Группоспецифические антигены крови А и В, их фрагменты и аналоги: синтез, иммунохимические характеристики, применение в гематологии тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ НАУК СССР

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. М. М. ШЕМЯКИНА

На правах рукописи

КОРЧАГИНА Елена Юрьевна

ГРУППОСПЕЦИФИЧЕСКИЕ АНТИГЕНЫ КРОВИ А И В, ИХ ФРАГМЕНТЫ И АНАЛОГИ: СИНТЕЗ, ИММУНОХИМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ, ПРИМЕНЕНИЕ В ГЕМАТОЛОГИИ

02.00.10 — Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 1991

Работа выполнена в Институте бпоорганнческой химии им. М. М. Шемякина АН СССР.

Научный руководитель —

кандидат химических наук, старший научный сотрудник Н. В. БОВИН

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор С. Э. ЗУРАБЯН, кандидат химических наук А. Я. ЧЕРНЯК

Ведущая организация — Московский институт тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова

Защита состоится 4 декабря 1991 г. на заседании специализированного совета Д 002.35.01 при Институте биоорганической химии им. М. М. Шемякина АН СССР по адресу: 117871, Москва В-437, ул. Миклухо-Маклая 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. М. М. Шемякина

АН Г.Г.Г.Р

1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

. А. НЕСМЕЯНОВ

ОБШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Антигены групп крови АВН, специфичность которых определяется углеводами, являются необходимой составляющей не только гемопоэтических клеток,, но и клеток большинства эпителиальных тканей. Они присутствуют также в биологических жидкостях в форме гликоконъюгатов (гликопротеинов я гликосфинголипидов) и свободных олигосахаридов. Структуры большинства вптигейов групп _ крови установлены, однако их роль в процессах иммунного ответа, диффере.нцировки, развития, а также злокачественных трансформаций клеток лишь констатируется, в то время как механизм их участия в жизненно важных процессах межклеточного узнавания, остается неясным. Поэтому актуальной задачей является синтез молекул для изучениями моделирования этих процессов - неогликопротеинов, неогликолшшдов, зондов и псевдополисахаридов. '' • :

Актуальность данного исследования диктуется также требованиями практической медицины. Задачи; удаление природных антй-А и анти-В антител (а- и |3-гемагтлютининов! из препаратов крови, создание реагентов для тигшрования сывороток и антител групповой, специфичности, - могут быть решены также с использованием синтетических углеводных производных в виде макромолекулярных форм и груигоспецифических иммуносорбентов.

Целью работы были 1) синтез грушюснсцифических трисахаридов А и В, их дисэхаридных Фрагментов и неприродных аналогов;

¿) получение неогликоконъюгатов различных типов: неогликонротеинов, неогликолипидов, псевдополисахаридов,^ и их использование в качестве антигенов и зондов;

3) синтез иммуносорбентов для удаления а- и (З-гемагглютининов из препаратов крови;

4) синтез реагентов для типирования ан'ти-А и анти-В антител и антисывороток.

Научная новизна и практическая давность работы. Синтезированы три-сахарили Са1Шса1-3(Риса1-2)Са1р- и Са1а1->3(Риса1-*2)Са]|3-, являющиеся детерминантными структурами антигенов групп крови А и Б, диса-харидные фрагменты СаШса1 >30а1р-, Тиса1-»2(5а1р-. Са1а1-\ЗСа]/)-. неприродные аналоги трисахаридор СаШАш1-3(СаШса1-2)Са1|3- (А) и Оа]«! >3(Са1а1 -<?)гСн13- (3) и дисахарид Риса) -ЗСа1Э-*, причем указанные непригодные аналоги группоспвнифичпских олигосахаридов

сянтезированы впервые.

Реализован новый универсальный путь синтеза неогликоконъюга-тов с полиакриламидной матрицей - конденсацией олигосахаридных гаптенов с поли(4-нитрофенилакрилатоы) получены полимерные неогликоконъюгаты: псевдополисахариды, неогликолипиды, биотин- и флуоресцеин-содержаше зонды.

Неогликоконъюгаты нашли применение в нескольких областях иммунодиагностики и гематологии: псевдополисахариды удобная форма антигенов для изучзния эпитопной специфичности моно- и поликлональ-ных рнтител; псевдополисахариды с групповой специфичностью А и В -практически удобные водорастворимые реагенты, нейтрализующие а- и ß-гемагглютинины в сыворотках; неогликолипиды А и Б использовались при разработке тест-системы для выявления природных гликолипндов А и В.

• На Основе латекспых частиц и синтетических антигенов групповой специфичности крови А и В синтезированы реагенты и разработана тест-сиотема для титрования анти-А и антв-В сывороток и антител.

" Иммобилизацией да- и трисахвридов на макропористом стекле получены иммуносорбенты с групповой специфичностью крови А и В, нашедшие применение в гематологии для получения универсальных. ■ сывороток антирезус.

Апробация полученных данных. Результаты работа были представлены на VJII Всесоюзной конференции по химии и биохимии углеводов (Тбилиси, 1987), на I и II Всесоюзных конференциях "Современные направления создания медицинских диагностикумов'' (Москза, 1988 и 1990), на 7 Европейском симпозиуме по углеводам (Прага, Чехословакия, 1989), на XV Международном симпозиуме по углеводам (Иокогама, Япония.. 1990), на IX Международном симпозиуме по гликоконъюгатам (Торонто, Канада, 199П и на У1 Европейском симпозиуме по углеводам (Эдинбург, Шотландия, 1991). Структура и объем 'диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (Конформации углеводных детерминант антигенов крови и механизм углевод-белкового взаимодействия), обсуждения результатов (4 раздела), экспериментальной части, заключения и выгодов. Содержание диссертации изложено на -/¿Я? стр., включающих рис., 2-f- таблиц и список цитируемой литературы из Щ наименований.

« Олигбсахвриды получены б виде Н-трифтроацетшидолропилгликозидов *« Данный подход разработан коллективом авторов.

СОДЕШНИВ РАБОТЫ

В денной работе осуществлен синтез спейсерированнмх (в виде -ОО^П^ИуЩСОСР^ гликозидов) трисахаридов А и В в 5-10 г количествах; синтезированы дисахвриды А, В, Н и КисоИ-ЗСа1|ЗОзр, а также не-неприродные аналоги А и В трисахаридов ПаШАса1-2(Са111Аса1-,3)Са1р-и Са1а1-.2(Са1а1-«3)Са1р-, биотинилироваппые производные трисахаридов А и В и. Производные с удлиненным (-0(СН2)31ШСО(СН2)5ЮСООС(СБ3)3) спейсером . Кроне того, синтезированы различные макромолекулярные формы трисахаридов Л и В, иммуносорбенты с групповой специфичностью крови А и В, разработана тест-система для типирования анти-А и анти-В антител и антисывороток.

I. СИНТЕЗ ОЛИГОСАХАИЗДШ ГАПТЕНОВ 1.1. Синтез трисахаридов с групповой специфичностью крова А и В

Синтез трисахаридов к (11) и В (8) был осуществлен по схеме I. Был использован традиционный подход - синтез трисахаридов из общего предшественника, защищенного дисетарида Н, что давало возможность сократить о''тее количество стадий синтеза. Для облегчения последующей функционализации (конъюгации с полимерами, удлинения, биотинилирования) олигосахаридов. в агликоновую часть на первых стадиях синтеза введена спейсерная группировка -ОСН2СН2СНгШСОСРэ.

Исходное спейсерированное производное галактозы (1) получали ликозилироввнием З-трифторацетамидопропанола 1,2,3,4,б-пенуа-О-8цетил-р~1)-галвктопиранозой ' в присутствии эфирата трехфтористого бора при 0°С. Выход р-гликозида составил 70-80%. Далее производпоо (1) дезвцетилировали по Земплепу и реакцией с а, а-диметокситолуолом в присутствии ТзОН нолуча-ли диол (2) с 80-85% выходом. Селективным вцетилированием диола' (2) хлористым ацетилом с 76* выходом синтезировали З-ацетат (3), выделено также незначительное количество (<4%) 2,3-ди-ацетата (4).

Фукозилирование соединения (3) проводили в условиях гнлоид-ионного катализа три-0 бензил-а-Ь-фукопиранозилбромидои (РисВг), выход дисахярида (5) составил 79%. Дисахарид (6) с. количественным^ выходом получали из лисахарида (5) дезвлегилированисм по Земплепу. Г.ликозилироланием двсчх'ррпда (6) тетря- 0-бензил « В-галактопишпо-зилбромидом (П.'Л1!г) в присутствии цианида ргути синтезировали засн-

Схема!

АсО ОАс „

АсО^^°1СН21зННСОСРЗ 1 1

Л

но 2

№ X

он

I /Г

Л|СН2)зМИСОСРз

снг^нсосгз дсо

^СН2)3МНСОСРз

он

Р»1

л

но

ВгЮ

схсн^зынсосрз

ОВг1

03г1

0 0

5

г 0Вг1

АсО

РЬ

ов^реа оАо

ВгиГ55^. 7 I

ВгЮ

АсО ОАс АсО

аа-узьнсосРз

^СЦСН^зШСОСРз О

_ ОВг! ОВг| ■ ю

(За1МАса1-Зч

БаЫ.—

Fuc.i1—2'

8 ИчСОСРз

9 И=Н

Рис ¿1—2 11 И=СОСРз

12. И=н

ра(р01СН2>зЫНР

6

шенный трисахарид В (7) с выходом 78%, а гликозилированием 2-азидо-3,4,б-три-О-ацетил-г-дезокси-р-В-гэлактопиранозилхлоридом (СаШ^Й) в присутствии карбоната и перхлората серебра - защищенный трисахарид А (10) с выходом . 90%. Снятие защитных групп с трисахаридов (7) и (10) обычными методами привело к свободным слейсерированным производным (8) и (11) соответственно. Высокие выходы на каждой стадии синтеза (1) —> (В), (11) делают выбранный . путь синтеза перспективным для получения больших .количеств трисахаридов для практического применения.

1.2. Синтез дисахаридных фрагментов трисахаридов А и В, и дясахарида Гиса1-»ЗСа1Р0ар

Синтез дисахаридов Н (18), А (24) В (£7) и Раса1-ЗСа1р1-0зр (33) осуществлен по схеме 2.

Соединение (13) было получено с выходом 68% взаимодействием ацетобромгалактозы . и трет-бутанола в стандартных условиях, ; " " --Следующие три стадии - дезацетилирование ортоэфира (13), бензилирование полученного триода и гидролиз бензилированного ортоэфира,- проводили без выделения и характеристики промежуточных веществ, выход соединения (14) составил 70%. Слейсерированное производное галактозы (15) получено с выходом 81% галактозилировяни-ем З-трифторщетамидопропанола 1,2-ди-0-ацетил-3,4,В-три-0-бензил-галпктозой (14) в присутствии эфирата трехфтористого бора при 0°С.

Дезацетилировапием по Земплену 2-0-ацетильного производного (15) с выходом 75% получено соединение (16), необходимое' для синтеза дисахарида Н. Следует отметить, что дезацетилирование производного (15) потребовало некеталитических количеств метилатв натрия и длигельного (70 ч) времени реакции, при этом наблюдалось частичное дезтрифторацетилирование.

Фукозшшрование соединения ' (16) проводили .в- условиях галоид-монногр катализа РиеВг. Выход защищенного дисахарида Н (17) - 73%. Гидрогемолизом дисахарида (17) с количественным выходом получен свободный дисахарид Н (18). • ...

Гидрогенолизом соединения (15) и последующей' реакцией с а.а-диметокситолуолом в присутствии ТзОН с выходом 76% получен гялвктозный сиитон (20), необходимый для синтеза дисахаридов А (24), В (27) н дисахарида (33), последний является потенциальным опухолсгосоцпировапным гаптеном. Отсутствие миграции ацетила при

-6- Схема2

Fuc«l-2CnlfaCH2t3NHR 16 R*COCF3 19 К=Н

Bz^V^^nhcocf,

Wob

t )

B^lOœz)

BzlotS^CH^NHCOCFg 16

Bzl ßzli

I

Ad) cue B2|D ÇQzl ВгЮ mzi

--~ B^^SvacH^NHCoa^,

. - 00 ' f,A .OAt

13 X v. I 15

■ Me O I-Bu ,. I -V' .-.

„Ph

, 25 I I 20' ' ' 0 ( a*c 21 .

'(МД-ЗОоЦЮОУЗЯ '{? „ - • ■ '

28 я.'н0СРз J ^ ^ЩУ^^н^,

¿ÍS^ 29 I 22

. :... ; JLrO I • I

^^aCH2l3NHCOCF3. t ^До(с^нсос?з. ' I . 30 Z-^ÄoBzl' 31 ealWc«l-3Soipaabl3NHR

I " I

I 1 24 R= COCF3

рисл'-ЗСоИгОДсрСКСьузГИСОСРз' Fuc4I-3GQI¡SOICH2Í3NHCOCF3 .-2SRíH 32 33

! FucU-3Ga!iO(CH2l3NHz ■ ■

.34

втором атоме углерода галактозы на синтетическом пути от (15) к (20) подтверждено данными спектроскопии

Гликозилироввнием производного (20) бромидом Са1Вг в присутствии цианиде ртути синтезировали защищенный дисахарид В (26) с выходом 80%, гликозилироватшм при помоши СаШ3С1 в присутствии карбоната и перхлората серебра - защищенный дисахврид А (22.) с выходом 77%, фукозюшровавием бромидом ГисВг в' условиях галоид-ионного катализа - защищенный даахарид (29). ■ *

Снятием защит обычными . методами синтезированы свободные диса-хариды А (24), В (27) и Риса1->ЗСа)(31-*Озр (33). Однако, также как и в случае гвлактозного производного (15) дезацетилирование дисехвридов (22), (26), (29) было затруднено- Так выход на стадии деэацетилирования' дисахарида (26) составил' лишь 58%. При дезацетили-ровании производного (29) тоже наблюдалось частичное' снятие трифторацётильной защиты,■ поэтому реакцию, не доводя до конца, остановили, реакционную смесь дебензшшденировали и хроматографией на силикагеле выделили 40£ производного (30) и 20% - (31). Удаление защит в соединении (21) проводили в следующей последовательное™: дебензили дотирование, гидрогенолиз,. ацетилированиё, дезацетилирование. При этом выход полностью ацетилированного производного (22) составил 855», дезацетилирование дисахарида (22) по Земплену (каталитическое количество металатв патрия, 3 ч) привело с количественным выходом к дисахарнду (23). Положение ацетильной группы в дисахариде (23) подтверждено спектроскопией ПМР.

Сложность удаления ацетила при втором атоме углерода * р-гликозидов галактозы отмечалась радом исследователей. Во всех описанных случаях галактоза ■была также алкилированной или гликозилированной по третьему . гидроксилу. Отсутствие шцинальвых гидроксилов в таких' производных может объяснить повышенную стабильность ацетила при втором атоме галактозы. В дальнейшем удаление ацетильной и. трифторацетильной груш проводили одновременно -на стадии получения аминопропилгликозидов.

1.3. Глякозилированиа' диола. Синтез гругоосаацифэтеских диеахарадов Л а В, и нэприродиых аналогов триевхарадов А и В

Гликозилирование диола (2) привлекало возможностью сократить количество стадий в синтезе дисахаридов А. и В.-

Возможность селективности, а-гликозилирования • диола (2)

предполагалась на основании следующих известных фактов: I) галак-тозаминирование похожего диола, защищенного трисахарида Н(типа 1) шло в положение 3, причем а-стереоселективно, 2) гликозилирование диолов с соседними гидроксильными группами, как правило, иде. значительно легче, чем производных с одной незащищенной гидроксильной группой. Однако, в данном случае селективное гликозилирование не дало ожидаемых результатов.

Так, галактозилирование диола (2) . одним эквивалентом баШг в присутствии цианида ртути привело к смеси дисахаридов (35), (36), (37 > (схема 3) с низким суммарным выходом (34% на прореагировавший диол). Выход целевого защищенного дисахарида В (35) составил 22%, дисахарида с а1-2 связью (36) - 8,5% и дисахарида с §1-2 связью (37)- 3,5%. Структура полученных дисахаридов однозначно вытекает из данных спектров ПМР.

„Гликозилированием диола (2) избытком (}а1Вг в присутствии циаридй ртути синтезировали , трисахарид с двумя соседними а-галактозилышш остатками (38). Низкий выход (29%) трисахарида связан с трудностью его выделения из сложной реакционной смеси.

Гликози-шфовотие диола (2) 1 экв. Са1И3С1 в присутствии • карбоната и перхлората серебра привело к получению защищенного дисахарида А Г41) с выходом 34%, выделено также 23% дисахарида (42) с а1-»2 связью между моносахаридными звеньями и 12% трисахарида (43). Гликозилированием диола (2) избытком СаШ3С1 в тех же условиях синтезирован трисахарид .(43) с двумя соседними а-гликозильными остатками, выход 50%; с незначительными (<5%) выходами выделены также трисахарида (44) и (45), в которых по данным ПМР-спектроскошш одно из 2-8зидэ-3,4,6-три-0-ацетил-2-де-зокси-0-галактопиранозных звеньев имеет а-, а второе - р-копфигура-цию гдакозидной связи, положение этих связей (0-2 или 0-3) определено не было.

Гликозилирование диола ■ (2). во всех рассмотренных случаях, сопровождалось образованием сложных реакционных смесей, трудоемким их разделением. Необходимость рехроматографий приводила к потерям . вещества и снижзнию выходов. Таким образом, селективное гликозилирование не позволяет разработать препаративных подходов к синтезу ■ дисахаридов (24) и (27!).

1/31*

АсО;

АсО 0А=

1421 И> = Н (42а) Я1 =Ас

^БаМЮЩзМ«

Схема3

Л

1411 в'=н ШаЖ'-Ас

135) в'=Н |ЗМИ'=Ас

^ с

£

В20 ОМ

136) Р1 =н 36а) .?*Ас

087.1

1371

|ЗЛт'=Ас

АсО\

05р

АсО 0 Ас

И31 )СН№

(ИМАс*!—2,

I I

^¡ЗДОЕН^зМНЯ

И6|Н.С0СР3

1471*1« у*

АсО АсО'

«3

АсО^Г^ '

АсО ОАс

1441.1151 зр •1СН21з»СОСРз

" О

АсО}---

+

-101.4. Модификация одягосахзридных гаптенов 1.4.1. Получение аминопропилгликозидов олигосахарадов

Действием анионита в ОН'. форме на И-грифтроацетильные производные с количественными выходами получены следующие аминопропилгликозшш олигосахаридов:

С.а1а1 -3 (1\1са1 -2 )0а1р1 -ОССБ^ )3Ш2' (9)

СаШАса) -3 (1\1еа1 -2 )(3а:ф1 -0(С1^ . (12)

^аса172Са1р1-0 (СН^ )3Ш52 (19) %

СаШАса1-ЗСа1Р1-0 (СН2 )3ЯН2 (25)

Са1а1 -ЗСаХр1 -0 (СН2 )3Ж1р (28) %

РисаЬЗСагрЬО^)^ (34) »«ц

Са1а1 -2 (Са1а! -3>Са1р1 -0(СН2 (40) в11ке

Са1а1 -2 (Са1а) -3 )Са1|31 -0(СН2 . (47)

Свободная аминогруппа открывает широкие возможности для дальнейшей их функционализации, а также конъюгации олигосахаридов с полимерами и иммобилизации на активированном твердом носителе с" цельщ получения неогликоконъюгатов и иммуносорбентов.

1.4.2."Синтез биотиншироаанных производных и производных с удлиненным спейс8роы

. Взаимодействием, аминопропилгликозидов с пентафторфениловым эфиром ' биотипа получены биотигоишрованные производные (48), (49) и (50) с выходом 75, 72 и 6в% соответственно.

■ Реакцией аминопропилгликозидов с 4-нитрофенилов1Ш эфиром Н-трет-бугоксикарбониламинокапротовой кислоты с выходами Слизкими к 80% синтезированы пройзводше с удлиненным спейсером (51) и (52). Удаление трет-бутоксикарбонильной группы 85% муравьиной кислотой с количественным выходом привело к производным (53) и (54), которые, наряду и производными (9) и (12), бЫли использованы для синтеза иммуносорбентйв. НЫ Ж

Са1КАса1~Заа1§1-0(СН,)оШС0(СН5Ь-Н 9 (48)

Са]к1-3(Риса1-г)Са1?1-0(СН2)зШСО(СН2)4-Ср (49)

-11 и

СаШса1-3(Риса1 -г)аа1Э1-0(СЯ2)3КНС0(СНг)4-У (50)

Св1а1-3(Риса1-2)Са1р1-0(СН2)зШС0(СН2)51ШН В = С00С(СН3)3 . (51)

И = Я (53)

СаШоа1-3(?иса1-2)Са1р1-0(С^)зШСО((И2)5Ш К=СООС(СН3)3' (52)

И = Н (54) 2. ШОГЛЖОКОШИГА'ГЦ; СИНТЕЗ. ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ

Синтетические аналоги гликоконтлогатов - неогликопротеины, неогликолйпиды, псевдололисахариды имеют широкую область применения: получение и характеристика поли- и моноклоналышх антител, изучение специфичности лектинов, выявление углеводсвязываюших Сел-ков на поверхности клеток и другие. Одно из главных преимуществ применения синтетических гликоконъюгатов - это возможность создавать молекулы с зарайее запрограммированными свойствами - растворимостью, молекулярной массой, плотностью лигандов, бисдеградируе-мостыо.

Нами разработан методически простой, и в го же время универсальный подход к синтезу разнообразных неогликоконшгатов, построенных по одному плену: к лоливкриламидному кору присоединены через спейсер углеводные группы, а также дополнительные неуглеводные лиганды (литая, биотин и т.п.).

2.1. Синтез неогликоконыогагов

Лля синтеза полиакриламидных производных углеводов (псевдополисахаридов) ранее применялась стратегия, основанная на введении в углевод одефиновой группы (аллильной или вкрилоилыюй) и последующей сополимеризации с. вкриламидом. В данной работе исследоввн подход, основанный на реакции конденсации поли(4-нитрофенил8крила-та), то есть полностью активированной полиакриловой кислоты, с ами-ноалкилгликозидями (схема 4). Одновременное или последующее введение других (неуглеводшх) аминолигвндов позволяет придавать полимерной молекуле необходимые дополнительные (функциональные и физические) свойства- В работе кроме псевдополисахаридов (0-эр)п-РАА были получены неогликолипиды (0-яр)п-РЕп)-РАА (производные с дошлвитсдыто иммобилизованным фосфатидилэтанолвминсм, РЕ), а также зонды, содержащие» помимо- углевода, биотип (П-ар)п-В1о^-РАА или флуорсснгин (0-г;р)п-РАт-РАЛ

Схеыв 4

СОО СОО СОО

ф Ф ф

1) цои-ш.

2) Шзaq '

2

СОШ!о СОШ СОШ,

¡НЮ

N02 ы02 N02

6 - остаток сахара И - неуглеводный лиганд

Псевдополдсахариды. ПолиакриламидНые производные олигосахари-дов (псевдополисэхвридн) получали конденсацией поли(4-нитрофенил-акуи'лата) и аыкнопропилгликозида в ШР или ЮБО. Б пределах 30-35^-ой модификации реакция проходит количественно. Замещение в пределах 15-20% идет количественно при комнатной температуре и в отрутствии катализатора. Для Солее высоких степеней замещения применяли нагревание до 40-Ь0°С и катализ триатиламином или диизопро-пилэтидамином. В ШР реакция идет быстрее, чем в СИЗО. Полноту присоединения лиганда контролировали ТСХ, проявляя непрореагиро-вавший амин нингидрином.

После тг-'о; как к полимеру присоединены все необходимые СЖ,. избыточные активированные группы превращали в амидаше действием ?,-ампнаэтанола или аммиака» Эти амины, небольшого размера и взятые в 10-100-кратном избытке, превращают активированные эфиры в вмиды количественно. Очистка кэнъюгата сводилась к отделению его от нитрофенола и избытка Ш3 (этвнолаыина) и проводилась при помощи гель-фильтрации. В ряде случаев, например, когда конъигат использовался для активации планшетов или нитроцеллюлозных мембран, вообще не требовалось никакой очистки, конъюгат только разбавлялся подходящим буферный раствором. Такий подход позволяет очень быстро получать серии конъюгатов с различным содержанием углеводных лигандов, • когда необходимо, например, исследовать ■зависимость связывания углеводсвязывающего белка с коиыогвтом от апитопн^Ч плотности лиганда на последнем.

ЭТ/м методом получены полиакриламидные производные всех синтезированных олигосахвридов с различной степенью замещения - от 5 до 35%.

Неоглгосаяипиды и зонды. Синтез неогликолипидов и зон нов включает дополнительную стадию ' - присоединение к акриловому кору Лдо.,, 1'де Я2 - это дополнительный (неуглеводный) лиганд.

Пвогликолипшм синтезировали, присоединяя к полимеру вслед зп

углеводным лигандом (или одновременно с ним) фосфатидилэтаноламин, причем присоединение РЕ из-за наличия в нем фосфатной группы требовало обязательного присутствия в реакционной смеси диизопропил-этиламина (или триэтиламина). Обычно молярное соотношение исходных реагентов было следующее: пмшюалкилгликозид/РЕ/мономерное звено = 1:1:6; в тех случаях, когда нужно было повысить растворимость в нешдярннх органических растворителях и понизить растворимость в воде, соотношение бралось 1:2:10. Во всех изученных примерах наблюдалось количественное присоединение кек литанда тек и РЕ.

Зонда. Для получения углеводных зондов - реагентов на угле-водсвязывающие белки (лектини, гликозилгрзнсфразы, и, возможно, гликозидазы) в полимерную молекулу кроме сахарида вводили биотиновую метку при помощи аминогексилпроизвсдного (i-биотина BlotNH^. Соотношение GOCHgCHgCI^NH^/BlotN^ в синтезе зондов было выбрано равным 4:1. Относительно низкое содернвние биотиновых групп, как оказалось, заметно не влияет на растворимость зонда в воде, и в то же время оно является вполне достаточным для обнаружения связавшегося зонда при помощи евидивового конъюгата.

Аналогичным образом синтезированы флуоресцентные зонды, содержащие в качестве метки флуоресцеинамин. Соотношение СО (СНр )3NHr,/FA также равно 4:1. Эти зонды предназначены для изучения процессов взаимодейсг :ия углеводов с поверхностью клеток цитофлуориметри-ческим методом.

2.2. Примвнаниэ нвогликоконыегатов 2.2.1. Применение неогликолшидов для получения антител к углеводным антигенам и выявления природных гликолмшдов I и В

В работах S.Batornorl приведены примеры успешного использования в качестве иммуногенов природных гликолипидов, сорбированных на Salmonella Minnesota. Мы показали, что макромолеку-лярные неогликолипиды, (G-sp^-PI^-PAA, также легко встраиваются в бактериальные мембраны. Сорбированные на Salmonella miroiesota неогликолипиды, несущие гаптепы "tri' Btri и Дисахарид Fuca1-3Galß1использовались л качестве иммунотаюв при получении ыоноклональыых антител, что приводило ч высокому специфическому иммунному ответу у мышей.

Heofликолипиды с групповой специфичностью крови А и В, содержащие повышенное по сравнению с обычным количество РЕ (чтобы их растворимость в органических растворителях была близка к растворимости природных гликосфинголипидов), использовали , в качестве модельных соединений для разработки тест-системы, выявляющей природные гликолипиды А и В.

£.2.2. Использование биотинилированного Ад^-зоада для изучения специфичности дактиле из Batea frondosa

Batea frondosa - растение из семейства leguminoaeas (бобовых), дентин., из его семян обладает гемагтлютинирующей активностью. Для изучения тонкой специфичности этого лектина был использован зонд с биотином в качестве метки и А-дисахаридом в качестве1 специфической части (Agj-PAA-Biot). Разработан следующий вариант твердофазного анализа: лектином покрывали лунки полистироловых планшетов, взаимодействие иммобилизованного лектина с зондом инги5ир<?вали серией моно- и олигосахаридов, а степень ингибирования этого взаимодействия оценивали по последующему связыванию зонда с конъюгатом авидин-пероксидаза. Выбор А-дисйхаридэ в качестве связывающего лигандв в данной тест-системе определился его активностью при аффинном выделении лектина. Описанный метод показал высокую воспроизводимость результатов, низкое фоновое значение сигнала и достаточную чувствительность (сильные ингибиторы могут использоваться в концентрациях порядка 1 мкг/мл). В то же время, величины относительной ингибирующей способности моносахаридов, полученные в данном методе и в реакции торможения гематтлютинации, практически совпадали.

2.2.3. Получение универсальных сывороток антирезус с помощью

псевдополисахэридоа с групповой специфичностью крови А и В

Проблема получения универсальных сывороток ангирезус (анти-ВЮ, то есть сывороток, не содержащих а- и р-изоагглютининов, до сих пор окончательно не решена. Иммунные цоноры группы АВ(TV) составляют только В% популяции в СССР, причем не все доноры из rrnix 8% имеют высокий анти-Ríi титр антител.

Нами изучена возможность использования растворимых РАА-конь-

югатов (псевдополисахаридов с групповой специфичностью А и В) для нейтрализации анти-А и анти-В антител в сыворотках крови, содержащих одновременно анти-А (В) и шти-ТШ антитела. РАА-конъюгаты с дисахаридными лигандами значительно уступали по нейтрализующий способности трисахаридным конъюгатам. Особенно существенны различия между ли- и трисахвридными конъюгатами в случае иммунных сывороток. Эпитопиая плотность трисахаридного лиганда а приделах 5-30& существенно не влияла на нейтрализующую способность псевдополисахарида. Для нейтрализации гемагглютининов титров Т:8 -. 1:128 требуется 2-С мг трисахаридного РАА-конъюгата на I мл сыворотки, снижения 8нти-№ титра при этом не наблюдалось.

Таким образом, хруппоспецифические псевдополисахариды А и В могут быть использованы для нейтрализации а- и р-гемагглютинипов с целью экспрессного получения универсальных антирезусных сывороток из групповых сывороток ангирезус.

2.2.4. Использование псевдтаодисахарздов для изучения зштопной специфичности моноклоналыза антител

Псевдополисахариды, несущие олигосахаридпые детерминанта антигенов А, В. Н и их структурных вналогов, нарядусо свободными олигосахаридами были использованы для . изучения эпигопкой специфичной., трех ноноклопальных антител (НА) анти-А: ЗР9, 441'Э, 1ШО, а также десяти анти-В НА.

Показано, что все десять изученных анти-В НА взаимодействую? с грушюспецифической В-трисшаридной детерминантой независимо от способности дискриминировать серологические варианты внутри группы В (т.н. "сильные" и "слабые", варианты В-антигенов). Использование панели ПАА-конъюгатов с количеством Иммобилизованного В^ 5, 10, 15, 20, 25, 30 и 35% позволило выявить чувствительность ряда антител к эпитопной платоат лиганда.

При изучении специфичности анти-А МА выяснено, что МА 1НШ наибольшее' сродство проявили к тзтрасахериду А (тип 3). а МА ЗР9 -к детерминантиому трисахариад А Наиболее интересными

оказались МА 44Т9. Ипгибирование связывания антител 44Р9 с природам антигеном . синтетическими олигосахаридами показало максимальное сродство этих МА к Однако, трис.ахарид

Са1Щсос1-3(Риса1-2)Са1р1-Озр. весьма далекий от природного антигена аналог трисахврида А (в которой а-т,-фукозильный остаток

заменен на a-D-GalNAc), обладал близкой к Atrl активностью. По-видимому. максимальный вклад во взаимодействие Atr;¡_ с антителами 44F9 вносит фрагмент GalNAca1-3GalfS, в то время как фукоза вносит свой вклад не столько за счет непосредственного взаимодействия с МА, сколько путем увеличения конформационной жесткости фрагмента Gal№ca1-3Galfí, уменьшая подвижность моносахаридов по связи «1-3. В этом смысле моносахаридные остатки а-Ь-Puc и a-IMIalKAc при 0-2 могут оказывать сходное влияние, в именно - делать ганформационно более жестким фрагмент GalNAco.1 -3Gaip.

6. СОРБЕНТЫ С ГРУППОВОЙ СПЕЩШЧНОСТЫО КРСМ А И В

Сорбенты с олягосахаридшш лигандами, являющимися антигенными детерминантами групповых веществ крови системы ABO, предназначены для выделения и изучения специфичности поли- и моноклональных антител, выделения и характеристики специфичности лектинов, для удаления гемагглютинйнов из сывороток' и других препаратов крови при получении различных типиоующих реагентов, лекарственных средств, а также при трвнсшантациях костного мозга и органов.

При создании сорбе-нтов со специфичностью групп крови мы рассмотрели влияние матрицы и иммобилизованного лиганда на активность сорбентов.

3.1. Сорбенты вэ основа МПС, модифицированного поли (4-штрофенилакрилатом)

Иммобилизация лигвндов на МНС, модифицированном поли(4-ни-трофенилакрилатом)*. идет количественно при использовании 2-15 мкмоль лиганда на1 г ШС. Иммобилизацию проводили в MF или DMS0 в присутствии триэтиламина при 20-3?°С, избыточные 4-штрофениль-иые группы удаляли 2-этанолвмином. Все сорбенты, полученные на основе модифицированного НПО, выдерживали 10-12 црклов регенерации без потери активности и не теряли" сорбционной активности при хрвнстши более 2 лет.

Сорбеют с жтосатрийныя мютдом. Активность сорбентов с a-N-гщетилгалактоэамином в качестве лиганда оказалась очень

* Ш1С - макропористое, аминопротышрованное стекло; активированное МПС 4, ,1нзрнботапо А .К.Иванович' в лаборатории проф. В.П.Зубова, ИБХ ЛН СССР.

низкой. Полного удаления антител из сывороток не происходило и

после проведения повторной сорбции. Попытка улучшить активность

сорбентов за счет гидрофобных или полярных взаимодействий антител

с поверхностью носителя к положительным результатам не привела.

Сорбент с ди- и трисатридныни лиеанВсиш,. Значительно лучшие

результаты по сорбции гемагглютииирующих антител получены прп

использовании в качество лигандов • аминопропилгликозидов

дисахаридов АЙ1 (25). (28) и трисахаридов (12) и В^ (9).

Сравнение свойств сорбентов, содержащих различные количества

иммобилизованных лигандов, показало, что максимальную активность

из дисахаридных сорбентов проявили ШС-А^ и МПС-В^*. Увеличение

количества иммобилизованного лиганда до 15 мкмоль/г к улучшению

* 1 п

сорбции не привело. Из трисахаридных сорбентов близкая к ШС-А^ и ,

активность наблюдалась у и МПС-А^г1. Указанные

сорбенты с ди- и трисахаридными лигандами по . адсорбции .

гемагглютииирующих антител из сывороток не уступали образцам

БупвогЪ А и БупвогЬ В (СТюпМотеа, Канада). Значительно меньшая

10 '2 активность сорбентов МПС-В^, по сравнению с МПС-Б^г1 в отношении

МА выявлена при изучении эпитопной специфичности анти-В МА.

Сорбенты ШС-Вщ и ШС-А^ и ШС-А^г1 показали вы-

сокую специфичность: сорбенты В не снижали или снижали не более чем на одн ступень титр анти-А сывороток и наоборот; снижение титра антирезус-анмтел в сыворотках не происходило. Эти качества сделали возможным применение сорбентов для получения универсальных сывороток антирезус.

Иммобилизацией олигосахаридов (53) и (54) (см. раздел 1.4.2.) получены сорбенты, в которых трисахариды А и В присоединены к • матрице удлиненным спейсером. Увеличение активности сорбентов, по сравнению с МПС-В^г1 и ШС-а|г1, при этом не наблюдалось.

Аминонропилгликозиды трисахаридов оказались наиболее подходящими лигандами для получения сорбентов с групповой специфичностью крови: лучшие сорбционные свойства, малое количество лиганда, взаимодействие как с поли-, так и с моноклональными группоспецифическими антителами. Короткой

** В принятом обозначении сорбентов, например. ШС-3^, подстрочный индекс ((11, гг1) указывает на иммобилизованный олигог.ахарид, а надстрочной индекс (2, 10 ит.д.) на количество иммобилизованного лиганда, мкмоль/г.

спейсерной1 группировки между олигосахаридом и матрицей оказалось достато-шр для достижения максимальной активности сорбентов, по-видимому, гибкий полимер, покрывающий МПС, обеспечивает подвижность лиганда, выполняя роль спейсера. , -

Гежосовлиеатшые сорбент. Проблема преодоления несовместимости по системе АВО крови донора и реципиента при пересадках органов и костного мозга может быть решена путем создания гемосовместимых • сорбентов для' адсорбции гемагглютинирующих антител непосредственно из крови, без предварительного удаления форменных элементов (клеток) крови.

Нами была изучена .возможность применения сорбенте ШС-Д^, а также модифицированных, - бычьим сывороточным альбумином -ВБА-ШС-а!^, . гепарином - Г-ШС-А^г1 и гепариноидом-С - ГС-№С-А^г1 - сорбентов для удаления зитк-а штител из цельной крови. Активность всех сорбентов была проверена на ряде донорских сывороток. Лучшими свойствами обладали МПС-а|г1 и Г-МПС-а^. они и были использованы для удаления антител из крови. Полученные предварительные результаты по^' гемосорбции показали, что эритроциты, лейкоциты, тромбоциты остаются в норме после длительной инкубации с сорбентом (3 ч), что .дает надежду на разработку гемосовместимых сорбентов, полученных/на основе покрытого гидрофильным полимером МПС..

3.2; Влияние матрицы на активность сорбентов

Сорбенты, полученные на основе модифицированного полиальдегид-декстраном МПС, показали значительно меньшую сорбционнуго. активность, чем сорбенты на основе НПС, модифицированного полиакрила-том. Иммобилизация лиганда непосредственно на носитель (иммобилизацию аминопропилгликозидов проводили по эпоксидным группам модифицированного сили,чагеля) ведет к полной потере сорбиионных свойств. По-видимому, это происходит в результате того, что значительно менее гибкий, чем полиакрилат, полисахарид уже не обеспечивает необходимой для связывания' с антителами подвижности антигенной детерминанты, а непосредственная иммобилизация лигандв на матрице (в отсутствии "буферного" полимера) приводит к ситуации, когда лиганд становится недоступен пля антител.

Тагам образом, приведенные выше результаты показали, что 1) лигвндвми, которые обеспечивают наилучшее взаимодействие как с пог ли-, так и с моноклоналышми группосперифическими антителами являются и 2) лучшей матрицей, при использовании в качестве

лигандов ачинопропилгликозидов олигосахаридов, является модифицированное полиакрилатом МПС. Гибкий полимер, покрывающий носитель, выполняя роль спейсера, обеспечивает необходимую для взаимодействия с антителами подвижность лиганда; 3) возможно создание гемосовмеми-мых сорбентов па основе покрытого гидрофильным полимером МПС.

6. ЛАТЕКСЫ, ШСИБШМЗИРОШШШВ 1УУШ10СПЩМЧВСКШ ' АНТИШШ; СИНТЕЗ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ ШШРОШШЯ АНТИ-А И АНТИ-В АНТИТВЛ И АНТИИВОРОТО

Для оценки пригодности выпускаемых анти-А и анти-В антител и антисывороток а настоящее время используют эритроциты человека, которые не поддаются стандартизации", поэтому актуальной является задача разработки стандартных- реагентов - для < типирования группоспецифических антител и антисывороток.

Перспективным вариантом решевия этой проблемы, является замена эритроцитов синтетическим эквивалентом. В ,качестве матрицы при его создашад были использованы окрашенные полиакролешовне латексные частицы* (в дальнейшем просто латекс). Грулдаспецифические латексы конструировали двух типов: 1) проводили' иммобилизацию ачииопропилгликозидов трисахаридов А.^ и В^ на вшодифицирбванном латексе; 2). сенсибилизацию модифицированного бычьим : сывороточным альбумином латекса проводили полимерными формами, трисахаридов А' и. В: п6ли(4-нитрофенилакрилатом), в котором, 30% нитрофенильных груш подверглось замещению на соответствующий- грисахаридный . диганд (А^ или Вгг1), а 70% осталось незамещешшми и пригодными для двльнейией конденсации.-

Полученные группоспецифические латексы спонтанно агрегировали при контакте с изучаемыми сыворотками и поэтому не' могли быть применены в. качестве "синтетических - эритроцитов". Проблема исключения нежелательного контакта сывороток с' латексаыи была-решена в предлагаемой, ниже твердофазной тест-системе.

Тестируемые сыворотки инкубировали о синтетическими антигенами, предварительно иммобилизованными на 11-образяых лунках микропланшета. После промывания плышета в лунки добавляли суспензию группоспецифических латексов (А или В) • и контролировали

.*~~Йшолровадась~~латёксы7"пол уч5тыё~~В7В7Л^йным7"~лаб5раторйя проф. В.П.Зубова, ИБХ АН СССР.

связывание частиц с адсорбированными антителами. Результат учитывал^ визуально: при отрицательной реакции на дне лунки формировался точечный осадок, а при положительной - конъюгаты оседали на дно лунки в виде зонтика или кольца. Характер взаимодействия в этом случае похож на агглютинацию.

Определение титра анти-А(В) сывороток разработанным методом характеризуется высокой воспроизводимостью результатов, а полученные в работе грушоспецифические латексы обладают всеми необходимыми свойствами, чтобы стать стандартом для типирования различных АВО-реактивов.

ВЫВОДЫ

•1. Синтезированы спейсерированные трисахериды Galci1-3(Fuca1-2)Gaip-и GaIffilca1-3(Fucat-2)GaIp-, являющиеся детерминантами антигенов групп крови В и А.

2. Синтезированы' спейсерированные дасагаридные фрагменты GalNAcal -3Gaip-, Fiical-2Gal|3-, Gala I -3Gaip- трисахвридов А и В, a также их неприродные трисахеридные аналоги, содержащие два а-галактозпых ; или два а-галактозвминяых звена: GalNAcal-3(GalllAcal-2)Gaip- и Gala1-3(Gala1-2)Gaip~.

3. Реализован новый универсальный подход к синтезу неогликоконъюга-тов; конденсацией гаптенов с поли(4-нитрофенилакрилатом) получены псевдополисахариды, неогликолипиды, биотин- и флуоресцеин-содержащие зонды на полиакриламидной основе.

4. Показано, что псевдополисахариды и полимерные зонды являются удобными реагентами для изучения эпитопной специфичности монокло-нальных антител и лектинов; полимерные неогликолипиды проявили сильные иммуногенные свойства.

5. Группоспецифические псевдополисахариды А и В могут быть использованы в гематологии с целью экспрессного получения универсальных сывороток янгирезус.

G. Иммобилизацией олигосахаридов А и В на макропористом стекле получена итупосорбепт, нашедшие применение в гематологаи для получения универсальных сывороток антирезус.

7. На основе • синтетических антигенов и лвтексных частиц синтезированы реагенты и разработана тест-система для типирования шти-А и амти-В сывороток и антител.

Основные результата диссертационной работы изложены в следующих публикациях:

1. Е.Ю.Корчагина, Н.В.Бовин. З-Ашшопропилглшшзиды дисахаридов в качества лигандов иимуносорбентов для связывания грушюспецифических- антител анти-А и анти-В. Авторское свидетельство JS IGI6924. Бвл. № 48. 1990.

2. Бовин Н.В., Еайрамова Н.Э., Землянухияа Т.В., Корчагина E.D.. Андриацшй Л.И., Нягкова И.А., Иванов А.Е., Земляков А.Е., Сухенко Л.Т., Ющенка А.А., Зубов В.П. Способ получения, искусственных антигенов. Авторское свидетельство № IGI4202, 1990.

3. Бовин Н.В., Зотиков В.А., .Иванов А.Е., Корчагина, E.D., Мягкова 11.А., Чагаашвили Ц.Н., Зубов В.П., Пименэва Г.Н. Способ получения иимуносорбентов ■ для связывания грушюспецифических антител а- и р-агглкшгаинов. Заявка на авторское свидетельство » 4341034, 9.02.1988. Положительное решение 28.12.1389.

4. N.V.Boyln, N.E.Byramm, T.V.Zeffllyamffilra,' E.Yu.Kor-chagina. An aproach to carbohydrate antigen engineering. Abstracts oi 5th European Synposlum on Carbohydrates. Prague. Chechoslovakia, 1989, C-72.

5. П.Н.Чагиашвили, Е.В.Корчагина, E.А.Зотиков, Н.В.Бовин. Иммуносорбентн для получения универсальных анти-Rh сывороток. Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Современные направления создания медицинских диагностикумов". Москва. 1988. С. 73.

. G. T.V.Zemlyanukhlna, E.Yu.Korchaglna, K.B.Byramova, N.V.Bovln. Synthesis оГ А, В, H (type 3) oligosaccaride3 and their fragments. - Abstracts of 5th iuropean Symposium on Carbohydrates, Prague, Chechoslovakia, 1989, P. A-47. -

7. O.E.Galanina, A.B.SoroKin, M.H.Nikolskl, E.Yu.Korchaglna, N.V.Bovin. The carbohydrate specificity, oi the monoclonal antibody against EGF receptor of the A431 cells. - Abstracts of ' 5tlr European Symposium on Carbohydrates, Prague, Chechoslovakia, '1989, P. C-71.

8. Ц.Н.Чагиашвшга, E.А.Зотиков, Е.Ю.Корчагина, Н.В.Бовин. Получение универсальных сывороток автирезус с помощью иммуносорбентов А и В. - Гематология и трансфузиология. 1989. $8. С. 56-58.

9. M.Bovin, N.E.Byrarova, T.V.Zemlyanukhina, E.Yu.Rorchagl-na. Synthesis and properties of polymeric neoglycoconjugates. -

Abstraets' oí XVtli International Carbohydrate Syuiposlum, Yokohama, 1990, BI^O. P.287.

10- O.E.Galanina. T.V.ZemlyanuXhlna, E.Yu.Korchagina, N.V.Bovin. Epitope specillclty oí hemagglutlmtlng monoclonal antibodies. - . Abstracts of XVth International Carbohydrate Symposium, Yokohama. 1990. B040, P.216.

11. Е.Ю.Корчагина. О.Я.Волкова, Ю.В.Лукин, Н.В.Минеева, В.П.Зубов, Н.В.Бовин. - Иммунодисперсная тест-система для стандартизации типирующих реагентов системы ABO. Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Современные напрааления создания медицинских диагаостикумов". Москве. 1990. С. 52.

12. О.Е.Галанина, Е.И.Дерюгина, М.И.Лапеяков, А.Е.Носырев, Е.Ю.Корчагин?, Т.В.Землянухина, Н.В.Бовин. Эпитопная специфичность геыагглютинирущих ыоноклоналышх анти-А-антител. ' - Биоорган, •химия, 1991, т.17, С.343-352.

13. O.E.Galanlna, E.I.Deryiigim. T.V.ZemlyanWúilna, E.Yu.Korchagina. N.V.Bovin. Fine epitope specificity of 3 hemag-glutlJiating anti-А/ monoclonal antibodies. - Abstracts of Xlth International Symposium on Glycoconjugates, Toronto, Canada, 1991. CIycoconjugate J. 1991. V.8. №3. P.177.

14. О.Е.Галанина, Е.И.Дерюгина, Н.И.Оловникова, А.Е.НУсырев. М.И.Лапенков, Н.Б.Чекнева. Т.В.Землянухина, Е.В.Корчагина. Н.В.Бовин. Эпитонная специфичность гомагглютинируюших моноклоналышх анти В антител. - Пиоорган. химия. 1991, т.17.