Химико-ферментативный синтез О-специфического полисахарида SALMONELLA KENTUCKY и его модифицированных производных тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ОРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. Н. Д. ЗЕЛИНСКОГО

На правах рукописи

УДК 547.455.6'! 18'366.057:579.222.7'124.5:579.842.14

СИЗОВА Ольга Владимировна

ХИМИКО-ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ СИНТЕЗ О-СПЕЦИФИЧЕСКОГО ПОЛИСАХАРИДА SALMONELLA KENTUCKY И ЕГО МОДИФИЦИРОВАННЫХ ПРОИЗВОДНЫХ

02.00.10 — Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва — 1990

Работа выполнена в Лаборатории • химии углеводов Ордена Трудового Красного Знамени Института органической химии им. Н. Д. Зелинского АН СССР.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

доктор химических наук В. Н. Шибаев

кандидат химических наук, ст. н. сотр. Т. Н. Дружинина

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор химических наук А. И. Усов доктор биологических наук И. Б. Наумова

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР, Пущино.

Защита диссертации состоится « Л » £6НI 1990 г. в

10,00 часов на заседании специализированного совета К 002.62.02 по присуждению степени кандидата химических наук в институте органической химии им. Н. Д. Зелинского АН СССР, 117913, Москва, Ленинский проспект, 47, Конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института органической химии им. Н. Д. Зелинского АН СССР.

Автореферат разослан « » 1990 г.

Ученый секретарь Специализированного совета канд. хим. наук

Н. Я. Григорьева

Акт^альпость_проблемыл

О-Специфические полисахарида - структурные компоненты липополи-сахаридов, входящих в состав внешней мембраны грамотрщательных бактерий. Многие из этих микроорганизмов являются возбудителями различных инфекций, в том числе, салмонеллезов. Специфический иммунный ответ, вызываемый бактериями, в большинстве случаев определяется структурой О-специфических полисахаридов. В связи с этим разработка методов искусственного получения природных полимеров этого ряда и их модифицированных производных представляет значительный интерес для выяснения физико-химических основ функционирования углеводсодержащих биополимеров и решения ряда вопросов бактериальной иммунологии, в частности, создания нетоксичных искусственных вакцин с заданной специфичностью.

Настоящая работа является частью программы исследований по разработке химико-ферментативного подхода к синтезу гетерополисаха-ридов бактерий, проводимой в лаборатории химии углеводов ИОХ АН СССР в рамках Всесоюзной научно-технической программы 074.05 ( задание 18.НЗ - "Изучить механизм биосинтеза антигенных и внеклеточных полисахаридов микроорганизмов и осуществить химико-ферментативный синтез этих полимеров" ). Этот подход основан на использовании в качестве ключевой стадии синтеза ферментативной реакции - поликонденсации олигосахаридных звеньев, входящие в состав полипренилшро-фосфатолигосахаридов - биосинтетических предшественников бактерий альных полисахаридов; эти предшественники могут быть получены химическим синтезом или комбинацией химических и ферментативных реакций. Цель работы. -

Настоящая работа посвящена исследованию возможности получения путем химико-ферментативного синтеза 0-специфического полисахарида Salmonella kentucky, представителя салмонелл серологической группы

Cg, и различных модифицирование производных этого полимера. Параллельно была изучена возможность применения в синтезе полисахаридов и их предшественников ферментов из микроорганизма близкородственной серологической группы С2 (Salmonella newport). Научная новизна и практическая ценность работы.

С помощью производных, полученных химическим синтезом, в работе подтверждено строение полипрешшшрофосфатолигосахаридов - промежуточных соединений при биосинтезе О-специфйческих полисахаридов салмонелл серогрупп С2 и Сд и установлен механизм введения остатка абеквозы в процессе биосинтеза.

Разработан удобный метод разделения гликозилтрансфераз, участвующих в сборке олигосахаридного повторяющегося звена полисахарида, что позволило использовать частично очищенные ферменты в химико-ферментативном синтезе модифицированных полисахаридов.

Выяснена специфичность маннозилтрансфераз П, участвующих в сборке главной цепи полисахарвдов, ТГконфигурации при C-I терминального остатка маннозы, а также к типу связи между моносахаридными остатками в дисахаридном акцепторе. Показана возможность химико-ферментативного синтеза разветвленных О-специфических полисахаридов в-которых остаток глюкозы, находящийся в разветвлении, связан с остатком галактозы основной цепи различными типами связей.

Продемонстрирована возможность введения в состав полимера 'при химико-ферментативном синтезе остатка' паратозы вместо остатка абеквозы. На основе синтетических глюкозилированных акцепторов получены О-специфические полисахариды, содержащие два узла разветвления Апробация работы.

Материалы диссертации докладывались на I Всесоюзной конференции молодых ученых "Современные проблемы биохимии и физико-химической биологии".(Москва, 1985 г.), V Всесоюзном биохимическом съезде

(Киев,-1986 г-),.Vffi.Всесоюзной конференции по химии и биохимии углеводов, (Тбилиси, 1987 г.) и Всесоюзной конференции "Регуляция микробного метаболизма" (Пущино, 1989 г.)- ,

По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ. Обьем_работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной часта и выводов. Работа изложена на /// стр., содержит 3 рис., /¿"табл. и ^литературных ссылок.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Основная цепь 0-специ$ичбских полисахаридов салмонелл серогрупп С2 и С3 построена из тетрасахаридных повторяющихся звеньев ( см. структуру А ), в разветвлениях находятся остатки a-D-глюкозы и а-абеквозы, являющиеся носителями серологической специфичности.

-4 )Rha(pi -2 )Мап (а1 -2 )Кап (a1 -3 )Gal ( 01 -"

R

Rg R3

(A) й1=Н2=йз=Н --

(Б) =АЬеа1 -3-, Н2=Ас201са1-4-, Н^Н

(B) И^АЬесИ-3-, И2=Н, И^АсгИссИ-4-

(Г) Й1=АЬеа1 -3-, Й2=Н, й3=С1са1-2-

Для О-специфического полисахарида из Б.пеяро^ (серогруппа С,) остаток абеквозы в разветвлении соединен а-1-З-связыо с остатком^" рамнозы главной цепи, а остаток глюкозы - а-1-4-связыо с первым остатком маннозы (см. структуру Б). О-Специфический полисахарид из Б.кепШску (серогруппа С3) отличается от такового Б.петерогг положением остатка глюкозы. По данным шведских исследователей, он присоединен а-1-4-связью к остатку галактозы основной цепи (формула В).

Проведенное в нашей лаборатории исследование структуры этого поли-мерз для штамма, использованного в настоящей работе, указывает на структуру (Г) с a-I-2-связью между остатками глюкозы и галактозы.

Ранее в нашей лаборатории было показано, что ферментативный синтез линейного полимера (А) в системе биосинтеза S.kentucky и S.newport протекает по блочному механизму. Процесс биосинтеза основной цепи полисахарида заключается в сборке тетрасахаридного звена (реакции а-г на схеме I) путем последовательного переноса a-D-галакто-пиранозилфосфата, двух остатков a-D-маннопиранозы и р-Ь-рамнопира-нозы с соответствующих нуклеотидсахаров (UDP.-Gal, GDP-Man и dlDP-Rha) на остаток полипренилфосфата. В реакциях In vitro вместо бактериального ундекапренилфосфата использовали морапренилфосфат (Мрг, фосфат С55 полипренола из листьев шелковицы), который отличается от бактериального полипренола соотношением цис- и транс-изопреновых звеньев (7:3 против 8:2 в бактериальном преноле). Заключительной стадией процесса (реакция д) является-ферментативная поликонденсация тетрасахаридных звеньев с образованием полисахариде (А).

Все приведенные на схеме I реакции катализируются комплексом ферментов, связанных с бактериальными мембранами: реакция а катализируется галактозилфосфаттрансферазой, реакции б и в - маннозилтрэн-сферазами I и П соответственно, реакция г - рамнозилтрансферазой. При обработке бактериальных мембран неионным детергентом часть ферментов удается перевести в раствор и получить "препарат растворимых гликозилтрансфераз", способный катализировать реакции а-г. Поликон-денсацкя повторяющихся звеньев осуществляется под действием полиме-разы, которая находится в препарате бактериальных мембран.

Схема I.

Биосинтез основной цепи полисахарида S.kentucky

Р-Мрг

-UDP-Gal

—»-тар

Gal(а)-РР-Мрг

Man(a1-3)Ga: в

--GDP-Man

——GDP (а)-РР-Мрг »—GDP-Man " ——GDP

Man(a1 -2)Man(a1-3)Gal(а)-РР-Мрг

-dlDP-Rha

—»-dlDP

n Rha (pi -2 )Man (a1 -2 )Man (a1 -3) Gal (a) -PP-Mpr 3 —*-(n-1) PP-Mpr

[-4 )Rha (p1-2 )Man (a1 -2 )Man (a1 -3 )Gal (pl-]n (а)-РР-Мрг

По имеющимся данным природный О-специфический полисахарид S.kentucky глзскозилирован примерно на 60%. Было выяснено, что при образовании разветвленных глюкозилированных полимеров непосредственным донором остатка глюкозы служит полипренил?юнофосфатглюкоза, образующаяся из UDP-Glc по следующей реакции: "

Мрг-Р + UDP-Glc -— Мрг-P-Glc + UDP (I)

Однако, по вопросу о том, на какой стадии построения полиса-харидной цепи салмонелл серогрупп С2 и С3 включается остаток глюкозы, в литературе имеются лишь предварительные сведения.

Также оставался неизученным вопрос о механизме введения в полимерную цепь остатка 3,6-дидезоксигексозы' - абеквозы. Поэтому, на первом этапе нашей работы были проведены дальнейшие исследова-

нкя биосинтеза О-специфического полисахарида S.kentucky.

I.I. Подтверждение структуры промежуточных соединений биосинтеза с_шмд§ы[^статетитес1^ В рамках синтетических исследований по получении полипренилпи-рофосфатсахаров в лаборатории химии углеводов ИОХ АН СССР был осуществлен синтез набора производных этого ряда, в которых остаток бактериального полипренола заменен на остаток морапренола. Исследование субстратных свойств этих соединений позволило однозначно подтвердить структуру биосинтетических интермедиатов. Мерой протекания реакций биосинтеза служил перенос меченых остатков Сахаров из соответствующих нуклеотидсахаров на липидный акцептор. За протеканием реакций следили по образованию радиоактивных продуктов, которые при экстракции инкубационной смеси органическим растворителем (смесь хлороформ-метанол, 2:1) переходят в органическую фазу.

Для подтверждения структуры дисахаридного промежуточного продукта при биосинтезе основного повторяющегося звена О-специфических полисахаридов из S.Kentucky и S.newport мы исследовали акцепторные свойства соединений I и П.

Man (а1 -3) Gal (а) -РРМрг (I) Man(ß1-3)Gal (а)-РРМрг (П)

Инкубационная смесь содержала исследуемое производное, препарат растворимых гликозилтрансфераз (ПРГ) из S.kentucky или S.newport и СВР-[,4СШап.

Экспериментальные данные показывают (см. табл.1), что дисаха-ридное производное морапренола с концевым остатком а-маннозы (I) является эффективным акцептором для переноса второго остатка ман-нозы. Хроматографяческая подвижность углеводного фрагмента, полученного после отщепления лшидного компонента путем мягкого кислотного гидролиза продукта (0,5 н. HCl, 30 мин, Ю0°С), с.оответство-

вала подвижности трисахарида I14СЗМап-Мап-Оа1 (И^ 0,42) в системе н-Оутанол-пиридин-вода (6:4:3) (А). После ферментативного гидролиза трисахарида действием а-маннозидазы Сил обнаружен единственный радиоактивный продукт, соответствующий по подвижности маннозе. Тагам осразом, было доказано, что присоединившийся в результате ферментативной реакции остаток маннозы имеет а-конфигурацшо при С-1.

Таблица I.

Маннозилирование дисахаридных производных морапренилпирофосфата N Концен- Радиоактивность органи-

опыта Акцептор* трация, ческой фазы, иш/мин

мкМ S.kentucky S.newport

I. Man(a1-3)Gal(a)-R (I) 20 не исслед. 1300

100 не исслед. 4160

250 II890 II560

2. Kan(pi-3)Gal(a)-R (П) 100 не исслед. 510

1000 290 780

О О • Gal(a)-R 20 не исслед. I4I50

500 24300 не иссл.

4. Контроль, без акцептора - 550 630

5. Кап (сИ -2)Man (a1 -3) Gal (а) ■ -R(IH) 100 5060 4370

6. Kan (а1 -2 )Мап (pi -3) Gal (a)- -R(IX) 50 880 860

100 1210 1210

7. Контроль, без акцептора - 750 880

* R=PF-Mpr; в опытах 1-4 донор моносахаридного остатка - GDP-[|4СШап, в опытах 5-7 - dIDP-[uC]Rha.

Отсутствие субстратных свойств у дисзхаридного производного (П) с остатком р-маннозы однозначно свидетельствует, что природный* биосинтетический предшественник содержит остаток а-маннозы.

Для подтверждения структуры трисахаридного предшественртка повторяющегося звена мы исследовали субстратные свойства производного Мал(а1-2)Мап(а1-3)Са1(а)-РР-Мрг (Ш).

Для этого производное (Ш) инкубировали с йТЮР-[14С]Ш1а и ПРГ. О результатах рамнозилирования судили по .переносу радиоактивного остатка [14С]рамнозы (табл.1). Полученный олигосахарид после мяг-

кого кислотного гидролиза соответствовал ш хроматографической подвижности тетрасахариду Г1iCJRha-Man-Man-Gal (HGal 0,34). Таким образом, было показано, что синтетическое производное (Ш) является эффективным субстратом для рамнозилтрансфераз из обоих штаммов.

Полученный продукт ([14С]Rha-Man-Man-Gal-PP-Mpr) переводили в раствор добавлением водного твина-85 и обрабатывали препаратом мембран из S.kentucKy или S.newport в обычных условиях ферментативной поликонденсации (2Ы трис-малеат рН 6,0, 2 ч, 37°С). Полимерный продукт реакции выделяли после центрифугирования реакционной смеси, мягкого кислотного гидролиза для расщепления гликозилфосфатной связи и гельфильтрации На сефадексе G-I5 или TSK HW 40. Выход полимера составил 51% в случае S.kentucKy и 47% в случае S.newport.

Эти результаты демонстрируют принципиальную возможность получения химико-ферментативным путем линейного полимера (А) на основе синтетических производных (I) и (Ш), соответствующих по структуре промежуточным продуктам биосинтеза полисахаридной цепи.

IjZ.__Введение остатков абеквозы в О-специфические полисахариды

салмонелл серогрупп Cg и Сд.

Данные по ферментативному 8беквозилированшо при биосинтезе 0-специфических полисахаридов S.kentucKy (серогруяпа С3) и S.newport (серогруппа С2) в литературе отсутствуют, и нашей задачей было исследование этого процесса. На первом этапе работы было необходимо продемонстрировать абеквозилтрансферазную активность в системе биосинтеза S.kentucky. Для этого были проведены опыты по инкубации препарата бактериальных мембран с нуклеозидпифосфатсахарами (UDP-Gal, GDP-Man, dTDP-Rha и CDP-t14C]Abe) в течение 3 ч при 18-20°С. Вследствие крайне высокой лабильности абеквозилтрансферазы, реакция проводилась с использованием препарата бактериальных мембран в качестве источника как полимеразы, так и абеквозилтрансферазы.

Анализ продуктов абеквозилирования после мягкого, кислотного

гидролиза, обработки щелочной фосфатазой и гельфильтрации на TSK HW 40 показал образование олиго- и полисахарида, содержащих остатки [14С]абеквозы. В данных условиях выход абеквозилированных продуктов для S.kentucky составил 60%, а в случае S.newport - 34%.

При уменьшении времени инкубации и понижении температуры доля полисахарида значительно уменьшалась, вплоть до практически полного отсутствия полимерной фракции при инкубации в течение I ч при Ю°С. Основной пик радиоактивности в этом случае смывался с колонки в зоне олигосахарида. Этот результат дал нам возможность предположить, что, как и в случае биосинтеза О-специфического полисахарида S.ty-phlmarlum (серогруппа В), акцептором остатка"абеквозы служит поли-пренилпирофосфатолигосахарид, т.е. реакция абеквозилирования предшествует реакции поликонденсащш. После формирования тетрасаха-рида (см. реакции а-г на схеме I) имеет место реакция абеквозилирования (см. реакцию е на схеме 2), а в реакцию ферментативной поликонденсации вступает пентасахарид с образованием разветвленного полисахарида (реакция ж, схема 2).__

Это предположение однозначно подтверждают результаты опытов по солюбилизации абеквозилтрансферазы из препарата мембран S.kentucky. Выло обнаружено, что абеквозилтрансфераза из S.kentucky частично переходит в ПРГ при обработке мембранного препарата раствором по-литергента (ПЕГ-1) или октил-глжозида (ПРГ-2) в течение 5 мин при 0°С. После инкубации ПРГ с нуклеотядсахарами (2 ч, 18-20°С) и гое^' ледущей обработки смесью хлороформ-метанол в органической фазе был обнаружен радиоактивный полипренилпирофосфатолигосахарид.

Схема 2.

Rha<p1-2)Man(a1-2)Мал(a1 -3)Gal(а) -РР-Мрг в

а Rha(pi-2)Man(а1-2 ?

Abeal . *

-4 )Rha С pi -2 )Man (a1 -2 3 i

Abeal

-CDP-[uC]Abe

Man(a1-3)Gal(a)-PP-Mpr -*-(n-I) PP-Mpr

Man(at-3)Gal(pt-

(a)-PP-Mpr

. n

Для подтверждения того, что акцептором остатка абеквозы при ферментативной реакции служат полипренилпирофосфатолигосахариды, мы изучали далее способность синтетического производного (Ш) Man(a1-2)Man(a1-3)Gal(a)-PP-Mpr служить субстратом в последовательности реакций рамнозилирования и абеквозилирования. Проведенные эксперимента показывают, что при использовании препарата бактериальных мембран-из S.kentucky выход абеквозилированных продуктов составляет 78,6%, а из S.newport - 60,2%.

Радиоиммунохимический анализ показал, что полученный химико-ферментативным методом полисахарид специфически связывается с ан-ти-08-сывороткой салмонелл. Так как детерминантой 08 серофактора является дасахарид Abe(a1-3)Rha, можно сделать вывод, что в результате ферментативной реакции образовалась a-I-З-связь между остатками абеквозы и рамнозы.

2. Фракционирование гликозилтрансфераз, участвующих в сборке повторяющегося звена линейного полисахарида S.kentucky.

Как уже отмечалось, при исследовании биосинтеза повторяющего ся звена полисахарида S.kentucky (реакции а-г на схеме I) используют обычно препарат растворимых трансфераз. Этот препарат удобен в тех случаях, когда в процессе химико-ферментативного синтеза необходимо провести сразу несколько ферментативных стадий.

В то же время при исследовании отдельных стадий биосинтеза к

специфичности гликозилтрансфераз, участвующих в этом процессе, мо-может возникнуть необходимость использования препаратов индивидуальных гликозилтрансфераз, в частности, разделения маннозилтрансфе-раз I и П, катализирующих реакции бив, соответственно.

Очистка гликозилтрансфераз является чрезвычайно сложной задачей вследствие высокой лабильности этих .ферментов. Результаты наших исследований, подробно описанные в диссертации, показали, что с помощью высокоэффективной гель-хроматографии на колонке с супе-розой 12 препарата растворимых гликозилтрансфераз из Б.кепШску удается добиться частичного разделения гликозилтран'сфераз и освобождения их от многих балластных белков.

Этот метод позволяет в одну стадию в течение одного часа получить частично очищенные стабильные препараты галактозилфосфат-трансферазы и, что особенно важно, двух различных маннозилтранс-фераз, участвующих в биосинтезе О-специфического полисахарида Б.кеп1;иску. Разделение маннозилтрансфераз дало возможность их независимого использования в химико-ферментативном синтезе модифицированных олигосахаридных производных- (см. раздел 3.3).

3. Изучение субстратной специфичности гликозилтрансфераз,

участвующих в сборке главной цепи полисахаридов. Предыдущие исследования в нашей лаборатории показали, что ферменты биосинтеза О-антигенов салмонелл серогрупп В и Е не обладают абсолютной субстратной специфичностью и с их помощью с использованием модифицированных субстратов может быть получен ряд аналси-гов природных полисахаридов, содержащих измененные моносахаридные остатки. Возможности химико-ферментативного подхода для получения модифицированных полисахаридов были исследованы наш для ферментов, ответственных за биосинтез О-специфкческого полисахарида в серо-группах С3 и С2-

Для исследования субстратной специфичности гликозилтрансфераз,

осуществляющих сборку основного повторяющегося звена, мы использовали набор синтетических гликозильных производных моралренилфосфата IV-VII; строение которых позволяло исследовать специфичность ферментов к структуре субтерминального остатка сахара дисахаридного акцептора и типу связи в дисахариде.

Man(а1 -3)Glc(a)-PP-Mpr (IV) Man(a1-6)Glc(a)-PP-Mpr (V)

Man(a1 -4)Glc(a)-PP-Mpr (VI) Man(a1-2)Glc(a)-PP-Mpr (TO)

Эффективность включения гликозилированных производных морапре-нола оценивали по сравнению с акцепторной способностью соответствующего природному предшественнику дисахаридного производного (I). 3 Л^_3зменз_дстатка_галад

При введении в реакцию с GDP-[14C]Man синтетического производного (IV), в котором в субтерминальном положении вместо природного остатка галактозы находится остаток глюкозы, наблюдается образование морапренилпирофосфаттрисахарида (см. табл. 2). Гидролиз последнего приводит к трисахариду [14CIMan-Man-GIc (Vffl), идентифицированного хроматографически (Rça]_ 0,42 в системе А). а-Конфигурация ман-нозидной связи подтверждена обработкой а-маннозидазой. После ферментативного гидролиза был обнаружен единственный радиоактивный продукт, соответствующий по подвижности маннозе.

Полученные результаты показывают, что маннозилтрансферазы П и; салмонэлл серогрупп С2 и С3 малочувствительны к изменениям в структуре субтерминального моносахаридного остатка акцептора.' Далее был! исследованы субстратные свойства синтетических производных (V-VH) i a-I-6-, a-I-4- и a-I-2-связями между остатками маннозы и глюкозы. Инкубация этих производных с препаратами растворимых гликозилтранс фераз из S.Kentucky или S.newport и GflP-t^CIMan не привела к вклю чению радиоактивной метки в органическую фазу (табл. 2). Этот факт показывает, что данные производные (V-Vn) не могут служить субстра

тами для манйозилтраясфераз Л, т.е. маннозилтрансферазы П из обоих штаммов чувствительны к типу связи между терминальным и субтерми-нальнкм остатками и способны использовать в качестве субстрата

только соединения с a-1-З-связыо.

Таблица 2.

Замена остатка галактозы на остаток глюкозы в

основной цепи полисахарида

N Концен- Радиоактивность органи-

опыта Акцептор* трация, ческой фазы, имп/мин

мкМ S.kentucky S.nev^ort

I. Man(a1-3)Glc(a)-R (IV) 1000 6130 8690

2. Man(a1-6)G1c(a)-R (V) 1000 200 150

3. Man(a1-4)Glc(a)-R (VI) 1000 290 270

4. Man(al-2)Glc(a)-R (УП) 1000 260 300

5. Man(a1-g)Gal(a)-R (I) 1000 I2I40 12870

6. Контроль, без акцептора - 550 630

*R=PP-Mpr, донор моносахаридного остатка - GDP-[14C]Man.

Мы обнарзткили далее, что морзпренилпирофосфаттрисахарид (V2i), содержащий" остаток глюкозы вместо остатка галактозы, может служить субстратом для последующих реакций-биосинтетического цикла. Для рамнозилирования (сх. I, реакция г) в инкубационную смесь, содержащую производное (VI), добавляли cUDP-Rha и препарат растворимых гликозилтрансфераз. После иннубацш и отщепления полученного продукта от липидной составляющей хроматографически обнаружили наличие двух радиоактивных соединений. Подвижность одного из них соответствует подвижности тетрасахарида Rha-[14C3Man-Man-Gal в системе А"""" ^Gal Второй продукт был'идентифицирован как исходный три-

сахарид (RGal 0,45).

Полученное производное тетрасахарида Rha-[14C]Man-Man-Glc-PP-Мрг, в котором вместо природного остатка галактозы находится остаток глюкозы, при инкубации с мембранным препаратом из S.kentucky (серогруппа Со) способен вступать в реакцию поликонденсации с вы-

ходом полимера 63%. С мембранным препаратом из S.newport (серо-группа С2) также образуется полимер с выходом 67%.

Представленные результаты показывают, что специфичность поли-меразы к структуре моносахаридного остатка на восстанавливающем конце цепи из салмонелл серогрушг С2 и С3 такова, что дает возможность синтезировать модифицированные полисахарида.

3^§^^1увствдтельндсть^^

При исследовании структуры промежуточных соединений при биосинтезе основного повторяющегося звена О-специфических полисахаридов из S.kentucky и S.newport (см. разд. I.I. и табл. I) мы указывали на отсутствие субстратных свойств у дасахаридного производного морапренола с остатком р-маннозы (П). Этот факт позволяет сделать вывод о высокой чувствительности маннозилтрансфераз П из S.Kentucky и S.newport к конфигурации при C-I концевого остатка сахара акцептора.

Специфичность рамнозилтрансферэзы из S.kentucky к конфигурации суотерминального остатка сахара исследовали с помощью синтетического производного Kan(al-2)Man((3t-3)Gal(a)-PP-Mpr (IX). Экспериментальные данные показывают (см. табл. I), что производное (IX) при инкубации с ПРГ и dTDP-l14С)1Ша является'крайне слабим акцептором, т.е. рамнозилтрансфераза чувствительна к неприродной р-кон-фигурации суотерминального остатка маннозы.

Аналогичные данные получены с ПРГ из S.newport.

3.3. Введение остатка талозы вместо остатка маннозы I или маннозы П.

Нами было показано, что при инкубации ПРГ из S.kentucky с GDP-Та1 и (uC]Gal-PP-Mpr возможно образование олигосахаридных продуктов, т.е. имеют место следующие ферментативные реакции, в которых маннозилтрансферазы используют в качестве субстрата производное D-

талозы (эшмера.П-маннозы по С-4):

[14C]Gal-£p-}ipr + GDP-Tal-—Tal-[14C]Gal-PP-Mpr + GDP

Tal-[UC]Gal-PP-Mpr + GDP-Tal-^-Tal-Tal-[uC]Gal-PP-Mpr + GBP

Как было изложено выше (см. разд. 1.3.), высокоэффективная хроматография позволила нам разделить трансферазы, переносящие остатки маннозы I и маннозы П. В диссертации описаны условия эксперимента. Возможность независимого использования маннозилтрансфераз I и П при отсутствии абсолютной специфичности последних позволила получить модифицированные производные (X) и (XI), в которых только один из остатков маннозы заменен на остаток талозы.

Tal-[I4C]Man-Gal-PP-Mpr (X) Man-Tal-[I4C]-Gal-PP-Mpr (XI)

XXX

Полученные результаты указывают на возможность синтеза некоторых модифицированных производных полисахаридов салмонелл серо-групп С2 и С3 с помощью химико-ферментативного подхода. Важно отметать, что ранее химико-ферментативный синтез был продемонстрирован только на примере близкородственных О-специфических полисахаридов салмонелл серогрупп В и Е. Результаты данной работы показывают, что этот метод может быть распространен и на другие 0-специ-Фтксше полисахариды.

4^_ШШ^о=Ферментат1шщй_сщтез_поотсаха^ содержащих остатки глюкозы в разветвлениях. Поскольку одним из иммунодоминантнкх остатков моносахаридов в О-специфических полисахаридах салмонелл серогрупп С2 и С3 является находящийся в боковых цепях остаток a-D-глюкозы, следующим этапом наших исследований являлось изучение возможности химико-ферментативного синтеза полимеров, содержащих остатки глюкозы в разветвлениях. Как уже отмечалось, при нормальном ходе биосинтеза ферментативное глюкозилирование, приводящее к производному разветвленного пентасахарида,. протекает неколичественно. Поэтому мы исследовали

возможность другого подхода к синтезу такого рода соединений -путь использования в ферментативных реакциях синтетических производных, уке имеющих остаток глюкозы в Соковой цепи. Стратегию такого подхода отражает схема 3'.

Схема 3.

Glc-Gal-PP-Mpr О» -—-GDP-Man —»-GDP Man-(Glc)Gal-PP-Mpr в' —GDP-Man

—f-GDP Man-Man-(Glc)Gal-PP-Mpr r' -—flTDP-Rha —ыЗГОР

n Bha-Man-Man-(Glc)Gal-PP-Mpr S' —»-(n-1) PP-Mpr j^-Rha-Man-Man- (Glc) Gal-] n-PP-Mpr

Нашей задачей было изучить, возможно ли достраивать разветвленные производные до повторяющегося звена, а также выяснить, на какой стадии сборки удобнее и экономичнее вводить разветвления с целью получения полностью гдакозилированных полисахаридов.

Результаты экспериментов по ферментативному маннозилированию и рамнозилированшо синтетических морапренилпирофосфатолигосахари-дов, содержащих остаток глюкозы, сушированы в табл. 3-5.

Г7

Таблица 3.

Образование 114С)Мап-содержащих морапренилпирофосфатолигосахаридов

из синтетических дисахаридных производных (ХШ-ХУ1) (реакции б'и в') Н Концен- Радиоактивность органи-

опыта Акцептор* трация, мкМ ческой фазы Б.кепгисКу , ИМП/МИН S.newport

I. Glc(a1-4)Gal(a)-R (ХП) 100 1930 1300

200 2420 1610

500 3180 2260

2. Glc(al-2)Gal(a)-R (ХШ) 50 3590 2900

100 7100 5800

200 9880 не иссл.

3. Glc((31-4)Gal(a)-R (XIV) 50 2350 1420

100 3170 1920

200 3350 2090

500 6900 10000

4. Glc(p1-2)Gal(a)-R (XV) 50 3720 3790

100 6450 5490

200 11340 9400

5. Gal(a)-R 100 101000 103900

6. Контроль, без акцептора - 800 750

Полученные данные показывают, что разветвленные пентасахарид-ные производные (ХХПа-г) могут быть получены последовательностью

реакций, показанных на схеме 3, хотя чувствительность маннозилтра-нсфераз I и П к замещению остатка галактозы остатком глюкозы относительно высока, и соответствующие разветвленные производные образуются с низким выходом. Природа связи между остатками галактозы и глюкозы имеет второстепенное значение. На стадии дисахаридных прб^ изводных предпочтительными оказались соединения с 1-2-связью.

Использование синтетических три- и тетрасахаридных производных морапренилпирофосфата позволило оценить влияние удаленности узла разветвления от места гликозилирования на эффективность ферментативных реакций в' яг'.

Таблица 4.

Маннозилирование разветвленных морацренилпирофосфатолигосахаридов

(реакция в')

К Концен- Радиоактивность органи-

опыта Акцептор* трация, ческой фазы. имп/мин

мкМ S.Kentucky ; S.newport

I. Кап(а1-3)Gal(a)-R (XVI) 100 2540 не иссл.

i Glcai 200 4700 2900

2. Man(al-3)Gal(a)-H (XVII) 50 1800 2170

» Glcai 100 1640 2860

3. Maniai-3)Gal(a)-K (XVIII) 100 1980 не иссл.

Glcj31 200 2600 2800

4. Man(a1-3)Gal(a)-R (XIX) 2 Glcpl 100 4330 3120

5. Man (a1 -3 ) Gal (a ) -R (I) 200 57000 45000

6. Контроль, без акцептора - 800 750

Таблица 5.

Рамнозилирование морапренилшфофосфатолигосахаридов (реакция г')

N Концен- Радиоактивность органи-

опыта Акцептор* трация, ческой фазы, имп/мин

мкМ S.Kentucky S.newport

I. ■ ■ Man (Ш -2 )Мап (a1 -3 )Gal (a)-R f Glcai (XX) 50 не иссл. 2240

100 200 ' 2020 2340 5400 не иссл.

2. Man(al -2 )îian(al -3 )Gal (a)-R 50 не иссл. 1280

Glcpi (XXI ) 100 200 2080 2340 не иссл. не иссл.

3. Man(a1-2)Man(a1-3)Gal(a)-R 100 5060 4370

4. Контроль, без субстрата. - 750 800

*Я=?Р-Крг, в таблицах 3-4 донор моносахаридного остатка - GBP-I14СЗ Man, в таблице 5 - dTDP-[I4C]Rha.

Полученные путем комбинирования химических и ферментативных

методов производные пентасахаридов вводили в реакцию полимеризации

1У

с ферментам! из S.kentucky и S.newport (реакция g'). После инкубации этих соединений с мембранными препаратами и соответствуыцей обработки удалось зафиксировать образование полимерных продуктов ■„см. табл. 6).

Таблица 6.

Получение разветвленных полисахаридов.

N Структура повторя- Выход полимера,Ж Отношение голимер/олигосах. опыта кщегося звена* S.kent. S.newp. S.kentucky S.newport

2,6:1 1,3:1

2,8:1 2,5:1

2,2:1 2,9:1

0,9:1 1,2:1

3,4:1 4,0:1

*R=PP-Mpr '

Полученные данные показывают, что разветвленные пентасахариды являются эффективными субстратами для поликеразы из S.kentucky и S.newport и могут быть использованы для получения полностью глюко-зилирозанных полимеров. На основе производного (XX) при использовании мембранного препарата из S.newport ферментативная поликонденсация протекает значительно медленнее, чем в случае S.kentucky.

Полученные разветвленные полисахариды в условиях мягкого кислотного гидролиза дают пентасахариды типа f14C]Man-i14C]Man-Gal(Glc) -Rha (Rq32 0,25 в системе А). После ферментативного гидролиза а-ман-нозидазой был обнаружен единственный радиоактивный продукт, соответствующий по подвижности маннозе. Пентасахарид Rha-[14C)!ian-t14C]Man-Gal(Glc), соответствующий повторяющемуся звену (Rgal 0,25),

1. Rha-Man-Man-Gal-R 72 56

Cleat

2. Rha-?ian-Man-Gal-R 74 71 (ХХПб) G1J

3. Rha-Man-Man-Gal-R 69 75

Glcal

4. Rha-Man-Man-Gal-R 46 54

ixxnn Glcpf

5. Rha-Man-Man-Gal-R 77 80

под действием а-маннозидазы не гидролкзуется вследствие того, что остаток маннозы экранирован остатком рамнозы.

XIX

В результате проведенных исследований мы показали, что специфичность ферментов биосинтеза О-сдацифических полисахаридов из Б.кепШску и Б.педарогг позволяет получать на основе разветвленных предшественников разной длины (ХП)-(ХП) полностью глюкозилирован-ные полимеры (по схеме 3). Следует подчеркнуть, что с помощью химико-ферментативного метода оказалось возможным получить модифицированные полисахариды, в которых остаток глюкозы, находящийся в разветвлениях, связан с основной цепью £1-2-, а1-4- и р1-4-связями.

' 5. специфичность абеквозилтрансферазы. Введение остатка паратозы в О-специфический полисахарид Б.кепШдску вместо остатка абеквозы.

Паратоза (3,6-дидезокси-Б-рибо-гексоза) - характерный компонент О-специфических полисахаридов салмонелл серогруппы А, В связи с работой по химико-ферментативному синтезу О-антигенных полисахаридов значительный интерес представляет вопрос о том, насколько строга специфичность гликозилтрансфераз к структуре переносимого остатка 3,6-дидезоксигексозы и возможно ли получение с помощью химико-ферментативного синтеза полисахарида (ХХШ), в котором вместо остатка абеквозы присутствует остаток паратозы. Реакция проводилась аналогично тому, как это делалось при изучении абеквозилиро-вания (раздел 1.2.)., В качестве донора остатка паратозы использовали СБР-114С]Раг. '

(а)-РР-Мрг (ХХШ)

п

Проведенное исследование показало, что при замене СБР-[14С]АЬе на СБР-[14С]Раг образование полисахарида происходит, хотя.его выход уменьшается в три раза по сравнению с нормальным донором. Таким образом, мы показали, что абеквозилтрансфераза из Б.кепШску не обла-

Г-4 )ЙИа (61 -2 )Мап (а1 -2 )Мап (а1 -3)Са1((31-?

Рага!

дает'абсолютной специфичностью, и возможно получение модифицированного полисахарида с заменой остатка абеквозы на остаток паратозы.

6. Химико-ферментативный синтез полисахаридов, содержащих

__§^азветвлегат_остатга_глтозы_и_абекю

Как уже упоминалось выше, мы показали возможность получения глюкозилированных полисахаридов последовательностью реакций (б'~ §•), показанной на схеме 3 исходя из полипренилпирофосфатолигоса-харидов, содержащих в разветвлениях остатки глюкозы. Оставалось неясным, возможно ли протекание с этими предшественниками реакции абеквозилирования и образования в результате поликонденсации полисахаридов,- содержащих два разветвления:

Схема 4.

НИа-Мап-Мап-Са1-РР-Мрг (ХХП)

31с

-СРР-АЬе

-ЕПа-Нап-Мап-Са1-1ре ¿1с

п АЬе-Ита-Мап-Мап-Са1-РР-Мрг

-Мп-1) РР-Мрг

-РР-Мрг

п

Нашей задачей было исследовать влияет ли введение остатка глюкозы на эффективность реакции абеквозилирования и последующую полимеризацию, и возможно ли получить химико-ферментативным методом полисахариды, несущие оба разветвления.

Для этой цели в качестве субстратов для абеквозилирования мы использовали синтетические разветвленные полипренилпирофосфатоли-госахариды. Исследование субстратных свойств соединений типа (ХХП) показало, что они могут служить исходными соединениями для получения абеквозилированных продуктов. Данные таблицы 7 показывают, что выход абеквозилированных полисахаридов колеблется в пределах 62-79%.

"Л Таблица,?.

Получение полисахаридов с двумя разветвлениями.

N Структура повторяющегося опыта - звена • Выход полисахсахарида, % Б.кепшску Б.пеирогг

I. 1Ша-Ыап-Кап-(Иса1-4)йа1-й (XXIVа) 79 67

2. НМ-Мап-Мап-(С1ср1 -4)6а1-Н (ХХПб) .76 ■ ,62

3. Ю1а-Мап-Мап-Са1-Л- 77 '80

жй=?Р-Мрг

Таким образом, было показано, что наличие остатка глюкозы в боковой цепи практически не оказывает влияния на процесс ферментативного а'Оеквозилирования, в результате чего возможно,использовать синтетические полипренилпирофосфатолигосахариды, несущие в разветвлениях остатки глюкозы, в качестве субстратов для получения 0-специфических полисахаридов с двумя узлами разветвлений.

ВЫВОДЫ

I. Проведено исследование биосинтеза О-специфических полисахаридов салманелл серогрупп С^ и С^:

а) е помощью синтетических производных подтверждено строение полипренилпирофосфатди- и трисахаридов - промежуточных соединений при биосинтезе; .

б) показана чувствительность маннозилтрансфераз П, участвующих в сборке главной цепи полисахаридов Б.кеп1;иску и Б.нейрон, к конфигурации при С-1 терющального остатка маннозы, а также к ищу связи между моносахаридами остатками в дасахаридном акцепторе;

в) разработан метод разделения гликозилтрансфераз, участвующих в сборке олигосахаридного повторяющегося звена. Показана возможность использования частично очищенных маннозилтрансфераз I и П из Б.кепгцску в химико-ферментативном синтезе модифицированных олигосахаридов;

г) установлен механизм введения остатков абеквозы при биосинтезе О-специфических полисахаридов салмонелл серогрупп С3 и С2.

2. Показана возможность химико-ферментативного синтеза разветвленных О-специфических полисахаридов с остатком 'глюкозы в разветвлениях. Получены полимеры с различной конфигурацией при C-I и

и различным местом присоединения остатка глюкозы к остатку галактозы в главной цепи.

3. Получен химико-ферментатийным синтезом О-специфический полисахарид Salmonella Kentucky, содержащий остатки глюкозы и абек-возы в разветвлениях.

4. Продемонстрировано введение в состав полимера S.kentucky остатка паратозы вместо остатка абеквозы при химико-ферментативном синтезе полисахаридов.

Основное_со£ержаше_дассертацш_изложено_в публикациях:

1. Дружинина Т.Н., Гогилашвили Л.М., Сизова О.В., Шибаев В.Н. Акцепторная специфичность маннозилтрансфераз салмонелл серогрупп С2 и С3.//Биоорган, химия. 1986. Т.12. H 12. СЛ589-1596.

2. Сизова О.В., Дружинина Т.Н., Шибаев В.Н. Химико-ферментативный синтез разветвленных О-специфических полисахаридов салмонелл серо-группы Сд.//Тез.докл. на VIII Всесоюзной конференции по химии и биохимии углеводов. 1987. Тбилиси.

3. Нечаев O.A..Сизова О.В..Дружинина Т.Н..Торгов В.И., Шибаев В.Н. Превращение метилгликозидов да- и трисахаридов в морапренилпирофос-

фзтные производные и использование последних для изучения субстрат.—

ной специфичности маннозилтрансфераз Salmonella kentucky.//Биоорган. ХИМИЯ. 1988. Т. 14. N 9. С. 1290-1292.

4. Дружинина Т.Н., Сизова О.В., Шибаев В.Н., Рожнова С.Ш. Введение остатков абеквозы в О-специфические полисахариды салмонелл серогрупп В, С2 и С3.//Биоорган.химия. 1988. Т. 14. N 10. С. 1419-1427.

5. Сизова О.В., Дружинина Т.Н., Торгов В.И., Шибаев В.Н. Фракционирование гликозилтрансфераз, осуществляющих сборку повторяющихся гве-

ньев О-антигенов салмонелл. //Тез. докл. на Всесоюзной конференции "Регуляция микробного метаболизма". 1969. Пущино.

6. Дружинина Т.Н., Сизова О.В., Шибаев В.Н., Рожнова С.Ш. Введение остатка паратозы в О-специфические полисахариды салмонелл с помощью ферментативных реакций.//Биоррган.химия. 1990.Т.16. N 6."С.816-821.

7. Дружинина Т.Н., Сизова О.В., Шибаев В.Н. Химико-ферментативный синтез разветвленных О-спешфческих полисахаридов салмонелл серо-. груш С2 И Сз.//БИООргаН.ХИМИЯ. 1990. Т. 16. N 6. С. 822-629. Г\ )

Т- IMibßT 2РМ.Ш

Т«р /И) Т«а. Миаы гултуры СССР