Сульфатированные производные пектиновых полисахаридов

Витязев, Фёдор Васильевич

Сульфатированные производные пектиновых полисахаридов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Витязев, Фёдор Васильевич АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Сыктывкар МЕСТО ЗАЩИТЫ

2013 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.10 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Сульфатированные производные пектиновых полисахаридов»

Автореферат диссертации на тему "Сульфатированные производные пектиновых полисахаридов"

На правах рукописи

ВИТЯЗЕВ ФЁДОР ВАСИЛЬЕВИЧ

СУЛЬФАТИРОВАННЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ ПЕКТИНОВЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ

02.00.10 - биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Сыктывкар - 2013

1 б май т

005058152

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте физиологии Коми научного центра УрО РАН

Научный руководитель: кандидат химических наук, доцент

Головченко Виктория Владимировна

Официальные оппоненты: Усов Анатолий Иванович

доктор химических наук, профессор, заведующий лабораторией Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН

Ермак Ирина Михайловна

доктор химических наук, главный научный сотрудник Федерального государственного бюджетного учреждения науки

Тихоокеанского института биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт химии Коми научного центра УрО РАН, г. Сыктывкар

Защита состоится 16 мая 2013 г. в Ю00 часов на заседании диссертационного совета Д 005.005.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс: (423)231-40-50, e-mail: dissovet@piboc.dvo.ru

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН).

Текст автореферата размещен на сайте www.piboc.dvo.ru

Автореферат разослан «¿> 3» 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н. Черников О.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из важных и актуальных задач биоорганической химии является исследование высокомолекулярных биорегуляторов и выяснение взаимосвязи между их структурой и биологической активностью. Пектины и сульфатированные полисахариды являются физиологически активными биополимерами, строение макромолекул которых обусловливает их активность (Toida et al., 2003; Оводов и др., 2009; Попов, 2010). Наличие сульфатных групп и их распределение обусловливает не только полианионный характер сульфатированных полисахаридов, но и их антикоагулянтные свойства (Hirsh et al., 2005; Coombe et al., 2005). В клинической практике в качестве антикоагулянта используется гепарин, сульфатированный полисахарид животного происхождения, существенными недостатками применения которого являются сложность стандартизации его состава и возможность передачи споровых форм бычьего энцефалита человеку (Hirsh et al., 2004; Diaz-Nido et al., 2002). Поэтому ведется поиск аналогов гепарина среди полисахаридов растительного происхождения. Однако антикоагулянтная активность исследованных к настоящему времени природных и синтетических сульфатированных полисахаридов, полученных на основе целлюлозы (Wangefa/., 2007), декстранов (Huynhefa/., 2001) и пуллуланов (Mahner et al., 2001), ниже активности гепарина. Вероятно, антикоагулянтная активность сульфатированных полисахаридов обусловлена не только наличием сульфатных групп и их распределением, но и строением углеводных цепей полисахаридов, присутствием других функциональных заместителей, их положением и распределением. Большинство синтетических аналогов гепарина представляют собой производные нейтральных полисахаридов, и строение их макромолекул отличается от строения гепарина, в состав которого входят остатки гликуроновых кислот. Остатки галактуроновой кислоты являются главными структурными компонентами углеводных цепей пектиновых полисахаридов, поэтому сульфатирование пектинов позволит получить производные, максимально приближенные по структуре к гепарину. Более того, манипуляция условиями экстракции дает возможность получать пектины гомогенные по составу и молекулярной массе.

Цель работы:

Получение сульфатированных производных пектинов и определение влияния сульфатных групп на их свойства.

Задачи исследования:

1. Разработать метод сульфатирования пектиновых полисахаридов.

2. Получить набор сульфатированных производных с различной молекулярной массой и степенью сульфатирования на основе пектинов, отличающихся строением углеводных цепей.

3. Определить влияние степени замещения сульфатированных производных пектинов на их физико-химические свойства.

4. Определить влияние степени сульфатирования и молекулярной массы полученных производных пектинов на их способность связывать липопротеины низкой плотности.

5. Установить влияние степени сульфатирования полученных производных пектинов на их антикоагулянтную активность.

Положения, выносимые на защиту:

1. Сульфатирование пектиновых полисахаридов хлорсульфоновой кислотой обеспечивает получение производных с высокой степенью замещения.

2. В процессе сульфатирования пектиновых полисахаридов происходит замещение гидроксильных групп при втором и третьем атомах углерода остатков галактуроновой кислоты.

3. Степень связывания липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) зависит от количества сульфатных групп и молекулярной массы сульфатированных производных пектинов. Наибольшей способностью связывать липопротеины низкой плотности обладают сульфатированные производные пектинов с молекулярной массой выше 200 кДа, содержащие две сульфатные группы в одном мономерном звене.

4. Сульфатирование пектинов приводит к появлению антикоагулянтной активности, нехарактерной для пектинов, которая зависит от количества сульфатных групп, введенных в состав их макромолекулы.

Научная новизна. Впервые на основе пектиновых полисахаридов получен набор сульфатированных производных с различной молекулярной массой и с различным содержанием сульфатных групп.

Впервые показано, что при сульфатировании пектиновых полисахаридов происходит замещение гидроксильных групп при втором и третьем атомах углерода остатков галактуроновой кислоты.

Впервые установлено, что сульфатированные производные пектиновых полисахаридов обладают антикоагулянтной активностью, отсутствующей у исходных пектинов.

Впервые установлено, что способность сульфатированных производных пектинов связывать ЛПНП зависит от степени их сульфатирования и молекулярной массы.

Теоретическая и практическая значимость. Результаты исследования вносят вклад в понимание взаимосвязи между структурой полисахаридов, их физико-химическими свойствами и физиологической активностью. Выявлено, что введение сульфатных групп в макромолекулу пектинов изменяет их реологические свойства и физиологическую активность. Присутствие сульфатных групп в макромолекуле пектинов уменьшает их характеристическую вязкость и увеличивает растворимость в воде, а также приводит к появлению у них антикоагулянтных свойств, не характерных для пектинов. Кроме того, введение сульфатных групп повышает способность пектинов связывать ЛПНП, при этом степень связывания зависит от количества сульфатных групп и от молекулярной массы полисахарида.

Разработан оптимальный метод сульфатирования пектинов и показано, что, манипулируя условиями реакции сульфатирования, можно регулировать глубину замещения и получать на основе пектиновых полисахаридов сульфатированные производные с разным содержанием сульфатных групп. При сульфатировании пектинов происходит замещение гидроксильных групп при втором и третьем атомах углерода остатков галактуроновой кислоты с преимущественным первоначальным замещением по второму положению.

Полученные результаты позволяют расширить исследования по созданию антикоагулянтных препаратов на основе пектиновых полисахаридов.

Полученные данные об антикоагулянтной активности и способности сульфатированных производных пектинов связывать ЛПНП в большей степени, чем гепарин, открывают перспективы для использования их в медицинской практике при гемодиализе.

Апробация работы. Результаты исследования были представлены лично в виде устных и стендовых докладов на Н-ой Международной научной конференции «Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений» (г. Алма-Ата, Казахстан, 2007 г.), Ш-ей Всероссийской научной конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (г. Барнаул, 2007 г.), Ш-ей Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (г. Уфа, 2008 г.), XII-ой Всероссийской молодежной школе-конференции «По актуальным проблемам химии и биологии» (г. Владивосток, 2009 г.), VIII-ой Молодежной научной конференции Института физиологии Коми НЦ УрО РАН «Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике» (г. Сыктывкар, 2009 г.), VI-ой Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (г. Санкт-Петербург, 2010 г.), YII-ой Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (г. Сыктывкар, 2011 г.), 16-ом Европейском симпозиуме по углеводам (г. Сорренто-Неаполь, Италия, 2011 г.).

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 11 печатных работ, в том числе две статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ, и один патент Российской Федерации.

Личный вклад автора. Вклад в работы, выполненные в соавторстве и включенные в диссертацию, состоял в проведении анализа литературы, планировании экспериментов, получении экспериментальных данных, интерпретации и систематизации полученных результатов и оформления их для публикации. На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, в получении которых роль автора была определяющей.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, трех глав: обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 199 источников, в том числе 162 на английском языке. Работа изложена на 125 страницах, содержит 34 рисунка и 21 таблицу.

Работа выполнена в лаборатории гликологии Отдела молекулярной иммунологии и биотехнологии Института физиологии Коми НЦ УрО РАН в рамках плановой темы НИР «Выделение, структурная характеристика и физиологическая активность пектин-белковых комплексов» № ГР 01201050888 (2010-2013 гг.).

Работа частично получила финансовую поддержку Программ интеграционных проектов фундаментальных научных исследований, выполняемых в УрО РАН совместно с СО РАН.

Сокращения и условные обозначения. ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография, ДМФА - диметилформамид, ТФУ - трифторуксусная кислота, GalA - галактуроновая кислота, Rha — рамноза, Ara — арабиноза, Ху1 — ксилоза, Man — манноза, Glc — глюкоза, Gal - галактоза, МеО - метоксильные группы, SO3 - сульфатные группы, ИК-спектр - инфракрасный спектр, ЯМР-спектр - спектр ядерного магнитного резонанса, Мп - среднечисловая молекулярная масса, Mw - средневесовая молекулярная масса, Mw / Мп - степень полидисперсности, ВС - пектин бадана толстолистного Bergenia crassifolia L. (бергенан), LM - пектин ряски малой Lemna minor L. (лемнан), PN - пектин рдеста плавающего Potamogeton natans L. (потамогетонан), ВСН - галактуронан, полученный из бергенана, ЛПНП - липопротеины низкой плотности, DS - степень сульфатирования, Ts-OH - толуолсудьфоновая кислота, RG-I - рамногалактуронан I, ПС - полисахарид.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Для сульфатирования были использованы пектиновые полисахариды с различным строением углеводной цепи: бергенан ВС, потамогетонан PN, лемнан LM. Пектины различаются соотношением линейных и разветвленных участков, а также строением разветвленных областей. Линейные участки всех пектинов образованы галактуронаном, разветвленные - RG-I, за исключением пектина LM, разветвленная область которого представлена апиогалактуронаном, составляющим 16 % макромолекулы пектина (Golovchenko et al., 2002). Пектины ВС и PN имеют близкое строение и характеризуются незначительным содержанием RG-I (3-^5 %), различие в их структуре определяется степенью метилэтерификации остатков галактуроновой кислоты в галактуронане (Головченко и др., 2007; Popov et al., 2007). Все использованные в работе пектины были выделены водным 0.7 % раствором оксалата аммония (Оводова и др., 2000).

Получение галактуронана из бергенана и его характеристика

Для разработки метода сульфатирования был использован галактуронан, поскольку он является главным компонентом пектиновых полисахаридов. Галактуронан получали из бергенана ВС методом кислотного гидролиза 2 M ТФУ при 100 °С. Время гидролиза варьировали от 2 до 5 ч для определения оптимальных условий, при которых достигалась наибольшая деструкция боковых цепей в разветвленных областях и наименьшая деструкция галактуронана. В результате получено три образца галактуронана: ВСН, ВСН-1

и ВСН-2, в состав углеводных цепей которых входит 98+100 % остатков галактуроновой кислоты (Табл. 1). Количество гликуроновых кислот определяли спектрофотометрически по реакции с 3,5-диметилфенолом в присутствии конц. Н2504 (Шоу е/ а/., 1995). Молекулярная масса всех образцов галактуронана составляет -100 кДа, и увеличение времени обработки не приводит к ее существенному снижению. Полное разрушение боковых цепей, образованных нейтральными моносахаридными остатками, происходит только при пятичасовом гидролизе пектина (Табл. 1).

Таблица 1. Характеристика бергенана и продуктов его кислотного гидролиза

ПС Т.ч Выход, %' Содержание, %2 Mn, кДа Mw, кДа Mw/Mn

GalA Gal Ara Rha Xyl Man Glc OMe

ВС - - 84 3.0 2.3 1.0 0.2 0.6 0.9 3.7 176.9 543.5 3.0

ВСН 5 31 100 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 1.4 33.8 101.3 3.0

ВСН-1 3 35 98 1.8 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 1.4 34.8 107.9 3.1

ВСН-2 2 40 98 1.9 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 1.4 35.3 112.6 3.2

- выход рассчитан от исходной массы пектина; - массовые проценты.

В работе использовали галактуронан ВСН, высокое положительное значение удельного вращения раствора которого, [а]*",, +246° (0.1 г на 100 мл воды), указывает на а-конфигурацию остатков О-галактуроновой кислоты. Хроматограмма ВЭЖХ галактуронана ВСН содержит единственный симметричный пик, характеризующийся низким значением полидисперсности (М\у/Мп) (Рис. 1, Табл. 1), что свидетельствует об узком молекулярно-массовом распределении сополимеров, входящих в состав галактуронана.

максимума пика соответствует Мш ~ 101.3 кДа.

В |3С ЯМР-спектре галактуронана ВСН (Рис. 2) присутствует шесть сигналов атомов углерода, положение которых свидетельствует о наличии в его углеводной цепи фрагмента: ->4-а-0-С1а1/зА-1—» (Табл. 6).

Рис. 2. 13С ЯМР-спектр галактуронана ВСН. Положение сигналов С6 остатков галактуроновой кислоты при б 175.5 м.д. указывает на преимущественное присутствие в составе его

углеводных цепей остатков галактуроновой кислоты со свободными карбоксильными группами (Odonmazig et al., 1992; Catoire et al., 1998). Спектрофотометрическим методом (Wood et al., 1971) установлено, что степень метилэтерификации ВСН составляет 1.5 % (Табл. 1).

Сульфатирование пектиновых полисахаридов

Для сульфатирования пектинов использовали следующие сульфатирующие реагенты: монометилсульфат пиридина,

пиридинсульфотриоксид и хлорсульфоновую кислоту.

Метод I. Сульфатирование галактуронана ВСН проводили по методу (Takano et al., 2000) с модификациями, используя в качестве сульфатирующего реагента монометилсульфат пиридина. Сульфатирование проводили при 80 °С и пониженном давлении, варьируя количество монометилсульфата пиридина (пяти- и восьмикратный избыток реагента на одну гидроксильную группу остатка галактуроновой кислоты) и время реакции (0.5 ч, 1.5 ч и 3 ч).

Схема сульфатирования галактуронана ВСН:

OR О

Установлено, что увеличение продолжительности сульфатирования с 0.5 ч до 3 ч при пятикратном избытке монометилсульфата пиридина приводит к повышению степени сульфатирования производных в два, а при восьмикратном избытке — в три раза (Табл. 2). Ранее показано, что увеличение количества монометилсульфата пиридина при сульфатировании 1,3-Р-глюкана также приводит к увеличению степени сульфатирования производных, полученных на его основе (Такапо е1 а!., 2000).

Таблица 2. Условия сульфатирования галактуронана ВСН монометилсульфатом пиридина и характеристика полученных производных ___

ПС Т,ч Избыток, моль1 Выход, %2 GalA, %3 -SOjNa, %3 DS Мп, кДа Mw, кДа Mw/Mn

BCHS1 0.5 5 76 81 9 0.2 12.8 73.2 5.7

BCHS2 1.5 5 60 84 12 0.3 17.7 68.3 3.9

BCHS3 3.0 5 55 80 18 0.4 12.5 56.6 4.5

BCHS4 0.5 8 62 80 10 0.2 14.1 65.7 4.6

BCHS5 1.5 8 62 76 14 0.4 13.1 54.9 4.2

BCHS6 3.0 8 71 66 21 0.6 11.5 51.3 4.4

'- избыток монометилсульфата пиридина на одну ОН-группу остатка Са1А; - выход рассчитан от массы навески галактуронана, взятой для сульфатирования; 3- массовые проценты.

Максимальная степень сульфатирования галактуронана составляет 0.6 сульфатных групп на один остаток галактуроновой кислоты и

достигается при использовании восьмикратного избытка сульфатирующего реагента и при проведении сульфатирования в течение 3 ч (Табл. 2).

Установлено, что увеличение времени сульфатирования и количества монометилсульфата пиридина приводит к снижению средневесовой молекулярной массы (М\у) полученных производных, что свидетельствует о частичной деструкции углеводных цепей галактуронана в процессе его сульфатирования (Табл. 1 и 2), что также подтверждается наличием на хроматограммах ВЭЖХ сульфатированных производных пика с Муу 4 кДа, отсутствующего в галактуронане ВСН (Рис. 1 и 3). Площадь пика с М\у 4 кДа составляет до 30 % от суммы площадей пиков на выходной кривой.

Время выхода максимума пика соответствует (а) - Mw ~ 78.5 кДа, (б) - Mw ~ 4.0 кДа

Метод II. Сульфатирование галактуронана ВСН проводили пиридинсульфотриоксидом (SOj-пиридин) по методу (Mahner et al., 2001), ранее использованному для сульфатирования декстрана, с модификациями. При сульфатировании галактуронана варьировали только температуру реакции (30 °С, 50 °С, 60 °С и 70 °С), поскольку в процессе сульфатирования пуллулана, декстрана и галактоманнана показано, что оптимальными параметрами, при которых можно получать сульфатированные производные с различной степенью замещения являются трехкратный избыток SOj-пиридина и время реакции 4 ч (Mahner et al., 2001; Chaidedgumjorn et al., 2002).

Схема сульфатирования галактуронана ВСН:

Установлено, что повышение температуры от 30 °С до 60 °С приводит к увеличению степени сульфатирования в полтора раза. Образец ВСШЮ, полученный при 70 °С, характеризуется меньшей степенью сульфатирования, чем образец ВСН89, полученный при 60 °С. Следовательно, прямая зависимость степени сульфатирования от температуры реакции наблюдается лишь в диапазоне температуры от 30 °С до 60 °С (Табл. 3).

Повышение температуры реакции при сульфатировании декстрана и пуллулана приводит к увеличению степени сульфатирования в диапазоне температур с 30 °С до 65 °С (Mahner et al, 2001). Максимальная степень сульфатирования полученных производных галактуронана составляет 0.8 (Табл. 3), что в три раза ниже степени сульфатирования пуллулана (DS 2.4) и декстрана (DS 2.1) (Mahner et al., 2001).

Таблица 3. Условия сульфатирования галактуронана ВСН 50з-пиридином и характеристика полученных производных_

ПС t,°C Выход, %' GalA, %2 -S03Na,%2 DS Mn, кДа Mw, кДа Mw/Mn

BCHS7 30 95 75 20 0.5 12.1 71.2 5.9

BCHS8 50 94 74 23 0.7 10.5 68.4 6.5

BCHS9 60 92 70 28 0.8 9.2 67.3 7.3

BCHS10 70 95 73 23 0.7 9.1 66.5 7.3

- выход рассчитан от массы навески галактуронана, взятой для сульфатирования; 2- массовые проценты.

Повышение температуры реакции сульфатирования приводит к увеличению полидисперсности полученных производных и свидетельствует о деструкции углеводных цепей галактуронана. Молекулярная масса образца ВСН87, полученного при 30 °С, выше молекулярной массы образца ВСНБЮ, полученного при 70 °С (Табл. 3). На хроматограммах ВЭЖХ сульфатированных образцов ВСН87 — ВСНЭЮ, так же как и образцов, полученных при сульфатировании монометилсульфатом пиридина: ВСН81 — ВСН86, присутствует пик с М\у 4 кДа, содержание которого в образце ВСШЮ составляет 40 %, что на 10 % больше, чем в образце ВСШб (Рис. 3 и 4). Полученные результаты свидетельствуют о том, что 50^-пиридин вызывает большую деструкцию углеводных цепей галактуронана, чем монометилсульфат пиридина.

BCHS10. Время выхода максимума пика соответствует (а) - Mw ~ 98.0 кДа, (б) - Mw ~ 4.0 кДа.

Метод III. Сульфатирование галактуронана ВСН хлорсульфоновой кислотой проводили двумя способами, используя комплекс серный ангидрид-ДМФА (SOj-ДМФА) (А) и хлорсульфоновую кислоту с толуолсульфоновой кислотой (Б).

А) Сульфатирование галактуронана ВСН комплексом серный ангидрид-ДМФА. Метод сульфатирования SOj-ДМФА (Huang et al., 2003),

ранее использованный для хитозана, был модифицирован и впервые применен для сульфатирования пектинов.

Схема сульфатирования галактуронана ВСН:

Р^ОзН или Н

Комплекс получали при добавлении хлорсульфоновой кислоты к ДМФА при температуре - 25 °С. Сульфатирование проводили в течение 4 ч при комнатной температуре (25 °С), варьируя количество сульфатирующего реагента (одно-, двух-, и трехкратный избыток хлорсульфоновой кислоты на одну гидроксильную группу остатка галактуроновой кислоты). Увеличение количества сульфатирующего реагента до трехкратного избытка приводит к семикратному увеличению степени сульфатирования производных (Табл.4).

Таблица 4. Условия сульфатирования галактуронана ВСН SOj-ДМФА и характеристика полученных производных _i____

ПС t,°C Избыток, моль1 Выход, %2 GalA, %3 -SOjNa, %' DS Мп, кДа Mw, кДа Mw/Mn

BCHS11 25 1 90 84 10 0.3 18.5 74.2 4.0

BCHS12 25 2 82 69 30 1.0 15.5 64.9 4.2

BCHS13 25 3 79 45 42 2.0 14.6 64.1 4.4

'- избыток хлорсульфоновой кислоты на одну ОН-группу остатка Оа1А; 1- выход рассчитан от массы навески галактуронана, взятой для сульфатирования;3- массовые проценты.

Молекулярная масса всех полученных сульфатированных производных ниже молекулярной массы галактуронана (Табл. 1 и 4). Увеличение количества реагента приводит к увеличению деструкции углеводных цепей. Образцы сульфатированных производных галактуронанов, полученные при использовании большего количества сульфатирующего реагента, имеют меньшую Mw и характеризуются более высокой полидисперсностью. Молекулярная масса образца BCHS11, полученного при однократном избытке хлорсульфоновой кислоты, выше, чем молекулярная масса образцов BCHS12 и BCHS13, полученных при двух- и трехкратном избытке (Табл. 4).

Б) Сульфатирование галактуронана ВСН хлорсульфоновой кислотой в присутствии толуолсульфоновой кислоты (Ts-OH). Метод был ранее использован для сульфатирования карбоксиметилцеллюлозы (Vogt et al., 1995).

Сульфатирование проводили хлорсульфоновой кислотой в ДМФА в течение 1 ч при температуре 25 °С в присутствии Ts-OH в качестве катализатора. В процессе сульфатирования варьировали количество сульфатирующего реагента (одно-, двух-, и трехкратный избыток на одну гидроксильную группу остатка галактуроновой кислоты). Установлено, что увеличение количества сульфатирующего реагента до трехкратного избытка приводит к существенному увеличению степени сульфатирования (в пять раз),

при этом повышение температуры реакции с 25 °С до 60 °С не влияет на степень замещения (Табл.5).

Сульфатирование протекает по схеме:

ОХ + СЕО.Н

в5ИСГК

Таблица 5. Условия сульфатирования галактуронана ВСН хлорсульфоновой кислотой в присутствии толуолсульфоновой кислоты и характеристика

ПС Избыток, моль1 Выход, %2 ва1А, %' -ЗОзИа, %' Мп, кДа Мш, кДа М\у/Мп

ВСШ14 25 1 45 84 9 0.3 22.3 90.6 4.1

ВСНБ15 25 2 75 69 31 1.0 17.0 78.2 4.6

ВСШ16 25 3 65 62 39 1.5 15.6 75.8 4.8

ВСНБ17 40 3 55 61 40 1.5 11.8 70.9 6.0

ВСШ18 60 3 61 61 41 1.5 12.0 64.5 5.4

от массы навески галактуронана, взятой для сульфатирования;3- массовые проценты.

На хроматограммах ВЭЖХ сульфатированных образцов ВСН814-ВСН818, так же как и образцов, полученных при сульфатировании монометилсульфатом пиридина и ¿Юз-пиридином: ВСН81 - ВСН810, присутствует пик с Мш 5 кДа, содержание которого в образце ВСН818 составляет 25 %, что на 5 % и 15 % меньше, чем в образцах ВСН86 и ВСН810 (Рис. 3-5).

23 Ш (а)

27 873(6)

110 15» »0 15 0 300 Э50 «5 .50«

Рис. 5. Хроматограмма ВЭЖХ сульфатированного галактуронана ВСН818. Время выхода максимума пика соответствует: (а) - М\у~79.3 кДа, (б) - М\у ~ 3.8 кДа.

Определение наличия и положения сульфатных групп

О присутствии сульфатных групп в макромолекулах полученных производных галактуронана свидетельствует наличие в их ИК-спектрах интенсивной полосы поглощения в области 1238 см"', характерной для валентных колебаний 8=0, и полосы поглощения в области 834 см"1,

характерной для деформационных колебаний С-О-Б группы, отсутствующих в спектре исходного галактуронана ВСН (Рис. 6).

I {Ста1'

1600 1400 1200 1000 ООО 600 I

1600 1400 1200 1000 аоо 600 С1

Рис. 6. ИК-спектры галактуронана ВСН (а) и сульфатированного галактуронана ВСН813 с максимальной степенью сульфатирования (б).

Смещение сигнала аномерного атома углерода остатка галактуроновой кислоты в 13С ЯМР-спектре сульфатированных производных в область сильного поля (8 98.3 м.д.) по сравнению с его положением в остатке галактуроновой кислоты галактуронана (8 100.8 м.д.) свидетельствует о локализации сульфатных группы при С2. Смещение сигнала С4 в область более сильного поля (8 77.4 м.д.) свидетельствует о наличии сульфатной группы при СЗ (Рис. 7, Табл. 6).

Таблица 6. Химические сдвиги сигналов атомов углерода в 13С ЯМР-спектрах

ПС Химические сдвиги, 5 м.д. (ацетон 31.45 м.д.)

С1 С2 СЗ С4 С5 С6

ВСН 100.77 69.51 69.95 79.49 72.37 175.47

вашз 98.32 72.25 73.32 77.39 74.60 173.82

Рис. 7. ,3С ЯМР -спектры галактуронана ВСН (а) и сульфатированного галактуронана ВСН813 (б).

Сульфатирование пектинов

На основании данных, полученных при сульфатировании галактуронана, установлено, что использование Л'ОгДМФА позволяет получить сполна

сульфатированные производные галактуронана. Поэтому сульфатирование пектинов, которые наряду с 1,4-а-0-галактуронаном включают разветвленные области с боковыми цепями, образованными остатками нейтральных моносахаридов, проводили 50з-ДМФА. Сульфатирование проводили в течение 4 ч, при 25 °С, варьируя количество комплекса (одно-, двух-, и трехкратный избыток хлорсульфоновой кислоты на одну гидроксильную группу остатка галактуроновой кислоты в пектине). В результате были получены сульфатированные производные бергенана (ВС8), лемнана (ЬМБ) и потамогетонана (РЫБ) (Табл. 7). Выявлено, что сульфатирование лемнана сопровождается разрушением боковых цепей разветвленных областей, образованных остатками апиофуранозы. Образец ЬМБЗ, полученный при сульфатировании ЬМ с использованием наибольшего количества сульфатирующего реагента, содержит меньшее количество остатков апиозы (Табл. 7). При сульфатировании пектинов ВС и РЫ также происходит разрушение боковых цепей, сопровождающееся снижением содержания остатков нейтральных моносахаридов (Табл. 7). Методом ВЭЖХ показано, что в процессе сульфатирования пектинов, как и галактуронанов, происходит деструкция, приводящая к снижению М\у и увеличению Ми / Мп (Табл. 7).

Таблица 7. Характеристика пектинов и их сульфатированных производных

ПС Состав, %' Мп, кДа Мш кДа М\у/Мп

Оа1А -803Ыа ва1 Ага Ют Ху1 Ар1

ВС 84 - 2.3 3.4 1.8 1.1 1.0 - 177 540 3.0

ВС81 60(83) 28 0.9(1.3) 0.5(0.7) 1.0(1.4) 2.1(2.9) 0.3(0.4) - 76 480 6.3

всэг 49(82) 40 0.7(1.2) 0.8(1.3) 0.9(1.5) 1.5(2.5) 0.2(0.3) - 135 508 3.8

ВСБЗ 48(87) 45 0.7(1.3) 1.1(2.0) 1.2(2.2) 0.0 0.3(0.5) - 39 206 5.3

РЫ 87 - 2.3 1.5 0.9 0.5 1.2 - 65 349 5.3

РЫ81 80(85) 6 1.5(1.6) 1.1(1.2) 0.5(0.5) 0.8(0.9) 1.6(1.7) - 39 240 6.1

рыэг 48(79) 39 0.3(0.5) 0.4(0.7) 0.2(0.3) 1.1(1.8) 0.2(0.3) - 67 364 5.4

РЫЭЗ 43(78) 45 0.6(1.1) 0.7(1.3) 0.9(1.6) 0.5(0.9) 0.5(0.9) - 67 458 6.8

ьм 64 - 2.2 1.6 2.0 2.8 1.2 25.5 65 260 4.0

ЬМЭ1 64(69) 7 2.7(2.9) 1.4(1.5) 2.0(2.2) 3.5(3.8) 1.6(1.7) 15.1(16.2) 27 205 7.5

ЬМБ2 40(60) 33 0.9(1.3) 0.1(0.1) 0.6(0.9) 2.6(3.9) 0.9(1.3) 8.5(12.7) 30 216 7.3

ЬМБЗ 36(63) 43 0.9(1.6) 1.0(1.8) 0.8(1.4) 0.9(1.6) 0.4(0.7) 7.5(13.2) 26 208 8.2

- массовые проценты; в скобках представлены данные в пересчете на массу образца полисахарида без учета сульфатных групп.

ИК-спектроскопия пектинов и их сульфатированных производных

О наличии сульфатных групп в макромолекулах полученных производных пектинов свидетельствует присутствие в ИК-спектрах производных интенсивной полосы поглощения в области 1230 - 1270 см"1, характерной для валентных колебаний 8=0, и полосы поглощения в области 820 - 830 см"1, характерной для деформационных колебаний С-О-8 (Рис. 8).

Образцы сульфатированных производных, близкие по моносахаридному составу, но различающиеся степенью сульфатирования (ВС81 и ВС83; ЬМ81 и ЬМЭЗ; РЫ81 и РЫЭЗ), были разделены на мембранах с размером пор, характерным для молекул с Мш 300 и 100 кДа, методом последовательной ультрафильтрации. В результате для каждого образца получен набор сульфатированных производных пектинов с Мш более 300 кДа (ВС81-1,

ВС83-1, ЬМБЫ, ЬМ83-1, РЫБЫ и РЫ83-1), с Mw ЮОн-ЗОО кДа (ВС81-2, ВС83-2, ЬМ81-2, ЬМ83-2, РЫ81-2 и РЫ83-2) исМш менее 100 кДа (ВС81-3, ВСЭЗ-З, ЬМ81-3, ЬМ83-3, РЫ81-3 и РЫ83-3) (Табл. 8).

1а

1750

й/\

1 л. Аг

у 1626

/ I

V 1028

" \

1750 V 1640

п IXI %

V V

1750 У V 1 / \ А 1640 <«2 1 ^

1800 1600 1400 1200 1000 600 см1 1800 1600 1400 1200 1000 800см1 1800 1600 1400 1200 1000 800см1

Рис. 8. ИК-спектры сульфатированных производных ЬМ83 (а), ВС83 (б) и РЫБЗ (в).

Таблица 8. Характеристика сульфатированных производных пектинов

ПС Состав, %' Мп, кДа М\у, кДа М\у/Мп

Оа1А -803№ Са1 Ага Шш Ху1 СТс Ар1

ВС81 51 28 0.9 0.5 1.0 2.1 0.3 - 76 480 6.3

ВСБМ 51 28 0.4 0.9 0.5 2.3 0.3 - 107 446 4.1

ВС81-2 49 21 0.4 0.5 0.5 2.7 0.3 - 18 60 3.1

ВС81-3 45 18 0.3 1.1 0.4 2.2 0.3 - 2.6 3 1.1

ВСБЗ 48 45 0.7 1.1 1.2 0.0 0.3 - 39 206 5.3

ВС83-1 49 48 0.3 0.6 0.4 0.5 0.3 - 74 260 3.5

всБз-г 51 45 0.4 0.5 0.3 0.6 0.6 - 40 114 2.8

ВСБЗ-З 51 40 0.6 0.4 0.1 0.0 0.7 - 20 57 2.8

РЫЯ1 80 6 1.5 1.1 0.5 0.8 1.6 - 39 240 6.1

РИБЫ 87 7 0.7 0.9 0.6 0.7 0.9 - 50 245 3.4

РЫ81-2 77 9 1.1 1.0 0.4 0.9 1.0 - 22 60 2.7

РЫБ 1-3 60 10 1.3 1.2 0.3 1.8 0.0 - 9 30 3.4

РЫБЗ 43 45 0.6 0.7 0.9 0.5 0.5 - 67 458 6.8

РЫБЗ-1 46 45 0.5 0.5 0.1 0.5 0.3 - 101 400 3.9

РКЯЗ-2 37 42 1.2 0.9 0.4 0.3 0.5 - 39 151 4.5

PNSЗ-3 29 33 0.5 1.1 1.2 0.2 0.4 - 3.2 3.5 1.1

ЬМЭ1 64 7 2.7 1.4 2.0 3.5 1.6 15.1 27 205 7.5

ЬМЭМ 66 7 2.4 1.2 2.0 3.5 1.6 14.2 48 237 4.9

ЬМ81-2 57 9 3.2 2.0 2.5 5.4 1.1 16.3 24 74 3.1

ЬМ81-3 40 12 3.4 2.1 1.3 11.8 2.1 14.4 8 36 4.0

ьмвз 36 43 0.9 1.0 0.8 0.9 0.4 7.5 25 208 8.2

ЬМ83-1 34 40 1.0 0.3 0.9 1.2 1.1 6.0 50 209 4.1

ЬМ83-2 34 37 1.5 0.4 0.9 1.4 1.1 6.9 26 74 2.8

ЬМЭЗ-З 23 36 1.9 1.1 1.0 0.9 0.8 4.7 6 20 3.2

- массовые проценты.

Спектроскопия ЯМР сульфатированных производных пектинов

В 13С ЯМР-спектре сульфатированного производного ЬМ81-1 со степенью замещения 0.2 положения сигналов С2 и СЗ остатков галактуроновой кислоты смещены в область слабого поля по сравнению с сигналами этих атомов углерода в остатках галактуроновой кислоты в галактуронане. Это

может свидетельствовать о замещении остатков галактуроновой кислоты сульфатными группами по С2- и СЗ-положению. Однако смещение сигнала аномерного атома углерода в область сильного поля и отсутствие изменений в положении сигнала С4 свидетельствует о локализации сульфатных групп только при втором атоме углерода (Рис. 9, Табл. 9).

Таблица 9. Химические сдвиги сигналов атомов углерода в 13С ЯМР-спектрах пектина ЬМ и его сульфатированных производных ЬМБЗ-! и ЬМ81 -!_

ПС Химические сдвиги, 5 м.д. (ацетон 31.45 м.д.)

С1 С2 СЗ С4 С5 С6

ЬМ 100.24 69.58 70.35 79.24 72.82 176.73

ьмвм 98.90 71.32 71.43 79.02 72.91 175.35

ЬМЭЗ-! 97.61 72.53 73.51 77.20 74.81 175.01

Смещение сигнала аномерного атома углерода остатка галактуроновой кислоты в 13С ЯМР-спектре сульфатированного производного ЬМ83-1 со степенью замещения 2.0 в область сильного поля (5 98.9 м.д.) по сравнению с его положением в остатке галактуроновой кислоты галактуронана (5 100.2 м.д.) свидетельствует о локализации сульфатной группы при С2. Смещение сигнала С4 в область более сильного поля (5 77.2 м.д., в исходном галактуронане 5 79.0 м.д.) свидетельствует о наличии сульфатной группы при СЗ (Рис. 9, Табл. 9).

Рис. 9. 13С ЯМР-спектры пектина ЬМ (а) и сульфатированных производных ЬМ81-1 (б), ЬМ83-1 (в).

Растворимость пектинов и их сульфатированных производных

Установлено, что растворимость сульфатированных производных выше растворимости исходных пектинов. Сульфатированные производные с максимальным количеством сульфатных групп характеризуются наибольшей растворимостью (Рис. 10).

Рис. 10. Растворимость в воде пектинов и их сульфатированных производных.

Физиологическая активность пектинов и их сульфатированных производных

Острую токсичность пектинов и их сульфатированных производных оценивали при однократном внутрибрюшинном введении мышам с помощью экспресс-метода, разработанного Прозоровским (Прозоровский и др., 1978). Установлено, что полулетальная доза (ЛД50) пектинов и их сульфатированных производных превышает 1000мг/кг, поэтому, согласно классификации токсичности (ГОСТ 12.1.007-76 «Вредные вещества»), использованные в работе пектины и их сульфатированные производные относятся к IV классу опасности (незначительно опасные вещества, 50 < ЛД50 < 5000 мг/кг). Таким образом, полученные данные показывают, что введение сульфатных групп в макромолекулу пектина не изменяет их токсичность.

Связывание ЛПНП сыворотки крови человека in vitro

Для пектинов ВС, PN, LM и их сульфатированных производных определена способность связывать ЛПНП, которая ранее была продемонстрирована для ряда других пектинов (Vergara-Jimenez et al., 1998; Злобин и др., 2003). Способность связывать ЛПНП у пектинов ВС и LM ниже способности PN, которая сравнима с активностью гепарина, использованного в качестве положительного контроля (Рис. 11).

Рис. 11. Связывание ЛПНП сыворотки крови человека in vitro сульфатированными производными пектинов с различной молекулярной массой (контроль - гепарин). * - различия достоверны при р < 0.05.

Способность связывать ЛПНП у сульфатированных производных пектинов (BCS, LMS и PNS) выше, чем у исходных пектинов и

гепарина (Рис. 11). Существенным фактором, влияющим на связывание ЛПНП, является молекулярная масса сульфатированных производных пектинов (Рис. 11). Сравнение степени связывания ЛПНП сульфатированными производными с близким строением и одинаковым содержанием сульфатных групп показало, что образцы сульфатированных производных с большей молекулярной массой обладают наибольшей активностью (Рис. 11).

Из полученных результатов следует, что степень связывания ЛПНП зависит от количества сульфатных групп и молекулярной массы образцов сульфатированных пектинов. Увеличение отрицательного заряда макромолекулы в процессе сульфатирования пектинов, независимо от строения их макромолекул, приводит к увеличению способности связывать ЛПНП (Рис. И).

Антикоагулянтные свойства сульфатированных пектинов

Показано, что полученные сульфатированные производные в отличие от исходных ... пектинов обладают антикоагулянтной активностью. Сульфатированные производные пектинов ВСЭЗ и ЬМБЗ удлиняют время свертывания плазмы крови человека в тесте определения протромбинового времени (ПВ) и снижают активность фактора Ха в диапазоне концентраций от 4 до 400 мкг/мл. Значение эффективной концентрации, при которой время свертывания увеличивается в два раза, для сульфатированных пектинов выше, чем для гепарина (Табл. 10).

Таблица 10. Эффективная концентрация сульфатированных производных

ПС Эффективная концентрация, мкг/мл

ВСБЗ 0.34 ± 0.06

ЬМБЗ 0.36 ± 0.09

гепарин 0.07 ± 0.02

Наибольшим ингибированием фактора На (аНа-активность) в единицах стандарта гепарина обладают производные ВСБЗ и ЬМ83 (47.4 ± 5.5 и 32.7 ± 4.6 ЕД/мг) с содержанием сульфатных групп 45 и 43 % соответственно. Исходные пектины не удлиняют время свертывания плазмы человека в тесте на тромбиновое время (ТВ). Сульфатированные производные пектинов увеличивают время свертывания плазмы человека в тесте активированния частичного тромбопластинового времени (АЧТВ). Наибольшая антитромбиновая аНа-активность производных ВС83 и ЬМ83 составляет 90.33 ± 8.91 и 64.53 ± 5.50 ЕД/мг соответственно (Табл. 11).

Сульфатированные производные ВСБЗ и ЬМЯЗ отличаются аПа-активностью по ингибированию скорости гидролиза хромогенного субстрата тромбином: для ЬМвЗ скорость возрастает в 1.7 раз (100.0 ± 18.3 ЕД/мг) только в присутствии антитромбина, для ВС83 — снижается в 2.3 раза (39.0 ± 5.2 ЕД/мг). В коагулологическом тесте РеаКлот ЬМвЗ в два раза больше ингибирует фактор Ха (аХа-активность), чем ВСвЗ (Табл. 11).

Таблица 11. Специфическая антикоагулянтная активность сульфатированных производных пектинов__

Тест АЧТВ Тест РеаКлот

2АЧТВ, мг/мл аНа, ЕД/мг 2РеаКлот, мкг/мл аХа, ЕД/мг

ВС >500 0 >500 0

ВСБ! 470.00±40.00 0.71±0.23 112.11±18.00 0.22±0.07

ВСБ2 240.00±3.03 1.40±0.21 100.12±9.23 0.25±0.06

ВСБЗ 1.11±0.06 90.33±8.91 5.60±0.70 5.82±0.73

ЬМ >500 0.25±0.11 >500 0

ЬМЗЗ 1.78±0.22 64.53±5.50 3.98±0.9б 11.92±2.44

ЬМ82 5.60±0.30 53.10±9.89 20.00±5.00 3.40±0.55

Гепарин 0.36±0.05 203.00±11.00 0.02±0.01 220.00±7.00

ЬМБЗ эффективнее, чем ВСБЗ ингибирует амидолитическую активность фактора Ха (Табл. 12). Поскольку оба образца имеют одинаковую степень сульфатирования и молекулярную массу (Табл. 7), то различия в активности, скорее всего, обусловлены строением их углеводных цепей. Ранее при исследовании антикоагулянтной активности сульфатированных производных галактана и фукоидана с одинаковым типом гликозидных связей и с сульфатными группами в С2-положении показано, что активностью обладает только сульфатированный галактан (Мао е/ а1, 2009). Так как полисахариды отличаются только моносахаридным составом, то взаимодействие сульфатированных полисахаридов с кофакторами коагуляции и их протеиназными мишенями определяется не только степенью сульфатирования полисахаридов и положением сульфатных групп в моносахаридном остатке, но и строением полисахарида. В пектине ЬМ присутствуют остатки апиозы, которые отсутствуют в пектине ВС (Табл. 7). Вероятно, остатки апиозы играют важную роль в проявлении аХа-активности.

Таблица 12. Ингибирование амидолитической активности фактора Ха в присутствии антитромбина__

1С50, мкг/мл аХа, ЕД/мг

ВС >500.000 0

ВС81 >500.000 0.0012±0.0006

ВС82 >500.000 0.0013±0.0005

ВС83 125.000±32.000 0.1432±0.0251

ЬМ >500.000 0

ЬМБЗ 63.000±7.000 0.3233±0.0905

ЬМБ2 56.000±6.000 0.3000±0.0701

Гепарин 0.051±0.004 220.0000±10.0000

Таким образом, сульфатированные производные пектинов ЬМ и ВС, в отличие от исходных пектинов, проявляют антикоагулянтные свойства, связанные с ингибированием фибриногенсвертывающей и амидолитической активности тромбина и фактора Ха посредством антитромбина. Удельная антикоагулянтная активность синтезированных сульфатированных производных пектинов зависит от количества сульфатных групп.

На основании полученных результатов можно заключить, что для сульфатирования пектинов и для получения производных с высокой степенью замещения рационально использовать этерификацию хлорсульфоновой кислотой. Методом ЯМР-спектроскопии установлено, что при сульфатировании пектинов остатки галактуроновой кислоты замещаются по С2- и СЗ-положениям. Введение сульфатных групп в макромолекулу пектина увеличивает их растворимость и снижает вязкость их водных растворов, а также модифицирует физиологическую активность. Показано, что в отличие от исходных пектинов их сульфатированные производные обладают антикоагулянтной активностью.

Выводы:

1. Разработаны методы сульфатирования пектиновых полисахаридов монометилсульфатом пиридина, пиридинсульфотриоксидом, хлорсульфоновой кислотой, и показано, что для получения производных с высокой степенью замещения рационально использовать этерификацию хлорсульфоновой кислотой.

2. Получен набор сульфатированных галактуронанов с содержанием сульфатных групп 9-5-42 % и набор сульфатированных производных пектинов с содержанием сульфатных групп 7-^45 % и с молекулярной массой от 3 до 450 кДа.

3. Установлено, что при сульфатировании пектинов наблюдается замещение остатков галактуроновой кислоты по С2- и СЗ-положению, с преимущественным первоначальным замещением по С2-положению.

4. Независимо от строения способность пектинов связывать липопротеины низкой плотности увеличивается при введении сульфатных групп в их макромолекулы, и зависит от молекулярной массы сульфатированных производных пектинов и от степени их сульфатирования: наибольшей способностью обладают образцы с максимальной степенью сульфатирования, молекулярная масса которых более 200 кДа.

5. Показано, что в отличие от пектинов их сульфатированные производные обладают антикоагулянтной активностью, которая зависит от строения их макромолекул и степени сульфатирования. Наибольшую активность проявляют образцы с максимальной степенью сульфатирования.

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

1. Витязев Ф.В., Головченко В.В., Патова O.A., Дрозд H.H., Макаров В.А., Шашков A.C., Оводов Ю.С. Синтез сульфатированных пектинов и их антикоагулянтная активность // Биохимия. 2010. Т. 75. С. 857-867.

2. Витязев Ф.В., Падерин Н.М., Головченко В.В. Связывание липопротеинов низкой плотности сыворотки крови человека in vitro сульфатированными производными пектинов//Биоорган, химия. 2012. Т. 38. С. 1-5.

3. Пат. 2344829 Российская Федерация. Способ получения из растительного сырья галактуронанов, обладающих противовоспалительным действием /

Головченко В.В., Витязев Ф.В., Оводов Ю.С., Оводова Р.Г., Попов C.B., Попова Г.Ю. заявитель и патентообладатель Ин-т физиологии Коми НЦ УрО РАН. -№ 2007147162/15; заявл. 27.01.2007; опубл. 27.01.2009; Бюл. № 3.

4. Витязев Ф.В., Патова O.A., Головченко В.В. Сульфатированные пектиновые полисахариды и их физиологическая активность // Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений: Тезисы Докладов Н-ой Международной научной конференции, 10 -13 октября 2007 г. - Алма-Ата: Изд-во Казахский национальный университет им. Аль-Фараби, 2007. С. 195.

5. Витязев Ф.В., Патова O.A., Головченко В.В. Сульфатирование пектиновых полисахаридов //Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья: Тезисы Докладов Ш-ей Всероссийской научной конференции, 23 - 27 апреля 2007 г; - Барнаул: Изд-во Алтайтайского университета, 2007. Кн. 1. С. 203.

6. Витязев Ф.В., Патова O.A., Головченко В.В., Оводова Р.Г. Сульфатирование пектиновых полисахаридов // Химия и технология растительных веществ: Тезисы Докладов Ш-ей Всероссийской научной конференции, 8-12 июня 2008 г; - Сыктывкар: Изд-во Института химии Коми НЦ УрО РАН, 2008. С. 29.

7. Витязев Ф.В. Гиполипидемическая активность сульфатированных пектиновых полисахаридов // Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике: Тезисы Докладов VIII-ой Молодежной научной конференции Института физиологии Коми НЦ УрО РАН, 14 - 16 апреля 2009 г; - Сыктывкар: Изд-во Учреждения Российской академии наук Института физиологии Коми научного центра Уральского отделения РАН, 2009. С. 47.

8. Витязев Ф.В., Шашков A.C. Сульфатирование бергенана, пектина бадана толстолистного Bergenia crassifolia II По актуальным проблемам химии и биологии: Тезисы Докладов ХИ-ой Всероссийской молодежной школе-конференции, 7-14 сентября 2009 г; - Владивосток: Изд-во ТИБОХ ДВО РАН, 2009. С. 10.

9. Витязев Ф.В. Сульфатирование пектинов и их гиполипидемическая активность // Химия и технология растительных веществ: Тезисы Докладов VI-ой Всероссийской научной конференции, 14 - 18 июня 2010 г; —СПб: ООО «Сборка», 2010. С. 234.

10. Витязев Ф.В., Дрозд H.H. Антикоагулянтная активность сульфатированных производных пектинов // Химия и технология растительных веществ: Тезисы Докладов VII-ой Всероссийской научной конференции, 3 — 5 октября 2011 г; — Сыктывкар: Изд-во Института химии Коми НЦ УрО РАН, 2011. С. 43.

11. Vityazev F., Drozd N. Pectins sulfates and their anticoagulant activity // Abstracts of 16th European Carbohydrate Symposium. Sorrento-Naples, Italy, 2011. P. 582.

Автор выражает искреннюю благодарность своему научному руководителю к.х.н., доценту Головченко В.В. и академику Оводову Ю.С. за ценные советы и консультации, к.х.н., доценту Патовой O.A., к.х.н., ст.н.с. Оводовой Р.Г., д.б.н., доценту Попову C.B. и всем сотрудникам Отдела молекулярной иммунологии и биотехнологии Института физиологии. Особую признательность автор выражает сотрудникам Института органической химии им. Н.Д. Зелинского: д.х.н., профессору Шашкову A.C. за исследование образцов методом ЯМР-спектроскопии и помощь в интерпретации полученных спектров, к.х.н. Билан М.И. за подготовку образцов для анализа методом спектроскопии ЯМР. Автор благодарит научного сотрудника Института химии Коми научного центра УрО РАН Ипатову Е.У. за исследование образцов методом ИК-спектроскопии, сотрудника Гематологического научного центра РАМН ГНЦ РАМН д.м.н. Дрозд H.H. за помощь в исследовании антикоагулянтной активности образцов.

Лицензия КР № 0025 от 20.06.1996

Компьютерный набор. Формат 60x90 1\16. Отпечатано на ризографе. Усл.печ.л. 1.04 Тираж 100 Заказ №122

Информационно-издательский отдел Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук

Текст научной работы диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Витязев, Фёдор Васильевич, Сыктывкар

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии Коми научного центра Уральского отделения

Российской академии наук

04201356791

На правах рукописи

ВИТЯЗЕВ ФЁДОР ВАСИЛЬЕВИЧ

СУЛЬФАТИРОВАННЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ ПЕКТИНОВЫХ

ПОЛИСАХАРИДОВ

02.00.10 — биоорганическая химия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: - кандидат химических наук, доцент Головченко Виктория Владимировна

Сыктывкар-2013 г.

Содержание

Введение..........................................................................................5

1. Обзор литературы....................................................................... 10

1.1. Сульфатированные полисахариды...................................................................10

1.2. Гликозаминогликаны.........................................................................................10

1.2.1. Гиалуроповая кислота....................................................................................12

1.2.2. Хондроитинсульфаты....................................................................................12

1.2.3. Дерматансульфат..........................................................................................13

1.2.4. Кератансульфаты..........................................................................................13

1.2.5. Гепарин.............................................................................................................14

1.3. Сульфатированные полисахариды растительного происхождения.............16

1.3.1. Полисахариды бурых водорослей..................................................................16

1.3.2. Полисахариды красных водорослей..............................................................18

1.3.3. Полисахариды зеленых водорослей...............................................................21

1.4. Синтез сульфатированных полисахаридов.....................................................22

1.5. Определение компонентов в сульфатированных полисахаридах.................27

1.5.1. ИК-спектроскопия..........................................................................................27

1.5.2. ЯМР спектроскопия сульфатированных полисахаридов...........................27

1.5.3. Методы количественного определения сульфатных групп

в полисахаридах.........................................................................................................28

1.5.3.1. Колориметрический метод........................................................................28

1.5.3.2. Гравиметрический метод...........................................................................29

1.5.3.3. Турбидгшетрический метод.......................................................................29

1.5.3.4. Количественное определение сульфата по методу Додэ/ссона..............29

1.5.3.5. Ионно-хроматографический метод..........................................................29

1.6. Антикоагулянтная активность сульфатированных полисахаридов.............30

1.6.1. Влияние сульфатных групп на антикоагулянтную активность...............32

1.6.2. Влияние локализации сульфатных групп......................................................34

1.7. Пектиновые полисахариды...............................................................................36

1.7.1. Линейная область...........................................................................................36

1.7.2. Разветвленные области.................................................................................37

1.7.3. Рамногалактуронан 1......................................................................................37

1.7.4. Рамногалактуронан II....................................................................................38

1.8. Физиологическая активность пектинов...........................................................39

1.9. Заключение..............................................................................41

2. Обсуждение результатов.............................................................42

2.1. Получение галактуронана из пектина бадана толстолистного и его характеристика..........................................................................................................43

2.2. Дериватизация галактуронана и пектинов......................................................46

2.3. Сульфатирование галактуронана.....................................................................47

2.4. Сульфатирование пектинов..............................................................................61

2.5. ИК-спектроскопия пектинов и их сульфатированных производных...........67

2.6. ЯМР спектроскопия сульфатированных производных пектинов.................71

2.7. Растворимость пектинов и их сульфатированных производных..................75

2.8. Физиологическая активность пектинов и их сульфатированных производных..............................................................................................................80

2.9. Заключение..............................................................................89

3. Экспериментальная часть...........................................................91

3.1. Реактивы и материалы.......................................................................................91

3.2. Экспериментальные условия............................................................................91

3.2.1. Общие экспериментальные условия.............................................................91

3.2.2. Аналитические методы...................................................................................94

3.2.3. Получение галактуронанов из пектина бадана толстолистного Bergenia crassifolia L (ВС).......................................................................................................96

3.2.4. Получение триэтиламмониевой соли пектиновых полисахаридов и галактуронана............................................................................................................96

3.2.5. Получение монометил сульфата пиридина...................................................96

3.2.6. Сульфатирование галактуронана ВСН.........................................................97

3.2.6.1. Метод I. Сульфатирование галактуронана ВСН монометилсульфатом пиридина....................................................................................................................97

3.2.6.2. Метод II. Сульфатирование галактуронана ВСН

пиридинсульфотриоксидом.....................................................................................97

3.2.6.3. Метод III. Сульфатирование галактуронана ВСН хлорсульфоновой кислотой.....................................................................................................................98

3.2.7. Сульфатирование пектиновых полисахаридов............................................99

3.2.8. Фракционирование сульфатированных производных пектинов.............100

3.2.9. Определение физиологической активности...............................................100

3.2.10. Статистический анализ...............................................................................103

Выводы......................................................................................... 104

Список литературы....................................................................... 105

Условные обозначения

вэжх гжх

ДМФА

дмсо

ФА

ТФУ

ваІА

ПС

Шш

Ага

Хуі

Мап

ас

ваі МеО 803

ИК-спектр

ЯМР-спектр

Мп

вен

ВС

ьм

РЫ

СР

ТУБ

МБ

РБ

ЛПНП ББ

Тб-ОН

БЮ

ШЗ-І

АЧТВ

ТВ

ПВ

- высокоэффективная хроматография

- газожидкостная хроматография

- А^іУ-диметилформамид

- диметилсульфоксид

- формамид

- трифторуксусная кислота

- галактуроновая кислота

- полисахарид

- рамноза

- арабиноза

- ксилоза

- манноза

- глюкоза

- галактоза

- метоксильные группы

- сульфатные группы

- инфракрасный спектр

- спектр ядерного магнитного резонанса

- среднечисловая молекулярная масса

- средневесовая молекулярная масса

- галактуронан, полученный из пектина бадана толстолистного

- пектин бадана толстолистного

- пектин ряски малой

- пектин рдеста плавающего

- пектин сабельника болотного

- пектин борщевика Сосновского

- пектин пижмы обыкновенной

- пектин плодов яблони домашней

- пектин плодов сливы домашней

- липопротеины низкой плотности

- степень сульфатирования

- толуолсульфоновая кислота

- рамногалактуронан

- рамногалактуронан I

- тест частичного активированного тромбопластинового времени

- тест тромбинового времени

- тест протромбинового времени

Введение

Одной из важных и актуальных задач биоорганической химии является исследование высокомолекулярных биорегуляторов и выяснение взаимосвязи между их структурой и биологической активностью. Пектины и сульфатированные полисахариды являются физиологически активными биополимерами, строение макромолекул которых обусловливает их активность [1-3]. Наличие сульфатных групп и их распределение обусловливает не только полианионный характер сульфатированных полисахаридов, но и их антикоагулянтные свойства [4, 5]. В клинической практике в качестве антикоагулянта используется гепарин, сульфатированный полисахарид животного происхождения, существенными недостатками применения которого являются сложность стандартизации его состава и возможность передачи споровых форм бычьего энцефалита человеку [6, 7]. Поэтому ведется поиск аналогов гепарина среди полисахаридов растительного происхождения. Однако антикоагулянтная активность исследованных к настоящему времени природных и синтетических сульфатированных полисахаридов, полученных на основе целлюлозы [8], декстранов [9] и пуллуланов [10], ниже активности гепарина. Вероятно, антикоагулянтная активность сульфатированных полисахаридов обусловлена не только наличием сульфатных групп и их распределением, но и строением углеводных цепей полисахаридов, присутствием других функциональных заместителей, их положением и распределением. Большинство синтетических аналогов гепарина представляют собой производные нейтральных полисахаридов, и строение их макромолекул отличается от строения гепарина, в состав которого входят остатки гликуроновых кислот. Остатки галактуроновой кислоты являются главными структурными компонентами углеводных цепей пектиновых полисахаридов, поэтому сульфатирование пектинов позволит получить производные, максимально приближенные по структуре к гепарину. Более того, манипуляция условиями экстракции дает возможность получать пектины гомогенные по составу и молекулярной массе.

Цель работы:

Получение сульфатированных производных пектинов и определение влияния сульфатных групп на их свойства.

Задачи исследования:

1. Разработать метод сульфатирования пектиновых полисахаридов.

Положения, выносимые на защиту:

4. Сульфатирование пектинов приводит к появлению аптикоагулянтной активности, нехарактерной для пектинов, которая зависит от количества сульфатных групп, введенных в состав их макромолекулы.

сульфатированные производные с разным содержанием сульфатных групп. При сульфатировании пектинов происходит замещение гидроксильных групп при втором и третьем атомах углерода остатков галактуроновой кислоты с преимущественным первоначальным замещением по второму положению.

Апробация работы. Результаты исследования были представлены лично в виде устных и стендовых докладов на Н-ой Международной научной конференции «Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений» (г. Алма-Ата, Казахстан, 2007 г.), Ш-ей Всероссийской научной конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (г. Барнаул, 2007 г.), Ш-ей Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (г. Уфа, 2008 г.), ХИ-ой Всероссийской молодежной школе-конференции «По актуальным проблемам химии и биологии» (г. Владивосток, 2009 г.), УШ-ой Молодежной научной конференции Института физиологии Коми НЦ УрО РАН «Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике» (г. Сыктывкар, 2009 г.), У1-ой Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (г. Санкт-Петербург, 2010 г.), УП-ой Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (г. Сыктывкар, 2011 г.), 16-ом Европейском симпозиуме по углеводам (г. Сорренто-Неаполь, Италия, 2011 г.).

1. Обзор литературы

1.1. Сульфатированные полисахариды

К полисахаридам относятся высокомолекулярные продукты поликонденсации моносахаридов, связанные друг с другом гликозидными связями и образующие линейные или разветвленные цепи. Полисахариды могут состоять из одного или нескольких типов моносахаридов, в зависимости от этого различают гомо- и гетерополисахариды.

Полисахариды являются компонентами растительных и животных клеток. Целлюлоза, гемицеллюлозы, пектиновые вещества, амилоза, амилопектин, фруктаны входят в состав высших растений (мхов, папоротников, голосеменных, покрытосеменных), галактаны, агар, каррагинаны, альгиновые кислоты, фуканы, целлюлоза, пектиновые вещества - в состав водорослей. В бактериях, грибах и плесени обнаружены хитин, целлюлоза, маннаны, гликопротеины, крахмал, фруктаны. Главными полисахаридами позвоночных животных являются хрондроитинсульфаты, гликоген, беспозвоночных - хитин, целлюлоза, гликоген, галактаны [11].

Полисахариды свои биологические функции в растительных и в животных клетках чаще всего выполняют в виде комплексов с белками (гликопротеинов и протеогликанов). Полисахариды содержат в углеводной цепи функциональные группы (ацетильные, метоксильные, сульфатные группы), которые придают им дополнительные свойства. Ярким примером таких полисахаридов являются гликозаминогликаны.

1.2. Гликозаминогликаны - линейные отрицательно заряженные гетерополисахариды, содержащие сульфатные группы. Гликозаминогликаны представлены в организме прогеогликанами. Протеогликаны -высокомолекулярные соединения, состоящие из белка (5ч-10%) и гликозаминогликанов (90-^95 %). Они являются главным компонентом межклеточного матрикса и могут составлять до 30 % сухой массы соединительной ткани. Гликозаминогликаны и протеогликаны, являясь

обязательными структурными компонентами межклеточного матрикса, играют важную роль в межклеточных взаимодействиях, в образовании каркаса при формировании тканей, в поддержании формы клеток и органов [11]. Они специфически взаимодействуют с коллагеном, эластином, фибронектином, ламинитом и другими белками межклеточного матрикса.

Благодаря особенностям структуры и физико-химическим свойствам, протеогликаны и гликозаминогликаны выполняют в организме животных многочисленные функции. Являясь полианионами, они могут присоединять