Низкомолекулярные производные ионных полисахаридов. Структура и свойства тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

Калитник Александра Анатольевна

Низкомолекулярные производные ионных полисахаридов. Структура и свойства

02.00.10 - Биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Владивосток - 2013

г 1 МАР 2013

005050937

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор химических наук, главный научный сотрудник Ермак Ирина Михайловна

Каминский Владимир Абрамович

доктор химических наук, Дальневосточный федеральный университет профессор кафедры органической химии Иколы естественных наук

Ермакова Светлана Павловна

кандидат химических наук, доцент Федеральное государственное бюджетное учреждении науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения РАН, стар ими научный сотрудник

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии Коми научного центра Уральского отделения РАН

Занята состоится " 20 " марта 2013 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 005.005.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс: (423)231-40-50, e-mail: dissovet@piboc.dvo.m

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН).

Текст автореферата размещен на сайте www.piboc.dvo.ru Автореферат разослан " 20 " февраля 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета к.б.н.

/ Черников О.В

Актуальность проблемы. Вещества растительного и животного происхождения проявляют различные биологические свойства, что открывает перспективу создания на их основе новых эффективных лекарственных препаратов. Среди природных полисахаридов особое место занимают полиэлектролиты, характеризующееся уникальными физико-химическими свойствами и разнообразной биологической активностью. К таким полисахаридам относятся хитозан и каррагинаны, которые имеют разную природу - поликатионную, в случае хитозана, и полианионную, в случае каррагинанов. Интерес к этим полисахаридам обусловлен их структурными особенностями и имрокими возможностями использования в различных областях медицины и фармакологии, благодаря многообразию полезных свойств, биосовместимости, безопасности и доступности.

Каррагинаны - сульфатированные полисахариды красных водорослей, в основе химической структуры которых находится дисахарццное повторяющееся звено, состоящее из остатков Р-галактозы, соединенных регулярно чередующимися р-(1-4) и а-(1-3) гликозцдными связями. Структурное разнообразие каррагинанов обусловлено присутствием (3-(1-4)-связанного моносахаридного остатка в вцце 3,6-ангццрогалактозы, а также количеством и местоположением сульфатных групп в молекуле полисахарида. Регулярные полисахариды, полимерная цепь которых построена из повторяющихся дисахаридных звеньев одного типа, получили собственные названия и условно делятся на желирующге и нежелирующге. Природные каррагинаны редко имеют регулярную структуру, чаще они содержат повторяющиеся звенья нескольких типов и представлены блочной или гибридной структурой, что обусловлено биосинтезом полисахаридов. Для определения соотношения и характера распределения этих звеньев в полимерной цепи, установления степени их влияния на проявление биологической активности необходимо использование различных модификаций полисахаридов, включая получение их низкомолекулярных (НМ) производных.

Хитозан - р-1,4-глюкозаминогликан - полностью или частично дезацетилированное производное хитина, обычно получаемое из него методом щелочного дезацетипирования. Низкая растворимость хитозана в нейтральных растворах часто является серьезным препятствием для практического использования полисахарида, в связи с этим, применяются различные методы его модификации, в том числе деполимеризация полимера.

Известно, что структурные особенности полисахаридов, их молекулярная масса, количество и распределение заместителей вдоль углеводной цепи оказывают существенное влияние на физиологическую активность полимеров. Так, согласно литературным данным, олигосахариды каррагинанов проявляют более высокую противоопухолевую активность по сравнению с исходными полисахаридами, тогда как, например, активность хитозана зависит не только от степени деполимеризации, но и от источника получения и степени ацетилирования полисахарида. Однако данные по некоторым биологическим свойствам НМ-производных как каррагинанов, так и хитозана, в сравнении с исходными полисахаридами весьма противоречивы, что может быть обусловлено различием методов их получения и фракционирования. Для корректной оценки биологических свойств полисахаридов, а также выбора наиболее перспективных из них для применения в качестве биопрепаратов и новых лекарственных средств необходимо получение образцов с заданными физико-химическими свойствами с помощью различных модификаций, включая деполимеризацию полимеров химическими и ферментативными методами.

Сокращения и условные обозначения, в - 3-[3-0-галактоза; Э - 4-а-0-галактоза; ОА - 4-а-3,6-ангадро-0-галактоза; Б — сульфатная группа; ВМ - высокомолекулярный; ВТМ - вирус табачной мозаики; ВЭЖХ — высокоэффективная жидкостная хроматография; ИК - инфракрасный; ИЛ - интерлейкин; ИФА -иммуноферментный анализ; ИЭР - ионизация электрораспылением; ЛПС - липополисахарид; МАЛДИ -матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация; ММ - молекулярная масса; МПО- миелпероксидаза; НМ - низкомолекулярный; СА - степень ацетилирования; ФНО - фактор некроза опухоли; Х-ВМ - хитозан высокомолекулярный; Х-НМ- хитозан низкомолекулярный; ЯМР — ядерный магнитный резонанс.

Изучение структуры и свойств НМ-производных полисахаридов может внести определенный вклад в установления взаимосвязи структуры и биологической активности полисахаридов.

Целью данной работы является сравнительное изучение структуры, физико-химических и биологических свойств НМ-образцов каррагинанов и хитозана, полученных различными методами, а также изучение тонкой структуры каппа/бета-каррагинана из красной водоросли Т'юЬосагриэ сппНиэ на основе анализа его олигосахаридов для доказательства гибридной структуры этого желирующэго полисахарида.

Для достижения данной цели были поставлены следующее задачи:

1. выбрать оптимальные условия деполимеризации исследуемых полисахаридов;

2. изучить структуру и физико-химические свойства НМ-производных каррагинанов и хитозана, полученных химическими и ферментативными методами;

3. установить тонкую структуру каппа/бета-каррагинана и доказать гибридную структуру данного полисахарида;

4. изучить биологическую активность продуктов химической и ферментативной деполимеризации НМ-производных каррагинанов и хитозана в сравнении с исходными полимерами.

Настоящая работа выполнена в соответствии с планом научных исследований в лаборатории молекулярных основ антибактериального иммунитета ТИБОХ ДВО РАН. Работа поддержана грантами: Президиума РАН - «Фундаментальные науки -медицине» (руководитель д.х.н. И.М. Ермак), «Молекулярная и клеточная биология» (руководитель к.б.н. В.А. Рассказов) и интеграционным грантом ДВО - УРО РАН (руководитель д.х.н. И.М. Ермак).

Научная новизна работы. Впервые на основе структурного анализа олигосахаридов каппа/бета-каррагинана из Т. сппНиэ показано, что полимерная цепь этого желирующэго полисахарида построена из блоков регулярного каппа-, протяженных блоков бета-, гибридных блоков каппа/бета-каррагинана, с включением звеньев йота- и гамма-каррагинана. Впервые показано, что деполимеризация каппа/бета-каррагинана не влияет на его способность индуцировать синтез противовоспалительных цитокинов, но снижает индуцируюц^ю способность синтеза провоспалительных цитокинов. Впервые показано, что цитокин-индуцирующая активность НМ-производных хитозана значительно выше активности исходного полисахарида. На модели ВТМ показано, что антивирусная активность НМ-образцов хитозана выше, чем активность исходного полисахарида, в то время как антивирусное действие исходных каррагинанов выше активности их НМ-производных, независимо от способа получения последних. Получены антитела к каппа-каррагинану и показано, что основным звеном, входящим в состав антигенных детерминант каррагинанов, является сульфатированная 3-связанная (В-Р-галактоза, и важную роль в формировании антигенной структуры играет макромолекулярная организация полисахаридов. Впервые на модели экспериментального колита показано, что каррагинан (каппа) и хитозан обладают противовоспалительным эффектом, который не зависит от степени полимеризации в случае хитозана, но не проявляется для НМ-образца каррагинана.

Практическая значимость работы. Показано, что НМ-производные хитозана обладают высокой антивирусной активностью в отношении ВТМ, которая проявляется в ингибировании вирусоиндуцированных локальных некрозов в листьях табака на ранних стадиях инфекции, что позволяет рассматривать олигосахарицы хитозана в качестве перспективных препаратов при защите растений от вирусных инфекций. Показано, что пероральное введение хитозана и его НМ-производных, а также высокомолекулярного каппа-каррагинана способствует уменьшению тяжести воспаления толстой кишки, что открывает возможность потенциального использования этих полисахаридов в качестве препаратов для профилактики воспалительных процессов в толстом кишечнике. Деполимеризация ВМ-хитозана способствует значительному расширению возможностей его использования в

качестве препарата медицинского и фармакологического назначения вследствие повышения растворимости полисахарида в воде и снижения вязкости его растворов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Химическая деполимеризация каррагинанов приводит к получению НМ-производных с ММ от 1,2 до 3,5 кДа и не сопровождается образованием побочных продуктов.

2. НМ-производные каррагинанов, полученные кислотным гидролизом в мягких условиях (37°С), отличаются по составу и структуре от олигосахаридов, образующихся в результате обработки полисахарида кислотой при высоких температурах (60°С).

3. Продуктами ферментативной деполимеризации каппа/бета-каррагинана каппа-каррагиназой являются как олигосахарцды, так и высокомолекулярная фракция полисахарида, устойчивая к действию фермента.

4. Желирующий полисахарид из красных водорослей Tichocarpus crinitus имеет гибридную структуру, его полимерная цепь состоит из блоков регулярного каппа-каррагинана, протяженных блоков бета-каррагинана, а также гибридных блоков каппа/бета-каррагинана, с включениями звеньев йота- и гамма-каррагинана.

5. В результате свободно-радикальной деполимеризации образцов хитозана с различными ММ и СА образуются НМ-производные с ММ в пределах 4-17 кДа, структура которых соответствует структуре исходных полимеров.

6. НМ-производные исследуемых полисахаридов обладают антивирусной активностью в отношении ВТМ, которая зависит от способа их получения. Исходные образцы каррагинанов проявляют большую антивирусную активность по сравнению с НМ-производными, в то время как антивирусная активность хитозана возрастает с уменьшением молекулярной массы полимера.

7. НМ-производные исследуемых полисахаридов сохраняют способность иццуцировать синтез цитокинов иммунокомпетентными клетками крови человека. Деполимеризация каррагинана (каппа/бета) не влияет на его способность индуцировать синтез противовоспалительного цитокина ИЛ-10, но снижает его активность в отношении синтеза провоспалительного цитокина ФНО-альфа. Цитокин-индуцирующая активность НМ-производных хитозана значительно выше активности исходного полисахарида.

8. Каррагинан (каппа) обладает иммуногенными свойствами. В состав антигенных детерминант каррагинанов входит сульфатированный остаток 3-связанной P-D-галактозы, и важную роль в формировании антигенной структуры играет макромолекулярная организация полисахаридов.

9. Исследуемые полисахариды проявляют заиуггный эффект при воспалении толстой кички экспериментальных животных. Противовоспалительный эффект каррагинана (каппа) проявляется при низкой дозе полисахарида. Олигосахарцды каррагинана не оказывает защитного действия, в то время как противовоспалительная активность хитозана не зависит от степени полимеризации.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены автором в вцде устных и стендовых сообщений на XIII и XIV Всероссийских молодежных окопах-конференциях по актуальным проблемам химии и биологии, Владивосток, 2010, 2012; на II Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия», Санкт-Петербург, 2012. 4" Annual Korea-Russia Conference «Current Issues of Natural Products Chemistry and Biotechnology», Novosibirsk, 2012.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи в отечественных и зарубежных журналах, рекомендованных ВАК РФ и 5 тезисов докладов в материалах научных конференций.

Диссертация обсуждена и одобрена на расширенном заседании отдела молекулярной иммунологии ТИБОХ ДВО РАН 26 ноября 2012 г.

Личный вклад соискателя в проведение исследования. Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично автором совместно с сотрудниками ЛМОАБИ и других лабораторий ТИБОХ ДВО РАН, а также совместно с сотрудниками ОМИБ ИФ Коми НЦ УРО РАН. На заи+тту

вынесены только те положения и результаты экспериментов, в получении которых роль соискателя была определяющей.

Объем и структура работы. Диссертация построена по традиционной схеме и содержит разделы «Введение», «Литературный обзор», «Материалы и методы» «Результаты и обсуждение», «Выводы» и «Список литературы», включающей 235 наименований. Диссертация изложена на 136 страницах. Результаты представлены в 13 таблицах и иллюстрированы 30 рисунками.

Автор выражает искреннюю благодарность своему руководителю д.х.н. И.М. Ермак за неоценимую помощ= в выполнении диссертационной работы, к.х.н. А.О. Барабановой и к.х.н. В.Н. Давыдовой за любезное предоставление образцов полисахаридов и помоиф при проведении экспериментов, д.х.н. Т.Ф. Соловьевой, к.х.н. В.И. Горбачу и всем сотрудникам ЛМОАБИ, к.х.н. С.Д. Анастюку и к.ф.-м.н. В.П. Глазунову за получение и помоиф в интерпретации масс-спектров и ИК-спектров, к.х.н. В.В. Исакову за получение ЯМР спектров, к.б.н. О.Ю. Портнягиной за практическую помощ* в проведении иммунологических исследований каррагинанов, д.б.н. A.B. Реунову и к.б.н. В.П. Нагорской за проведение экспериментов по антивирусной активности полисахаридов. Особая благодарность директору Института Физиологии Коми НЦ УРО РАН академику Ю.С. Оводову за предоставление возможности проведения экспериментальных работ в ОМИБ этого института и также сотрудникам этого отдела: д.б.н. C.B. Попову, к.б.н. П.А. Маркову,

H.С. Падерину, к.б.н. Д.С. Храмовой за практическую помоц*> и консультации при проведении биологических испытаний по противовоспалительной активности полисахаридов. Автор также благодарит Dr. W. Heibert за любезное предоставление фермента каппа-каррагиназы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I. Получение НМ-производных каррагинанов

Для получения НМ-производных использовали каппа-, лямбда- и каппа/бета-каррагинаны, выделенные из дальневосточных красных водорослей Chondrus armatus (Gigartinaceae) и Tichocarpus crinitus (Tichocarpaceae), собранных в Японском море (залив Петра Великого, м. Фалышвый). Установление химической структуры этих полисахаридов было проведено ранее в лаборатории молекулярных основ антибактериального иммунитета ТИБОХДВОРАН.

Таблица 1. Структуры повторяющихся дисахаридных звеньев исследуемых каррагинанов и их молекулярные массы

Вид водоросли Тип каррагинана ММ, кДа Структура повторяющегося звена

Остаток 3-(i-U-галактопиранозы Остаток 4-а-и-галактопиранозы

Chondrus armatus каппа 250 G4S DA

лямбда* 650 G2S D2S, 6S

Tichocarpus crinitus каппа/бета 400 G4S/G DATOA

Kappaphycus alvarezii каппа 390 G4S DA

HP сн2он сн2он Г-0 4OH ...... 'OhT^ G HO D G DA он

Примечание: * - лямбда каррагинан использовали в эксперименте по изучению антигенной структуры каррагинанов

Также в работе использовали коммерческий образец каппа-каррагинана (Sigma), выделенный из водоросли Kappaphycus alvarezii. Средневязкостные молекулярные массы полисахаридов были рассчитаны на основании измеренного значения характеристической вязкости при 25°С в 0,1 N NaCI из уравнения Марка-

Хаувинка-Куна. Структуры повторяющихся звеньев исследуемых каррагинанов и величины их молекулярных масс представлены в таблице 1.

1.1. Химическая деполимеризация

НМ-производные каппа- и каппа/бета-каррагинана были получены свободно-радикальной деполимеризацией (30% пероксцц водорода) и мягким кислотным гццролизом (0,1 N соляная кислота) исходных полисахарццов с последующем фракционированием продуктов деградации гельпроникающей хроматографией на колонке с биогелем Р-6. Основные фракции олигосахарццов (в дальнейшем - НМ-производные, НМ-образцы, НМ-продукты) были выделены, лиофилизованы и проанализированы. Их молекулярные массы, рассчитанные на основании определения концевых восстанавливающих групп Сахаров, приведены в таблице 2.

Таблица 2. Качественный и количественный состав каппа- и каппа/бета-каррагинана и продуктов (основных фракций) их химической деполимеризации

Гидролиз, агент Выход % Содержание

Образец химическии анализ % от сухого веса вещества ИК-спе ктроскоп ия MM, кДа

Gal 3,6-AnGal S042" 3,6-AnGal т S042"'4

- 30 27 22 0,38 0,59 250

X га X Н202, 24 ч 37°С 32 29 25 22 0,33 0,59 3,5

s га га с о. 0,1 N HCl, 4 ч 60°С 30 22 8 20 0,12 0,38 1,7

га га ^ -< 0,1 N HCl, 24 ч 37°С 50 27 22,5 21 0,18 0,58 1,6

- 28 21 14 0,38 0,59 400

Н202, 24 ч 37°С 30 27 20 10 0,31 0,53 2,3

го £ 1- га щ X 0,1 N HCl, 4 ч 60°С 25 20 10 8 0,26 0,48 1,2й

ю s "(3 га с о. 0,1 N HCl, 4 ч 60°С 40 20 10 8 0,26 0,48

га га 0,1 N HCl, 24 у 37°С 42 /л ■ ■ ffl 26 18 -тк—r~m-J 11 0,29 0,52 1,7

отличаются только по ММ

- данные

Согласно результатам химического анализа, содержание основных моносахаридов в процессе свободно-радикальной деполимеризации меняется незначительно, в то время как кислотный гццролиз при 37°С и, в большей степени, при 60°С приводит к уменьшению содержания галактозы и 3,6-ангццрогалактозы. Кроме того, в процессе кислотного гидролиза (как при 37°С, так и при 60°С) и деполимеризации полисахаридов под действием пероксцца водорода происходит снижение степени сульфатирования образцов каррагинанов (таблица 2). Наименьшее содержание сульфатных групп и 3,6-ангццрогалактозы отмечается в продуктах кислотного гидролиза каррагинанов при 60°С.

ИК-спектры НМ-продуктов деполимеризации каррагинанов и исходных полисахаридов идентичны в характеристической области (1000 - 700 см"1). В ИК-спектрах НМ-производных каппа-каррагинана, как и в спектре исходного полисахарида присутствуют полосы поглощения, характерные для данного типа каррагинана (рис. 1 А). Полоса поглощения при 1070 см"1 относится к скелетным колебаниям моносахарццного кольца, широкая полоса поглощения при 1258 см"1 указывает на достаточно высокое содержание сульфатных групп, интенсивная полоса поглощения при 930 см"1 характерна для присутствия 3,6-ангццрогалактозы, а

полоса поглощения при 848 см"1 указывает на наличие сульфатных групп при С-4 3-связанной (З-й-галактозы.

В ИК-спектрах НМ-продуктов химической деполимеризации каппа/бета-каррагинана, как и в спектре исходного полисахарида, кроме вышеперечисленных сигналов, присутствует полоса поглощения при 892 см"1, характерная для несульфатированной галактозы (рис. 1 В).

Отсутствие в ИК-спектрах НМ-продуктов свободно-радикальной деполимеризации каррагинанов полос поглощения в области 1705 - 1690 см"1, 1712 см"1 и 1700 см"1, характерных для карбонильных групп альдегидов, для кето- и карбоксильных групп, соответственно, свидетельствует о том, что обработка каррагинанов пероксидом водорода не приводит к образованию продуктов окисления полисахарид ной молекулы.

Рис. 1. ИК спектры каппа- (А) и каппа/бета-каррагинана (В): полимеров (а) и их олигосахаридов, полученных с помощью: (b) - HCl, 37°С, (с) - HCl, 60°С, (d) - Н202

Соотношение интенсивности соответствующих полос (А1258/А 1070) поглощения свидетельствует о более низком содержании сульфатных групп и 3,6-ангидрогалактозы (Адзо/Аю7о) в НМ-производных по сравнению с полисахаридами, что согласуется с данными химического анализа (таблица 2).

В спектре С ЯМР НМ-продукта свободно-радикальной деполимеризации каппа-каррагинана (С. armatus) в области резонанса аномерных атомов углерода наблюдаются следующее сигналы: сигнал с 5 95,47 м. д. относится к атому С-1 остатка 3,6-ангидро-0-галактозы каппа-каррагинана, сигнал с 5 92,9 м. д. соответствует атому С-1 остатка З.б-ангидро-й-галактозы йота-каррагинана, плохо разрешенные сигналы двойной интегральной интенсивности с б 102,9 и 103,04 м. д. являются результатом наложения сигналов атомов С-1 остатков галактозы каппа- и йота-каррагинана (рис. 2 б). Подобные сигналы, характерные для йота-каррагинана, наблюдаются и в спектрах 13С ЯМР НМ-продуктов кислотного гидролиза коммерческого образца каппа-каррагинана. Сигнал в аномерной области 1 С ЯМР спектра НМ-каррагинана с 5 105,46 м. д. может быть отнесен к атому С-1 остатка галактозы, имеющему сульфатную группу при С-4, и указывать на присутствие мю-или ню-типов каррагинана - биологических предшественников каппа-каррагинана. В области относительно сильного поля спектры 13С ЯМР исходного каппа-каррагинана и его НМ-производного имеют типичный для каппа-каррагинана вцд (рис. 2 а, б).

ЯМР спектр НМ-производного каппа/бета-каррагинана, полученного свободно-радикальной деполимеризацией, также соответствует спектру исходного полимера. В спектрах 13С ЯМР НМ-продуктов свободно-радикальной деполимеризации каррагинанов отсутствуют сигналы с 5 165 - 185 м. д., относяцукся к альдегидным и карбоксильным группам, и с 5 200 - 204 м. д. - к кетогруппам. Эти данные подтверждают, что обработка каррагинанов пероксидом водорода не сопровождается образованием продуктов окисления.

Таким образом, данные 13С ЯМР и ИК-спектроскопии доказывают, что в процессе свободно-радикальной деполимеризации полисахаридов пероксидом водорода не образуется никаких побочных продуктов окисления углеводной молекулы, и химическая структура НМ-продуктов химической деполимеризации каррагинанов соответствует структуре исходных полимеров.

8

С4Э-3

РА-1

С4Э-1

>,80 СВ,ОН Ь, "О^О СП-.ОН Гъ

он

ОА

С4Б-1

0,43-1 ,

0А2Б-1

С243-1 I"

Рис. 2.13С ЯМР спектры: каппа-каррагинана (а) и его НМ-производного, полученного деполимеризацией пероксидом водорода (6)

Для характеристики НМ-производных исследуемых полисахаридов, а также для уточнения и доказательства гиб рад; ¡ой структуры каппа/бета-каррагинана использовали методы МАЛДИ и ИЭР масс-спектрометрии. Согласно данным МАЛДИ масс-спектрометрии, в результате кислотного гидролиза (при 37°С) каппа- и каппа/бета-каррагинана образуется набор олигосахаридов как с четным, так и с нечетным числом моносахарццных остатков. Олигосахарццы каппа- и каппа/бета-каррагинана, состоящее из четного числа чередующихся остатков С(48) и ОА, на восстанавливающем конце содержат ОА, тогда как олигосахарццы с нечетным числом моносахаридных остатков на восстанавливающем конце имеют С(4Б) (таблица 3).

Таблица 3. Состав олигосахаридов каппа- и каппа/бета-каррагинана

т/г

259.01

403.06

421.07

505.02 667.07 709.17 811.09 913.04 1075.07 1381.16 1483.39

Состав и структура олигосахаридов

С43-РА, ОА-С43

в-РбБ

С43-РА2Э

С43-РА-С43, 0-РА23-в43 С45-РА-С-РА, ОА-в43-ОА-в С43-РА-С43-РА, С-РА-С43-РА23 С43-РА-643-РА23 С43-РА-С43-РА-С43

С43-РА-С43-РА-С-РА-643, С48-РА-6-РА-С43-РА-343 С43-РА-С43-РА-С43-РА-С43

Кроме того, наличие характерных ионов в масс-спектрах НМ-производных исследуемых полисахаридов указывает на то, что в процессе кислотного гидролиза каррагинанов в мягких условиях (при 37°С) образуются каппа-каррабиоза (DA-G4S), каппа-тетраоза ((DA-G4S)2) и другие олигосахариды, которые отличаются по строению от НМ-продуктов кислотного гидролиза полисахаридов в стандартных условиях (60°С) и присутствуют среди продуктов ферментативной деполимеризации исследуемых каррагинанов (в таблице 3 выделены жирным курсивом).

Присутствие в масс-спектрах олигосахаридов каппа-каррагинана сигналов с m/z 667.07 и 913.04 указывает на содержание остатков йота-каррагинана, что согласуется с данными ЯМР спектроскопии (в таблице 3 выделены подчеркиванием). Наличие характерных ионов в масс-спектре продуктов кислотного гидролиза каппа/бета-каррагинана указывает на присутствие в его структуре остатков бета- (m/z 1381.16), йота- {m/z 667.07) и гамма-каррагинана (предшественник бета-каррагинана) (m/z 421.07). Положение сульфата при С-6 дисахарида с m/z 421.07 (таблица 3) доказано с помощзю щзлочной модификации, в результате которой происходит замыкание цикла и снятие сульфатной группы при С-6.

Присутствие в спектрах МС/МС каппа/бета-каррагинана характерного иона с m/z 505.1 свидетельствует о наличии незначительного количества гибридных бета/йота- (m/z 811.09) звеньев' Наличие подобных фрагментов в спектре МС/МС олигосахаридов каппа-каррагинага может быть следствием снятия сульфатной группы при кислотном гидролизе, либо в процессе ионизации.

1.2. Ферментативный гидролиз

Ферментативный гидролиз каппа- и каппа/бета-каррагинана проводили с использованием рекомбинантной каппа-каррагиназы из Pseudoalteromonas carrageenovora, любезно представленной французскими коллегами. В результате гидролиза получен набор НМ-продуктов (олигосахаридов) каппа- и каппа/бета-каррагинана с ММ 2,2 и 4,3 кДа и ВМ-фракция каппа/бета-каррагинана (160 кДа), устойчивая к действию фермента, обозначенная как резистентная фракция (РФ).

Сравнительный анализ НМ-продуктов ферментативного гидролиза каппа- и каппа/бета-каррагинана методом ВЭЖХ показал, что смесь олигомеров каппа/бета-каррагинана состоит из блоков как регулярного каппа-, так и гибридного каппа/бета-каррагинана (рис. 3).

Рис. 3. Высокоэффективная жидкостная хроматография смеси олигомеров каппа- и каппа/бета-каррагинана, полученных в результате ферментативного гидролиза

По данным ИЭР МС/МС основные компоненты смеси олигосахаридов каппа/бета-каррагинана: каппа-каррабиоза, каппа-тетраоза, гекса- и октасахариды с различной последовательностью чередования звеньев каппа- и бета-каррагинана (таблица 4).

По данным 13С ЯМР и ИК-спектроскопии структура РФ каппа/бета-каррагинана соответствует структуре исходного полимера, но отличается соотношением дисахаридных звеньев каррагинанов каппа- и бета-типа. В исходном образце каррагинана их соотношение составляет 3:2, тогда как в резистентной фракции - 2:3.

mV

2 - ди-, 4 - тетра-, 6 - гекса-, 8 - октасахариды каппа-каррагинана

мин

Кроме того, в 13С ЯМР спектре РФ присутствуют сигналы, характерные для предшественников каппа- и бета-каррагинана.

Таблица 4. Состав олигосахаридов каппа/бета-каррагинана - продуктов ферментативного гидролиза

m/z Состав и структура олигосахаридов

403.06 DA-G4S

811.09 DA-G4S-DA-G4S

1117.18 DA-G4S-DA-G-DA-G4S, DA-G-(DA-G4S)2

1423.28 (DA-G)2 (DA-G4S)2

1525.24 DA-G4S-DA-G-DA-G4S-DA-G4S, DA-G4S-DA-G4S-DA-G-DA-G4S

1730.45 (DA-G4S)2 (DA-G)3

Продукты кислотного гидролиза (при 37°С) РФ были исследованы методами МАЛДИ и ИЭР масс-спектрометрии. Согласно полученным данным, смесь продуктов гидролиза содержит остатки бета- (m/z 565.1, G4S-DA-G) и йота-каррагинана (m/z 667.0, G-DA2S-G4S), а также олигосахарццы, в которых присутствует D6S, являюыуеся предшественниками бета-каррагинана (m/z 685.1).

Наличие фрагментов, содержащих D6S, отчетливо видно по характерным разрывам 0,2Х/°'2А гексапиранозного кольца. Важно отметить, что указанный разрыв может образовываться только при наличии незамещенного протона при гидроксильной группе атома С-3, что позволяет определить точное местоположение 4-связанной 6-сульфатированной галактозы методом ИЭР МС/МС.

В масс-спектре ИЭР положительных ионов были найдены следую nyie нейтральные минорные фрагменты - m/z 203.059 ([G +Na]+), m/z 365.113 ([G-D +Na]+) и m/z 527.160 ([G-D-G +Na]+). Высокую интенсивность имели сигналы ионов с m/z 509.152 ([G-DA-G +Naf), m/z 815.244 ([G-DA-G-DA-G+Na]+), что свидетельствует о наличии протяженных блоков бета-каррагинана. Полученная информация о структурных особенностях РФ объясняет устойчивость части каппа/бета-каррагинана к ферментативному гидролизу каппа-каррагиназой.

Таким образом, получение НМ-производных каппа/бета-каррагинана химической и ферментативной деполимеризацией и исследование их структуры методами ИК-, ЯМР спектроскопии и масс-спектрометрии позволило доказать и охарактеризовать гибридную структуру этого полисахарида

2. Получение НМ-производных хитозана

Для получения различных НМ-производных хитозана были использованы 2 исходных образца полисахарида с высокой степенью полимеризации. Один из них с ММ 300 кДа и CA 17% (Х-ВМ-300), полученный ранее в ТИБОХ ДВО РАН, другой -коммерческий образец (ООО «Биополимеры») с ММ 500 кДа и CA 25% (Х-ВМ-500), Из образца Х-ВМ-300 методом щелочного дезацетилирования получен продукт с ММ 130 кДа и CA 1,5% (Х-ВМ-130). Молекулярные массы исходных полисахаридов были определены визкозиметрическим методом.

2.1. Свободно-радикальная деполимеризация

НМ-образцы хитозана были получены методом свободно-радикальной деполимеризации с использованием пероксида водорода при разных температурах: 25 и 37°С, в течение 24, 48 и 72 часов с последуюи+iM фракционированием НМ-продуктов деградации гельпроникаюшрй хроматографией на колонке с сефадексом G-50. Основные фракции (в дальнейшем - НМ-производные, НМ-образцы, НМ-продукты) НМ-производных были выделены, лиофилизованы и проанализированы.

Как видно из таблицы 5, в результате свободно-радикальной деполимеризации Х-ВМ-500, Х-ВМ-300 и Х-ВМ-130 при различных условиях получены НМ-производные хитозана с ММ в пределах 5-17 кДа.

Таблица 5. Характеристика НМ-производных исследуемых образцов хитозана, полученных в результате свободно-радикальной деполимеризации

Образец Условия деполимеризации Выход, % ММ, кДа

Х-ВМ-500, СА 25% 37иС, 48 ч 5,7 6,0

37°С, 24 ч 13,8 6,0

25°С, 48 ч 39,6 10,5

25"С, 24 ч 30,4 17,0

Х-ВМ-300, СА 17% 37иС, 48 ч 18,1 17,0

Х-ВМ-130, С А 1,5% 37°С, 48 ч 25,5 15,0

37°С, 72 ч 15,2 5,0

Примечание: ММ НМ-образцов хитозана рассчитаны на основании

определения концевых восстанавливающих групп Сахаров

В ИК-спектре НМ-производного ВМ-хитозана (Х-ВМ-500), как и в спектре исходного полисахарида, присутствуют полосы поглощэния, характерные для хитозана. Интенсивная полоса поглощэния при 1642 см"1 указывает на присутствие свободных аминогрупп, полоса поглощения в области 2885 см"1 соответствует валентным колебаниям метильной группы ацетатного остатка, интенсивные полосы поглощения при 1088 и 1154 см"1 относятся к колебаниям углеводного скелета хитозана. Полосы поглощения в области 1710 - 1690 см , характерные для альдегидных, карбоксильных и кетонных групп, в ИК-спектрах НМ-продукта свободно-радиальной деполимеризации хитозана отсутствуют.

В спектрах 13С ЯМР (рис. 4) исходного образца хитозана (Х-ВМ-130) и его НМ-производного (рис. 5 а, б), полученного свободно-радикальной деполимеризацией (ММ 5 кДа), присутствуют 6 основных сигналов атомов углерода с химическими сдвигами: 98,2 (С-1), 76,8 (С-4), 75,0 (С-5), 70,7 (С-3), 60,5 (С-6), 56,2 (С-2) м. д. и минорный сигнал метильной группы ацетамидного атома углерода при 23,4 м. д. В спектрах 13С ЯМР НМ-продуктов свободно-радикальной деполимеризации хитозана отсутствуют сигналы с 5 165 - 200 м. д., относящееся к альдегидным, карбоксильным и кетонным группам. Степень ацетилирования НМ-продуктов, рассчитанная по данным 1Н ЯМР спектров на основании отношения интенсивности сигнала протонов группы СНз в ацетатном остатке к интенсивности сигнала протона при втором или третьем атоме углерода в остатке глюкозамина, соответствует степени ацетилирования исходных полимеров.

Рис. 4. 13С ЯМР спектры: (а) хитозана (Х-ВМ-130) и (б) его НМ-производного, полученного деполимеризацией пероксидом водорода

Таким образом, данные ИК- и ЯМР спектроскопии подтверждают, что в процессе деполимеризации хитозана пероксццом водорода не образуется побочных продуктов окисления молекулы полисахарида, и НМ-образцы хитозана имеют структуру, соответствующую структуре исходных полисахаридов и представляют собой поли- и олигомеры, состоящие из остатков 1,4-связанного р-Р-глюкозамина и ацетилглюкоза м и на.

2.2. Ферментативный гидролиз

Ферментативный гидролиз Х-ВМ-500 проводили с использованием лизоцима при 37°С и при рН 6,0. Эффективное соотношение фермент/субстрат было подобрано предварительно.

Рис. 5. Гель-хроматография на колонке с сефадексом С-50 суммарного продукта ферментативного гидролиза хитозана

Анализ молекулярно-массового распределения суммарного продукта ферментативного гидролиза хитозана методом гельпроникающэй хроматографии показал (рис. 5), что в результате деполимеризации хитозана лизоцимом, получаются как НМ-, так ВМ-продукты (фракция хитозана, устойчивая к действию лизоцима).

Согласно данным ИК- и ЯМР спектроскопии, структура продуктов ферментативного гццролиза хитозана соответствует структуре исходного полимера. ММ продуктов деполимеризации хитозана рассчитывали на основании определения концевых восстанавливающих групп Сахаров, а также визкозиметрическим методом.

3. Биологическая активность полисахаридов (каррагинанов и хитозана) и их НМ-производных

Известно, что природные полисахариды обладают широким спектром биологической активности, при этом имеющиеся литературные данные о физиологической активности полисахаридов и их производных весьма противоречивы, что может быть объяснено как источниками, так и методами их получения. Анализ биологической активности НМ-производных полисахаридов может внести определенный вклад в изучение механизма действия самих природных полисахаридов и установление структурных элементов, ответственных за проявление физиологической активности.

3.1. Сравнительный анализ антивирусной активности НМ-производных полисахаридов в отношении вируса табачной мозаики (ВТМ)

Проведено изучение антивирусной активности НМ-производных каррагинанов и хитозана, полученных химической и ферментативной деполимеризацией. Как видно из таблицы 6, НМ-производные каррагинанов и хитозана сохраняют антивирусную активность, которая проявляется в уменьшении количества вирусиндуцированных локальных некрозов, образующихся на листьях табака Ксанти-нк, при инокуляции их смесью вируса и исследуемых образцов полисахаридов в сравнении с листьями, инокулированными только вирусом. Данные по антивирусной активности представлены в таблицах 6, 7, 8.

Как видно из таблицы 6, антивирусная активность НМ-прозводных каррагинанов значительно ниже (в 1,5 и более раза), чем активность исходных полисахаридов. При этом антивирусная активность НМ-каррагинанов зависит от способа их получения. Так, НМ-каррагинаны, полученные в результате мягкого кислотного гидролиза полисахаридов, проявляют большую активность по сравнению с продуктами ферментативного гццролиза и свободно-радикальной деполимеризации.

Таблица 6. Антивирусная активность каррагинанов и их НМ-производных

Образец Гидролизующий агент ММ, кДа Антивирусная активность, %

каппа-каррагинан (С. агта^в) - 250 88 ± 2,5

Н202, 24 ч 37иС 3,5 40 + 7,1

0,1 N НС1, 4ч60иС 1,7 53 ± 6,2

0,1 N НС1, 24 ч 37иС 1,6 54 ±5,8

каппа-каррагинан (К. аЫагеш) - 390 85 ± 2,7

каппа-каррагиназа 2,2 28 ± 9,1

каппа/бета-каррагинан (Т. сппИиэ) - 400 77 ± 3,2

Н202, 24 ч 37"С 2,3 37 ± 7,3

0,1 N НС1, 4ч60°С 1,2 54 ± 5,2

0,1 N НС1, 4ч60°С 3,0 51 ± 6,4

0,1 N НС1, 24 ч 37°С 1,7 52 ± 5,8

каппа-каррагиназа 160 45 ± 5,4

каппа-каррагиназа 4,3 32 ± 8,4

Данные представлены в виде среднего арифметического значения ± стандартное отклонение. Количество измерений - 30. Различия достоверны по сравнению с контролем при р<0,05.

Данные, представленные в таблицах 2 и 6, свидетельствует о том, что величина ММ в значительно большей степени оказывает влияние на антивирусную активность каррагинанов, чем их структурные особенности, в частности, количество сульфатных групп в молекуле полисахарида.

В отличие от каррагинанов, в результате деполимеризации хитозана его антивирусная активность увеличивается (таблицы 7 и 8). Уменьшение ММ от 130 до 15 кДа приводит к возрастанию его ингибирующей активности на ВТМ более чем в 2 раза. Однако, дальнейшее уменьшение молекулярной массы олигомера до 5 кДа не вызывает существенного изменения его антивирусного действия (таблица 7).

Таблица 7. Антивирусная активность НМ-хитозанов, полученных химической и ферментативной деполимеризацией исследуемых образцов полисахарида

Гидролизующий агент ММ, кДа Антивирусная активность,%

Хитозаны, СА 1,5%

пероксид водорода 130 32 ±3,8

15,0 75 ±8,1

5,0 87 ±9,0

Хитозаны, СА 25%

пероксид водорода 17,0 84 ± 8,7

6,0 75 ± 7,9

лизоцим 160 17 ±2,0

12,0 58 ±6,1

4,4 60 ±6,5

2,2 58 ± 6,2

Таблица 8. Антивирусная активность хитозанов с разной СА

Степень ацетилирования, % ММ, кДа Антивирусная активность, %

1,5 15,0 75 ± 8,1

17 17,0 73 ± 7,8

25 17,0 84 ± 8,9

Данные представлены в виде среднего арифметического значения ± стандартное отклонение. Количество измерений - 30. Различия достоверны по сравнению с контролем при р<0,05.

Антивирусная активность НМ-производных хитозана с ММ 17 и 6 кДа, полученных из Х-ВМ-500 с использованием пероксида водорода, также существенно не различается (табл. 7). Как и в случае с каррагинанами, антивирусная активность НМ-производных хитозана, полученных ферментативным гидролизом, ниже, чем активность олигосахаридов, образующихся в результате химической деполимеризации. Степень ацетипирования хитозана (таблица 8) не оказывает существенного влияния на его антивирусную активность, поскольку снижение СА с 25 до 17% вызывает ее незначительное уменьшение, а ингибирующэе действие на ВТМ для образца хитозана со СА 17% сопоставимо с таковым для образца со СА 1,5%.

Таким образом, полученные данные свидетельствует о существенном влиянии молекулярной массы каррагинанов и хитозана на проявление их антивирусной активности в отношении ВТМ. Деполимеризация каррагинанов сопровождается снижением их антивирусной активности, в то время как с уменьшением молекулярной массы хитозана его ингибирующэе действие на ВТМ возрастает. Антивирусная активность НМ-производных каррагинанов и хитозана зависит от способа деполимеризации, наименьшей активностью обладают НМ-образцы полисахаридов, полученные ферментативным гидролизом. » i

3.2. Сравнительный анализ ex vivo цитокин-индуцирующей активности НМ-производных полисахаридов и исходных полимеров.

Известно, что многие полисахариды обладают иммунотропной активностью. Одним из проявлений иммуномодулирующего действия вещэств является их цитокин-индуцируюшэя активность. Способность каппа/бета-каррагинана и его НМ-производных влиять на синтез цитокинов иммунокомпетентными клетками крови человека была изучена в отношении синтеза как провоспалительных (ФНО-альфа), так и противовоспалительных (ИЛ-10) цитокинов (для продуктов химической деполимеризации). В качестве положительного контроля использовали Л ПС. Как показали результаты, НМ-производные каппа/бета-каррагинана сохраняют цитокин-индуцирующую активность, стимулируя синтез ФНО-альфа и ИЛ-10 мононукпеарными клетками крови человека (рис. 6 а, б).

Рис. 6. Влияние каппа/бета-каррагинана и его НМ-производных на индукцию синтеза (а) ФНО-альфа и (б) ИЛ-10: контроль - спонтанная индукция; 2-ЛПС; 3 - ВМ-каппа/бета-каррагинан; 4 - НМ-каппа/бета-каррагинан, полученный кислотным гидролизом при 37°С; 5 - НМ-каппа/бета-каррагинан, полученный свободно-радикальной деполимеризацией. Содержание цитокинов выражено в виде среднего ± стандартное отклонение (п = 5). Различия достоверны по

сравнению с контролем при р<0,05.

Цитокин-индуцируюоэя активность каппа/бета-каррагинана в отношении продукции ФНО-альфа зависит от молекулярной массы - исходный ВМ-каррагинан имеет более высокую активность по сравнению с продуктами его деполимеризации (рис. 6 а).

В отношении синтеза противовоспалительного цитокина ИЛ-10 активность всех образцов каппа/бета-каррагинана сравнима с активностью Л ПС (рис. 6 б). В способности каппа/бета-каррагинана и его НМ-производных индуцировать синтез ИЛ-10 явной концентрационной зависимости не наблюдается (рис. 6 6).

1600 1400

С

■§ 1200 С. 1000

контроль - спонтанная индукция; 2 - ЛПС; 3 - ВМ-каппа/бета-каррагинан; 4 - РФ калпа/бета-каррагинана, 5 ■ «/с«—

каррагинана

I и VII I и I I, —Г I ^ |\и1 II I и/

- олигосахариды каппа/бета-

Рис. 7. Влияние каппа/бета-каррагинана и продуктов его ферментативного гидролиза на индукцию синтеза ФНО-альфа

НМ-про_дукты ферментативного гидролиза каппа/бета-каррагинана обладают более низкой по сравнению с исходным полисахаридом цитокин-индуцирующэй активностью в отношении ФНО-альфа (рис. 7)

Сравнительный анализ цитокин-индуцирующзй активности образцов хигозана различной ММ и СА, полученных разными методами, проводили в отношении способности индуцировать синтез провоспалительного цитокина ФНО-альфа клетками крови человека. В качестве положительного контроля использовали ЛПС.

Как вцдно из рис. 8, цитокин-индуцируюшэя активность НМ-производных хитозана, деполимеризованных с помощэю пероксида водорода, возрастает с уменьшением ММ, в то время как ВМ-хитозан не стимулирует синтез ФНО-альфа в этих клетках. Сущзственное возрастание активности происходит при снижении молекулярной массы полимера от 160 до 17 кДа, при этом ее дальнейшее уменьшение до 6 кДа не приводит к каким-либо значительным изменениям цитокин-индуцирующей активности хитозана.

контроль - спонтанная индукция; 2 - ЛПС; 3-10 (исследуемые образцы хитозана): 3-Х-ВМ-130, СА 1,5%; 4-Х-НМ-15, СА 1,5%; 5 - Х-НМ-5, СА 1,5%; 6 - Х-НМ-17, СА 17%; 7 - Х-НМ-17, СА 25%; 8 - Х-НМ-6, СА 25% -образцы, полученные свободно-радикальной деполимеризацией

9 - Х-ВМ-160, СА 25%; 10 - Х-НМ-4,4, СА 25% -образцы, полученные ферментативным гидролизом

Рис. 8. Влияние хитозанов различной молекулярной массы на индукцию синтеза

ФНО-альфа

Содержание цитокинов выражено в виде среднего ± стандартное отклонение (п = 5). Различия достоверны по

сравнению с контролем при р<0,05.

Сравнительный анализ цитокин-индуцирующэй активности НМ-образцов хитозана с близкими ММ (15 и 17 кДа), но разной СА не обнаружил влияние последнего параметра на проявление данной активности (образцы 4, 6 и 7, рис. 8). В то же время, существенным фактором, влияющем на цитокин-иццуцирук>1±ую активность деполимеризованных продуктов хитозана, является способ их получения. Как видно из рис. 8, образцы хитозана с разными ММ, полученные обработкой лизоцимом, не проявляют активности в исследованных концентрациях.

Таким образом, полученные результаты показали, что НМ-производные каррагинана (каппа/бета) и хитозана, как и исходные полисахариды обладают иммуномодулируюшим действием, которое проявляется в их способности индуцировать синтез цитокинов иммунокомпетентными клетками крови человека. Цитокин-индуцирующая активность НМ-производных каррагинана в отношении ФНО-альфа ниже, чем у исходного полисахарида, но сопоставима с таковой в случае ИЛ-10. В то же время, способность НМ-производных хитозана ицдуцировать синтез

цитокинов существенно выше, чем у исходного полимера. Иммуномодулируюиуй эффект НМ-производных полисахаридов зависит от способа их получения. Продукты ферментативного гидролиза полисахародов проявляют очень низкую цитокин-индуцирующую активность.

3.3. Характеристика антигенной структуры каррагинанов

Сульфатированные полисахариды водорослей проявляют не только иммунотропную активность, но и являются иммуногенами для теплокровных животных. Антитела, получаемые при иммунизации животных этими полисахаридами, могут быть использованы для характеристики и выявления особенностей антигенной структуры исследуемых вещэств при наличии ряда полисахаридов и их производных.

В результате иммунизации кроликов каппа-каррагинаном нами была получена специфическая антисыворотка, титр антител которой составил 4,1 (в -1д). Эта антисыворотка была использована для характеристики структуры антигенных детерминант каррагинанов с помощью метода конкурентного ингибирования в ИФА.

В эксперименте использовали каррагинаны нескольких структурных типов: каппа, лямбда и каппа/бета, выделенные из водорослей С. агтаЮэ и Т. сппНиэ, их НМ-производные, полученные методом мягкого кислотного гидролиза (суммарные фракции), а также коммерческие полисахариды - декстран сульфат и агарозу, имеюиуе некоторые общ^е с каррагинанами структурные элементы. Так, полисахаридная цепь агарозы построена из дисахаридных звеньев, состоя пух из остатков 3-связанной р-Э-галактозы и 4-связанной а-3,6-ангидро-Ьгалактозы, а молекула декстран сульфата построена из сульфатированных остатков 3- и 6-связанной а-й-глюкозы. Структуры повторяющихся звеньев и молекулярные массы образцов каррагинанов, используемых в данном эксперименте, представлены в таблице 9.

Таблица 9. Характеристики образцов каррагинанов, используемых в данном эксперименте

Тип каррагинана Структура повторяющегося звена ММ кДа

-З-р-О-галактозный остаток -4-а-0-галактозный остаток

каппа С4Э ОА 250

НМ-каппа 2,3

лямбда С2Э 02Э, 6Э 650

НМ-лямбда 8,2

каппа/бета 043/3 РА/РА 400

НМ-каппа/бета 1,9

При использовании в качестве ингибитора агарозы, в углеводной цепи которой, как и в случае каррагинанов, присутствует 3-связанная |3-0-галактоза, но не содержатся сульфатные группы, наблюдалось около 20% ингибирования специфической реакции связывания антигена с антителом, а в случае декстран сульфата - сульфатированного глюкана - ингибирование связывания сыворотки с каппа-каррагинаном практически не наблюдалось. В то же время, каррагинаны различных структурных типов проявляли достаточно высокую ингибируюиую активность (от 45 до 80%). Наибольшая ингибирующая активность наблюдалась в случае лямбда-каррагинана и его НМ-производного (около 20 дисахаридных звеньев в цепи), независимо от концентрации ингибитора. Каппа/бета-каррагинан и его олигосахариды (около 5 дисахаридных звеньев в цепи) проявляли слабую ингибируюшую активность, что вероятно, обусловлено его гибридной структурой, представленной блоками как регулярного каппа-каррагинана, так и протяженными блоками несульфатированного бета-каррагинана.

Сравнительный анализ ингибирующэй активности каппа- и лямбда-каррагинана проводили по оценке величины ЕД50 - количество ингибитора, при котором наблюдается 50% ингибирование связывания специфических антител с гомологичным антигеном (каппа-каррагинаном).

0,45

ВМ-каппа НМ-каппа ВМ-лямбда НМ-лямбда

Рис. 9. Ингибирующая активность различных типов каррагинанов и их НМ-производных

Как вццно из рис. 9, каппа-каррагинан - гомологичный антиген наиболее эффективно ингибирует связывание антител с антигеном. Ингибирующая активность НМ-образца каппа-каррагинана значительно (в 1,8 раза) ниже по сравнению с исходным полисахаридом и сравнима с таковой для лямбда-каррагинана и его НМ-производного. В то же время, деполимеризация лямбда-каррагинана незначительно изменяет его способность связываться с антителами к каппу-каррагинану.

Вероятно, это связано с различной локализацией антигенных детерминант в каппа- и лямбда-каррагинане, что обусловлено разной макромолекулярной организацией этих полисахаридов. Согласно данным электронной микроскопии, каппа-каррагинан формирует в растворе гибкие фибриллы (рис. 10 а), состоящее из двойных спиралей, которые, вероятно, образуют пространственные антигенные детерминанты. Подобная макромолекулярная структура каппа-каррагинана нарушается при деполимеризации полисахарида. В отличие от каппа-каррагинана, лямбда-каррагинан в растворе имеет конформацию неупорядоченного клубка (рис. 10 6), независимо от степени полимеризации полисахарида.

Рис. 10. Электронная микроскопия: каппа- (а) и лямбда-каррагинана (б)

Различие макромолекулярной организации этих полисахаридов объясняет уменьшение способности каппа-каррагинана связываться с антителами вследствие деполимеризации и отсутствие существенного влияния степени полимеризации лямбда-каррагинана на его ингибирующ/ю способность. Сравнительный анализ ингибирующэй активности каппа- и лямбда-каррагинанов и их НМ-производных указывает на то, что в состав антигенных детерминант каррагинанов входит сульфатированная 3-связанная (З-й-галактоза, и важную роль в формировании антигенной структуры играет пространственная организация полисахарида.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что в формировании структуры антигенных детерминант каррагинанов участвует как первичная, так и пространственная структура полисахаридов.

3.4. Противовоспалительное действие полисахаридов и их НМ-производных

Иммуномодулирующэе действие поли- и олигосахаридов, показанное выше, может способствовать проявлению ими противовоспалительного эффекта.

В настоящзй работе было изучено действие каррагинана, хитозана и их НМ-производных на процесс воспаления толстой кишки у мышей на модели экспериментального химически-индуцированного колита.

В работе использовали образец каппа-каррагинана (С. агтаЮэ) с ММ 250 кДа (ВМ-каппа) и суммарную фракцию олигосахаридов (НМ-каппа), полученную мягким кислотным гидролизом, со среднечисловой молекулярной массой 2,3 кДа; высокомолекулярный хитозан с ММ 130 и СА 1,5% (ВМ-Х) и его НМ-производное с ММ 5,0 кДа (НМ-Х), полученное свободно-радикальной деполимеризацией.

В настоящем эксперименте полисахариды и их НМ-производные вводились перорально за сутки до индукции колита в следующих дозах: 5, 10 и 50 мг/кг. Степень поражения толстой кишки оценивали по морфологическим (степень и плошадь поражения) и биохимическим (содержание миелпероксидазы - МПО) показателям.

ВД ................... 4.5 45

Рис. 11. Площадь поражения (а), степень повревдения (б) и активность МПО (в) в стенке толстой кишки у мышей при пероральном введении образцов каррагинана (ВМ-каппа и НМ-каппа) за 24 4 ДО ректального введения уксусной КИСЛОТЫ. Данные представлены в виде среднего арифметического значения ± стандартное отклонение. Количество животных - 7. Различия достоверны по сравнению с контролем при р<0,05. Контроль: физраствор, ПН - преднизолон

Как показали результаты, каппа-каррагинан в дозе 5 мг/кг и хитозан в дозе 50 мг/кг при пероральном введении мышам оказывают защитный эффект сравнимый с действием преднизолона в дозе 5 мг/кг. Под действием полисахаридов снижается степень и плошадь поражения стенки толстой кишки, а также содержание миелпероксидазы (МПО) в ткани кишки (рис. 11, 12).

Способность каррагинана ингибировать развитие колита в значительной степени зависит от ММ полисахарида. НМ-производное каппа-каррагинана при пероральном введении мышам в указанной концентрации не оказывает защитного эффекта по морфологическим показателям повреждения толстой кишки (рис. 11 а, б). В то же время, занятное действие хитозана при воспалении толстой кишки не зависит от ММ полисахарида, и противовоспалительная активность НМ-хитозана сопоставима с активностью исходного полимера (рис. 12).

Влияние каппа-каррагинана на процесс воспаления толстой кишки сильно зависит от концентрации полисахарида. Повышение дозы каррагинана до 10 мг/кг приводит к отсутствию защитного эффекта по морфологическим показателям тяжести воспаления толстой кишки (рис. 11 а, б), а десятикратное увеличение дозы полисахарида (до 50 мг/кг) способствует усилению развития воспаления толстого кишечника (по макроскопическим показателям), индуцированного ректальным введением уксусной кислоты (рис. 11 а, б).

Как видно из рис. 12 в, оба исследуемых образца каппа-каррагинана способствуют снижению активности МПО при пероральном введении мышам во всех используемых дозах, но по морфологическим показателям занятный эффект проявляется только в случае ВМ-образца каппа-каррагинана при введении его в дозе 5 мг/кг (рис. 12 а, б).

»8 | 20 л 15

I

I»

Рис, 12. Плошэдь поражения (а), степень повреящения (б) и активность МПО (в) в стенке толстой кишки у мышей при пероральном введении образцов хитозана (50 мг/кг) за 24 ч до ректального введения уксусной кислоты. Данные представлены в виде среднего арифметического значения ± стандартное отклонение. Количество животных- 10. Различия достоверны по сравнению с контролем при р<0,05. Контроль: физраствор, ПН - преднизолон

Таким образом, полиионные полисахариды - каррагинан (каппа) и хитозан оказывают противовоспалительное действие, которое проявляется в ингибировании развития химически-индуцированного воспаления толстой кишки экспериментальных животных. В случае каррагинана, противовоспалительный эффект проявляется только при низкой (5 мг/кг) дозе полисахарида. НМ-каррагинан не оказывает защитного действия, тогда как противовоспалительная активность хитозана не зависит от его ММ.

вм-х нм-х

I ■ 111 111

ютроль ВМ-Х

контроль ВМ-Х

Выводы

1. Показано, что свободно-радикальная деполимеризация (с использованием пероксцца водорода) каппа- и каппа/бета-каррагинана приводит к получению НМ-производных с ММ 3,5 и 2,3 кДа, тогда как в результате ферментативного гидролиза полисахаридов каппа-каррагиназой образуются олигосахарцды с ММ 2,2 и 4,3 кДа, а также ВМ-фракция каппа/бета-каррагинана (160 кДа), устойчивая к действию фермента.

2. Установлено, что в результате кислотного гидролиза каппа- и каппа/бета-каррагинана в мягких условиях (37°С) образуется набор олигосахаридов, состоящих как из четного числа чередующихся остатков в(43) и ОА, с ЭА на восстанавливающем конце, так и олигосахарцды с нечетным числом моносахаридных остатков, имеюшце на восстанавливающем конце С(43), а также каппа-каррабиоза (-йА-С43-), каппа-тетраоза ((-ОА-<343-)2), которые, наряду с гекса-и октасахарццами, присутствуют в продуктах ферментативного гидролиза каппа- и каппа/бета-каррагинана каппа-каррагиназой.

3. На основе структурного исследования олигосахаридов каппа/бета-каррагинана, полученных химической и ферментативной деполимеризацией, доказана гибридная структура желирующего полисахарида из Т. сппИив. Установлено, что полимерная цепь каппа/бета-каррагинана состоит из блоков регулярного каппа- (-С43-РА-), протяженных блоков бета-каррагинана (-в-ОА-), а также гибридных блоков каппа/бета-каррагинана (-С43-ОА-С-ОА-), с включением звеньев йота- (-С43-йА23-) и гамма-каррагинана (-С-ОбЭ-).

4. Показано, что в результате свободно-радикальной деполимеризации образцов хитозана с различными ММ и СА образуются НМ-производные с ММ в пределах 4-17 кДа, структура которых соответствует структуре исходных полимеров. Продуктами ферментативной деполимеризации хитозана лизоцимом являются НМ-образцы (2-12 кДа) и фракция полисахарида (160 кДа), устойчивая к действию лизоцима.

5. Показано, что НМ-производные как каррагинанов, так и хитозана обладают в отношении ВТМ антивирусной активностью, которая зависит от способа их получения. НМ-образцы каррагинанов обладают более низкой антивирусной активностью по сравнению с исходными полисахаридами, в то время как

ингибирующее действие на ВТМ НМ-продуктов деполимеризации хитозана значительно выше такового для исходных полимеров.

6. Показано, что НМ-производные исследуемых полисахаридов сохраняют способность иццуцировать синтез цитокинов иммунокомпетентными клетками крови человека. Деполимеризация каппа/бета-каррагинана не влияет на его индуцируюиую активность в отношении синтеза противовоспалительного цитокина ИЛ-10, но снижает его способность активировать синтез провоспалительного цитокина ФНО-альфа. Цитокин-индуцируюшдя активность НМ-производных хитозана значительно выше активности исходного полисахарида.

7. Показано, что основным звеном, входящим в состав антигенных детерминант каррагинанов, является сульфатированная 3-связанная p-D-галактоза, и важную роль в формировании антигенной структуры этих полисахаридов играет их макромолекулярная организация.

8. Установлено, что исследуемые полисахариды ингибируют развитие химически-индуцированного воспаления толстой киики экспериментальных животных. Противовоспалительный эффект каппа-каррагинана проявляется при низкой дозе полисахарида. Противовоспалительная активность НМ-хитозана сопоставима с активностью исходного полимера, тогда как НМ-производное каррагинана не оказывает занятного действия.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. Давыдова В.Н., Нагорская В.П., Горбач В.И., Калитник А.А., Реунов А.В., Соловьева Т.Ф., Ермак И.М. Антивирусная активность хитозана: зависимость от структуры и способа деполимеризации // Прикладная биохимия и микробиология. -2011.-Т. 47,-С. 113-118.

2. Kalitnik А.А., Barabanova А.О., Glazunov V.P., Nagorskaya V.P., Reunov A.V., Solov'eva T.F., Yermak I.M. Low molecular weight derivatives of different carrageenan types and their antiviral activity // J. Appl. Phycol. -2013. - Vol. 25.- P. 65-72.

3. A.A. Калитник, B.H. Давыдова, И.М. Ермак, В.П. Нагорская. Зависимость антивирусной активности хитозана от его структуры и способа деполимеризации // Тезисы докладов XIII Всероссийской молодежной иколы- конференции по актуальным проблемам химии и биологии. Владивосток. -2010.

4. A.A. Kalitnik, А.О. Barabanova, A.V. Reunov, V.P. Nagorskaya, I.M. Yermak. Preparation, structural characterization and in vitro antiviral activity of carrageenan oligosaccharides // International Conference "Renewable Wood and Resources: Chemistry, Technology, Pharmacology, Medicine". Saint-Petersburg. -2011.

5. Калитник A.A. Барабанова A.O., Нагорская В.П., Реунов А.В., Ермак И.М Низкомолекулярные производные сульфатированных полисахаридов красных водорослей и их антивирусная активность // Тезисы докладов IV Международной научно-практической конференции «Морские прибрежные экосистемы. Водоросли, беспозвоночные и продукты их переработки». Южно-Сахалинск. -2011.

6. Kalitnik А.А., Marcov Р.А., Davydova V.N., Volodko A.V., Popov S.V. Preventive effect of chitosan, carrageenan and their low molecular weight (LMW) derivatives on acetic acid-induced colitis in mice // Abstracts of the 4th Annual Korea-Russia Conference «Current Issues of Natural Products Chemistry and Biotechnology». Novosibirsk. -2012.

7. Калитник A.A., Марков П.А., Володько А.В. Противовоспалительная активность хитозана и его низкомолекулярного производного // Тезисы докладов II Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия». Санкт-Петербург. -2012.

Соискатель

Калитник

А.А.

Александра Анатольевна КАЛИТНИК

НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ ИОННЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ. СТРУКТУРА И СВОЙСТВА

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Подписано к печати 12.02.2013 г. Печать офсетная. Формат 60x90/16. Бумага офсетная. Усл. п. л. 1,38. Уч.-изд. л. 1,04. Тираж 120 экз. Заказ 28

Отпечатано в типографии ФГУП Издательство «Дальнаука» ДВО РАН 690041, г. Владивосток, ул. Радио,7

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения Российской академии наук

На правах рукописи

Калитник Александра Анатольевна

Низкомолекулярные производные ионных полисахаридов.

Структура и свойства

02.00.10 - Биоорганическая химия

Диссертация на соискание ученой степени _1—. кандидата химических наук

О

со

СО

^ со

Ю тг Научный руководитель:

СО С\| д.х.н. Ермак Ирина Михайловна

©3

СМ ^

ВЛАДИВОСТОК - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ...............................................................4

ВВЕДЕНИЕ...............................................................................................................................5

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР..............................................................................................11

1.1. Каррагинаны - сульфатированные полисахариды красных водорослей.........11

1.1.1. Источники выделения и химическая структура каррагинанов.......................11

1.1.2. Физико-химические свойства каррагинанов и их применение.......................15

1.2. Хитозан - поликатионный полисахарид..................................................................18

1.2.1. Химическая структура и получение хигозана.....................................................18

1.2.2. Физико-химические свойства и применение хитозана.....................................20

1.3. Получение низкомолекулярных производных полисахаридов..........................22

1.3.1. Физико-химические методы....................................................................................22

1.3.2. Химические методы...................................................................................................23

1.3.3. Ферментативные методы..........................................................................................27

1.4. Биологическая активность полисахаридов и их производных...........................32

1.4.1. Биологическая активность каррагинанов и их производных...........................32

1.4.2. Биологическая активность хитозана и его производных..................................39

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ...........................................................................................48

2.1. Реагенты и материалы..................................................................................................49

2.2. Основные аналитические методы..............................................................................49

2.3. Физико-химические методы.......................................................................................50

2.4. Дезацетилирование хитозана......................................................................................51

2.5. Получение низкомолекулярных производных полисахаридов..........................51

2.6. Гель проникающая хроматография............................................................................53

2.7. Определение молекулярной массы...........................................................................54

2.8. Биологическая активность...........................................................................................55

2.9. Иммунизация экспериметальных животных, получение антисывороток.....58

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ................................................................................60

3.1. Получение низкомолекулярных (НМ) каррагинанов............................................60

3.1.1. Изучение кинетики мягкого кислотного гвдролиза...........................................61

3.1.2. Химическая деполимеризация................................................................................61

3.1.3. Характеристика структуры продуктов мягкого кислотного гвдролиза

каппа- и каппа/бета-каррагинана методом масс-спектрометрии...............................68

3.1.4. Ферментативныйгвдролиз......................................................................................72

3.2. Получение НМ-производных хитозана....................................................................77

3.2.1. Свободно-радикальная деполимеризация............................................................78

3.2.2. Ферментативный гвдролиз......................................................................................81

3.3. Биологическая активность полисахаридов (каррагинанов и хитозана) и их ЫМ-производных..................................................................................................................84

3.3.1. Антивирусная активность каррагинанов и их НМ-производных, зависимость от структуры, молекулярной массы и способа деполимеризации.............................85

3.3.2. Антивирусная активность хитозана и его НМ-производных, зависимость

от структуры, молекулярной массы и способа деполимеризации.............................88

3.3.3. Цигокин- индуцирующая активность полисахаридов и их НМ-производных..................................................................................................................92

3.3.4. Харктеристика антигенной структуры каррагинанов........................................99

3.3.5. Противовоспалительное действие полисахаридов и их

НМ-производных................................................................................................................103

4. ВЫВОДЫ..........................................................................................................................112

5. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................................................114

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

Б АД - биологически активная добавка БСА - бычий сывороточный альбумин ВМ - высокомолекулярный ВТМ - вирус табачной мозаики

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ГЖХ - газо-жидкостная хроматография

ИК - инфракрасный

ИЛ - ингерлейкин

ИФА - иммуно ферментный анализ

ИЭР - ионизация электрораспылением

ЛПС - лило полисахарид

МАЛДИ - матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация

ММ - молекулярная масса

МПО - миелпероксидаза

НМ - низкомолекулярный

ОФД - ортофенилецдиамин

ПХ - пероксвдаза хрена

СА - степень ацетилирования

УФ - ультрафильтрационный

ФНО - фактор некроза опухоли

ФСБ - фосфатно-солевой буфер

Х-ВМ - хигозан высокомолекулярный

Х-НМ - хигозан низкомолекулярный

ЯМР - ядерный магнитный резонанс

Э - 4-а-О-галактоза

ЭА - 4-а-3,6-ангидро-В-галактоза

О - 3-(3-0-галактоза

Б - сульфатная группа

ВВЕДЕНИЕ

Вещества растительного и животного происхождения проявляют различные биологические свойства, что открывает перспективу создания на их основе новых эффективных лекарственных препаратов. Среди природных полисахаридов особое место занимают полиэлектролигы, характеризующиеся уникальными физико-химическими свойствами и разнообразной биологической активностью. К таким полисахаридам относятся хигозан и каррагинаны, которые имеют разную природу - поликатионную, в случае хигозана, и полианионную, в случае каррагинанов. Интерес к этим полисахаридам обусловлен их структурными особенностями и широкими возможностями использования в различных областях медицины и фармакологии, благодаря многообразию полезных свойств, биосовместимости, безопасности и доступности.

Каррагинаны - сульфатированные полисахариды красных водорослей, в основе химической структуры которых находится дисахаридное повторяющееся звено, состоящее из остатков Э-галактозы, соединенных регулярно чередующимися Р-(1-4) и а-(1-3) гликозвдными связями. Структурное разнообразие каррагинанов обусловлено присутствием (3-(1-4)-связанного моносахарвдного остатка в виде 3,6-ангвдрогалактозы, а также количеством и местоположением сульфатных групп в молекуле полисахарида. Регулярные полисахариды, полимерная цепь которых построена из повторяющихся дисахаридных звеньев одного типа, получили собственные названия и условно делятся на желирующие и нежелирующие. Природные каррагинаны редко имеют регулярную структуру, чаще они содержат повторяющиеся звенья нескольких типов и представлены блочной иш гибридной структурой, что обусловлено биосинтезом полисахаридов. Для определения соотношения и характера распределения этих звеньев в полимерной цепи, установления степени их влияния на проявление биологической активности необходимо использование различных модификаций полисахаридов, включая получение их низкомолекулярных (НМ) производных.

Хигозан — (3-1,4 - глюкозам иногликан - полностью или частично дезацетилированное производное хитина, обычно получаемое из него методом щелочного дезацетилирования. Низкая растворимость хигозана в нейтральных

растворах часто является серьезным препятствием для практического использования полисахарида, в связи с этим, применяются различные методы его модификации, в том числе деполимеризация полимера.

Известно, что структурные особенности полисахаридов, их молекулярная масса, количество и распределение заместителей вдоль углеводной цепи оказывают существенное влияние на физиологическую активность полимеров. Так, согласно литературным данным, олигосахариды каррагинанов проявляют более высокую противоопухолевую активность по сравнению с исходными полисахаридами, тогда как, например, активность хигозана зависит не только от степени деполимеризации, но и от источника получения и степени ацетилирования полисахарида. Однако данные по некоторым биологическим свойствам НМ-производных как каррагинанов, так и хигозана, в сравнении с исходными полисахаридами весьма противоречивы, что может быть обусловлено различием методов их получения и фракционирования. Для корректной оценки биологических свойств полисахаридов, а также выбора наиболее перспективных из них для применения в качестве биопрепаратов и новых лекарственных средств необходимо получение образцов с заданными физико-химическими свойствами с помощью различных модификаций, включая деполимеризацию полимеров химическими и ферментативными методами.

Изучение структуры и свойств НМ-проюводных полисахаридов может внести определенный вклад в установления взаимосвязи структуры и биологической активности полисахаридов.

Целью данной работы является сравнительное изучение структуры, физико-химических и биологических свойств НМ-образцов каррагинанов и хигозана, полученных различными методами, а также изучение тонкой структуры каппа/бета-каррагинана из красной водоросли 7Чскосагрт сгтИт на основе анализа его олигосахарвдов для доказательства гибридной структуры этого желирующего полисахарида.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. выбрать оптимальные условия деполимеризации исследуемых полисахаридов;

2. изучить структуру и физико-химические свойства НМ-производных каррагинанов и хигозана, полученных химическими и ферментативными методами;

3. установить тонкую структуру каппа/бета-каррагинана и доказать гибридную структуру данного полисахарида;

4. изучить биологическую активность продуктов химической и ферментативной деполимеризации НМ-проговодных каррагинанов и хигозана в сравнении с исходными полимерами.

Настоящая работа выполнена в соответствии с планом научных исследований в лаборатории молекулярных основ антибактериального иммунитета ТИБ ОХ ДВО РАН. Работа поддержана грантами: Президиума РАН -«Фундаментальные науки - медицине» (руководитель д.х.н. И.М. Ермак), «Молекулярная и клеточная биология» (руководитель к.б.н. В.А. Рассказов) и интеграционным гратом ДВО -УРОРАН (руководитель д.х.н. И.М. Ермак).

Научная новизна работы. Впервые на основе структурного анализа олигосахаридов каппа/бета-каррагинана из Т. сгтЫт показано, что полимерная цепь этого желирующего полисахарида построена из блоков регулярного каппа-, протяженных блоков бета-, гибридных блоков каппа/бета-каррагинана, с включением звеньев йота- и гамма-каррагинана. Впервые показано, что деполимеризация каппа/бета-каррагинана не влияет на его способность индуцировать синтез противовоспалительных цигокинов, но снижает индуцирующую способность синтеза провоспалительных цигокинов. Впервые показано, что цито кин- индуцирую щая активность НМ-проговодных хигозана значительно выше активности исходного полисахарида. На модели ВТМ показано, что антивирусная активность НМ-образцов хигозана выше, чем активность исходного полисахарида, в то время как антивирусное действие исходных каррагинанов выше активности их НМ-производных, независимо от способа получения последних. Получены антитела к каппа-каррагинану и показано, что основным звеном, входящим в состав антигенных детерминант каррагинанов, является сульфатированная 3-связанная р-Б-галактоза и важную роль в формировании антигенной структуры играет макромолекулярная организация полисахаридов. Впервые на модели экспериментального колита показано, что

каррагинан (каппа) и хигозан обладают противовоспалительным эффектом, который не зависит от степени полимеризации в случае хигозана, но не проявляется для НМ-образца каррагинана.

Практическая значимость работы. Показано, что НМ-производные хигозана обладают высокой антивирусной активностью в отношении ВТМ, которая проявляется в ингибировании вирусоицдуцированных локальных некрозов в листьях табака на ранних стадиях инфекции, что позволяет рассматривать олигосахарвды хигозана в качестве перспективных препаратов при защите растений от вирусных инфекций. Показано, что пероральное введение хигозана и его НМ-про из водных, а также высокомолекулярного каппа-каррагинана способствует уменьшению тяжести воспаления толстой кишки, что открывает возможность потенциального использования этих полисахаридов в качестве препаратов для профилактики воспалительных процессов в толстом кишечнике. Деполимеризация ВМ-хигозага способствует значительному расширению возможностей его использования в качестве препарата медицинского и фармакологического назначения вследствие повышения растворимости полисахарида в воде и снижения вязкости его растворов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Химическая деполимеризация каррагинанов приводит к получению НМ-про из водных с ММ от 1,2 до 3,5 кДа и не сопровождается образованием побочных продуктов.

2. НМ-производные каррагинанов, полученные кислотным гидролизом в мягких условиях (37°С), отличаются по составу и структуре от олигосахарцдов, образующихся в результате обработки полисахарида кислотой при высоких температурах (60°С).

3. Продуктами ферментативной деполимеризации каппа/б ета- каррагинана каппа-каррагиназой являются как олигосахарвды, так и высокомолекулярная фракция полисахарида, устойчивая к действию фермента.

4. Желирующий полисахарид из красных водорослей Tich.oca.rpus сгтИш имеет гибридную структуру, его полимерная цепь состоит из блоков регулярного каппа- каррагинана, протяженных блоков бета-каррагинана, а также гибридных блоков каппа/бета-каррагинана, с включениями звеньев йота- и гамма-каррагинана.

5. В результате свободно-радикальной деполимеризации образцов хигозана с различными ММ и СА образуются НМ-производные с ММ в пределах 4-17 кДа, структура которых соответствует структуре исходных полимеров.

6. НМ-производные исследуемых полисахаридов обладают антивирусной активностью в отношении ВТМ, которая зависит от способа их получения. Исходные образцы каррагинанов проявляют большую антивирусную активность по сравнению с НМ-производным и, в то время как антивирусная активность хигозана возрастает с уменьшением молекулярной массы полимера.

7. НМ-производные исследуемых полисахаридов сохраняют способность индуцировать синтез цитокинов иммунокомпетентными клетками крови человека. Деполимеризация каррагинана (каппа/бета) не влияет на его способность индуцировать синтез противовоспалительного цигокина ИЛ-10, но снижает его активность в отношении синтеза провоспалигельного цигокина ФНО-альфа. Цигокин-индуцирующая активность НМ-производных хигозана значительно выше активности исходного полисахарида.

8. Каррагинан (каппа) обладает иммуногеиными свойствами. В состав антигенных детерминант каррагинанов входит сульфатированный остаток 3-связанной P-D-галактозы и важную роль в формировании антигенной структуры играет макромолекулярная организация полисахаридов.

9. Исследуемые полисахариды проявляют защитный эффект при воспалении толстой кишки экспериментальных животных. Противовоспалительный эффект каррагинана (каппа) проявляется при низкой дозе полисахарида. Олигосахариды каррагинана не оказывает защитного действия, в то время как противовоспалительная активность хигозана не зависит от степени полимеризации.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены автором в виде устных и стендовых сообщений на ХШ и XIV Всероссийских молодежных школах-конференциях по актуальным проблемам химии и биологии, Владивосток, 2010, 2012; на П Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия», Санкт-Петербург, 2012. 4th Annual Korea-Russia Conference «Current Issues of Natural Products Chemistry and Biotechnology», Novosibirsk, 2012.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи в отечественных и зарубежных журналах, рекомендованных ВАК РФ и 5 тезисов докладов в материалах научных конференций.

Диссертация обсуждена и одобрена на расширенном заседании отдела молекулярной иммунологии ТИБОХ ДВО РАН 26 ноября 2012 г.

Личный вклад соискателя в проведении исследования. Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично автором совместно с сотрудниками ЛМОАБИ и других лабораторий ТИБОХ ДВО РАН, а также совместно с сотрудниками ОМИБ ИФ Коми НЦ УРО РАН. На защшу вынесены только те положения и результаты экспериментов, в получении которых роль соискателя была определяющей.

Объем и структура работы. Диссертация построена по традиционной схеме и содержит разделы «Введение», «Литературный обзор», «Материалы и методы» «Результаты и обсужден�