404S2: 578.346 [М]+. Спектр ЯМР 1Н: 0.67 (с, 3 Н, С(13)Ме), 0.85 (д, 3 Н, J = 6.6, С(25)Ме), 0.86 (д, 3 Н, J = 6.6, С(25)Ме), 0.91 (д, 3 Н, J = 6.5, С(20)Ме), 1.01 (с, ЗН, С(Ю)Ме), 0.95-1.70 (м, 21 Н, протоны Chol), 1.75-2.10 (м, 5 Н, протоны Chol), 2.26-2.40 (м, 2 Н, Н2С(4)), 2.70 (т, 2 Н, J =7.1, ChbCOOChol), 2.79 (т, 2 Н, J = 7.5, СНзСООН), 2.92 (т, 2 Н, J = 7.1, CH2S), 2.92 (т, 3 Н, J = 7.5, CH2S), 4.52-4.78 (м, 1 Н, Н(3)), 5.30-5.45 (м, 1 Н, Н(6)). Спектр ЯМР 13С: 11.83, 18.69, 19.28, 21.00, 22.54, 22.80, 23.81, 24.26, 27.73, 27.98, 28.20, 31.82, 31.87, 32.70, 33.31, 33.86, 34.42, 35.76, 36.16, 36.54, 36.92, 38.04, 39.49, 39.69, 49.98, 56.11, 56.65, 74.54, 122.74, 139.45, 171.08, 177.59.

Холест-5-ен-ЗР-ил)-Л/-{2-[(2-аминоэтил)дитио]этил}карбамат (23): К суспензии цистамина (1.98 г, 13 ммоль), в безводной смеси растворителей CH2CI2-Et3N-flHOKcaH (30:10:10 мл) добавили соединение 15 (0.782 г, 1,63 ммоль) и перемешивали при кипении в течение 35 ч. Реакционную массу фильтровали, промывали 3 % водным раствором HCl (3 х 30 мл), сушили над Na2S04, фильтровали, упаривали. После хроматографии на силикагеле (CHCI3-MeOH, (10 : 1)) получили соединение 23 в виде кристаллов светло коричневого цвета (0.580 г, 59%). Kf0.30(H). Масс-спектр, m/z (/от „(%)): 565.456 [М - С1]+ (100). Вычислено для C32H57CIN202S2: 601.390 [М]+. Спектр ЯМР 1Н: 0.61 (с, 3 Н, С(13)Ме), 0.79 (д, 3 Н, J = 6.6, С(25)Ме), 0.80 (д, 3 Н, J = 6.6, С(25)Ме), 0.85 (д, 3 Н, J =6.2, С(20)Ме), 0.94 (с, 3 Н, С(Ю)Ме), 0.87-1.62 (м, 21 Н, протоны Chol), 1.65

2.07 (м, 5 Н, протоны Chol), 2.17-2.40 (м, 2 Н, Н2С(4)), 2.70-2.90 (м, 2 Н, CHaNHa), 2.90-3.17 (м, 2 Н, ChbNHCOOChol), 3.17-3.60 (м, 4 Н, 2 CHzS), 2.79 (т, 2 Н, J =7.5, CHzCOOH), 2.92 (т, 2 Н, J = 7.1, CH2S), 2.92 (т, 3 Н, J = 7.5, CH2S), 4.20-4.58 (м, 1 Н, Н(3)), 5.22-5.40 (м, 1 Н, Н(6)), 5.43-5.70 (м, 1 Н, NHCO), 7.00-7.50 (м, 3 Н, NH3). Спектр ЯМР 13С: 11.98, 18.84, 19.49, 21.19, 22.65, 22.90, 24.06, 24.41, 28.09, 28.35, 32.00, 35.81, 35.95, 36.34, 36.68, 37.14, 38.21, 38.75, 39.29, 39.63, 39.89, 50.11, 56.39, 56.81, 74.69, 122.65, 139.89, 156.44.

Л/9,М14,Л/17-Три-(трет-бутоксикарбонил)-Л/5-(2-нитрофенилсульфонил)-1-(холест-5-ен-ЗР-илоксикарбонил)-17-амино-5,9,14-триазагептадекан (24а): К раствору соединения 5а (0.175 г, 0.254 ммоль) в безводном ДМФА (Змл) последовательно добавили Cs2C03 (0.083 г, 0.254 ммоль) и бромид 14 (0.168 г, 0.306 ммоль). Реакционную смесь перемешивали 1 ч при 60°С. Осадок отфильтровывали через Cellte® 545, промывали CH2CI2. После удаления растворителей в вакууме остаток хроматографировали на колонке с силикагелем, элюируя смесью CHCI3-MeOH (100:1). Получили соединение 24а в виде кристаллизующегося масла (0.253 г, 86%). Rf 0.38 (В). Масс-спектр, m/z (/0™(%)): 1178.741 [М + Na]+ (100). Вычислено для CesH^NsO^S: 1155.748 [М]+. Спектр ЯМР 1Н: 0.61 (с, 3 Н, С(13)Ме), 0.79 (д, 3 Н, J = 6.5, С(25)Ме), 0.80 (д, 3 Н, J = 6.5, С(25)Ме), 0.83 (д, 3 Н, J = 6.5, С(20)Ме), 0.94 (с, 3 Н, С(Ю)Ме), 0.90-2.00 (м, 38 Н, протоны Chol, 2 СН2(СН2)2СН2, 2 NCH2ch2ch2N), 1.36 (уш. с, 18 Н) и 1.39 (уш. с, 9 Н, ЗС(СНз)з), 2.11-2.33 (м, 4 Н, Н2С(4), 0С(0)СН2), 2.95-3.12 (м, 8 Н, 4 NCH2), 3.12-3.30 (м, 6 Н, CHzNH, 2 NCH2), 4.43-4.59 (м, 1 Н, Н(3)), 5.01-5.26 (м, 1 Н, NH), 5.26-5.34 (м, 1 Н, Н(6)), 7.50-7.59 (м, 1 Н), 7.59-7.70 (м, 2 Н) и 7.87-8.00 (м, 1 Н, С6Н4). Спектр ЯМР 13С: 11.94, 18.80, 19.39, 21.11, 22.03, 22.64, 22.89, 23.90, 24.36, 25.61, 25.79, 27.87, 28.07, 28.29, 28.53, 31.94, 31.98, 34.00, 35.86, 36.26, 36.68, 37.07, 37.67, 38.22, 39.60, 39.82, 42.40, 43.94, 44.54, 45.19, 46.77, 47.07, 50.12, 56.23, 56.78, 74.02, 79.58, 122.73, 124.24, 130.80, 131.73, 133.50, 133.58 139.71, 148.13, 155.50, 156.10, 172.51.

Л/9,Л/14,Л/17-Три-(шреш-бутоксикарбонил)-Л/5-(2-нитрофенилсульфонил)-Л/1-(холест-5-ен-Зр-илоксикарбонил)-1,17-диамино-5,9,14-триазагептадекан (24Ь): Получали как соединение 24а исходя из соединения 5а (0.098 г, 0.142 ммоль), Cs2C03 (0.046 г, 0.142 ммоль) и бромида 17а (0.096 г, 0.170 ммоль). Получили соединение 24Ь в виде кристаллизующегося масла (0.157 г, 94%). /?f 0.4 (В). Масс-спектр, m/z (/отн(%)): 1193.762 [М + Na]+ (100). Вычислено для

CeaHioeNeOiaS: 1170.759 [M]+. Спектр ЯМР 1Н: 0.61 (с, 3 Н, С(13)Ме), 0.79 (д, 3 Н, J = 6.5, С(25)Ме), 0.80 (д, 3 Н, J = 6.5, С(25)Ме), 0.84 (д, 3 Н, J = 6.5, С(20)Ме), 0.94 (с, ЗН, С(Ю)Ме), 0.90-2.00 (м, 38 Н, протоны Chol, 2 СН2(СН2)2СН2, 2 NCH2CH2CH2N), 1.36 (уш. с, 18 Н) и 1.39 (уш. с, 9 Н, 3 С(СН3)з), 2.11-2.33 (м, 2 Н, Н2С(4)), 2.91-3.12 (м, 10 Н, CHzNH, 4 NCH2), 3.12-3.30 (м, 6 Н, СЩМН, 2 NCH2), 4.32-4.47 (м, 1 Н, Н(3)), 4.55-4.96 (м, 1 Н, NH), 4.96-5.25 (м, 1 Н, NH), 5.25-5.33 (м, 1 Н, Н(6)), 7.50-7.59 (м, 1 Н), 7.59-7.70 (м, 2 Н) и 7.87-8.00 (м, 1 Н, С6Н4). Спектр ЯМР 13С: 11.97, 18.84, 19.44, 21.17, 22.67, 22.92, 23.95, 24.40, 25.61, 26.01, 27.20, 27.57, 28.11, 28.30, 28.58, 32.01, 35.90, 36.31, 36.54, 36.69, 37.13, 37.80, 38.70, 39.63, 39.87, 40.36, 42.44, 44.16, 44.70, 45.57, 46.70, 50.15, 56.27, 56.82, 74.36, 79.66, 122.56, 124.27, 130.83, 131.77, 133.48, 133.61, 139.98, 148.18, 155.56, 156.16, 156.35.

Л/11,Л/16,Л/19-Три-(трет-бутоксикарбонил)-Л/7-(2-нитрофенилсульфонил)-Л/1-(холест-5-ен-Зр-илоксикарбонил)-1,1 Э-диамино-7,11,16-триазанонадекан (24с): Получали как соединение 24а исходя из соединения 5а (0.203 г, 0.302 ммоль), Cs2C03 (0.098 г, 0.302 ммоль) и бромида 17Ь (0.215 г, 0.362 ммоль). Получили соединение 24с в виде кристаллизующегося масла (0.382 г, 88%). Rf 0.45 (В). Масс-спектр, m/z(/0TH(%)): 1221.424 [М + Na]+(100). Вычислено для C65HiioN6012S: 1198.790 [М]+. Спектр ЯМР 1Н: 0.61 (с, 3 Н, С(13)Ме), 0.79 (д, 3 Н, J = 6.5, С(25)Ме), 0.80 (д, 3 Н, J = 6.5, С(25)Ме), 0.84 (д, 3 Н, J =6.5, С(20)Ме), 0.94 (с, ЗН, С(Ю)Ме), 0.90-2.00 (м, 42 Н, протоны Chol, NHCH^ChbbC^N, 2 NCHzChbC^N, СН2(СН2)4СН2), 1.37 (уш. с, 18 Н) и 1.39 (уш. с, 9 Н, 3 С(СН3)з), 2.11-2.35 (м, 2 Н, Н2С(4)), 2.92-3.13 (м, ЮН, ChhNH, 4 NCH2), 3.13-3.33 (м, 6 Н, ChbNH, 2 NCH2), 4.33-4.47 (м, 1 Н, Н(3)), 4.50-4.85 (м, 1 Н, NH), 4.96-5.25 (м, 1 Н, NH), 5.26-5.35 (м, 1 Н, Н(6)), 7.51-7.59 (м, 1 Н), 7.59-7.70 (м, 2 Н) и 7.87-8.00 (м, 1 Н, С6Н4). Спектр ЯМР 13С: 12.00, 18.87, 19.48, 21.20, 22.70, 23.00, 23.98, 24.43, 25.91, 26.31, 26.37, 27.60, 28.09, 28.14, 28.36, 28.60, 30.30, 32.05, 35.93, 36.34, 36.72, 37.16, 37.81, 38.74, 39.66, 39.90, 40.88, 42.47, 44.13, 44.67, 45.28, 46.82, 47.48, 50.19, 56.30, 56.85, 74.36, 79.65, 122.57, 124.29, 130.87, 131.73, 133.57, 133.68, 140.03, 148.20, 155.59, 156.18, 156.33. a,Nu,Nn-Tpw-(mpem-6yTOKCWKap6oHMn)^-{xonecT-5-eH-3ß-илоксикарбонил)-17-амино-5,9,14-триазагептадекан (25а): К раствору соединения 24а (0.150 г, 0.130 ммоль) в ДМФА (3 мл) при перемешивании добавили К2С03 (0.072 г, 0.520 ммоль), а затем PhSH (0.13 мл, 1.310 ммоль).

Через 1 ч реакционную массу фильтровали через Celite® 545, промывали осадок МеОН, растворитель упаривали в вакууме. После хроматографии на силикагеле CHCI3-MeOH-25% водн. NH3, (25:1:0.1) получили соединение 25а в виде желтоватого кристаллизующегося масла (0.079 г, 83%). Rf 0.33 (Е). Масс-спектр, m/z (/0Тн(%)): 971.7 [М + Н]+ (100). Вычислено для СбгНюг^Ов: 970.7 [М]+. Спектр ЯМР 1Н: 0.61 (с, 3 Н, С(13)Ме), 0.79 (д, 3 Н, J = 6.5, С(25)Ме), 0.80 (д, 3 Н, J = 6.5, С(25)Ме), 0.84 (д, 3 Н, J = 6.5, С(20)Ме), 0.94 (с, 3 Н, С(Ю)Ме), 0.90-2.00 (м, 38 Н, протоны Chol, 2 СН2(СН2)2СН2, 2 NCH2CH2CH2N), 1.36 (уш. с, 18 Н) и 1.39 (уш. с, 9 Н, 3 С(СН3)3), 2.15-2.33 (м, 4 Н, 0С(0)СН2, Н2С(4)), 2.60-2.87 (м, 4 Н, CthNHChh). 2.96-3.35 (м, ЮН, СНгЫН, 4 NCH2), 4.44-4.59 (м, 1 Н, Н(3)), 5.01-5.26 (м, 1 Н, NHBoc), 5.26-5.33 (м, 1 Н, Н(6)). Спектр ЯМР 13С: 11.94, 18.81, 19.40, 21.12, 22.29, 22.66, 22.91, 23.91, 24.37, 25.82, 27.88, 28.09, 28.31, 28.54, 31.94, 31.99, 34.02,

35.87, 36.27, 36.68, 37.07, 37.53, 38.22, 39.60, 39.82, 42.39, 43.42, 43.99, 44.35, 45.45, 46.88, 47.25, 50.12, 56.22, 56.78, 74.12, 79.70, 122.74, 139.71, 156.14, 172.53.

Л/9,Л/14,Л/17-Три-(трет-бутоксикарбонил)-Л/1-(холест-5-ен-Зр-илоксикарбонил)-1,17-диамино-5,9,14-триазагептадекан (25Ь): Получали как соединение 25а исходя из 24Ь (0.130 г, 0.110 ммоль), К2С03 (0.050 г, 0.360 ммоль) и PhSH (0.1мл, 1.10 ммоль). Получили соединение 25Ь в виде желтоватого аморфного вещества (0.107 г, 99 %). Rf 0.35 (Е). Масс-спектр, m/z (/отн(%)): 986.796 [М + Н]+ (100). Вычислено для C57Hio3N508: 985.781 [М]+. Спектр ЯМР 1Н: 0.61 (с, 3 Н, С(13)Ме), 0.79 (д, 3 Н, J = 6.5, С(25)Ме), 0.80 (д, 3 Н, J = 6.5, С(25)Ме), 0.84 (д, ЗН, J = 6.5, С(20)Ме), 0.94 (с, 3 Н, С(Ю)Ме), 0.90-2.00 (м, 38 Н, протоны Chol, 2 СН2(СНг)2СН2, 2 МСН2СНгСН2Ы), 1.36 (уш. с, 18 Н, 2 С(СН3)3), 1.39 (уш. с, 9 Н, С(СН3)3), 2.11-2.33 (м, 2 Н, Н2С(4)), 2.53-2.82 (м, 4 Н, CHaNHChb), 2.95-3.33 (м, 12 Н, 2 CÜNH, 4 NCH2), 4.32-4.47 (м, 1 Н, Н(3)), 4.55-4.96 (м, 1 Н, NH), 4.96-5.25 (м, 1 Н, NH), 5.25-5.33 (м, 1 Н, Н(6)). Спектр ЯМР 13С: 11.92, 18.77, 19.40, 21.10, 22.62,

22.88, 23.88, 24.34, 26.01, 27.40, 28.05, 28.25, 28.28, 28.51, 31.93, 35.84, 36.23, 36.61, 37.06, 37.58, 38.66, 39.57, 39.79, 40.29, 42.36, 43.73, 44.21, 46.56, 46.84, 50.07, 56.19, 56.75, 74.21, 79.67, 122.46, 139.94, 156.15, 156.41.

Л/11,Л/16,Л/19-Три-(трет-бутоксикарбонил)-Л/1-(холест-5-ен-Зр-илоксикарбонил)-1,19-диамино-7,11,16-триазанонадекан (25с): Получали как соединение 25а исходя из 24с (0.106 г, 0.088 ммоль), К2С03 (0.053 г, 0.380 ммоль) и PhSH (0.1мл, 1.10 ммоль). Получили соединение 25с в виде желтоватого аморфного вещества (0.079 г, 89 %). f?f 0.37 (Е). Масс-спектр, m/z (/отн(%)): 1014.7

M + Hf (100). Вычислено для C59Hi07N5O8: 1013.8 [Mf. Спектр ЯМР 1Н: 0 61 (с, 3 Н, С(13)Ме), 0.79 (д, 3 Н, J = 6.5, С(25)Ме), 0.80 (д, 3 Н, J = 6.5, С(25)Ме), 0.84 (д, ЗН, J =6.5, С(20)Ме), 0.94 (с, 3 Н, С(Ю)Ме), 0.90-2.00 (м, 42 Н, протоны Chol, NHCH2(ch2)2ch2N, 2 NCH2CH2CH2N, СН2(СН2)4сн2), 1.37 (уш. с, 18 Н) и 1.39 (уш. с, 9 Н, 3 С(СНз)з), 2.11-2.35 (м, 2 Н, Н2С(4)), 2.47-2.76 (м, 4 Н, CÜ-NHChb), 2.933.30 (м, 12 Н, 2 СНгЫН, 4 NCH2), 4.32-4.52 (м, 1 Н, Н(3», 4.50-4.85 (м, 1 Н, NH), 4.96-5.25 (м, 1 Н, NH), 5.26-5.35 (м, 1 Н, Н(6)). Спектр ЯМР 13С: 11.95, 18.81, 19.43, 21.13, 22.66, 22.92, 23.92, 24.38, 25.59, 25.96, 26.31, 26.37, 27.60, 28.09, 28.29, 28.32, 28.54, 29.93, 31.97, 35.89, 36.27, 36.65, 37.10, 37.55, 38.69, 39.60, 39.83, 40.79, 42.40, 43.73, 44.20, 44.30, 45.83, 45.90, 46.47, 46.60, 46.84, 47.08, 50.10, 56.22, 56.78, 74.22, 79.56, 122.50, 139.97, 156.13, 156.18, 156.33.

17-Амино-1-(холест-5-ен-Зр-илоксикарбонил)-5,9,14-триазагептадекан, тетрагидрохлорид (26а): К раствору соединения 25а (0.164 г, 0.169 ммоль) в 4 мл CH2CI2 добавили 4н HCl в диоксане (4 мл) и перемешивали 2 ч при 24°С. Растворители удаляли в вакууме, остаток перекристаллизовывали из смеси CHCI3-EtOH (1 : 1). Получили соединение 26а в виде аморфных бежевых кристаллов (0.136 г, 99%). Rf 0.35 (Ж). Масс-спектр, m/z (/отн(%)): 671.5 [М-4HCI + Н]+ (100). Вычислено для C42H82Cl4N402: 670.61 [М -4HCI]+. Спектр ЯМР 1Н (D20): 0.61 (с, ЗН, С(13)Ме), 0.77 (д, 3 Н, J = 6.5, С(25)Ме), 0.79 (д, 3 Н, J = 6.5, С(25)Ме), 0.84 (д, 3 Н, J = 6.5, С(20)Ме), 0.94 (с, 3 Н, С(Ю)Ме), 0.90-2.00 (м, 38 Н, протоны Chol, NHCH2(ch2)2CH2N, 2 NCH2CH2CH2N, СН2(сн2)2СН2), 2.11-2.32 (м, 2 Н, Н2С(4)), 2.90-3.15 (м, 16 Н, 0С(0)СН2, 7 CH2N), 4.20-4.40 (м, 1 Н, Н(3)), 5.205.35 (м, 1 Н, Н(6)).

1,17-Диамино-М1-(холест-5-ен-Зр-илоксикарбонил)-5,9,14-триазагептадекан тетрагидрохлорид (26Ь): Получали как соединение 26а исходя из 25Ь (0.120 г, 0.122 ммоль). Получили соединение 26Ь в виде аморфных бежевых кристаллов (0.098 г, 97%). Rf0.38(>K). Масс-спектр, m/z (/отн(%)): 686.6 [М - 4HCI + Н]+ (100). Вычислено для C42H83Cl4N502: 685.63 [M-4HCI]+. Спектр ЯМР 1Н (D20): 0.60 (с, 3 Н, С(13)Ме), 0.76 (д, 3 Н, .7 = 6.5, С(25)Ме), 0.79 (д, 3 Н, J = 6.5, С(25)Ме), 0.85 (д, 3 Н, J = 6.5, С(20)Ме), 0.95 (с, 3 Н, С(Ю)Ме), 0.90-2.00 (м, 38 Н, протоны Chol, NHCH2(CH2)2CH2N, 2 NCH2CH2CH2N, СН^СНг^СНг), 2.10-2.33 (м, 2 Н, Н2С(4)), 2.91-3.15 (м, 16 Н, 8 CH2N), 4.13-4.39 (м, 1 Н, Н(3)), 5.17-5.38 (м, 1 Н, Н(6)).

1,19-Диамино-Л/1"(холест-5-ен-Зр-илоксикарбонил)-7,11,16-триазанонадекан, тетрагидрохлорид (26с): Получали как соединение 26а исходя из 25с (0.144 г, 0.142 ммоль). Получили соединение 26с в виде аморфных бежевых кристаллов (0.116 г, 95%). /?f0.40(>K). Масс-спектр, m/z (/0™(%)): 714.6 [М - 4HCI + Н]+(100). Вычислено для C44H87CI4N5O2: 713.65 [М - 4HCI]+. Спектр ЯМР 1Н (D20): 0.61 (с, 3 Н, С(13)Ме), 0.77 (д, 3 Н, J = 6.5, С(25)Ме), 0.79 (д, 3 Н, J = 6.5, С(25)Ме), 0.85 (д, 3 Н, J = 6.5, С(20)Ме), 0.94 (с, 3 Н, С(Ю)Ме), 0.91-2.05 (м, 42 Н, протоны Chol, NHCH2(ch2)2ch2N, 2 NCHhChbChbN, СЬЫСН^СНг), 2.12-2.35 (м, 2 Н, Н2С(4)), 2.91-3.14 (м, 16 Н, 8 CH2N), 4.13-4.40 (м, 1 Н, Н(3)), 5.17-5.38 (м, 1 Н, Н(6)).

Л/9,Л/14-Ди-(тре/п-бутоксикарбонил)-Л/5,Л/18-бис(2-нитрофенилсульфонил)-1,22-бис(холест-5-ен-Зр-илоксикарбонил)-5,9,14,18-тетраазадокозан (27а): К раствору соединения 12 (0.200 г, 0.259 ммоль) в безводном ДМФА (7 мл) последовательно добавили CS2CO3 (0.084 г, 0.259 ммоль) и бромид 14 (0.300 г, 0.546 ммоль). Реакционную смесь перемешивали 1 ч при 60°С. Осадок отфильтровывали через Celite® 545, промывали CH2CI2. После удаления растворителей в вакууме, остаток хроматографировали на колонке с силикагелем, элюируя смесью СНС1з-МеОН-25% водный NH3 (60 : 2 : 0.1 с увеличением полярности до 60:4:0.1). Получили соединение 27а в виде кристаллизующегося светло-желтого масла (0.307 г, 78%). Rf 0.38 (В). Спектр ЯМР 1Н: 0.61 (с, 6Н, 2 С(13)Ме), 0.79 (д, 6 Н, J = 6.5, 2 С(25)Ме), 0.80 (д, 6 Н, J = 6.5, 2 С(25)Ме), 0.83 (д, 6 Н, J = 6.5, 2 С(20)Ме), 0.94 (с, 6 Н, 2 С(Ю)Ме), 0.90-2.07 (м, 68 Н, протоны Chol, 3 СН2(СН2)2СН2, 2 NCH2ch2ch2N), 1.36 (уш. с, 18 Н, 2 С(СНз)з), 2.20-2.38 (м, 8 Н, 2 Н2С(4), 2 0С(0)СН2), 3.00-3.17 (м, 8 Н, 4 NCH2), 3.17-3.31 (м, 8 Н, 4 NCH2), 4.33-4.49 (м, 2 Н, 2 Н(3)), 5.25-5.34 (м, 2 Н, 2 Н(6)), 7.497.60 (м, 2 Н), 7.58-7.69 (м, 4 Н) и 7.88-7.98 (м, 2 Н, 2 С6Н4). Спектр ЯМР 13С: 11.95, 18.64, 19.21, 20.96, 21.88, 22.46, 22.69, 23.75, 24.19, 25.58, 25.74, 27.30, 27.46, 27.72, 27.89, 28.11, 28.37, 31.81, 31.82, 33.84, 35.68, 36.12, 36.52, 36.93, 38.07, 39.44, 39.68, 42.25, 44.48, 45.07, 46.99, 47.02, 50.01, 56.12, 56.64, 73.85, 79.37, 122.2, 124.06, 130.60, 131.54, 133.38, 139.58, 147.00, 155.32, 172.30.

Л/9,Л/14-Ди-(трет-бутоксикарбонил)-Л/5,Л/18-бис(2-нитрофенилсульфонил)-1,22-бис(холест-5-ен-Зр-илоксикарбониламино)-5,9,14,18-тетраазадокозан (27Ь): Получали как соединение 27а исходя из соединения 12 (0.200 г, 0.259 ммоль), Cs2C03 (0.127 г, 0.389 ммоль) и соединения

17а (0.300 г, 0.531 ммоль). Остаток элюировали системой CHCI3-MeOH (100 : 0.5 с увеличением полярности до 100:1). Получили соединение 27Ь в виде кристаллизующегося светло-желтого масла (0.276 г, 57%). Rf 0.38 (В). Спектр ЯМР 1Н: 0.61 (с, 6 Н, 2 С(13)Ме), 0.79 (д, 6 Н, J = 6.5, 2 С(25)Ме), 0.80 (д, 6 Н, J = 6.5, 2 С(25)Ме), 0.83 (д, 6 Н, J = 6.5, 2 С(20)Ме), 0.94 (с, 6 Н, 2 С(Ю)Ме), 0.90-2.00 (м, 68 Н, протоны Chol, 3 СН2(СН2)2СН2, 2 NCH2CH2CH2N), 1.36 (уш. с, 18 Н, 2 С(СНз)з), 2.11-2.38 (м, 4 Н, 2 Н2С(4)), 2.96-3.14 (м, 12 Н, 2 ChbNH, 4 NCH2), 3.143.29 (м, 8 Н, 4 NCH2), 4.33-4.49 (м, 2 Н, 2 Н(3)), 4.58-4.75 (м, 2 Н, 2 NH), 5.26-5.33 (м, 2 Н, 2 Н(6)), 7.51-7.58 (м, 2 Н), 7.58-7.69 (м, 4 Н) и 7.88-7.98 (м, 2 Н, 2 С6Н4). Спектр ЯМР 13С: 11.95, 18.81, 19.43, 21.13, 22.66, 22.92, 23.92, 24.37, 25.52, 26.02, 27.13, 27.54, 28.09, 28.27, 28.32, 28.56, 31.96, 31.98, 35.88, 36.27, 36.64, 37.08, 38.68, 39.60, 39.81, 40.30, 42.39, 44.71, 45.20, 45.67, 47.28, 47.64, 50.09, 56.22, 56.77, 74.27, 79.62, 122.53, 124.25, 130.72, 131.81, 133.36, 133.65, 139.93, 148.11, 155.53, 156.33.

Л/1\М16-Ди-(трет-бутоксикарбонил)ЛУ7,Л/?°-бис(2-нитрофенилсульфонил)-1,26-бис(холест-5-ен-Зр-илоксикарбониламино)-7,11,16,20-тетраазагексакозан (27с): Получали как соединение 27а исходя из соединения 12 (0.200 г, 0.259 ммоль), CS2CO3 (0.084 г, 0.259 ммоль) и соединения 17Ь (0.338 г, 0.569 ммоль). Вещество элюировали системой CHCI3-MeOH (100 : 0.5 с увеличением полярности до 100: 1). Получили соединение 27с в виде кристаллизующегося светло-желтого масла (0.262 г, 56%). Rf 0.40 (В). Спектр ЯМР 1Н: 0.61 (с, 6 Н, 2 С(13)Ме), 0.79 (д, 6 Н, J = 6.5, 2 С(25)Ме), 0.80 (д, 6 Н, J = 6.5, 2 С(25)Ме), 0.83 (д, 6 Н, J = 6.5, 2 С(20)Ме), 0.94 (с, 6 Н, 2 С(Ю)Ме), 0.90-2.00 (м, 76 Н, протоны Chol, NCH2(CH2)2CH2N, 2 NCbhChhCHhN, 2 СНг^Нг^СНг), 1.37 (уш. с, 18 Н, 2 С(СНз)з), 2.11-2.37 (м, 4 Н, 2 Н2С(4)), 2.96-3.14 (м, 12 Н, 2 CHzNH, 4 NCH2), 3.14-3.30 (м, 8 Н, 4 NCH2), 4.33-4.50 (м, 2 Н, 2 Н(3)), 4.55-4.78 (м, 2 Н, 2 NH), 5.26-5.32 (м, 2 Н, 2 Н(6)), 7.51-7.58 (м, 2 Н), 7.59-7.68 (м, 4 Н) и 7.88-7.97 (м, 2 Н, 2 С6Н4). Спектр ЯМР 13С: 11.97, 18.83, 19.45, 21.14, 22.68, 22.94, 23.93, 24.40, 25.68, 26.25, 26.38, 27.50, 28.03, 28.11, 28.30, 28.34, 28.57, 29.97, 31.97, 35.90, 36.28, 36.66, 37.10, 38.70, 39.61, 39.83, 40.79, 42.41, 44.65, 45.14, 47.20, 50.10, 56.22, 56.78, 74.25, 79.61, 122.53, 124.26, 130.77, 131.78, 133.54, 133.62, 139.98, 148.11, 155.54, 156.29.

Л/^А/^-Ди^тре/п-бутоксикарбонилН ,22-бис(холест-5-ен-Зр-илоксикарбонил)-5,9,14,18-тетраазадокозан (28а): К раствору соединения 27а

0.215 г, 0.126 ммоль) в ДМФА (2 мл) при перемешивании добавили К2С03 (0.035 г, 0.252 ммоль), а затем PhSH (0.13 мл, 1.13 ммоль). Через 1 ч реакционную массу фильтровали через Celite® 545, промывали осадок МеОН, растворитель упаривали в вакууме. Остаток хроматографировали на колонке с силикагелем, элюируя смесью CHCI3-MeOH-25% водный NH3 (100:10:1). Получили соединение 28а в виде желтоватого кристаллизующегося масла (0.100 г, 60 %). Rf 0.32 (Е). Масс-спектр, m/z (/отн(%)): 1339.642 [М]+ (100). Вычислено для C84H146N408: 1339.114 [М]+. Спектр ЯМР 1Н: 0.61 (с, 6 Н, 2С(13)Ме), 0.79 (д, 6 Н, J = 6.5, 2 С(25)Ме), 0.80 (д, 6 Н, J = 6.5, 2 С(25)Ме), 0.83 (д, 6 Н, J = 6.5, 2 С(20)Ме), 0.94 (с, 6Н, 2 С(Ю)Ме), 0.90-2.03 (м, 68 Н, протоны Chol, 3 СН2(СН2)2СН2, 2 nch2cm2ch2n), 1.37 (уш. с, 18 Н, 2С(СН3)3), 2.30-2.35 (м, 8 Н, 2 Н2С(4), 2 0С(0)СН2), 2.50-2.70 (м, 8 Н, 2 СЩЧНСНг), 3.00-3.30 (м, 8 Н, 4 NCH2), 4.40-4.50 (м, 2 Н, 2 Н(3)), 5.25-5.33 (м, 2 Н, 2 Н(6)). Спектр ЯМР 13С: 12.03, 18.91, 19.47, 21.24, 22.71, 22.94, 24.03, 24.46, 26.07, 28.03, 28.16, 28.38, 28.66, 29.20, 32.10, 34.60, 35.95, 36.40, 36.80, 37.21, 38.37, 39.72, 39.97, 42.54, 45.03, 47.03, 49.55, 50.30, 56.41, 56.93, 74.04, 79.59, 122.76, 139.90, 155.97, 172.99.

Л/9,Л/14-Ди-(трет-бутоксикарбонил)-1,22-бис(холест-5-ен-Зр-илоксикарбониламино)-5,9,14,18-тетраазадокозан (28Ь): Получали как соединение 28а исходя из соединения 27Ь (0.200 г, 0.115 ммоль), К2С03 (0.048 г, 0.345 ммоль) и PhSH (0.14 мл, 1.15 ммоль). Остаток элюировали системой CHCI3-МеОН-25% NH3 водн. (120:7.6:1). Получили соединение 28Ь в виде светло-желтого кристаллизующегося масла (0.121 г, 77%). Rf0.30(E). Масс-спектр, m/z (/отн(%)): 1370.339 [М + Н]+ (100). Вычислено для C84H148N608: 1369.136 [М]+. Спектр ЯМР 1Н: 0.61 (с, 6 Н, 2 С(13)Ме), 0.79 (д, 6 Н, J = 6.5, 2 С(25)Ме), 0.80 (д, 6 Н, J = 6.5, 2 С(25)Ме), 0.83 (д, 6 Н, J = 6.5, 2 С(20)Ме), 0.94 (с, 6 Н, 2 С(Ю)Ме), 0.90-2.00 (м, 68 Н, протоны Chol, 3 СНг^ЬЬЬСНг, 2 МСН2СНгСН2М), 1.37 (уш. с, 18 Н, 2 С(СН3)3), 2.10-2.35 (м, 4 Н, 2 Н2С(4)), 2.47-2.62 (м, 8 Н, 2 CHzNHChb). 2-98 3.28 (м, 12 Н, 2 СЩМН, 4 NCH2), 4.34-4.49 (м, 2 Н, 2 Н(3)), 4.58-4.70 (м, 2 Н, 2 NH), 4.92-5.11 (м, 2 Н, 2 NH), 5.25-5.33 (м, 2 Н, 2 Н(6)). Спектр ЯМР 13С: 12.00, 18.86, 19.49, 21.19, 22.70, 22.96, 23.97, 24.43, 25.86, 26.14, 27.13, 27.97, 28.15, 28.37, 28.62, 32.02, 35.94, 36.33, 36.70, 37.15, 38.76, 39.66, 39.88, 40.86, 42.45, 44.45, 45.17, 46.81, 47.41, 50.15, 56.28, 56.83, 74.25, 79.54, 122.55, 140.02, 155.53, 156.38.

Л/11,Л/16-Ди-(трет-бутоксикарбонил)-1,26-бис-(холест-5-ен-Зр-илоксикарбониламино)-7,11,16,20-тетраазагексакозан (28с): Получали как 28а исходя из соединения 27с (0.330 г, 0.184 ммоль), К2С03 (0.076 г, 0.552 ммоль) и PhSH (0.19 мл, 1.83 ммоль). Получили соединение 28с в виде светло-желтого кристаллизующегося масла (0.185 г, 71 %). f?f 0.33(E). Масс-спектр, m/z (/0Тн(%)): 1426.339 [М + Н]+ (100). Вычислено для C88Hi56N608: 1425.198 [М]+. Спектр ЯМР 1Н: 0.61 (с, 6 Н, 2 С(13)Ме), 0.79 (д, 6 H, J = 6.5, 2 С(25)Ме), 0.80 (д, 6 H, J = 6.5, 2 С(25)Ме), 0.83 (д, 6 H, J = 6.5, 2 С(20)Ме), 0.94 (с, 6 Н, 2 С(Ю)Ме), 0.90-2.00 (м, 76 Н, протоны Chol, NCH2(CH2)2CH2N, 2 NCHaCHbCh^N, 2 СН^СН^СНг), 1.37 (уш. с, 18 Н, 2 С(СНз)з), 2.12-2.35 (м, 4 Н, 2 Н2С(4)), 2.47-2.61 (м, 8 Н, 2 CH2NHCH2), 2.99-3.27 (м, 12 Н, 2 ChbNH, 4 NCH2), 4.34-4.49 (м, 2 H, 2 Н(3)), 4.57-4.70 (м; 2 Н, 2 NH), 5.26-5.33 (м, 2 Н, 2 Н(6)). Спектр ЯМР 13С: 11.97, 18.83, 19.45, 21.14, 22.68, 22.94, 23.93, 24.40, 25.68, 26.25, 26.38, 27.50, 28.03, 28.11, 28.30, 28.34, 28.57, 29.97, 31.97, 35.90, 36.28, 36.66, 37.10, 38.70, 39.61, 39.83, 40.79, 42.41, 44.65, 45.14, 47.20, 50.10, 56.22, 56.78, 74.25, 79.61, 122.53, 139.98, 155.54, 156.29.

1,22-Бис(холест-5-ен-Зр-илоксикарбонил)-5,9^14,18-тетраазакозан тетрагидрохлорид. (29а): К раствору, соединения 28а, (0.100 г, 0.075 ммоль) в CH2CI2 (3 мл) добавили.4н раствор HCl в диоксане (4 мл) и перемешивали 2 ч при 24°С. Растворитель удаляли в вакууме, осадок промывали СН3ОН (5 мл). Получили соединение 29а в виде бежевых кристаллов (79 мг, 82%). Rf 0.40 (Ж). Масс-спектр, m/z (/0Тн(%)): 1139.784 [M-4HCI]+ (100). Вычислено для C74H134Cl4N404: 1139.009 [M - 4 HCI]+. Спектр ЯМР 1Н (flMCO-d6 - CDCI3, 1 : 3): 0.61 (с, 6 Н, 2 С(13)Ме), 0.77 (д, 6 H, J = 6.5, 2 С(25)Ме), 0.79 (д, 6 H, J = 6.5, 2 С(25)Ме), 0.84 (д, 6 H, J = 6.5, 2 С(20)Ме), 0.94 (с, 6 Н, 2С(10)Ме), 0.90-2.03 (м, 68 Н, протоны Choi, NHCH2(CH2)2CH2N, 2 NCH2CH2CH2N, 2 СН2(СН2)2СН2), 2.15-2.25 (м, 8 H, 2 Н2С(4), 2 0С(0)СН2), 2.90-3.15 (м, 16 Н, 8 CHbN), 4.20-4.40 (м, 2 Н, 2 Н(3)), 5.20-5.35 (м, 2 Н, 2 Н(6)).

1,22-Бис(холест-5-ен-Зр-илоксикарбониламино)-5,9,14,18-тетраазадокозан тетрагидрохлорид (29Ь): Получали как соединение 29а исходя из соединения 28Ь (0.086 г, 0.063 ммоль). Получили соединение 29Ь в виде бежевых кристаллов (82 мг, 99%). /^0.40(Ж). Масс-спектр, m/z (1от(%)): 1170.1 [М - 4 HCl + Н]+ (100). Вычислено для C74Hi36Cl4N604: 1169.13 [M - 4 HCIf. Спектр ЯМР 1Н (CD3OD - CDCI3, 1:4): 0.61 (с, 6 Н, 2С(13)Ме), 0.77 (д, 6 H, J = 6.5, 2 С(25)Ме), 0.79 (д, 6 H, J = 6.5, 2 С(25)Ме), 0.83 (д, 6 H,J = 6.5, 2 С(20)Ме), 0.94 (с, 6Н, 2 С(Ю)Ме), 0.90-2.04 (м, 68 Н, протоны Chol, NHCH2(CH2)2CH2NH, 2 NCHsCHzCHzN, 2 СН2(СН2)4СН2), 2.11-2.34 (м, 4 H, 2 Н2С(4)), 2.41-2.60 (м, 8 Н,

2 CH2NHCH2), 3.00-3.28 (м, 12 Н, 2 CÜ-NH, 4 NCH2), 4.33-4.49 (м, 2 Н, 2 Н(3)), 5.265.33 (м, 2 Н, 2 Н(6)).

1,26-Бис(холест-5-ен-Зр-илоксикарбониламино)-7,11,16,20-тетраазагексакозан тетрагидрохлорид (29с): Получали как соединение 29а соединения 28с (0.160 г, 0.112 ммоль). Получили соединение 29с в виде бежевых кристаллов (146 мг, 95%). Rf0.45(>K). Масс-спектр, m/z (/отн(%)): 1226.3 [М-4 HCl + Н]+ (100). Вычислено для C78H144CI4N6O4: 1225.13 [М - 4 HCI]+. Спектр ЯМР 1Н (ДМСО-ds - CDCI3, 1:3): 0.61 (с, 6 Н, 2С(13)Ме), 0.79 (д, 6 Н, J = 6.5, 2 С(25)Ме), 0.80 (д, 6 Н, J = 6.5, 2 С(25)Ме), 0.83 (д, 6 Н, J = 6.5, 2 С(20)Ме), 0.94 (с, 6 Н, 2 С(Ю)Ме), 0.91-2.04 (м, 76 Н, протоны Chol, NHCH2(CH2)2CH2NH, 2 NCH2CH2CH2N, 2 СН2(СН2)4СН2), 2.12-2.35 (м, 4 H, 2 Н2С(4)), 2.40-2.61 (м, 8 Н, 2 CH2NHCH2), 2.99-3.27 (м, 12 Н, 2 CÜNH, 4 NCH2), 4.34-4.49 (м, 2 Н, 2 Н(3)), 4.574.70 (м, 2 Н, 2 NH), 5.26-5.33 (м, 2 Н, 2 Н(6)).

Л/7,Л/12,Л/15-Три-бензилоксикарбонил-Л/3-(2-нитрофенилсульфонил)-1-(холест-5-ен-Зр-илоксиметокси)-15-амино-3,7,12-триазапентадекан (30а): К раствору соединения 5Ь (0.156 г, 0.20 ммоль) в безводном ДМФА (Змл) последовательно добавили Сэ2СОз (0.035 г, 0.11 ммоль) и соединение 20а (0.114 г, 0.22 ммоль). Реакционную смесь перемешивали 2 ч при 60 °С, приливали 15 мл СНСЬ, промывали 20% водным раствором NaCI (2x15 мл), сушили над Na2S04, упаривали. Остаток хроматографировали на колонке с силикагелем, элюируя смесью CHCI3-MeOH (200:1 с увеличением полярности до 50:1). Получили соединение 30а в виде кристаллизующегося масла (0.228 г, 94%). Rf 0.40 (Б). Спектр ЯМР 1Н: 0.64 (с, 3 Н, С(13)Ме), 0.83 (д, 3 Н, J =6.5, С(25)Ме), 0.84 (д, 3 Н, J = 6.5, С(25)Ме), 0.89 (д, 3 Н, J = 6.5, С(20)Ме), 0.95 (с, 3 Н, С(Ю)Ме), 0.93-2.05 (м, 33 Н, протоны Chol, NCH2(CH2)2CH2N, 2 ГМСНгСНгСНгЫ), 2.08-2.35 (м, 2 Н, Н2С(4)), 2.95-3.45 (м, 15 Н, Н(3), 7 NCH2), 3.45-3.55 (м, 2 Н, ЫСНгСНгО), 4.404.65 (м, 2 Н, 0СН20), 4.95-5.18 (м, 6 Н, 3 CÜPh), 5.23-5.38 (м, 1 Н, Н(6)), 7.15-7.40 (м, 15 Н, 3 Ph) 7.50-7.80 (м, 3 Н) и 7.88-8.03 (м, 1 Н, С6Н4). Спектр ЯМР 13С: 11.85, 18.71, 19.33, 21.02, 22.57, 22.83, 23.78, 24.26, 25.17, 25.74, 26.90, 27.98, 28.20, 28.79, 31.82, 31.90, 35.75, 36.14, 36.44, 36.67, 37.12, 37.56, 38.13, 39.38, 39.48, 39.70, 42.27, 44.01, 46.38, 46.95, 50.10, 56.08, 56.69, 65.59, 66.36, 67.09, 76.93, 93.29, 121.86, 124.05, 127.86, 128.02, 128.44, 128.50, 130.86, 133.41, 136.64, 140.48, 147.99, 155.95, 156.50.

Л^.^^Л/^-Три-бензилоксикарбонил-Л^^г-нитрофенилсульфонил)-!-(холест-5-ен-Зр-илоксиметокси)-17-амино-5,9,14-триазагептадекан (ЗОЬ): К раствору соединения 5Ь (0.377 г, 0.48 ммоль) в безводном ДМФА (9 мл) последовательно добавили CS2CO3 (0.156 г, 0.48 ммоль), соединение 20Ь (0.266 г, 0.53 ммоль) и Bu4NI (0.088 г, 0.24 ммоль). Реакционную смесь перемешивали 20 ч при 85°С, приливали 15 мл CHCI3, промывали 20% водным раствором NaCI (4 х 25 мл), сушили над Na2S04, упаривали. Остаток хроматографировали на колонке с силикагелем, элюируя смесью CHCI3-MeOH (100 : 1 с увеличением полярности до 50:1). Получили соединение ЗОЬ в виде кристаллизующегося масла (0.299 г, 50%). R, 0.42 (Б). Спектр ЯМР 1Н: 0.68 (с, 3 Н, С(13)Ме), 0.86 (д, 3 Н, J = 6.5, С(25)Ме), 0.87 (д, 3 Н, J = 6.5, С(25)Ме), 0.91 (д, 3 Н, J = 6.5, С(20)Ме), 1.00 (с, ЗН, С(Ю)Ме), 0.93-2.10 (м, 37 Н, протоны Chol, 2 СН2(СН2)2СН2, 2 NCH2CH2CH2N), 2.13-2.41 (м, 2 Н, Н2С(4)), 2.90-3.54 (м, 17 Н, Н(3), 7 NCH2> СН2СНгО), 4.67 (с, 2 Н, 0СН20), 5.00-5.15 (м, 6 Н, 3 Cj^Ph), 5.31-5.38 (м, 1 Н, Н(6)), 7.21-7.42 (м, 15 Н, 3 Ph) 7.50-7.72 (м, 3 Н) и 7.86-8.07 (м, 1 Н, С6Н4). Спектр ЯМР 13С: 11.84, 18.71, 19.33, 21.05, 22.53, 22.77, 23.81, 24.27, 24.95, 25.24, 25.60, 26.69, 27.08, 27.34, 27.99, 28.19, 28.90, 31.89, 31.92, 35.75, 35.87, 36.18, 36.74, 37.22, 39.50, 39.55, 39.78, 42.32, 43.71, 44.09, 45.04, 46.58, 46.92, 50.19, 56.18, 56.76, 66.95, 67.09, 67.51, 76.96, 93.41, 121.73, 124.09, 127.85, 127.99, 128.20, 128.55, 130.68, 131.52, 133.39, 136.66, 140.71, 148.05, 156.00, 156.97, 157.46.

Л/11,Л/16,Л/19-Три-бензилоксикарбонил-Л/7-(2-нитрофенилсульфонил)-1-(холест-5-ен-Зр-илоксиметокси)-19-амино-7,11,16-триазадодекан (30с):

Получали как соединение ЗОЬ исходя из соединения 5Ь (0.313 г, 0.40 ммоль), Cs2C03 (0.129 г, 0.40 ммоль), соединения 20с (0.255 г, 0.48 ммоль) и Bu4NI (0.074 г, 0.20 ммоль). Получили соединение 30с в виде масла (0.278 г, 54%). R\ 0.43 (Б). Спектр ЯМР 1Н: 0.68 (с, 3 Н, С(13)Ме), 0.86 (д, 3 Н, J = 6.5, С(25)Ме), 0.87 (д, 3 Н, J = 6.5, С(25)Ме), 0.91 (д, 3 Н, J = 6.5, С(20)Ме), 1.00 (с, 3 Н, С(Ю)Ме), 0.95-2.05 (м, 41 Н, протоны Chol, NCH2(CH2)2CH2N, OCH2(CH2)4CH2N, 2 NCH2CüCH2N), 2.20-2.41 (м, 2 H, Н2С(4)), 3.00-3.35 (м, 14 Н, 7 NCH2), 3.35-3.45 (м, 1 Н, Н(3)), 3.50 (т, 2 Н, J = 6.5, СНгСНгО), 4.71 (с, 2 Н, 0СН20), 5.00-5.20 (м, 6 Н, 3 CHzPh), 5.32-5.39 (м, 1 Н, Н(6)), 7.21-7.42 (м, 15 Н, 3 Ph) 7.52-7.73 (м, 3 Н) и 7.90-8.00 (м, 1 Н, С6Н4). Спектр ЯМР 13С: 11.99, 18.84, 19.51, 21.17, 22.71, 22.97, 23.95, 24.42, 25.37, 25.70, 25.95, 26.53, 27.25, 28.15, 28.37, 29.02, 29.69, 31.99, 32.06, 35.92, 36.30, 36.87, 37.35, 37.61, 38.24, 39.64, 39.67, 39.88, 42.43, 44.09, 44.48, 44.78, 46.89, 47.07, 50.25, 56.25, 56.86, 66.59, 67.29, 67.70, 76.97,93.56,

85

121.88, 124.25, 128.04, 128.20, 128.61, 128.65, 130.91, 131.70, 133.56, 136.78, 140.88, 148.11, 156.11, 156.65, 156.88.

Л/7,Л/12,Л/15-Три-бензилоксикарбонил-1-(холест-5-ен-Зр-илоксиметокси)-15-амино-3,7,12-триазапентадекан (31а): К раствору соединения 30а (0.200 г, 0.16ммоль) в ДМФА (5 мл) при перемешивании добавили К2СОэ (0.074 г, 0.54 ммоль), а затем PhSH (0.167 мл, 1.62ммоль). Через 15 мин к реакционной массе добавляли CHCI3 (10 мл), промывали 20% раствором NaCI (3x15 мл), сушили над Na2S04, упаривали. Остаток хроматографировали на колонке с силикагелем, элюируя смесью CHCI3-MeOH-25% водный NH3 (100:5:0.1). Получили соединение 31а в виде желтоватого масла (0.165 г, 97%). f?f0.58 (Н). Масс-спектр, m/z (1от{%))\ 1047.767 [М+Н]+ (100). Вычислено для C64H94N408: 1046.707 [М]+. Спектр ЯМР 1Н: 0.68(с, 3 Н, С(13)Ме), 0.86 (д, 3 Н, J = 6.5, С(25)Ме), 0.87 (д, 3 Н, J = 6.5, С(25)Ме), 0.92 (д, 3 Н, J = 6.5, С(20)Ме), 1.00 (с, 3 Н, С(Ю)Ме), 0.93-2.1 (м, 33 Н, протоны Chol, NCH2(CH2)2CH2N, 2 NCH2CH2CH2N), 2.20-2.40 (м,

2 Н, Н2С(4)), 2.50-3.00 (м, 4 Н, СШМНСНг), 3.00-3.30 (м, ЮН, 5 NCH2), 3.30-3.50 (м, 1 Н, Н(3)), 3.50-3.80 (м, 2 Н, МСН2СНгО), 4.73 (с, 2 Н, 0СН20), 5.00-5.15 (м, 6 Н,

3 ChbPh), 5.25-5.40 (м, 1 Н, Н(6)), 7.20-7.40 (м, 15 Н,' 3 Ph). Спектр ЯМР 13С: 11.97, 18.85, 19.45, 21.19, 22.66, 22.90, 23.96, 24.40, 25.44, 25.86, 27.27, 28.11, 28.32, 29.03, 32.03, 35.88, 36.33, 36.87, 37.35, 37.90, 39.65, 39.92, 42.46, 44.29, 44.29, 44.87, 46.67, 46.90, 50.33, 56.33, 56.90, 65.72, 66.63, 67.29, 77.26, 93.75, 121.92, 127.99, 128.15, 128.57, 128.61, 136.87, 140.78,156.58.

Л/^Л/^М^-Три-бензилоксикарбонил-! -(холест-5-ен-Зр-илоксиметокси)-17-амино-5,9,14-триазагептадекан (31Ь): Получали как соединение 31а исходя из ЗОЬ (0.220 г, 0.17 ммоль), К2СОэ (0.080 г, 0.58 ммоль), PhSH (0.179 мл, 1.75 ммоль). Получили соединение 31 b в виде желтоватого масла (0.139 г, 74 %). Яг 0.60 (Н). Масс-спектр, m/z (/отн(%)): 1075.760 [М+Н]+ (100). Вычислено для C66H98N408: 1074.738 [М]\ Спектр ЯМР 1Н: 0.68 (с, 3 Н, С(13)Ме), 0.86 (д, 3 Н, J = 6.5, С(25)Ме), 0.87 (д, 3 Н, J =6.5, С(25)Ме), 0.91 (д, 3 Н, J =6.5, С(20)Ме), 1.00 (с, ЗН, С(Ю)Ме), 0.95-2.08 (м, 37 Н, протоны Chol, 2 СН2(СН2)2СН2, 2 NCH2ch2ch2N), 2.15-2.40 (м, 2 Н, Н2С(4)), 2.45-2.65 (м, 4 Н, ch2nhch2), 3.033.35 (м, 10 Н, 5 NCH2), 3.35-3.50 (м, 1 Н, Н(3)), 3.53 (т, 2 Н, J = 6.2, СНгСНаО), 4.72 (с, 2 Н, 0СН20), 5.03-5.17 (м, 6 Н, 3 Ch^Ph), 5.31-5.38 (м, 1 Н, Н(6)), 7.20-7.42 (м, 15 Н, 3 Ph). Спектр ЯМР 13С: 11.96, 18.83, 19.45, 21.17, 22.65, 22.90, 23.94, 24.39, 25.34, 25.82, 26.25, 27.27, 28.10, 28.32, 29.03, 29.78, 32.02, 32.04, 35.88, 36.31,

36.86, 37.38, 37.79, 39.62, 39.68, 39.91, 43.44, 44.21, 45.03, 46.66, 47.19, 50.30, 56.30, 56.88, 67.15, 67.26, 67.86, 76.95, 93.56, 121.762, 127.91, 128.08, 128.14, 128.55, 128.57, 128.63, 136.95, 140.92, 156.50, 156.56.

М11,Л/16,Л/1э-Три-бензилоксикарбонил-1-(холест-5-ен-Зр-илоксиметокси)-19-амино-7,11,16-триазадодекан (31с): Получали как соединение 31а исходя из 30с (0.210 г, 0.17 ммоль), К2СОэ (0.074 г, 0.54 ммоль), PhSH (0.167 мл, 1.63 ммоль). Получили соединение 31с в виде желтоватого масла (0.150 г, 83 %). Rf0.61(H). Масс-спектр, m/z (/0™(%))' 1103.6 [M+Hf (100). Вычислено для C68H102N4O8: 1102.770 [М]+. Спектр ЯМР 1Н: 0.67 (с, 3 Н, С(13)Ме), 0.85 (д, 3 Н, J = 6.6, С(25)Ме), 0.86 (д, 3 Н, J =6.6, С(25)Ме), 0.91 (д, 3 Н, J = 6.5, С(20)Ме), 1.00 (с, ЗН, С(Ю)Ме), 0.96-2.07 (м, 41 Н, протоны Chol, NCh^CühCHhN, OCH2(ch2)4ch2N, 2 NCH2CH2CH2N), 2.15-2.40 (м, 2 H, Н2С(4)), 2.45-2.70 (м, 4 Н, CÜNHChb). 3.02-3.35 (м, 10 Н, 5 NCH2), 3.35-3.45 (м, 1 Н, Н(3)), 3.53 (т, 2 Н, J = 6.0, СН2СНгО), 4.71 (с, 2 Н, 0СН20), 5.00-5.15 (м, 6 Н, 3 CJiPh), 5.32-5.37 (м, 1 Н, Н(6)), 7.21-7.40 (м, 15 Н, 3 Ph). Спектр ЯМР 13С: 11.95, 18.82, 19.44, 21.15, 22.64, 22.89, 23.92, 24.38, 25.37, 25.84, 26.33, 26.76, 27.55, 28.08, 28.31, 29.01, 32.00, 32.03, 35.86, 36.29, 36.84, 37.35, 37.81, 38.30, 39.61, 39.66, 39.89, 42.42, 44.21, 44.98, 46.60, 47.08, 49.64, 50 28, 56.28, 56.86, 67.16, 67.24, 67.63, 76.96, 93.53, 121.79, 127.91, 128.07, 128.12, 128.53, 128.57, 128.62, 136.92, 140.86, 156.29, 156.53, 156.71.

15-Амино-1-(холест-5-ен-Зр-илоксиметокси)-3,7,12-триазапентадекан, тетрагидрохлорид (32а): К раствору соединения 31а (131 мг, 0.13 ммоль) в THF (10 мл) добавили 5 % Pd/C (524 мг) и продували Н2 в течении 8 ч. Реакционную массу фильтровали, упаривали, сухой остаток промывали диэтиловым эфиром (5x10 мл). Получили соединение 32а в виде белых кристаллов (51 мг, 62%). Масс-спектр, m/z (/0™(%)): 645.581 [М+Н]+ (100). Вычислено для C4oH76N402: 644.597 [М]+. Спектр ЯМР 1Н: 0.58 (с, 3 Н, С(13)Ме), 0.75 (д, 3 Н, J = 6.5, С(25)Ме), 0.76 (д, 3 Н, J = 6.5, С(25)Ме), 0.81 (д, 3 Н, J = 6.5, С(20)Ме), 0.90 (с, 3 Н, С(Ю)Ме), 0.90-2.00 (м, 33 Н, протоны Chol, NHCH2(CH2)2CH2N, 2 NHCH2CH2CH2NH), 2.102.29 (м, 2 Н, Н2С(4)), 2.65-3.00 (м, 8 Н, 4 CH2N), 3.20-3.50 (м, 9 Н, Н(3), NCHzCHzO, 3 NCH2), 4.64 (с, 2 Н, 0СН20), 5.15-5.30 (м, 1 Н, Н(6)).

17-Амино-1-(холест-5-ен-ЗР-илоксиметокси)-5,9,14-триазагептадекан, тетрагидрохлорид (32Ь): Получали как соединение 32а исходя из 31 b (0.059 г, 0.06 ммоль), 5% Pd/C (177 мг). Получили соединение 32Ь в виде белых кристаллов (20 мг, 55%). Масс-спектр, m/z (1тн(%))\ 673.736 [М+Н]+ (100). Вычислено для C42H8oN402: 672.628 [М]+. Спектр ЯМР 1Н: 0.59 (с, 3 Н, С(13)Ме), 0.74 (д, 3 Н, J = 6.5, С(25)Ме), 0.75 (д, 3 Н, J = 6.5, С(25)Ме), 0.80 (д, 3 Н, J = 6.5, С(20)Ме), 0.90 (с, 3 Н, С(Ю)Ме), 0.91-2.03 (м, 37 Н, протоны Chol, NHCH2(CH2)2CH2N, 2 NHCH2CH2CH2NH, СН2(СН2)2СН2), 2.10-2.30 (м, 2 Н, Н2С(4)),

2.69-3.05 (м, 14 Н, 3 CH2NCH2, NCH2), 3.21-3.51 (м, 1 Н, Н(3)), 3.55 (т, 2 Н, J = 6.2, СН2СН2О), 4.72 (с, 2 Н, 0СН20), 5.14-5.19 (м, 1 Н, Н(6)).

19-Амино-1 -(холест-5-ен-Зр-илоксиметокси)-7,11,16-триазадодекан, тетрагидрохлорид (32с): Получали как соединение 32а исходя из 31с (0.058 г, 0.05 ммоль), 5% Pd/C (177 мг). Получили соединение 32с в виде белых кристаллов (23 мг, 60%). Масс-спектр, m/z (/отн(%)): 701. 834 [М+Н]+ (100). Вычислено для C44H84N402: 700.659 [М]+. Спектр ЯМР 1Н: 0.60 (с, 3 Н, С(13)Ме), 0.74 (д, 3 Н, J = 6.5, С(25)Ме), 0.75 (д, 3 Н, J = 6.5, С(25)Ме), 0.79 (д, 3 Н, J = 6.5, С(20)Ме), 0.91 (с, 3 Н, С(Ю)Ме), 0.91-2.03 (м, 41 Н, протоны Chol, NHCH2(CH2)2CH2N, 2 NHCH2CH2CH2NH, СН2(СШ)4СН2), 2.11-2.30 (м, 2 Н, Н2С(4)),

2.70-3.07 (м, 14 Н, 3 CH2NCH2, NCH2), 3.22-3.51 (м, 1 Н, Н(3)), 3.54 (т, 2 Н, J = 6.2, СН2СНгО), 4.71 (с, 2 Н, 0СН20), 5.15-5.20 (м, 1 Н, Н(6)).

Холест-5-ен-Зр-ил)-Л/11,Л/16,Л/19-три-(/прет-бутилоксикарбонил)-19-амино-6-оксо-3,4-дитиа-7,11,16-триазадодеканоат (33а). К раствору соединения 4а (99 мг, 0.198 ммоль) в ДМФА (2.5 мл) последовательно добавили соединение 22а (0,131 г, 0.238 ммоль), TBTU (0.076 мг, 0.238 ммоль) и Et3N (0.033 мл, 0.238 ммоль). Через 1 ч упариваем, остаток хроматографировали на колонке с силикагелем, элюируя смесью СНС1з-МеОН (100 : 1). Получили соединение 33а в виде кристаллизующегося бесцветного масла (0.122 г, 60%). f?f0.35(B). Спектр ЯМР 1Н: 0.68 (с, 3 Н, С(13)Ме), 0.85 (д, 3 Н, J = 6.5, С(25)Ме), 0.86 (д, 3 Н, J = 6.5, С(25)Ме), 0.91 (д, 3 Н, J =6.5, С(20)Ме), 1.02 (с, 3 Н, С(Ю)Ме), 0.90-2.10 (м, 34 Н, протоны Chol, 2 NCH2CH2CH2N, NCH2(CH2)2CH2N), 1.43 (с, 9 Н), 1.45 (с, 9 Н) и 1.50 (с, 9 Н, 3 С(СНз)з), 2.29-2.40 (м, 2 Н, Н2С(4)), 3.02-3.35 (м, 12 Н, 6 CJiN), 3.47 (с, 2 Н, SChbCOOChol), 3.54 (с, 2 Н, SCÜCONH), 4.35-4.75 (м, 1 Н, Н(3)), 5.27-5.40 (м, 1 Н, Н(6)). Спектр ЯМР 13С: 11.85, 18.72, 19.27, 21.05, 22.53, 22.77, 23.83, 24.27, 25.91, 27.70, 27.99, 28.19, 28.44, 28.47, 29.67, 31.88, 31.91, 33.94, 35.77, 36.20, 36.60, 36.95, 37.68, 38.00, 39.52, 39.75, 41.04, 41.71, 42.67, 44.11, 46.85, 49.14, 50.08, 56.20, 56.72, 75.76, 79.64, 122.99, 139.31, 156.01, 167.95, 169.08.

Холест-б-ен-ЗР-ил^Л/^М^ЛР^ри^трет-бутилоксикарбонил)^!-амино-8-оксо-4,5-дитиа-9,13,18-триазагенэйкозаноат (33b): Получали как соединение 33а исходя из соединения 4а (0.158 г, 0.314 ммоль), соединения 22Ь (0.218 г, 0.377 ммоль), TBTU (0.121 г, 0.377 ммоль) и Et3N (0.053 мл, 0.377 ммоль). Получили соединение ЗЗЬ в виде кристаллизующегося бесцветного масла (0.178 г, 82%). Rf 0.4 (Б). Спектр ЯМР 1Н: 0.68 (с, 3 Н, С(13)Ме), 0.85 (д, 3 Н, J = 6.5, С(25)Ме), 0.86 (д, 3 Н, J = 6.5, С(25)Ме), 0.91 (д, 3 Н, J = 6.5, С(20)Ме), 1.02 (с, 3 Н, С(Ю)Ме), 0.91-2.05 (м, 34 Н, протоны Chol, 2 nch2ch2ch2n, NCH^ChhhCHzN), 1.46 (уш. с, 27 Н, СМе3), 2.27-2.37 (м, 2 Н, Н2С(4)), 2.58 (т, 2 Н, J =7.1, SCHzChbCOOChol), 2.70 (т, 2 Н, J =7.1, SCH2CH2CONH), 2.87-3.00 (м, 4 Н,

2 SCH2), 3.07-3.40 (м, 12 Н, 6 CH^N), 4.55-4.72 (м, 1 Н, Н(3)), 5.33-5.40 (м, 1 Н, Н(6)). Спектр ЯМР 13С: 11.82, 18.67, 19.28, 20.98, 22.54, 22.80, 23.78, 24.24, 25.94, 27.17, 27.64, 27.72, 27.98, 28.19, 28.33, 28.41, 31.79, 31.86, 33.11, 33.82, 34.40, 35.75, 35.97, 36.13, 36.54, 36.91, 38.05, 39.47, 39.66, 42.94, 43.31, 46.66, 46.81, 49.95, 56.06, 56.63, 74.46, 79.92, 80.33, 122.74, 139.46, 157.02, 157.51, 170.66, 171.13.

Холест-5-ен-Зр-ил)-19-амино-6-оксо-3,4-дитиа-7;11,16-триазадодеканоат тригидрохлорид (34а): К раствору соединения 33а (0.055 г, 0.053 ммоль) в 3 мл CH2CI2 добавили 4н. HCl в диоксане (1 мл) и перемешивали

1 ч при 24°С. Растворители удаляли в вакууме, остаток промывали chci3. Получили соединение 29а в виде аморфных бежевых кристаллов (0.030 г, 67%). Rf 0.85 (Ж). Масс-спектр, m/z (/0™(%)): 735.623 [М - 3HCI + Н]+ (100). Вычислено для C4iH77Cl3N403S2: 734.520 [М - 3HCI]+. Спектр ЯМР 1Н (CDCI3- CD3OD, 1 : 5): 0.67 (с,

3 Н, С(13)Ме), 0.85 (д, 3 Н, J = 6.5, С(25)Ме), 0.86 (д, 3 Н, J = 6.5, С(25)Ме), 0.92 (д, ЗН, J =6.5, С(20)Ме), 1.03 (с, 3 Н, С(Ю)Ме), 0.91-2.05 (м, 34 Н, протоны Chol,

2 NCH2ChUCH2N, NCH2(ch2)2CH2N), 2.30-2.41 (м, 2 Н, Н2С(4)), 2.91-3.21 (м, 12 Н, 6 ch2n), 3.46 (с, 2 Н, SChbCOOChol), 3.55 (с, 2 Н, sch2conh), 4.36-4.76 (м, 1 Н, Н(3)), 5.28-5.41 (м, 1 Н, Н(6)).

Холест-5-ен-Зр-ил)-21-амино-8-оксо-4,5-дитиа-9,13,18-триазагенэйкозаноат тригидрохлорид (34Ь): Получали как соединение 34а исходя из ЗЗЬ-(0.05 г, 0.073 ммоль). Получили соединение 34Ь в виде аморфных белых кристаллов (0.048 г, 76%). Rf 0.86 (Ж). Масс-спектр, m/z (/от„(%)): 763.725 [М - 3HCI + Н]+ (100). Вычислено для C43H8iCI3N403S2: 762.552 [М - 3HCI]+. Спектр ЯМР 1Н (CDCI3- cd3od, 1 : 5): 0.68 (с, 3 Н, С(13)Ме), 0.84 (д, 3 Н, J = 6.5, С(25)Ме),

0.85 (д, 3 H, J = 6.5, C(25)Me), 0.90 (д, 3 H, J = 6.5, C(20)Me), 1.01 (с, 3 H, С(Ю)Ме), 0.90-2.06 (м, 34 H, протоны Chol, 2 nch2ch2ch2n, NCH2(ch2)2CH2N), 2.27-2.37 (м, 2 H, H2C(4)), 2.59 (т, 2 H, J =7.1, SCHzChbCOOChol), 2.71 (т, 2 H, J =7.1, SCH2ch2conh), 2.88-3.21 (m, 16 H, 2 SCH2, 6 ch2n), 4.55-4.72 (m, 1 H, H(3)), 5.335.40 (m, 1 H, H(6)).

Л/14,М19,Л/22-Три-(шрет-бутилоксикарбонил)-Л/1-(холест-5-ен-Зр-илоксикарбонил)-1,22-диамино-8-оксо-3,4-дитиа-7,10,14,19-тетраазадокозан (35): К охлажденному до 0°С раствору соединения 8а (100 мг, 0.167 ммоль) в ДМФА (5 мл) последовательно добавили TBTU (0.134 мг, 419 ммоль), раствор соединения 23 (0.302 мг, 0.502 ммоль), DIEA (0.146 мл, 0.837 ммоль) в ДМФА (2.5 мл). Через 2 ч к реакционной массе добавляли 20 мл CH2CI2, промывали 3 % водным раствором HCl (2 x15 мл), сушили над Na2S04, упаривали. После хроматографии на силикагеле CHCI3-MeOH, (80:1) получили соединение 35 в виде кристаллизующегося масла (0.176 г, 92%). Rf0.57(C). Масс-спектр, m/z (/отн(%)): 1107.867 [M - Cl]+ (100). Вычислено для C59H107CIN6O9S2: 1107.754 [M-Cl]+. Спектр ЯМР 1Н: 0.64 (с, 3 Н, С(13)Ме), 0.83 (д, 3 H, J = 6.6, С(25)Ме), 0.84 (д, 3 H, J = 6.6, С(25)Ме), 0.88 (д, 3 H, J = 6.5, С(20)Ме), 0.97 (с, 3 Н, С(Ю)Ме), 0.85-1.70 (м, 36 Н, протоны Chol, NCH2(ch2)2ch2N, nch2ch2ch2nh2ch2co), 1.40 (с, 9 H), 1.41 (с, 9 H) и 1.42 (с, 9 Н, ЗС(СНз)з), 1.70-2.07 (м, 7 Н, протоны Chol, b0cnhch2ch2ch2n), 2.20-2.39 (м, 2 Н, Н2С(4)), 2.55 (т, 2 H, J =6.5, ch2nh2ch2co), 2.76-2.84 (м, 4 Н, 2 ch2s), 3.01-3.32 (м, ЮН, 2 CH2N(Boc)CH2, NH(Boc)CÜ). 3.21 (с, 2 H, ch2nh2ch2co), 3.44 (квартет, J = 6.2, 2 H, ChbNHCOOChol), 3.57 (квартет, J = 6.3, 2 H, ch2oconhch2), 4.30-4.58 (м, 1 H, H(3)), 5.25-5.50 (m, 1 H, H(6)). Спектр ЯМР 13C: 11.93, 18.80, 19.40, 21.12, 22.63, 22.88, 23.91, 24.36, 25.98, 28.06, 28.25, 28.29, 28.52, 28.54, 28.56, 31.97, 31.98, 35.85, 36.27, 36.64, 37.08, 37.82, 37.94, 38.51, 38.64, 39.59, 39.83, 44.11, 46.73, 47.07, 50.12, 56.24, 56.78, 74.57, 79.07, 79.53, 79.64, 122.56, 139.87, 156.17, 156.18, 156.19.

1,22-Диамино-Л/1-(холест-5-ен-Зр-илоксикарбонил)-8-оксо-3,4-дитиа-7,10,14,19-тетраазадокозан (36): К раствору соединения 35 (0.200 г, 0.146 ммоль) в 4 мл THF добавили 4 н HCl в диоксане (3 мл) и перемешивали 3 ч при 24°С. Растворители удаляли в вакууме, остаток промывали МеОН. Получили соединение 36 в виде белых кристаллов (0.155 г, 81%). Rf 0.35 (Ж). Масс-спектр, m/z (/0Тн(%)): 807.654 [M - 4HCI + Н]+ (100). Вычислено для C44H86CI4N603S2: 806.589

М - 4НС1]+. Спектр ЯМР 1Н (D20): 0.65 (с, 3 Н, С(13)Ме), 0.84 (д, 3 Н, J =6.6, С(25)Ме), 0.85 (д, 3 Н, J = 6.6, С(25)Ме), 0.87 (д, 3 Н, J = 6.5, С(20)Ме), 0.96 (с, 3 Н, С(Ю)Ме), 0.85-1.70 (м, 38 Н, протоны Chol, NCH2(ch2)2CH2N, NCH2ch2ch2NH2CH2CO), 1.70-2.07 (м, 5 Н, протоны Chol), 2.21-2.40 (м, 2 Н, Н2С(4)), 2.54 (т, 2 Н, J = 6.5, CH2NH2CH2CO), 2.77-2.84 (м, 4 Н, 2 CH2S), 2.94-3.25 (м, 14 Н, 7ch2n), 3.45 (квартет, J = 6.2, 2 Н, CHzNHCOOChol), 3.56 (квартет, J = 6.3, 2 Н, СН2ОСОЫНСШ. 4.31-4.59 (м, 1 Н, Н(3)), 5.24-5.49 (м, 1 Н, Н(6)).

Получение композиции катионный амфифил-DOPE

Раствор поликатионного амфифила (26а-с, 29а-с, 34а,Ь, 36) и нейтрального фосфолипида DOPE в 50% мольном соотношении в подходящем органическом растворителе упаривали в вакууме до образования липидной пленки. Полученную липидную пленку гидратировали в необходимом количестве (с = 1мМ) автоклавированной деионизированной воды в течение 3-6 часов, а затем озвучивали на ультразвуковой бане до получения однородной смеси.

Доставка в клетки FITC-меченного олигонуклеотида с использованием композиции катионный амфифил-DOPE

Исследование проникновения FITC-меченного олигонуклеотида в клетки НЕК 293 проводили с помощью проточной цитофлоуметрии. Эффективность доставки оценивали по количеству трансфицированных клеток от общего количества клеток в образце. Клетки высаживали в 24-луночные планшеты (2x105 клеток на лунку) и культивировали в течение суток при 37 °С в атмосфере, содержащей 5% С02. Перед проведением трансфекции для экспериментов в присутствии или в отсутствие сыворотки среду в лунках заменяли на 200 мкл среды DMEM, содержащей 10% FBS, или DMEM, не содержащей сыворотку, соответственно. Одну из композиций (26a-c-DOPE, 29a-c-DOPE, 34a,b-DOPE, 36-DOPE) в среде OptiMEM смешивали с раствором FITC-меченного олигонуклеотида (конечная концентрация олигонуклеотида в лунке 1 мкМ) в этой же среде в соответствии с выбранным соотношением P/N (отношение количество отрицательных зарядов фосфатных групп к количеству положительных зарядов атомов азота) и инкубировали 20 минут при комнатной температуре. Затем образовавшиеся комплексы добавляли к клеткам и инкубировали в течение 4 ч. По окончании инкубации клетки промывали PBS (300 мкл), добавляли 40 мкл раствора трипсина и инкубировали 1-2 мин. (37°С, 5%С02). По окончании инкубации в лунки добавляли 200 мкл DMEM с 10% сыворотки, клетки суспендировали и переносили

91 в пробирки. Полученную клеточную суспензию центрифугировали при 1000-1200 об./мин., 4°С, отбирали среду и клетки промывали 0.5 мл PBS. Затем клетки фиксировали путем суспендирования в 600 мкл 2% раствора формальдегида в PBS. Анализ уровня трансфекции клеток проводили на флуоцитометре FC500 (Beckman-Coulter), определяя число FITC-положительных клеток в популяции и-средний уровень флуоресценции клеток, определяемый при длине волны возбуждения 488 нм. В качестве агентов сравнения использовали коммерческую композицию Lipofectamine®2000.

Трансфекция клеток НЕК 293 плазмидной ДНК с использованием композиции катионный амфифил-DOPE.

Исследование доставки плазмидной ДНК в клетки НЕК 293 проводили с помощью проточной цитофлоуметрии. Эффективность трансфекции оценивали по количеству клеток, в которых происходит экспрессия зеленого флуоресцентного белка (EGFP) от общего количества клеток в популяции. Клетки высаживали в 24-луночные планшеты (1.2х105 клеток на лунку для клеток НЕК 293) и культивировали в течение суток при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СОг. Перед проведением трансфекции-для экспериментов в присутствии или в отсутствие сыворотки среду в лунках заменяли на 200 мкл среды DMEM, содержащей 10% FBS, или DMEM, не содержащей сыворотку, соответственно. Одну из композиций (26a-c-DOPE, 29a-c-DOPE, 34a,b-DOPE, 36-DOPE) в среде OptiMEM смешивали с раствором ДНК плазмиды pEGFP-C2 (0.5 мкг в лунке) в этой же среде в определенном соотношении P/N, полученную смесь добавляли к клеткам и инкубировали в течение 24 ч. Через 4 часа среду в лунках со средой без сыворотки заменяли среду на DMEM' с 10% сывороткой. По окончании инкубации клетки обрабатывали и анализировали, как описано в доставки в клетки FITC-меченного олигонуклеотида с использованием композиции катионный амфифил-DOPE.

1. Mintzer М.А. and Simanek Е.Е. / Nonviral Vectors for Gene Delivery // Chem. Rev., 2009, 109 (2), P. 259-302

2. Templeton N. S. / Gene and cell therapy: therapeutic mechanisms and strategies. 3rd ed. / CRC, 2008

3. Vonarbourg A, Passirani C, Saulnier P, Benoit J.P. / Parameters influencing the stealthiness of colloidal drug delivery systems // Biomaterials, 2006, 27(24), P. 435673.

4. Rejman J., Bragonzi A., Conese M. Role of clathrin- and caveolae-mediated endocytosis in gene transfer mediated by lipo- and. polyplexes // Mol Ther, 2005, V. 12(3), P. 468-74.

5. Mellman I. / Endocytosis and moleculansorting // Annu Rev Cell Dev Biol; 1996, V. 12, P. 575-625.

6. Francis C.L., Ryan.T.A., Jones, B.D., Smith. S.J., Falkow S. / Ruffles induced by Salmonella and other stimuli direct macropinocytosis of bacteria.// Nature, 1993, V. 364(6438), P: 639-642.

7. Harbottle R.P., Cooper R.G., Hart S.L., Ladhoff A., McKay Т., Knight A.M. et al. / An RGD-oligolysine peptide: a prototype construct for integrin-mediated gene delivery // Hum Gene Ther, 1998, V. 9(7), P. 1037^7.

8. Wiethoff С, M., Middaugh С R. / Barriers to Nonviral Gene Delivery1 // J. Pharmaceut. Sci. 2003, V.92, 2, P. 203-217

9. Remy J.S., Abdallah В., Zanta M. A., Boussif O., Behr. J.P. / Demeneix B. Gene transfer with lipospermines and polyethylenimines // Adv. Drug Del. Rev. 1998; V. 30, P. 85-95

10. Luo D., Saltzman Wi M. / Synthetic DNA delivery systems // Nat. Biotechnol. 2000, V. 18, P. 33-37.

11. Feigner P.L, Gadek T.R., Holm.M., Roman R., Chan H.W., Wenz M., Northrop J.P., Ringold G.M., Danielsen M: / Lipofection: A highly efficient, lipid-mediated'DNA-transfection procedure// Proc. Natl.-Acad. Sci., 1987, V. 84, P. 7413-7417

12. Akinc A., Zumbuehl A., Goldberg M., LeshchinerE.S., Busini V., Zimmermann T.S. et al. / A combinatorial library of lipid-like materials for delivery of RNAi therapeutics // NATURE BIOTECHNOLOGY, 2008, V. 26 (5), P. 561-569.

13. Zimmermann T.S. et al: / RNAi-mediated gene silencing in non-human primates // Nature, 2006, V. 441, P. 111-114.

14. Bloomfield, V.A. I DNA condensation II Curr. Opin. Struct. Biol., 1996, V. 6, P. 334-341.

15. Allison S.A., Herr J.C. and Schurr J.M. / Structure of viral cp 29 DNA condensed by simple triamines: a light-scattering and electronmicroscopy study // Biopolymers, 1981, V. 20, P. 469-488

16. Stewart K.D. and Gray T.A. / Survey of the DNA Binding Properties of Natural and Synthetic Polyamino Compounds // J. Phys. Org. Chem., 1992, V. 5, P. 461-466

17. Geall A.J., Taylor R.J., Earll M.E., Eaton M.A.W. and Blagbrough I.S. / Synthesis of cholesterol-polyamine carbamates: pKa studies and condensation of calf thymus DNA// Chem. Commun., 1998, P. 1403-1404

18. Wilson R.W. and Bloomfield V.A. / Counterion-induced condensation of deoxyribonucleic acid: a light-scattering study // Biochemistry, 1979, V. 18, P. 21922196.

19. Zana R. / Alkanediyl-alpha, omega-bis(dimethylalkylammonium bromide) surfactants: II. Krafft temperature and melting temperature // J. Colloid Interface Sci., 2002, V. 252 (1), P. 259-61

20. Kim T.S., Kida T., Nakatsuji Y., Ikeda I. / Preparation and Properties of Multiple Ammonium Salts Quaternized by Epichlorohydrin // Langmuir, 1996, V. 12 (26), P. 6304-6308.

21. In M., Bee V., Aguerre-Chariol O., Zana R. / Quaternary Ammonium Bromide Surfactant Oligomers in Aqueous Solution: Self-Association and Microstructure // Langmuir, 2000, V. 16 (1), P. 141-148.

22. Zana R.; Talmon Y. / Dependence of aggregate morphology on structure of dimeric surfactants// Nature, 1993, V. 362, P. 228-230.

23. Moss R.A.; Li J.-M. / Bilayer-bridging bolaamphiphilic lipids // J. Am. Chem. Soc., 1992, V. 114 (23), P. 9227-9229.

24. McGregor C., Perrin C., Monck M., Camilleri P., Kirby A.J. / Rational Approaches to the Design of Cationic Gemini Surfactants for Gene Delivery // J. Am. Chem. Soc., 2001, V. 123 (26), P. 6215-6220.

25. Gerweck L.E., Seetharaman K. / Cellular pH gradient in tumor versus normal tissue: potential exploitation for the treatment of cancer // Cancer Res. 1996, V. 56 (6), P. 1194-1198.

26. Hunt C.A., MacGregor R.D., Siegal R.A. / Engineering targeted In vivo drug delivery I. The physiological & physicochemical principles governing opportunities & limitations // Pharm.Res. 1986, V. 3, P. 333-344.

27. Torchillin V.P. / Recent advances with liposomes as pharmaceutical carriers // Nat.Rev., Drug. Discov., 2005, V. 4, P. 145-160.

28. Shim W.S., Kim J.H., Kim K„ Kim Y.S., Park R.W., Kim I.S., Kwon I.C., Lee D.S. / pH-and temperature-sensitive, injectable, biodegradable block copolymer hydrogels as carriers for paclitaxel // Int.J.Pharm., 2007, V. 331 (1), P. 11-18.

29. Kim Y.H., Bae Y.H., Kim S.W. / pH/temperature-sensitive polymers for macromolecular drug loading and release // J.Control.Release, 1994, V. 28 (1-3), P. 143-152.

30. Benns J.M., Choi J.S., Mahato R.I., Park J.S., Kim S.W. / pH-sensitive cationic polymer gene delivery vehicle: N-Ac-poly(L-histidine)-graft-poly(L-lysine) comb shaped polymer// Bioconjug.Chem., 2000, V. 11 (5), P. 637-645.

31. Dufresne M.H., Garrec D.L., Sant V., Leroux J.C., Ranger M. / Preparation and characterization of water-soluble pH-sensitive nanocarriers for drug delivery // Int.J.Pharm., 2004, V. 277 (1-2), P. 81-90.

32. Liua S.Q., Wiradharma N., Gao S.J., Tong Y.W., Yang Y.Y. / Biofunctional micelles self-assembled from a folate-conjugated block copolymer for targeted intracellular delivery of anticancer drugs // Biomaterials, 2007, V. 28, P. 1423-1433.

33. Lee E.S., Na K., Bae Y.H. / Polymeric micelle for tumor pH and folate-mediated targeting // J.Control.Release, 2003, V. 91 (1-2), P. 103-113.

34. Fattal E., Couvreur P., Dubernet C. / «Smart» delivery of antisense oligonucleotides by anionic pH-sensitive liposomes // Adv.DrugDeliv.Rev., 2004, V. 56 (7), P. 931-946.

35. Boomer J.A., Thompson D.H., Sullivan S.M. / Formation of plasmid-based transfection complexes with an acid-labile cationic lipid: characterization of in vitro and in vivo // Gene Transfer. Pharm Res, 2002, V. 19 (9), P. 1292-1301

36. Zhu M.Z., Wu Q.H., Zhang G„ Ran T., Liu D., Guo Q.X. / Synthesis and evaluation of cationic lipids bearing cholesteryl groups for gene delivery in vitro // Bull.Chem.Soc.Jpn, 2002, V. 75 (10), P. 2207-2213.

37. Zhu J., Munn R.J., Nantz M.H. / Self-cleaving ortho ester lipids: a new class of pH-vulnerable amphiphiles//J.Am.Chem.Soc, 2000, V. 122 (11), P. 2645-2646.

38. Guo X., MacKay J.A., Szoka F.C. / Mechanism of pH-triggered collapse of phosphatidylethanolamine liposomes stabilized by an orthoester polyethyleneglycol lipid // Biophys. J., 2003, 84 (3), P. 1784- 1795.

39. Li S., Dory Y.L., Deslongchamps P. / Hydrolysis of cyclic orthoesters: experimental observations and theoretical rationalization // Tetrahedron, 1996, V. 52 (47), P. 14841-14854.

40. Masson C., Garinot M., Mignet N., Wetzer B., Mailhe P., Scherman D„ Bessodes M. / pH-sensitive PEG lipids containing orthoester linkers: new potential tools for nonviral gene delivery II Journal of Controlled Release, 2004, V. 99, P. 423-434

41. Choi J.S., MacKay J.A., Szoka FC.Jr. / Low-pH-sensitive PEG-stabilized plasmid-lipid nanoparticles: preparation and characterization // Bioconjug Chem., 2003, V. 14 (2), P. 420-429.

42. Wheeler O. H., Rosado-Lojo O. / Kinetics of formation and hydrolysis of steroid Girard-T hydrazones // Tetrahedron, 1962, V. 18, P. 477-482.

43. Simoes S., Moreira- J.N., Fonseca C., Duzgunes N., Lima M.C. / On the formulation of pH-sensitive liposomes with long circulation times // Adv.Drug Deliv.Rev., 2004, V. 56, P. 947-965.

44. Sergeeva A., Kolonin M.G., Molldrem J.J., Pasqualini R., Arap W. / Display technologies: application for the discovery of drug and gene delivery agents // Adv.Drug Deliv.Rev., 2006, V. 58 (15), P. 1622-1654.

45. Couffin-Hoarau A.C., Leroux J.C. / Report on the use of poly(organophosphazenes) for the design of stimuli-responsive vesicles // Biomacromolecules, 2004, V. 5, P. 2082-2087.

46. De Wolf H.K., Luten J., Snel C.J., Oussoren C., Hennink W.E., Storm G. / In vivo tumor transfection mediated by polyplexes based on biodegradable poly(DMAEA)-phosphazene//Journal of controlled release, 2005, V. 109 (1-3), P. 275-287

47. Papanicolaou I., Briggs S., Alpar H.O. / Increased resistance of DNA lipoplexes to protein binding in vitro by surface-modification with a multivalent hydrophilic polymer //J.Drug Target, 2004, V. 12 (8), P. 541-547.

48. Roux E., Passirani C., Scheffold S., Benoit J.P., Leroux J.C. / Serum-stable and long-circulating, PEGylated, pH-sensitive liposomes // J.Control.Release, 2004, V. 94, P. 447—451.

49. Shen H., Eisenberg A. / Control of architecture in block-copolymer vesicles II Angew. Chem., 2000, V. 39 (18), P. 3310-3312.

50. Liu S., Armes S.P. / Synthesis and aqueous solution behavior of a pH-responsive schizophrenic diblock copolymer// Langmuir, 2003, V. 19, P. 4432—4438.

51. Taillefer J., Jones M.C., Brasseur N., vanLier J.E., Leroux J.C. / Preparation and characterization of pH-responsive polymeric micelles for the delivery of photosensitizing anticancer drugs // J.Pharm.Sci., 2000, V. 89 (1), P. 52-62.

52. LeGarrec D., Taillefer J., VanLier J.E., Lenaerts V., Leroux J.C. / Optimizing pH-responsive polymeric micelles for drug delivery in a cancer photodynamic therapy model // J.DrugTarget., 2002, V. 10 (5), P. 429-437.

53. Shima M.S., Kwon Y.J., Controlled cytoplasmic and nuclear localization of plasmid DNA and siRNA by differentially tailored polyethylenimine, Journal of Controlled Release, 133 (3), (2009), 206-213.

54. Shima M.S., Kwon Y.J. / Acid-transforming polypeptide micelles for targeted nonviral gene delivery // Biomaterials, 2010, V. 31 (12), P. 3404-3413.

55. Ko I.K., Ziady A., Lu S., Kwon Y.J. / Acid-degradable cationic methacrylamide polymerized in the presence of plasmid DNA as tunable non-viral gene carrier // Biomaterials, 2008, V. 29, P. 3872-3881.

56. Townsend D.M., Tew K.D., Tapiero H. / The importance of glutathione in human disease // Biomed Pharmacother, 2003, V. 57(3-4), P. 145-55.

57. Go Y-M., Jones D.P. / Redox compartmentalization in eukaryotic cells. // Biochim. Biophys Acta, 2008, V. 1780 (11), P. 1273-1290.

58. Wu G., Fang Y-Z., Yang S., Lupton J.R., Turner N.D. / Glutathione metabolism and its implications for health // J. Nutr., 2004, V. 134(3), P. 489-92.

59. Hassan S.M., Rechnitz G.A. / Determination of glutathione and glutathione reductase with a silver sulfide membrane electrode // Anal.Chem., 1982, V. 54, P. 1972-1976.

60. Saito G, Swanson J.A., Lee K.D. / Drug delivery strategy utilizing conjugation via reversible disulfide linkages: role and site of cellular reducing activities // Adv. Drug. Deliv. Rev., 2003 V. 55(2), P. 199-215.

61. Kuppusamy P:, Afeworki M., Shankar R.A., Coffin D., Krishna M.C., Hahn S.M., et al. / In vivo electron paramagnetic resonance imaging of tumor heterogeneity and oxygenation in a murine model // Cancer Res., 1998, V. 58(7), P. 1562-1568.

62. Kuppusamy P., Li H., Ilangovan G., Cardounel A.J., Zweier J.L., Yamada K., et al. / Noninvasive imaging of tumor redox status and its modification by tissue glutathione levels. II Cancer Res., 2002, V. 62(1), P. 307-312.

63. Gosselin M.A., Guo W.J., Lee R.J. / Efficient gene transfer using reversibly cross-linked low molecular weight polyethylenimine II Bioconjugate Chem., 2001, V. 12(6), P. 989-994.

64. Wang Y., Chen P., Shen J. / The development and characterization of a glutathione-sensitive cross-linked polyethylenimine gene vector// Biomaterials, 2006, V. 27(30), P. 5292-5298.

65. Peng Q., Zhong Z.L., Zhuo R.X. / Disulfide cross-linked polyethylenimines (PEI) prepared via thiolation of low molecular weight PEI as highly efficient gene vectors // Bioconjugate Chem., 2008, V. 19(2), P. 499-506.

66. Sun Y-X., Zeng X., Meng Q-F., Zhang X-Z., Cheng S-X., Zhuo R-X. / The influence of RGD addition on the gene transfer characteristics of disulfidecontaining polyethyleneimine/DNA complexes // Biomaterials, 2008, V. 29(32), P. 4356-4365.

67. Choi S., Lee K-D. / Enhanced gene delivery using disulfide-crosslinked low molecular weight polyethylenimine with listeriolysin o-polyethylenimine disulfide conjugate II J. Control Release, 2008, V. 131(1), P. 70-76.

68. Neu M., Germershaus O., Behe M., Kissel T. / Bioreversibly crosslinked polyplexes of PEI and high molecular weight PEG show extended circulation times in vivo // J. Control Release, 2007, V. 124 (1-2), P. 69-80.

69. Anderson D.G., Lynn D.M., Langer R. / Semi-automated synthesis and screening of a large library of degradable cationic polymers for gene delivery // Angew. Chem., 2003, V. 42 (27), P. 3153-3158.

70. Christensen L.V., Chang C.W., Yockman J.W., Conners R., Jackson H., Zhong Z.Y., et al. / Reducible poly(amido ethylenediamine) for hypoxia-inducible VEGF delivery // J. Control Release, 2007, V. 118 (2), P. 254-261.

71. Jeong J.H., Christensen L.V., Yockman J.W., Zhong Z.Y., Engbersen J.F.J., Kim W.J., et al. / Reducible poly(amido ethylenimine) directed to enhance RNA interference II Biomaterials, 2007, V. 28 (10), P. 1912-1917.

72. Wang X-L., Nguyen T., Gillespie D., Jensen R., Lu Z-R. / A multifunctional and reversibly polymerizable carrier for efficient siRNA delivery // Biomaterials, 2008, V. 29 (1), P. 15-22.

73. McKenzie D.L., Smiley E., Kwok K.Y., Rice K.G. / Low molecular weight disulfide cross-linking peptides as nonviral gene delivery carriers // Bioconjugate Chem., 2000, V. 11 (6), P. 901-909.

74. Wong S.Y., Pelet J.M., Putnam D. / Polymer systems for gene delivery-past, present, and future // Prog. Polym. Sci., 2007, V. 32 (8-9), P. 799-837.

75. Manickam D.S., Hirata A., Putt D.A., Lash L.H., Hirata F., Oupick D. / Overexpression of Bcl-2 as a proxy redox stimulus to enhance activity of non-viral redox-responsive delivery vectors // Biomaterials, 2008, V. 29 (17), P. 2680-2688.

76. Stevenson M., Ramos-Perez V., Singh S., Soliman M., Preece J.A., Briggs S.S. et al. / Delivery of siRNA mediated by histidine-containing reducible polycations // J. Control Release, 2008, V. 130 (1), P. 46-56.

77. Mok H.J., Park T.G. / Self-crosslinked and reducible fusogenic peptides for intracellular delivery of siRNA // Biopolymers, 2008, V. 89 (10), P. 881-888.

78. Lo S.L., Wang S. / An endosomolytic Tat peptide produced by incorporation of histidine and cysteine residues as a nonviral vector for DNA transfection // Biomaterials, 2008, V. 29 (15), P. 2408-2414.

79. Manickam D.S., Oupicky D. / Multiblock reducible copolypeptides containing histidine-rich and nuclear localization sequences for gene delivery // Bioconjugate Chem., 2006, V. 17 (6), P. 1395-1403.

80. Oishi M., Hayama T., Akiyama Y., Takae S., Harada A., Yarnasaki Y., et al. / Supramolecular assemblies for the cytoplasmic delivery of antisense oligodeoxynucleotide: polyion complex (PIC) micelles based on poly(ethylene glycol)

81. SS-oligodeoxynucleotide conjugate // Biomacromolecules, 2005, V. 6 (5), P. 24492454.

82. Takae S., Miyata K„ Oba M., Ishii T., Nishiyama N., Itaka K„ et al. / PEG-detachable polyplex micelles based on disulfide-linked block catiomers as bioresponsive nonviral gene vectors // J.Am. Chem. Soc., 2008, V. 130 (18), P. 60016009.

83. Ghosh Y.K., Visweswariah S.S., Bhattacharya S. / Nature of linkage between the cationic headgroup and cholesteryl skelton controls gene transfection efficiency // FEBS Lett., 2000, V. 473, P. 341-344.

84. Ghosh Y.K., Visweswariah S.S., Bhattacharya S. / Advantage of the ether linkage between the positive charge and the cholesteryl skeleton in cholesterol-based amphiphiles as vectors for gene delivery // Bioconjugate Chem., 2002, V. 13, P. 378384.

85. Wether B., Byk G., Frederic M., Airiau M., Blanche F., Piterd B. et al. / Reductible cationic lipids for gene transfer// Biochem J., 2001, V. 356 (3), P. 747-756.

86. Zuber G., Zammut-ltaliano L., Dauty E., Behr J-P. / Targeted gene delivery to cancer cells: directed assembly of nanometric DNA particles coated with folic acid // Agnew. Chem., 2003, V. 42,(23), P. 2666-2669.

87. Balakirev M., Schoehn G., Chroboczek J. / Lipoic acid-derived amphiphiles for redox-controlled DNA delivery// Chem. Biol., 2000, V. 7(10), P. 813-819.

88. Chittimalla C., Zammut-ltaliano L., Zuber G., Behr J.P. / Monomolecular DNA nanoparticles for intravenous delivery of genes // J. Am. Chem. Soc., 2005, V. 127 (32), P. 11436-11441.

89. Maeda Т., Fujimoto K. / A reduction-triggered delivery by a liposomal carrier possessing membrane-permeable ligands and a detachable coating // Colloids Surfaces B: Biointerfaces, 2006, V. 49 (1), P. 15-21.

90. Patil S.D., Rhodes D.G. and Burgess D.J. I DNA-based Therapeutics and DNA Delivery Systems: A Comprehensive Review // AAPS J., 2005, V. 7 (1), P. 61-77.

91. Huang L,, Hung M.-C., Wagner E. / Non-viral Vectors for Gene Therapy. Part 1 II Elsevier, Amsterdam, 2005.

92. Martin B., Sainlos M., Aissaoui A., Oudrhiri N., Hauchecorne M., Vigneron J.-P., Lehn J.-M., and Lehn P. / The design of cationic lipids for gene delivery // Curr. Pharm. Design, 2005, V. 11 (3), P. 375-394.

93. Kostarelos K. and Miller A.D. / Synthetic, self-assembly ABCD nanoparticies; a structural paradigm for viable synthetic non-viral vectors // Chem. Soc. Rev., 2005, V. 34, P. 970.

94. Ghosh Y.K., Visweswariah S.S. and Bhattacharya S. / Advantage of the Ether Linkage between the Positive Charge and the Cholesteryl Skeleton in Cholesterol-Based Amphiphiles as Vectors for Gene Delivery // Bioconjugate Chem. 2002, V. 13, P. 378-384.

95. Hasegawa- S., Hirashima N. and Nakanishi Ml I Comparative Study of Transfection Efficiency of Cationic Cholesterols Mediated by Liposomes-Based Gene Delivery // Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2002, V. 12, P. 1299-1302

96. Маслов M.A., Сычева1 E.B., Морозова Н.Г., Серебренникова Г.А. / Катионныеамфифилы липидной и нелипидной природы в генной терапии // Изв. АН, Сер. хим., 2000, №3, С. 385-400 Russ. Chem. Bull., 2000, V. 49, P. 385 (Engl.1. Transl.).

97. Miller A.D. I Cationic Liposomes for Gene Therapy // Angew. Chem., Int. Ed., 1998, V. 37, P. 1768-1785.

98. S.J. Ryhanen, M.J. Saily, T.Paukku, S. Borocci, G. Mancini, J.M. Holopainen and P.K.J. Kinnunen / Surface Charge Density Determines the Efficiency of Cationic Gemini Surfactant Based Lipofection // Biophysical Journal, 2003, V. 84, P. 578-587

99. Sternberg B., Sorgi F.L. and Huang L. / New structures in complex formation between DNA and cationic liposomes visualized by freeze-fracture electron microscopy // FEBS Lett., 1994, V. 356 (2-3), P. 361-366

100. Kawaura C., Nogucki A., Furuno T. and Nakonishi M. / Atomic force microscopy for studying gene transfection mediated by cationic liposomes with a cationic cholesterol derivative // FEBS Lett., 1998, V. 421 (1), P. 69.

101. U'Ren L., Kedl R., Dow S. / Vaccination with liposome-DNA complexes elicits enhanced antitumor immunity // Cancer Gene Ther., 2006, V. 13, P. 1033-1044.

102. Gregoriadis G., Bacon A., Caparros-Wanderley W., McCormack B. / Plasmid DNA Vaccines: Entrapment into Liposomes by Dehydration-Rehydration // Methods in Enzymology, 2003, V. 367, P. 70-80.

103. Tabor C.W. and Tabor H. / Polyamines // Annu. Rev: Biochem., 1984, V. 53, P. 749-790.

104. Ouameur A.A. and Tajmir-Riahi H.-A. / Structural Analysis of DNA Interactions with Biogenic Polyamines and Cobalt(lll)hexamine Studied by Fourier Transform Infrared and Capillary Electrophoresis // J. Biol. Chem., 2004, V. 279, P. 42041-42054.

105. Eds J.-Y. Wang and R. A. Casero Jr! / Polyamine Cell Signaling: Physiology, Pharmacology and Cancer Research /, Humana Press Inc., 2006, P.91.

106. Geall A.J., Taylor R.J., Earll M.E., Eaton M.A.W. and Blagbrough I.S. / Synthesis of cholesteryl polyamine carbamates: pK(a) studies and condensation of calf thymus DNA // Bioconjugate Chem., 2000, V. 11 (3), P. 314-326.

107. Cooper R.G.,Etheridge C.J., Stewart L., Marshall J., Rudginsky S., Cheng S.H. and Miller A.D., Chem. Eur. J., 1998, V. 4, P. 137.

108. Lv H., Zhang S., Wang B., Cui S. and Yan J. / Toxicity of cationic lipids and cationic polymers in gene delivery//J. Control. Release, 2006, V. 114 (1), P. 100-109.

109. Guo X., Szoka F.C. / Chemical'approaches to triggerable lipid,vesicles for drug and gene delivery II Acc. Chem. Res., 2003; V. 36 (5), P. 335-341.

110. Asokan A., Cho M.J. / Cytosolic delivery of macromolecules. 3. Synthesis and characterization of acid-sensitive bis-detergents // Bioconjugate Chem., 2004, V. 15 (6), P. 1166-1173.

111. Hellberg P.-E., Bergstrom K., Juberg M. / Nonionic cleavable ortho ester surfactants // J. Surfact. Deterg., 2000, V. 3, P. 369-379.

112. Huang Z., Guo X., Li W., MacKay J.A., Szoka F.C. / Acid-triggered transformation of diortho ester phosphocholine liposome // J. Am. Chem. Soc., 2006, V. 128 (1), P. 60-61.

113. Ronsin G., Perrin C., Guédat P., Kremer A., Camilleri P. and Kirby A.J. / Novelspermine-based cationic gemini surfactants for gene delivery // Chem. Commun., 2001, P. 2234.

114. Miller K.A., Kumar E.V., Wood S.J., Cromer J.R., Datta A. and David S.A. / Lipopolysaccharide Sequestrants: Structural Correlates of Activity and Toxicity in Novel Acylhomospermines // J. Med. Chem., 2005, V. 48 (7), P. 2589-2599.

115. Geall A.J. and Blagbrough I.S. / Homologation of Polyamines in the Rapid Synthesis of Lipospermine Conjugates and Related Lipoplexes // Tetrahedron, 2000, V. 56 (16), P. 2449-2460.

116. Fukuyama Т., Jow C.-K., and Cheung M. / 2- and 4-Nitrobenzenesulfonamides: Exceptionally versatile means for preparation of secondary amines and protection of amines // Tetrahedron Lett., 1995, V. 36 (36), P. 6373-6374.

117. Fukuyama Т., Cheung M., Jow C.-K., Hidai Y., and Kan T. / 2,4-Dinitrobenzenesulfonamides: A simple and practical method for the preparation of a variety of secondary amines and diamines // Tetrahedron Lett., 1997, V. 38 (33), P. 5831-5834.

118. Maslov M.A., Morozova N.G., Serebrennikova G.A. / A Convenient Method for Synthesis of Cationic Glycerolipids via Methylthiomethyl Ethers // Mendeleev Commun. 2000. V. 10. P. 65-66

119. Маслов M.A., Морозова Н.Г., Серебренникова Г.А. / Удобный метод получения катионных глицеролипидов с потенциальной биологической активностью II Изв. АН, Сер. хим., 2002, № 3, С. 1778-1783 Russ. Chem. Bull., 2002, V. 51, P. 1931-11936 (Engl. Transl.).

120. Sokolik V.N., Sokolova T.V., Maslov M.A., Morozova N.G., Serebrennikova G.A. / Synthesis of cationic cholesterol-containing amphiphiles with an acid-labile linker // Mendeleev Commun., 2007, V. 17, P. 281-283.

121. Маслов M.A., Морозова Н.Г., Сенан И.М., Серебренникова Г.А. / Синтез катионных липидных агентов трансфекции с О,О- или N.O-ацетальными связями / Биоорган, химия, 2009, Т. 35, № 5, С. 696-700

122. Fuxing Tang and Jeffrey A.Hughes / Use of Dithiodiglycolic Acid as a Tether for Cationic Lipids Decreases the Cytotoxicity and Increases Transgene Expression of

123. Plasmid DNA in Vitro // Bioconjugate Chem., 1999, V. 10, P. 791-796

124. Greene T.W., Wuts P.G.M. / Protective Groups in Organic Synthesis // Wiley-Interscience, 4 edition, 2006

125. Донсон P., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. /Справочник биохимика // Мир, Москва, 1991 Dowson R.M.C., Elliot D.C., Elliot W.H. and Jones K.H. / Date for Biochemical Research // Clarendon Press, Oxford, 1986.

126. Kritchevsky D., Kirk M.R. / Radioactive eggs. III. Degradation of yolk glycerol // Arch. Biochem. Biophys. 1952, V. 39 (2), P. 305-309.