Синтез искусственных антигенов, содержащих фрагменты О-специфических полисахаридов бактерий рода Salmonella серогрупп А, В, О1, Е тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКА/ЕМИЯ МУК ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ОРГАНИЧЕСКОЙ НИМИИ " им. Н.Д. ЗЕЛИНСКОГО

На правах рукописи УДК 547.450.22.057.579.642.14.093.3

ЛЕВИНСКИй Анатолий Борисович

СИНТЕЗ ИСКУССТВЕННЫХ АНТИГЕНОВ, СОДЕРИМ ШИК ФРАГМЕНТЫ О-СПЕЦИФИЧЕСКИН ПОЛИСАХАРИДОВ БАКТЕРИЙ РОДА БАитоНЕНА СЕРОГРУПП А, 8, Оц Е.

02.00.10.- Биоорганическм химии, химия природных и физиояогически активных веществ

ч

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москйа 1993

Работа выполнена в лаборатории химии углеводов Иститута органической химии им. Н.Д.Зелинского РАН

Научные руководители: академик Н.К. Кочетков кандидат'химических наук А.Я. Черняк

Официальные оппоненты: доктор химических наук Э.И. Будовский кандидат химических наук Н.Э. Байрамова Ведущая организация: Московский институт тонкой химической технологии им. Н.В.Ломоносова

Зашита диссертации состоится г.

в часов на заседании специализированного совета К 002.62.02 по присуждении степени кандидата химических наук в Институте органической химии им. Н.Д.Зелинского РАН, 117913, г.Москва, Ленинский проспект, 47, конференцзад.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИОН РАН Автореферат разослан 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор химических наук

Н.Я. ГРИГОРЬЕВА

Актуальность работы. Бактерии рода 8а1топе11а являются рас-ространенныпи возбудителями острых кишечных заболеваний. Забо-еваемость сальмонеллезами о мире и в нашей стране в 70'/. случаев Ливана сальмонеллами серогрупп В и в меньшей степени й и Е. лабораторной диагностике сальмонеллезов используют в качестве '-антигена лилополисахариды (ЛПС) сальмонелл. Молекулы ЛПС состоят из трех различных по составу и принципу построения частей, одна из которых, О-специфнческин полисахарид, отвечает за специфичность взаимодействия бактерий с другими биологическими системами. В структуре О-антнгенов сальмонелл содержатся общие для разных серологических групп фрагменты, что затрудняет идентификации). Неогликопротеины, получаемые по принципу ковалентной прн-шноки детерминант ЛПС к природным белкам, моделируют только специфичность природных углеводных антигенов, но не сам иммунный ответ. Для точного моделирования и специфической диагностики необходимы искусственные антигены, содержащие характеристические олигосахарндные детерминанты и не содержащие нммуногенной белковой компоненты.

Новый принцип конструирования искусственных антигенов, предложенный в 1979 году в лаборатории химии углеводов ИОН РЙН и основывающийся на включении детерминант о высокомолекулярную полимерную цепь путем сополимеризации с неуглеводным мономером, позволяет получать высокомолекулярные безбелковые гляшонъюгатм.

В связи со структурными и синтетическими исследованиями О-антигеиных полисахаридов грамотрнцательных бактерий, проводимыми в лаборатории химии углеводов ИОХ РйН, н работами по усовершенствовании диагностики острых кишечных инфекций и иммунобиологическим изучением компонентов бактерий, проводимыми ЦНИИЗли-

*

демиологин, представлялось важным получить искусственные безбев-ковые углеводсодержащие антигены со специфичность» серологичес-

ких групп й, В и Djl бактерий рода Salmonella и диагностические препараты на нх основе.

Цель работы. Настоящее исследование посвящено разработке методов синтеза производных углеводных фрагментов бактериальных антигенных полисахаридов и высокомолекулярных искусственных антигенов на нх основе. Были поставлены следующие задачи: 1) синтезировать производные ояигосахаридных детерминант 0:2, 0:4 и 0:9 липополисахаридов бактерий рода Salmonella серологических групп А, В, D^ соответственно, содержащие группу, способную вступать в сополимеризацию с мономерами неуглеводной природы; . 2) получить высокомолекулярные моно- и полиспецифические искусственные антигены сополнмеризацией производных углеводных детерминант с акриламндом; 3) изучить возможность получения на основе олигосахаридных детерминант аффинного сорбента для выделения моноспецифических антител; 4) изучить возможность введения лнпофильных Фрагментов в молекулу синтетического антигена для сенсибилизации эритроцитов и получения эритроцитарного диагнос-тикума; 5) изучить возможность иммобилизации углеводных детерминант на полиглнцидилметакрилатном латексном носителе с целью получения латексного диагностикума.

Наччная новизна и практическая ценность работы. Синтезированы непредельные (аллнльные и акриламидоэтильные ) производные углеводных детерминант 0:2, 0:4 и 0:9 липополисахаридов бактерий Salmonella, способные вступать в сополимеризацию с акриламндом. На их основе получены искусственные моно- и полнспецнфическне антигены серогрупп й, В и D^, проявляющие высокую активность в серологических реакциях, а также получен аффинный сорбент, содержащий углеводные детерминанты фактора 0:4, и с его помощью из сыворотки выделены моноспецнфнческие антитела. Получен искусственный антиген со специфичностью фактора 0:4, обладающий повы-

шенными липофильными свойствами и способный сенсибилизировать поверхность эритроцитов. Путем присоединения к латексным частицам углеводных детерминант, соответствующих факторам 0:4 и 0:9, получены препараты для диагностики сальмонеллезов групп В и D^ методом латексагглютинации.

Апробация полученных результатов. Отдельные части работы докладывались на: V Всесоюзном симпозиуме "Целенаправленное изучение физиологически активных веществ", Рига, 1983 г; VI Всесоюзном симпозиуме "Синтетические полимеры медицинского назначения", йлма-йта, 1984- г, XIV Менделеевском съезде по общей и прикладной химии, Ташкент, 1989 г.

Структура и обьем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения полученных результатов, экспериментальной части, выводов, приложения и списка цитированной литературы ссылок). Общий объем диссертации ЛЪЪ страниц^

в ней содержите?. 4Г таблиц и 33 схемсгь

Срдержаци«? Р^РТЧ-

Биологические повторяющиеся звенья О-специфических полисахаридов ЛПС бактерий рода Salmonella серологических групп и Е могут быть представлены обобщенным олнгосахаридным фрагментом

R Glc

л II «II

2 3 1,4 1,3 J4 1

-> Man -> Rha -> Gal -—>

<»(ß) <1 d(P)

где R= flbe (абеквоза, 3,6-дидезоксиЧИ:сило-гексоза, группа В) Tyv (тивелоза, 3,ь-дидезоксиЧ)-арабнно-гексоза, группа D) Par (паратоза, 3,6-лидезоксиЧ)-рибо-гексоза, группа А)

Серологическая специфичность определяется уникальным» фраг-игнтами в структуре повторяющегося звена О-полисахаридной цепи' липополисахарида. Повторяющееся звено построено на основе общего 5яока моносахаридов - маннозил-раммозил-галактоза, который, в

- А -

«ависимости от серогруппы, содержит гликозидные связи разной стереохимии н модифицирован уникальными для каждой серогруппы бактерий иммунодоминантными остатками Сахаров - Par, fibe или Tyv. Для специфической диагностики сальмонеллезов требуются искусственные антигены с характеристическими олигосахаридными детерминантами. Группоспецифическим факторам 0:2, 0:4, 0:9 сальмо нелл в структуре ЛПС соответствуют однотипно построенные дисаха ридные детерминанты 3-0-(а-паратозил)-а-0-манноза, 3-0-(<»-абек-возил)-<И)-манноза и 3-0-(«-тивелозил)-л-0-манноза, которые нам и предстояло синтезировать. Общим элементом дисахаридов является маннозныи остаток, замешенный в положение 3 ¿-связанным иммуно-домннантным сахаром.

Высокомолекулярный коньюгат было решено получать методом, предложенным в лаборатории химии углеводов ИОИ РАН , состоящим в сополимернзации олигосахарндных детерминант с неуглеводным мономером. Принципиальной особенностью метода является введение в олигосахарндную детерминанту в качестве агликона непредельной функциональной группы (нами были использованы аллильная н акрил-амндоэтильная группы). Варьируя количество и природу второго мономера, можно изменять содержание олигосахарндных детерминант и, следовательно, относительную частоту их расположения вдоль • линейной цепи образующегося высокомолекулярного носителя. Все выше сказанное определяло план синтеза искусственных антигенов, который состоял из следующих этапов: 1) синтез непредельных а-гликоаидов D-маннопиранозы со свободной гидроксильной группой при С-3, 2) синтез гликозилируюиих агентов (гликозилгалогенидов паратоэы, абеквозы и тивелозы), 3) синтез детерминантных олиго-сахаридов, содержащих аллильнын или акриламидоэтильный остаток, 4) сопояимермзация олигосахаридн1>1Х детерминант с акриламидом.

Синтез непредельных а-глнкозндов Р-маннопнранозы. Для получения углеоодсодержащнх мономэров о качестве исходных соединений были выбраны два производных маннозм:

5 1?=-СН2СН=СН2; (?х= йс

11 Р=-СН2СН2ННС0СГ3; Вг

Для введения непредельных функциональных групп были использованы два тактических варианта. Йллнльнын аглнк'он вводился на первых стадиях гликозилированием аллнлового спирта. Для получения акрилонльного производного использовали тактику введения непредельной функции на последней стадии акрилонлированнем, после удаления трифторацетильнон защитной группы.

Синтез аллил-2,4»б-трн-0-ацетнл-<1-0-маннопиранозида (5) был осуществлен по разработанной нами схеме:

сИаОН

С^оч Ме р-снг

СН20АС

СН,ОАс

СН2СЖс Е1?СН3 -

Н0>

1 5 Ой

Р——СН2СН—СН2

Различная гидролитическая устойчивость 2,3- и 4,6-О-изопро-■жлнденовых групп в аллил-2,3;4,6-ди-0-изопропилиден-<Н)-манно-1иранозиде (1) позволила в условиях кислотного гидролиза (водный ацетон, ТзОН) получить аллил-2,3-0-изопропмлиден-<НЭ-маннопира-

- б -

нозид (2) с выходом 69%. Последовательное ацетилнрованне (2) и оштение второй изопропилиденовой группы приводило к *ллмл-4,6-ди-(Нщетив-«-0-наннопирано8иду <3) с в диодом 90Х. Получение производного паниозы (5) со свободной 3-ОН-группой основываюсь ид свойстве орто»фирнон группировки, сочлененной с пирднознын циклоп и вкдмчамиэй аксиальную и экваториальную гидроксильиме группы, раскрываться в условиях мягкой кислотной обработки (80* АсОН) с образованием вииинмьной системы с аксиальной сложно -•фирной и экваториальной ОН-группамм. Подобное раскрытие, проведенное для 2,3-этилортоацетата (4), дало возможность получить с выходом 90Х дллил-2,4,6-три-0-ацетил-<1-0-маннопиранозид (5). Строение соединений (3) н (5) подтверждали данные ^Н-ЯИР.^С-ЯИР спектроскопии. Кроме того положение свободной гидроксильной группы в (5) было подтверждено методом метилирования ( С^Ы^ вг3хе120) и хромато-масс-спектрометрией.

Кдичевой стадией в синтезе второго паннозного производного 2-трифтор»цет*ми*о«тил-2,4,6-три-0-бем»оил-*-[>-м»ммопираио8ИА«1 • (11) было селективное бензоилирование аксиальной 2-ОН группы в. соединении (в) бензонлцианидом.

11

\ -СН2СН2МНС0СГз

Защита ОН-групп беизоидьнмми остатками снижает опасность возпож-

ых миграций ацильных групп. Гликозилнрование 2-трифторацетами-озтанола л-ацетобромманнозой (б) в присутствии Нв(СМ)2 приводит соединении (7), которое через 4,б-0-изолропилиденовое произ-одное (8), селективным бензоилированием превращали в 2-0-бен-оильное производное (9,выход 77%). Последовательные ацетилиро-ание (9), удаление изопропилнденовой группы и бензоияироваиие риводили к полностью защищенному гяикозиду (10), дезацетилиро-ание которого мягким метанолизом (НС1/МеОН) давало целевое про-зводное (11) с выходом В7Х. Строение соединений (7-11) подтвер-дается данными *Н и 13С-ЯМР спектроскопии. Таким образом ыли получены соединения (5) и (11) со свободной 3-ОН группой, редоественники необходимых углеводных детерминант.

Синтез гяикозиябромидов З.б-дидезокси-гексоэ.

По литературным данным известно, что применение в гликози-><ровании гликозилбромидов 2,4-ди-О-п-нитробензоильиих пронзвод-.ix абеквозы и тиеелозы и 2,4-ди-О-бензильного производного па-»този приводит к удовлетворительным результатам. Поэтому было ;вено при получении детерминантннх фрагментов использовать эти >оизводные, полученные по модифицированной нами методике.

Синтез метил-3,б-дидевокси-а-0-гексопиранозидов основывался к введении 3,6-дидезоксигрупп и обращении конфигурации при С-2 С-4 в исходном а-метил-[)-гл»вкопиранозиде (см. стр. в ). Введе-1в 3-дезоксизвена осуществляли раскрытием ¿-окисного цикла в б-О-бензилиден-2,3- или 3,4-ангидро-производнмх (13,15) дейст-1ем ИЙ1Н4, протекавоее однозначно с обращением конфигурации 'И С-2 и С-4 соответственно. С целы» упрощения эксперимента мм казались от введения б-дезоксизвена через б-бромпроизводное, ручающееся при раскрытии И-бромсукцинимидом диоксанового цикл'а 4,6-0-бензияиденовых производных, н дальнейшего каталитическо-дебромирования. б-Дезоксизвено образовывалось при восстанов-

16МИИ 11й1Нд 6-тоэилоксигруппы в соединениях <19,20), полученных юсле каталитического СРв/С) снятия бензияиденовой защитной •руппм в соединениях (16,19) и монотозияироеанмя. В случае соединения (13) при действии Ш1Н4 происходило одновременное раскатив ¿-окисного кольца и восстановление б-тозияоксигруппы. 3 результате применения более простых и однозначных реакций удаюсь повысить выход целевых продуктов (14,23,24) почти на 10*.

Синтез производного паратозы (24) проводили двумя вариантами. 1ервый вариант включает 11 стадий и позволяет использовать про-тежуточные производные синтеза тивелозы после предношенного нам обращения конфигурации при С-2 (16) избирательным окислением !г03 2-ОН группы и последующего восстановления №ВН4 2-кетогруп-ы в (17). Второй вариант короче (4 стадии) и основывается на адикальном (Ви^пН / М,Н'-азо-бисизобутнроннтрия) дебромирова-ии 3,6-дибромпроизводного, получающегося при действии трибром -1идазола на «-метил-О-глюкопиранозид в присутствии РЬ^РН. йцети-ированием (25) удалось упростить выделение его в виде 2,4-ди-О-цетильного производного (26) из реакционной смеси. Бензияирова-ие *-метияпаратозида проводили действием бензилбромида в при-утствии МаН и Ви^Шг, по методике примененной для данного сое-инения впервые и позволившей с выходом 86% получить дибензиль-ое производное (24).

Для успешного проведения стереоселективного «-гликозияирова-ия производных (5,11) синтезировали следующие 3,6-дидезоксмгек-озилбромиды:

■ Вп(А Ар бВп

22

которые вследствие их чрезвычайной лабильности получали непосредственно перед глнкознлированием. Нетилглнкознды <14,23) превращали В гдикозилбромиди (27,28) действие» НВг/С^С^при температуре -10°. Аналогичная обработка соединения (24) приводила к полному разложению бромида (29) и отщеплению беизильных групп. Поэтому синтез гликознлбромнда паратозы проводили непосредственно во время гликозилирооания (см. стр. 11).

Палчченне олнгосахарндних детериннант 0:4 н 0;9.

Синтез олигосахаридных детерминант 0:4 и 0:9 проводили путем глнкозилнрования производных (5) и (11) в условиях Гельферн-ха (Нг(СЮ2, МеСЫ) действием 1,5-1,8 экв. соответствующего глнкознлбромида (27,28).

27(28) + 5(10.

30.32^34.35

441

22,21 К1=^=0ВгН02, Р2=К3=Н, й5=йс, Я=-СН2СН=СН2

_ _ _

22,22 ^=К4=Н, К2=К3=0ВгН02, Р=-СН2СН=СН2

21 Я1=й4=0ЭгИ02, й2=й3=н, 1*5=Вг, Я=-СН2СН2ННСОСГ3 25 Р1«!?4«»), Р2=Р3=0ВгИ09, Рр'Вг, й—СН2СН2ННС0СГ7

26.21 К1=^=ОН, |?*=к0=|з:э=н, к=-сн2сн=сн2

22.22 р1^4^5^, |?2=|?3=он, 1?=-сн2сн=сн2 (Ш Р1=к"=ОН, К2=К3=Й5-Н; к=-сн2сн2мн2

41 Р1«*4«*5'»!*, (*2=К3=0Н; Р=-СН2СН2МН2

^-^«ОН, К2«К3«{*5»Н, Ра-СН2СН2ННС0СН»СН2 В результате реакций были получены и выделены колоночной хроматографией мажорные л-связанные дисахариды 30(75/4),

2_пЗ_п5_,

32(66,5/0, 34(41/0 , 35(66/0 и минорные р-связанные дисахарндм 31(19/0 и 33(29/0. При гликознлнровании соединения (5) соотношение дисахаридов 30(<О:31(р)= 4:1, 32(л):33(р)= 2,3:1, а в случае гликознлировання соединения (11) р-соззанние дисахарндм при выделении продуктов реакции обнаружены не были. Удаление защитных групп на дисахаридах (30-33) проводили действием ВаО о кипящем абсолютном МеОН, а на дисахаридах (34,35) обработкой аиионнтом Дауэкс 1x8 ( ОН"- форма) в водном метаноле. Выходы незащищенных олигосахарндов (36-41) составили &9-97У.. Днсахарнды (40,41), содержащие первичную аминогруппу в агликоне использовали о дальнейшем для иммобилизации на нерастворимых носителях.

йминоэтнлглнкознд (40) N-ацилировалн действием акрнлонлхлорн-да в водном метаноле в присутствии анноннтя в HCOjj- форме и выделили детермннантный дисахарид (42), соответствующий Фактору 0:4 сальмонелл, о виде акрнламндоэтилгликозида, удобном для со-полнмеризацин с акриламндом.

Строение полученных олигосахарндов подтверждали данными н 13С-ЯМР спектроскопии с использованием методики селективного гвтвроядврного двойного резонанса, результатами кис-

лотного гидролиза (соотношение 3,6-дндеэокснгексоза: манноза, 1:1) и результатами метилирования и хромато-масс-спектрометрнн олигосахарндов.

Получение олигосахарнлиой детерминанта 0:2.

Синтез необходимой днеахаридной детерминанты осуществили гликознлированием маннозного производного (И) бромидом, образующимся In situ в реакции гликознлировання (в присутствии глнко-зилируемой компоненты, безв. CoBr2, Bu^NBr и молекулярных ент 4Д°, в СН2С12, fir ) действием Me3SiBr:

24 + 11

С^ОИ2

.сн^ннк

42 ^=Вп, а2=Вг, к=-сосг.

;сц4кнк

йй (г=вг, Я=С0СГ3

I I

4. +

45 Я1««. (?2«Вг, й-СОСТз Ц

Щ й1»!?2««, Р»-СОСН«СН2 Реакция приводи«« к спеси дисахарида (43) и 3-О-тримвтилсилило-вого вфира (44), разделение которой нетодоп ВЗШК после гидрирования давало дебензилированный дисахарид (45, 23%) и десилилиро-ванный глнкознд (11), который вновь использовали в реакции гли-козилироеания. Дальнейшее превращение дисахарида (45) в 2-апино-•тильное производное (46), & затем Ы~акри*оияьное производное

(47) проводили диалогично превращению дисахарида (34). Строение дисахаридных производных (43-47) было подтверждено данными

и *'с-ЯМР спектроскопии.

В результате проведенных реакций получили производное (47), которое могло быть использовано для сополимеризации с акриламидоп. Получение вкриярияьного производного лстсриииннты 0;3. Ранее полученный в нашей лаборатории 4-нитрофеннвгяикозид

(48) детерминанты 0:3 ЛПС серогруппы Е

а к1- н

гидрироваииеп нд Р«^ превращали в производное (49) со свободной

первичной аминогруппой. Последовательная обработка (49) 2,5-»кв. CHgsCHCOCl ( МеОН, К2СО3) и НеОЫа приводили к кристаллическому М-акрилоильному производному (50, 63Х), а затем к дезацетилиро-ванному соединении (51, 93Я), которое представляло собой глико-зид углеводной детерминанты 0:3 и содержало акриламидний остаток в аглнконе ( данные 13С-ЯМР спектроскопии).

Таким образом в результате химического синтеза были подучены непредельные производные (36,38,42,47,51) детерминант соответствующие О-факторам 2,3,4,9 серогрупп Я.В.О^ и Е Salmonella, пригодные дня получения высокомолекулярного конъюгата методом деполимеризации.

Сополимеризаиия углеводных детерминант с акриламидом. Ранее в нашей лаборатории было показано, что високопоиешяриив неогликоконъюгаты, полученные на основе отдельных синтетических О-антигенных детерминант методом сополимеризации с акриламидом, обладают моноспецифнчностьм в серологических реакциях и могут быть с успехом использованы в иммунохимических исследованиях н в качестве диагностических препаратов. Очевидно, что метод сополимеризации открывает возможность объединить в молекуле неоглнко-коньюгата одновременно несколько синтетических О-детерминант. Подобные полидетерминантныв гликоконывгаты могли бы оказаться полезными для скрининга сывороток в эпидемиологических исследованиях подобно применяемому в настоящее время коммерческому аритроцитарному сальмонеллезному диагностикуму на основе ЛПС серогрупп rt.B.Cj^.Cg.O и Е.

В связи с этим на основе детерминантных олнгпсахаридов (36,36, 42,47,51) были получены монодетермннантныв (52-54) и полидетерминантныв (55-58) линейные полиакрилапидные гликоконьмгитм.

сонн сох

Й-СН=СН + СН =СНСОПН --> [ —(СН—¿1) -^СН—СИ—(СН—¿Н) —]

2 2 2 2 х 2 | 2 у п

где

52 (0:4) й - ЙЬе-(л1->3)-Мап-(л1->0СН2-, К» ЫН2 §2 (0:9) й = Туу-(й1->3)-Иап-(<11->0СН2-, К= ЫН2 51 (0:2) « Раг-(«1->3)-Мап-<<*1->0СН2СН2ШС0-, К=< Ш2

55 (0:4,9) R = ЙЬе - (<11->3)-Мап-(<*1->0СН2-, К= Ш2

и = ТуV-(й1->3)-Мап-(а1->0СН2-,

56 (0:3,4,9) и = ЙЬе-(л1->3)-Мап-(л1->0СН2-, К= Ш2

й = Туу-(ч1->3)-Иап-(а1->0СН2-, й «= Мап - (Р 1->4)-ЙЬ а-(<*1->3) -6а 1 - (Р 1->0С^Н^ЫНС0-§2 (0:2,4,9) I? » ЙЬе-(«1->3)-Мап-(<*1->0СН2СН2ННС0-, Н= НН2 « Туу-(«11->3)-Мап-(а1->0СН2-, Е = Раг-(а1->ЗИ1ап-(й1-ЖН2СН2МНС0-§а (0:4) й = йЬе-(л1->3)-Мап-(а!->ОСН -,

х=-инсн2сн2шсо (СН2) 14сн3

Превращение олигосахаридных детерминант в полимеры было осуществлено методом радикальной сополимеризацнн с акрнламидом в воде, при 20°С, в присутствии персульфата аммония н Н.М.Ы'Н'-тетраметилэтилендиамнна. Для получения сополимеров на основе углеводных детерминант (36) и (38), с содержанием углеводов ЗОЯ (по весу), смешивали детермииантные олигосахариды и ак-риламид в мольном соотношении 1:2,5. Уменьшая соотношение углеводного мономера и акриламида, получили сополимеры (59-62) с содержанием углеводов 10'/., 7'/., 52'А соответственно. Увеличение соотношения до 1:1 приводило к получении сополимера с содержанием углеводов 34%, что говорило об ограниченной возможности введения виниловых мономеров в сополимеризаци». В случае акрилами-доэтилгликозидов соотношения мономеров 1:7 в исходной смеси было достаточно, чтобы ввести до 30% углеводов в сополимер. Это практически подтверждало необходимость использования мономеров с одинаковой реакционной способность».

При получении полидетермннантнмх сополимеров в сополимериза-цкю вводили такое количество (по массе) углеводных детерминант, чтобы в сополимере соотношение введенных детерминант составляло 1:1:1, а по массе - 30/É углеводов.

Введение в сополимернзацию мономеров с реакционноспособными группами ( -С00Н,-ЫН2 и т.д.) открывает возможность для проведения модификации полимерной молекулы различными реагентами. Дцнлнрорание полнакриламндногп сополимера. С целью повышения липофнльности искусственных антигенов и создания на их основе эрнтроцитарнмх диагностических препаратов провели модификацию искусственного антигена со специфичностью 0:4 остатками пальмитиновой кислоты. Для этого незамещенные амидные группы сополимера (52) частично переамиднровали безводным этилендиаминоМ при 85°.

CONH CONH C0NHCH-CH-MH CQMH

|2 J 2 J 2 2 2 J 2

[-(СН—СН)—СН—СН—(СН—СН)-] ->[-(СН—СН) —СН—ПН—(СН—СН)-] —>

2x21 2 у п 2x21 2уп

R (52) Й

СОНИ СОН

—> С - (СН—¿H)—СИ—< СН—¿н) - ] R = rtbe-(<»l->3)-Han-(<il->0CH-2 х 2 I 2 у п 2

I X = -NH-CH-CH-NHC0(СН )—СН (59) R 2 2 2 14 3

После гель-фильтрации на Sephad'ex G-50 выделили амниоэтнлирооан-ный сополимер с содержанием 3,2/£ аминогрупп. Лцилнрование паль-митоилхлоридом в водной щелочи при 0°С по Шоттен-Бауману приводило к ацилироваиному сополимеру (58), с содержанием »Q5Í остатков пальмитиновой кислоты и соотношением абеквоза : манноза 1:1 (данные углеводного анализа).

Выделение н сронстеа искусственных антигенов. Выделение полимеров из реакционной смеси проводит гедь-хро-матографией на Sephadex G-50 ( Pharmacia, Sweden ) и*и геле Toyopearl HW-65 ( Toyo Soda, Japan ) в пиридин-ацетатном буфере

(рН 4,1). Выход полимерной фракции составлял 25-65Х, считая на детерминантиый олнгосахарнд. Выход увеличивался, при переходе от млнл-гликозидов к акрнламидозтил-гликозидам. В случае аллил-гликозидов выделяли низкомолекулярную фракции, которая содержала, в основном, невступивший в реакцию аллил-гликозид, который после регенерации использовали повторно. Сополимеризация акрила-иидоэтилгликозидов протекала практически полностью без образования низкомолекулярной фракции. Гель-хроматография сополимеров на 8ерЬа<1ех 6-100, 6-200 и даже на БерЬагове 2В приводила к элюции полимера с свободным объемом. При гель-фильтрации полимеров на геле НН-65, имеющем отличную от декстрана природу, наблюдалось удерживание сополимеров в геле до объема, соответствующего молекулярной массе 100-250 Кд (калибровка колонки по Оех^аи Т-2000, Т-500, Т-250, Т-100, Т-40, полизтиленгликоль РЕ6-40, РЕ6-6 ).

Физико-химические характеристики сополимеров. Калибровка колонки

Полимер Мономер полимер мономер V мл удержив Стандарт V мл удержив

52 36 ♦40° +131° 69 Т-2000 55

53 38 +32° +108° | 69 Т-500 65

54 47 +33° +89,5° 71 Т-250 69

55 | 36,39 +38° - 75 Т-100 78

56 |38,42,47 - - 71 Т-40 81

57 |38,42,51 - - 77 РЕв-40 90

58 36 - 70 РЕБ-б 98

Интервал молекулярных масс 100-250 Кд был подтвержден ультрафильтрацией растворов сополимеров через мембраны КМ-100 и ХМ-300 01аИо ("йш1соп"). Следует отметить, что оценка молекулярной массы по хроматографическим параметрам достаточно прнблшительна

из-за различии в строении сополимеров и калибровочных веществ.

Строение сополимеров (52-62) подтверждали данные моносахарид-ного анализа и 13С-ЯИР спектроскопии, при этом химические сдвиги сигналов атомов углерода, относящиеся к углеводным остаткам, практически совпадали с нх положением в спектрах олнгосахаридных мономеров. Это доказывает, что процесс радикальной сополимернза-ции не сопровождается деградацией иди модификацией углеводной части мономеров.

Из данных 13С-ЯМР спектров, по соотношению интегральных интен-снвностей сигнала С-6 гексозы и суммы сигналов С-атомов неугле-оодных метнновых и метнленовых групп, была проведена оценка относительного содержания замещенных (-СЯ^СН!?-, где Г?-углеооднын Фрагмент) и незамещенных С-СН2СН(С0НН2)~] фрагментов полимерной цепи которое составило от 1:10 до 1:13. Примерно те же соотношения обоих типов мономеров в полимерной цепи дает расчет на основе процентного содержания углеводов в сополимерах.

Подтверждением введения в полимер ЗОЯ углеводов могут служить данные измерения [*][, для мономера и полимера ( если полимер содержит детерминанту одного вида). Сравнение полученных значений (см. табл.) показывает, что [<0р.полимерного продукта составляет «1/3 от значения детерминанты.

Таким образом нами впервые были получены полностью синтетические моно- и полнспецифическне углеводные антигены серогрупп

и Е, не содержащие белка-носителя. Получение сшитого полнакриламндного иммчносорбента и выделение моноспеинФнческнх антител. Сополнмернзация олигосахарида (36), акряламида, М.Н'-метнленбнсакриламида в мольном соотношении 1:25:1.5 в описанных условиях даоала сшитый полнакриламиднын иммуносорбент (63) с содержанием »3,5-4/4 углеводов. Полученный иммуносорбент использовали для выделения поноспецифических 0:4

антител из фракции сыворотки кролика. В результате аффинной хроматографии происходил процесс сорбции специфических антител, которые десорбировали 3,5 М раствором роданида № или аммония, обессоливали и яиофияизовали. Сухой сорбент сохранял свом активность в течение продолжительного времени (минимум 5 лет), а лио-фияизованные антитела - 17 месяцев..

Таким образом, впервые в результате сополимеризации 3-х компонентов (углеводной детерминанты, акрияамида и сшивающего агента) был получен иммуносорбент со специфичностью фактора 0:4, применение которого позволило выделить моноспецифические антитела.

Модификация полигяииинияметакрияатных сополимеров.

В процессе синтеза олигосахаридных детерминант были получены производные олигосахаридов (40) и (41), содержащие первичную аминогруппу в структуре спейсера. Эти прозводные «ами были использованы при получении конъюгатов с полиглицидияпетакрилатными нерастворимыми гранулированными носителями ( Институт макромоле-кулярной химии, Прага, Чехия). Полимерные частицы, полученные на основе сополимера глицсдилметакрилата и атилендиметакрилата, содержали на поверхности эпоксидные группы, реакция которых с аминогруппой агликона детерминанты приводила к иммобилизаций последней на носителе. Для иммобилизации были использованы латекс-ные суспензии ( 650-900 нм ) и пористые гранулированные носители ( 250цм), которые инкубировали с олигосахаридными детерминантами (40,41) в буфере с рН И при 37°С. Количество присоединенных детерминант увеличивалось с увеличением температуры от 0,1-0,15 ммоля ( 37°, 24 часа) до 0,65 ммоля ( 70°, 24 часа) углеводов на 1 г полимера. В результате иммобилизации углеводных детерминант были получены монодетерминантные латексные коньюгаты (64) и (65) со специфичностью 0:4 и 0:9, которые в дальнейшем были использованы в реакции латекс-агглютинации, и гранулированные иммуносор-

бенты (66) н (67), содержание * 1,6-2Х углеводов.

йффинный сорбент (66) пм использовали для выделения монос-пецифмческих антител фактора 0:4 и показали, что эффективность выделения антител на сорбенте (66) в 50 раз выие, чей на гелеоб-разном сорбенте (63), что можно объяснить большей доступность» углеводных детерминант в гликоконъигате (66).

Таким образом применение олигосахаридных детерминант, содержащих в агликоне-слейсере реакционноспособнуи аминогруппу, позволило получить монодетерминатные латексные глнкоконыгаты и мо-нодетерминантные аффинные сорбенты; последние были успешно использованы для выделения моноспецифических антител.

Результаты иммчнохимических исследований. Иммунохимические свойства искусственных антигенов, глико-коньюгатов и антител исследовались в Центральном научно-исследовательском институте эпидемиологии РФ к.б.н. Тендетником И.Я. с сотрудниками. Здесь приводятся краткие результаты.

1) Проведена оценка специфичности и серологической активности сополимеров (52,53) по трем тестам: 1) двойная радиальная имму-нодиффузия в геле по Оухтерлони, 2) реакция пассивной гемагглю-тинации (РПГй) и реакция торможения пассивной генагглитинации (РТПГй), 3) иммуноферментный анализ (ИФЙ). Показано, что при тестировании с антисыворотками антигены проявляли четко выражен-, ную монофакторную специфичность 0:4 и 0:9 сальмонелл, реагируя в тесте (1) в 50 раз, а в тесте (2) в 4 раза более активно, чем соответствующие ЛЛС.

2) Исследованием зависимости серологической активности искусственных антигенов (52,59-62) от количественного содержания углеводных детерминант (с 2%, 5'/., 77., 10X и ЗОИ углеводов) было установлено, что увеличение концентрации детерминант от 2'А до 307. приводит к увеличению активности в 60 раз (относитепьно ППС).

3) С помощью искусственного антигена (52) и ЛПС 8ЛурЫшиг1иш было проведено сравнительное титрование антнтел трех классов

( 1йБ, 1£М, ) в сыворотках больных сальмонеллезом серогрупп В, 0^, Е, С н пищевой токсико-ннфекциен (ПТИ). Было сделано эа -ключенне о преобладающей роли ^М-антнтел на первых стадиях и ^Б-антител в конце заболевания.

4) Применение искусственных антигенов (52,53) позволило повысить в 10 раз достоверность диагностики методом ИФА больных сальмонеллезом групп В и

5) Полученные нами поливалентные искусственные антигены (55-57), содержащие по нескольку детерминант разной специфичности, нашли применение для скрининга сывороток (определения родовой принадлежности возбудителя инфекционного заболевания) и для изучения . явления антигенной конкуренции при тестировании методом ИФй.

6) Исследование антигена (52) на проявление антителостнмулирую-щен активности и возможного вакцинирующего действия показало, что антиген (52) не вызывал полной стимуляции иммунной системы у животных с образованием антител (тест 2), однако оказывал про-тективное действие у иммунизированных животных при заражении летальными дозами живых клеток 8а1топе11 (выживало 90% животных).

7) На примере сополимера (52) было показано, что сополимер хорошо адсорбируется на полистирольных планшетах, применяющихся в ИФй, а достоверные результаты реакции могут быть зарегистрированы при концентрации 0,01 цг/мл ( ЛПС - 1-2 цг/мл).

8) Исследовалась сорбция синтетических антигенов (52) и (58) на эритроцитах с целью получения эритроцитарного диагностика для РПГй. Было показано, что лмпофильности сополимера (52) недостаточно для сенсибилизации эритроцитов, в то время как обработка эритроцитов сополимером (58) дала диагностикум, который обладал монофакторной (0:4) специфичностью и значительно большей чувст-

витальность» (по сравнению с коммерческим эрнтроцнтарным диагностику моп В).

9) Диагностика сальмонеяяезов методом РПГй или РТПГА показала одинаковую активность коммерческого эритроцитарного днагностнку-ма на основе ЛПС и латексного гликоконъюгата (64). Однако латек-сный диагностикум проявлял моноспецнфичность фактора 0:4, что позволило повысить в 5 раз достоверность диагноза больных саль-монеллезом и ПТИ.

10) Аффннополученные моноспецифические антитела (фактор 0:4 ) использовали для выявления сальмонеллезного антигена в сыворотках больных методом ИФА и латекс-агглютинации. Сенсибилизация лолистирольных планшетов н латексных частиц моноспецифическими антителами позволило на порядок повысить чувствительность ИФЙ н латекс-агглютинации, которая была одинаковой в обоих тестах и равнялась 1 нг/мл.

Таким образом применении полученных нами моноспецифических и полидетерминантных О-антигенов, липофильного искусственного антигена, латексных гликоконъюгатов и моноспецифических антител позволило разработать систему реакций, позволяющих существенно повысить достоверность и значительна усовершенствовать диагностику сальмонеяяезов.

ШШШ.

1) Впервые радикальной сополимернзацией получены высокомолекулярные искусственные моно- и полиспецифические антигены, соответствующие факторам 0:2, 0:3, 0:4 и 0:9 бактерий рода Salmonella серологических групп й, 8, и Е.

2) Впервые синтезированы непредельные производные гяикозндов 3-0-( 3,6-дидезокси-<1-[)-рнбо-гексопиранозил)-<»Ч)-маннолира-нозы, 3-0-( 3,0-дидезокси-ч-0-кснло-гексопирано$ил)-<1-0-ман-нопирдиощ, 3-0~( Зрь-дмдезо> с и-а-О-арабнно-гнгсопнранояи) -

-d-D-маннопиранозы, соответствующие детерминантам 0:2, 0:4 и 0:9 липоподисахаридов бактерий рода Salmonella и способные вступать в сополимеризацию с мономерами неуглеводнон природы.

3) Впервые проведена трехкомпонентная сопоянмеризация аллия-гли-козида олигосахаридной детерминанты 0:4, акриламида и Н,Ы'-метилен-бисакриламида, в результате которой получен сшитый полиакриламидный иммуносорбент со специфичностью фактора 0:4.

4) Впервые модификацией синтетического антигена со специфичностью 0:4 остатками пальмитиновой кислоты получен искусственный антиген с повышенными липофильнымн свойствами для сенсибилизации эритроцитов и получения эритроцнтарного диагностикума.

5) Проведена иммобилизация углеводных детерминант соответствующих факторам 0:4 и 0:9 на полиглицидилметакридатиом латексиом и сферическом носителях с целью получения латексных диагнос-тикумов и аффинных сорбентов соответствующей специфичности;

6) С помощью синтезированных иммуносорбентов из гипериммунной сыворотки выделены коноспецифические антитела фактора 0:4.

ф * Ф

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях

1. Chernyak rt.Va., Levlnsky й.В., Dmltriev B.rt., Kochetkov N.K., ft neu type of carbohydrate-containing synthetic antigen: synthesis of carbohydrate-containing Polyacrylamide copolymers the specificity of 0:3 and 0:4 factors of Salmonella - Carbohydr. Res., (1992),110, C16-C20; (1994),129,p.269-282.

2. Черняк Й.Я., Левинский A.B., Тендетник К).Я., Кочетков Н.К.

Синтез детерминантных дисахаридов О-антигеное Salmonell серологических групп Д,В и D^ в виде глмкозидов, удобных для превращения в искусственные антигены методом сополимеризации - Биоорга-

нич.химия, (1988), т.14, 119, стр. 1047-1059.

3. Черняк А.Я., Левннский ti.Б. Моно- и полифакторные искусственные антигены с групповой специфичностью бактерий Сальмонелл -Тезисы VUI Всесоюзной конференции "Кимня н биохимия углеводов", Тбилиси, ноябрь, (1987), стр. 211-212.

4. Черняк А.Я., Левннский А.Б., Тендетннк 10.Я., Кочетков Н.К. Покровский В.И. Ионо- и полиспецифические глнкоконъюгаты на основе синтетических О-антигенных детерминант салмонелл и их серологическая характеристика - Биоорганнч.химия, (1992), т.18, N5, стр.680-688.

5. Svec F., Bouchai К., Zurkova Е., Tendetnik Ju.Ja., Cernjak A.Ja., LevinskiJ A.B., Kocetkov U.K., "Nazev vynalezu Latexove teatovaci systemy pro dukaz protilatek a antigenu pri ealroonelozach", Patent CSFR, (1989), prihlaseno 11.4.1989, PV 2238-99;

6. Покровский В.И., Тендетник Ю.Я., Покровский B.B., Черняк А.Я. Левннский A.B., Дмитриев Б.А., Кочетков Н.К. Иммунохимическая характеристика искусственных антигенов с О-детерминантами 4 и 9 Salmonella - Ш.мнкробиол.эпидемиолог.н иммунологии, (1904), N11, стр.69-72.

7. Покровский В.В., Тендетннк 10.Я., Трегуб A.B., Покровский В.И. Кочетков Н.К., Черняк А.Я., Левннский A.B. Иммунобиологические свойства искусственных антигенов - сополимеров синтетических О-детермннант с акрнламидом - Иммунология, 1986, N1, стр.46-50. О. Тендетник Ю.Я., Овчарова Н.М., Покровский В.И., ГрудКова М., Мали й., Черняк А.Я., Левннский А.Б., Кочетков Н.К. Определение в иммуноферментном анализе противосальмонеллезных антител, относящихся к трем классам иммуноглобулинов человека (6,А,И), к лн-пополисахариду и синтетическому О-антнгену - Иммунология, 19Q7, N1, с тр.80-82.

9. Tendetnik Ju.Ja., Pokrovskii V.l., Chernyak rt.Ja., Levlnsky rt.B., Kochetkov N.K.- Enzyme immunoassay (EIrt) test systems for the detection of salmonella O-antlgen - Biomedical Science, V.1, <1990), p.622-630.

10. Tendetnlk Ju.Ja., Pokrovskil V.l., Chernyak A.Ja., Levlnsky rt.B., Kochetkov N.K. The uee of O-antigene of Salmonella for Improvement of serological diagnosis of enteric infections - FEMS Microbiology rmmunology, (1991), v.76, 93-98