Сульфатированные производные на основе порошковых целлюлоз и кооперативные взаимодействия с их участием тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ



на правах рукописи

ТОРЛОПОВ МИХАИЛ АНАТОЛЬЕВИЧ

СУЛЬФАТИРОВАННЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ НА ОСНОВЕ ПОРОШКОВЫХ ЦЕЛЛЮЛОЗ И КООПЕРАТИВНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С ИХ УЧАСТИЕМ

02.00.04 - Физическая химия 02.00.06 - Высокомолекулярные соединения

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 8 ЭД

Уфа-2009

Работа выполнена в Институте химии Коми научного центра Российской академии наук

Научный руководитель

доктор химических наук Дёмин Валерий Анатольевич

Официальные оппоненты

доктор химических наук, профессор Булгаков Рамиль Гарифович доктор химических наук, профессор Колесов Сергей Викторович

Ведущая организация

Учреждение Российской академии наук Институт химической физики им. H.H. Семенова РАН

Зашита диссертации состоится «25» июня 2009 года в_часов на заседании диссертационного

совета Д 212.013.10 при Башкирском государственном университете по адресу: 450074, г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32, химический факультет, ауд. 305.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Башкирского государственного университета.

Автореферат разослан «_» мая 2009 года и размещён на сайте Башкирского государственного

университета www.bashedu.ru.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 212.013.10 доктор химических наук

Прочухан Ю.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

На сегодняшний день подтверждена высокая и разнообразная биологическая активность сульфатированных полисахаридов как природных (гепарин, фукоидан) так и полусинтетических - производных хитозана, полигалактоуронана, целлюлозы и некоторых других. Благодаря высокой биосовместимости, доступности, целлюлоза, и особенно ее структурные модификации - порошковые целлюлозы, являются перспективной основой для получения сульфатированных полисахаридов и их последующего внедрения.

В целях повышения эффективности применения производных целлюлозы, понимания их физиологической активности необходимо глубокое изучение физико-химических свойств этих веществ, поведения этих полимеров в водной среде, ионизационных равновесий и термодинамических параметров кооперативных конформацион-ных переходов макромолекул сульфатированых полимеров в растворе.

Поэтому, исследование физико-химических свойств этих соединений, установление их связи со структурой, природой дополнительных заместителей и молекулярной массой, приобретает особое значение.

Различными исследованиями установлено, что биологическая активность сульфатированных полисахаридов во многом связана с кооперативными реакциями комплек-сообразования между отрицательно заряженной цепью сульфатированного полисахарида (макроанионом) и положительно заряженными поверхностями белков. По этой причине актуальным для целенаправленного создания препаратов медицинского назначения на основе сульфатированных полисахаридов остается исследование их комплексо-образующей способности с биологическими объектами, белками, синтетическими и полусинтетическими поликатионами, исследование факторов влияющих на образование и устойчивость подобных комплексов методами физической химии. Эти исследования имеют значение для создания на основе полимер - полимерных комплексов с участием сульфатированных полисахаридов и средств транспорта лекарств, и самостоятельных лекарственных средств.

Работа выполнена в соответствии с тематическими планами НИР Института химии КНЦ УрО РАН по теме «Структурная организация и физико-химические свойства природных полисахаридов и лигнинов - перспективных биополимеров для создания новых материалов» и при частичной финансовой поддержке программы «Фундаментальные науки - медицине».

Цель работы

Изучение влияния структуры продуктов деструкции целлюлозы на их реакционную способность в полимераналогичных превращениях, физико-химические свойства их полифункциональных сульфатированных производных и кооперативных взаимодействий с их участием.

Основные задачи: 1) Изучить строение, физико-химические свойства продуктов деструкции и полимераналогичных превращений целлюлозы. 2) Исследовать изменения термодинамических параметров при кооперативных конформационных переходах сульфатированных сульфатированных производных целлюлозы содержащих дополнительные (карбоксильные, фосфатные) функциональные группы. 3) Исследовать интерполимерные кооперативные реакции полифункциональных сульфатированных производных целлюлозы с полиэтиленгликолем и белковым полимером. 4) Исследовать свя?ь

между структурой полученных полимеров, их способностью к кооперативным взаимодействиям с белоксодержащими объектами природного происхождения и их биологической активностью.

Научная новизна

Изучены физико-химические свойства впервые синтезированных препараты сульфата цианоэтил-, амидоэтилцеллюлозы, сульфата фосфорилированной целлюлозы, а также сульфатов целлюлозы на основе порошковых целлюлоз, полученных методом каталитической деструкции в среде органических растворителей. Показано влияние способа получения и надмолекулярноной структуры порошковых целлюлоз на их активность в реакциях сульфатирования, физико-химические свойства получаемых производных.

Методами потенциометрического титрования и капиллярной вискозиметрии показано образование компактных вторичных структур в растворах сульфатированных производных целлюлозы; дана количественная оценка изменения энергии Гиббса, энтальпии и энтропии кооперативного конформационного перехода сульфатированных производных целлюлозы;

Установлено, что сульфаты целлюлозы, содержащие дополнительные (карбок-силметильные, амидоэтильные, фосфатные) группы участвуют в интерполимерных реакциях с препаратами полиэтиленгликоля и белковых полимеров. Показано влияние молекулярной массы поликатионов и температуры на степень превращения этих реакций.

Определено, что сульфаты целлюлозы с дополнительными функциональными группами на основе порошковых целлюлоз способны к комплексообразованию со сложными белковыми структурами и обладают свойствами гиполипидеметиков, а также обладают способностью избирательному ингибированию клеточной адгезии в зависимости от природы дополнительного заместителя.

Практическая значимость работы

Получены высокозамещенные сульфатированные производные на основе порошковых целлюлоз включающие в свою структуру различные дополнительные (карбокси-метильные, эмидоэтильные, фосфатные) группы. Показана перспективность использования ПЦ, полученных различными методами, для синтеза сульфатированных производных целлюлозы. Показано, что полианионы на основе целлюлозы являются перспективными компонентами гидрофильных полиэлектролитных комплексов. Комбинированные сульфатированные производные целлюлозы, содержащие дополнительные (карбоксильные, амидоэтильные, фосфатные) группы, полученные на основе ПЦ, могут служить основой для производства препаратов медицинского назначения. Защищаемые положения

1. Результаты изучения влияния структуры ПЦ на их активность в процессах полиме-раналогичных реакций целлюлозы и физико-химические свойства получаемых продуктов.

2. Результаты определения изменения энергии Гиббса, энтальпии и энтропии кооперативных конформационных переходов сульфатированных производных.

3. Результаты исследования интерполимерных взаимодействий сульфатированных производных целлюлозы с полиэтиленгликолем, белковым полимером.

4. Результаты исследования комплексообразования сульфатированных производных целлюлозы с белоксодержащими объектами природного происхождения.

Апробация работы и публикации

Материалы диссертации были доложены на 15 Коми республиканской молодежной научной конференции (г. Сыктывкар, 2004 г.); на 11 международной научно-технической конференции «эфиры целлюлозы и крахмала: синтез, свойства, применение» (г. Владимир, 2007 г.); Ill Всероссийской конференции «новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (г.Барнаул, 2007 г.); 4th Saint-Petersburg Young Scientists Conference (with international participation) «Modern problems of polymer polymerscinse». Saint-Petersburg, 2008; на симпозиуме с международным участием «проблемы адаптации человека к экологическим и социальным условиям севера». По результатам проведенных исследований опубликовано 6 статей (из них 4 в журналах, рекомендованных ВАК) и тезисы трех докладов.

Струюура и объем работы

Диссертационная работа общим объемом 140 страниц состоит из введения, 3 глав: литературного обзора, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, а также выводов и приложения; содержит 13 таблиц, 56 рисунков. Список литературы включает 126 наименований.

В первой главе проведен анализ литературных источников, посвященных общему состоянию проблем получения сульфатированных полисахаридов растительного происхождения. Рассмотрены сведения по физико-химическим свойствам растворов водорастворимых производных целлюлозы. Обзор содержит анализ работ по изучению кооперативных конформационных переходов полимеров в растворе, а так же по интерполимерным реакциям с участием углеводсодержащих полимеров. Рассмотрены современные представления о роли кооперативных взаимодействий в проявлениях разнообразной физиологической активности, связанной с комплексообразованием сульфатированных полисахаридов и белковых тел. Во второй главе приведены экспериментальные методы, использованные в данной работе. Третья глава посвящена обсуждению и анализу результатов экспериментов.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Методы получения производных целлюлозы

Исходными целлюлозными материалами для последующих химических превращений послужили лиственная беленая сульфатная целлюлоза (далее ВЦ, производства ОАО «Монди Сыктывкарский ЛПК»). Средняя степень полимеризации (Р) препарата определенная по вязкости их растворов в кадоксене' составляет 540; Индекс кристалличности (Igp) = 0.54. Микрокристаллическая целлюлоза (МКЦ, коммерческий препарат производство ЗАО Полиэкс ТУ 64-11-124-90; получен из хлопковой целлюлозы). Р = 230; 1„р = 0.88.

Для установления состава, структуры и свойств целлюлозных материалов в работе использовались следующие методы: полный и частичный кислотный гидролиз, газожидкостная и гельпроникающая хроматография, ИК- и ЯМР "С - спектроскопия, рентгенофазовый анализ, вискозиметрия, потенциометрическое титрование и другие. Для определения содержания серы, фосфора и азота в производных целлюлозы использовали методы элементного анализа.

В работе использованы следующие методы получения порошковых целлюлоз (ПЦ): частичная гидролитическая деструкция волокон целлюлозы в водном растворе пероксомоносерной кислоты (1.0 %-ный раствор пероксида водорода в водном растворе

10 %-ой серной кислоты); деструкция с использованием кислот Льюиса ('ПС14, А1С13) в среде апротонных растворителей.

Карбоксиметилцеллюлозу (КМЦ) получали модифицированным методом2.

Сульфаты целлюлозы (СЦ, рис. 1а) получали этерификацией целлюлозы С1803Н в сухом пиридине, 3 ч при 90 °С (этот метод использовали также с небольшими изменениям).

Сульфат карбоксиметилцеллюлозы (СКМЦ, рис. 16) получали методом с предварительной активацией полимера.

Сульфаты цианоэтилцеллюлозы (СЦЭЦ) и амидоэтилцеллюлозы (САЭЦ, рис. 1в) получали этерификацией цианэтилцеллюлозы растворенной в ДМФА при 60 °С. Для получения САЭЦ цианэтильные группы омыляли в водном растворе Н202 при рН = 10 в течение 10 ч, затем САЭЦ осаждали прибавлением этанола, отделяли и очищали.

Сульфат фосфат целлюлозы (СФЦ, рис. 1г) получали методом одностадийной эте-рификации целлюлозы смесью оксида фосфора (V) и хлорсульфоновой кислоты (в различных мольных соотношениях) в /У'.Л'-диметилформамиде с содержанием воды в растворителе 2 моль на 1 моль Р205. Температура 30-70 °С, продолжительность реакции (1-3 ч).

Для получения смешанных солей сульфати-рованных производных целлюлозы с катионами ^-металлов использовали одно- или многократную обработку Ыа-солей целлюлозных поликислот насыщенными растворами солей Си2+, Со2+. Затем водорастворимые соли осаждали и промывали 70 %-ным этанолом для очистки от неорганических примесей.

Исследование кооперативных взаимодействий с участием сульфатированных

производных целлюлозы

Исследование конформаций цепи в растворе сульфатированных производных целлюлозы осуществляли методами потенциометрического титрования и вискозиметрии.

Изменение энергии Гиббса при конформационном переходе упорядоченной формы поликислоты рассчитывали по (1.1). Выражение для расчета полного изменения энергии Гиббса (1.2); где рК^)- константа диссоциации при данном значении а; рК0- истинная константа диссоциации полиэлектролита. Значение АС рассчитывали графическим методом, по площади ограниченной двумя кривыми - экспериментальной кривой потенциометрического титрования, соответствующей конформационным изменениям структурированной формы поликислоты и гипотетической кривой для неструктурированной формы поликислоты (ДОь), полученной методом экстраполяции3. Для расчета рКа решали эмпирическое уравнение Гендерсона - Хессельбаха (1.3); где а - степень ионизации полиэлектролита; принимали значения а

СН,ОЯ кп сж

ко-^г^Ч^^А- о

но СН201Ч

Рисунок 1 - Сульфатирован-ные производные целлюлозы а. Я=803Ыа, Н; б. Я=803Ка, СНгСООЫа, Н; в. [^ЭО^а, СН2СН2СОШ2, Н; г. [^О^а, Р0(0№)2, Н.

ДСа = ДСх - АСЬ(1.1)

Дв = 2.3ЕТ|[рК(а)- рКо]с1а (1.2)

рН = рКа+п1ё(а/1-а)(1.3)

= 0 в отсутствие щелочи и а = 1 в точке нейтрализации поликислоты; рКа и п - некоторые постоянные для данной системы полимер-растворитель.

Исследование интерполимерных реакций осуществляли методами фотометрии и вискозиметрии.

Комплексообразование анионных полисахаридов с липидами крови исследовали по методу4, адгезию сульфатированных производных на клеточную стенку и ингибиро-вание клеточной адгезии - по методу5.

Функциональный состав и надмолекулярная структура ПЦ

В работе были проанализированы характеристики ПЦ полученных как методами «классического» кислотно-катализируемого гидролиза, так и ПЦ, полученных деструкцией целлюлозы в среде апротонных растворителей с использованием кислот Льюиса. Образцы ПЦ анализировались на содержание карбоксильных и карбонильных групп. Показано, что в ПЦ, полученных методами кислотного гидролиза содержание карбонильных групп не превышает 0.05 %масс.

Процесс деструкции целлюлозы при взаимодействии с кислотами Льюиса приводит к глубоким изменениям в химической и надмолекулярной структуре целлюлозного материала. На рентгенограммах препаратов ПЦ, полученные в «мягких» условиях обработки, присутствует максимум в области 22 т.е упорядоченная структура природной целлюлозы I сохраняется. Эти образцы характеризуются индексами кристалличности 0.50-Ю.65 и имеют снежно-белый цвет. При более интенсивной обработке кислотами Льюиса образцы приобретают серый цвет, а доля упорядоченной части уменьшается вплоть до полного исчезновения. Такие ПЦ заметно изменены химически. А именно, по мере увеличения интенсивности обработки кислотами Льюиса резко возрастает содержание альдегидных и карбоксильных групп (в сумме до 1.5 % масс.).

Получение сульфатов целлюлозы на основе различных ПЦ и их физико-химические свойства

В результате сульфатирования образцов порошковых целлюлоз в одних и тех же условиях более высокозамещенные препараты получены для образцов с меньшими индексами кристалличности. Сравнительно меньшая степень замещения для МКЦ объясняется высоким содержанием упорядоченной части в ней, затрудняющей диффузию сульфатирующего агента внутрь частиц. В процессе этерификации МКЦ, внутренние, высоко упорядоченные области реагируют медленнее. Это приводит к неравномерному распределению гидрофильных заместителей в микрокристаллах, вследствие различной доступности их областей.

1. Болотникова Л.С., Данилов С.Н., Самсонова Т.И. Метод определения вязкости и степени полимеризации целлюлозы // ЖПХ. -1966. № 1. С. 176-180.

2. Barba С, Montan D., Rinaudo M. Synthesis and characterization of carboxymethylcelluloses (CMC) from non-wood fibers 1. Accessibility of cellulose fibers and CMC synthesis II Cellulose. -2002. -V. 9. -P. 319-326.

3. Mandel M., Leyte J. C., Stadhouder M. G. The conformational transition of po(y(methacrylic acid) in solution // The Journal of Physical Chemistry. -1967.-V. 71, N. 3. - P.603 - 612.

4. Климов A.H., Ловягина Т.Н., Баньковская Э.Б. Турбидиметрический метод определения липопротеидов и хиломикронов в сыворотке крови и тканях И Лабораторное дело. -1966. -Т.5. С. 276-279.

5. Хаитов P.M., Пинегин Б.В., Истамов Х.И. Экологическая иммунология. М., 1995.219 с.

В растворе сульфатов МКЦ находится небольшое количество немолекулярно-диспергированной СЦ-Na с неравномерной СЗ, т. е. агрегатов макромолекул, связанных друг с другом так же, как в кристаллических участках МКЦ, и образующих коллоидный раствор. ИК спектр СЦ-Na: 1240 см'1 (полоса средней интенсивности, ассиметричные колебания S=0); 810 см"' (интенсивная полоса поглощения, валентные колебания -С-SOj"); широкая полоса в области 3400 см"1 (колебания связи -ОН); ЯМР 13С (D20) представлен на рис. 2.

Сульфатирование ПЦ, полученных обработкой волокнистой целлюлозы кислотами Льюиса, проводили хлорсульфоновой кислотой в абсолютном пиридине, при температуре 80 °С в течение 3 ч.

После сульфатирования в этих условиях ПЦ, полученных методом каталитической деструкции в системе А1СЬ - ССЦ, синтезированы препараты со C3S до 0.5. Все полученные на основе данных ПЦ сульфаты целлюлозы были полностью или частично нерастворимы в воде. Сульфатирование ПЦ, полученных деструкцией волокон целлюлозы в каталитических системах TiCl4-CCl4 и TiCl4-C6H)4, напротив, приводит к препаратам с высокой C3S, за исключением ПЦ, полученных в наиболее «жестких» условиях обработки (табл. 1).

Таблица 1 - Результаты сульфатирования ПЦ и свойства полученных продуктов

Сульфатируе-мый образец8 C3S Выход, % Пор. СМ3/гб в воде Г|пр см3/г6 в 1 %-ном водном растворе ЫаС1

ПЦ-6 1.42 75 441.1 78.0

ПЦ-7 1.21 83 нерастворим нерастворим

ПЦ-8 1.76 88 нерастворим нерастворим

ПЦ-9 0.03 94 нерастворим нерастворим

ПЦ-10 1.53 71 412.4 61.3

ПЦ-11 1.57 н/о нерастворим нерастворим

ПЦ-12 1.49 82 нерастворим нерастворим

а - ПЦ получены деструкцией целлюлозы в системе ГПС14-СС14 соответственно (ПЦ-6,7,8 и 9) после 5, 15, 60 мин обработки, и 60 мин с послеобработкой при 100 °С без отмыва; в системе ТЧСЦ-СбНн соответственно (ПЦ-10, 11 и 12) после 5, 15 и 60 мин обработки; б - Концентрация полимера 1 %, измерения при 30 °С.

Изменений реакционной способности в реакции сульфатирования ПЦ, полученных с помощью кислот Льюиса, в зависимости от времени их обработки кислотой Льюиса, не наблюдается. Сульфаты на основе этих ПЦ различаются по растворимости в воде. Нами показано, что различие в реакционной способности при сульфатировании ПЦ, полученных с использованием соединений титана или алюминия, вероятно, объясняется глубиной химической модификации целлюлозы происходящей в процессе их

СЗ-С5 C2-S ■ ci .сз-s!

s4;l c8-s

<1 $ ^ с

ill ) <!Ч •; Si в Г. ко "?3 - il ьь Vu tV PPm

Рисунок 2 - ЯМР 13С спектр СЦ со C3S = 2.95.

получения. Воздействие более активной Льюисовой кислоты, такой как AJCij, приводит к более интенсивным изменениям целлюлозы (увеличению содержания карбонильных и карбоксильных групп). В воде растворимы сульфаты целлюлозы на основе тех Г1Ц, которые получены после наиболее краткой обработки целлюлозы кислотами Льюиса (табл. 1, ПЦ-6 и 10).

Пониженная растворимость таких СЦ может быть связана с образованием внутри - и межмолекулярных полуацетальных и водородных связей. В целом, растворимость в воде полученных продуктов зависит от структуры исходной ПЦ, которая определяется интенсивностью воздействия кислотой Льюиса на целлюлозу.

Активация КМЦ-Na для последующего сульфатирования в среде органического растворителя основана на реакции: Cell-CH2COONa + НАп —> Cell-CH2CÓOH + AnNa. Образующаяся кислая форма КМЦ образует водородные связи с подходящим растворителем, например ДМАА, ДМСО, ДМФА. Отмечено, что для получения высоких значений C3S при сульфатировании КМЦ с СЗсоон = 0.97 и выше требуется возрастающий избыток сульфатируюшего агента.

ИК-спектр СКМЦ-Na: 1626 см-1 (ис00"), 1240 см-1 (щ02), 814 м-1 (us0). ЯМР |3С 8, м.д. (D20,1, Гц): 61.6 (С6), 75.3 (С5), 79.8 (С4), 76.1 (С3), 74.7 (С2), 102.8 (С,), 179.3 (-СН-СОО"), 71.8 (СНг при С6), 72.8 и 68.1 (C-2S и C-6S).

Препараты СКМЦ в виде свободных карбоновых поликислот растворимы в воде, что отличает эти производные целлюлозы от КМЦ, которая в виде свободной поликислоты в воде нерастворима. Кривые потенциометрического титрования СКМЦсоон (карбоксильные группы в Н+ - форме) при различных ионных силах раствора имеют перегиб в области рН = 5.5 - 7.2.

Сульфаты целлюлозы, содержащие в структуре макромолекулы амидные группы были получены нами впервые сульфатированием цианэтилцеллюлозы и последующим мягким омылением (рН = 10, в присутствии пероксида водорода). В составе САЭЦ присутствуют сульфатные, амидные и в небольшом количестве, карбоксильные группы. Таким образом, полученное соединение является полиполифункциональным гетеропо-лисахаридом.

ИК - спектр САЭЦ-Na: 1626 см"' (uCOnh «амид 1»),. 1240 см''(и502), 814 см"' (uso). ЯМР 13С спектр (САЭЦ-Na, D 20): сигнал для С6 отсутствует; 5 74.3 (С3), 8 73.5 (С2), 5 103.8102.2 (С,); 8 178.5 (—С2Н4—CONH2); 8 36.9 и 37.5 (аСН2 и [5СН2 при CONH2), 8 83.8 и 68.6 (C-2S и C-6S). В области 70 - 73 м.д. может так же находится сигнал C-3S.

Реакция этерификации целлюлозы смесью P2Os: C1S03H начинается как гетерогенная. При комнатной температуре целлюлоза постепенно набухает (кроме МКЦ), образуя вязкий гель. При температуре 50 °С гель переходит в вязкий раствор и реакция заканчивается в гомогенной среде. При проведении реакции без добавления воды гомогенизации реакционной смеси не происходит, а полученные продукты обладают низкой степенью сульфатирования и нерастворимы в воде.

ИК спектр СФЦ-Na 814 см'1 (\>So), 1240 cm"'(\)so2); в области 1250-1235 см"1 так же возможно поглощение фосфатных групп (ир« Для групп включенных и не включенных в водородную связь). Полоса в области 1640 см'1, может быть соотнесена с валентными колебаниями связи Р=0-(0Н), кроме того, в этой области поглощает сорбированная вода. ЯМР 13С спектр (D20): сигналы для Сб и С2 отсутствуют; 8 74.7 (СЗ), 8 103.6 -101.7 (С1); 8 83.4 и 67.8 (C2-S и C6-S). В области 8 81 - 83 м.д. может также находится сигнал СЗ-Р. Сигналы ядер углерода С|, С2, С3 дополнительно расщеплены на дуплеты в результате спин-спинового взаимодействия с фосфором (Jmc - 4.0 - 6.0 Гц).

?5Л

2 о 200

а. с СГ 150 ■ *

1UU ■ А

50 ■ »S.

п

ъ

и

110

С. мг/см

С, мг/см

Рисунок 3 - Зависимости Т1пр - С для образцов СФЦ-7 (а), СФЦ-2 (б), СФЦ-8 (в), СФЦ-4 (г), в воде (1) и в растворе 1.5 М №С1 (2) при 30 °С.

СФЦ-2 содержание 8=9.1, Р=5.9; СФЦ-4 8=7.1, Р=11.0; СФЦ-7 8=9.3, Р=7.7 СФЦ-8 8=9.6, Р=8.4.

l- 260 i

Таким образом, получено новое перспективное производное целлюлозы - сульфат фосфата целлюлозы. По результатам по-тенциометриче-ского титрования показано, Производное содержит в своем составе сульфатные, а также фосфатные группы в виде moho-, ди- и трехзамещен-ных фосфатов, хорошо растворимо в воде с образованием вязкого раствора, и свойствами типичными для растворов сильных полиэлектролитов (рис. 3).

Измерение относительной вязкости проводили при низких концентрациях растворов полисахаридов (от 1 % и менее) в вискозиметре Оствальда. Все сульфатированные производные целлюлозы, полученные в данной работе, обладали аномальным возрастанием приведенной вязкости в области низких концентраций.

С целью создания водорастворимых носителей для направленного транспорта катионов полизарядных металлов, были получены соли сульфатированных производных целлюлозы со смешанным катионным составом, включающие кроме Na-солей, соли двухвалентного металла. Замена катиона Na на катион двухвалентного металла в кислотных группах сульфатированных производных, сильно отражается на реологических свойствах их растворов (рис. 4), в частности приводит к снижению rinp при постепенной замене катионов Na на катионы двухвалентных металлов, что свидетельствует об уменьшении объема и размеров макромолекулярных клубков, процессе «сшивки» полимера в результате образования «мостичных» R0-S03-Me-0S(0)2-0R связей, где R - целлюлоза.

0 20 40 60 80 100 замещено N8.%

Рисунок 4 - Приведенная вязкость 1.0 %-ных водных растворов СЦ, с различной степенью замещения катионов на Со2+, 25 °С.

Исследование термодинамических параметров конформационных переходов сульфатированных производных целлюлозы в растворе

Нами исследованы конформационные переходы, обусловленные кооперативными эффектами, а также влияние на них полиэлектролитной природы сульфатированных

производных целлюлозы, содержащих в своем составе дополнительные кислотные группы - карбоксильную (СКМЦ) или фосфатную (СФЦ) в Н-формах. и обозначенных здесь как СКМЦсоон и СФЦРОн-

Введение в структуру элементарного звена КМЦ или СФЦ высоко электроотрицательной сульфатной группы повышает кислотность карбоксильных и фосфатных групп. Влияние степени сульфатирования на рКа препаратов СКМЦ и СФЦ демонстрируют данные представленных в табл. 2.

Таблица 2 - рКа сульфатированных производных целлюлозы

Образец СЗэ СЗсоон или СЗР рКа" 1/11

СКМЦ -2 2.50 0.13 4.40

СКМЦ-11 0.48 1.00 3.92

СКМЦ-299 0.86 1.00 4.35

СКМЦ-371 1.50 1.00 6.34

СКМЦ-365 1.50 1.50 5.45

СФЦ-2 0.95 0.66 5.1/7.2

СФЦ-7 1.06 1.73 5.3/7.8

а - измерения выполнены в бессолевом водном растворе при 20 °С

Увеличение содержания сульфатных групп в макромолекуле целлюлозы приводит к увеличению электростатического потенциала полимера и, в отсутствии экранирующих противоионов, к удержанию протонов внутри макромолекулярного клубка, и к повышению кажущегося значения рКа поликислоты.

На рис. 5 представлены зависимости рКа - а для образцов СКМЦ (СООН), полученные при нейтрализации полимера в водных растворах и при различных ионных силах фонового электролита (№С1). Электростатические взаимодествия полимеров с противоположно заряженными низкомолекулярными ионами имеют кооперативный храктер, благодаря чему равновесие сдвинуто в сторону образования ассоциатов с низкомолекулярными ионами, т.е. к удержанию положительно заряженных ионов в обьеме отрицательно заряженного макромолекулярного клубка. В результате смещения диффузионного равновесия в сторону ухода протона

из ассоциатной оболочки создаваемой противоположно заряженным полиионом, увеличение ионной силы раствора сопровождается уменьшением значений рКа. Кроме того, проявляется аномальное увеличение рКа в области низких концентраций (рис. 5, 6),

«9 1

рКа без ЫаС1

^^У}

7 -

с^^рКа 0.05 М №С1 | 1

6 ■ / рКа 0.10 М ЫаС1 Я

5 i ! рКа 0.30 М ЫаС1 > Д £ и щЗГ

4 - г.........—'

0 0,2 0.4 0,6 0,8 1

Рисунок 5 - Графические зависимости рКа- а

при различных ионных силах раствора, обра-

зец СКМЦ-371, титрант №ОН, 20°С.

которое, как и для других полиэлектролитов, связано с дополнительной работой включающей ионизацию шепотной группы, диффузию протона из объема заряженного мак-ромолекулярного клубка и дополнительную энергию кооперативного конформационно-го перехода от компактной к развернутой структуре макромолекулы.

Графические зависимости «рКа-а», полученные методом потенциометрического титрования образцов СКМЦ/СФЦ в СООН/РОН - форме, в присутствии фонового электролита, обладают участком аномального хода зависимости в области низких а (рис. 5, 6). Для образцов СКМЦ с высокой степенью сульфатирования, а так же для всех образцов СФЦ аномалия проявляет

¡2

Рисунок 6 - Графические зависимости рКа - а при различных ионных силах раствора (участок соответствующий второй ступени диссоциации); тит-рант N3011, 20 °С. Для кривых а, в пунктиром показаны экстраполированные кривые. Образец СФЦрон, Щ = 9.6, = 8.4 %.

ся только при добавлении постороннего электролита и возрастает с увеличением ионной силы раствора (см. рис. 5 и 6, область а =0.05-0.20).

На рафиках зависимости приведенной вязкости водного раствора СКМЦ от степени нейтрализации карбоксильных групп выделены две области (рис. 7). В области (I) происходит возрастание значений ц„р при добавлении основания. Максимумы значений г|пр соответствуют степеням ионизации '1=0.5-^0.7 для примера а, без кооперативного конформаци-онного перехода, и 0.1-Ю.2 для б, имеющего выраженную аномалию в области а=0.1-0.2 соответствующей информационному переходу. В области (II) при добавлении №ОН наблюдается снижение г)пр- В данной области эффективная ионная сила раствора возрастает, что приводит к экранированию зарядов в цегш противотоками, образующимися при добавлении титранта. Максимум вязкости раствора соответствует наиболее развернутой конформации цепи полимера. Процесс разворачивания цепи начинается при малых степенях нейтрализации (область значений участка 1) и определяется появлением карбоксилатных (или фосфатных) групп, хорошо диссоцирующих в воде. В свою очередь процесс ионизации карбоксильных групп приводит к увеличению одноименных отрицательных зарядов в цепи. Взаимооталки-вание отрицательно заряженных групп является основной причиной постепенного вытягивания по лиэлектролитных клубков и разрушения вторичной структуры, стабилизи-

450 Ъ и §400 1 сг .....* * а

350 - !Л

300 ■ 250 1 \ б __я

0 0,2 0,4 0.6 0,8 1 а.

Рисунок 7 - Графическая зависимость приведенной вязкости от степени ионизации для растворов СКМЦ-371 (а) и СКМЦ-299 (б).

рованной многоточечными водородными связями до того предела, когда начинает работать фактор увеличения ионной силы раствора.

Суммируя представленные факты, можно заключить, что в водных растворах СКМЦ и СФЦ наблюдается образование компактных упорядоченных структур, разрушающейся при постепенной ионизации полимера. Нами были рассчитаны термодинамические параметры, характеризующие изменение энергии Гиббса, энтальпии и энтропии при конформационном переходе для этих производных (табл. 3).

Таблица 3 - Термодинамические параметры информационного перерехода СКМЦ (в бессолевом растворе)

Образец C3s СЗ соон AGiomtb Дж/моль при 20 °С АСкОиф» Дж/моль при 50 °С АН„,вф. Дж/моль при 20 °С АНконф, Дж/моль при 50 °С АЗцоиф, Дж/моль К

СКМЦ-2 2.50 0.13 0 0 0 0.00 0.0

СКМЦ-11 0.48 1.00 181 ±9 517±25 3463 0 11

СКМЦ-299 0.86 1.00 419 ±21 1137±61 7435 8860 24

СКМЦ-371 1.50 1.00 0 24 ±1 235 259 1

СКМЦ-365 1.S0 1.50 0 404 ±26 3958 4756 14

Полученные нами значения термодинамических функций находятся в пределах изменения энтальпии и энергии Гиббса при кооперативных конформационных переходах природных и синтетических полиэлектролитов3'6

Изменение энергии Гиббса ДСКОНф при конформационном переходе поликислоты складывается из ДО при ионизации карбоксильных групп, работы против электростатических сил при удалении Н+ из макромолекулярного клубка и работы при изменении конформации макромолекулы.

Таблица 4 - Изменение энергии Гиббса для образцов СКМЦсоон при различных ионных силах раствора

Образец АОконф- Дж/моль при 20 °С,при концентрации NaCl, моль/дм3

0 0.05 0.1 0.3 0.5

СКМЦ-376* СКМЦ-371 510 ±38 0 н/о 140 ±5 610 ±26 150 ±7 н/о 400 ±14 900±41 610 ±24

*СЗсоон = 1.0; C3s = 0.71

В бессолевых водных растворах высоко замещенные сульфатированные производные целлюлозы не образуют устойчивых компактных структур, однако такие структуры могут образоваться при добавлении солей, благодаря способности низкомолекулярных электролитов экранировать заряженные участки сульфатированных полимеров подавляя тем самым эффекты взаимоотталкивания одноименно заряженных анионных групп.

6. Leclercq L., Pollet А., et. all. Conformation of water soluble copolymers of methacrylic acid and bensyl methacrylat//J. Eur. Poiym., -1999. N. 35. -P.185- 193.

Препараты СФЦРОн представляют собой полимер, содержащий остатки двухосновной кислоты фосфора (сульфатная группа, как и для СКМЦсоон, представлена солью). Выше было показано, что по данным потенциометрического титрования в бессолевых растворах, эта группа полимеров не образует компактных структур.

Параметр конформационного перехода а, который найден из графической зависимости рКа - а, соответствует степени ионизации макромолекулы полимера, при которой происходит конформационный переход. Эту величина использована при вычислении доли полимера вовлеченной в образование вторичной структуры (4=а.); ^ а=а»= а'^а-О; где - доля вовлеченной в образование вторичной структуры к доле полимера оставшейся до его полной ионизации (табл. 5).

Т аблица 5 - Параметры конформационного перехода

Образец * а, 20 °С а*, 50 °С и, 20 °С Ь-х, 50 °С f , 'а и ' 20 °С 50 °С

СКМЦ-271 0.360 0.043 0.305 0.630 0.110 0.027

СКМЦ-299 0.054 0.061 0.910 0.650 0.049 0.397

СКМЦ-371 - 0.064 - 4.110 - 0.263

СКМЦ-365 - 0.060 - 0.790 - 0.047

Как и для высокосульфатированных препаратов СКМЦсоон причиной тому, вероятно, служат электростатические силы, т.е. взаимоотталкивание суль фатных (карбоксильных, фосфатных) групп обладающих значительным отрицательным зарядом. Подобное взаимоотталкивание препятствует образованию компактной вторичной структуры, или приводит к ее разрушению после ионизации кислотных групп.

Для сульфатов фосфатов целлюлозы так же наблюдаются увеличение значений изменения энергии Гиббса кооперативного конформационного перехода при увеличении ионной силы раствора и температуры с нулевых значений при отсутствии низкомолекулярного электролита, до 300 Дж/моль при концентрации ЫаС1=1.5 моль/дм3.

Интерполимерные реакции анионных полисахаридов с полиэтиленгликолем (ПЭГ)

Использование лолиэтиленгликоля как компонента интерполимерных комплексов основано на способности этого полимера образовывать в водной среде последовательно сти водородных связей с подходящими полианиономи, например СООН - поликислотами. В.заимное связывание полярных групп макромолекул приводит к гидрофобизации частиц поликомплекса и сворачиванию их в компактные клубки, что позволяет следить за ре акцией по изменению вязкости смеси.

Минимум т}пр соответствует максимальной степени превращения в реакции между полимерами (рис. 8 А - 1, 2 образец СКМЦ со С35 = 0.9 и С3с00н= 1-0). Для смесей СКМЦсоон - ПЭГ при любых соотношениях (моль СООН-группа/моль элементарного звена ПЭГ) образование гидрофобных осадков не происходит, что позволяет сделать выр.од о не полном протекании интерполимерной реакции. Гидрофильность комплекса СКМЦсоон - ПЭГ в этом случае обеспечивают как участки макроцепей ПЭГ не участ-

С 680

А

660

640 -

620

В 10 12 мопь/мопь

750

о 700

с£

с С 650

600

550

500

а

]__Ё

м

У

300 1500 8000 20000 молекулярные массы ПЭГ

Рисунок 8 - (А) графическая зависимость Т1пр - соотношение полимеров смеси СКМЦСоон-376/2 и ПЭГ6000 (моль СООН СКМЦ/моль элементарного звена ПЭГ), 30 °С (1) и 50 °С (2); (Б) Изменение г)пр смеси от молекулярной массы ПЭГ при критических соотношениях: 1- 30 °С, 1.0/1.0; 2 - 50 °С. 1.0/2.0).

вующие в образовании водородных связей, так и сульфатные группы. При одинаковом содержании СООН групп на статистическое элементарное звено, для образцов с более высокой степень сульфатирования минимум г|пр достигается при намного больших соотношения СООН / элементарное звено ПЭГ. Если для препаратов со С35 около 0.5 критические соотношения (моль/моль) не превышают 1.0/1.0, то для препаратов со

.0 (при повышении температуры возрастают до 2.0 и более), а со С35от 1.5 до соотношения 1.0/10 и более (см. рис. 9). Следовательно, образование комплекса СКМЦсо-он - ПЭГ происходит не только за счет многоточечных водородных связей между мономерными звеньями ПЭГ и карбоксильными группами СКМЦсоон, а также и по другим механизмам. Учитывая высокую электроотрицательность сульфатных групп, можно предположить, что именно действие электростатических сил приводит к дополнительному интерполимерному взаимодействию. Это предположение подтверждается сниженим значений г|пр в определенном диапазоне при добавлении ПЭГ к растворам сульфатов целлюлозы (рис. 10). В данном 4а-соль со С35= 1.3 и ПЭГ с ММ = 20000). При увеличении содержания ПЭГ в смеси происходит сначала плавное уменьшение приведенной вязкости, что связано с образованием ИПК, а затем, после достижения минимума, когда все макроцепи СЦ электростатически связаны с макроцепями ПЭГ, последующее увеличение содержания ПЭГ в растворе приводит к линейному возрастанию г|пр. Образование комплексов с помощью электростатических взаимодействий доказывается отсутствием снижения т|пр при введении в смесь низкомолекулярного электролита (0.1 М ЫаС1), который разрушает электростатические связи между СЦ и ПЭГ

СЗс=0.5-1.0 эти соотношения составляют

0 25 50 75 100 А моль/моль

Рисунок 9 - (А) графическая зависимость т|пр - соотношение полимеров смеси СКМЦсоон-365 и ПЭГ6000 (моль СООН СКМЦ/моль элементарного звена ПЭГ). 30 °С (1) и 50 °С (2).

случае, использован сульфат целлюлозы Т

экранируя отрицательно заряженные сульфатные группы (рис. 10.2). Поскольку положительный заряд иона гидроксония в элементарном звене ПЭГ очень мал, образование устойчивых ИПК возможно только при кооперативном взаимодействии. Основное участие в этом процессе принимают, возможно, особые положительно заряженные структуры, образованные макромолекулами ПЭГ, поскольку маловероятно, что отрицательно заряженные полимерные цепи производных целлюлозы способны вступать в электростатическое взаимодействие с макромолекулами ПЭГ в обычном их виде. Возможно, такими гипотетическими структурами могут быть комплексы, образованные катионами № (сульфатных групп) и ПЭГ, подобные комплексам катионов щелочных металлов и краун-эфиров.

Было исследовано влияние длины цепи ПЭГ на протекание интерполимерной реакции. Показано, что среди полимер-гомологов ПЭГ, наиболее устойчивые (компактные) комплексы с СКМЦсоон образуют макромолекулы ПЭГ с молекулярной массой 6000 и 300. С увеличением температуры «компле-ментарность» ПЭГ с различной молекулярной массой 1С СКМЦ изменяется. При высоких степенях сульфатирования наиболее компактные и устойчивые структуры образуются в реакции СКМЦсоон и ПЭГ с ММ 20000, что связано, вероятно, с превышением вклада электростатических взаимодействий над кооперативными водородными связями.

Нами было исследовано также участие в компл ексообразовании с ПЭГ препаратов СФЦ, г.\ фосфатными группами в Н-форме (СФЦрОН). Поскольку фосфатные группа СФЦ представлены в основном двухосновными, они способны образовывать многочис-леннь 1е водородные связи, наиболее устойчивые из которых образуются при диссоциации 'фосфатной группы первой ступени. Из-за высокой гидрофильности образующихся ком'ллексов, падение вязкости смеси происходит меньше, чем при комплексообразова-пш ПЭГ и СКМЦсоон.

Кооперативные взаимодействия сульфатированных производных с белком

Анализ результатов исследования реологических свойств смесей сульфатированных производных целлюлозы и белкового полимера (желатин), указывает на образование гидрофильных комплексов, сопровождается снижением г]пр растворов при добавлении белкового поликатиона (рис. 11, 12). С увеличением содержания сульфатных групп в макромолекуле (отрицательного заряда) способность производного к связыванию с белком резко увеличивается: от 1.0 мг белка на мг сульфатированного полимера при СЗя 1.0 до 6.0 - 7.0 мг белка на мг сульфатированного полимера при более высоких степенях замещения и ли (в меньшей степени) при увеличении содержания других отрицательно заряженных групп, например, фосфатных или карбоксильных.

0 0,4 0,8 1,2 ммопьПЭГ

Рисунок 10 - Графическая зависимость тц - соотношение полимеров смеси СЦ и ПЭГ (ММ = 20000) (СЦ 0.022 ммоль/ммоль элементарного звена ПЭГ), 30 °С (1) и в присутствии 0.1 МШС1(2).

|б00 п

="450

300 150 0

Образование поликомплекса между белком и сульфатированным производным в данном случае, происходит благодаря и водородным связям, и электростатическим силам, на что указывает исчезновение минимума г)пр характерного для зависимостей смесей сульфатирован-ный полисахарид/желатин в отсутствие фонового электролита, который экранирует цепь полимера препятствуя образованию многоточечных межполимерных связей.

При использовании карбоксил - содержащих полисахаридов (полигалактуроновая кислота, низкосульфатированные препараты СРСМЦсоон) интерполимерное взаимодействие с желатином сопровождается образованием устойчивых коллоидных растворов, т.е. образованием гидрофобного комплекса стабилизированного водородными связями. С ростом степени сульфатирования СКМЦсоон (выше 1.0) или при реакции с участием СФЦрон образуются гидрофильные комплексы.

В присутствии постороннего электролита значения г^р постепенно возрастают с увеличением содержания желатина, а для смесей САЭЦ и для смесей СКМЦ отмечается область более резкого роста совпадающего с областью изменения хода зависимости для смесей полимеров при той же температуре, но без постороннего электролита (рис. 11, 12). Можно предположить, что в этой области изменение геометрических размеров комплекса полисахарид-белок связанное с образованием более компактных структур. Когда полиэлектролитные эффекты подавлены введением фонового электролита, комплексооб-разование все же происходит (хотя и в меньшей степени, по указанной выше причине экранирования цепи полимеров) приводя к образованию комплексов и ассоциатов с геометрическими размерами, ходных макромолекул.

0 10 20 30 40 50 содержание желатина, кг

Рисунок 11 - Приведенная вязкость смесей СКМЦ (5 мг) и желатина при различном содержании желатина (мг), 1- 30 °С; 2-50 °С; 3 - в присутствии №С1 0.1 М, 30 °С. СКМЦ (СЗв = 0.7; СЗсоон = 0.97).

О 4 8 12 16 20 24 28 32 содержание желатина, мг

Рисунок 12 - Приведенная вязкость смесей САЭЦ (6 мг) и желатина при различном содержании желатина, 30 °С (а) и 50 °С (б). В присутствии 0.1 М №С1,30 °С (в).

превышающими размеры ис-

Исследование комплексообразования анионных полисахаридов с биологическими объектами

В серии экспериментов по изучению взаимодействия сульфатированных производных целлюлозы с биологическими объектами, была исследована их способность связывать липиды крови, и ингибирования клеточной адгезии. С использованием метода тур-бидиметрии показано образование гидрофобных комплексов полианион - липопротсид. Как видно из приведенных данных (рис. 13), по способности к комплексообразованию

выделяются сульфатированные полисахариды, активность которых возрастает с увеличением степени сульфатирования.

Комплексообразуюшая способность сульфатированных полисахаридов имеющих дополнительные функциональные группы (карбоксиметильную, амидоэтильную) несколько ниже. Образование комплекса полианиона с липидами крови, представляет собой интерполимерную реакцию с белковой частью гликопротевда циркулирующего в крови. При этом наблюдается образование сложного, многосоставного гидрофобного комплекса.

Нами было исследовано ингибирование спонтанной и активированной клеточной адгезии. Поскольку известно, что адгезия клеток опосредуется специфическими белковыми рецепторами, представленными на поверхности клеток7, процесс ингибирования может быть представлен как комгшексообразование отрицательно заряженных цепей полисахарида с этими белками и блокирование их функций. Показана различная инги-бирующая активность сульфатированных полисахаридов в случаях спонтанной и активированной адгезии клеток, зависящая (при одной и той же степени сульфатирования) от типа дополнительного заместителя. Так, при спонтанной адгезии для препарат САЭЦ проявляет низкий ингибирующий эффект, тогда как при активированной адгезии для этот тип производного проявляет высокий ингибирующий эффект, т.е. большее сродство к дополнительным белковым рецепторам, появляющимся на клеточной мембране при активации. Следовательно, варьируя вид дополнительного заместителя в сульфатированных полианионах, можно получать препараты-ингибиторы, со специфическим действием.

Рисунок 13 - Комплексообразование анионных полисахаридов с липидами крови (активность гепарина принята за 100%)

1. Гепарин; 2. САЭЦ-5; 3. СЦЭЦ-5; 4.СЦ-9; 5.СД-500; 6. СД 3650; 7. СКМЦ-10; 8. ВС80з; 9. ВС-Н; Данные представлены в виде среднего арифметического со стан-даотным отклонением:* различия достоверны той d<0.05 по сравнению с контролем.

Эти результаты, представляют интерес также с точки зрения изучения потенциальной биологической активности рассматриваемых в этой работе сульфатированных производных целлюлозы с учетом их низкой токсичности, определенной с помощью метода ЛД50. Их способность к связыванию липидов может быть использована для разработки гликолипедимических препаратов, а способность к ингибированию клеточной адгезии in vitro, могут представлять интерес для создания противовоспалительных, а так же иммуномодулирующих препаратов.

7. Геннис Р. Биомембраны: молекулярная структура и функции // пер. с англ. М: Мир, 1997. 624 с.

о 400

5 320 5 я ___

23456789 Образец

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

1. Показано, что физико-химические свойства (растворимость, вязкость растворов) сульфатированных производных целлюлозы на основе ПЦ, полученных методом каталитической деструкции целлюлозы кислотами Льюиса в агтротонных растворителях, могут быть заданы условиями получения ПЦ на этапе деструкции целлюлозы.

2. Определены константы диссоциации карбоксильных и фосфатных групп в препаратах СКМЦ и СФЦ. Показано уменьшение рКа этих производных при увеличении ионной силы раствора и степени сульфатирования. Установлено падение вязкости растворов с увеличением содержания Л - металлов в № - солях сульфатированных производных целлюлозы содержащих Со2+ и Си2+.

3. Показано образование в растворе компактных структур полифункциональными сульфатированными производными целлюлозы стабилизированных кооперативными взаимодействиями в области низких степеней ионизации. Установлено, что энергия Гиббса конформационного перехода сульфатированных производных целлюлозы ограничена пределами от 0 до 3 кДж/моль и обладает тенденцией к повышению при увеличении концентрации постороннего электролита в растворе.

4. Впервые показано, что сульфатированные производные карбоксиметилцеллюлозы и фосфата целлюлозы образуют гидрофильные интерполимерные комплексы с препаратами ПЭГ стабилизированные как водородными связями, так и электростатическими взаимодействиями, вклад которых увеличивается с увеличением степени сульфатирования производного целлюлозы.

5. Установлено, что в результате интерполимерной реакции сульфатированных производных целлюлозы с деструктированным белком наблюдается образование гидрофильных комплексов стабилизированных электростатическими кооперативными взаимодействиями.

6. Показано комплексообразование сульфатированных производных целлюлозы с белоксодержащими объектами: липопротеидами, клеточной стенкой. Показана способность этих производных связывать липиды крови, ингибировать спонтанную и активированную клеточную адгезию. Комплексообразующая способность этих производных по отношению к биологическим объектам может быть задана степенью замещения по сульфатным группам и типом дополнительного (карбок-симетильного, амидного или фосфатного) заместителя.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Торлопов М.А. Сульфатирование порошковых материалов, полученных деструкцией целлюлозы тетрахлородом титана / C.B. Фролова, В.А. Демин // Химия в интересах устойчивого развития. - 2007. №4. - С. 491-496.

2. Торлопов М.А. Сульфатированные и карбоксиметилированные производные микрокристаллической целлюлозы / В.А. Демин // Химия растительного сырья. -2007. №4.-С. 55-61.

3. Торлопов М.А., Особенности структуры и ферментативной деструкции порошковых целлюлоз ! Д.В. Тарабукин, C.B. Фролова // Химия растительного сырья. -2007. №3. - С. 63-67.

4. Торлопов М.А., Сульфатирование порошковых материалов, полученных деструкцией целлюлозы кислотами Льюиса / С.В. Фролова // Химия растительного сырья. - 2007 . №4. - С. 69-76.

5. Torlopov М.А., Davydova A.l. Interpolymer interactions of the derivatives of cellulose contain oter functional groups supplementary and ther biological actyvity // Abstract Book 4th Saint-Petersburg Young Scientists Conference (with international participation) Modern problems of polymer polymerscinse. Saint-Petersburg. - 2008. - P.21.

6. Торлопов M.A., Демин B.A. Пат. № 38879/2008 приор, от 30.09.2008.

7. Торлопов М.А. Комбинированные сульфатированные целлюлозные материалы, синтезированные на основе порошковых целлюлоз льна, хлопка и древесины // Материалы докладов 11-ой международной конференции Эфиры целлюлозы и крахмала: синтез, свойства, применение: сб. тр. - Владимир, 2007. С.103-104.

8. Торлопов М.А. Сульфатированные производные целлюлозы с высокой степенью замещения: получение, комплексообразование с биологическими объектами in vitro и потенциальная биологическая активность // Ежегодник института химии Коми НЦ РАН. - 2008. - С. 62-71.

9. Торлопов М. А. Антикоагулянтный потенциал сульфатированных производных на основе порошковых целлюлоз / Дрозд Н.Н. // Ежегодник института химии Коми НЦ РАН.-2009.-С. 50-52.

Тираж 100 Заказ №34

Информационно-издательский отдел Коми НЦ УрО РАН 167982, г. Сыктывкар, ул. Первомайская, 48

Список основных сокращений

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Целлюлоза и ее структурные производные

1.2 Анионные производные целлюлозы и физико-химические свойства их водных растворов

1.2.1 Карбоксиметилцеллюлоза

1.2.2 Сульфаты целлюлозы

1.2.3 Смешанные сульфатированные эфиры целлюлозы

1.2.4 Фосфорилированные производные полисахаридов

1.2.5 Физико-химические свойства растворов анионных производных целлюлозы

1.3 Кооперативные процессы в растворах углеводсодержащих поли- 25 меров

1.3.1 Кооперативный конформационный переход полимеров в растворе

1.3.2 Интерполимерные взаимодействия с участием углеводсодержащих полимеров

1.3.3 Взимодействие анионных полисахаридов с белком 34 1.5 Биологическая активность сульфатированных полисахаридов, связанная с кооперативными взаимодействиями

Актуальность темы. На сегодняшний день подтверждена высокая и разнообразная биологическая активность сульфатированных полисахаридов как природных (гепарин, фукоидан) так и полусинтетических - производных хи-тозана, полигалактоуронана, целлюлозы и некоторых других. Благодаря высокой биосовместимости, доступности, целлюлоза, и особенно ее структурные модификации - порошковые целлюлозы, являются перспективной основой для получения сульфатированных полисахаридов и их последующего внедрения.

В целях повышения эффективности применения производных целлюлозы, понимания их физиологической активности необходимо глубокое изучение физико-химических свойств этих веществ, поведения этих полимеров в водной среде, ионизационных равновесий и термодинамических параметров кооперативных конформационных переходов макромолекул сульфатированых полимеров в растворе.

Поэтому, исследование физико-химических свойств этих соединений, установление их связи со структурой, природой дополнительных заместителей и молекулярной массой, приобретает особое значение.

Различными исследованиями установлено, что биологическая активность сульфатированных полисахаридов во многом связана с кооперативными реакциями комплексообразования между отрицательно заряженной цепью сульфатированного полисахарида (макроанионом) и положительно заряженными поверхностями белков. По этой причине актуальным для целенаправленного создания препаратов медицинского назначения на основе сульфатированных полисахаридов остается исследование их комплексообразующей способности с биологическими объектами, белками, синтетическими и полусинтетическими поликатионами, исследование факторов влияющих на образование и устойчивость подобных комплексов методами физической хиI мии. Эти исследования имеют значение для создания на основе полимер полимерных комплексов с участием сульфатированных полисахаридов и средств транспорта лекарств, и самостоятельных лекарственных средств.

Работа выполнена в соответствии с тематическими планами НИР Института химии КНЦ УрО РАН по теме «Структурная организация и физико-химические свойства природных полисахаридов и лигнинов - перспективных биополимеров для создания новых материалов» и при частичной финансовой поддержке программы «Фундаментальные науки - медицине».

Цель работы. Изучение влияния структуры продуктов деструкции целлюлозы на их реакционную способность в полимераналогичных превращениях, физико-химические свойства их полифункциональных сульфатированных производных и кооперативных взаимодействий с их участием.

Основные задачи: 1) Изучить строение, физико-химические свойства продуктов деструкции и полимераналогичных превращений целлюлозы. 2) Исследовать изменения термодинамических параметров при кооперативных конформационных переходах сульфатированных сульфатированных производных целлюлозы содержащих дополнительные (карбоксильные, фосфатные) функциональные группы. 3) Исследовать интерполимерные кооперативные реакции полифункциональных сульфатированных производных целлюлозы с полиэтиленгликолем и белковым полимером. 4) Исследовать связь между структурой полученных полимеров, их способностью к кооперативным взаимодействиям с белоксодержащими объектами природного происхождения и их биологической активностью.

Научная новизна. Изучены физико-химические свойства впервые синтезированных препаратов сульфата цианоэтил-, амидоэтилцеллюлозы, сульфата фосфорилированной целлюлозы, а также сульфатов целлюлозы на основе порошковых целлюлоз, полученных методом каталитической деструкции в среде органических растворителей. Показано влияние способа получения и надмолекулярноной структуры порошковых целлюлоз на их активность в реакциях сульфатирования, физико-химические свойства получаемых производных.

Методами потеициометрического титрования и капиллярной вискозиметрии показано образование компактных вторичных структур в растворах сульфатированных производных целлюлозы; дана количественная оценка изменения энергии Гиббса, энтальпии и энтропии кооперативного конфор-мационного перехода сульфатированных производных целлюлозы;

Установлено, что сульфаты целлюлозы, содержащие дополнительные (карбоксилметильные, амидоэтильные, фосфатные) группы участвуют в интерполимерных реакциях с препаратами полиэтиленгликоля и белковых полимеров. Показано влияние молекулярной массы поликатионов и температуры на степень превращения этих реакций.

Определено, что сульфаты целлюлозы с дополнительными функциональными группами на основе порошковых целлюлоз способны к комплексообра-зованию со сложными белковыми структурами и обладают свойствами гипо-липидеметиков, а также обладают способностью избирательному ингибиро-ванию клеточной адгезии в зависимости от природы дополнительного заместителя.

Практическая значимость работы. Получены высокозамещенные сульфатированные производные на основе порошковых целлюлоз включающие в свою структуру различные дополнительные (карбоксиметильные, эми-доэтильные, фосфатные) группы. Показана перспективность использования ПЦ, полученных различными методами, для синтеза сульфатированных производных целлюлозы. Показано, что полианионы на основе целлюлозы являются перспективными компонентами гидрофильных полиэлектролитных комплексов. Комбинированные сульфатированные производные целлюлозы, содержащие дополнительные (карбоксильные, амидоэтильные, фосфатные) группы, полученные на основе ПЦ, могут служить основой для производства препаратов медицинского назначения.

На защиту выносятся:

1. Результаты изучения влияния структуры ПЦ на их активность в процессах полимераналогичных реакций целлюлозы и физико-химические свойства получаемых продуктов.

2. Результаты определения изменения энергии Гиббса, энтальпии и энтропии кооперативных конформационных переходов сульфатированных производных.

3. Результаты исследования интерполимерных взаимодействий сульфатированных производных целлюлозы с полиэтиленгликолем, белковым полимером.

4. Результаты исследования комплексообразования сульфатированных производных целлюлозы с белоксодержащими объектами природного происхождения.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации были доложены на 15 Коми республиканской молодежной научной конференции (г. Сыктывкар, 2004 г.); на 11 международной научно-технической конференции «эфиры целлюлозы и крахмала: синтез, свойства, применение» (г. Владимир, 2007 г.); III Всероссийской конференции «новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (г.Барнаул, 2007 г.); 4th Saint-Petersburg Young Scientists Conference (with international participation) «Modern problems of polymer polymerscinse». Saint-Petersburg, 2008; на симпозиуме с международным участием «проблемы адаптации человека к экологическим и социальным условиям севера». По результатам проведенных исследований опубликовано 6 статей (из них 4 в журналах, рекомендованных ВАК) и тезисы трех докладов.

Структура и объем работы Диссертационная работа общим объемом 144 страниц состоит из введения, 3 глав: литературного обзора, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, а также выводов и приложения; содержит 23 таблицы, 53 рисунка. Список литературы включает 127 наименований.

Выводы

1. Показано, что физико-химические свойства (растворимость, вязкость растворов) сульфатированных производных целлюлозы на основе ПЦ, полученных методом каталитической деструкции целлюлозы кислотами Льюиса в апротонных растворителях, могут быть заданы условиями получения ПЦ на этапе деструкции целлюлозы.

2. Определены константы диссоциации карбоксильных и фосфатных групп в препаратах СКМЦ и СФЦ. Показано уменьшение рКа этих производных при увеличении ионной силы раствора и степени сульфатирования. Установлено падение вязкости растворов с увеличением содержания с! — металлов в № - солях сульфатированных производных целлюлозы содержащих Со2+ и Си2+.

3. Показано образование в растворе компактных структур полифункциональными сульфатированными производными целлюлозы стабилизированных кооперативными взаимодействиями в области низких степеней ионизации. Установлено, что энергия Гиббса конформационного перехода сульфатированных производных целлюлозы ограничена пределами от 0 до 3 кДж/моль и обладает тенденцией к повышению при увеличении концентрации постороннего электролита в растворе.

4. Впервые показано, что сульфатированные производные карбоксиметил-целлюлозы и фосфата целлюлозы образуют гидрофильные интерполимерные комплексы с препаратами ПЭГ стабилизированные как водородными связями, так и электростатическими взаимодействиями, вклад которых увеличивается с увеличением степени сульфатирования производного целлюлозы.

5. Установлено, что в результате интерполимерной реакции сульфатированных производных целлюлозы с деструктированным белком наблюдается образование гидрофильных комплексов стабилизированных электростатическими кооперативными взаимодействиями.

6. Показано комплексообразование сульфатированных производных целлюлозы с белоксодержащими объектами: липопротеидами, клеточной стенкой. Показана способность этих производных связывать липиды крови, ингибировать спонтанную и активированную клеточную адгезию. Ком-плексообразующая способность этих производных по отношению к биологическим объектам может быть задана степенью замещения по сульфатным группам и типом дополнительного (карбоксиметильного, амидно-го или фосфатного) заместителя.

Заключение

Тенденции применения целлюлозы в настоящее время связаны не только с химической функционализацией этого полимера, но и с модификацией его надмолекулярной структуры: получением различных порошковых, нанокри-сталличеких целлюлоз. Причем, именно изменение надмолекулярной структуры во многом расширяет возможности дальнейшей химической модификации целлюлозы и, что не менее важно, оказывает влияние на конечные физико-химические свойства получаемых производных.

Разработка новых и более эффективных путей применения биологически активных агентов на основе сульфатированных полисахаридов связана с исследованием физико—химии кооперативных процессов, в первую очередь, касающихся образования надмолекулярных структур в растворе в результате кооперативных взаимодействий.

Анализ литературных источников, осуществленный нами, показал, что исследования в области кооперативных конформационных переходов полисахаридов в растворах практически отсутствуют. Вместе с тем, в этой области разработаны и могут быть использованы доступные методики, применяемые для исследования кооперативных формационныхе переходов синтетических полимеров. Одним из наиболее информативных методов в настоящее время остается метод потенциометрического титрования.

Обзор тенденций по исследованию механизмов биологического действия сульфатированных полисахаридов показал, что в значительной мере их действие на живые системы может объясняться физико-химическими взаимодействиями с макромолекулярными биологическими объектами, а именно кооперативными взаимодействиями между макромолекулой анионного полисахарида и биологической структурой (клеточной мембраной, оболочкой вируса, макролипидом). Вместе с тем, имеются пробелы в сфере понимания физико-химических основ биологического действия сульфатированных полисахаридов. В этой связи актуальными целями исследований в этой области становятся механизмы взаимодействия сульфатированных полисахаридов с поликатионами. Особенный интерес здесь представляют синтетические поли-каоны. Реакции с ними обладают значением и для моделирования природных процессов, и для разработки новых интерполимерных транспортных систем.

ГЛАВА 2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 2.1 Общие методы анализа целлюлозы и ее производных

2.1.1. Среднюю степень полимеризации (Р) образцов целлюлозы определяли вязкозиметрическим методом (растворитель кадоксен, вискозиметр Оствальда с диаметром капилляра 0.82 мм) [102].

2.1.2. Содержание сульфатных групп в сульфатированных образцах целлюлозы определяли двумя методами:

Гравиметрическим методом [28], после десульфатирования образцов в 1 н растворе соляной кислоты (3 ч, 50° С).

Определяли содержание серы методом элементного анализа на приборе ЕА-1110 фирмы «CE instruments».

Степень замещения в препаратах СЦ-Na (C3S) находили по уравнению:

162 , .

C3S =---, где cos — содержание серы (масс. %)

3200 - û)s • 103

2.1.3. Определение карбоксильных групп в карбоксиметилцеллюлозе осуществляли ацидиметрически. КМЦ-Na обрабатывали избытком 0.4 н раствора НС1 в 70 % -ном этаноле. Полученную свободную поликислоту отделяли центрифугированием, промывали водно-этанольной смесью и сушили в вакууме при 60 °С. Затем навеску 1.00 г поликислоты нейтрализовали избытком титрованного раствора NaOH оттитровывая избыток NaOH 0.1 н НС1. Степень замещения СЗсоон в препаратах КМЦ рассчитывали по формуле: СЗсоон =162п/4500-58п, где п - содержание карбоксильных групп (масс. %) п = (0.00045 - VUC[ ■ 0.1/1000) • 45/тн, где т„ - масса сухой, навески КМЦ.

2.1.4. Содержание азота в образцах определяли методом элементного анализа на приборе ЕА-1110 фирмы «CE instruments».

2.1.5. Содержание фосфора в образцах производных целлюлозы осуществляли фотометрически в виде фосфорномолибденовой сини [103].

2.1.6. ИК - спектры пропускания получены на ИК-Фурье спектрометре MIR-8000 (ORIEL) в таблетках КВг.

2.1.7. Рентгенофазовый анализ проведён на рентгеновском дифрактометре ДРОН-3 (начальный угол 5.00 град., шаг измерения 0.05 град., конечный угол 40.00 град.). Индекс кристалличности (1кр) рассчитан по отношению интен-сивностей рефлекса при углах 22° и 19° с использованием метода Сегала [104].

2.1.8 Молекулярная масса и ММР водорастворимых производных целлюлозы изучены методом гель - проникающей хроматографии: колонка Shodex Asahipak GS—620HQ (7.6 мм х 30 см, «Shimadzu», Япония) и предколонка Shodex GS-26 7В (7.6 мм х 5 см, «Shimadzu»), термостат СТО - 10AS («Shimadzu»), детектор-рефрактометр RID G136A («Shimadzu»). Элюирование проводили 0.15 М NaCl при 40 °С со скоростью элюента 0,5 мл/мин. Для калибровки колонки использовали декстран сульфаты с молекулярной массой в диапазоне

36 -40, 100, 400 - 600- 10J («Sigma», США). Процентное содержание определяли от общей площади пиков.

2.1.9 ЯМР !Н, 13С, 31Р спектры получены на приборах Brucker АМХ - 400 и Brucker - 300; растворитель D20, 30 °С; время релаксации 3.5 с.

2.1.10 Вязкость водных растворов определена с помощью вискозиметра Оствальда с диаметром капилляра 0.56 мм, при температуре 30°С.

2.2 Методы модификации целлюлозы 2.2.1 Порошковые целлюлозы

Деструкцию целлюлозы, выделенной из древесины лиственных пород, осуществляли в водном растворе состава 1.0 % пероксида водорода, 10 % серной кислоты, целлюлозы выделенной из льна - перуксусной кислотой (10 %-ный водный раствор). Деструкцию проводили при температуре кипения смеси в течение двух часов. Затем полученные препараты отделяли на фильтре, промывали до нейтральной реакции дистиллированной водой, инк-людировали ацетоном и сушили на воздухе при комнатной температуре.

Для получения ПЦ каталитической деструкцией с использованием кислот Льюиса использовали метод, подробно изложенный в [105].

ПЦ-МКЦ представляет собой коммерческий препарат, полученный кислотным гидролизом волокон хлопковой целлюлозы. Данный препарат выпускается для пищевых и медицинских целей ЗАО «Полиэкс» г. Бийск, под торговой маркой «Анкир-Б», согласно ТУ 64-11-124-90.

Лиственная сульфатная целлюлоза (ВЦ) производства ОАО «МБП Сыктывкарский ЛПК». Предварительная подготовка целлюлозных препаратов к работе состояла в удалении минеральных соединения обработкой 1 н соляной кислотой, а затем водой до нейтральной реакции. Препарат обезвоживали ацетоном и сушили до постоянной массы при 103°С.

2.2.2 Получение промежуточных производных целлюлозы

Карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ)

Карбоксиметилцеллюлозу (КМЦ) получали по модифицированному методу [106]. Типовая процедура состояла в следующем: о

МКЦ (10 г, 61.73 ммоль) активировали в 20 см 40 %-го раствора ЫаОН. Суспензию перемешивали и оставляли на 10 мин при комнатной температуре. Затем прибавляли 20 см изо-пропанола и термостатировали смесь 30 мин о при 55°С. После этого вносили раствор монохлоруксусной кислоты в 20 см изо-пропанола. Продолжительность реакции: 3 ч при 55 °С или 2 ч при 80 °С. Продукт отфильтровывали на стеклянном фильтре, промывали водным этанолом. Полученную КМЦ-Ка очищали в аппарате Сокслета (экстракция 60 %-ным водным этанолом до нейтральной реакции промывных вод и отрицательной реакции на ионы СГ). В форму свободной кислоты (КМЦ-Н) натриевую соль КМЦ переводили обработкой 10 %-ным раствором соляной кислоты с последующей отмывкой продукта дистилированной водой, иклюдирова-ли ацетоном и сушили в вакууме при 60 °С. Цианэтилцеллюлоза (ЦЭЦ)

Целлюлозу (10 г., 61.73 ммоль) диспергировали в 4 % -ном водном растворе NaOH и термостатировали 30 мин. при 40 °С. Суспензию охлаждали до 5 °С, при перемешивании вносили акрилонитрил. Реакцию проводили в течение 3 ч при постепенном повышении температуры до 40 °С, после чего продукт отделяли на фильтре, промывали большим количеством воды, затем этанолом и сушили в вакууме при 60 °С.

2.2.3 Получение сульфатированных производных целлюлозы

Сульфат целлюлозы получали сульфатированием в системе пиридин -хлорсульфоновая кислота. Образец порошковой целлюлозы (1.00 г; 6.17 ммоль), предварительно высушенный до постоянной массы при 103 °С суспендировали в пиридине при 0 °С. Охлаждая и интенсивно перемешивая ре-акционнонную смесь, в нее по каплям вносили хлорсульфоновую кислоту (3 экв. на ангидроглюкозную единицу). После термостатирования в течении 1 ч при 90 °С реакцию продолжали в течении 2 ч при 80 °С. Продукт отфильтровывали на стеклянном фильтре, промывали 20 см ацетона и растворяли в 50 см 4 %-го NaOH. Образовавшуюся натриевую соль сульфата целлюлозы л

СЦ-Na) осаждали 100 см этанола, промывали водно-этанольной смесью от неорганических солей и сушили в вакууме.

Сульфат карбоксиметилцеллюлозы (СКМЦ) получали модификацией метода [33]. Высушенный до постоянной массы образец КМЦ-Na (1.0 г) суспендировали в 10 см ДМФА. При интенсивном перемешивании и охлаждении до 5 °С добавляли безводную и-толуолсульфоновую кислоту (1 экв. на карбоксильную группу полимера) и термостатировали 0.5 ч при 60 °С. Затем колбу с сильно набухшим полимером охлаждали до 0 °С, добавляли по каплям хлорсульфоновую кислоту (2 экв. на мономерное звено) и оставляли на 3 ч при комнатной тепературе. Для выделения полимера к охлаждённой реакционной смеси прибавляли 20 см3 безводного ацетона. Осадок отфильтровывали, обрабатывали водным раствором гидроксида натрия. Из полученного раствора этанолом осаждали СКМЦ-Na, полимер отделяли, промывали водно - этанольной смесью для очистки от неорганических солей и сушили в вакууме при 60 °С.

Сульфат цианоэтилцэллюлозы (СЦЭЦ) и амидоэтилцеллюлозы (САЭЦ).

Для сульфатирования цианэтилцеллюлозы (C3cn= 0.36) 1.0 г сухого обо разца растворяли в 10 см ДМФА и оставляли на 1 ч при комнатной температуре. Колбу с сильно набухшим и частично растворившимся полимером охлаждали до О °С, по каплям прибавляли хлорсульфую кислоту (2 экв. на мономерное звено) и термостатировали при 20 °С. По окончании реакции, охлаждая и перемешивая, реакционную смесь нейтрализовали насыщенным раствором ацетата натрия в этаноле. Осажденный полупродукт отделяли на фильтре, растворяли в 20 см3 раствора 3 %-го Н2О2 при рН = 10. Гидролиз нитрильных групп проводили в течение суток при комнатной температуре, после чего полимер осаждали этанолом (100 см ), отделяли на стеклянном фильтре и очищали диализом на целлофановых мембранах. Полученную о

САЭЦ-Na осаждали этанолом (150 см ) отделяли, промывали водно - этанольной смесью, инклюдировали ацетоном и сушили в вакууме при 60 °С.

Сульфат фосфата целлюлозы (СФЦ-Na). л

1.0 г (6.17 ммоль) целлюлозы суспендировали в 10 см сухого ДМФА и оставляли на ночь. Отдельно готовили этерифицирующую смесь, для чего в 20 см3 сухого ДМФА растворяли 0.90 г (6.34 ммоль) Р2О5 и при охлаждении добавляли 0.22 г воды (12.22 ммоль). После перемешивания полученной смеси к ней по каплям прибавляли 1.43 г (12.27 ммоль) CISO3H обеспечивая хорошее перемешивание и охлаждение до 0 - 5 °С. Полученный раствор оставляли на 5 - 6 ч, после чего этерифицирующую смесь вносили к набухшей целлюлозе, перемешивали и термостатировали 1.5 ч при 50 °С. По истечении этого строка, гомогенную реакционную смесь охлаждали до -10 °С, дисперо гировали в 250 см холодного ацетона. Осадок отфильтровывали, диспергио ровали в 100 см холодной воды и нейтрализовали 4 %-ным ИаОН по фенолфталеину. Полученный раствор диализовали на целлофановых мембранах против дистиллированной воды (до отрицательной реакции на сульфат - ионы); полимер осаждали этанолом и сушили в вакууме при 60 °С.

Поучение солей производных целлюлозы с катионами Са2+, Си2+, Со2+.

Для получения катионных форм различных производных целлюлозы использовали обработку № - солей целлюлозных поликислот насыщенными растворами солей Са2+, Си2+, Со2+. Типовая процедура: 1.00 г СЦ-Иа оставляли в 5 см дистиллированной воды для набухания. Затем порциями прибавляли насыщенный раствор хлорида двухвалентного металла (так что бы общий о объем смеси составил 30 см ). Катионообменную реакцию продолжали в течение 15 мин. при перемешивании, после чего полученную соль осаждали этанолом (50 см ), отделяли от избытка смеси, промывали водно-этанольным раствором от неорганических солей, инклюдировали ацетоном и сушили в вакууме при 60 °С. При необходимости, процедуру катионного обмена повторяли несколько раз.

2.3 Исследование кооперативных взаимодействий сульфатированных производных целлюлозы

2.3.1 Исследование конформаций цепи в растворе сульфатированных производных целлюлозы

Потенциометрическое титрование производных целлюлозы и других полисахаридов выполняли на рН - метре рН-410 «Аквилон», используя комбинированный электрод марки ЭСК-10601/7 в термостатированной ячейке при 20 и 50 ±0.2 °С Раствор гидроксида натрия С = 0.05 моль/дм3 готовили из стандарт-титра. Титрование проводили при постоянном перемешвании

Препараты СКМЦ, СФЦ соответственно, карбоксильные и фосфатные группы которых представлены натриевыми солями, обрабатывали в растворе расчетным количеством и-толуолсульфокислоты для получения указанных анионных групп в Н*- форме. Поликислоту осаждали этанолом (70 % об.), промывали 70 %-ным этанолом и лиофильно высушивали. Для последующих потенциометрических исследований использовали растворы полисахаридов концентрацией 0.25 г/дл.

Расчет изменения энергии Гиббса (АО) осуществляли общепринятым методом (см. например [49, 55]). Выражение для изменения энергии Гиббса: где рК(а)— константа диссоциации при ] данном значении а; рК0 - истинная кон- АО = 2.3КТ/[рК(а)-рКо]ёа (1.1) станта диссоциации полиэлектролита.

Для нахождения рКа решали эмпирическое уравнение Гендерсона-Хессельбаха: рН = рКа+ п ^(а/1-а) (1.2) где а - степень ионизации полиэлектролита; принимали значения а = 0 в отсутствие щелочи и а = 1 в точке нейтрализации поликислоты; рКа и п-некоторые постоянные для данной системы полимер-растворитель. Полное изменение Аву определяли согласно уравнению (1.1) решением интеграла графическим методом. 1

АС1 = 2.3Ят1[рК(а) - рК0]с!а (1.3) о

Изменение энергии Гиббса при конформационном переходе упорядоченной формы поликислоты АОа: АОа = Ав^ - Авь (1.4) где АОь - полное изменение энергии Гиббса при конформационном переходе неструктурированной формы поликислоты; подставляя выражение 1.4 в уравнение 1.3 получаем: АСа = 2.3КТ(АО£ - АОьКОнф) (1.5)

Значение Ава рассчитывается графическим методом, по площади ограниченной двумя кривыми (экспериментальной кривой потенциометрического титрования соответствующей конформационным изменениям структурированной формы поликислоты и гипотетической кривой для неструктурированной формы поликислоты). Гипотетическую кривую для неструктурированной формы поликислоты строили методом экстраполяции прямолинейного участка из области высоких значений а в область а = 0.05^0.3 на кривой рН = рКа+ п ^(а/1-а), откуда рассчитывали значения рН экстр и рК экстр.

Изменение и энтропии (А8К0Нф) при конформационном переходе рассчитывали по уравнению (1.6): (Дв1 - АО2) (1 6) где АСконф = изменение энергии Гиббса А8К0Нф =

Т'-Т2) при конформационном переходе структурированной формы поликислоты (Ава) при данной температуре. Изменение энтальпии рассчитывали из выражения: АОа = ДНа - ТД8К01,ф (1-7).

2.3.2 Исследование интерполимерных реакций о

Готовили основные растворы полимеров с концентрацией 0.2-10"*" г/см . Смеси полимеров заданного соотношения готовили смешением основных о растворов. Для этого к 3.0 см основного раствора анионного полимера прибавляли соответствующий объем основного раствора поликатионита. Полуп ченную смесь разбавляли водой до объема 10.0 см . Измерения времени истечения растворов полимеров выполняли с помощью капиллярного вискозиметра Оствальда, с1—0.56 мм, при температурах 30 и 50 °С ±0.1 °С. Значения приведенной вязкости рассчитывали: цпр = т/^/С; где цуд — (^-т0)/т0; С -концентрация анионного полисахарида, г/см ; то - время истечения чистого растворителя, [с]; время истечения раствора полимера, [с].

2.4.1 Исследование комплексообразования анионных полисахаридов с биологическими объектами

Для определения гиполипидемической активности полисахаридов применяли турбидиметрический метод, предложенный авторами работы [107]. Использовали 0.5 % водный раствор полисахарида. В качестве положительного контроля применяли нефракционированный гепарин.

Для определения влияния анионных полисахаридов на адгезивность фагоцитирующих клеток использовали перитониальные макрофаги белых лабораторных мышей. Суспензию макрофагов (2-10 кл/см ) в среде Хэнкса, содержащей 10 % эмбриональной телячьей сыворотки, инкубировали в лунках плоскодонного планшета (ICN Biomedicals, США) с растворами полисахаридов 1.0 мг/см в течение 20 мин. при 37 °С. Количество прикрепившихся клеток определяли колориметрическим методом, используя краситель Рома-новского-Гимзы [108]. После полного растворения красителя измеряли поглощение (А) раствора при длинне волны 650 нм с помощью спектрофотометра PowerWawe 200 (BioTek Instruments, США). Адгезию выражали в процентах от поглощения лунок с контрольным раствором: Адгезия = (А0-А;/АО-100.

2.4.2 Определение ЛД50 и стистическая обработка результатов

Острую токсичность определяли с помощью экспресс-метода Прозоровского при однократном внутрибрюшинном введении растворов полисахаридов мышам [109].

Статистическая обработка данных выполнена по рекомендациям, изложенным в работе [110].

ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1 Модификация целлюлозосодержащих материалов 3.1.1 Исходные целлюлозные материалы

В исследовании были использованы ПЦ, полученные различными методами деструкции целлюлозных волокон. Все образцы ПЦ, за исключением ПЦ-МКЦ, получены обработкой древесной волокнистой целлюлозы (ВЦ, табл. 3.1).

1. Czaja W. К., Young D. J., Kawecki M., et. all. The future prospects of microbial cellulose in biomedical applications (Review) // Biomacromolecules. -2007. -V.8. N.l. -P.1-12.

2. Mora P., Wood J. W. Synthetic polysaccharides. I. Polycondensation of glucose //J.Am.Chem.Soc.-1958. -V.3. -P. 685-697.

3. Mora P., Wood J. W. Synthetic Polysaccharides. 111. Polyglucose Sulfates // J.Am.Chem.Soc.-1958.-V.80.-P. 3700-3702.

4. Роговин З.А. Химия целлюлозы. M., Химия, 1972. с. 231.

5. Целлюлоза и её производные / под ред. Байклза Н., Сегала Л. пер. с англ. под ред. З.А.Роговина, Т. 2, М: Мир, 1974.

6. Патент РФ 2163945. А.В.Кучин, А.В.Попов, М.В.Сазонов, В.А.Демин. Способ получения микрокристаллической целлюлозы. Опуб. 10.03.2001, БИ № 7.

7. Sarybaeva I., Sultankulova A.S. et al., Physico-chemical and technological properties of powdery celluloses, obtained by the Lewis acids // Cellulose Chem. and Technol.-1991.-V.24.-P. 199-210.

8. Ardisone S., Dioguardi F.S., Mussini T., et. al. Microcrystalline cellulose powders: structure, surface feature sand water sorption capability // Cellulose.-1999.-N.6.-P. 57-69.

9. Thummler K., Fischer S., Pfeiffer K. et. al. Evaluation of molten inorganic salt hydrates as reaction medium for the derivatization of cellulose // Cellulose.2002.-N. 9.-P. 293-300.

10. З.Петропавловский Г.И. Гидрофильные частично замещённые эфиры целлюлозы и их модификация путём химического сшивания. Ленинград, Наука,-1988. с. 297.

11. Chauvelon G., Buleon A., Thibault J.-F., Saulnie L. Preparation of sulfoacetate derivatives of cellulose by direct esterification // Carbohydrate Research.-2004.- N. 8.-P. 743 -750.

12. Chauvelon G., Doublier J.-L., Buleon A., Thibault J.-F., Saulnie L. Rheological properties of sulfoacetate derivatives of cellulose // Carbohydrate Research.2003.- V. 338.- N. 8.-P. 751 759.

13. Heinze T., Liebert T., Klufers P. Carboxymethylation of cellulose in unconventional media//Cellulose 1999.-N. 6.-P. 153-165.

14. Berthold J., Olsson R. Water sorbtion for hydroxy 1 and carboxylyc acid groups in CMC stdied with NIR-spectroscopy // Cellulose.-1998.-№ 5.- P. 281 298.

15. КМЦ техническая. Технические условия ТУ 6-55-40-90. М.,1990.

16. Карпова Е.В., Базарнова Н.Г., Маматюк В.И. Определение содержания карбоксиметильных групп в карбоксиметилированной древесине методом ИК-спектроскопии // Химия растительного сырья. -2002. -№2.- С 33-38

17. Saake В., Horner S., Puis J., Heinze Th. A new approachin the analysis of the substituent distribution of Carboxymethylcelluloses // Cellulose.- 2001.-N. 8.-P. 59-67.

18. Петропавловский Г.А., Крунчак M. M. Сернокислые эфиры целлюлозы (сульфатцеллюлоза) // ЖПХ. 1967.-Т. 38.-№ 10.-С. 2209-2220.

19. Takano R., Nagaim Т., Wu J.X. Sulfation of polysaccarides using monometyl sulfate // J. Carbohydrate chemistry.- 2000.-Vol.l9.-№ 9.-. P.l 185-1190.

20. Wang Z. M., Li L., Zheng В., Hamatov N. N. Preparation and anticoagulation activity of sodium cellulose sulfate // International Journal of Biological Ma-cromolecules . 2007. N. 41. - P. 667-678.

21. Fhilipp В., Wagenknecht W., Nehls I. Untersuhungen zur sulfatirung von cellu-loseformiat im vergleich zu cellulose acetat unter homogen reaktionbedingungen // Cellulose chem. and tech.-1990.-N.24.-P. 667-678.

22. Schuldt U., Wagenknecht W., Richter A. Electrosorption of sodium cellulose sulfates with different substitution patterns // Cellulose.- 2002. N 9.-P.271-282.

23. Gohes M., Mischnick P. Determination of the substitution pattern in the poly-merchain of cellulose sulfates // Carbohydrate Research.-1998. N. 309. -P. 109— 115.

24. Основы аналитической химии / В.И. Фадеева, Т.Н. Шеховцева и др.; под. ред. Ю.А.Золотова.-М.: Высш. шк., 2001.- 463 с.

25. Malhner С., Dieter М. Lechner, Nordmeier Е. Synthesis and characterisation of dextran and pullulan Sulphate // Carbohydrate Research. -2001.-Vol. 331.-P. 203-208.

26. Richter A., Wagenknecht W. Synthesis of amylose acetates and amylose sulfates with high structural uniformity // Carbohydrate Research. -2003. Vol. 338. -P. 1397-1401.

27. Groth Th., Wagenknecht W. Anticoagulant potential of regioselective deriva-tized cellulose // Biomaterials.- 2001. N.22. -P.2719-2729.

28. Liu C., Baumann H. Exclusive and complete introduction of aminogroups and thier N-sulfo and N-carboxymethyl groups into the 6-position cellulose with out the use of protecting groups // Carbohydrate Research. -2002. N.337, -P. 1297— 1307.

29. Baumann H., Liu C., Faust V. Regioselectively modified cellulose and chitosan derivatives for mono-and multilayer surface coatings of hemocompatible biomaterials // Cellulose,-2003. N.10. -P.65-74.

30. Vogt S., Heinze T. Preparation of carboxymethylcellulose sulfate of high degree of substitution // Carbohydrate Research. 1995. V.266. -P. 315-320.

31. Miyamoto К., Shimizu P., Tokita M. Adhesion of 3-carboxymethyl-cellulose-6-sulfate to extra domain A-containing fibronectin: development of ligands for cry о gel removal // J. Artif. Organs -2002. V.5. -P.132-135.

32. Тимохин И.М., Прокофьева M.B. и др. Получение и свойства некоторых смешанных эфиров целлюлозы // Химия и технология производных целлюлозы. Владимир. 1971. с. 223-227.

33. Shashkov A.S., Senchenkova S.N. et. all. u. Structure of a phosphorylated poly-saccaride from Shewanellaputretacies strain S 29. // Carb. res. 1997, N.303 -P. 333-338.

34. Fricain J.C., Granja P.L., Barbosa M.A. Cellulose phosphates as biomaterials. In vivo bi©compatibility studies // Biomaterials, -2002. N.23. -P. 971-980.

35. The use of starch in meat products // by A.C.Payn. A dissertation in partial fulfillment of the requirments for the doctor of philosophy degree. Kentucky. 1993.

36. E.Tarelli, X. Lemercinier, S. Wheler. Direct preparation of cyclodextrin monophosphates // Carb. Res., -1997. N.302. -P.27-34.

37. Петров K.A., Нифантьев Э.Е., Сопикова И.И. и др. Метод фосфорилирова-ния целлюлозы фосфористой кислотой // выс. мол. соед. Целлюлоза и ее производные, 1963. С. 90-93.

38. Петров К.А., Нифантьев Э.Е., Сопикова И.И. и др. Фосфорилирования целлюлозы диалкил-(арил) фосфитами // выс. мол. соед. Целлюлоза и ее производные, 1963. С.86-89.

39. Reid J., Viazzeno L. Preparation and Properties of cellulose Phosphates // Ind. Eng. Chem. 1949. Vol. 41. N. 12. -P. 2828-2831.

40. Tian C.M., Xie X.J. et. al. The Effect of metal ions on thermal oxydative degradation of cotton cellulose ammonium phosphate // J. of thermal analysis and ca-lorymetry. 2003. -N. 73. -P. 827.

41. Петропавловский Г.А., Котельникова H.E. Дегидратация и фосфорилиро-вание целлюлозы оксидом фосфора (5) в среде диметилформамида // Cellulose chemistry and technology,-1985. N.19.-P. 591-600.

42. Farriol X., Barba C., Montane D. Synthesis and characterization of carboxyme-thylcelluloses from non-wood pulps II. Rheological behavior of CMC in aqueous solution // Cellulose, 2002. N.9. -P.327-335.

43. A. Katchalsky, H. Eisenberg //J. Polymer Sci. -1951.N.6, P. 145.

44. Mandel M., Leyte J. C., Stadhouder M. G. The conformational transition of poly(methacrylic acid) in solution // The Journal of Physical Chemistry, -1967.-V. 71, N. 3.- P.603 612.

45. Kawaguchi S., Nishikawa Y., KitanoT. Dissociation behavior of poly(itaconic acid) by potentiometric titration and intrinsic viscosity // Macromolecules, 1990, N. 23. -P.2710-2714.

46. Byoung S.K., Li С., Jianping G., Titration behavior and spectral transitions of water-soluble polythiophene carboxylic acids // Macromolecules, 1999.N. 32. -P.3964-3969.

47. Poly(methacrylic acid) derivatives. 5. microcalorimetric study of poly(N-methacryloyl-L-alanine) and poly(N-methacryloyl-co-alanine-co-N-phenylmethacrylamide) in aqueous solutions // Macromolecules. 1982. N. 15. -P. 890-894.

48. Leclercq L., Pollet A., et. all. Conformation of water soluble copolymers of methacrylic acid and bensyl methacrylat // Eur. Polym. J. -1999. N. 35. -P. 185193

49. McDiarmid R., Doty P. The spectrophotometric titration of polyacrylic, poly-L-aspartic, and poly-L-glutamic acids // The Journal of Physical Chemistry,-1966. -V. 70. N. 8,- P.2620-2627.

50. Godecand A., Skerjanc J. Enthalpy changesupon dilutionand ionization of poly (L-glutamicacid) in aqueous solutions //J.Phys.Chem.B 2005, N.109, -P.13363-13367.

51. Wangand C., Tam K.C. Dissolution behavior of HASE polymer in presence of salt: potentiometric titration, isothermal titration calorimetry, and light scattering studies//J.Phys.Chem.B, 2002, N.106, -P. 1195-1204.

52. Morcellet M., Wozniak M. Analysis of the potentiometric titration curves of some polyacids using polymeric subunits// Macromolecules, 1991, N.24, -P. 145-148.

53. Ravi P., Wang C., Tam K.C., Gan L.H. Association behavior of poly(methacrylicacid)-block-poly(methylmethacrylate) in aqueous medium: potentiometric and laser light scattering studies // Macromolecules, -2003, N.36. -P.173-179.

54. Groot J., Koper G.J.M., Borkovec M., Bleijser J. Dissociation behavior of poly(maleic acid): potentiometric titrations,viscometry, pulsed field gradient NMR, and model calculations// Macromolecules, -1998. N.31, -P.4182-4188.

55. Bongaertsand K., Reynaers H. On the molar mass of carrageen an in the course of conformational transition from the disordered to the fundamental ordered form//Macromolecules,- 1999. N. 32. P. 675-682.

56. Кабанов B.A. Физико-химические основы и перспективы применения растворимых интерполиэлектролитных комплексов (обзор) // Высокомолекулярные соединения, 1994. Т. 36. № 2. С. 183-197.

57. Кабанов В.А., Зезин А.Б. Водорастворимые нестехиометричные полиэлектролитные комплексы — новый класс синтетических полиэлектролитов // Итоги науки и техники. Сер. "Органическая химия". М., 1984. Т. 5. С. 131189.

58. Philippova О. Е., Karibyants N. S., Starodubtzev S. G. Conformational Changes of Hydrogels of Poly(methacrylic acid) by interaction with Polyethylene glycol) induced // Macromolecules 1994. -V.27, -P. 2398-2401.

59. Bergbreiter D. E., Hein M. D., and Huang K. J. Chain-Length Effects of Poly(ethylene glycol) on a Monolayer of a Poly(methacrylic acid)-Based Amphiphile at the Air-Water Interface // Macromolecules 1989, V.22, P. 46504652.

60. Huangand X.D., Goh S.H. Interpolymer complexes through hydrophobic Interactions: C-End-capped 60 poly(ethyleneoxide) / poly(methacrylicacid) complexes // Macromolecules 2000. -V. 33. -P. 8894-8897.

61. Fredheim G.E. Polyelectrolyte complexes: interactions between lignosulfonate and chitosan // Biomacromolecules. -2003. -V. 4. -P. 232-239.

62. Паламарчук И.А., Макаревич H.A., Бровко O.C. Кооперативные взаимодействия в системе лигносульфонат-хитозан //Химия растительного сырья -2008.- №4. С. 29-34.

63. S. Nath, С. S. Patrickios, T.Hatton. Turbidimetric titration study of the interaction of proteins with acrylic polyampholytes // Biotechnol. Prog. -1995, -V. 11, -P. 99-103.

64. Dubolazov A.V., Nurkeeva Z.S., Muni G.A. Design of mucoadhesive polymeric films basedon blends of poly(acrylicacid) and (hydroxypropyl)cellulose // Biomacromolecules. 2006. -V. 7. - P. 1637-1643.

65. Lu X., Hu Z., Schwartz J. Phase transition behavior of hydroxypropylcellulose under interpolymer complexation with poly(acrylic acid) // Macromolecules, -2002.-V. 35.-P. 9164-9168.

66. Schatz C., Lucas J-M., Viton C. Formation and Properties of Positively Charged Colloids Basedon Polyelectrolyte Complexes of Biopolymers // Langmuir. 2004. -V. 20. - P. 7766-7778.

67. Arguelles-Monal W., Peniche C., Rinaudo M. Conductimetric study of the in-terpolyelectrolyte reaction between chitosan and polygalacturonic acid // Polymer. 2000. - V.4. -P. 12373-2378.

68. Yakovlev S., Gorlatov S., Ingham K. et. all Interactionof fibrin(ogen) with heparin: further characterization and localization of the heparin-dinding site // Biochemistry. 2003. -V. 42. - P. 7709-7716.

69. Kunou M., Koizumi M., Shimizu K., et. al. Synthesis of sulfated colominic acids and their interaction with fibroblast growth factors // Biomacromolecules. -2000, -V. 1.-P. 451-458.

70. Matsudo Т., Ogawa K., Kokufuta E. Complex formation of protein with different water-soluble synthetic polymers // Biomacromolecules. -2003, -V. 4. -P. 1794-1798.

71. De Angelis P. L., Glabe C. G. Role of basic amino acids in the interaction of bindin with sulfated fucans // Biochemistry. 1988. -V. 27. -P. 189-194.

72. Wang X., Li Y., Wang Y. Microstructure of lactoglobulin / pectin coacervates studiedby small-angle neutron scattering // J.Phys.Chem. 2007, V. Ill, P. 515-520.

73. Zhu Ai, Fang N. Adhesion dynamics, morphology, and organization of 3T3 fi-broblaston chitosan and its derivative: the effect of O-carboxymethylation // Biomacromolecules. -2005. -V. 6, -P. 2607 -2614.

74. Weinbreck F., Nnieuwenhuije H., et. all Complexation of whey proteins with carrageenan // J. Agric. Food Chem. 2004. - V. 52. -P. 3550-3555.

75. Grymonpre K. R., Staggemeier B. A., Dubin P. Identification by integrated computer modeling and light scattering studies of an electrostatic serum albu-min-hyaluronic acid binding Site // Biomacromolecules. 2001, -V. 2, -P. 422429.

76. Jeon K-J., Katsuraya K., Kaneko Y. et. all. NMR spectroscopic detection of interactions betweena HIV protein sequence and a highly anti-HIV active curdlan sulfate // J.Am.Chem. Soc. -2000. -V. 122. -P. 12536 12541.

77. Gekk K., Noguchi H. Effects of ionic dextran derivatives on heat precipitation of protein // J. Agric. Food Chem. 1978. -V. 26, N. 6. -P. 1409-1413.

78. Poortinga A., Boos R. et all. Electric double layer interactions in bacterial adhesion to surfaces // Surface Science report. 2002. -V. 47. - P. 1-32.

79. Lipolsky R. Domain sand raftsin membranes-hidden dimensions of selforgani-zation // J. of Biol. Physics. 2002. -V. 28. -P. 195-210.

80. Grootenbuis P.D. J., van Boeckel C. A. A. Constructing a molecular model of the interaction between antithrombin III and a potent heparin analogue // J. Am. Chem. SOC. -1991, -V. 113. N. 7. -P. 2743-2747.

81. Rabenstein D.L. Heparin and heparan sulfate: structure and function // Nat. Product report. -2002. -V. 19. N 3. -P. 312-331.

82. Побочные эффекты введения гепарина // нефрология и диализ 2005 № 5. -с. 69-72.

83. Хотимченко Ю.С., Ермак И.М., Бедняк А.Е. Фармакология некрахмальных полисахаридов // Вестник ДВО РАН. -2005. № 1.- С. 72-82.

84. Усов А.И. Строение и биологическая активность сульфатированных полисахаридов бурых водорослей // Информационный бюллетень РФФИ 1998. № 6. -С. 104.

85. Matsui S., Muizzudin N. et. all. Sulfated polysaccarides from red microalgae have antiinflamatory properties in vitro and in vivo // Applied biochemistry and biotechnology. -2003. -V. 104. -P. 13-21.

86. Kolender A., Matulewicz M., Cerezo A. Structural analysis of antiviral sulfated a -D-(l—>3)-linked mannans// Carb. Res. -1995. -V. 273. P. 179-185.

87. Nishimura S-I., Kai H., Shinada K. Regioselective syntesis of sulfated polysaccharides: specific anti HIV-1 activity of novel hitosan sulfates // Carb. Res. -1998.-V. 306.-P. 427-433.

88. Yoshida Т., Yasuda Y., Mimura T. Synthesis of curdlan sulfates having inhibi-tyory effects in vitro against AIDS viruses HIV-l and HIV-2 // Carb. Res. -1995.-V. 276. -P. 425-436.

89. Matsuda M., Shigeta S., Okutani K. Antiviral activities of Marine Pseudomonas polysaccharides and their oversulfated derivatives // Marine biotechnology. -1999. -V. l.-P. 68-73.

90. Ono L., Wollinge W., Rocco I. In vitro and in vivo antiviral properties of sulfated galactomannans against yellow fevervirus (BeH lllstrain) and den-guelvirus (Hawaii strain) // Antiviral Research. -2003. -V. 60. P. 201-208.

91. Петров P.B., Хаитов P.M. Искусственные антигены и вакцины /АМН СССР. М.: Медицина, 1988, 288 с.

92. Belyaev E.Yu. New medical materials based on modified polysaccharides // Pharmaceutical Chemistry Journal. -2000. -V. 34, N.l 1. P. 36-41.

93. Fukuda C., Kollmar O., Schafer T. Anionic polysaccharides: a class of substances with hepatoprotective and antiadhesive // Transpl. Int. -2002. -V. 15. -P. 17-23.

94. Dedgumjorn A.C., Toyoda H., Woo E. Effect of (1—>3)-and (1—>4)-linkages of fully sulfated polysaccharides on the ir anticoagulant activity // Carbohydrate Research .-2002. -V. 337. -P. 925-933.

95. Болотникова Л.С., Данилов C.H., Самсонова Т.И. Метод определения вязкости и степени полимеризации целлюлозы // ЖПХ. 1966. № 1. С. 176-180.

96. Основы аналитической химии / В.И. Фадеева, Т.Н. Шеховцева и др.; под. ред. Ю.А.Золотова.-М.: Высш. шк., 2001,- с .463. С. 418.

97. Синицын А.В., Черноглазов В.М., Гусаков А.В. Методы изучения и свойства целлюлолитических ферментов «Биотехнология», (Итоги развития науки и техники АН СССР) М., 1990. №. 25. с.152.

98. Торлопов М.А., Фролова С.В., Демин В.А. Сульфатирование порошковых материалов, полученных деструкцией целлюлозы тетрахлоридом титана // Химия в интересах устойчивого развития, 2007. №4. с. 491-496.

99. Юб.ВагЬа С., Montan D., Rinaudo М. Synthesis and characterization of carbox-ymethylcelluloses (CMC) from non-wood fibers I. Accessibility of cellulose fibers and CMC synthesis // Cellulose. 2002 V. 9. P. 319-326.

100. Климов A.H., Ловягина Т.Н., Баньковская Э.Б. Турбидиметрический метод определения (3-липопротеидов и хиломикронов в сыворотке крови и тканях // Лабораторное дело. 1966. Т.5. С. 276-279.

101. Хаитов P.M., Пинегин Б.В., Истамов Х.И. Экологическая иммунология. М., 1995. 219 с. С.147-148.

102. Прозоровский В., Прозоровская М., Демченко В. // Фармакол. токсикол. 1978. №4. С. 497-502.

103. Лакин Г.Ф. Биометрия.-4-е изд. перераб. и доп. -М.: Высш. шк., 1990. -352 с.

104. Льноводство / Отв. ред. А. Р. Рогаш. М. : Колос, 1967. - 583с.

105. Оболенская A.B., Ельницкая З.П., Леонович A.A. Лабораторные работы по химии древесины и целлюлозы. -М., 1991.- 319 с.

106. ПЗ.Сиггиа С., Ханна Г. Количественный органический анализ по функциональным группам / пер. с англ. М.: Химия, 1983. с. 294.

107. Алексеев Ю.Е, Гарновский А.Д., Жданов Ю.А. Комплексы природных углеводов с катионами металлов // Успехи химии. 1998. №8 С. 723-744.

108. Физер Л., Физер М. Реагенты для химического синтеза // пер. с англ. под ред. д.х.н. Л.Н.Зефирова., -М.: Мир, 1970, 282 с.

109. Изумрудов В.А., Зезин А.Б., Кабанов В.А. Равновесие интерполиэлек-тролитных реакций и явление молекулярого «узнавания» в растворах Интерполиэлектролитных комплексов // Усп. хим. -Т. 60, вып. 7. -1991. С. 1534- 1570.

110. Володин В.В., Шупик А.Н. Строение координационных центров и молекулярная подвижность цепей в гель иммобилизованных каталитических системах // Высокомол. соед. -1987. -Т. 34. С. 469-498.

111. Томас X. Карбоксиметилированные эфиры целлюлозы и крахмала (обзор) // Эфиры целлюлозы и крахмала: синтез свойства, применение. Владимир, 2007. 19 с.

112. Mun G.A., Nurkeeva Z.D., Krutoryaskiy V.K. et.al. Interolymer complexes of copolymers of vinil ether diethylen glycol with poly (acrylic acid). // Colloid Polym. Sci.-2002. N. 280 . -P.282-289.

113. Кабанов B.A., Мустафьев В.И., Некрасов A.B. и др. Критический характер степени полимеризации полиэлектролитов и его влияние их иммуностимулирующие свойства // Докл. АН СССР.-1984. Т. 274, № 4. -С. 9981001.

114. V.B.Galazka, D.A.Ledward, I.G.Sumner and all. Influence of high pressure on bovine serum albumin and its complex with dextran sulfate // J.Agric.Food Chem.-1997. N. 45. -P. 3465-3471.

115. Климов A.H., Никульчева Н.Г. Липиды, липопротеиды и атеросклероз. СПб: Питер Пресс. 1995. С. 156-159.

116. Климов А.Н. Никульчева Н.Г. Обмен липидов и липопротеидов и его нарушения. СПб. Питер Ком. 1999. С. 512.

117. Рыженков В.Е., Соловьева М.А., Ремезова О.В., Окуневич И.В. Гиполи-пидемическое действие сульфатированных полисахаридов. // Вопросы медицинской химии. 1996. - Т. 42. № 2. — С. 115 - 118.

118. Геннис Р. Биомембраны: молекулярная структура и функции // пер. с англ. М.: Мир, 1997 624 с.

119. Попов C.B., Оводова Р.Г. и др. Ингибирующее действие пектиновых га-лактоуронанов на адгезию нейтрофилов // Биоорг. Химия. 2007. - Т 33. №1.-С. 187-192.

120. Linnemann. G., Reinhard. К., Parade. U. The effects of ingibition leukocyte migration wiht fucoidin in rat peretonitis model // Intensiwe care med. -2000, N.26. -P. 1540-1546.