Неогликоконъюгаты: синтез и применение в гемо- и онкодиагностике тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РГБ ОД

/ Я МАЯ №43 российская академия наук ' 0 '|1'и|ИНСТИТУТ- БИРОРГАНИЧЕСКОИ ХИМИИ, ИМ— Н.Н ..ШЕЫЯШНА

и П.А. ОВЧИННИКОВА

На правах рукописи

БОВИН Николай Владимирович

НЕОГЛИКОКОНЪЮГАТЫг СИНТЕЗ И ПРИМЕНЕНИЕ В ГЕМО— И ОНКОДИАГНОСТИКЕ

02.00.01 - Биоорганическая химия, химия природных и Физиологически активных веществ

Диссертация на соискание ученой степени доктора химических наук в форме научного доклада

Москва - 1993

¡-¿¡йоти выполнена в Институте бпоорганпческоп хш.ши им. (.1.1.1. Шемякина н Ю.А.Овчинникова Российской Академии Наук

официальные оппонента:

Э.В.Дятловиикая

локтсго химических наук

?. едун: ал оргаюгеот; я:

Институт органической ' химии им. Н.Д.Зелинского

РАН

"эти?;- состоится 12 мал 19ЭЗ года в !0 часов на заседании специализированного совета Л.002.35.0! при Институте биоорганической "иміш им. ПЛ.'. .Шемякина РАЯ по адресу: 11 ”ЗТ 1, Москва В-437, ул.

Пиклухо-Наклал 16/10. '

Автореферат разослан 9 апреля 1993 г.

0*п?-?тзчо кг полігогвическог участке КБ> РАН Т/эг* 120 Эка. сссетн?*

ОБШЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

стуальность__проблемы. Процессы межклеточного узнавания и внутрикле-)чной регулировки в значительной степени обусловлены углевод-белко-п-га и углевод-углеводными взаимодействиями. Практически все функ-1И, постулированные, для гликоконъюгатов 10-20 лет назад, подтвердись. Углевод-опосредованная адгезия является одной из стадий проие-:ов инфицирования, клеточного иммунного ответа, фертилизашга. диф-:ренцировки, контроля роста и миграции клеток, онкотрансформации и ¡тастазирования. Биомолекулы, вовлеченные в названные процессы, 1еют потенциальное медицинское применение в качестве противоинфек-юнных, противовоспалительных, антиаллергенных, контрацептивных, ¡отивоопухолевых средств, а также в диагностике.

Особенностями гликоконъюгатов (в наибольшей мере - гликспротеи->в), осложнлюшими их изучение и медицинское применение, являются ¡терогенность и быстрая изменчивость in vivo (в ответ на внешний ¡и зщ трбг'т’ий с’.т^а.”). В свл?’*. с *т незриенчму*’ *>лп*. л

учении углеводов и углевод-связываюших белков играет химический итез, позволяющий нарабатывать вещества в гомогенном виде и необ-|димых количествах. Химический синтез, в отличие от выделения и зиматического синтеза, имеет еше одно преимущество - дает возмож->сть модифицировать биомолекулы в нужном направлении, если это тре-ется для усиления биологического эффекта, выбора одной активности i их спектра, придания устойчивости и т.д.

Углеводные группоспецифические антигены крови групп АВН, Le, Р, швлекают внимание исследователей тем, что, с одной стороны, широко юпространены, являясь мажорными компонентами эритроцитов и многих >угих клеток, а . с другой стороны, их специфическая функция до сих >р не выяснена. Кроме того, группоспецифические антигены структурно глзки (или идентичны) некоторым дифферениировочным. адгезивным и [ухолевым молекулам. Поэтому актуальной задачей является синтез |уппоспеиифичь.л;их антигенов крови, их опухоле-ассоциированных риэнтов, структурно родственных дифференцировочных маркеров, шгментов и аналогов. Актуальной является также разработка подходов

молекулярному дизайну названных низкомолекулярных соединений, то ть удобных методов синтеза их конъюгированных форм - антигенов, и.’.уногенов. зондов. аффинных сорбентов, - инструментов для дико-биологических исследований.

Ридов систем АНН. T.fiwiq, р. о»»™«™.» l ■

w j, раораОита удооного метода получения высокомолекулярных гликсконъюгатов (кеогликоконъюгетов) максимально широкого спектра: изучение с пх подели? углсБОД-свяпипгкютх белков - антител и ля-

1 ' • ; -|к • ------- и1;41тл ЛОЛ lki;i'J£

нормальных и опухолевых клеток; разработка диагностических. реагенте! для применения в исследовательской и практической гематологии i: онкологии.

. На^чьая_новизнй. Разработаны новые схемы синтеза группоспецифических олигосахаридов крови, в том числе пути, позволяющие получать несколько олнгосахвридов из обшего предшественника; впервые синтезированы некоторые олигосахариды и их структурные аналога. Предложен новый, наиболее эффективный из известных, реагент для создания а-га-лактозаминидной связи. Предложен метод синтеза оксазолиновых производных сложных олигосахаридов в условиях, исключаюшнх растепление наиболее кислото-лабильных гликозидных связей. В практику углевод-углеводного синтеза введены тетрагидрофуранильная и хлорацетильная защитные группы.

В качестве спейсерной группировки предложена CFgCONHCr^CHpCI^- , на многочисленных примерах изучено введение спейсерэ в начале синтеза и на завершающих его стадиях; предложены подходы к деспейсериро-ванию олигосахаридов.

Разработан новый обший и мр.тппниргки прплфг'л ----

v. ii.muuwiimjii линиоидаии; 11 ил а ид позволяет по приннипиапкнп

iii ' ‘Л:' ' ^ .. О _ - .лслог\.0лыс: пипыи-

гати. Нпод позволяет: проводить иммобилизацию лигандон па полипск количественно. }:а'ул!!р;;р':Т! нолекуллрнук' маоеу и гео;к'Т!Г' конг’п;::’: конъюгата, вводит! з?ран"г ~:.ланное о.опчг птн. л\г ам.чоь.

Предложен» (:хсг,я п.-1 vo;1 пох '"гп".'. ''И. ':,■•,!!!:•;" г:-

иммунизации мышей полностью синтетическим углеводным антигено!,1 (встроенным в Salmonella mtnnesoia); получены моноклон альны<

антитела к антигенам Lex, Le\ Ъе^, 51аЪеа. Т^.

На основе неогликоконъюгатов разработано два типа иммунофермент-ных тест-систем: 1) для изучения специфичности моноклональных антител; 2) для изучения специфичности лектинов. Изучена эпитопная специфичность моноклональных антител против антигенов А, В, Н, le, Р, а также лектинов из Batea frondosa и Msgumus fossllls.

С помощью углеводных зондов, представляющих собой конъюгаты сахаридов и биотина с полиакриламидом, выявлены олигосахарид-связывашие молекулы на поверхности гемопозтических, миелоидных и раковых клеток, в том числе эндогенные лектинн. специфически взаимодействующие с трисахэридами А и В. Показано резкое увеличение экспрессии некоторых эндогенных лектинов на опухолевых клетках, сопровождающее одновременное накопление опухоле-ассоциированных углеводных антигенов.

Практическая_значимость. В синтезе. Разработан препаративный синтез детерминантных трисахаридов групп крови А и В, позволяющий юлучать спейсерированные трисэхариды в 10-г количествах для нужд фактической гематологии. Разработан обшй, практически удобный летод синтеза неогликоконъюгатов любого типа, используемых в качест-зе антигенов в иммуноанализе (сенсибилизирующий антиген для поли-;тирола, поливинилхлориде, нитроцеллюлозы), зондов в цито- и гистохимии, аффинных сорбентов. В биоаналитических методах. Разработано 1есколько вариантов твердофазных ферментных аналитических систем уш выявления и установления специфичности моноклональных антител :МА) к углеводам, а также лектинов: 1 )прямое связывание МА с псевдо-юлисахаридом, сорбированным на пластике; 2)ингибирование связывания 1А с антигеном, сорбированным на пластике; 3)прямое связывание МА с интетическим углеводным антигеном, необратимо сорбированным на гатроцеллюлозе (варианты дст-блст и илшуноблст); 4 )ингибиторный нализ специфичности лектинов в следующей версии: лектин сорбируется ¡а пластике, а выявляется биотинилированным конъюгатом углевода с шиакриламидом (зондом). .В гематологии. Разработаны группо-пецифические сорбенты А и В для получения анти-Rh сывороток путем ффинного удаления мешающих Rh-диагностике анти-А и анти-В-антител. орбенты испытаны и применяются на 80 станциях переливания крови, ля тех же целей, получены водорастворимые синтетические вещества полиакрилэмид-связанные трисахариды А и В). Сорбенты регенерируются поэтому используются для препаративного получения

нти-Шьсывороток, а водорастворимые вещества (действующие по прин-

нипу нейтрализации янтнтг," в ряптпарс) тгрлншЯлп оя гл» оперативного (Закличссжи мгног.еннот'о - полу--» шы ;шн Kii-oabopotoK* . Разработана латексная тест-система, аяменягаяя глЛой эритроцита гтртт стппдзртпза-шш антп А и гмт С антител**. В онколога;;, ¡¡а -:н-'Ф‘ .ч::гвдач.'<л.'!Г.':0-íTiAA ойсЦИфнЧпиигью антигена томсена—Фриден—

рейха, разработана иммуноферыентная тест-система для количественного определения естественных aimi-TF-антител в сыворотке крови опухоле-ноаиелей***. Синтезироьэиы гшухоле-ассоциированные гаптенц Tí', г , ;v. г , :! (тип 3), }.>, r.j.vti .Vla¡, с гак.«

рованные зонды, содержание эти сахариды. Получены моноклональные антитела к синтетическим опухоле-ассошшрованным антигенам Ъеу, SlaLe3. Синтезированы флуоресцентно-меченые сахариды - фрагменты 0-цепей опухолевых гликопротеинов, в качестве стандартов для количественного определения данных 0-цепей. С помошью олигосах аридных зондов показана возможность дифференциальной диагностики некоторых типов лимфопролиферативных заболеваний****.

Апробаиия_полученных_данных. Результаты настоящей работы были доложены на VII и VIII Всесоюзных конференциях по химии и биохимии углеводов (Пущино 1982, Тбилиси 1987); на III и IV Советско-Шведских симпозиумах по химии и биохимии углеводов (Киев 1988, Лунд 1990); Симпозиуме стран СЭВ по углеводам (ГДР 1985); V и VI Европейских симпозиумах по углеводам (Прага 1989, Эдинбург 1991); XV и XVI Международных симпозиумах по углеводам (Иокогама 1990, Париж 1992); IX Симпозиуме по гликоконъюгатам (Торонто 1991); на XIII и XIV Конференциях по лектинам (Берлин 1991, Дарджелинг, Индия 1992), II Международной конференции по гликобиологии (Силберторн, США 1992).

Публикации. Основной материал изложен в 38 статьях и 3 рвторгжиу т.и<к т. дьствях; опугш'к.i.'1. L.piibit ci ;л;.

».Совместно с лабораторией акал. АНН Е.А.Зотикокэ, БГНЦ. Москва.

Совместно с лабораторией проф. Е.П.Зубова, ИБХ РАН, Москва, и лабораторией проф. Н.В.Минской. НИИ гематологии и перелнванияя дави. Санкт-Петербург.

Совместно с лабораторией Г.А.Ткачевой. БОНН, Москва.

Совместно с лабораторией проф. Д.Ф.Глузмана, Институт экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Кавеикого, Киев.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ .

1. Синтез олигосахаридов системы АЕН [3,7,9,12.14,25,34,41].

К данной группе относятся детермин антные трисахариды А и

тетрасахариды типов 1, 2 и 3, а также их дисахаридные фрагменты:

В,

СаШсоИ-З

5Часа1 -2 Саіаі-З

Са10

СаІЗ

Рисаі-2 СаШАсаІ -З

Са1(31-ЗС1сМс|3 РисоИ-2

Са1а1-3

Са1|31-ЗС1сМс|3 ЇЧдсаІ -2

Рисаі-2Са101-ЗСІсМсЗ СаІИАсаІ -З

ЄаІЗІ-4С1сИАср Рисаі -2

Саіаі-З

Са1|31-401сМс(ї

гисаі-2

Б*иса1-2СаІ31-4С1сЫАср Са1ЫАса1-З

Рисаі-2 Саіаі-З

Gal31-ЗGalNAcа

СаІЗІ-ЗСаІМса

(1) детершнантшй трисахарид А

(2) детерминантннй трисахарид В

(3) тетрасахарвд А (тип 1)

(4) тетрасахарид В, (тип 1)

(5) трисахарид Н (тип 1)

(6) тетрасахарид А (тип 2)

(7) тетрасахарид В (тип 1)

(8) . трисахарид Н (тип 2) '

(9) тетрасахарвд А (тип 3)

(10)

(11)

(12)

(13)

(14)

гиса1-2 г*иса1 -2Са1р1 -ЗСаШАса СаШАса1-ЗСа1В . Са1а1-ЗСа1В Риса1-2Са10 1.1. Синтез дисахаридов А и В. спейсерировэнных (зр производных (13зр) и (Мэр) Согласно первой (см. Схему 1) 2-0-Ас-4,6-0-ВсМЗа13зр (15), с

группой, в которое вводили а-Са1 гликозил-доноров ВПдСа1аВг

осн2сн.

тетрасахарид В (тип 3) трисахарид Н (тип 3) дисахарид А дисахарид В дисахарид Н Дисахариды . или получены сначала одной

'2 были

(12) и (13) в виде зр = ОС^С^С^ЖОСРз) по двум разным схемам, синтезировали соединение свободной гидроксильной

и а-йаПАс, используя в качестве и АСд(2-Лд)Са13С1, выходы

і

-pBzi

BzioY>^ch^hco;:f3

rrz

B2i(^^?\acH2)3NHcocF3

ch

ч^о. — Bzte0. _B2tooXO(

cOV-'-'rA BzraV--^-Tv\ Ez!0\_—-тДЯ

AcoU-f^ BzioVT-fi, Bz¡dC^\P1CHib NHCOCF3

oJ> . AcO^ (0AC

Me Ol-Bu І

B2lL0B¿0, «ґГ Л№ ACO ^ APh

^Zl^'i^EzicT^, \^^\р;СН2!з'.НСССГз .,C^3^COCF3 AcO\¿-''"\ —''^xöiCH-J-.NHCOCFi

OAc —. Cftc N31 —"ГА/ ■“ 3

161 15 I 0 ^

/CPh

GoUl —3Ga'pOiCH2l3R ° n „ ^

„ O^Í\FH2l3NHCOCF3 Æn

I3sp 1 0AC ^Ä0!CH^«ocf3

Bz 10 ,

0------ OAc

но он Q

н°чЙ^ \5Д?СИ2ІЗ«0СРз

0^n¿? " ' J' _A^A/U"'n2'3''‘nl'ul'r3

I BziO

t

¿ЦІІ-WVI J

24aR=H

,Ph

BzIO

BzIO OBzl A

\^L—ov о о

- ¿ЛЦы*

BzlO^S/ BzIO OBz I

Ph

R10

GolNAc« 1 —3GalpOsp

і 13sp

GaloU —3Ga!?Osp

I

Osp

Ac 0 № „

20 R1 =H 20a R' = Ac

AcO;

ÇÂC- Á

Ph

N3

OR'

18 Ri = H 18a R1 =Ac

.OH

17

BzIO OBzl sp BzIO.

Fti

12sp

/С

+ ноУ^Р^Р

BzIO ' 19

AcC

O'

AcO;

Osp

Osp +

isp BzIO ÓH' BzlO^I^

BzIO OBzl 21

AcO

BzIO A

ÖBzl 22 R1=H

22a R' = Ac

R'+RlrCHPh AcO Ote . R1 = Ac .

АсОГ^Ш-}

°

GalNAcd.1—2 GdNAcdl—3

^GaipOICH2l3NHR

sp =(СН2)зЫНС0СРз

23 R = COCF3

23a R = H

I

Ю

I

. ' •'!, И [ И,|| М I' I 'IIV ' 11 44 I 'П:];п !,М ММ' ;?-■ " и ( '31 '1! 1|1 11(- I ' С. ; 1 I' ; V и; ,1('г '

а-фукозилированиеи по 2-ОН. Согласно схеме 2, дисахариды А и Б получали значительно более коротким путем, избирательно гликозилируя

гтрггиррпушпр "ПЯ Л г ттрумэ ррп/'лптшишл гп! ттрпигн пиыиин гги/лпямп

выходом лишь \54~ь, схема позволяет одновременно синтезировать необходимые для изучения специфичности антител и лектинов неприродные производные со связями а1-2, 31-3 (20-22), а также

трисахариды (Са1а)Са1 (24) и (СаШса)Са1 (23). Обе схемы позволяют получать кроме дисахарпдов также и трисахариды А и В, что и было осушествлено, однако такой синтез трпсахаридов препаративно оказался значительно менее удобным, чем описанный в следуюием разделе. 1±2±_Синтез_трисахаридов_А_и_В. Синтез трпсахаридов (1зр) и (2вр) проводили согласно схеме 3, из обшего дисахаридного предшественника (26), который получали с выходом 795 из соединения (25) и ВПоРисВг в условиях гэлоид-ионного катализа. Введение а-галактозного звена в дисахарид проводили с использованием Вп40а1аВг по Гельфериху (выход 78?); введение а-галактозаминидного звена - с использованием Ас^(2-!Ц)Са13С1 в присутствии карбоната и трифлата серебра (выход 90-2). Высокие выходы, как на стадиях глнкозилирования, так и на стадиях блокирования-деблокирования, позволяют по данной схеме нарабатывать спейсерированные трисахариды А и В (а также дисахарид (14вр)) в 10-граммовых количествах и использовать их не только в

Ю17П1Х (нропейгернрованных 1 производных получены. В ОТЛИЧПР от уже ■вписанных случаев, путем ппппс/вппшлввшв! щн д-пс гтв( нников (27! и (28) Оьнзшшрованным донором галактозамина, а именно Вп0(<-’-Мо)йа13С1. ' ВПа;и Та'] ‘П.. 1^1 '■■ 1 В’ПЖВПП.ЛПраВсВ’: аКПиГВ >ра (27) I' (28/

с,' нп.кпп выходом, ь ю время как Ьл.^■■ с выходил; до Трисахарпд СаШса1-ЗСа131-ЗС1сЫАс был получен двумя способами: из производного с одной свободной гидроксильной группой (30), выход 74?, а также региоселектнвным галактозаминпрованпем диола (29), выход 33?.

Схема З

Ас О ОАс

Асо\І^ОСН2іЗШСОС^

ОАс

1РІї

А

но

Ш-^зЖСОСРз

РЬ

X о о

I

он

лрь-0 о

Ас0^ї\01СН2)З^С0СР3 + Ас0^%СН2)3ЫНС0СР ОАс он •

РИ

Л

но

ВгЮ

0(СН2)зЫНС0СРз

I 25

хРЬ 0 0

АсО^Л010^^00^

26

ОВг!

ОВгі

?ОВгІ

І^£7о,

Г ОВгі

ОВгі ОВгі

'О,

РЬ

л

о о

ВгЮІ

ВгІО

Ас О ОЛс АсО

ВгЮ

асн2)3мнсоср3

ВгЮ

Г ОВгі

ОВгі

PH

А 0 Р

)5Х^£)(СН2Ь^СОСР3

/^^ОВгІ ВгІО ®21

(Заиі— 2

Рис*1-ГС5о1р0,СН2,3МНК 2зр Р=СОСРз

2зр я=н

ОаІМАссії—Зч Рис сМ—2

І5Р РЬСОСРз 1эр Я=н

і

)ЗаІ(Ю(СН2)3ЖЯ

Предложенный в данной работе гликознл-донор BnQ(2~:ï3)Gal3Cl (его

реакционноспособных гликозил-акцепторов предпочтительным, из-з относительно большей доступности, был Ac3(2-N3)Gal3Cl; однако в те: случаях, когда гликозилирование последним не шло, или сопровождалос побочными реакциями (перенос ацетильной группы с донора н акцептор), бензилированный реагент давал неизменно высокий выход i практически полную а-стереоселективность (см. также главу 5).

Введение а-галактозного звена в трисахарид (27) с целью синтез тетрасахарида В (тип I ) проводили двумя методами: дифенилцикло

пропеншювым (акцептор в виде 1,2-дифенилциклопропенилового эфира, донор - ВПдСаШг, катализатор - AgC104) и классическим по Гельфери ху, выходы были примерно одинаковыми (60-66%).

1.4л_Синтез_олигосахаридов_типа_3. Исходным соединением для синтез; спейсерированных производных типа 3 (9sp, 10sp, 11sp) был зашищенньп дисахарид Томсена-Фриденрейха (31) (см. главу 5), которьп дезацетилировали по Земплену, бензилиденировали, избирательнс вводили хлорацетильную группу по третьему гидроксилу галактозногс остатка, после чего фукозилировали по третьему гидроксилу Gal.

[¡веденії:-.

ггі.пак'іи.^.ииншш. цч

і.

схема í

:n

^0Ac\. O

OAc

NHAc

32 R = ClCH?C0

33 R*: H

OBn

По схеме синтеза вместо хлорапетильной группы (соединение 32) можно было использовать и ацетильную, однако региоселективности при апетилировании не было. После удаления хлорацетильной защиты получен трисахарид (33), дальнейшее гликозилирование которого проводили при помощи ВПдСа1Вг (по Гельфериху, выход 83%), и Brig (2-N3 )GaipCl (суммарный выход на стадии гликозилирования и всех последующих стадиях снятия защит составил 43%).

Удаление защитных групп с целью получения свободных или спейсе-рированных олигосахаридов (1-14) проводилось стандартными методами, И за редкими исключениями проходило без осложнений. ............

2. Синтез олигосахаридов Le? leí Le? и Led [3,4,9-12,20,22].

Gal 31-З

Fucal -4

GlcHAcp

(34) трисахарид Le

Fucal-2Gal 31 -3

GlcNAcS Fucal -4

(35) тетрасахарвд Le

.b

Fucal -2Gal31-3GlcNAc3

(36) трисахарид Led (H тип 1)

Gal31-3GlcNAc3

(37) дисахарид Le

c*

Gal31-4

G

Fucal-3 Fucal-2Gal31-4

GlcNAc¡3

GlcNAcS Fucal -3

(38) трисахарид Le

(39) тетрасахарид Ley

Fucal-2Gal31-4GlcNAc3 (40) трисахарид (H тип 2)

* Старая классификация. Согласно уточненным данным антигенності обусловлена более сложной углеводной цепью, фрагментом которой является данный дисахарид. •.

К ;;МТЧ* РРгШПЙ г,щ,,р<-м^ Лишмр /Т^\ Г!,ГТ)От,Г> У,'>,Т'Г']*'ГТ лчт^лптп«

гпш и. 1Ш не ыешьв. б данной тэаооте оулбт иассмотшн (глявя т

иЧг 11

Ключсеым уомептом синтеза сшгссехпридов типа 1 (1.оа и >

является создание разветалеипя на глгаозэчпновом остатке. Попыткг

ь шгспеИвзм '.шаледопайбиь только обратная послсдоьотелыюсг> гллкозшшрования,

Ьял создания разветвления примбнялмсь две принципиально отличные схем^. Согласно первой» в полс&енне 4 остатка и 1 о^ас вводилась вропеннзя защитная группа, а именно хлораистпльная, которую можно в лалкеЛыси избирательно и количественно удалять в присутствии других шильных групп, после того, как введено звено 2C-.il. Согласно второй схеме. Проводилось региоселективное Г8ЛЧКГО:ШЛТ!рОРЗНИе акцепторов типа 3,4-(0Н)о01с'1А'-'. в положение 3. а затем фукозилирование полученного дпсахарида со свободной гидроксильной группой при м (схема г).

СХ6МЭ_С

,ои1 ти

^О)—:0 1-0

0К?ВГ *

0R3 ЫНАс

Я1=Ас,Вп,В2 Р^Ас.Вп

р2~ ^ о-, оЬ------ог «

:п^г-

I г!

П">КГ>ЭД1ЯП ИрГ’К'-’ПЬК''' ПФОТТЦТТ рпг прутт» -

1'Аыл. нривьде.нпь галактозилирования в классических условиях реакции Гсльфериха даьало 1 -З-днсахарид с выходом около 80-'., нсожюлмо от

природы заместителей при С1 (а-Вп, 3-зр) и Сб' глюкозамина (Ас, Вп). Изомер с ¡31 -4-галактозидной связью также был выделен, однако выход его не превышал 10% от основного изомера. Фукозилирование дисахарида по. С4-гидроксильной группе, которое проводили дифенилниклопропенило-вым или галоид-ионным методом, затруднений не вызывало.

Синтез тетрасахарида Ье^ требует дополнительного введения фукозильного звена в положение 2 галактозы, что можно делать либо одновременно с введением фукозы в положение 4 глюкозамина, либо

■ »^

последовательно. Схема 6 иллюстрирует одноврелгенное введение двух фукозных остатков, заместитель И с равной эффективностью может быть бензильной и ацетильной группой.

Вариант последовательного фукозилирования изображен на схеме которая позволяет синтезировать из общего предшественника (27) не только тетрасахарид 1еь, но и тетрасахариды А и В (тип 1). схема 7

Синтез трисахарида 1.е^ описан ранее, кроме того, он получен избирательным фукозилпрованием дисахарида (41): при кестикратнон

избытке фукозил-донора образуется тетрасахарид Ге0 (выход 63?-), а при двукратном избытке фукозилирование идет сначала по более

рса:сшюнноспособному гидроксилу при С2 гпльитсшого зг.снп, т. ¡ход трисахарида составил 70?;.

0 ^Чгттто'** л П' ,1'СПЛ^опт»тт ос Ъсх, 1су Г* II / *^^7 2 )

Струетуриоо сходство ';л:нг.гахарндоь т. ‘28--:’,

олигосахатадами ье“’“ (34-35) навогтт на мысль гтттбпкять

• л XV/ ж дницАР^пли оопппла иа!^ I ~ои±их1Л^

используется изомер Са1р!-4С1с:1Ас. Однако многочисленные попытки глпкозилировать спейсерпрованные производные глюкозамина с временной ^днтнои группой при 03 ¡1 :л;ог.'од!К'.й ' пярьу.еи"г н;0 :: ; ,1

либо отсутствовал в реакционной смеси совсем. Попытки

гликозилировать диолы ЗН-СОШ^ИсВДс селективно в положение 4 дали следующий результат: удалось найти условия галактозилировэния (42) в положение 4. Однако в тех аш условиях (ацетобромгалактоза + трифлат серебра) соединение (43), отличающееся лишь заместителем при С1, галактозилировалось неизбирательно и с низким общим выходом. Кроме того, фукозилирование дисахарида (44) в обычных условиях

галоид-ионного катализа практически не шло, и, чтобы синтезировать соединение (45), пришлось применить наиболее жесткие ИЗ НЗСЙСТНЫХ условия фукозилирования (схема 3). ДгпС^п’ г'^Вп_

о г-ОВп . пГ-0Ас г0Вп УПДг У П

с^ема_§ АсОС_0р Е_00зр N¿^/4,

_(0Н — фАс У 0 уфн у) Вп3Рис$£(.СиВг2,

НО'1 1 I ^ 1 Ви,МВг,Т(0Ад

ИНА= ОАс ЖАс 4

42. Я=а-Вп , . _

43.Я=/5-5р ОВп

Поэтому для синтеза производных типа 2 (то есть 1ех и Ге7) была

выбрана принципиально иная, чем для синтеза производных типа I,

схема синтеза (схема 9).

-О -ОР1

/м ■ ' ■ к:

4

НО

МИДе 0Р;; 0Р2 N4 Ас

46. 48. Н:=В2,ЬГ=Ас 47. Я:=Н =Ас,Н3=И------51-----чя

¿9. Я^^=2г.а‘=И--о?--------

50.Я!=В2,К'=Я=Н------ЬЗ----ЗУ.

Ее отличают две особенности. 1. В качестве гликозилакцептора берется ангидро-И-ацетилглюкозашга (46), т.е. производное с пираноз-

ным циклом в закрепленной конформации 1 С, в котором реакционная способность гидроксила при С4 вше, чем при СЗ. 2. Весь синтез ведется с сохранением ангидро-цикла, а спейсерирование проводится лишь на последней стадии. Диол (46) гликозилируется с невысоким выходом (около 40%) при всех изученных условиях гликозилирования. Однако доступность исходного ангидро-соединения, высокая региоселективность гликозилирования по С4, а также отсутствие стадий перезащиты перед вторым гликозилированием, позволяют считать выход 40% вполне удовлетворительным с точки зрения всей схемы в целом. Гликозилирова-

■у

ние диола (46) донором кс^аП. дает предшественник трисахарида 1е (47). Гликозилирование (46) донором с ацетильной группой при С2 и бензоильными при СЗ, С4 и С6, (48), дает (после стадий бензоилирова-ния по 3-ОН глюкозамина и последующего избирательного кислотного удаления ацетата) предшественник трисахарида Н (тип 2), (¿95, п

так.'г.е (после стадии снятия ацетата, но без предшествующего ему бензоилирования) тетрасахарида 1еу, (50). Фукозилирование соединений (49) и (50) проходило без затруднений. В полученных зашишенных олигосахаридах (51), (52) и (53) необходимо было раскрыть ангидро-

иикл, эта реакция требует жестких условий кислотного ацетолиза. Однако в данных условиях, как было специально показано, отщепляются бензилированные фукозные остатки. Поэтому сначала проводили гидро-

генолиз и ацетилирование фукозильных остатков, что приводило к заметному повышению устойчивости фукозильной связи, после чего яцето-лиз проходил без дефукозилирования. Полученные олигосахарид-пераиетаты как дезаиетилировали, так и превращали в спейсерированные производные через олигосахарид-оксазолины, по схеме, описанной в главе 6.2.

4. Синтез олигосахаридов Р1 и Р .

Са1а1-4Са131-4С1сМс (54) Р1

Са1а1-4Са131-4С1с (55) Рк-

В синтезе трисахэридов данной группы сложность представляет

ГЛИКСЗ»! ЛПрОГиОлПГ, Г;1СС,То-уЛЛТОП , Г:Л.'ЬпГ' .и': 1 п"_мС ¡ШГ-П 'Г.’^ТТГз

нНи[)'1НИХ И С>.'1ИГ> Л.гзлУрПГиЧОМ СИЬ'^ Ьи^С^.Ь ; ! Л ;ГДл'.( '.¡ЫI ги Г.

Не"! Г

Кепш’иа-агшрра *ее ьарпшт и а качестве иримитира; и ш

В качестве защитных групп как в гликозил-акиепторах (58 и 59) и глнкозил-доноре (60), причем использовалась вакуумная техника

глпкозидного спнть:;^. Я этих /с .ль:,;ь:* „-елпна.нши !с;с:,

составило около 4:1. схема 10

1.РЬСН(0Ме)2 .н +

2.ВпС1, №Н

63п3^аВ,:1зСК1

ОН Я2

56. И1=Вп,Я2=МНАс

57. Я1=Н, Я2=0Н

г0Вп ВпОС—о ВлдбаИЗг (60) ©Вп У О

ОВп

ОВп

58. Я2=ЫНАс

59. Я2 = 0Вп

ОВп

ОВп ^

61. ^сЫНАс-------- 54 -—— 54эр

62. Я2=0Вп--------55------- 55Бр

НА папииугп'^и и г'рпфтэрф^гтштдтл г -зфтти ^ п п а г» ши/р'зтл пптроцп а липи

ЯППСТЯНЯВ ЛЦВЯШПТЙ

шеисернриьамнл

—1-:.'. ..-¡г---„и.;.. „

сштветствуюший З-гликозилш.нш, который ¡шшш роняли х.юргллетплхл ;,п дом, и затем монохлорапстамнднос.- производное действ;:!м зммизкп

первичной аминогруппе, одинаково пригодны для конденсаций с активированными эфирами, описанными в главе 8.

СпейсерироБянир, гпиг.яхапппя р, , имеющего .<,> аполш'ичпи илш’ииаларидвм вс -. длн

5. Синтез олигосахаридов а гликозил-серинов со яецифичностыо TF и некоторых родственных соединений [15,17,21,25).

GalNAcal -OSer (63) Tn(Ser)

Neu5Aca2-6GalNAc (64) SiaTn

GalNAcal -вр (65) Tn

Gal 01 -3GalNAca1 -OSer (66) TF(Ser)

Galßl -3GalNAca1 -sp (67) TP

Galß1-3GalNAcß1-sp (68) Tßß

Galal -3GalNAca1 -o% (69) ^Ctd

GalNAcßl -3GalNAca1 -sp (70) Fscra

GalNAc ß1 -3GalNAc ß1 -вр (71) Pb '

Сушествует несколько причин, из-за которых углеводные антигены того семейства . рассматривают как близкородственные

руппоспецифическим антигенам крови системы АВН. Во-первых, антиген F является одним из основных эритроцитарных антигенов. Во-вторых, исахарид TF является кором для олигосахаридов АВН типа 3, а исахарид - кором для олигосахаридов типа 4. В-третьих,

нтигены с терминальным остатком GalNAca имеют серологическое ходство с антигенами группы крови А, а антиген Тш - с антигенами руппы крови В. Наконец, перечисленные выше антигены являются пухоле-ассошшрованными, также, как и некоторые антигены групп рови АВН, которые при онкотрансформации могут экспрессироваться в зсколько измененном виде или появляться в несвойственных им <анлх.

Для синтеза a-галактозаминидов применялось несколько вариантов яикозилнрования. Наиболее простые из разработанных методов получе-яя GalNAca-sp: изомеризация соответствующего 3-гликозида под дейст-■іем трифторметансульфокислоты, а также одностадийное гликозидирова-■ІЄ ацетата N-аиетилгалактозамина 3-трифторацетамидопропанолом. Производное серина, соединение MeNH (О)ССН (СН20Н ШС (0) (СН2) д COOEt. ¡идопроизводным галактозы Ac3Gal(2-Ng)|3Cl гликозилировалось с низ-!м выходом, не более 25%. Предложенный в данной работе более ыоаный шкозилируюший агент. Bn3Gal(2-N3)ßCl (см. также главу 1.3), шкозилировал то же производное серина с выходом 84%.

Фрагмент гдгшозги! -3Gal’!Ae синтезировали во всех случаях (в том

числе в составе тетрасахаридов А и В типа 3, см. гл. 1.4) после Ы»( Д(КПЛ ;■ И ■ И.!:’ Г.1’ 7;{ И. >: .

Ас^Са1(2-Т^)ЗС1) - опухоле-ассошшрованные антигены Форссмана (Кв) и его аа-аналог. ■

Кроме того, по аналогичной синтетической схеме (с топ лишь . ,-:1; 1 ■ и;-!' ,.!](йс( л\ '.одь ■ : -,л;].ч .. м,

дисахариды Са101-ЗСа1НАс, Са1а1-ЗСаШАс, Са1ИАса1 -ЗСаШАс. Из этих дисахаридов, а также из СаШАс, Рисо1-2Са181-ЗСа]ИАс и Хеи5Аса2-6Са1ИАс* действием 7-амино-4-метилкумарина и

цианоборгидрида натрия были получены соответствующие флуоресцентно-меченые производные, которые могут быть использованы в качестве стандартов для химического количественного выявления опухоле-ассоциированных фрагментов 0-иепей гликопротеинов с помощью ВЭЖХ. Такой подход отличается от имыуноцитохимических (взаимодействие с гликопротеинами поверхности клеток антител и лектинов) тем, что выявляет не только хорошо экспонированные (доступные) цепи, но и скрытые.

6. Ноше реагенты и синтетические приемы, предложенные для получения олигосахаридов.

6.1. Синтез 2-азидо-З,4,6-три-0-бензил-2-дезоксигалактопиранозилхло-рида [5,7-91. Для введения группы И3 во второе положение пиранозного кольца предложена реакция радикального присоединения галоидазидов

¡Т’Т'Ч- и Т?т-Т\1. Ч V ггцгаялои (яирфц лирпппннии пттп.пряитти

вы ми методами, включающими синтез ряда модельных соединении и кине-

к шнлироьанным и апкплиропшшмм гликаяям.

*Л1К;ахарп;; "с.'А’Г -"'.ч'ТТ-. ■, харжтгрны.'; для : ликопр^тг пне л '■'Г.ухолп молочной :+ии;;и, ькд!.."лл1: * п.: подчито:тциго муппна овны

: Г|Г.М). Лисах арид -пагпдлл;: гидра-.пнг*лп''0п при С Г'С н ьпдедлл;' с помошью нескольких хроматографических стадий.

Нв основании экспериментальных и расчетных данных были предложены оптимальные условия присоединения C1N3 к три-О-бензилгалакталю, позволяющие получать 2-азид с гсисгао-конфигурацией с выходом 80%. Кроме того, предложен альтернативный метод синтеза BngGal(2-N3)ßCl, ключевой стадией которого является реакция трибензилгалакталя с азидом натрия в присутствии четырехвалентной соли церия. Отличительными особенностями BngGal(2-N3)ßCl как гликозилирующего агента по сравнению с ACgGal<2-Ng) ßCl, являются высокий, не зависящий от реакционной способности агликона, выход при гликозилировании, высокая а-стереоселективность, отсутствие побочных процессов.

6.2. Синтез оксазолиновых производных олигосахаридов [6,40]. Хотя ранее описано несколько различных подходов к синтезу 2-метил-глико[2.1-сП-2-оксазолиновых производных сахаров, все они включали стадию обработай сахарида сильной кислотой. Так как многие группоспецифические. олигосахариды содержат . кислото-лабильные гликозидные связи, в частности 'а-фукозильные, существовала опасность частичной или полной деградации олигосахаридов при получении их спейсерированных производных через оксазолины (см. главу 7). В данной работе предложен новый общий метод синтеза глико-оксазолинов в мягких условиях. Метод заключается в превращении перацетата аминосахара действием гидразин-ацетвта в производное со свободной 1-0Н-группой и мёзилировании последнего с одновременным образованием оксазолинового цикла:

схема_Ц

У Ц. М2НГДС0Н

\0Ас ) 0Ас------------- дОАс,

NHAc NHAc

MsCi. s - coll

X

NHAc

NHAcJ

-HX

X = 0Ms, CI

Аиетилирование незащищенного олигосахарида, 1-0-дезацетилирование и замыкание оксазолинового цикла проводятся без выделения промежуточных соединений ("one-pot synthesis"), выход олигосахарид-оксазолинов около 80%.

",. 3. Rbg ггсггпс бснзттлт ”nfT ...Г1,?, 1Р 7.

L.3. ! . Ь л ' 'Л ' i.illi'i i’)■"’ ' ’ '■ ■ ' '' ’ i!

Ло«?и.чьну1п тпуппу R частично анетилированные сахара, ни

ЧЬиТПииТИ, П,у ЛШи udwiu i и

Н-ацетилглюкозашша, отличающуюся низкой реакционной способностью. Били предложены следующие условия аффективного, но в то же время не

¡сЗТр^ГП iicJiOlilbrc '■ {‘"’J.i-i'i 10FU

иПОТГП'Ы *

гч'нзи

t . г I-

Б.3.2. Другая задача - замена ацильных защитных групп в частично анилированных (имеющих незащищенный гидроксил) сахарах на бензильные, решалась при помощи следующей последовательности реакций: схема 12

IThfCl.s-coll

2.MeONa

1. BnCl, NaH

2. AcOH

HO OAcyl

ThfO OH

HO OBn

Для введения новой для химии углеводов тетрагидрофуранильноЯ (ТМ) группы применялся тетрагидрофуран-2-илхлорид, получаемый из Tiff и SO^Clp in situ; в качестве примера замены ацильных групп на

бензильные можно привести синтез производного трисахарида Н типа 1 (28) из (27): схемэ_13

Ph. ГЦ

\ин / о

О

RON

OR

С

O^L_/?Bn

NHAc

27 R= и-N02C6H/.C0 28. R ^ Bn

6л4л_1В§менная_хлорацетальная_защитаая_группа [3,7,25,34].

Для синтеза разветвленных Лгликозилированы 2-ОН и 3-ОН остатка галактозы) олигосахаридов А и В, а также разветвленных

(гликозилированы 3-ОН и 4-ОН остатка глюкозамина) олигосахаридов 1е в качестве временной, при создании разветвления, предложена

хлор ацетильная группа. Избирательное количественное удаление

хлорацетата тиомочевиной позволяет использовать тандем двух ацильных групп - ацетильной и хлорацетильной, что значительно расширяет стратегические возможности синтеза сложных олигосахаридов, особенно в тех случаях, когда использование традиционного тандема Ас/Вп невозможно. Еще одно преимущество хлорацетильной группы, выявленное в данной работе, - большая региоселективность ацилирования диолов хлорацетилхлоридом по сравнению с ацетилхлоридом (см.' 1.4).

6.5. Региоселективное гликозилирование [4,7,9,12,14,20,22,34]. Наиболее коротким способом создания разветвлений (см. 6.4) является региоселективное гликозилирование агликона-диола с последующим вторым гликозилированием. Такая схема не требует стадий перезащиты между гликозилированиями и значительно упрощает всю стратегическую схему синтеза. Кроме того. реакционная способность гликозил-акцепторов с двумя соседними незащищенными гидроксильными группами, как правило, заметно выше, чем у похожих моно-ОН-производных. Наиболее удачным примером подобного подхода в данной работе является синтез фрагмента Gal31 -3GlcNAc олигосахаридов 1еа и 1еь в условиях гликозилирования по Гельфериху (см. главу 2). Для синтеза олигосахаридов 1ех и Ьеу нужно было обеспечить обратную региоселективность' при гликозилировании 3,4-(0H)2-G1cNAc. На примере 6-0-Bn-GlcNAcaBn удалось найти условия гликозилирования (ацетобромгалактоза, трифлат серебра, хлористый метилен), приводящие к преимущественному (7:1) образованию изомера 1 -4. Однако реакция не носит общего характера, соединение ö-O-Bn-OlcNAcSsp в тех же условиях гликозилировалось неселективно и с низким выходом. Попытки изменить порядок гликозилирования. т.е. сначала селективно $укозилировать, а затем галактозилировать, оказались неудачными: во-первых, фукозилировэние диола шло нерегиоселективно (см. 6.6), во-вторых, галактозилирование производного дисахарида Pucal-3Glc:iAc лло с низким выходом. Лишь изменение конформации ппранозного кольиа глюкозамина путем замыкания I,6-агидро-цикла приводило к обращению

реакщюнноП способности гидроксильных групп 3-ОН И 4--ОН и позволило селективно синтезировать фрагмент Gali31 -4GlcNAc (см. главу 3). В

отдельных случаях удавалось региосолективно т\)П!Ко:«Ш!|кж&ть иисдимснии пша 2. о-(СП чС.'.'.. uc.’i;'_JiL'iy.i ч с л ■ ■ и ну kj

реакционную способность 3-ОН, чнако г'слгктиьш'.гть и ..¡дешачпйюс.’ь :’Л1!К0?'т.яирсвантля в значительной степени '‘ивне'мш иг iпн a ¡имминнилх ■ защитных групп.

6.6. Намеренная регионеселективность [203. В ряде случаев, когда рогйоппемери лсп:о разделяются нрепарзтарно, выгодчрв провести несилективное гликошишрование дпола о пг.ол-ту к/лп" р,т>!’; чишп*

дисахаридов, чем по отдельным схемам направлении импгезирииатв каждый дисахарид. Удачным примером подобного подхода является синтез дисахаридов Fucal -3GlcNAc|3sp и Fuea1-4GlcNAc(3sp. Селективное триметплеплилпрование GlcNAcpsp по 6-ОН дает 3,4-диол, который в условиях галоид -ионного гликозилирования донором Вп^УисВг давал смесь 1-3 и 1-4 дисахаридов 1:1. Изомерные дисахариды были разделены после обработки их смеси PhCH(0Me)2+T50H, то есть превращения 1-3-дисахарида в бензилиденовое производное.

6л7^_Сштез_тидаыидных_производных_галактозамина. Аминосахара, в которых амидный кислород заменен на серу, позволяют изучать вклад ацетамидной группы во взаимодействие с антителами и лектинами. Именно группа' СНдССШ- определяет различия между детерминантными олигосахаридами групп крови А и В (1) и (2). Замена кислорода на серу в амиде позволяет "выключать" из взаимодействия с активным центром белка водородные связи типа СО”‘НХ, не затрагивая гидрофобные взаимодействия через метальную группу. Синтез тиоамидных производных соединений (1sp), (12sp) и Т , т.е. спейсерированных

три-, ди-, и моносахарида группы крови А, был осуществлен следующим

чячяртся спейсерироврние. В зависимости от биологической палачи, /, :t.ii iu :к:и ■••интетиками. нслиои олип'-^харил :•< жст ; шги .-ир| лап ся лиоо как восстанавливающий, т.е. со свободной гидриксильпой ipyn-:.u: ' - СИ, либо как ош'йсьририьанннн, i.l. как лл;!к; .;.цд rpyiiiuip' .

ИуОССН^^пСООН или С1уО(СН2)пШ2. Стратегия синтеза спейсерированных производных может быть различной: одни исследователи предпочитают вводить зр на первых же стадиях синтеза, используя спейсер по ходу синтеза как 1 -О-зашитную группу; другие вводят спейсер в самом конце синтеза, уже имея готовый олигосахарид; третьи вводят спейсер на промежуточных этапах. Каждый из названных подходов имеет свои преимущества и недостатки. Первый и третий варианты не позволяют синтезировать свободный олигосахарид, кроме того, спейсер обычно привносит некоторые ограничения в стратегию синтеза, т.к. имеет функциональную группу. Второй вариант позволяет одновременно в самом конце синтеза иметь как свободный, так и спейсерированный олигосахарид, а также позволяет использовать не только синтетические, но и выделенные из природных источников олигосахариды. Однако спейсерирование, как правило, проходит со значительными потерями (выходы 50-70%), особенно на микроколичествах олигосахаридов.

Так как в цели данной работы входило, в основном, получение конъюгированных олигосахаридов, предпочтение отдавалось первой стратегии. Однако, для некоторых целей нужны были и .восстанавливающие олигосахариды, а использование ангидро-глюкозэмина в синтезе олигосахаридов 1ех*^ (глава 3) вообще исключало возможность спейсерирования в начале синтеза. Поэтому применялась и вторая стратегия, т.е. введение спейсера в завершение синтеза. Кроме того, в данной работе предложен новый подход, согласно которому весь синтез ведется на спейсерированных производных, а в конце работы проводится удаление зр (деспейсерирование).

Выбор в качестве спейсера группы -СГ^С^С^Х-КОС^ обусловлен несколькими причинами. Во-пержых, слишком длинный, а тем более гидрофобный типа -(^2^8-12 или ароматический спейсер может искажать специфическое взаимодействие олигосахарида с антителами и лектинами, а кроме того, придает соединению непредсказуемую растворимость и детергентные свойства, что осложняет очистку на промежуточных и конечных стадиях. Во-вторых, терминзиил в виде -С00Н или -C00Et была для данной работы неприемлема, так как исключала из круга интересов гликозиды нейраминовой кислоты; а терминация (как предшественник _'Ш2) исключала применение 2-азидопрсизводных в синтезе группоспеиифических сахаридов типа А и Т . В-третьих, выбранная '1-трифторацетильная зашита спейсера легко и количественно удаляется

независимо от того, какое количество есзсстио глюдктсл в ргкатоь, в то же время, выдерживает большинство типичных дал химии углеводов условии бл :кп|Т;г,::-Т"оки;. д гин г : с.. , "

несовместимые кс : ■: Г; г:./;::. .■ . .:iv,.4. ■ . .* , ' •

завершающей стадии. Наконец, длины аминопропильного спейсера достаточно для взаимодействия сахарида с белком (см. главу 8) благодаря конъюгации гликозида с гибким полимевом. выполняющим соль дополнительного СПРЙГ'ера it- Ч " ! ••

L/ I »vi-fcVsC’fsV'*» ) I CJ 1_> 1 Г4 WiJTU/lA 1 i ,J ÿKJ J 1,11VIX1

спейсер легко удлинялся реакцией с S’jOOC(CB2)-:raBoc.

В арсенале методов конъюгации нпскомолекулярных гаптенов с носителями можно найти огромное число органохш.шческих и ферментативных реакций. Однако очень немногие из них дают количественный выход и не привносят в конъюгат нежелательные дополнительные (заряженные, гидрофобные) Срогяс'ггы. i.L; выброс: для конъюгации реакцию емядировекия. причем, в отлитие от большинства других работ, активировали не гаптен, ь матрицу (см. главу 8), что обеспечило возможность количественного присоединения, т.к. гаптен КС подвергался побочным реакциям сольволизь.

Удаление спейсерной группы изучено на примере трисахаридов А (1sp) и В (2sp), последовательность реакций следующая: 0^^

« «

м N'-j

^OCHjCHjCH^Ml-b v-qOCHjCHXKN-1 ■

J0 -¿к-¡о

2sp

и+ оОСН2СН2СНО AcONa, Ас20, АсОН ^-0Ч

т.е. ппевиашение аминомр.ти.пы-юй mvnTiw « япкиртчишт/т лп wnr.n чатпч

идлиороМсппым сшетшшриьанием {.АСоСн-АСС.чаI ; апетшишованпс

необходим ,

8. Синтез неогликоконъигатов [10.11,13,15,16,19,21, 22,24,26,28,32,33.36,38,39,43].

Гликоконъюгаты, экспонированные на поверхности клетки, а также плазматические и внеклеточные гликоконъюгаты участвуют во многих жизненно важных процессах узнавания. Для изучения и моделирования этих процессов успешно применяются синтетические аналоги - неогликопротеины, неогликолипиды и псевдополисахариды. Следует выделить два главных преимущества применения синтетических гликоконъюгатов перед природными: 1) заведомую структурную гомогенность, 2) возможность создавать молекулы с заранее запрограммированными свойствами, такими как растворимость, молекулярная масса, плотность расположения специфических углеводных лигандов на макромолекуле, биодеградируемость и т.д. Для каждого из перечисленных классов соединений - неогликопротеинов, неогликолипидов и псевдополисахаридов, известны специальные методы синтеза. В данной работе предлагается -подход, методически простой и в то же время одинаково применимый к синтезу разнообразных неогликоконъюгатов. Конъюгаты построены по одному плану: к полиакриламиду присоединены через спейсер углеводные группы, а также дополнительные неуглеводные лиганды (липид, биотин, и т.п.).

Для синтеза полиакриламид-связанных углеводов (псевдополисахаридов) ранее применялась, в том числе и автором [10. 113. стратегия, основанная на введении в углевод олефиновой группы (аллильной или акрилоильной) и последующей сополимеризации с акриламидом (реакция 2 на схеме). В данной работе предлагается подход, основанный на реакции конденсации поли(4-нитрофенилакрилата), то есть полностью активированной по карбоксилам акриловой кислоты, с аминоалкил-гликозидами (И1Ш^). Одновременное или последующее введение других (неуглеводных) аминолигандов (И2!®,,) по реакции 1, позволяет придавать полимерной молекуле необходимые дополнительные функции и свойства.

8.1. Исходные полимеры. Попытки активировать полиакриловую кислоту или ее сополимеры с 1Нзинилпирролидоном при помощи П-гидроксисукцинимидв, нитрофенола или пентафторфенола в присутствии карбодиимидов приводили к очень невысоким степеням активации, не более 10%. Поэтому активация была перенесена на стадию синтеза мономера, т.е. синтезировали активированный эфир акриловой кислоты, который радикально полимеризовали в присутствии А1Ш, получая

~ тт *тт,ттГ'*т -V44THI4 і гг ■» ^inrruoT tri,лемі * va uu їЛ"} і ііШГі '. ! {( 'н' |1 ''М'ПГ

•И0ЇҐН8ЛЇ!Г0НІШП IU.3tfif30-'t>£ Я ПШіНЛвіииіГі-НШ \) fíildiuíulnl LUHib.J

Uttd Н k'U d'.J.J U.O.U mil l.-.GCHJ. ІІ^ЛПП ІІП ГІГ ícxiui^'. -imu w;i ’ ^ і ..

ііок.ізшчоя iidu оннзахзэы'лгоя ¿зїи эинэшэпйй ':-02-SI хвігзіГогіц g -но’ґ -охяа ипннэахззкшгоя о -зжяв-і •нгшішаніпгзоооншчв ( Ш'нчнігоззкмЛон) шч -?ічя;гдшіШ!ґотої о окгмзнаїгноя чішґоасгіи iíwo:reoii гоЬяитш s utuídj хпн -куяоіиашяз „orjucc, гогтігод кзппіпавізо •sirudBX'îo ?.. хгшчіґоіч о і пігоно »•'KHinraoontfu *o!fHfiçdu м'А •оннзахо-Эпшгом ¿эгв ішгошсі ¡іі'пггяпфіпгсп s’OH-^ge-oc XB'iairsdu а оявнїґо ‘¿íitroxonodu эн (ШЖ0Э~ <- г(Ж“Н93003-) ¡íimeaodinnu'iB ojohitoo ‘biiuMj і'вніпківхвзсш!іґо нв^ошчэчдо олс - а штзз •шчишізнпїґзозоншчв ( |. HifflMsad) ішпеяифиїгсіч иігїґ іизонжоїчєоа зтгогїии іаеїґ ’ HHGaodiiaiUHG nuMdj зннчілізяос^вя -wq зйзічнігоц понїїохзи a o¿h

• ox • Fiôd§iTiSif5ü'HnHHëa5driârüM§“5_âôîrH§jriK;ôrmnB_HrmG3H3ïfHÔ>i~T'2T8

■?¿08 оігояо шгнеавіооо ганзїґжвзсМоц ішіґвлз зігзои нїґохиа ‘Bdsmnow хваїззьиігоя j-oi вн и яві \m-ooi ви явя чзшппґоа -cuodiiooa omodox штееМэншгои нівічц-Аєз^ чле^яшшэфехкнн-ишгои

Таблица 1.

Количество введенного в реакцию Количество реально присоединив-Неи5Аах2-0СН2С6Н4ШС0СН2Ш2 шегося лиганда, вычисленное по

|ЛП01 по отношению к активированным группам полимера калибровочной прямой, рлю1

0 0 0

1.75 10% 1.8

3.5 20% 3.3

3.9 30% 3.7

значительному частичному гидролизу до карбоксильных групп (показано с помощью элементного анализа и электрофореза), тэкого типа конъюгаты имеют небольшой отрицательный заряд, не мешающий при последующем применении конъюгатов. Гидролиз избыточных активных групп водным 0.1 М КаОН приводит к замещенным полиакриловым кислотам. Очистка конъюгатов сводится к отделению нитрофенола и избытка аммиака (этанолами-на, щелочи) и проводится при помоши гель-фильтрации, детекция визуальная по нитрофенолу. В ряде случаев, например, когда конъюгат использовался для активации пластиковых планшетов, очистки не требовалось вообше. Данный подход особенно удобен при получении серии конъюгатов, различающихся содержанием углеводного лиганда, когда нужно подобрать оптимальный для данной аналитической задачи конъюгат.

8^3л_Иолекул®ные_массы_ПАА;КОнъюгатов. Кажущиеся молекулярные массы (Мг) оценивались с помощью двух подходов. Первый - гель-хроматография низкого давления на различных колонках, а также ВЭЖХ, с калибровкой колонок по стандартным белкам, декстранам и поли-зтнленгликолям. Второй - ультрафильтрация на мембранах с предельным пропусканием белков 30, 100 и 300 кБа. Названные способы оценки Нг дали вполне согласующиеся результаты. Величина Мг конъюгатов задавалась молекулярной массой исходного поли(4-нитрофенилакрилата); практически вся описанная работа проводилась на одной партии исходного полимера, для некоторых специальных случаев получали поли(4- нитро-$енилакрилат) повышенной молекулярной массы. Определенные Мр незамещенных акрилатов были следующие (Рис. 1): 70 кБа для -С0Ш2> 90 кБз для -С0ННСН2СН20Н и 150 кБа для -С00Н при калибровке колонки белками и примерно втрое меньшие величины при калибровке декстрана-

ми. Кажущиеся молекулярные массы олигосахаридных конъюгатов были

->>■ 1Н г<Г!!1г;;клип'/ Т'.;Л;1М‘ р.о-,, >:■:;.т;V*.ч;■ чшог а/.'.птчл; л V,'

МсЗЬи]2] 11^Н ^ ОСЛИ ЧОП*!*! /V «ли 1 си!,дс1 ^ , *1«.., ^ I' I,!

1 “ О Ч С- и

ли имеют почти правильную сферическую форму; диаметр (около 150 а) согласуется с величиной Иг.

СйНТВГ- НС-.УГ ЛТКГмГШПЛ" , “Г””", Г~рлГ!'ТГт% 1!Г"".,Г'Л!‘^,””"ЯТГ,Т>Л'В

второго, неуглеводного, лиганда в виде 1ЛШ2.

Неогликолипиды синтезировали, присоединяя к полимеру вслед за углеводом фосфатидилэтаноашш (РЕ), причем присоединение РЕ из-за наличия в нем фосфатной группы необходимо проводить в присутствии третичного амина. Природный РЕ удобнее синтетического из-за лучшей растворимости. Чтобы показать, идет ли присоединение РЕ количественно, применяли ТСХ (обнаружение остаточного амина нингидрином), а также радиоактивно-меченый 14С-РЕ. Конъюгаты для иммунизации (см. главу 9) обычно синтезировали при следующем соотношении исходных;

амино- алкилгликозид/РЕ/мономерное звено = 1:1:6. Для синтеза растворимых в органических растворителях конъюгатов (полимерные аналоги гликолипидов) соотношение бралось 1:2:10. Радиоактивно-меченые неогликолипиды использовали для количественной оценки встраивания в

биологические мембраны. Характерной особенностью описанных здесь неогликолипидов является то, что они высокомолекулярны и несут сразу несколько олигосахаридных фрагментов, поэтому в какой-то степени могут служить моделью "осколков" (продуктов. шеддинга) биологической

мембраны.

——г..„------------ ■ : 1 . ■

1 ОЧНЫМ ДЛЯ СШПВВаШ'Л РОНДЯ гг гтргптпшт пит? - ферментным конъюгатом. И I; Ти же время не ухудшал.: растворимости в воя- и суфг рных растворах. Сорбенты. Глккосорбрнтн сконструированы по тому же принципу, что и остн.пьнш описанные выше производные, в качестве I!' ?Гм-. выступай аминопропилированное макропористое отекли (¿000А, содержание аминогрупп около 100 мкмоль/г; активированные носители разработаны

А.Е.Ивановым и В.П.Зубовым, ИБХ РАН). После конденсации матрицы с полимером, большая часть (> 100 мкмоль/г) карбоксильных групп полимера остается активированной. Аминоалкилгликозид присоединяли к полимеру, ковалентно иммобилизованному на стекле в количестве 0.5-20 мкмоль/г, после чего избыточные активные группы превращали в амидные действием зтанодамина. Условия и количественная сторона присоединения такие же, что и в случае синтеза псевдополисахаридов (см. 8.2).

8л§^_Лизайн_более_сложнга_углевод-сддержаших_конструкиий.

Латексы. Для присоединения углеводных лигандов к латексным частицам (латексы разработаны Ю.В.Лукиным и Б.П.Зубовым, ИБХ- РАН) использовалась следующая схема: 30'i нптрофенидьных групп полимера замешали

углеводным лигандом, полученный водораствориимй, но несущий 70%

активированных групп, конъюгат конденсировали с ББА-моднфинированным латексом.

Антиген для анализа на нитроцелшолозных мембранах (дот-блоттинг). Конъюгата углеводных гаптеиов с ПАА связываются со стгздгртншш

нитроиеллюлозными мембранами, однако чувствительность аналитических методик (при анализе антител) при этом не превышала чувствительности ИФА в варианте с использованием полистироловых планшет. Поэтому для активации нитроцеллюлозы была применена методика, аналогичная

описанной в предыдущем разделе: 2,0% нитрофенильных групп полимера

замещали углеводным лигандом, полученный конъюгат наносили на мембрану и гидролизовали до полиакриламида непосредственно на мембране. Такой подход позволял уменьшать количество наносимого на нитроцеллюлозу антигена на 2-3 порядка.

Белок-модифишрованные сорбенты. Для создания гликосорбентов, совместимых с клетками крови, к активированной полимером поверхности макропористого стекла, кроме .трисахаридов А и Б, присоединяли человеческий альбумин и гепарин. Были реализованы две различные схемы. Согласно первой, трисахарид и белок присоединяли к активированному поли(4-нитрофенилакрилатом) стеклу. Согласно второй, поверхность активированного полимером стекла сначала модифицировали альбумином, после чего уже к альбумину присоединяли полимер, содержащий 30 мольных i триеэхарида.

§-ёл_Преимушества_кснденсаупднногд_полхода^к_спнтезу_ .зкрилэтннх гликоконъюгатов. Синтезы разного типа неогликоконъюгэтов конденсацией поли(4-нитрс.фенилакрплата) с аминолигандами. проведенные в

различных условиях на многих домуках щиш^роь, иозъоля<иГ сфор;л,ули -ропать следуюжш характерные для метода особенности.

В синтеза. 1. Конденсация проходит количественно, что дсет возмо:;;-

:: 'ЛГЬ 'с/', I7 'Тл;л- ЛСПЛ.ЛЛкЛЛ-Л. П.'ЛЛВ' г:л'Г;-:",-:кьи: ■ уд !■■ ;,•/ 'у,,’ , . ... -д

,,!п г ли ! ллпЬ^гам <: лл ; лл;и лддллл л- л ■ ;л -.;ч ;■ ,,л

-I; ’ . Лч.Л; Л;;Л Л В Л ь,., :ц Л Л11, 1.Л..Л.Л)Л Л -".. -

г)■ \I ц1! л<. . * - I «; 1 „ I , 1 л: ¿д.хI:!,, , .^1.»: ....11 , . ' . ’ , ,

лиганды, тем самым подучая зонда, (с бнотшювой, флуоресцентной, электронно-плотной, радиоактивной метками), иммуцогени, сорбенты и г,п.тя пложныв конструкции. 3. Ксшхо направленно регулировать моле-

Л'.’ЛЛЛ'Л; '!'•... чур !! -Л.~ V”! \"чг < •■-л;.,;1. . ■ л.-‘л ,

ГЬирИМииТЛЭ 1.1 ИО ООи^ОАОО диниш с_/ х ^>1^ • * • _„ _ _____..1_

дельно прост методически, проводится в рутинных условиях (не требует низких температур, безводных растворителей); следить за ходсм реакции можно с помошью обычной ТСХ, а очистка заключается в гель-(Тильтращга с визуальны:.; контролем. 5. Простота методики и количественные выходы позволяют синтезировать 1 мг конъюгата и мопее.

Б праыаиенак (см. главу 9). 1. Конъюгаты химически и термлчлекл устойчивы. 2. Благодаря инертной полиакриламидной матрице конъюгаты показывают низкую неспецифическую сорбцию по отношению к сывороточным бел>;а;.1 и клеточной поверхности; матрица сама по себе не проявляет иммуногенных свойств. Короткий алифатический спейсер так:;;е практически исключает неспецнфические взаимодействия с исследуемым;: белками. 3. Полиакриламид, являясь гибким полимером, служит дополнительным спенсером - не было ни одного случая взаимодействия с угле-В0Д-СВЯЗЫВЭЮ1ДИМ белком, который потребовал бы удлинения спейсера. Гибкий полимерный клубок, по-видимому, обеспечивает правильное под-страивание неогликоконъюгата к поливалентным углевод-связываюшим молекулам и их кластера:.! на поверхности клетки. 4. Серии конъюгатов

-------- —- ~ т.т*пп11ТТГ. /чОГГЛИИОТ) ^

----- 'Т-'” пплтилп«тл илпорппнпгп ТШГЯН71Я. Я ТЗКЖе ПОДОИрЗТЬ

плшхнчеилал лип цепни/»

тически все мембранные бежи гликозилированы, а значительная часть мембранных липидов - это, гликосфинголипиды. Интегральные и сек-ретируемые гликопротеины, гликолипиды и протеогликаны находятся в состоянии динамической связанности с эндогенными лектинами и другими белками, имеющими углевод-связывающий домен, образуя своего рода внешний цитоскелет - гликокаликс. Углеводы поверхности клетки и весь гликокаликс в целом изменяются в ответ на внутренний (например, смена фазы митотического цикла) и внешний (например, воздействие цитокинов) сигнал, являясь, : таким образом, характерным показателем состояния клетки, в том числе и патологического, в данный момент. Анализ литературных данных показывает, что на поверхности одних и тех же клеток одновременно могут быть экспрессированы как углеводные цепи, так и комплементарные им углевод-связывающие белки. Изучать экспрессию эндогенных лектинов можно, в том числе и на живых клетках, с помощью углеводных зондов (см. 8.4), а изучать экспрессию углеводных антигенов - с помощью антител и лектинов точно известной специфичности. В данном разделе описано применение группоспецифических и опухолеассоциированных олигосахаридов и конъюгатов (синтез которых описан в главе 8) для выявления углеводсвязываюших молекул клетки, а также для получения антител и изучения специфичности антител и лектинов как углевод-узнающих реагентов. •

9^1.___Выявление__эндогенных___лектинов___нормальных___и опухолевых

клеток [33,38,39,40] С помощью биотинилированных зондов (см. 8.4) изучали экспрессию углевод-связывающих молекул на клетках человека -мононуклеарах периферической крови здоровых доноров и больных некоторыми (см. таблицу 2) лимфопролиферативными заболеваниями, раковых клетках, а также на мышиных клеточных линиях Р-338 и Е1-4 (работа проводилась совместно с лабораторией проф. Д.Ф.Глузмана, Институт экпериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Кавецкого, АН Украины). Кроме прямого связывания зондов с клетками, изучали ингибирование связывания низкомолекулярными сахаридами, обычно в концентрации равной десятикратной мольной концентрации зонда. Результаты связывания 15 зондов (всего изучено 25) с клетками человека приведены в таблице 2. Прежде всего, следует отметить специфичность связывания, о чем свидетельствуют следующие данные.

1. Зонд С1с|3 (отрицательный контроль) не взаимодействовал с клетками.

2. Связывание олигосахаридных зондов ингибировалось соответ-

-зи-

Таблнца 2 Взаимодействие зондов с клетками крови больных гшобластоэй.м ' и с гистаоцитатм ко з;;сеу дативной едкости.

Заболевание* Зонды Лы-ПАА-биотин

ИЛИ клепш ----------------£ygT------------------------------------

’ ТР H Рис Ьеа Gal(3 В Iacïf bac Adl F3GN GalNAc F4GN Bdl А

! прз-ї-ОЛЛ t - - ^ + і f

2 пре-Т-ОЛЛ. + + + '■ - + * + -

3 О-ОЛЛ - + V - - - . -

4 О-ОЛЛ - - - + -

о О-ОЛЛ + - - - - + -

6 О-ОЛЛ' + + + + + -

7 О-ОЛЛ + - • - __ + + -

8 О-ОЛЛ + + , + + + _ -

9 ХЛЛ - - * - - + + _

10 ХЛЛ - - - - - +

И ХЛЛ - _ - - _ - -

12 ВКЛ . - - - - + , + -

13 ВКЛ + - - - + + -

14 НЗЛ + _ + + + _ -

15 НЗЛ - - - + + + +

16 НЗЛ . - - - + + + -

17 НЗЛ • ■— * + + + ,+ + +

18 НЗЛ - + - 4 +

19 ПЛ + + - + +, + +

20 ОМЛ - - + + + - -

21 ОМЛ - - - + - - -

22 ОМЛ - - + + - - -

23 ОММЛ + - + - + _ -

24 ОММЛ + - + -, _ -

25 ОММЛ + + - - - + -

26 ОМонЛ. + + + + + + -

27 ОМонЛ + + + + + но но

?8 ГГТСТИОЇШТН + - + - + + -

'У> Гі!стиоіі;ігп » - *

Ли ! ііслисішті; » * •

+ + . - - т т

+ - + но - - +

+ - - - - - +

- - + - - - +

+ + + + - +

+ + + _ - - +

+ + + - - - -

— + - но - - +

- + + - - + +

- + - + - + +

- но - - - + +

- + + - - + -

+ + + - - + +

+ + + - + + +

+ - + + - - +

- _ + но + +

+ + - - ■ + - +

+ - + . но + - +

+ + - - - + -

- + + - _ _

+ + + + + + -

+ + + - - + -

+ - + _ - + +

но но но но но но Н(

+ - - - - +

I и 1 і М 1 ^ КЛ^.іОК, " !!' . і .’V .

определялось

*острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ), плазмобластний лейкоз СИЛ). остры]

миелоблэгтаий лейкоз (ОМЛ). острый миеломоноблвстный лейкоз (ОММЛ),

острый мс-нобластный лейкоз (ОМонЛ), хронический лимфоцитарный лзйко;

(ХЛЛ), волосатоклеточный лейкоз (ВКЛ), В-клеточные формы яыюджкински;

лиыфом в стадии лейкемизашш (НЗЛ) .

ствуюшими низкомолекулярными сахаридами, но не ингибировалось близкородственными. Это показано на примере связывания зонда ЇТ (см. таблицу 3) с клеточными линиями; связывание ингибировалось Таблица 3.

Ингибирование низкомолекулярными сахарами связывания клеточных линий Р-338 и ЕЬ-4, а также клеток из миндалин с зондом ЗТ (0.1 мг/мл)

Ингибитор (0.15 нМ) Степень ингибирования _

Gal(31 -3GalNAca1 -sp + (полное ингибирование для всех клеток)

Galf31-3Gamca1-OCH2C6H5 +

Gal|31-3GalNAc + (частичное ингибирование) ...

Gaipi-ОСН3 - + '

Gaipi-3GalNAc|3-sp - (отсутствие ингибирования)

GalNAfca1-sp -

а-гликозидами ди сахарида ТР, но практически не ингибировалось р-гликозидом дисахарида TF и гликозидами моносахаридов. Аналогичные результаты получены с трисахаридными зондами А и В. связывание которых с клетками человека заметно ингибировалось лишь трисахаридами (А и В, соответственно).

3. Критерием специфичности связывания, служит также статистическая достоверность (сопряженность) связывания с большим массивом клеток пар зондов, х2 (таблица 4). Так, отсутствует корреляция для пар .

Таблица 4. .

Статистическая сопряженность связывания пар зондов (данные получены для всего изученного массива клеток)

___________________________р________________________р_____________________.

‘ TF ->4.4<- Риса Ъеа ->5.8<- Gaip

Мал ->5.0<- Риса LacN ->9.3<- Fuc4GN

H ->5.8<- Lac В ->4.6<- Gaip '

Lea ->4.5<- Lac Bdl ->4.2<- Afll

Lea ->6.9<- PUC1-4GN

Для остальных пар зондов из табл.2 корреляция недостоверна.

ИУСа1(3 и ТР/СаШса (что свидетельствует о специфичности лектина именно к дисахаридному фрагменту Са1@1-ЗСаШАса). Отсутствует корреляция для пер А^гі^їгі и А^/А^, что свидетельствует о специфичности лектина к трисахариду. В то же время наблюдается высокая корреляция Риса/Мапа, что отражает типичный для лектинов млекопитающих дуализм специфичности Рис/Мап, и подтверждает применимость

Л5НН0Р0 подходе к изучению специфичности клеточных лектинов.

¡мпчгрг-г Пр*.\РС70ВЛЖ’Т ■ .ЬЯ'<Нг:чН1;> ТрИОаХ арИДНЫХ ',")НДОЬ >■

И« КОТОРЫе активнее итиЫоЬт!Сл ^иаиишт'т, тСЗи и 1*1;!^.111 *

''■/.-луг, г тм-. чтг а: н::'‘.лгщш::н:1 ;!!;!;:!сип,)с;п шу.цу сь--пк

ииипиш ^ 1—'.* 1. - М.' >’ т 1 ^ ’"1 ч Г ' ■%Гг'!! , ■ ’!Гл (’I’!\!’ 1 ^'1‘Ь/1 ( I [ '1, г

Функция самих антигенов А и В, несмотря на их пирокую распространенность, до сих пор остается неизвестной; не■исключено, что обнаружение ¡IX ГШиифЧЧОСлЧХ кяеточпкх рСП-^ПТОрОГ СЯДОГеНКЬПГ .ЧаКТКНЮ -

.ь):!:'::'.:";1 нчясшт функшни I’>>у 1; 1 к;;11 ^ 1Ш1;.11 ч■.т.кп^ г.гппгоно!; Л и Г,. Чт:. касается функции А- и В-специфических лектинов в опухолевых клетках, то ярко выраженная реактивность метастазируюиих клеток наводит на

предположение, что эти лектины используются раковыми клетками в

качестве адгезинов, взаимодействующих с гисто-антигенами А и В при

метастазировании.

Анализ связи фенотипа изученных клеток с экспрессией на них эндогенных лектинов позволяет сделать следующие выводы. 1. Экспрессия лектинов зависит от природы клеток, стадии их дифференцировки и митотического цикла. 2. Вариабельность экспрессии велика, однако лишь для некоторых зондов наблюдается отчетливая корреляция структуры углеводного лиганда с типом заболевания, например, Риса1 -4С1сМс и В-клеточными формами неходжкинских лимфон. 3. Открываются возможности проводить дифференциальную диагностику заболеваний: хронического В-клеточного линфолейкоза и неходжкинских злокачественных лимфом, острого лимфобластного лейкоза и острого ыонобластного лейкоза.

Наибольшую специфичность к раковым клеткам проявляют зонды, в качестве лигандов которых выступают Са1Шса, СаШАса)-ЗСа1МАсЗ (Ре)

1 .... ч . ,,.....¡-'их но'"' II!!>П’ . ТЧК II ! ------ГГГ“Т П7РУТ^т^р«П"* . '»•та

ПЛТ>1!.;7ИЧГ-СКСр иСМбВРТСЙ ЯКОПТ>?ГГИ1П ПР.КТИНОВ, специфичных

!.!Г:К!:.'!'Т>Г>,»НМ* вчпииапрйотиий Р. опухоли: не исключено, 410 ОДНОЙ

ВреМеННаЯ ЗКСПрУССНЛ ил^лилси1Чин|*’п1'-и1...11 —- ■■ 'А);1 ^ ’ *

комплементарных им белков. Найденная закономерность заставляет по-

новому оценить феномен "скрытых" опухолевых 8нтигенов.

Структурные и биохимические характеристики УГЛеВОД-СВЯЗЫВ8ЮЩИХ молекул, выявленных при помощи биотинилированных зондов, предстоит изучить. Пока установлено следующее: обнаруженные молекулы являются не гликозилтрансферазвми, не антителами, а Са2+-зависимыми лектина-ми, которые можно элюировать без разрушения плазматической мембраны; некоторые из них вффинно выделены с помощью сорбентов (см. 8.4) и охарактеризованы величиной Мг; по-видимому, часть активных центров полисубъединичных лектинов связана со своим углеводным партнером, так как отмывка клеток ведет к эффекту усиления интенсивности окраски клеток зондами. Предстоит также выяснить, являются ли лектины опухолевых клеток уникальными, опухолеспецифичными белками, или наблюдается лишь увеличение экспрессии (или доступности) белков характерных и для нормального состояния эпителиальной клетки, что интересно с точки зрения диагностики злокачественных новообразований. Кроме того, если справедливо предположение о функциональной комплементарности углеводных опухолевых маркеров и эндогенных лектинов, представляется перспективным выделить и использовать для диагностических целей сами эндогенные лектины, обладающие, как показано, высокой специфичностью.

9.2. Получение и характеристика специфичности углевод-связыващщ_белков_как_реагентов [13,19,27,28,27].

9.2.1. Иммунизация синтетическими углеводными антигенами. В данной работе синтетические углеводные антигены использовались для получения как поликлональных, так и моноклональных антител. Поликлональные

О

кроличьи антитела к конъюгатам синтетических олигосахаридов ТР и Le с BSA, которые после аффинной хроматографии на соответствующих углеводных сорбентах можно считать моноспецифическими, использовались для выявления углеводных антигенов на поверхности тимоцитов и клеток линии F9, соответственно.

Преимущества синтетических антигенов при получении моноклональных антител не столь очевидны, как поликлональных, потому что гибридом-ная техника позволяет отталкиваться от гетерогенного, неочищенного антигена. Тем не менее, практика показала, что синтетические углеводные антигены не только значительно облегчают и ускоряют получение специфических гибридомных линий, но и позволяют добиться качественно новых результатов. Для иммунизации мышей использовали липофилизован-

пые фосфатидилотаноламином полиакриламидные антигены (см. 8.4),

гп>]. " ¡и:;: ур;:""п;, ни.) mmvhoi'î'Iîh^':"'!; :<( 'л^пкги,,; i убил;г: Гл;;т:тьн:

l\iU',cnet i((.идифиниронмши/ м-л одт-л. mviK-iUib^a.-:

- г f1, Т1а,Л~7Г'’чТ1 ■'* TT^IT T*î,VY',TTÏ,‘'r*TTT,!T* T1 ”TV/rîT1”TTT*nf?V™ ) TTna пг»титоит*а

нес, около 0.1 мг антигене/мышь. после стандартной процедуры слияния спленоцнтов ыыаи с миеломнымп г-летками, отбор специфических гибридом проводился с использованием синтетических антигенов. Так, при получении a’iTH-li^-aniUTWi, проверялись оккзившше анттс.' (. Ч /. /

браковать гибридомы, продуцирующие антитела широкой специфичности. Тонкую эпитопную специфичность полученных антител изучали при помощи набора синтетических олигосахаридов и конъюгатов несколькими методами (см. 9.2.2 и 9.2.3). Обобщая опыт по получению моноклональных антител к синтетическим антигенам Ьеу, Le15, bed, SlaLea, TF, Тш, можно отметить, что иммунный ответ к тетрасахаридам в применявшихся условиях был значительно специфичнее, чем к ди- и трисахаридам; данный подход позволил, в частности, получить несколько антител к Ьеу не только "абсолютной" специфичности (см. рис. 1), но и высокоаффинных, Кд=1СГ8 (это максимальная описанная в литературе величина для анти-олигосахаридных антител). Следует отметить также, что моноклональные анти-Ъе^ антитела, полученные к полностью синтетическому антигену, выявляли природный антиген Ley на клетках опухолевых линий.

Кроме облегчения технической стороны получения моноклональных антител, синтетические антигены открывают ряд новых, принципиальных возможностей. Во-первых, инициирование эффективного иммунного ответа к очень слабым, "молчащим", а также "скрытым" антигенам; чего не

7«»<чуттт»опп1та vimm/pMjj . т* ЧЯГ,ТНГ1ПТХ1 ППУХП.ЛР.ШМИ - ДЛЯ ПОИСК8

тела К химически синтезированным, НО не НВИдсппым о njJiipuAo, и „.«ши

куллрпшИ дхЯосшп i. w i *1 ■ ‘ 'Я' , J ■ ■1 '

рироаать антителч нужной vin-üiiHor- .•инлшфичюйти, чт>; п-:,сзС')Х.илнмг- щи швучьнии гистохнмг.' lcki'x {(‘•.•гснто» к уг.::;,г.:'¡;нмх дс.-термк

¡¡ант, КПГД-i i'I/!.“'!": i V ! 1Л fj ; Л’ TU 'pf’ ri i ’1 Т.Н: Ф7''ТТТГ;^Т чо, 1 nr

<Зокам жранирон' cc.t f jiii’.ît.u*,. На^ианиы*' « >'»!*.ожно;ти :-:;ш>дл?сл ¡;

состоянии экспериментальной проверки.

9.2.2. Изучение специфичности моноклональных антител. Ингибиторный ИФА. Всего изучено нескольких десятков МА (против антигенов А, В, Н, 1ех, 1еу, Т, 31а1еа), полученных непосредственно в группе структуры и синтеза углеводов ИБХ, совместно с другими лабораториями, в других лабораториях, а также полученные с Рабочих Совещаний международных конференций по моноклональным антителам. Специфичность НА изучали разработанным применительно к углеводным антигенам вариантом метода ингибиторного ИФА (твердофазного иммуноферментного анализа). Лунки 96-луночных планшетов (из полистирола или поливинилхлорида) покрывали синтетическим (ПАА-конъюгат) или природным (гликопротеины эритроцитов человека) антигеном подобранной концентрации (обычно 1-10 мкг/мл), подбирали оптимальное разведение антител, затем ставили ингибирование, добавляя серийно двукратно разведенные олигосахариды или их конъюгаты. С помошью данной тест-системы было показано, что антитела 1Н10 (полученные против рецептора эпидермального фактора роста клеток А431, в лаборатории проф. Н.Н.Никольского, Институт цитологии РАН) узнают тетрасахарид А типа 3, до сих пор не обнаруженный в клетках А431; антитела ЗР9 и 44Р9 (получены иммунизацией эритроцитами человека, в лаборатории проф. И.Л.Черткова, ВГНЦ) направлены против детерминантного трисахарида А, причем для вторых вклад фукозильного остатка в связывание незначителен. То есть три антитела совершенно различны по своей тонкой эпитопной специфичности, тем не менее все три являются хорошими типирующими реагентами для эритроцитов при определении группы крови. Полученные результаты позволили выдвинуть следующую гипотезу о специфичности "идеальных" (т.е. одинаково хорошо узнаюших эритроциты А| и А2) реагентов: они должны быть либо строго направлены к терминальному трисахариду А и при этом нечувствительны к эпитопной плотности олигосахаридов на эритроцитах, либо должны одинаково хорошо распознавать как антигены А типа 3, так и Н типа 3, т.е. взаимодействовать с внутренним участком тетрасахарида А типа 3. В отличие от анти-А. все десять изученных анти-В !,!А (получены в ВГНЦ. и .........с Рабочего Совещания по

анти- эритроцитарным МА в Лунде, 1Э89), независимо от различий в агглютинации подтипов эритроцитов, узнавали детерминантный трисахарид В и были нечувствительны к эпитопной плотности трисахарида: единственной особенностью !.1А, выделяющихся способностью агглютинировать все подтипы эритроцитов В, было взаимодействие с тетрэсзхарндом

Рис Связывание ионоклоналы;ых aimi-Lcr1' шлттея В2 с РАЛ-коііьюгатаи;; олнгосахарздоз, нанесеннши на полістирол (96-луночные плакаты). По оси X - концентрация антигена, ыкг/луику. По осп У - поглсцгки& (4S2 іг*о.

' і

1.5 --

Le — PAA (10%) Ley- PAA (30%)

Lex — PAA (30%)

H (type 1)-PAA(10%)

Рис. 2 . Ингибирование связывания акти-Ьеу- антител Н01 конъюгатоы РАА-1еу различными низко- и высокомолекулярными сахарами в ИФА. По оси X - концентрация ингибитора, икг/ил. По оси У - ингибирование, %.

100

В типа 3, который до сих пор не обнаруживался в составе эритроцитов человека ни химическими, ни иммунохимическими методами.

С помощью ингибиторного ИФА показана очень высокая олигосахарид-нвя специфичность нескольких МА против синтетического антигена Ьеу (см. 9.2.1), которые не взаимодействовали с близкородственными олигосахаридами Ье^, Ьех и Н (тип 2), а также их дисахэридными фрагментами (рис. 2).

9.2.3. Изучение специфичности МА методами прямого связывания. Хотя

наиболее."тонкую" информацию об эпитопной специфичности антител дает метод ингибирования, прямое связывание также находит сферы приложения, в частности, для скриннинга гибридом-продуцентов антител, для изучения чувствительности антител к эпитопной плотности антигена, а также для тех случаев, когда антигена слишком мало для постановки ингибирования. В данной работе мы использовали три варианта прямого связывания, в качестве твердой фазы выступали: полистирол (96-

луночные планшеты), нитроцеллюлозные мембраны (дот блот, см. 8.5), макропористое стекло (см. 8.4). Сравнение результатов прямого связывания с результатами ингибирования олигосэхаридами проведено, на примере 10 анти-В-антител. Найдено, что некоторые из МА, взаимодействие которых совершенно не ингибировалось В-дисахаридом, при постановке прямого связывания показали высокое (хотя и меньшее, чем к трисахариду) сродство к иммобилизованному В-дисахариду. Таким образом, информация, получаемая в экспериментах по связыванию и по ингибированию, может значительно различаться; по-видимому, ингибирование дает специфичность как таковую, на уровне взаимодействия одного РаЬ-фрагмента, в то время как при прямом связывании на результат накладывается эффект поливалентности, причем величина этого эффекта в значительной степени определяется способом иммобилизации (то есть представленностью) олигосахарида.

9.2.4. Тест-сястема для изучения специфичности лектинов. Антитела и лектины - два класса углевод-связываюших белков, существенно различаются по характеру связывания с гликоконъюгатами, что. с одной стороны, дает основание предполагать для них существенно разные механизмы белок-углеводного взаимодействия, а с другой стороны, позволяет решать существенно разные задачи при использовании их в качестве, инструментов исследования гликоконъюгатов. Поэтому, параллельно с генерированием моноклональных антител нужной специфичности.

ь:а изучала зкзогешшо лектсны б качество потенциальных рсогснтои іілл ■і ллллоіллпіл г.роьн и ьллклгллл ■П~П"Г'П’"- —. о.'їнн И"3 них -

лллл .и ..и!ь ... її.

”‘™п; . Чн-л" липхимкн. .львов) сисі^іачсл г.

ОбїІ^руЖбІІО ПОВЫИОННОв СОДЄрі^ашіе ии’Ші иі,ала|лідии ^ ^ ^-Л_

изииж&ие ИБ-11ко" кз-оз их способности свлзцвсться с епти-В р-ггеїтілл. Поэтому представлялось кктерсснші изучить топкую спецк-

і-- лг.л л мног ) лс:: ■ пиа :. ■ ;лп:л,л1люг(. ¡гаг; л: . ..■ г . лл. >•.■.

анализа моноклональных апглтед (си. 9.2.2), сказалась в даииом случай непригодной, так ккс лектші кеспсщгЬгчсски сортировался іш пласти:«. причем независимо от того, нанесен иа пластик предварительно и-СаІ-содеряалшй глккокопъигэт, или нет. Поэтому был разработан обратный вариант твердофазного анализа: сначала лектин сорбировали ни пластике (физическая сорбция), затем изучали его связывание с бпоткшшіровапнш зондом в присутствии ингибиторов. Зонды для такого типа тест-систем брались аналогичные описанным ьише (см. 8.4 и 9.1) для выявления эндогенных лсктинов поверхности клеток. В качестве углеводного лиганда зонда подбирался сравнительно низкоаффинный, чтобы можно было ингибировать поливалентное связывание зонда с дентином невысокими концентрациями низкомолекулярных сахаров. В частности, для лектина из М. /оззШэ лигандом зонда служила галактоза в (3-конфигурации. Изучение широкого круга моно- и олигосахаридов, ¡їх природных и синтетических конъюгатов, позволяет сделать следующие заключения о специфичности лектина из М. /сззШз. 1. Из низкомолекулярных галактозо-содержащих сахаридов наибольшую

ппч^ппйяппопиитюванные дисахариды ТЕ и Т

сиг"

иппп ингиЛиплвяния (Ш ' Ш'/ШЧ і іилаоил

*СКХ

содержания ь нем

- . мпн.лшл.. Лін їм . -^„ііісіь Т ¡ллл ■<:. ТТр"™";

_-/К Л .,'УЛЛ!Л їм;. : ІЛ .¡ЛкіЛЛІ, ”7П "Т Т’Р"Т”НЛП рмЛ У яті як—

. . ■ '.гін ,мгя л;Л;'[ №1. Млжчл '1 ] (лай\н ллілі, ,л

евлзпвакия с активным центром лектина существенна конфигурация ти-

юв С2, СЗ и С4 (совпадающая для В-галектозы и Ь-рамнозы), кроме гого, в лектане • есть гидрофобный сайт, связывавшийся .либо с нотпль-юй группой рзшгозы, либо с а-агликоном галактозы. Яв рис. 3 показа-ш предполагаемые сайты подобия Ь-Ига и ГМй!.

Второй изученный лектин выделен из семян Butea /гопаоза« по гатературным данным этот лектин специфичен к гапактшираппзе. "

юмошью аффинной хроматографии на сорбенте GalNAca1-3Gal <А-

исехарид) лектин был разделен ка две формы разной специфичности, пеиифичность определялась С ПОМОШЬЮ описанной выпе ТеСТ-СИС1еГ.Н, 3 ;ачестве специфического компонента был взят лиганд аффинного сор-

бента. т.е. А-дисахарид. Изучение ингибирования взаимодействия с омоиью широкого набора моно- и олигосахэридов выявило следующую

пеиифичность двух лектинов (см. таблицу 5). БРА-1: Puca1-2Gal и

e\i5Aca2-6Galj31-4Glc; БРА-11: Gaipi-3GlcNAc и GalMca1-3GalMcB.

олимерные формы олигосахаридов, в отличие от описанного выше праые-

а, показали незначительное увеличение активности по сравнению с пзкомолекулярными сахаридами (не более двух порядков, см. таблицу 6.

»¡лучение эпитопной специфичности лектинов показало, что лектин из . fossil is является потенциальным реагентом для выявления терато-арцином (специфичен к Т^), а лектин II из В. frondosa может быть еагентом для обнаружения антигена Форссмана GalMca1-3GalNAc.

9.3. Антитела сыворотки крови человека С23.32,35.36.44].

.3.1. Тест-система для выявления больных лепрой. Хотя специфический нтиген микобактерии лепры не имеет прямого отношения к группо-пепифическим и опухолевым маркерам, иммуноферментная тест-система а основе ПАА-конъюгата углеводного антигена М. leprae (3,6-ди-0-етил-(3-Б-глюкопиранозы, DMG) является удачным примером, где со-етаются высокая чувствительность и специфичность полиакриламидного онъюгата. Для выявления больных лепрой диагностическое значение меют антитела класса IgM к MG. Рис. 4 показывает, насколько низ-

ОН

НО a- D-Gal

но

or- L-Rha

ОН ОН

... .

.’.-,.-4 «.v.. ....

Kuli (манси iCBTiaum 50^-horo ингибировании (альнал величина ингибирования, V Лктча»* и-т»

Ингибитор • l!j"A 1 ЕКА II СТИЧИиНИС. к RFA I ’•

mM „г. „л мМ мг mi

! и < 'z ) J-, \*■ 11 \C'C f'l... 1 . «IN \f , " N, '■ ! ,,г. Г-. 1 М3 ь/.

07 0.5 н.о 1 и.о.

,<\ V -т м (jaip-siNj*

Galcc-Äfuf

Cidl^l-'íGlcNAcp-sp

GaJ¡JI-3G]ciNACiJ-.«p

GalNAc

Gal^-ONp

GalNAcct Muí Г,,В-г

.4-1 m- ít. л< !>" ' и /'

2-Дезокси-/>-(^а)

Gal^-OBzl

Gal

Gala-OMe

Gal^-SEt

GaU-OMe

° tt?í-GC4сЛ Acö-ep 0»i

Galß-NlITol

GalNAcß-sp

GalNAcal-3GalNAc&-

sp

GaI?l-4Glc-oí

Gal?l-3GalNAcMp

tíalaJ-3Ga!NAca-sp Atn (тип 1)

16

1,7

2

2.3

3

0.5

0.9

1

0,5

С,У

3.3

ОЛИ 38; U.Oí)

0,2

1,0

l.t

Ü.5(3ö)

0.045

0,05

o.c.

íi.V43>

Ь 2 1 Vе" : (s.',> :

С 1 и. 2(38»

б 1.0 7(38)

8 1.4 25 4.Г>

9 1,8 3 0,0

0 2 9 2

10 2 10 2

1,С<43) 1(53) и п

3(42) 1(42) 3(19) 1(19).

7(37) 2(37) 4(32) 1 (32)

3(33) 1(33) 2 0,9

3(31) 2(30 <и 0.00

/ . И. 3(33) 1(33)

» 2(30) 1(30)

3(28) 0.5(28)

Ä 3(25) 2(25)

X25 x 10

1 /:*

у.ч

* МиГ-метилхмболлифпшл. Lac — лактоза, sp — OC!I,CJl,Cll,NHCOCF,. Np - l-.raTpwKm'o. Toi — 4-толуил. Adi-GalNAmWGalß-sp. Bdl - GaloslJüalMP ■ Alri (тип n-r,alNAcal-3fi.,]H|.

•G1 ^'jj порядке уменьшения активности по отношению h BFA I.

3* Отмечено, когда разница более чем двукратная,

** 11. о — не определялась, н п.— не ингибирует.

Ингибирование двух форм лектина на Д. fr&ndosa (BFA I н BFA II) полиакриламидными производными сахаридов и природными групооспецнфическимп ' А1И1 1 Л С веществами *

Концентрация 50%-ного ингибирования (Максимальная величина ингибирования, %) АКТИВНОСТЬ BFA II по

Ингибитор •* BFA I BFA II

мМ МГ/М.1 мМ мг/мл К ВГА I»*

.-vn-iirtíi fbIW~ ПЛ л • i!3 П \ ППч on?* ñ'ñí n ftñft Х5

. U..I Нчл l,er' II \ \ И„,, и„а, Fucal-3Gal3-IlAA l.o' МЛ \ I Киса II \ \ 1 1(42) Í 1. í г»i) Н 1 и,id л 17 * 0 Пд(ЗГн 0 5(25} 1(42) ítííi - I и. и,! и п И (1 1 1 ('.I И. о. , | С,2

* НАЛ — полиакриламид, ЬСА—бычиа сывороточный альбумин. Anaj, Впа{, IInaj — сум-парная фракции гликопротеинов из человеческих эритроцитов групп крови А, В n H. Aj, — GalNAcal-3Üalß-8p, B¿¡ — Gaial-3Galß-ep, Atri (тип 1) - GalN’Acal-3GaIßl-3GIcNAc.

** В порядке уменьшения активности по отношению к BFA I ** Отмечено, когда разница более чем двукратная •* Н о — не определялась, н. и.— не ингибирует.

Проверенные в качестве ингибиторон, но оказавшиеся неактивными по отношению к обеим формам лектина из В. frondosa вещества: L*Ara. L-Araft-OMuf. GalN-HCl, D-GuJ. D-GalA.

i>-T ul. /-Pr ,rn.r»\h,f Г.ия-í» t..r о * »> /*-»/» . - ... -

1/

Puc.t РасШРоька датигеноь и сыаороток оол&ных лепрой.

По оси X KtwêHTPoiiW QttiwreriQ при сенеадилюацми планшетов; HÛ 0&И У П0ГА0Ц4НМй Ь Ц<РА"С6МЬ шьых еооштет&пот /ДОЙНЫМ pasefcAfi-HMSM сыбороиц {начинав с титра );воо)

1 0£ 0,25 0J25 $тг 0,0} 0,016 0003 ОООІ 0002 0,00/ 0,000?.

. . ■ DMG-BSA

ш га 25 {if s,2S }J2 is vs q# a,2 .<?/ aos

Puc.5 PesvAbTQTot сраыштедьного ИФА (гистограмма) сыюроток больных ЛвПРОЙ /IL/, ÎVECîWeiû лёглих /Т/ н доиороь /АІ, с мспольм ьанием двуX онтигеноь.

По oí'/У - 'дптвкси'ьносі ь псглощениа 5 ПФА.

кой может быть концентрация антигена для сенсибилизации полистирол; (0.0! 01 мкг/мл) иг) сравнение трвдпшклш.' шлк^ьоушьн.

1£Л-цсс;:гс’гсл! ;!■ лс.-:.: :р'.0уетсл ;н. дчь ■ (.,.ог

К!‘Ъ"ИЧ;Ч’ТНП ПНТ’И I ^[!г| } . А, рис . ^ : и К о^!лР,Г , ч ?л;1 '1 )Л ЬК( > ЯП с) Пн)! "I ИМ г.1 К^/

ГТОНИфИЧНР'УГЬ ПАЛ -КОтЮРЯТЯ пг’ГН* (Ч 1г:!ШфИЧН1 и : И 1ч,м - т л\ь*. I и а 1'.^, ,;и

г&птена: больные лепрой Ы,, туберкулезом Т и здоровые доноры четкс

отличаются по интенсивности реакции с ПАА-ШС но не с ВБА-ЫМ е

7‘2Ср^бОТЯ”КОЙ Т?СТ-Г*Т*ГТРМв ) . прцмр.рй г.ИЯ'РвТИЧР.Г.КПГП ЯНТИГвНЕ

полимеризациеп з-акриламидопропил-^, Ь-Д11-и-метИЛ-р-и-1*Л1или1шрсзпио*1дс с акриламидом, и второй - присоединением З-ашгаопропилгликозида диыеталглюкозы к поли(4-нитрофенилакрилату), с точки зрения выявления антител были совершенно идентичны. Данная тест-система легла в основу создания практически значимого диагностикуыа для выявления больных лепрой и контроля за ходом химиотерапии.

9.3.2. Выявлений аутоантигел к спухолеассоцаированнсыу антигену ТР.

У карцяномных больных, согласно литературншл данным, наблюдается снижение уровня естественных антител класса 1ф1 к антигену Томсена-Фриденрейха, что было показано с помощью ИФА, где в качестве сенсибилизирующего антигена брался эритроцитарный материал. В данной работе изучены две тест-системы с использованием синтетических антигенов, ТР-ВБА и ТР-ПАА, аналогично вариантам из 9.1.3. Второй, полностью синтетический антиген, давал существенно лучшие аналитические результаты - низкую неспецифическую сорбцию (фоновое значение) и большую аналитическую чувствительность по выявлению анти-ТР-антител в сыворотке крови. Результаты тестирования сывороток здоровых доноров и пациентов с опухолями молочной железы показали, что: 1)

!/' Г7”""'Г ~ "7ТТТ**^ !ТГ тт т» rt r>Ttr>TTVr* TTT\OVrmn7ûr>vriT>

ІТПТи ОТЯТИСТИЧРСКИЙ М£ТРТУИЯ.Л .

0.3. Л. Ггаирсвакле человачиских анти-А и англ-Б антасызсрстск. :■ гематологии для оценки титра тишфуюших реагы-пиа іанш-А и ¿лі;;; ь

1.ui4>:!.'K.K и МЛ і ;і::;ии'Ьоуи'ї' эритроциты, kl.pi ори:' її a ,і}кіКТ.іК! :i. ..

ttu і ciGpui'cnhùCTiri ki wi'pui;H4eiüiüi U СрОКа лриіі-НАІ.-: ÜL' ..ІиГу І' і і . - 'і

дартом. Поэтому актуально создание синтетических. действительно

гандартных, заменителей эритроцитов, в качестве таковых в данной аботе опробованы латексы с иммобилизованными трисахаридами А и В синтез, см. 8.5). Однако, прямая реакция агглютинации, аналогичная закции эритроцитов, была неспецифической из-за спонтанной агрегации этексных частиц при контакте с сыворотками. Поэтому на основе тех э латексов была разработана непрямая твердофазная сэндвичевая тест-ютема, с визуальной оценкой результатов. Тестируемые сыворотки жубировали с ПАА-конъюгатами трисахаридов, иммобилизованными на -образных лунках планшета. Антитела обнаруживали соответствующим этексом (А или В). Разработанная полуколичественная тест-система 5ладает всеми необходимыми свойствами, чтобы стать стандартом при феделении титра сывороток и моноклональных антител.

.3.4. Получение сывороток анти-Юь Сыворотки доноров с высоким держанием анти-Юьантител, используемые для определения резус-эктора при переливаниях крови и контроле конфликтных беременностей, ж и любые другие сыворотки, могут содержать анти-А и анти-В антика. мешающие определению резус-антигена. Лишь около, 10% популяции юноры группы АВ(IV)] не имеют этих антител. Таким образом, около )% Кьсывороток непригодны в качестве анти-1Ш-реагентов. В данной ¡боте предложено (совместно с лабораторией акад. АМН Е.А.Зотикова, 'НЦ) два способа получения пригодных для ТШ-типирования реагентов ! сывороток групп А, В, и 0. Первый подход заключается в аффинном (алении анти-А и анти-В антител из резус-сывороток с помощью аф-1нных сорбентов, представляющих собой трисахариды А и В, им-»билизованные через акрилатный полимер на макропористом стекле (см. 4). Испытания сорбентов, проведенные на нескольких десятках стан-1й переливания крови в течение трех лет, показали их практическую гагодность для получения анти-ТШ-сывороток. Сорбенты удаляют мешаю-:е диагностике антитела из всех сывороток, в наиболее неблагоприят-IX случаях (когда титр анти-А/В антител высок) требовалось провести :укратную сорбцию для полного удаления антител. Сорбенты легко генерируются, что позволяет использовать их более десяти раз без 1тери активности. Сорбенты рекомендованы Минздравом СССР (1991 г.) 1Я практического применения на станциях переливания крови [44].

Второй подход к универсализации анти-Юьсывороток - нейтрализация не удаление) анти-А и (или) анти-В-антител. Для этой цели были пытаны водорастворимые ПАА-конъюгаты трисахаридов А и В, которые

“'""'"¡ни полттогтьг: г~л~:тбл77' 7?е;крл?ггг.~ън'тг г;тг“‘ .гл,

1*'.1;!т;1:.л»1::'л;!:•; ■ :'инн'. п.к’Лг смиплш; ''¡а'-; ■ гг-:\

Г ТЧЙПФЯП^ПМ Р^ТНТРФ11иРГипрГ> ЦПНТ.ШГ'Я'Т'Я Я УП1тУ1к*^Г Я«ФЦ[1РНЙ п ННП'Н-

I- .1 ■" ■- ■! 1\.Г Ч!1 г Г ¡-’М'мИ- ‘ г---!-. -.■ ‘ !'. ■ . 11 > 1 . ■!,.,н:

ра^раиотнмы дии метидики пилучупин иьширитик вкти-гш - алинимичмьж

с использованием сорбентов, и скоростная, с использовекийм ПАА-конъкгатэв. •

олк.:)' Ч( :-И'

водов и углевод-свлзивоааих белков (дектинов) поверхности клетки. Чувствительные 1.:?торн х>!гд:ческого аншгаз? углеюдшх цепоЗ. татг ьак описанный ь главе & пацход к хроматографическому выявлши» флуоресцентно-меченых О-т'ляканов. позволяют определять итегрсльнгх? количество цепей данных г,:пов. Цито.<ш.гаческие подходи, использукягне

меченые антитела и лекглны хорошо известной специфичности, позволяют выявлять апкрип:- эпопонирсЫоаю цепи, количество которых может быть

значительно ыеныыш, чем интегральнее, в силу зхранлрозашосто сс-седняк:*, ооьем*стыни уолзчулами и связанности с бндогсинымк лек-тинами. Обе величины, кж общее количество данных гликаноЕ, так количество открыты:: для сзжмолспствкя с другими клзтккд:, важны пр; изучении функции гликанов и являются взаимодополняющим1.!. Особен:;;-ценной, в денное вреуя практически недоступной, является пнформаш;-" о дижипше излленечия углеводных цепей в процессе взаимодействия с другими клетками и молекулами. Такую информацию монет дать физико-

химический подход - спектроскопия ГКР (гигантского комбинационного

рассеяния), который позволяет регистрировать специфический сигнап от

* »к

Гт’Крич’НХ ^несвязанных с .тк-ктцкями ' ПИЯЛИПГГОЯННИХ уг.цр.ВПЛНЫХ пепел .

'1 ич< I.’ г ■; ‘ *;.’а ' •' ■ лн : • " ■

раоотанньш и разраоишаьемыи далье нимилели мешдичеолнл иидлидии

■; - н - ' : '

СТВИЯ, Н ЧрОПе- ¥''ЗНП!‘ ’НУг’1''"Т1' «:,‘'ТКГ.

*K1 ./>', N.7..v-j, A .['..-T U ,

. T>. fr, . N. V . iiovi:;I.!(<-v. .v?i:i r-:-s i du~>-

and studies oi tneir organization in nomial and tumor u.j-aoid

glycoprotein as probed by suriace-erihanced Raman spectroscopy. -Applied Spectroscopy, 1993, in press.

ВЫВОДЫ:

. Синтезированы следующие группоспецифические и опухоле-юсоциированные сахариды в виде свободных и (или) спейсерированных юединений:

исахариды А, В, Н, И1, Т^, Т^, Ез, СаШАса1-ЗСаШАса, Ьес.

'аса! -ЗСа1, Риса1-301сПАс, РисоИ-401с1ТАс, Са1|31-4С1сНАс; рисахариды А, В. СаШса1 -30а!81 -ЗС1сМАс, Н (тип. 2), Н (тип 3), еа, Ьех, Ъей, Р1, р\-

етрасахариды А (тип 1), А (тип 2), А (тип 3), В (тип 1), В (тип 2), (тип 3), 1еЬ. Ье7, 51аЬеа; также Тп> Тп~5ег и ТР-Бег.

. Предложены новые в химии углеводов синтетические приемы, защитные руппы и синтоны: общий метод синтеза глико-оксазолинов; 2-азидо, 4, б-три-О-бензил-2-дезокси-р-В-галактопиранозилхлорид для синтеза -галактозаминидов; хлорацетильная и тетрагидрофуранильная зашиты; эвые подхода к введению, в том числе селективному, бензильной за-;ты; регионаправленное гликозилирование; тионирование ацетамидной ^гнкции; деспейсерирование.

, Разработан универсальный метод синтеза полимерных неогликоконъю-этов, основанный на конденсации поли(4-нитрофенилакрилата) с -аминоалкилгликозидами, а также метками и другими дополнительными 1гандами. Синтезированы псевдополисахариды, олигосахаридные зонды : биотиновой, радиоактивной, флуоресцентной, ртутной метками),

'огликолшшды, гликосорбенты и группоспецифические латексы.

С помощью биотинилированных углеводных зондов показано, что: на поверхности нормальных клеток крови и раковых клеток экспрес-рованы лектины, специфически связывающиеся с олигосахэридами, в м числе групповыми антигенами (А, В, Ье) и опухолевыми маркерами п, Рэ, 51аЬеа);

для раковых и особенно метастазирующих клеток характерно повышен-е содержание олигосохарий-связываюших лектинов; .

высокая экспрессия опухоле-ассоииированных олигосахаридов со-овождается одновременным накоплением комплементарных лектинов.

Разработан подход к получению моноклональных антител к синтети-зким углеводным антигенам, • включавший иммунизацию эгликолнпидаии, скриннинг гибридом с использованием псевдополи-(аридов, установление эпитопной специфичности при помоши олиго-

сахаридов и их полимерных конъюгатов. Полу чини моноклонсльнио антитела К íiiniU'r,hí;.,i Та*. Т.-Г-3'. Т.С^ 7, Г.1пТоа.

Ь. Придлоу.ена iiMMyН’ .v<-.p: л;:, i í i: . С Т - СПСТи.Г: JUi.i ; i 'i.; ,J¡¡,:'и.! TCHKOÍ

“П7~ППОД 'ГПеЯйфйЧНОСТИ МЛНПКЛПНЯЛЬНЫХ антител К углеъиды

-':p;:KTf;p;K;;.i!íi;í., чв три;;;;:.-:"; .нт,i Л- и .'Лг:;: Г; Míütu:, ^г .: ;г рЫХ ИШрОКО ИСПОЛЬУуЮТСЯ ДЛЛ j. рjГ'_Г

.охарактеризован ряд анти-Le3, a¡mi-Iex, анти-1еу, aim-SiaLe3, анти-Тпг, и анти-Н антител.

7. Предложена имлуноферкентаа; .’fгд1стьмг> дли уг ■ г<л;~о

_ \ !ДН(" 11 ГПЙППфПЧНООТИ .uüí.'.i';: ’.rí'/;ítí¡!' ' 'П* i;i!¿ .Г'*Ж'О \ ; Jk'h ; i 1 i10 í ■■ м'

Butea frondosa и liísgumus fossílts.

8. Разработана неинструментальная латексная тест-система для типиро-

вания сывороток анти-А и анти-В в практической гематологии.

9. Внедрены в практическую гематологию два метода получения сыворо-

ток анти-Rh из групповых сывороток: 1) сорбцией групповых антител I и В на гликосорбентах; 2) нейтрализацией групповых антител А и I синтетическими гликоконъюгатами.

Основные результаты диссертационной работы изложены в следующих статьях и авторских свидетельствах:

1.Н.В.Бовин, С.Э.Зурабян, А.Я.Хорлин. Бензилирование бензил-2-ацет-амидо-З.б-ди-О-ацетил-г-дезокси-а-ГЬглюкопиранозида. - Известия А1 СССР, сер. хим., 1980, N 1, с.199-201.

2.Н.В.Бовин, С.Э.Зурабян, А.Я.Хорлин. Введение бензильноЯ зэщии вместо ацетильной в частично ацетилированных сахарах. - Известия Ai СССР, сер. хим. ,1980, N1, с.215-217.

3.Н.В.Бовин, С.Э.Зурабян, А.Я.Хорлин. Хлорацетильная и 2- тетра-гидрофуранильная группы как временные защитные группы в синтез« олигосахаридов. - Еиооргая. химия, 1980, т.6, с.242-249.

790. ' ' • •

Í.U ¿-ЦуОс*1о. i • . ^ . i . 1

■j.И.Б.Бовин, С.Э.Зурабян, 4.Я.Хсрлин. Удобный метод синтезу 2-метил-1ХКо[2. Wlj-2-оксэзолжюь. - Лзвестая АН СССР, сер. хим., 1081, '

н °, ".2806-2^08. .

7.'J.7.Bovín, S. Е. Zurabyar., A.Ya.Xhorl in. Stereoselectivity of «;i,y>x; sylation with derivativas oí 2-azido-2-deoxy-D-galac topyra nose. 1'гк synthesis of a determinant oligosaccharide related to blood group i (type 1). - Carbohydr. Res., 1983, V.112, P.23-35.

в.N.V.Bovin, S.E.Zurabyan, A.Ya.Khorlin. The effect of substituents on the reactivity of the double bond of D-glycals. - J.Carbohydrate Chem., 1983, V 2(3). P.249-262.

9. H. 3. Бовин , А.Я.Хорлин. Синтез детерминантных олигосахаридов

грулпоспе цифре ских антигенов крови системы АВН (тип 1) и тетрасахарида Ье из общего предшественника. - Биоорган, химия, 1984,

т.10, с.853-860.

10. Н. В. Бовин, И. А. Иванова, А.Я.Хорлин. Искусственные углеводные

антигены. Конъюгация трисахарида Ье с полимерами по схеме: олиго-

сахарид—>гликозилированный спейсер—>антиген. - Биоорган. химия, 1985, т.11, с.662-670.

11 .А.Я.Хорлин, Н.В.Бовин. Иммобилизация трисахарида Ьеа и мурамил-дипептида на полиакриламиде. Встраивание адъюванта в искусственные

углеводные антигены. - Биоорган, химия, 1985, т.11, с.671-673.

12.Н.В.Бовин, А.Я.Хорлин. Удобный синтон для получения детерминантных олигосахаридов Ье и АВН (тип 1). - Биоорган, химия, 1985. т.11,

с.836-829.

13.А.Э.Медведев, Н.Д.Габриэлян, Н.В.Бовин, А.Я.Хорлин. Моноспе пифи-

ческие антитела к искусственному Т-антигену, характеристика их специфичности и применение для идентификации Т-антигенных детерминант на поверхности клеток. - Биоорган, химия. 1985, т.11, с.908-919.

14.Н.В.Бовин, Е.Ю.Корчагина, А.Я.Хорлин. Простой синтез бензил-2-

-ацетамидо-4-0- (2,3,4,6-тетра-0-ацетил-р-1>-галактопиранозил )-6-0--бензил-2-де зокси-а-Б-глюкопиранозида. - Биоорган, химия, 1985, т.

11. с.1253-1255.

15.Н.В.Бовин, Т.В.Землянухина, А.Я.Хорлин. Синтез неогликопротеинов, 16сущих гаптены Gal(3l -3GalNAoal )5ег, Gaip-3GalNAcai, Gal|31-3GaINAc|3l, (GalNAcal-)Ser. -Биоорган, химия, 1985, т.11, с.1256-1264.

16. В. В. Юровский, Н.В.Бовин, Н.Г. Сафронова. Р.Г.Василов, А.Я.Хорлин.

1скусственные пептидные и углеводные антигены. Иммобилизация гап-

генов и адъюванта (МДП) на полиакриламиде. - Биоорган, химия. 1986, N12, с.100-105.

7.Н.З.Бовин, Т.В.Землянухинэ, А.Я.Хорлин. Изомеризация трифтор-

щетамидопропил-2-ацетамидо-2-дезокси-|3-В-галактопиранозида в

t-аномер. Удобный метод синтеза искусственного Т-антигена. - Био-)рган. химия, 1986. т.12, с.533-538.

8.Н.З.Бовин. Л.Ю.Мусина, А.Я.Хорлин. Подходы к избирательному «нзилированию первичной гидроксильной группы. - Известия АН СССР. :ер. хим.. 1986, N 3. с.671-€75.

9.А.Я.Хорлин. Н.В.Бовин, Н. Д. Габриэлян, Е.В.Таргульян, Г.В.Затева-инэ, Л.М.Анфимова. Поликлональные антитела к искусственному анти-ену Льюис А: получение, характеристика и их применение к идентифи-,аши углеводных детерминант на поверхности клеток тератокарциномы -9 мышей. - Иимунология, 1987, N 5, с.65-69.

.Гч;влн, А.Я.Хордин. Оли.'/нремгнаый синт*»* дьп яхирилси

FjvMi - 3Glc'IAc ,i i"j«ai-4GloNA. i. вавб- й- (тр>!$л:

гликозилов. - Биоорган, химия, 19«у, т.13, c.14ud-14uo.

, 1 ,1.1:.0?млянуллна, :1.Б.Г-оьп.н , Н.Э.г-оЯр.мчм . Син о-.- -it-:: .т/ :o:ii>„

лады АН СССР, 1988, т.299, с.129-131.

'22.H.В.Бовин, Т.В.Землянухинэ, Ц.Н.Чэгиашвилл, А.Я.Хорлин. Искус-

СТрГТТИ!.!^ ^^rvSou'pvi г> ррупНОВ1^# г'Лйт^^^дичоо.Т^

I-' . Тг , и Ьн . •• Химия природных согзинкний. 193ft, !1 В, с^*5.

23.Ц.Н.Чагиашвили. Е.А.Зотиков, Н.В.Бовин, is.ю.Корчагина. получение

сывороток антирезус с помощью синтетических иммуносорбентов А и В. -Гематология и трансфузиология, 1989, N 8, с.56-58.

24.M.N.Matrosovich, I.V.Mochalova, V. P. Marinina, N.E.Byramova, N.V.

Bovin. Synthetic polymeric sialoside inhibitors of influenza virus receptor-binding activity. - FEBS Lett., 1990, V.272, P.209-211.

2 5. Т.В.Землянухинэ, H.В.Бовин. Синтез олигосахаридов с групповой

специфичностью крови А, В и Н (тип 3). - Биоорган, химия, 1990,

т.16, с.1096-1104.

26.N.E.Byramova, L.V.Mochalova, I.M.Belyanchikov, M.M.Matroso vich, N.V.Bovin. Synthesis of sialic acid pseudopolysaccharides by coupling of spacer-armed Neu5Ac with activated polymer. - J.Carbohydrate Chera., 1991, V.10(4), P.691-700.

27.0.E.Галанина, E.И.Дерюгина, А.Е.Носырев, М.И.Лапенков, Т.В.Земля-нухина, Е.Ю.Корчагина, Н.В.Бовин. Эггатопная специфичность гемаг-глютинирующих моноклональных анти-А-антител. - Биоорган. химия, 1991, т.17, с.343-352.

28.0.Е. Галанина, Е. И. Дерюгина, Н.И.Оловникова, А.Е.Носьфев,

М.И.Лапенков, Н.Б.Чекнева, Т.В.Землянухинэ, Е.Ю. Корчагина,

Н.В.Бовин. Эпитопная специфичность гемагглютинирующих моноклональных

анти-В-антител. - Биоорган, химия, 1991, т.17, с.1177-1187.

. А .F. I vurK-v , М. V. bov i n, F. Y j . Kvrch«« i;i4, V.T'.Zjt, .. Favoral.l-

t-iosji--.' i fi'1 reactivity of t,l(>o<1 group P antiir^nJ? tr iHae-'har'i 1-

OlitsillXUcll J-Ji owvciOhod pvly .« \ *— ' О *. ~ ■

poro'js {’1hss. Biomedical Chromatography. , 199?, V.6, Т\1<*-4?.

ЗО.Д.в.Глузмчн, H. В. Бовин, И.Ь.АОраменко, Л.М.Скляренко. Эндогкчнш-лектины клеток иммунной системы и лимфоидных новообразований. -Экспериментальная онкология, 1992, т.12, с.13-22.

31 .Д.Ф.Глузман, Н.В.Бовин, й. В.Абраменко, Л.М.Скляре нко. Эндогенные лектины клеток опухолей и некоторые аспекты метастазирования. -Экспериментальная онкология, 1992, т. 14-, с.3-10.

32.N.V.Bovin, Е.Yu.Korchagina, T.V.Zemlyanukhina ' et al. Synthesis of polymeric neoglycoconjufi-ates based on N-substituted polyacrylamide.

- Glycocon. J., 1992, V. , P. .

33.1.7. Abramenko, D.F.Gluzman, E.Yu.Korchagina, T.V.Zemlyanukhina,

N.V.Bovin. Oligosaccharide-binding molecules on the surface of human

hemopoietic and lymphoid cells. - FEBS Lett., 1992, V.307, P.283-286.

34.Е.Ю.Корчагина, H.В.Бовин. Синтез спейсерированных трисахаридов с

групповой специфичность™ крови А и В, их фрагментов и структурных

аналогов. - Биоорган, химия, 1992, т.18, с.283-298.

35.П.НЛагиашвили, Е.А.Зотиков, Н.З. Бовин, Е.Ю.Корчагина. Получение

универсальных сывороток антирезус с помощью растворимых синтетичес-

ких групповых веществ А В. - Гематология л трансфузиология, 1992, N

2, с.15-16.

36.Е.Ю.Корчагина, Ю.В.Лукин, К.Н.Климова, Н.В.Минеева, Н.В.Бовин,

3.П.Зубов, О.Я.Волкова. Тест-система для оценнки активности и специфичности изогемагглютинирукдах сывороток. - Гематология и транс-

фузиология, 1992, N 3, с.34-35.

37. O.E. Галанина, С.Падманабхан, Е.Ю.Корчагина, Т.В.Землянухинэ,

3.3.Демин, Н.З.Бовин. Специфичность лектина из Butea, fronäosa. -

Биоорган. химия, 1992, т. 18, с.346-356. -

38.H.-J.Gabius, S.Gabius, T.V.Zemlyanukhina, N.V.Bovin, U.Brinck,

A.Danguy, S.S.Joshi, K.Xayser, J.Schottelius, F.Sinowatz, . L.F.Tietze, F.Vidal-Vanaclocha, J.-P.Zanetta. Reverse lectin histochemistry: design and application of glycoligands for detection of

cell and tissue lectins. - Histol. Histopathol., 1993, V..., P. -

39-N.V.Bovin. Sugar-polyacrylamide conjugates as probes for cell

lectins. In: Lectins And Glycobiology, H.-J.Gabius, Ed., Springerverlag, 1993, P. 23-30. •

40.N.V.Bovin, E. Yu. Korchagina, -T.V.Zemlyanukhina, D.F.Gluzman, I.V.

Abramenko. Oligosaccharide-binding molecules on the surface of human

iiemopoietic cells. - Experimental. Oncol., 1993. V.15. P.41-46.

41.A.c. 925963 (СССР). Способ получения ацетилировзнных 2-метил- '

гдике-[2,1-с1]-2-оксазолйнов. Н.В.Бовин, С.Э.Зурзбян, А.Я.Хорлия.

Хпубл. в Б.И., 1980.

42.А.с. I6I6924 (СССР). З-Аминспропилгликозиды дисахаридов в качестве лигандов иммуноссрбентов для связывания группоспепифических ан-гител энти-А и анти-3. Е.Ю.Корчагина, Н.З.Бовин. Опубл. в 5.И., 1988

13.А.с. I6I42202 (СССР), Способ получения искусственных антигенов.

1.3.Бовин и др. Опубл. в Б.И., 1988. .

И.Е.А.Зстиков, С.Я.Донсков, А.А. Михайлова, А.А.Бэшлай, Н.З.Бовин,

1.Н.Чэгпэшвили. Удаление из сыворотки энтлрезус-КМВ) антител другой специфичности. - Методические рекомендации, Минздрав СССР, М.' 1ЭЭ1.

►5. Н.Э.Бовин, А.Я.Хорлин. Мягкое отщепление олигосахаридных О-пепей 'ллхолрстеинов в виде полных ацетатов. - Биоорган. химия, 1985, '.11, с.420-421.