Полиэлектролитные комплексы хитозан-каррагинан тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

Володько Александра Викторовна

Полиэлектролитные комплексы хитозан-каррагинан

02.00.10 - Биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

'¿и ГичР ¿014

Владивосток - 2014

005546145

Работа выполнена в Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН

Научный руководитель:

доктор химических наук, старший научный сотрудник Ермак Ирина Михайловна

Официальные Варламов Валерий Петрович оппоненты: доктор химических наук, профессор,

зав. лабораторией инженерии ферментов Центра «Биоинженерия» РАН

Попов Сергей Владимирович

доктор биологических наук, доцент, зав. отделом молекулярной иммунологии и биотехнологии Института физиологии Коми научного центра УрО РАН

Ведущая Тихоокеанский научно-исследовательский

организация: рыбохозяйственный центр (ТИНРО-Центр), г. Владивосток

Защита состоится «28» апреля 2014 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 005.005.01 при Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г. Б. Елякова ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс: (423) 231-40-50, e-mail: dissovet@piboc.dvo.ru

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН).

Текст диссертации и автореферата размещен на сайте www.piboc.dvo.га

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

«э» MAjHUl 2014 года

Черников О. В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Одной из актуальных задач современной биологии и медицины является создание новых композитных материалов с широким спектром биологической активности и минимальным побочным действием. В последние годы для их получения используются как синтетические, так и природные полимеры, в зависимости от структуры которых могут формироваться стехиометрические или нестехиометрические композиты в виде раствора, геля, нано- и микрочастиц, пленок, мембран и жидкокристаллических дисперсий. В создании таких полимерных систем особая роль отводится полиионным полисахаридам морского происхождения благодаря их биоразлагаемости, биосовместимости, доступности и разнообразной биологической активности. Способность противоположно заряженных полиионов образовывать полиэлектролитные комплексы (ПЭК) открывает возможность создания на их основе различного рода биологически активных композитов.

Среди полианионных полисахаридов важное место занимают каррагинаны - линейные сульфатированные полисахариды красных водорослей, построенные из остатков D-галактозы и ее производных, соединенных f3-( 1 —>4) и а-(1—>3) гликозидными связями. Структурное разнообразие каррагинанов обусловлено присутствием |3-(1—>4)-связанной 3,6-ангидрогалактозы, местоположением и количеством сульфатных групп и нерегулярной или гибридной структурой полисахарида. Каррагинаны обладают уникальными физико-химическими свойствами и разнообразной биологической активностью, в том числе выраженной антивирусной, антимикробной, иммуномодулирующей и антикоагулирующей.

Хитозан - природный поликатионный линейный полисахарид, полимерная цепь которого состоит из Р-(1—>4)-связанных остатков D-глюкозамина и М-ацстил-О-глюкозамина. К настоящему времени установлено, что хитозан обладает широким спектром биологической активности, в том числе гиполипидемической, гепатопротекторной, радиопротекторной,

антибактериальной и противовирусной.

Биологические и физико-химические свойства ПЭК, полученных на основе каррагинанов и хитозанов, могут существенно отличаться от свойств исходных полимеров и будут зависеть, как от структурных особенностей полисахаридов (молекулярной массы, плотности заряда, распределения ионизированных групп вдоль полимерной цепи, конформации в растворе и макромолекулярной организации), так и от условий, при которых происходит

образование комплексов._

Сокращения, иеполыуемые в тексте: АСМ - атомно-силовая микроскопия; ВТМ -вирус табачной мозаики; ДРС - динамическое рассеяние света; ИК - инфракрасный; ИП -индекс Паулса; К - каррагинан; ММ - молекулярная масса; ПЭК - полиэлектролитный комплекс; СА - степень N-ацетилирования; СС - степень сульфатирования; ТИ -тиксотропный индекс; ФИО - фактор некроза опухоли; X - хитозан; ЯМР - ядерный магнитный резонанс.

Изучение влияния всех этих факторов позволит дополнить представление о механизме образования ПЭК и расширит возможности получения новых композитных материалов с заданными физико-химическими характеристиками и биологической активностью. Наличие в нашем распоряжении ряда каррагинанов различных структурных типов с одной стороны и хитозанов разной степени Ы-ацетилирования и полимеризациии с другой, позволит получить широкий набор ПЭК и выбрать наиболее эффективные из них.

Получение растворимых форм комплексов каррагинан-хитозан позволит расширить возможности применения ПЭК и увеличить их биодоступность. В связи с этим, в данной работе основное внимание уделено получению растворимых форм ПЭК каррагинана с хитозаном и изучению их состава, макромолекулярной организации и биологической активности.

Целью диссертационной работы является получение и характеристика полиэлектролитных комплексов каррагинан-хитозан, изучение влияния структурных особенностей полисахаридов на процесс формирования комплексов, а также экспериментальное обоснование возможности использования полиэлектролитных комплексов для биомедицинского назначения.

Основные задачи диссертационной работы:

1. Получить и охарактеризовать каррагинаны различных структурных типов и хитозаны с разной степенью М-ацетилирования и полимеризации;

2. Подобрать условия образования растворимых комплексов каррагинан-хитозан;

3. Изучить влияние на процесс формирования комплексов структуры и молекулярной массы полисахаридов, концентрации и соотношения исходных компонентов, а также условий среды;

4. Охарактеризовать полученные ПЭК (определить их размер, ^-потенциал, константы связывания каррагинана с хитозаном и изучить макромолекулярную организацию комплексов);

5. Получить гелевые формы ПЭК и оценить их реологические свойства;

6. Изучить биологическую активность полученных комплексов в сравнении с исходными полисахаридами.

Научная новизна работы. Впервые охарактеризованы растворимые ПЭК каррагинан-хитозан (К-Х), полученные на основе каррагинанов различных структурных типов с хитозанами разной степени Ы-ацетилирования и полимеризации. Показано влияние структурных особенностей полисахаридов на процесс формирования комплексов. Впервые определены константы связывания каррагинана с хитозаном, методом компьютерного моделирования рассчитаны теоретические модели пространственных структур комплексов. Впервые методом атомно-силовой микроскопии изучена надмолекулярная структура комплексов К-Х, и показана ее зависимость от соотношения исходных компонентов. Впервые показано, что комплексы К-Х обладают гастропротекторной активностью, которая зависит от их состава.

Практическая значимость работы. На основе полисахаридов морских гидробионтов создано средство, обладающее гастропротекторной активностью и

представляющее собой водорастворимый ПЭК каррагинана с хитозаном при соотношении Х:К 10:1 в/в. Показано, что парентеральное введение ПЭК каррагинан-хитозан экспериментальным животным достоверно снижает выраженность воспалительной реакции организма, индуцированной гистамином. Полученный ПЭК может найти применение в медицине для профилактики и лечения язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, а также для снижения побочного ульцерогенного действия нестероидных противовоспалительных средств и других лекарственных препаратов. Основные положения, выносимые на защиту.

1. Подобраны условия для получения комплексов каррагинан-хитозан в растворимой и гелевой форме.

2. Образование растворимых ПЭК в широком диапазоне соотношений исходных компонентов определяется степенью сульфатирования каррагинанов и степенью N-ацетилирования хитозанов.

3. Высокосульфатированный х-К полностью связывается с хитозанами различной степени полимеризации, а хитозан с низкой степенью полимеризации полностью связывается с каррагинанами (к-К и х-К).

4. Гелевые формы полученных ПЭК представляют собой неньютоновские псевдопластичные жидкости с тиксотропными свойствами.

5. Макромолекулярная структура ПЭК зависит от концентрации и соотношения исходных полисахаридов.

6. Комплексы с высоким содержанием каррагинана проявляют цитокин-индуцирующую, антивирусную и антиоксидантную активности in vitro.

7. ПЭК каррагинан-хитозан снижают выраженность воспалительной реакции, индуцированной гистамином, и проявляют гастропротекторную активность, которая зависит от их состава.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены автором в виде устных и стендовых сообщений на XIII и XIV Всероссийской молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии (Владивосток, Россия, 2010, 2012); «Renewable wood and plant resources: chemistry, technology, pharmacology, medicine» (Санкт-Петербург, Россия, 2011); «2nd International symposium on life sciences» (Владивосток, Россия, 2013).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в международных журналах, рекомендованных ВАК РФ, и 7 тезисов докладов в материалах научных конференций.

Диссертация обсуждена и одобрена на расширенном заседании отдела молекулярной иммунологии ТИБОХ ДВО РАН 18 февраля 2014 г.

Личный вклад соискателя в проведение исследования. Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично автором и совместно с сотрудниками ЛМОАБИ и других лабораторий ТИБОХ ДВО РАН, а также совместно с сотрудниками ИАПУ ДВО РАН и НИОХ СО РАН. На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, в получении которых роль соискателя была определяющей.

Структура и объем диссертации. Диссертация содержит разделы: Введение, Литературный обзор, Результаты и обсуждение, Материалы и методы,

Выводы и Список литературы, включающий 217 наименований. Диссертация изложена на 137 страницах. Результаты представлены в 18 таблицах и иллюстрированы 30 рисунками.

Автор выражает искреннюю благодарность своему руководителю д.х.н. И.М. Ермак за неоценимую помощь в выполнении диссертационной работы, к.х.н. В.Н. Давыдовой, к.х.н. В.И. Горбачу за любезное предоставление образцов полисахаридов и помощь при проведении экспериментов, д.х.н. Т.Ф. Соловьевой и всем сотрудникам ЛМОАБИ ТИБОХ ДВО РАН, В.П. Глазунову за получение и помощь в интерпретации ИК-спектров, д.б.н. А.В. Реунову и к.б.н. В.П. Нагорской за проведение экспериментов по антивирусной активности полисахаридов и их комплексов, к.ф-м.н. Г.Н. Лихацкой за компьютерное моделирование взаимодействия каррагинана с хитозаном. Сотрудникам ИАПУ ДВО РАН к.ф-м.н. Е.А. Чусовитину и С.А. Балагану за предоставление возможности проведения экспериментальных работ на атомно-силовом микроскопе и помощь в интерпретации результатов, а также сотрудникам НИОХ СО РАН д.б.н. И.В. Сорокиной, д.б.н. Т.Г. Толстиковой и М.П. Долгих за проведение экспериментов по изучению биологической активности in vivo.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Получение и характеристика исходных компонентов комплекса

Понимание процесса взаимодействия биополимеров невозможно без характеристики каждого из компонентов в отдельности. Поэтому, прежде чем приступить к исследованию взаимодействия каррагинана с хитозаном, полисахариды были получены и охарактеризованы (таблица 1).

В работе использовали образцы полисахаридов различных типов: к-, к/р и Х-каррагинаны (к-К, к/[?-К и Х-К), структура которых была ранее установлена в Лаборатории молекулярных основ антибактериального иммунитета ТИБОХ ДВО РАН. Как было показано, желирующий каррагинан выделенный из водоросли Tichocarpns crinitus относится к гибридному к/(3-К, тогда как модифицированный нежелирующий полисахарид, содержащийся в небольших количествах в стерильной форме этой водоросли, был отнесен к новому структурному типу, обозначенному как х-каррагинан (х-К). Так как количественный и качественный полисахаридный состав красных водорослей зависит от стадии их развития, для уточнения структуры нежелирующего типа каррагинана в настоящей работе был выделен и изучен сульфатированный полисахарид из водоросли Т. crinitus, находящейся в репродуктивной стадии развития. Он представлял собой каррагинан, структура которого, по данным ИК и ЯМР-спектроскопии, а также МАЛДИ-спектрометрии, была идентична структуре х-К.

В качестве поликатиона в работе использовали пять образцов хитозана: 3 образца хитозана с высокой ММ со степенью N-ацетилирования (СА) 1%, 6% и 17%, полученные методом щелочного N-дезацетилирования хитина, и 2 образца хитозана с низкой ММ и СА 1% и 11%, полученные методом химической деполимеризации с использованием перекиси водорода.

Средневязкостные ММ полисахаридов (таблица 1), были рассчитаны на основании измеренного значения характеристической вязкости согласно эмпирическому уравнению Марка-Хаувинка-Куна.

Таблица 1 - Физико-химические характе ристики полисахаридов

Полисахарид Характеристическая вязкость [г|], мл/г ММ, кДа Степень

сульфатирования на дисахаридное звено >}-ацетили-рования, %

к/р-К 0.619х103 380 0.6

к-К 0.512хЮ3 311 1

к-К 0.885х103 550 1

х-К 0.845х103 527 2

1.035х10э 650 3

Х-300 0.225хЮ3 300 17

Х-130 0.105хЮ3 130 1

Х-110 0.089хЮ3 110 6

Х-11 О.ОПхЮ3 11 1

Х-17 0.015х103 17 11

2. Подбор условий для получения растворимых ПЭК каррагинан-хитозан

Для подбора условий получения растворимых комплексов К-Х использован метод турбодиметрического титрования, основанный на регистрации мутности раствора. Проведен анализ формирования комплексов в зависимости от способа их приготовления, состава буфера, структуры каррагинана и хитозана, концентрации и соотношения исходных компонентов. Формирование осадка в смеси полисахаридов выражалось в резком увеличении мутности раствора (т). Значение т<5 соответствовало растворимым комплексам, т>5 - нерастворимым комплексам. На представленных рисунках граница образования растворимых комплексов обозначена звездочкой (*).

Как показали экспериментальные данные (рис. 1), процесс формирования комплексов зависит от способа их получения. При титровании одного компонента другим (способ I) растворимые комплексы формировались в очень узком диапазоне соотношений Х:К (до соотношения Х:К 6:1 моль/моль при низкой концентрации каррагинана (0.1 мг/мл)). При этой же концентрации каррагинана и смешивании заданных соотношений исходных компонентов (способ II) растворимые ПЭК К-Х получались во всем исследованном диапазоне соотношений Х:К (от 0.1:1 до 30:1 моль/моль). При более высоких концентрациях полианиона (Ск = 0.5 и 1 мг/мл) растворимые комплексы формировались в более узком диапазоне соотношений К:Х. Процесс образования комплекса незначительно зависел от времени и состава буфера. Постоянное значение мутности достигалось после часа инкубации смеси при 25°С и не изменялось в течение 24 ч.

О 1 Z 3 4 5 10 20 30 40 50

0 1 2 5 10 15 20 25 30

Соотношение Х:К, моль/моль

Рисунок 1 - Зависимость мутности смесей к-К с Х-130, полученных способом I (а) и способом II (б), от соотношения Х:К 1 - Ск-к= 0.1 мг/мл, 2 - Ск.к= 0.5 мг/мл, 3 - Ск.к= 1 мг/мл

Для изучения влияния структурных особенностей полианиона на формирование ПЭК использовали три типа каррагинана: к-К, к/р-К и х-К, различающиеся С С и Х-130 (рис. 2).

ft

О—

Ыг

О 1 2 3 4 5 10 20 30 40 50 -0 2 4 6 100 200

СоотношениеX:К, моль/моль

0 1 2 3 4 5 10 20 30 40 50

Рисунок 2 - Зависимость мутности смеси каррагинана с Х-130 от соотношения Х:К: а - Ск = 0.1 мг/мл; б - Ск= 0.5 мг/мл; в - Ск = 1 мг/мл 1 -х-КХ-130; 2 - к-К:Х-130; 3 - к/р-К:Х-130

Как видно из рисунка 2а, при Ск = 0.1 мг/мл к-К и к/р-К образуют с Х-130 растворимые комплексы во всем исследованном диапазоне молярных соотношений. В случае х-К наблюдается формирование осадка при соотношениях Х:К от 20:1 и 25:1 моль/моль. При увеличении концентрации каррагинанов в смеси до 1 мг/мл преимущественно образуются нерастворимые комплексы (рис. 26, в). При этом диапазон молярных соотношений Х:К, при которых образуется растворимый ПЭК, для х-К несколько шире, чем для к-К и к/р-К, что, вероятно, обусловлено как высокой СС этого типа каррагинана, так и его конформацией в растворе. Полученные в данных условиях ПЭК оставались стабильными в течение 24 ч.

30

50 0 10 20 30 100 200 О Соотношение X:l£, моль/моль

а зо

0 5 10 15 20 25 30 35

Рисунок 3 - Зависимость мутности смеси каррагинана с хитозаном от молярного соотношения Х:К: а - влияние ММ хитозана, б - влияние СА хитозана,

1 _ к-К-311 :Х-130; 2 - к-К-311 :Х-11; 3 - к-К-311 :Х-17; 4 - к-К-550:Х-130

ММ и СА хитозана играют важную роль в образовании растворимых ПЭК. Как видно из рисунка За, снижение ММ хитозана сопровождается увеличением интервала образования растворимых комплексов до соотношения Х:К 30:1 моль/моль. В случае снижения ММ к-К (рис. Зв) интервал образования растворимых комплексов меняется незначительно. Увеличение СА хитозана изменяет характер формирования комплекса (рис. 36, кривая 3) - вначале наблюдается увеличение мутности реакционной смеси, а затем ее уменьшение и образование растворимых комплексов.

Таким образом, согласно данным турбодиметрического титрования, образование растворимых комплексов зависит от способа их получения, структуры и концентрации каррагинана, ММ и СА хитозана, а также соотношения исходных компонентов.

3. Характеристика образования растворимых комплексов К-Х

Метод турбодиметрии позволяет быстро следить за формированием ПЭК, однако не дает информации о полноте связывания компонентов в комплексе, что является важным параметром процесса взаимодействия. Для регистрации образующихся комплексов в данной работе использовали методы гель-проникающей хроматографии и центрифугирования в градиенте перколла.

3.1. Гель-проникающая хроматография

На рисунке 4 представлены результаты гель-проникающей хроматографии исходных полисахаридов: Х-130, к-К, к/(3-К и их смесей в соотношении Х:К 10:1 в/в.

в - влияние ММ каррагинана

Рисунок 4 - Гель-проникающая хроматография полисахаридов и их смесей при соотношении Х:К 10:1 в/в: а-исходные полисахариды; б-к-К:Х; в - к/р-К :Х; 1 -Х-130; 2 - к-К; 3-к/р-К

Анализ кривых показывает, что Х-130 представляет собой гомогенный по ММ полисахарид. Профили элюции для к-К и к/р-К свидетельствуют о высокой ММ полианионов, что соответствует данным вискозиметрии (таблица 1). Совпадение максимумов выходных кривых для смесей к-К с Х-130 (рис. 46) и к/р-К с Х-130 (рис. 4в) указывает на образование комплекса, помимо этого остается часть свободных полисахаридов.

3.2. Центрифугирование в градиенте перколла

Наиболее информативным методом регистрации формирования комплексов является метод градиентного центрифугирования, позволяющий разделять макромолекулы в соответствии с их плавучей плотностью. Этим методом были проанализированы смеси двух образцов хитозана (Х-130 и Х-17) с тремя типами каррагинанов: к-К, к/р-К и х-К.

О 2 А 6 8 10 12 14 О 2 4 6 8 10 12 14 Номер фракции

Рисунок 5 - Результаты центрифугирования в градиенте перколла: а -содержание аминогрупп хитозана, б - содержание сульфатных групп каррагинана; 1 - Х-13 0; 2 - Х-17; 3 - х-К; 4 - к-К; 5 - к/р-К

Как можно видеть из рисунка 5, Х-130, к/р-К и х-К представляют собой гомогенные полисахариды, тогда как Х-17 и к-К в условиях центрифугирования разделяются на две фракции. Совпадение максимумов кривых распределения компонентов для смеси Х-130 с к/р-К (Х:К 10:1 в/в), представленных на рисунке 6, указывает на образование комплекса. Наряду с комплексом в растворе присутствуют свободный Х-130 и к/р-К.

2 4 6 8 10 Номер фракции

Рисунок 6 - Результаты центрифугирования в градиенте перколла смеси к/р-К с Х-130: 1-Х-130; 2-к/р-К

В случае смесей к-К с Х-130 (рис. 7), независимо от соотношения Х:К, образуются два типа комплекса с разной плавучей плотностью. На это указывает совпадение максимумов кривых распределения Х-130 и к-К. Наряду с этим, при высоком содержании полианиона в смеси остается несвязанный к-К, а при избытке Х-130 - хитозан.

0.0<Н

2 4 6 8 10 12 14 0 2 4 Номер фракции

Рисунок 7 - Результаты центрифугирования в градиенте перколла смеси к-К с Х-130: а-Х:К 10:1 в/в; б-К:Х 10:1 в/в;в-К:Х2:1 в/в; 1 - Х-130; 2 - к-К

При взаимодействии высокосульфатированного каррагинана (х-К) наблюдается полное связывание полисахаридов с образованием двух типов комплекса (рис. 8), о чем свидетельствует совпадение максимумов кривых распределения х-К и Х-130.

О 3 6 9 12 15 18 О 3 6 9 12 15 18

Номер фракции

Рисунок 8 - Результаты центрифугирования в градиенте перколла смеси х-К с Х-130: а —Х:К 10:1 в/в; б-К:Х2:1 в/в; 1 -Х-130; 2-х-К

В то же время снижение ММ хитозана (со 130 до 17 кДа) приводит к полному связыванию поликатиона не только с х-К, но и с к-К и образованию двух типов комплексов (рис. 9). Однако в случае к/р-К, имеющего низкую СС, наряду с комплексом в растворе остается часть несвязанного каррагинана (рис 9а).

Рисунок 9 - Результаты центрифугирования в градиенте перколла смесей каррагинана с Х-17 при соотношении К:Х 2:1 в/в: а-к/р-К:Х-17; б-к-К:Х-17; в - х-К:Х-17; 1 - Х-17; 2 - к/р-К; 3 - к-К; 4 - х-К

Таким образом, результаты гель-проникающей хроматографии и центрифугирования в градиенте перколла позволили установить, что каррагинан с высокой СС (х-К) полностью связывается с хитозанами различной степени полимеризации, а хитозан с низкой степенью полимеризации полностью связывается с к-К и х-К.

3.3. ИК-спектроскопия

Формирование ПЭК К-Х регистрировали методом ИК-спектроскопии (рис. 10). Разложение ИК-спектра на индивидуальные компоненты позволило оценить образование ПЭК вследствие связывания сульфатных групп

каррагинана с аминогруппами хитозана. Для этого были рассчитаны отношения площадей полос поглощения при 1259 см"1 (валентные колебания у(803~)) и при 842 см'1 (деформационные колебания 5(8-0-С(4)) как в исходном каррагинане, так и в его комплексе с хитозаном.

1065

Рисунок 10 — ИК-спектр: а - полисахаридов и их комплекса; б - ПЭК К-Х; в - к-К; 1 - хитозан; 2 - к-К; 3 - ПЭК К-Х

Расчет показал, что для к-К отношение (Я) площадей полос 81259 и 8842 равно 4.0, тогда как для комплекса К-Х отношение Я = 1.7. Такое уменьшение отношения площадей полос поглощения сульфатных групп в комплексе приблизительно в два раза указывает на связывание этих групп к-К с аминогруппами хитозана.

4. Компьютерное моделирование ЗО-структуры комплексов хитозана с к-К в растворе

Методами компьютерного моделирования впервые получены теоретические модели ЗБ-структуры комплексов хитозана с к-К в водной фазе. Рассчитаны структуры 30 комплексов. На рисунке 11 представлена полноатомная модель комплекса пентасахаридного фрагмента хитозана с к-К с наиболее низкой энергией.

Рисунок 11 - Полноатомная модель ЗБ- структуры комплекса пентасахаридного фрагмента хитозана (1) с к-К (2)

Как видно из таблицы 2, водородные и ионные связи аминогрупп хитозана вносят наибольший вклад в энергию образования комплекса хитозана с каррагинаном.

Таблица 2 - Контакты, стабилизирующие структуру комплекса пентасахаридного фрагмента хитозана с к-К _

Лиганд Рецептор Связь Расстояние, Ä Е, ккал/моль

Об 19 07 G4S 1 (В) водородная 3.01 -1.6

03 46 07 DG6 (А)водородная 2.72 -1.9

N2 60 07 DG6 (А)водородная 3.00 -0.9

N2 60 08 DG6 (А)водородная 3.27 -5.3

03 69 Ol DG6 (А)водородная 3.18 -0.7

03 115 07 G4S 1 (В) водородная 2.89 -2.2

04 117 07 G4S 1 (В) водородная 2.95 -2.0

N2 12 09 DG6 (А)ионная 2.96 -4.7

N2 60 07 DG6 (А) ионная 3.00 -4.5

N2 60 08DG6 (А) ионная 3.27 -2.9

G4S - 4-0-сульфо-Р-0-галактопираноза; DG - 3,6-ангидро-0-галактоза

С помощью программы GRAMM 1.03 рассчитаны структуры 100 комплексов хитозана в протонированной форме (состоящего из 50 моносахаридных остатков) с к-К. Показано, что хитозан может иметь несколько сайтов связывания с двойной спиралью к-К, наиболее вероятные комплексы получаются, когда на 1 аминогруппу хитозана приходится 1 или 1.5 сульфатные группы к-К.

5. Определение параметров связывания каррагинана с хитозаном

На основании структуры исходных полисахаридов, а также данных экспериментов in silico можно считать, что связывание хитозана с каррагинаном осуществляется в основном за счет ионного взаимодействия катионных и анионных групп полимеров. В связи с этим для определения констант связывания ПЭК К-Х был использован метод конкурентного связывания

полианиона с комплексом хитозан/анионный краситель, основанный на вытеснении каррагинаном красителя из комплекса хитозан/краситель с последующей регистрацией высвободившегося красителя.

Как показали результаты экспериметов, для достижения постоянной величины оптической плотности раствора при титровании комплекса тропеолин/Х-130 к-К требовалось время. Экстинция реакционной смеси достигала постоянного значения через 24 ч, что указывает на достаточно сложный процесс образования комплексов. На основании кривых титрования было определено количество остатков глюкозамина, связанных с 1 молекулой каррагинана, и число сульфатых групп, приходящихся на 1 аминогруппу хитозана (п*). Полученные значения представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Количество сульфатных групп в молекуле каррагинана, которые связываются с одним остатком глюкозамина в молекуле хитозана_

Тип каррагинана Молекулярная масса Число сульфатных групп в молекуле каррагинана Количество остатков глюкозамина, связанных с молекулой каррагинана Число сульфатных групп на 1 Ш3+,п*

Каррагинана, кДа Структурного фрагмента. Да

к-К 367 392 936 722 1.3

Х-К 650 630 3095 1512 2.0

кУр-К 380 1754 650 934 0.7

х-К 527 510 2066 1728 1.2

Как известно на одно дисахаридное звено к-К приходится 1 сульфатная группа, х-К - 2 сульфатных группы, ^-К - 3 сульфатные группы. В случае к/р-К на 5 дисахаридных звеньев приходится 3 дисахаридных звена к-К и 2 - |3-К. Таким образом, на дисахаридное звено к/|3-К приходится 0,6 сульфатных групп. При расчете п* (таблица 3) для этих полисахаридов соответствующей корреляции между количеством связанных аминогрупп хитозана и числом сульфатных групп каррагинана, участвующих в связывании с хитозаном, не наблюдается. Вероятно, это связано с тем, что не все сульфатные группы в молекуле каррагинана доступны для связывания с Х-130, что может быть обусловлено конформацией молекул каррагинана. Как известно, наличие 3,6-ангидрогалактозы и небольшое количество сульфатных групп приводит к снижению гибкости молекулы. Такая жесткость молекулы полианиона может обуславливать пространственные затруднения для его взаимодействия с катионом. Необходимо отметить, что эти данные согласуются с результатами экспериментов ш эШсо.

Использование метода графического представления данных в координатах Скетчарда (рис. 12) позволило нам определить константы связывания (Ксв) каррагинанов с Х-130. Их значения представлены в таблице 4.

АБ/С

ДБ

Рисунок 12 — Графики Скетчарда связывания каррагинана с хитозаном 1 - к-К:Х-130; 2 - Х-К:Х-130; 3 - к/(3-К:Х-130; 4 - х-К:Х-130

Полученные зависимости имеют линейный характер. Это свидетельствует о том, что в электростатическом связывании хитозана с каррагинаном участвуют сайты одного типа и взаимодействие носит некооперативный характер.

Как видно из таблицы 4, Ксв Х-130 с каррагинанами различных структурных типов различаются между собой. Этот эффект может быть связан как с количеством сульфатных групп, их распределением вдоль полимерной цепи, так и конформацией макромолекулы каррагинана. Макромолекулярная организация Х-К отличается от таковой для к-К и к/(3-К. ¡^-К имеет в растворе конформацию неупорядоченного клубка. Вследствие гибкости полимерной цепи Х.-К места связывания на нем могут смещаться одно относительно другого в пространстве и уменьшать стерические препятствия при связывании с хитозаном. В случае жестких молекул к-К и к/р-К, которые образуют двухцепочечные спирали, это становится невозможным.

Достаточно высокая величина Ксв, видимо, определяется дополнительной стабилизацией комплекса водородными связями между молекулами хитозана и каррагинана, наличие которых подтверждается экспериментами т яШсо.

Таблица 4 - Значения констант связывания (Кса) в комплексе К-Х

Комплекс Ксв, х10' моль"1

к-К:Х-130 2.38

Х-К:Х-130 23.39

к/(3-К:Х-130 2.85

х-К:Х-130 8.47

Таким образом, данные центрифугирования и значения Ксв свидетельствуют о существенной роли структуры каррагинана в процессе его взаимодействия с хитозаном.

6. Размер и ^-потенциал комплексов к-К с X

Для более детальной характеристики ПЭК к-К с хитозаном был использован метод динамического рассеяния света (ДРС) и электрокинетических измерений. Для этих целей были приготовлены 2 серии растворимых ПЭК к-К с хитозаном: первая - с избытком хитозана, вторая - с избытком к-К (таблица 5).

Таблица 5 -Размер и поверхностный потенциал ПЭК К-Х

Образец Размер частиц Индекс полидисперсности ¡¡-потенциал, мВ

Б, нм %

Х-110 0.5 мг/мл 541.9±55.2 75 0.986± 0.018 38.3±0.9

23.1±4.8 25

К:Х 0.05:1 в/в 163.Ш5.67 100 0.397± 0.018 33.7±1.3

К:Х 0.1:1 в/в 168.7±2.171 100 0.276± 0.007 29.1±2.5

К:Х 0.15:1 в/в 192.6±20.16 100 0.244± 0.015 32.3±1.28

К:Х 0.25:1 в/в 222.0±3.6 100 0.230± 0.006 38.5±1.6

К:Х 0.35:1 в/в 241.4±17.55 100 0.223± 0.011 36.2±0.3

К:Х 0.45:1 в/в 277.2±15.9 100 0.255±0.009 32.2±0.9

К:Х 0.5:1 в/в 270.2±19.8 100 0.251±0.007 35.6±0.8

К:Х 0.6:1 в/в 335.5±43.8 100 0.263±0.012 34.5±0.2

К:Х 0.65:1 в/в 535.1±81.5 96 0.394±0.007 31.7±0.9

4600.0±100.0 4

К:Х 0.7:1 в/в 460.6±21.8 88 0.389±0.020 35.5±0.9

4518.0±685.0 12

К:Х 0.8:1 в/в 647.6±168.0 90 0.441±0.020 32.9±0.7

4844.0±135.0 10

К:Х 1:1 в/в 569.0±189.0 88 0.463±0.062 31.9±0.6

4874.0±249.0 12

к-К 231.5±39.4 41 0.499±0.046 -54.2±2.3

758.8±55.8 59

Х:К 0.05:1 в/в 338.6±76.7 38 0.520±0.040 -48.3±1.5

538.5±266.0 62

Х:К 0.1:1 в/в 117.5±63.5 17 0.343±0.041 -45.0±0.5

557.4±79.3 83

Х:К 0.15:1 в/в 61.8±15.9 6 0.294±0.011 -48.1±1.9

461.1±4.5 94

Х:К 0.25:1 в/в 195.5±21.4 23 0.327±0.046 -42.0±2.1

702.7±115.0 77

Х:К 0.35:1 в/в 269.5±122.5 29 0.303±0.010 -41.2±1.5

1001.5±277.6 71

Х:К 0.45:1 в/в 650.5±146.7 76 0.463±0.018 -41.3±1.3

4185.0±112.7 24

Х:К 0.5:1 в/в 374.0±92.9 38 0.641±0.088 -35.8±1.82

1548.0±319.9 62

Как показали данные ДРС, растворимые комплексы при избытке хитозана представляют собой гомогенные по размерам (от 160 до 335 нм) положительно заряженные частицы. Увеличение содержания каррагинана в смеси до соотношения К:Х 0.65:1 в/в приводит к увеличению индекса полидисперсности и размера частиц от 460 до 647 нм, а также образованию еще одной популяции частиц с размером более 1 мкм (4-8.5%).

Во второй серии комплексов с избытком к-К формируются более крупные полидисперсные отрицательно заряженные частицы. В данном случае образование частиц с размером более 1 мкм происходит уже при соотношении Х:К 0.35:1 в/в.

Незначительное изменение ¡¡-потенциала и размеров ПЭК в случае комплексов с избытком хитозана позволяет предположить, что электростатическая стабилизация сформированных частиц ПЭК осуществляется непрореагировавшими группами компонента находящегося в избытке (в данном случае аминогруппами хитозана) за счет образования так называемой гидрофильной «короны», описанной в литературе. При небольшом содержании к-К в смеси сначала наблюдается уменьшение ^-потенциала комплекса, а потом его стабилизация, что подтверждает сделанное нами предположение.

Анализ комплексов, полученных с избытком к-К, позволяет предположить несколько иной характер формирования частиц ПЭК. С увеличением содержания хитозана в комплексе величина ¡¡-потенциала ПЭК уменьшается с -55 до -35 мВ. Это означает, что количество несвязанных сульфатных групп к-К с увеличением содержания в комплексе хитозана уменьшается и стабилизации частиц ПЭК непрореагировавшими группами в этом случае не происходит.

Таким образом, на механизм образования ПЭК оказывает влияние полимер, находящийся в избытке. При достижении соотношения К:Х 0.65:1 в/в и Х:К 0.35:1 в/в наблюдается формирование крупных частиц с диаметром больше 1 мкм. Однако это не приводит к значительной нейтрализации поверхностного ¡¡-потенциала частиц комплекса. ПЭК, полученные с избытком хитозана, более стабильны, чем ПЭК с избытком каррагинана.

7. Изучение макромолекулярной структуры комплексов К-Х методом атомно-силовой микроскопии

Макромолекулярная структура комплексов к-К с Х-110, полученных при разном соотношении К:Х и Х:К 10:1 в/в, в сравнении с исходными полисахаридами была изучена методом АСМ (рис. 13).

При концентрации 0.01 мг/мл хитозан формирует однородную и очень ровную (среднеквадратичная шероховатость - 0,13 нм) плёнку (рис. 13а). Как видно из рисунка 136, к-К образует трехмерную сетчатую структуру высотой стенок ячеек до 2.5 нм, что указывает на характер межмолекулярной ассоциации полисахарида по типу «бок-к-боку». Сеть непрерывна и состоит из разветвленных волокон. Средняя толщина стенки ячейки составляет 50 нм. На рисунке 13г изображена гистограмма распределения площадей ячеек, на которой для к-К наблюдается мономодальное распределение площадей с максимумом около 1600 нм2.

-----------,-------.-------.-----,............7------О - ,-f-.-,-------------------,

о 2«ю жхю та ^ооо iixx» о им та «ов ш itxxi

Площадь, нм* Площадь, нмГ

Рисунок 13 - АСМ образцов, нанесенных на свежесколотую слюду: а - Х-110 (0.01 мг/мл); б - к-К (0.1 мг/мл); в - к-К:Х-110, 10:1 в/в; и гистограмма распределения площадей ячеек: г-к-К (0.1 мг/мл); д - к-К:Х-110, 10:1 в/в

Макромолекулярная структура ПЭК к-К с Х-110 при соотношении К:Х 10:1 в/в отличается от структуры исходных компонентов. Структура комплекса представлена несколькими слоями. Нижний слой имеет сетчатую структуру аналогичную структуре к-К, но со значительно меньшей толщиной стенок (25 нм). Гистограмма распределения площадей ячеек (рис. 13д) имеет бимодальный характер с двумя максимумами около 150 и 300 нм2, что в 10 раз меньше, чем области, соответствующие пику гистограммы для к-К (рис. 13г). Второй слой, расположенный над сетчатой структурой, состоит из длинных перекрученных фибрилл. Возможно, эти два слоя соответствуют двум типам комплексов, которые регистрировались при центрифугировании этого ПЭК в градиенте перколла (рис. 76).

Увеличение концентрации Х-110 в 10 раз приводит к изменению его надмолекулярной структуры (рис. 14а), которая представлена неоднородной поверхностью, составленной из плотно упакованных шарообразных частиц (среднеквадратичная шероховатость - 14.3 нм).

При низкой концентрации (0.01 мг/мл) к-К образует длинные нитеобразные структуры, переплетенные в некоторых местах, что приводит к увеличению высоты и может соответствовать образованию двухцепочечных структур, характерных для к-К.

Рисунок 14 - ACM образцов, нанесенных на свежесколотую слюду: а — Х-110 (0.1 мг/мл); б-к-К (0.01 мг/мл); в-Х-110:к-К 10:1 в/в

АСМ комплекса к-К с Х-110 при соотношении Х:К 10:1 в/в свидетельствует об образовании морфологически неоднородной структуры, отличной от таковой для исходных полисахаридов.

На рисунке 14в видны плотно упакованные образования, состоящие из похожих сегментов, характерных для Х-110, вероятно, в основе которых расположены фибриллы к-К (в среднем длина 500 нм). Равномерный подслой, сформированный из шарообразных сегментов, возможно, соответствует свободному Х-110. Неоднородность наблюдаемой структуры соответствует данным, полученным методом центрифугирования, согласно которым при этих соотношениях полисахаридов образуются два типа комплекса, при этом остается часть несвязанного хитозана (рис. 7а).

8. Реологический свойства гелевых комплексов К-Х

В современной литературе достаточно широко описано получение гелевых ПЭК на основе полисахаридов. Большинство этих работ посвящено исследованию прикладных аспектов таких систем. В то же время данные о влиянии структурных особенностей полисахаридов на формирование таких композитов и исследовании их реологических свойств очень немногочисленны.

Для получения гелевых ПЭК были использованы к-К, х-К и так называемый суммарный каррагинан (£-К), представляющий смесь к-К и Х-К в соотношении 3:1, а также Х-110 и Х-300. Характер зависимости напряжения сдвига от скорости сдвига (рис. 15) указывает на то, что исследуемые каррагинаны и комплексы на их основе представляют собой неньютоновские псевдопластичные жидкости.

Как можно видеть из графика зависимости напряжения сдвига от скорости сдвига (рис. 156, г), для комплексов к-К:Х-110 (5:1 в/в) и к-К:Х-300 (10:1 в/в) восходящая кривая петли гистерезиса лежит ниже нисходящей, что указывает на наличие реопексных свойств. Это может быть следствием сильного межмолекулярного взаимодействия между компонентами комплекса. В то же время для комплекса к-К:Х-110 (10:1 в/в) наблюдается поведение, характерное для тиксотропной системы.

Рисунок 15 - Реологические свойства ПЭК К-Х: а, в - кривые вязкости в логарифмических координатах; б, г - зависимость напряжения сдвига от скорости сдвига; I - к-К + К+; 2 - к-К:Х-110 (10:1 в/в); 3 - к-К:Х-110 (5:1 в/в); 4-к-К:Х-300 (10:1 в/в); 5 - к-К; 6 - Е-К:Х-110(10:1 в/в); 7 -Х-К + К+; 8 - £-К:Х-300 (10:1 в/в);

9-Х-К

Кривые вязкости Е-К и его комплексов с хитозанами (рис. 15в) указывают на меньшую вязкость системы по сравнению с к-К и его комплексами с хитозанами (рис. 15а). Наблюдаемая разница в реологическом поведении, вероятно, связана с присутствием в 2-К Х-К, который имеет конформацию неупорядоченного клубка, в отличие от к-К, имеющего спиральную конформацию. Добавление ионов калия к £-К приводит к увеличению вязкости (рис. 15в, кривая 7). Наличие петли гистерезиса и расположение восходящей и нисходящей кривой указывает на реопексию.

В условиях эксперимента для х-К, а также его комплексов с хитозанами, зависимости вязкости от скорости сдвига не наблюдалось. Гелеобразующих свойств эти системы не проявляли, что может быть обусловлено как высокой СС и распределением сульфатных групп вдоль полимерной цепи, так и конформацией полисахарида в растворе.

Полученные системы могут представлять практический интерес. Наличие тиксотропных свойств позволяет рассматривать тестируемые гели как перспективные основы для создания кремов и мазей, которые могут обладать собственной биологической активностью.

9. Биологическая активность полисахаридов и их комплексов К-Х

9.1. Антивирусная активность на модели вируса табачной мозаики

Биологическая активность полученных комплексов (к-К:Х, к/р-К:Х и х-К:Х) была изучена на модели ВТМ. Комплексы К-Х проявляют способность ингибировать ВТМ, которая зависит от соотношения исходных компонентов и структуры каррагинана. Наибольшую антивирусную активность проявляют комплексы хитозана с каррагинанами тех структурных типов, которые имеют конформацию двойной спирали.

9.2. Цитокин-индуцирующая активность

Полиионные полисахариды, в том числе каррагинан и хитозан способны к многоточечному взаимодействию с поверхностью иммунокомпетентных клеток, что может обеспечивать модуляцию различных компонентов иммунной системы организма.

Сравнительное изучение влияния полисахаридов и их комплексов К-Х на индукцию синтеза ФНО-альфа клетками периферической крови человека показало, что к/р-К, х-К и их комплексы с хитозаном (при соотношении К:Х 2:1 в/в) проявляют цитокин-индуцирующую активность, стимулируя синтез ФНО-альфа мононуклеарными клетками.

9.3. Антиоксидантная активность

Было показано, что комплексы К-Х проявляют способность перехватывать оксид азота, и их активность сравнима с действием стандарта (аскорбиновая кислота). Антиоксидантная активность комплексов К-Х зависит от содержания каррагинана в комплексе: ПЭК с высоким содержанием каррагинана проявляют активность, сопоставимую с активностью исходного каррагинана.

9.4. Противовоспалительный эффект ПЭК К-Х

Исследование противовоспалительной активности проводили на модели воспаления, индуцированного гистамином и формалином, а также на модели «псевдоаллергического» воспаления лапы, индуцированного конканавалином А.

Проведенное исследование противовоспалительных свойств полисахаридов и их комплексов показало, что они наиболее эффективны при эксудативном воспалении, вызванном гистамином (таблица 6). В этих тестах их активность сравнима с нестероидным противовоспалительным средством. Следует подчеркнуть, что противовоспалительная активность свободных полисахаридов в условиях гистаминного воспаления сохраняется при их комплексообразоваии.

Таблица 6 - Противовоспалительный эффект полисахаридов и их ПЭК К-Х на модели гистаминного отека лапы у мышей_

Группа Доза мг/кг в/бр. Средний индекс отека Размер отека, % Противовоспалительный эффект, %

Контроль - 35.84±3.56## 100 0

к-К:Х 1:10 10 17.45±3.04" 49 51

к-К:Х 10:1 10 22.44il.53*'"' 63 37

Е-К:Х 10:1 10 19.5i2.32** 54 46

к-К 9.0 20.77i2.56*" 63 37

S-K 9.0 17.34i2.47* 48 52

Хитозан 9.0 16.70i3.66* 47 53

Индометацин 50 12.61il.ll** 35 65

PO.Ol, Р<0.001 относительно контрольной группы; 'Р<0 05, Р<0.001 относительно группы с внутрибрюшинным введением (в/бр.) индометацина (50 мг/кг)

Результаты эксперимента на формалиновой модели воспаления не выявили противовоспалительного действия у всех протестированных агентов. Все полисахариды и их комплексы проявили небольшой провоспалительный эффект на этой модели.

В результате эксперимента на модели «псевдоаллергического» воспаления лапы, индуцированного конканавалином А, установлено, что свободные полисахариды обладают высокой противовоспалительной активностью, однако после образования ими комплекса их противовоспалительный эффект исчезает. На основании полученных данных можно прогнозировать отсутствие у комплексов антиаллергенного действия.

Оценку влияния агентов на клеточный иммунный ответ проводили с использованием в качестве модели реакции гиперчувствительности замедленного типа к эритроцитам барана. Результаты эксперимента показали, что комплексы к-К и Z-K с хитозаном проявляют иммунологическую толерантность по отношению к антигену, при этом свободные полисахариды к-К и 2-К оказывают иммунотоксическое действие, в отличие от хитозана. Таким образом, комплексирование с хитозаном устраняет иммунотоксичность каррагинана в составе комплекса.

9.5. Гастропротекторное и противоязвенное действие полисахаридов и их ПЭК К-Х на модели индометаг^иновой язвы желудка у крыс

Было исследовано гастропротекторное и противоязвенное действие двух комплексов к-К с хитозаном при соотношении компонентов К:Х и Х:К 10:1 в/в, которые, как было показано выше, имеют разную морфологию. Исследование показало, что оба комплекса обладают гастрозащитным эффектом (ПА>2.0 ед.), однако его выраженность различна. Введение комплекса к-К:Х 10:1 в/в снижает количество язв в желудке в 2.2 раза, тогда как под действием комплекса Х:к-К 10:1 в/в язвообразование уменьшается почти в 7 раз. По своей гастрозащитной активности комплекс Х:к-К 10:1 в/в превышает активность препарата сравнения Фосфалюгель (таблица 7).

Таблица 7 - Гастрозащитная активность к-К, Х-130 и их ПЭК в сравнении с препаратом Фосфалюгель ____

Образец Среднее число язв на 1 крысу Общее число язв на группу (6 крыс) Индекс Паулса Противоязвенная активность, ед Гиперемия слизистой в баллах

Контроль 9.2±1.6 55 9.2 - 3.2±0.4

к-К 2.8±1.5 " 17 1.9 4.8 3.0±0.37

Х-110 6.2±1.9* 37 6.2 1.5 3.7±0.2

к-К:Х 10:1 в/в 4.2±1.3 * 25 4.2 2.2 3.2±0.5

Х:к-К 10:1 в/в 1.3±1.0 "* 8 0.4 23.0 1.5±0.2 ***

Фосфалюгель 1.0±0.4"" 6 0.7 13.1 3.3±0.4

'Р<0.05, "Р<0 01, "*Р<0.0001 относительно контрольной группы; ЙР<0.01 относительно референсной группы

При профилактическом введении исследуемые полисахариды и их комплексы не повышают собственные защитные свойства слизистой желудка, обуславливающие ее устойчивость к ульцерогенному воздействию. Полученные результаты позволяют предположить, что гастропротекторное действие комплексов полисахаридов может быть связано с созданием ими на поверхности слизистой оболочки желудка защитного слоя, затрудняющего непосредственный контакт с ульцерогенным агентом (индометацином).

Выводы

1. Показано, что образование растворимых полиэлектролитных комплексов каррагинан-хитозан зависит от способа их получения, соотношения и концентрации исходных компонентов. Установлено, что растворимые комплексы формируются при смешивании полисахаридов в широком диапазоне соотношений Х:К (от 0.1:1 до 30:1 моль/моль, при Ск = 0.1 мг/мл).

2. Установлено, что образование растворимых полиэлектролитных комплексов каррагинан-хитозан зависит от структуры каррагинанов и хитозанов. Каррагинаны с высокой степенью сульфатирования, а также хитозаны с низкой степенью ацетилирования и полимеризации образуют растворимые комплексы в широком диапазоне соотношений исходных компонентов. Высокосульфатированный х-каррагинан полностью связывается с хитозанами различной степени полимеризации. В случае к- и к/(3-каррагинанов в комплексе с хитозаном при высоком содержании полианиона в смеси остается несвязанной часть каррагинана, а при избытке высокомолекулярного поликатиона свободным остается хитозан.

3. Определены константы связывания и количество мест связывания хитозана с каррагинанами различных структурных типов. Установлено, что наибольшую аффинность к хитозану проявляют каррагинаны с высокой степенью сульфатирования и гибкой конформацией макромолекул в растворе.

4. Исследована надмолекулярная структура полиэлектролитного комплекса к-каррагинан-хитозан и показано, что ее особенности зависят от концентрации и соотношения исходных полисахаридов.

5. Показано, что полученные гелевые комплексы каррагинан-хитозан представляют собой неньютоновские псевдопластичные жидкости с тиксотропными свойствами.

6. В экспериментах in vitro показано, что полиэлектролитные комплексы с высоким содержанием каррагинана проявляют цитокин-индуцирующую, антивирусную и антиоксидантную активности.

7. В экспериментах in vivo установлено, что парентеральное введение полиэлектролитных комплексов каррагинан-хитозан достоверно снижает выраженность воспалительной реакции, индуцированной гистамином. Показано, что водные растворы комплексов к-каррагинана с хитозаном обладают гастропротекторным действием, выраженность которого зависит от их состава. Высокую гастропротекторную активность, превосходящую действие эталонного препарата Фосфалюгель, проявляет полиэлектролитный комплекс с высоким содержанием хитозана (Х:К 10:1 в/в).

Основное содержание диссертации изложено в следующих

работах:

1. Volod'ko А. У.. Davydova V. N., Chusovitin Е. A., Sorokina I. V., Dolgikh М. P., Tolstikova Т. G., Balagan S.A., Gatkin N.G., Yermak I. M. Soluble chitosan-carrageenan polyelectrolyte complexes and their gastroprotective activity // Carbohydr. Polym. - 2014. - Vol. 101. - P. 1087-1093.

2. Volod'ko A.V.. Davydova V.N., Barabanova A. O., Solov'eva T.F., Ermak I.M. Formation of soluble chitosan-carrageenan polyelectrolyte complexes. // Chem. Nat. Compd. - 2012. - Vol. 48. - P. 353-357.

3. Byankina (Barabanova) A.O., Sokolova E.V., Anastyuk S.D., Isakov V. V, Glazunov V. P., Volod'ko A.V.. Yakovleva I. M., Solov'eva T. F., Yermak I. M. Polysaccharide structure of tetrasporic red seaweed Tichocarpus crinitus U Carbohydr. Polym. - 2013. - Vol. 98. - P. 26-35.

4. Лихацкая Г.Н., Володько A.B.. Трифонов E.B., Нурминский Е.А., Ермак И.М., Давыдова В.Н. Изучение in silico ЗО-структуры комплексов хитозана с каппа-каррагинаном в растворе // Акутальные проблемы биохимии и бионанотехнологии: III Международная Интернет-конференция. Казань. - 2012. - С. 189-192

5. Давыдова В.Н., Володько А.В.. Ермак И.М., Изучение процессов формирования комплексов хитозан-каррагинан в разбавленных растворах // Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана: Материалы Десятой Международной конференции. Н. Новгород: ННГУ. -2010.-С. 95-97.

6. Volodko А. У.. Davydova V. N., Glazunov V. P., Chusovitin E. A., Sorokina I. V., Yermak I. M. Soluble Polyelectrolyte Carrageenan:Chitosan Complexes and Their Gastroprotective Activity // 2nd International Symposium on Life Sciences. Vladivostok. - 2013. - P. 92.

7. Volodko A.V.. Davydova V.N., Yermak I.M. Rheological properties of chitosan-carrageenan polyelectrolyte complexes in gel form // 4th Annual Russian-Korean conference «Current issues of natural products chemistry and biotechnology». Novosibirsk. -2012. - P. 161.

8. Калитник A.A., Марков П.А., Володько A.B. Противовоспалительная активность хитозана и его низкомолекулярого производного // Тезисы докладов II Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия». Санкт-Петербург. -2012. -С. 60-61.

9. Volodko A.V.. Davydova V.N., Glazunov V.P., Barabanova A.O., Gorbach V.I., Yermak I.M. The effect of structural features of carrageenan and chitosan on the formation of soluble polyelectrolyte complexes // International conference «Renewable wood and plant resources: chemistry, technology, pharmacology, medicine». Saint-Petersburg. - 2011. - P 275-276.

10. Володько A.B., Давыдова B.H., Ермак И.М., Растворимые комплексы хитозан-каррагинан // Науч.-практ. конф. «Физико-химическая биология». Сыктывкар. - 2009. - С. 42^13.

Володько Александра Викторовна ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫЕ КОМПЛЕКСЫ ХИТОЗАН-КАРРАГИНАН

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Подписано в печать 25.02.2014 Формат 60x84/16 Усл. печ. л. 1,51 Уч-изд. 1,4 Тираж 125 экз. Заказ 084 Отпечатано в дирекции публикационной деятельности ДВФУ 690990, г. Владивосток, ул. Пушкинская, 10

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения Российской академии наук

На правах рукописи

04201457060

Володько Александра Викторовна Полиэлектролитные комплексы хитозан-каррагинан

02.00.10 - Биоорганическая химия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: д.х.н. Ермак Ирина Михайловна

ВЛАДИВОСТОК - 2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ............................................................6

ВВЕДЕНИЕ........................................................................................................................7

1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР..........................................................................................12

1.1 Хитозан.......................................................................................................................12

1.1.1 Структура. Физико-химические свойства............................................................12

1.1.2 Биологическая активность хитозана.....................................................................14

1.1.2.1 Антивирусная активность хитозана..................................................................17

1.1.2.2 Иммуномодулирующая и противовоспалительная активность......................18

1.1.3 Применение хитозана.............................................................................................19

1.2 Каррагинан.................................................................................................................20

1.2.1 Структура. Физико-химические свойства............................................................20

1.2.2 Биологическая активность каррагинана...............................................................23

1.2.2.1 Антивирусная активность...................................................................................24

1.2.2.2 Иммуномодулирующая активность...................................................................26

1.2.3 Применение каррагинана.......................................................................................27

1.3 Полиэлектролитные комплексы...............................................................................29

1.3.1 Общее представление о формировании полиэлектролитных комплексов.......29

1.3.1.1 Формирование полиэлектролитных комплексов на основе хитозана...........30

1.3.1.2 Формирование полиэлектролитных комплексов каррагинан-хитозан..........34

1.3.2 Методы изучения полиэлектролитных комплексов...........................................35

1.3.2.1 Основные понятия реологии. Классификация материалов по их реологическому поведению............................................................................................36

1.3.3 Применение полиэлектролитных комплексов.....................................................39

2 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ..............................................................................42

2.1 Получение и характеристика исходных компонентов комплекса........................42

2.1.1 Выделение и фракционирование каррагинана из водоросли Тжкосагрш сппИш...............................................................................................................................42

2.1.2 Получение образцов низкомолекулярного и 1Ч-дезацетилированного хитозана ...........................................................................................................................................45

2.1.3 Физико-химические характеристики полисахаридов.........................................46

2.2 Получение полиэлектролитных комплексов каррагинан-хитозан.......................46

2.2.1 Подбор условий для формирования растворимых комплексов каррагинан-хитозан..............................................................................................................................46

2.2.1.1 Влияние способа получения полиэлектролитного комплекса на его растворимость..................................................................................................................47

2.2.1.2 Влияние параметров среды на процесс формирования комплексов каррагинан-хитозан.........................................................................................................49

2.2.1.3 Влияние структуры и молекулярной массы каррагинана на процесс формирования комплексов каррагинан-хитозан..........................................................51

2.2.1.4 Влияние концентрации каррагинана на процесс формирования комплексов каррагинан-хитозан.........................................................................................................52

2.2.1.5 Влияние молекулярной массы и степени N-ацетилирования хитозана на процесс формирования комплексов каррагинан-хитозан...........................................53

2.3 Характеристика образования растворимых комплексов каррагинан-хитозан.... 56

2.3.1 Гель-проникающая хроматография......................................................................57

2.3.2 Центрифугирование в градиенте перколла..........................................................58

2.3.3 ИК-спектроскопия..................................................................................................63

2.4 Изучение in silico комплексов хитозана с к-каррагинаном в растворе................64

2.5 Определение параметров связывания каррагинана с хитозаном.........................68

2.6 Размер и ^-потенциал комплексов к-каррагинана с хитозаном............................72

2.7 Исследование макромолекулярной организации полиэлектролитных комплексов методами микроскопии..............................................................................75

2.7.1 Электронная микроскопия.....................................................................................75

2.7.2 Атомно-силовая микроскопия...............................................................................76

2.8 Получение и реологические свойства гелевых комплексов каррагинан-хитозан ...........................................................................................................................................79

2.9 Биологическая активность in vitro комплексов каррагинан-хитозан...................84

2.9.1 Антивирусная активность полисахаридов и их комплексов каррагинан-хитозан на модели вируса табачной мозаики...............................................................84

2.9.2 Цитокин-индуцирующая активность полисахаридов и их комплексов каррагинан-хитозан.........................................................................................................85

2.9.3 Антиоксидантная активность полисахаридов и их комплексов каррагинан-

хитозан..............................................................................................................................86

2.10 Биологическая активность in vivo полисахаридов и их комплексов каррагинан-хитозан ..............................................................................................................................87

2.10.1 Противовоспалительное действие полисахаридов и их комплексов каррагинан-хитозан.........................................................................................................88

2.10.2 Гастропротекторное и противоязвенное действие полисахаридов и их

комплексов каррагинан-хитозан....................................................................................93

3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ........................................................................................98

3.1 Используемые в работе полисахариды...................................................................98

3.2 N-Дезацетилирование хитозана...............................................................................98

3.3 Получение низкомолекулярного хитозана.............................................................98

3.4 Выделение и фракционирование каррагинана.......................................................99

3.5 Приготовление растворимых и гелевых полиэлектролитных комплексов.......100

3.5.1 Растворимые комплексы......................................................................................100

3.5.2 Приготовление гелей............................................................................................100

3.6 Определение молекулярной массы полисахаридов.............................................100

3.7 Основные аналитические методы..........................................................................101

3.8 Турбидиметрический метод...................................................................................101

3.9 Гель-проникающая хроматография.......................................................................102

3.10 Центрифугирование в градиенте перколла.........................................................102

3.11 ИК-спектроскопия.................................................................................................103

3.12 Компьютерное моделирование............................................................................103

3.13 Метод конкурентного связывания с использованием анионного красителя тропеолина 000-1............................................................................................................104

3.14 Измерение размера и ^-потенциала.....................................................................105

3.15 Электронная микроскопия....................................................................................105

3.16 Атомно-силовая микроскопия..............................................................................106

3.17 Измерение реологических параметров................................................................106

3.18 Биологическая активность in vitro.......................................................................107

3.18.1 Антивирусная активность..................................................................................107

3.18.2 Цитокин-индуцирующая активность...............................................................108

3.18.3 Антиоксидантная активность............................................................................108

3.19 Биологическая активность ш vivo........................................................................108

3.19.1 Противовоспалительая активность...................................................................108

3.19.2 Иммуномодулирующая активность..................................................................109

3.19.3 Гастропротекторная и противоязвенная активность......................................110

ВЫВОДЫ.......................................................................................................................113

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................................................115

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АСМ — атомно-силовая микроскопия;

ВМ - высокомолекулярный;

ВТМ — вирус табачной мозаики;

ВПГ - вирус простого герпеса;

ВПЧ — вирус папилломы человека;

ГЗТ — гиперчувствительность замедленного типа;

ДРС - динамическое рассеяние света;

ИК -инфракрасный;

ИЛ - интерлейкин;

ИП - Индекс Паулса;

К - каррагинан;

ЛПС - липополисахарид;

ММ - молекулярная масса;

НМ - низкомолекулярный;

ПА - противоязвенная активность;

ПЭК - полиэлектролитный комплекс;

СА - степень N-ацетилирования;

СД - степень N-дезацетилирования;

СС - степень сульфатирования;

СЭМ — сканирующая электронная микроскопия;

ТИ - тиксотропный индекс;

ТНБС - 2,4,6-тринитобензолсульфокислота;

ФНО - фактор некроза опухоли;

ФСБ - фосфатно-солевой буфер;

X - хитозан;

ЭБ - эритроциты барана.

ВВЕДЕНИЕ

Одной из актуальных задач современной биологии и медицины является создание новых композитных материалов с широким спектром биологической активности и минимальным побочным действием. В последние годы для их получения используются как синтетические, так и природные полимеры. Особый интерес представляют полиионные полисахариды морского происхождения благодаря их биоразлагаемости, биосовместимости, доступности и разнообразной биологической активности. Способность противоположно заряженных полиионов образовывать полиэлектролитные комплексы (ПЭК) открывает возможность создания на их основе различного рода биологически активных композитов, которые в зависимости от условий получения могут существовать в виде растворов, гелей, нано- и микрочастиц, пленок и мембран, пористых структур и жидкокристаллических дисперсий.

Среди природных полианионов важное место занимают сульфатированные полисахариды красных водорослей — каррагинаны, построенные из остатков Б-галактозы и ее производных, соединенных (3(1—>4) и а(1—>3) гликозидными связями. Структурное разнообразие каррагинанов объясняется присутствием 3,6-ангидрогалактозы, различным местоположением и количеством сульфатных групп, а также нерегулярностью расположения каррабиозных звеньев в молекуле. Каррагинаны обладают уникальными физико-химическими свойствами и разнообразной биологической активностью, в том числе выраженной антивирусной, антимикробной, иммуномодулирующей и антикоагулирующей.

Среди природных поликатионных полисахаридов широким спектром активности обладает хитозан - линейный полисахарид, полимерная цепь которого построена из (3-1,4-связанных остатков Б-глюкозамина и К-ацетил-Б-глюкозамина. К настоящему времени установлено, что хитозан обладает гиполипидемической, гепатопротекторной, радиопротекторной, иммуностимулирующей,

антибактериальной и противовирусной активностями, проявляет кровоостанавливающие свойства, регулирует кислотность желудочного сока, нормализует микрофлору кишечника.

В немногочисленных работах, описывающих комплексы хитозана с коммерческими образцами каррагинана (к-, I- или А,-типами), основное внимание авторов уделено вопросам их практического использования. При этом практически не затронутыми остаются вопросы, связанные со структурными особенностями исходных полисахаридов, условиями формирования ПЭК и их макромолекулярной структурой. Вместе с тем физико-химические свойства этих природных биополимеров определяются, прежде всего, их структурой, концентрацией, значением рН, ионной силой и составом растворителя. Очевидно, что процесс формирования ПЭК на основе каррагинана и хитозана зависит от всех вышеперечисленных параметров. Изучение влияния всех этих факторов позволит дополнить представление о механизме образования ПЭК и расширит возможности целенаправленного регулирования физико-химических и биологических свойств новых композитных материалов.

Наличие каррагинанов различных структурных типов с одной стороны и хитозанов разной степени Ы-ацетилирования и полимеризациии с другой позволит получить широкий набор композитов с различной структурой и свойствами и выбрать наиболее эффективные из них для дальнейшего использования. Получение растворимых форм комплексов каррагинан-хитозан позволит расширить возможности применения ПЭК и увеличить их биодоступность. В связи с этим в данной работе основное внимание уделено получению растворимых комплексов каррагинана с хитозаном и изучению условий их формирования в зависимости от структурных особенностей исходных компонентов.

Целью диссертационной работы является получение и характеристика полиэлектролитных комплексов каррагинан-хитозан, изучение влияния структурных особенностей полисахаридов на процесс формирования комплексов, а также экспериментальное обоснование возможности использования полиэлектролитных комплексов для биомедицинского назначения.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Получить и охарактеризовать каррагинаны различных структурных типов и хитозаны с разной степенью М-ацетилирования и полимеризации;

2. Подобрать условия образования растворимых комплексов каррагинан-хитозан:

3. Изучить влияние на процесс формирования комплексов структуры и молекулярной массы полисахаридов, концентрации и соотношения исходных компонентов, а также условий среды;

4. Охарактеризовать полученные ПЭК (определить их размер, ^-потенциал, константы связывания каррагинана с хитозаном и изучить макромолекулярную организацию комплексов);

5. Получить гелевые формы ПЭК и оценить их реологические свойства;

6. Изучить биологическую активность полученных комплексов в сравнении с исходными полисахаридами.

Настоящая работа выполнена в соответствии с планом научных исследований в лаборатории молекулярных основ антибактериального иммунитета ТИБОХ ДВО РАН. Работа поддержана грантом: Президиума РАН — «Молекулярная и клеточная биология» (руководитель к.б.н. В.А. Рассказов) и интеграционными грантом ДВО — УРО РАН (руководитель д.х.н. И.М. Ермак), ДВО — СО РАН (руководитель акад. Стоник В.А.).

Научная новизна работы. Впервые охарактеризованы растворимые ПЭК каррагинан-хитозан (К-Х), полученные на основе каррагинанов различных структурных типов с хитозанами разной степени 1Ч-ацетилирования и полимеризации. Показано влияние структурных особенностей полисахаридов на процесс формирования комплексов. Впервые определены константы связывания каррагинана с хитозаном, методом компьютерного моделирования рассчитаны теоретические модели пространственных структур комплексов. Впервые методом атомно-силовой микроскопии изучена надмолекулярная структура комплексов К-X, и показана ее зависимость от соотношения исходных компонентов. Впервые показано, что комплексы К-Х обладают гастропротекторной активностью, которая зависит от их состава.

Практическая значимость работы. На основе полисахаридов морских гидробионтов создано средство, обладающее гастропротекторной активностью и представляющее собой водорастворимый ПЭК каррагинана с хитозаном при соотношении Х:К 10:1 в/в. Показано, что парентеральное введение ПЭК каррагинан-хитозан экспериментальным животным достоверно снижает выраженность воспалительной реакции организма, индуцированной гистамином.

Полученный ПЭК может найти применение в медицине для профилактики и лечения язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, а также для снижения побочного ульцерогенного действия нестероидных противовоспалительных средств и других лекарственных препаратов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Подобраны условия для получения комплексов каррагинан-хитозан в растворимой и гелевой форме.

2. Образование растворимых ПЭК в широком диапазоне соотношений исходных компонентов определяется степенью сульфатирования каррагинанов и степенью N-ацетилирования хитозанов.

3. Высокосульфатированный х-К полностью связывается с хитозанами различной степени полимеризации, а хитозан с низкой степенью полимеризации полностью связывается с каррагинанами (к-К и х-К).

4. Гелевые формы полученных ПЭК представляют собой неньютоновские псевдопластичные жидкости с тиксотропными свойствами.

5. Макромолекулярная структура ПЭК зависит от концентрации и соотношения исходных полисахаридов.

6. Комплексы с высоким содержанием каррагинана проявляют цитокин-индуцирующую, антивирусную и антиоксидантную активности in vitro.

7. ПЭК каррагинан-хитозан снижают выраженность воспалительной реакции, индуцированной гистамином, и проявляют гастропротекторную активность, которая зависит от их состава.

Апробация работы. Материалы диссертации были предста